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1 MÁSTER EN INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS CURSO 2013-2014 PROYECTO FIN DE MÁSTER Estudio preliminar sobre la influencia de los genes cspA, cpxA, hscA, recA y clpB en la resistencia al calor de Escherichia coli ELISA CANTÁN ARNAL DIRECTORES: DIEGO GARCÍA GONZALO Y RAFAEL PAGÁN TOMÁS 2 Resumen ............................................................................................................................. 3 Abstract ......................................................................................................................................... 4 1-Introducción ..................................................................................................................... 5 2-Objetivos .................................................................................................................................. 11 3Materiales y métodos ..................................................................................................... 13 3.1 .Microorganismos y condiciones de cultivo ...................................................................... 14 3.2 Estudio de la resistencia frente al calor (55 °C) de E. coli BW25113 y de los mutantes seleccionados para el estudio ................................................................................................. 14 3.3. Elaboración de las curvas de crecimiento bacteriano ...................................................... 16 3.4. Estudio del daño subletal ................................................................................................. 16 3.4.1. Siembra en medios selectivos y determinación del daño subletal ........................... 19 3.5. Análisis estadístico de los datos ....................................................................................... 20 3.6. Construcción de mutantes E. coli MG1655 ∆cpxA y E. coli MG1655 ∆clpB ..................... 20 3.6.1. Transducción ............................................................................................................. 20 3.6.2. Eliminación del marcador de la kanamicina .............................................................. 21 3. 6.2.1. Aislamiento del plásmido pCP20 a partir de NB762 ..................................... 22 3.6.2.2. Transformación ............................................................................................... 22 4. Resultados y discusión ............................................................................................................ 24 4.1. Resistencia frente al calor (55 °C) de E. coli BW25113 y de cinco cepas mutantes deletéreas para los genes cspA, cpxA, hscA, recA y clpB ....................................................... 25 4.2. Curvas de crecimiento ...................................................................................................... 26 4.3. Resistencia frente al calor (55 °C) de E. coli BW25113 y de cinco cepas mutantes deletéreas para los genes cspA, cpxA, hscA, recA y clpB en medios selectivos: Determinación de la presencia de daño subletal ............................................................................................. 27 4.4. Construcción de mutantes E. coli MG1655 ∆clpB y E. coli MG1655 ∆cpxA ..................... 34 4.4.1 Transducción con el fago P1 ....................................................................................... 36 4.4.2. Eliminación del marcador de la kanamicina .............................................................. 39 5. Conclusiones............................................................................................................................ 42 3 RESUMEN En esta investigación se ha realizado un estudio preliminar sobre la influencia de los genes cspA, cpxA, hscA, recA y clpB en la resistencia al calor de Escherichia coli, mediante la comparación de la resistencia de la cepa parental BW25113 y las cepas mutantes obtenidas de la colección Keio. Posteriormente, y con objeto de poder confirmar en un futuro los resultados obtenidos en una cepa de referencia (E. coli MG1655), se han creado mutantes deletéreos en esta cepa mediante el uso de herramientas moleculares. Como resultado del estudio preliminar, se ha podido establecer relación directa entre la deleción de los genes cpxA, recA y clpB y una mayor sensibilidad a los tratamientos térmicos. Concretamente, este estudio ha revelado una disminución de la resistencia intrínseca de la membrana citoplasmática como consecuencia de la deleción de los genes cpxA, recA y clpB, por lo que la expresión de estos genes podría estar relacionada con la estabilización de esta envoltura celular frente a los tratamientos térmicos, y en el caso de los genes cpxA y clpB con los mecanismos de reparación de los daños ocasionados sobre dicha envoltura celular. Del mismo modo, el estudio ha revelado una disminución de la resistencia intrínseca de la membrana externa como consecuencia de la deleción del gen clpB. Así, se han seleccionado los genes clpB y cpxA, y mediante la técnica de mutagénesis dirigida mediante transducción con bacteriófagos P1 se ha introducido la mutación para los genes clpB y cpxA a partir de las cepas de la colección Keio, E. coli JW2573 y JW3525, respectivamente, en la cepa de referencia de E. coli MG1655. Posteriormente, se ha eliminado el marcador de resistencia antibiótica mediante una FLP recombinasa, lo que ha permitido que la cepa mutante construida tuviese una secuencia genómica lo más parecida posible a la secuencia original. Una vez obtenidos estos mutantes en E. coli MG1655 será posible evitar cualquier posible interferencia