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1 TRABAJO DE FIN DE GRADO CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Curso 2012-2013 Desarrollo de una técnica de ELISA en placa, basada en la determinación de las proteínas alergénicas Ara h1 y Ara h2, y su optimización para la detección de cacahuete en chocolate Autora: Elia Lucea Ojeda Tecnología de los Alimentos Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza Directora: Dra. Mª Dolores Pérez Cabrejas 2 Datos personales Lucea Ojeda, Elia 17767079-Q Paseo de la Ribera nº 6 8ºA Teléfono: 685388258 Elia_zgz20[email protected] 3 ÍNDICE Resumen ........................................................................................................................... 4 Summary ........................................................................................................................... 5 Introducción ...................................................................................................................... 6 Objetivos ......................................................................................................................... 14 Materiales y Métodos ..................................................................................................... 15 Resultados y discusión ................................................................................................... 21 Conclusiones ................................................................................................................... 35 Conclusions .................................................................................................................... 36 Identificación de las aportaciones que, en materia de aprendizaje, han supuesto la realización de esta asignatura ......................................................................................... 37 Evaluación de la asignatura y sugerencias de mejora .................................................... 38 Bibliografía ..................................................................................................................... 39 4 Resumen El cacahuete es un alimento que se consume entero, tostado o frito, o se usa como ingrediente en la elaboración de numerosos alimentos tales como chocolates, turrones, galletas, golosinas, etc. El cacahuete también es el causante de un 15-20% de las alergias alimentarias en los países europeos, que pueden tener consecuencias graves, ya que en un 20% de los casos da lugar a una reacción anafiláctica. El consumidor puede estar expuesto de forma inadvertida a los alérgenos del cacahuete cuando consume alimentos que han sufrido una contaminación cruzada durante su procesado. Por todo ello, es necesario disponer de técnicas específicas y sensibles para su detección en los alimentos. Es un hecho conocido que los taninos y otros polifenoles presentes en el chocolate enmascaran la detección de las proteínas alergénicas del cacahuete al interaccionar con las proteínas diana y/o con los anticuerpos usados en los inmunoensayos. En este trabajo, se ha estudiado el efecto que diferentes bloqueantes tales como leche en polvo, gelatina y polivinilpolipirrolidona, adicionados al medio de extracción en distintas proporciones, tienen en la detección de las proteínas alergénicas del cacahuete en muestras de chocolate. Para ello, previamente se han desarrollado técnicas de ELISA de tipo competitivo indirecto basadas en la determinación de las proteínas alergénicas Ara h1 y Ara h2, que han mostrado ser lineales en un rango de concentración entre 50 ng/ml y 10 µg/ml. Los resultados obtenidos indican que la adición de gelatina y de leche en polvo disminuye las interferencias producidas por el chocolate, obteniéndose los mejores resultados con porcentajes del 5% y del 1%, respectivamente. En esas condiciones, las técnicas de ELISA desarrolladas permiten detectar la adición de un 0,05% de cacahuete en chocolate, obteniéndose mayores diferencias de concentración entre las muestras con un menor contenido de cacahuete y el blanco al usar la gelatina como bloqueante. 5 Summary Peanut is consumed raw, roasted or fried, or used as an ingredient in the preparation of many foods such as chocolates, candies, cookies, etc. Peanut is also responsible for 15-20% of food allergies in European countries, which may have serious consequences as around 20% of cases result in an anaphylactic reaction. The consumer may inadvertently be exposed to peanut allergens when consuming foods that have been cross-contaminated during processing. Therefore, it is necessary to develop sensitive and specific techniques to detect peanut in food. It is known that the tannins and other polyphenols present in chocolate could mask the target proteins and/or the antibodies used in immunoassays. In this work, we have studied the effect of different blocking agents such as milk powder, gelatin and polyvinylpolypyrrolidone, added to the extraction medium in different proportions, in the detection of allergenic peanut proteins in chocolate. For this purpose, previously we developed indirect competitive ELISA techniques based on the determination of the allergenic proteins Ara h1 and Ara h2, which have shown to be linear over a range of concentrations between 50 ng/ml and 10 µg/ml. Results obtained indicated that the addition of gelatin or milk powder to the extraction buffer decreases interferences of chocolate samples in the immunoassays, obtaining the best results when using percentages of 5% and 1%, respectively. Under those conditions, ELISA techniques developed could detect the addition of 0.05% peanut in chocolate, obtaining higher differences in the concentration between the sample with a lower content of peanut and the blank when using gelatin as the blocking agent. 6 INTRODUCCIÓN 1. Alergia alimentaria La alergia alimentaria se define como el conjunto de reacciones adversas, de patogenia inmunológica comprobada, debidas a la ingesta, contacto o inhalación de alimentos (Bush y Hefle, 1996). Las reacciones alérgicas a los alimentos se deben diferenciar de las reacciones de intolerancia y de las intoxicaciones. Estas dos últimas se caracterizan por ser dependientes de la dosis, es decir, a mayor cantidad de alimento ingerido, mayor es la intensidad de las manifestaciones clínicas. Sin embargo, esta relación dosis-respuesta no existe en las reacciones alérgicas, en las que una cantidad muy pequeña, puede desencadenar una respuesta clínica severa. Además, las intoxicaciones pueden afectar a cualquier individuo si ingiere el alimento en cantidad suficiente. Sin embargo, las reacciones de alergia e intolerancia tras la ingestión de un alimento están exclusivamente relacionadas con las peculiaridades de cada individuo, de tal forma que esa misma dosis puede ser perfectamente tolerada por otro individuo (Esteban y Polanco, 2002). La alergia alimentaria incluye las reacciones mediadas por IgE, en las que el individuo presenta un título alto de anticuerpos de la clase IgE frente al alimento y las reacciones no mediadas por IgE, en las que existe un aumento de anticuerpos específicos de otras clases de inmunoglobulinas, complejos inmunes o respuestas de inmunidad mediada por células. En algunos casos, puede darse una participación mixta, mediada por IgE y por células (Strobel et al., 2001). La reacción alérgica más conocida es la mediada por IgE, en la que estas inmunoglobulinas se fijan sobre la superficie de determinadas células, como mastocitos y basófilos. Cuando el alérgeno se une a las IgE fijadas a dichas células, se producen una serie de reacciones celulares que conducen a la liberación de sustancias activas, como la histamina, las prostanglandinas y los leucotrienos. La acción fundamental de estas sustancias tiene lugar a nivel de los vasos sanguíneos, la musculatura lisa y algunas glándulas, produciendo vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar, espasmo de la musculatura lisa e hipersecreción glandular (Martín Esteban y Polanco, 2002). En la actualidad, se estima que las alergias a alimentos afectan a un 3-4% de la población adulta y a un 7-8% de la infantil, por lo que están consideradas un serio problema de seguridad alimentaria (Sampson, 2004). Estas cifras equivalen a unos dos millones de individuos afectados en España, datos que ponen de manifiesto la 7 importancia del problema en nuestra sociedad actual. La prevalencia de las alergias alimentarias está experimentando un gran aumento en los últimos años, y se estima que lo hará aún más en las próximas décadas (Sicherer et al., 2003). Este aumento se asocia en parte a los cambios en los hábitos alimentarios de la población y a la mayor complejidad de los ingredientes y de los procesos tecnológicos utilizados en la industria alimentaria (