del gen de resistencia antibiótica, y de este modo, 4 verificar, en un estudio posterior, el posible papel de los genes seleccionados sobre la termorresistencia de E. coli. ABSTRACT In this research, a preliminary study has been carried out about the influence of cspA, cpxA, hscA, recA y clpB genes on the heat resistance of Escherichia coli, by comparing the resistance of the wild type strain BW25113 with the mutants obtained from Keio’s collection. Subsequently, and in order to be able of confirming in the next future, the results obtained in a reference strain (E. coli MG1655), deleterious mutants of this strain were built by using molecular tools. As a result of the preliminary study, a direct relationship has been established between the deletion of cpxA, recA y clpB genes and a greater microbial sensitivity to heat treatments. Precisely, the study has revealed a decrease in the intrinsic resistance of the cytoplasmic membrane as a consequence of the deletion of cpxA, recA y clpB genes so, the expression of theses genes might be related to the stabilization of this cell envelope against heat treatments, and in the case of cpxA y clpB genes with the repair mechanism of the damages occurred on that cell envelope. Similarly, the study has revealed a decrease in the intrinsic resistance of the outer membrane as a consequence of the deletion of clpB gene. Thus, clpB y cpxA genes were selected, and by using a conducted mutagenesis technique by transduction with bacteriophague P1, the mutation for clpB y cpxA genes obtained from Keio’s collection, JW2573 and JW3525, respectively, has been included in the reference strain (E. coli MG1655). Subsequently, the antibiotic resistance marker has been deleted by using a FLP recombinase, which has allowed us to obtaine a mutant strain with a genomic sequence similar to the original sequence. Once the E. coli MG1655 mutants were obtained, it will be possible to avoid any unlikely interference of the antibiotic resistance gene, and thus, to verify in a later study the likely role of the selected genes of the heat resistance of E. coli. 5 1. INTRODUCCIÓN 6 A medida que la población mundial crece, la disponibilidad de alimentos disminuye. Estimaciones de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) señalan que la producción de alimentos para el año 2050 debería aumentar en un 70%. Por esta razón, se están invirtiendo enormes esfuerzos en el desarrollo de métodos que permitan aumentar la producción de más alimentos. Por un lado, se han propuesto investigaciones dirigidas hacia la mejora de la distribución y explotación agrícolas, tales como la selección de plantas más resistentes al calor, a la sequía, parásitos y falta de nutrientes, rotaciones de cultivos o gestión del suelo (Nature 2010). Por otro lado, el 40% de los alimentos producidos mundialmente se pierden o se estropean (UNEP 2009). Una de las principales causas del deterioro de los alimentos es la presencia y crecimiento de microorganismos. Además de provocar el deterioro de los alimentos, la presencia de microorganismos en los alimentos puede causar graves enfermedades. Recientemente, estos problemas han sido especialmente evidentes en Europa con el brote de Escherichia coli O104:H4, que causó 50 muertes, y más de 4.000 casos de Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) y no-SUH. Por esta razón, hay también una gran necesidad de mejorar la seguridad alimentaria. Por lo tanto, mejoras en los procesos de conservación, junto con mejores técnicas agrícolas e higiénicas, podrían contribuir al aumento de la disponibilidad y seguridad de los alimentos. Los métodos de conservación de los alimentos que actúan inactivando microorganismos permiten, además de prolongar su vida útil, garantizar su inocuidad. En la actualidad el método de inactivación microbiana más usado en la conservación de alimentos es el calor (Gould 2000). Si bien se han descrito aspectos fundamentales tales como la resistencia de las especies patógenas y alterantes, o la influencia de factores medioambientales, un adecuado aprovechamiento de la potencialidad de los tratamientos térmicos requiere profundizar en el estudio de los mecanismos de inactivación microbiana por el calor. Por una parte, el fenómeno de daño subletal tras el tratamiento térmico es un aspecto relevante desde el punto de vista de la conservación de los alimentos (Mackey, 2000; Mañas y Pagán, 2005). Las células subletalmente dañadas tienen una resistencia inferior a estreses posteriores 7 (Mackey 2000). El estudio de la existencia de daños subletales ha permitido describir efectos sinérgicos al combinar el calor con otras barreras o métodos de conservación (García et al 2005; Somolinos et al. 2007, 2010; Leistner et al 1995; Espina et al 2010, 2011). Para obtener una adecuada comprensión del efecto de esta tecnología sobre los microorganismos, en este estudio se propone la utilización de nuevas herramientas moleculares que nos permitan profundizar en el campo de la termobacteriología y, más concretamente, en la descripción de los mecanismos de inactivación microbiana por calor. En este sentido, la investigación planteada se ha centrado en el estudio de la expresión de diferentes genes relacionados con la respuesta al estrés de E. coli sobre la termorresistencia de Escherichia coli BW25113. Entre todo el genoma de E. coli se seleccionaron los siguientes genes candidatos, por su posible implicación en estreses de origen alimentario: -cspA: Este gen codifica para CspA (Jones et al 1987), una proteína principal del choque frío que actúa como factor positivo de transcripción de los genes de choque frío hns (Brandi et al 1994; La Teana et al 1991; Giangrossi et al 2001) y gyrA (Jones et al 1992). -cpxA: Este gen codifica para CpxA, un receptor quinasa de la membrana citoplasmática, que forma parte del sistema de dos componentes CpxAR de transducción de señales (Dong et al 1993). Se cree que este sistema está implicado en la respuesta a daños en las envolturas celulares (Pogliano et al 1997). De hecho, la producción de CpxA se induce bajo diversas condiciones, como pH alcalino, alteraciones en la composición lipídica de la membrana, interacción con superficies hidrofóbicas y alta osmolaridad (Dorel et al 2006), estreses relacionado con situaciones de estrés en las envolturas celulares. -hscA: Este gen codifica para la chaperona HscA, que junto a HscB forman un sistema chaperona/cochaperona similar al de DnaK/DnaJ (Vickeri at al 1997, Silberg et al 1998). -recA: Este gen codifica para RecA, implicado es varias funciones bioquímicas, como la recombinación homóloga mediante la catálisis de las reacciones de 8 intercambio de cadenas de DNA, como proteína reguladora que induce la respuesta SOS frente al daño en el DNA mediante su acción sobre la proteína represora LexA, o como componente para el reemplazo mutagénico de las lesiones sobre el DNA durante la respuesta SOS (Kuzminov 1999: Courcelle et al 2003). -clpB: Este gen codifica para ClpB, que pertenece a la superfamilia de proteínas AAA+ (ATPasas asociadas con múltiples actividades celulares). ClpB junto al sistema de chaperonas DnaK pueden resolubilizar agregados proteicos (Mogk et al 2003) in vitro e in vivo (Mogk et al 1999; Zolkiewski 1999; Goloubinoff et al 1999). La manipulación genética de los microorganismos es una herramienta molecular basada en la tecnología del DNA recombinante especialmente útil para nuestra investigación, siendo uno de los estudios más interesantes la determinación de la resistencia microbiana de cepas mutantes con deleciones en determinados genes. La comparación de la resistencia entre las cepas parentales y sus correspondientes mutantes permiten estudiar la implicación de determinados genes en los mecanismos de inactivación, resistencia y reparación microbiana frente a tratamientos de conservación de los alimentos. Escherichia coli ha sido uno de los organismos mejor caracterizados en biología molecular. De hecho, basado en este microorganismo, se desarrolló un proyecto de genómica funcional en Japón para crear nuevos recursos experimentales, establecer y desarrollar nuevos métodos de análisis y analizar la función de los genes (Mori et al 2000). Entre los objetivos de este proyecto se encontraba la construcción de una colección de mutantes deletéreos simples cubriendo todos los genes de E. coli (Baba et al 2006). Este objetivo se alcanzó mediante un método altamente eficiente para la inactivación de genes cromosómicos en E. coli (Datsenko et al 2000). Para ello, se utilizó un plásmido de pocas copias y fácil curación que expresaba la recombinasa 1 Red (sistema 1 Red). Entre las ventajas de este sistema se encuentran la posibilidad de seleccionar genes para su deleción, diseñar deleciones arbitraria y eliminar fácilmente el marcador (cassette) de resistencia a continuación. Para la mutagénesis se utilizaron productos de PCR que contenían una cassette de resistencia de kanamicina flanqueada por los sitios de reconocimiento del FLP (sitios FRT) y unas secuencias de 50 pb 9 adyacentes a la secuencia cromosómica a delecionar. La transformación del plásmido en la célula permitía la recombinación con el gen a eliminar, sustituyendo todo el gen por el marcador de la kanamicina flanqueado por los sitios FRT (Figura 1). Siguiendo este procedimiento de un modo masivo y sistemático se consiguió la colección Keio, que cuenta con más de 3.000 mutantes deletéreos en E. coli (Baba et al 2006). Figura 1. Procedimiento empleado para la construcción de los mutantes deletéreos de la colección Keio de E. coli. En primer lugar se sustituye el gen a delecionar por un fragmento que contiene el marcador de resistencia a la kanamicina. Este marcador es eliminado en el último paso con la ayuda de una FLP recombinasa. Adaptado de Baba et al (2006). Nuestro laboratorio dispone de esta colección en la actualidad, lo que nos está permitiendo realizar un estudio detallado de la influencia de ciertos genes en los mecanismos de inactivación, resistencia y reparación microbiana frente a tratamientos de conservación de los alimentos. Sin embargo, el uso de esta colección en nuestros estudios presenta dos problemas principales: - Por un lado, la cepa utilizada para la construcción de esta colección es E. coli BW25113, una cepa modificada para facilitar los trabajos de mutagénesis dirigida. Por 16 3.3. Elaboración de las curvas de crecimiento bacteriano. Se elaboraron las curvas de crecimiento de la cepa parental y de aquellos mutantes que mostraron una termorresistencia distinta a la de la cepa parental, con objeto de comprobar si dichas mutaciones podían también afectar al crecimiento microbiano. Para la realización de las curvas de crecimiento, a partir de las suspensiones microbianas bajo incubación a 37 °C ± 1 °C, se extrajeron muestras de 100 μL a intervalos regulares de tiempo durante un periodo de 24 horas. Tras las diluciones seriadas en agua peptona al 0,1% se realizó la siembra en superficie en placas de LAy se incubaron a 37 °C ± 1 °C durante 24 h. Las curvas de crecimiento se elaboraron representando el logaritmo del número de UFC/mL frente al tiempo de incubación. 3.4. Estudio del daño subletal. Para detectar la presencia de células dañadas subletalmente en sus envolturas celulares tras el tratamiento térmico se usó la técnica de la siembra diferencial en medio no selectivo (LA) y medios selectivos (LA –NaCl: para la determinación de daños subletales en la membrana plasmática; y LA –sales biliares: para la determinación de daños subletales en la membrana externa) (Mackey, 2000). Previamente fue necesario determinar la CMNI (Concentración Máxima No Inhibitoria) para cada una de las cepas y medios selectivos. En el presente estudio se ha considerado la Concentración Máxima No Inhibitoria (CMNI) como aquella que causa una disminución en el la población de células nativas inferior al 20 %. Para detectar los daños en la membrana plasmática se sembraron en masa placas de LA con diversas concentraciones crecientes de NaCl (Panreac, S.A., Alella, Barcelona, España), entre 0 y 6 % (p/v) y, tras 48 h de incubación, se procedió a determinar el número de supervivientes. Como se muestra en la Figura 3.2 y la Tabla 3.1, la CMNI de NaCl fue coincidente para las seis cepas estudiadas. 17 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 A % NaCl %supervivivientes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 B % NaCl % supervivientes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 % NaCl % supervivientes C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 D % NaCl % supervivientes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 E % NaCl % supervivientes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 % NaCl % supervivientes F Figura 3.2. Influencia de la presencia de NaCl en el medio de recuperación sobre la supervivencia de células nativas de (A) E. coli BW25113, (B) E. coli BW25113 ∆clpB, (C) E. coli BW25113 ∆cpxA (D) E. coli BW25113 ∆cspA (E) E. coli BW25113 ∆hscA y (F) E. coli BW25113 ∆recA. La concentración rodeada por el círculo señala la CMNI de NaCl. 18 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 A % SB % supervivientes 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 B % S.B % supervivientes 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 C %SB %superviventes 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 D % SB % supervivientes 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 E % SB % supervivientes 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 F % SB % supervivientes Figura 3.3. Influencia de la concentración de sales biliares en el número de colonias de células nativas de (A) E. coli BW25113, (B) E. coli BW25113 ∆clpB, (C) E. coli BW25113 ∆cpxA (D) E. coli BW25133 ∆cspA (E) E. coli BW25113 ∆hscA y (F) E. coli BW25113 ∆recA. La concentración rodeada por el círculo señala la CMNI de sales biliares. De igual modo, para detectar daños en la membrana externa celular se realizaron siembras en masa en placas de LA con diversas concentraciones de sales biliares (Biolife), entre 0 y 0,35 % (p/v) y, tras 48 h de incubación, se procedió al recuento de UFC por placa mediante el contador automático. La Figura 3.3 y la Tabla 19 3.1 muestran las CMNI obtenidas en el medio LA-sales biliares para las distintas cepas ensayadas. Así, se obtuvo una CMNI de 0,2% para las cepas E. coli BW25113, E. coli BW25113 ∆clpB y E. coli BW25113 ∆cspA .Las células nativas de las cepas E. coli BW25113 ∆cpxa y E. coli BW25113 ∆recA mostraron mayor sensibilidad presentando una CMNI de 0,15%; y por el contrario, la cepa mutante E. coli BW25113 ∆hscA mostró una mayor resistencia a la presencia de sales biliares que la cepa parental tolerando una concentración de 0,25%. Tabla 3.1: Concentraciones máximas no inhibitorias de NaCl y sales biliares adicionadas a los medios de recuperación de cultivos de células nativas de E. coli en fase estacionaria de crecimiento. 3.4.1. Siembra en medios selectivos y determinación del daño subletal. Una vez aplicado el tratamiento a 55 °C se realizaron las siembras en medio no selectivo (LA), y medios selectivos (LA –NaCl) o (LA-sales biliares). Esta técnica nos permite observar si los daños causados por el calor en las envolturas celulares bacterianas son letales/irreversibles, en cuyo caso, el número de supervivientes tras el tratamiento es el mismo en medio selectivo y no selectivo. Cuando el número de supervivientes recuperados en los medios selectivos tras el tratamiento es inferior, es en ese caso cuando se detecta daño subletal. Así, se estimó la proporción de células dañadas subletalmente a nivel de membrana plasmática y de membrana externa, como la diferencia entre el número de log10 de U.F.C/mL obtenidas en medios no selectivos y selectivos. Cepa CMNI (LA-NaCl) CMNI (LA-sales biliares) E. coli BW25113 4% 0,2% E. coli BW25113 ∆clpB 4% 0,2% E. coli BW25113 ∆cpxA 4% 0,15% E. coli BW25113 ∆cspA 4% 0,2% E. coli BW25113 ∆hscA 4% 0,25% E. coli BW25113 ∆recA 4% 0,15% 20 3.5. Análisis estadístico de los datos. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y en días independientes, utilizando suspensiones obtenidas en diferentes días. Las barras de error en las figuras indican las desviaciones estándar de la media para los recuentos obtenidos en esos tres experimentos independientes. El análisis estadístico de los datos se realizó con el programa GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EE. UU.). Este programa se utilizó para determinar las desviaciones estándar, realizar los test t de student y los análisis de Varianza. 3.6. Construcción de mutantes E. coli MG1655 ∆cpxA y E. coli MG1655 ∆clpB. 3.6.1. Transducción. Para la obtención de los lisados que contuvieran partículas víricas con el material genético encapsulado de las cepas donantes de E. coli BW25113 ∆cpxA y E. coli BW25113 ∆clpB, se prepararon tubos de ensayo estériles con 2 mL de LB suplementado con MgCl2 (10 mM) CaCl2 (5 mM) y glucosa al 0,2 %. Estos tubos se atemperaron a 37 °C durante 15 min y se inocularon con 20 μL de las cepas donantes E. coli BW25113 ∆clpB y E. coli BW25113 ∆cpxA en fase estacionaria. Cuando los cultivos alcanzaron una OD 595 = 0,25 se inocularon 80 μL de bacteriófagos P1 y se incubaron a 37 °C durante unas 4 horas hasta que la turbidez en el tubo disminuyó de forma evidente debido a la lisis bacteriana. A continuación, estos cultivos se adicionaron con 100 μL de cloroformo y se realizó una resuspensión en mezclador de vórtice (Genius, modelo ika vortex 3, Königswinter, Alemania). El contenido del tubo de ensayo se pasó a tubos eppendorf estériles y se centrifugaron durante 2 min a 14.000 rpm (microcentrífuga Eppendorf, modelo Mini Spin, Hamburgo, Alemania). Los fagos procedentes del lisado que se encontraban en el sobrenadante se recogieron mediante pipeta, se les añadió 20 μL de cloroformo y se conservaron a 4 °C hasta su posterior uso. 21 Para el siguiente paso de la transducción se hizo crecer la cepa receptora E. coli MG1655 hasta alcanzar una fase exponencial tardía con una OD 595= 0,8. 1 mL de este cultivo se centrifugó (6000 rpm, 2 min) y se resuspendió en 300 μL de LB suplementado con MgSO4 (100 mM) y CaCl2 (5 mM). A 100 μL de esta suspensión se le añadieron 100 μL del stock del lisado P1 procedente de E. coli ∆clpB y se incubaron durante 30 min a 37 °C en agitación. Transcurrido este tiempo se añadió 1 mL de caldo LB y 100 μL de una solución 1 M de citrato de sodio para detener la infección de las células. Tras volver a incubar a 37 °C en agitación durante 1 h, las muestras se centrifugaron a 6.000 rpm durante 5 min, y el pellet se resuspendió en 100 μL de medio LB con citrato de sodio (100 mM). Esta suspensión bacteriana se sembró en placas de LA con kanamicina (25 μg/mL) y citrato de sodio (10 mM) y se incubó a 37 °C durante 24 h. Se seleccionaron algunas de las colonias que crecieron en este medio y se sometieron a dos nuevos pases en placas de LA con kanamicina y citrato de sodio. A esta nueva cepa obtenida tras la transducción se le denominó E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR). Esta cepa es una E. coli deletérea para el gen que codifica la chaperona ClpB y con un cassette de resistencia a la kanamicina en el locus de dicho gen. Este segundo paso de la transducción se repitió de igual manera con el lisado obtenido a partir de la cepa mutante ∆cpxA y el resultado fue la obtención de la nueva cepa E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR), que al igual que en al caso anterior presentaba un cassette de resistencia a la kanamicina en lugar del gen que codifica la proteína CpxA. 3.6.2. Eliminación del marcador de la kanamicina. Para evitar posibles errores e interferencias del gen de resistencia a la kanamicina en la evaluación de la resistencia microbiana de las diferentes cepas mutantes se eliminó dicho gen. Este proceso se denomina curación y para tal fin se utilizó el plásmido pCP20. 22 3. 6.2.1. Aislamiento del plásmido pCP20 a partir de NB762. El plásmido pCP20 se obtuvo a partir de la cepa NB762 (suministrada por el Profesor Beckwith de Harvard Medical School, EE.UU.). Para ello, esta cepa se cultivó en una placa de LA con ampicilina (100 μg/mL) a 30 °C durante 24 h para la sobreexpresión de este plásmido. Para el aislamiento del plásmido pCP20 se usó el kit “QIAprep Spin Miniprep” (QIAgen, Hilden, Alemania). Este kit se basa en tecnología de membrana de gel de sílice y produce el aislamiento en tres pasos: (1) lisis alcalina, (2) adsorción del DNA a la membrana de gel de sílice en presencia de una elevada concentración salina y (3) el lavado y elución del DNA plasmídico en una solución amortiguadora de baja concentración salina. 3.6.2.2. Transformación Para la transformación se cultivaron las cepas receptoras del plásmido E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) a 37 °C en agitación hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento (OD 595=0,3-0,4). Se centrifugaron 10 ml de este cultivo a 4.000 rpm durante 20 min a 4 °C (centrífuga Heraeus, modelo Megafuge 1.0 R, Hanau, Alemania). El pellet se resuspendió en 5 ml de solución “transformante” compuesta por 60 mM de CaCl2, 15% de glicerol y 10 mM de PIPES (piperazine-N,N′- bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)) y los tubos se depositaron en hielo durante 20 min. Tras volver a centrifugar a 2.500 rpm durante 5 min a 4 °C, se resuspendió en 1 mL de la solución "transformante" para obtener las células competentes. A 200 μL de las células competentes E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) se les añadió 20 μL del plásmido pCP20. Esta suspensión se dejó reposar en hielo 20 min tras los cuales se sometió a un choque térmico de 42 °C durante 1,5 min para la introducción del plásmido al citoplasma bacteriano , se volvió a incubar en hielo 2 min, se añadieron a la suspensión 800 μL de LB y se incubó 1 h a 37 °C. 23 A continuación se sembraron alícuotas de 100 μL y 50 μL en placas de LA con diferentes concentraciones de ampicilina (100, 25 y 20 μg/mL) y tras la incubación a 30 °C durante 24 h se seleccionaron las colonias correspondientes. 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 4.1. Resistencia frente al calor (55 °C) de E. coli BW25113 y de cinco cepas mutantes deletéreas para los genes cspA, cpxA, hscA, recA y clpB La Figura 4.1 muestra las gráficas de supervivencia a 55 oC en tampón McIlvaine de pH 7,0 de la cepa parental E. coli BW25113 y de las cinco cepas mutantes seleccionadas. 0 5 10 15 20 25 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 Tiempo (min) log10 Nt/N0 Figura 4.1. Gráficas de supervivencia de E. coli BW25113 ( ), E. coli BW251133 ∆cspA ( ), E. coli BW251133 ∆hscA ( ), E. coli BW251133 ∆recA ( ), E. coli BW251133 ∆clpB ( ) y E. coli BW251133 ∆cpxA ( ) tras un tratamiento a 55 oC en tampón McIlvaine de pH 7,0. Como se observa en la gráfica, la cinética de inactivación de la cepa parental siguió un curso exponencial, lográndose la inactivación de aproximadamente 2 ciclos logarítmicos tras 20 min de tratamiento a 55 oC. Del mismo modo, se observa que la inactivación de las cepas E. coli BW25113 ∆cspA, E. coli BW25113 ∆hscA y E. coli BW25113 ∆recA siguió también un curso exponencial, no detectándose diferencias significativas (p ≤ 0,05) entre la curvas de supervivencia, y por tanto, entre la termorresistencia a 55 oC de los tres mutantes y la cepa parental. Por el contrario, la termorresistencia a 55 oC de las cepas E. coli BW25113 ∆clpB y E. coli BW25113 ∆cpxA fue significativamente menor (p > 0,05) a la de la cepa parental. Así, tras 20 min de tratamiento a 55 oC se logró la inactivación de aproximadamente 4 ciclos logarítmicos de la cepa E. coli BW25113 ∆cpxA y más de 5 ciclos logarítmicos (superándose el límite de detección) de la cepa E. coli BW25113 ∆clpB. La mayor sensibilidad de estas dos 32 mayor termosensibilidad de la membrana plasmática frente al calor, y confirma el papel de la expresión del gen clpB en la termorresistencia microbiana, concretamente sobre la estabilidad de la membrana citoplasmática. De este modo, la chaperona ClpB implicada en la supresión y reversión de la agregación de proteínas desnaturalizadas (Mogk et al 2003), intervendría no sólo facilitando la reparación de los daños causados por el calor en las envolturas celulares, sino en la generación de unas envolturas más resistentes a la acción de este agente inactivador. Por el contrario, los resultados obtenidos sobre E. coli BW25113 ∆cpxA resultaron algo más complejos dado que, a diferencia del comportamiento de las otras cinco cepas de E. coli, los recuentos obtenidos en medio selectivo LA-sales biliares fueron mayores a los obtenidos en medio selectivo LA-NaCl, lo que significa que el porcentaje de células dañadas en su membrana externa en esta cepa fue menor que el de células dañadas en su membrana plasmática. Con objeto de comprobar si las diferencias en termorresistencia entre la cepa parental y las cepas mutantes E. coli BW25113 ∆clpB y E. coli BW25113 ∆cpxA están relacionadas con una menor resistencia intrínseca de sus envolturas celulares y/o fenómenos de reparación celular, a continuación se han representado las gráficas de supervivencia de la cepa parental y las 2 cepas mutantes obtenidas en LA-sales biliares (Figura 4.6) y LA-NaCl (Figura 4.7). 0 5 10 15 20 25 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 Tiempo (min) log10 Nt/N0 Figura 4.6.Curvas de supervivencia a 55 0C de las cepas E. coli BW25113 ( ), E. coli BW25113 ∆clpB ( ) y E. coli BW25113 ∆cpxA ( ) tratadas en tampón McIlvaine de pH 7,0, y recuperadas en medio selectivo con NaCl. 33 0 5 10 15 20 25 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 Tiempo (min) log10 Nt/N0 Figura 4.7. Curvas de supervivencia a 55 0C de las cepas E. coli BW25113 ( ), E. coli BW25113 ∆clpB ( ) y E. coli BW25113 ∆cpxA ( ) tratadas en tampón McIlvaine de pH 7,0, y recuperadas en medio selectivo sales biliares. La falta de coincidencia entre las curvas de supervivencia de la cepa parental y las cepas mutantes obtenidas en el medio selectivo con NaCl (Figura 4.6) indicaría que la resistencia intrínseca de la membrana plasmática de ambas cepas mutantes era menor que la de la cepa parental al verse afectadas un mayor número de supervivientes, lo que sugiere que la expresión del gen cpxA, al igual que la del gen clpB, podría estar relacionada con la estabilización de esta envoltura celular frente a los tratamientos térmicos. Además, el mayor porcentaje de células dañadas en la membrana plasmática para un mismo tiempo de tratamiento entre la cepa parental (Figura 4.3) y las cepas E. coli BW25113 ∆clpB (Figura 4.5.B) y E. coli BW25113 ∆cpxA (Figura 4.3.F), también indicaría que la expresión de estos dos genes no solo está relacionada con la resistencia intrínseca de esta estructura, sino también con los mecanismos de reparación de los daños ocasionados sobre dicha envoltura celular. De este modo, la deleción de los genes cpxA, y especialmente la del gen clpB, podría estar relacionada con una menor capacidad de reparación de daños subletales sobre la membrana plasmática. La representación de las curvas de supervivencia de la cepa parental y las dos mutantes en medio selectivo con sales biliares (Figura 4.7) permite evidenciar que, al menos durante los primeros minutos de tratamiento, la resistencia intrínseca de la membrana externa de la cepa mutante E. coli BW25113 ∆clpB es similar a la de la cepa 34 parental; no obstante, tras 8 min de tratamiento se observa un mayor número de células de la cepa mutante afectadas, indicando que la expresión del gen clpB también podría estar relacionado con la mayor resistencia intrínseca de la membrana externa y/o una mayor capacidad de reparación de los daños ocasionados por el tratamiento térmico. Por el contrario, esta figura permite comprobar que los recuentos obtenidos en el medio selectivo con sales biliares para la cepa E. coli BW25113 ∆cpxA son mayores que los obtenidos para la cepa parental. Es decir, en este caso, hay un menor número de células de la cepa mutante afectadas en su membrana externa por el tratamiento térmico. Estos resultados sugieren que la deleción del gen cpxA supondría un aumento de la termorresistencia de la membrana externa de E. coli, lo que no resulta fácil de explicar, y requeriría de un estudio más amplio. Es decir, el incremento de resistencia intrínseca en la membrana citoplasmática debido a la acción de la chaperona CpxA, podría conllevar a una disminución de la resistencia de la membrana externa. Así, de confirmarse estos resultados en otras especies o cepas, se podría concluir que esta mutación es capaz de incrementar sensiblemente la resistencia al calor, lo que podría tener cierta relevancia, por ejemplo, en el desarrollo de procesos combinados basados en la aplicación simultánea de calor y antimicrobianos (Somolinos et al., 2010), para los que la mayor estabilidad de la membrana externa impediría su acción al dificultar su acceso al interior celular. 4.4. Construcción de mutantes E. coli MG1655 ∆clpB y E. coli MG1655 ∆cpxA. El trabajo exploratorio sobre la implicación de los genes cspA, hscA, recA, clpB y cpxA en la termorresistencia de E. coli BW25113 demostró la relevancia de la expresión de clpB y cpxA en la resistencia intrínseca y los mecanismos de reparación de los daños ocasionados sobre las envolturas celulares. Estos resultados pueden ser de gran relevancia para el conocimiento de la respuesta al estrés de E. coli. Sin embargo, la cepa estudiada E. coli BW25113 es una cepa modificada para facilitar los trabajos de mutagénesis dirigida. Por ello, es necesario seleccionar una cepa de referencia más aceptada por la comunidad científica internacional para la elaboración de estudios de fisiología microbiana con el fin último de contribuir al desarrollo del conocimiento del 35 comportamiento microbiano ante situaciones de estrés y poder comparar estos datos con los publicados utilizando cepas de referencia. De este modo, para realizar una investigación con mayor profundidad científica, se decidió la creación de los mutantes deletéreos clpB y cpxA en la cepa E. coli MG1655, sobre la que, desde su secuenciación por Blattner et al. (1997), se han realizado algunos de los estudios más relevantes del campo de la fisiología microbiana. En este estudio se utilizó una técnica de mutagénesis dirigida (Hutchison et al., 1978) para delecionar la secuencia de los genes clpB y cpxA. Esta técnica consiste en introducir una construcción con la mutación en el genoma bacteriano a mutar. Nuestra colección Keio dispone de dichas construcciones incorporadas en el genoma de E. coli. De este modo, no es necesario que hagamos de nuevo esas construcciones, simplemente tenemos que "moverlas" de un genoma a otro. Con ese objetivo, utilizamos la transducción con fagos, que contienen fragmentos de la secuencia genómica del E. coli inicial, con las construcciones incluidas, que transferiremos a nuestro E. coli deseado. Este procedimiento permite crear mutantes en diferentes cepas de E. coli de una forma rápida, económica y precisa. Del mismo modo, la conservación de los fagos con diferentes construcciones nos permitirán en un futuro crear dobles o triples mutantes en diferentes genes para, de este modo, poder realizar análisis más detallados y dirigidos de regulación y relación génica. No obstante, en las técnicas del DNA recombinante usadas en la mutagénesis dirigida con la cepa E. coli BW25113 se utilizó como marcador un gen de resistencia a la kanamicina, con objeto de detectar de una forma rápida, sencilla y económica las bacterias que han resultado mutadas. A pesar de su utilidad, una vez detectados y aislados los organismos mutantes, la presencia de estos marcadores en la secuencia genómica no es necesaria, pudiendo llegar a ser perjudicial en los estudios microbiológicos, ya que estos genes pueden intervenir en diferentes procesos del metabolismo y fisiología microbianas. Por tanto, su eliminación resulta de gran importancia para realizar estudios fiables sobre este microorganismo. De este modo, una vez realizada la transformación, resulta necesario eliminar el marcador de 36 resistencia antibiótica, con el objetivo de obtener una cepa cuya secuencia genómica sea lo más parecida posible a la secuencia original. El uso de la cepa de referencia de E. coli MG1655, en lugar de la cepa BW25113 (colección Keio), nos permite trabajar con la cepa de referencia de E. coli en los estudios de fisiología bacteriana. Al ser una cepa cuya secuencia genómica es de acceso público, se permiten posteriores modificaciones genéticas y estudios transcripcionales y traduccionales. En este sentido, al trabajar con esta cepa podremos comparar directamente nuestros resultados con los de otros autores sin añadir el factor de variación de la cepa y nos permitirá el uso de herramientas bioinformáticas gratuitas como E. coli Gene Expression Database (http://genexpdb.ou.edu/main/) para el estudio de la expresión génica y el transcriptoma en situaciones de estrés. 4.4.1 Transducción con el fago P1. En el proceso de la transducción se usaron como cepas donantes dos mutantes deletéreos de Escherichia coli pertenecientes a la colección Keio, E.coli BW25113 ∆clpB (JW2573) y E.coli BW25113 ∆cpxA (JW3525). Estos mutantes se seleccionaron para esta segunda parte de la investigación debido a que fueron los que presentaron diferencias más significativas con respecto a la cepa parental en los estudios de termorresistencia. Como cepa receptora de la transducción se seleccionó E. coli MG1655, cepa de referencia de E. coli en los estudios de fisiología bacteriana. El primer paso para lograr la transferencia de material genético se centra en la infección de las cepas donantes en fase estacionaria con el bacteriófago P1 .Tras 4 horas de incubación a 37 °C se obtuvo el lisado para ambas cepas donantes. En la Figura 4.8 se muestran los tubos preparados como control negativo (B) y (D), a los cuales no se les añadieron bacteriófagos, en los que no se produjo lisis bacteriana y por tanto, no se detectó un descenso de la turbidez. En el caso de los tubos (A) y (C), los cuales se inocularon fagos P1 para la infección de las células 37 donantes, se observa claramente un descenso de la turbidez como consecuencia de la lisis bacteriana. Figura 4.8. Obtención de los lisados de los bacteriófagos P1a partir de las cepas donantes E. coli BW25113 ∆cpxA (A), y ∆clpB (C). La Figura incluye los controles negativos (B) y (D) sin adición de bacteriófagos P1 de (A) y (C) respectivamente. En el siguiente paso de la transducción, las células receptoras E.coli MG1655, se incubaron junto con el lisado de bacteriófagos obtenidos a partir de las cepas donantes durante 4 h a 37oC ± 1 ºC en agitación. La Figura 4.9.muestra los tubos (A) y (C) sin turbidez debido a la acción de los bacteriófagos P1. Además, se muestran los controles negativos (B) y (D) en los que la turbidez aumentó como consecuencia del crecimiento bacteriano en ausencia de bacteriófagos. 38 Figura 4.9. Transducción con bacteriófago P1. (A) Transducción de E. coli MG1655 con P1 obtenido tras lisado de E. coli BW25113 ∆cpxA, (C) Transducción de E. coli MG1655 con P1 obtenido tras lisado de E. coli BW25113 ∆clpB. (B) y (D) fueron utilizados como controles negativos (sin adición de bacteriófagos P1) de (A) y (C) respectivamente. A partir de las suspensiones bacterianas obtenidas de los tubos (A) y (C), se sembraron alícuotas de 100 μL en placas de LA con kanamicina (25 μg/mL), y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Transcurrido este tiempo, se aislaron colonias para su cultivo en nuevas placas con kanamicina y así verificar que las células de E. coli MG1655 habían incorporado el fragmento de DNA correspondiente a la deleción provocada por la inserción del gen de resistencia al antibiótico. De este modo, confirmamos que habíamos obtenido las nuevas cepas E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) (Figura 4.10). A B C 39 4.4.2. Eliminación del marcador de la kanamicina. En este proceso denominado curación, se eliminó el gen de resistencia a la kanamicina para evitar su interferencia en futuras evaluaciones sobre la resistencia bacteriana de las nuevas cepas. Para ello, en primer lugar, se realizó un proceso de transformación con el plásmido pCP20. El plásmido incorporado a las cepas E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) presenta un gen de resistencia a la ampicilina y al cloranfenicol, así como un gen que permite la producción de una FLP recombinasa dentro del mutante. Esta recombinasa permite la recombinación entre los fragmentos FRT y la expulsión del marcador de resistencia a la kanamicina (Figura 4.11). Figura 4.11. Reacción catalizada por la FLP recombinasa en la que se recombinan las dos secuencias de reconocimiento de flipasa (fragmentos FRT) que flanquean el gen a eliminar (Baba et al. 2006). Tras la transformación de E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) con el plásmido pCP20 se realizaron siembras en placas de LA con ampicilina (100 μg/mL) para confirmar la incorporación del plásmido en las bacterias (Figura 4.12). Figura 4.10. Placas de Luria Agar con kanamicina (25 μg/mL) sembradas con las cepas E. coli MG1655 (A), E. coliMG1655 ∆cpxA (+kanR) (B), y E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) (C). 40 Por último, se activó la expresión de la FLP recombinasa del plásmido pCP20 sensible a la temperatura sembrando colonias de E. coli MG1655 ∆clpB (+kanR) y E. coli MG1655 ∆cpxA (+kanR) transformadas con este plásmido en placas LA a 43oC durante 24 h. Tras este paso, se comprobó la pérdida de todas las resistencias antibióticas sembrando en medios con antibióticos. Estas cepas se denominaron finalmente E. coli y E. coli MG1655 ∆cpxA (Figura 4.13) y MG1655 ∆clpB (Figura 4.14). Figura 4.12.Placas de Luria Agar con ampicilina (100 μg/mL) sembradas con las cepas E. coli MG1655 (A), E. coliMG1655 ∆cpxA (+AmpR) (B), y E. coli MG1655 ∆clpB (+AmpR) (C). A B C C.3. C.1. C.2. B.1. B.2. B.3. Figura 4.14.Cepa E. coli MG1655 ∆clpB en medio Luria Agar (C.1), Luria Agar con ampicilina (100 μg/mL) (C.2),y Luria Agar con kanamicina(100 μg/mL) (C.3). Figura 4.13.Cepa E. coli MG1655 ∆cpxA en medio Luria Agar (B.1), Luria Agar con ampicilina (100 μg/mL) (B.2),y Luria Agar con kanamicina(100 μg/mL) (B.3) 41 Como último paso de esta investigación, debería confirmarse con PCR la deleción del gen deseado y la eliminación del gen de resistencia de la kanamicina. Una vez verificada que la deleción de los genes clpB y cpxA se había realizado correctamente, se deberán realizar los correspondientes experimentos de termorresistencia sobre estas cepas mutantes y sobre la cepa parental E. coli MG1655 (actividad para la que ya no se ha dispuesto de tiempo suficiente para su finalización) En resumen, la transformación mediante el uso del bacteriófago P1 nos permitió crear mutantes en la cepa de referencia MG1655 de una forma rápida y económica. La transformación de los mutantes así conseguidos con el plásmido pCP20 permitió la eliminación del gen de resistencia a la kanamicina. De esta manera hemos obtenido los mutantes “limpios” en la cepa MG1655, sobre los que deberán verificarse los resultados obtenidos en la cepa BW25113, descartando la influencia del cassette de kanamicina y de las modificaciones realizadas sobre la cepa BW25113 utilizada para la construcción de la cepa Keio. Además, estos mutantes en la cepa MG1655 nos permitirán realizar futuros trabajos de fisiología microbiana, así como utilizar los fagos con estas construcciones para crear dobles o triples mutantes destinados a estudios más detallados del papel de estos genes y su interacción con otros genes.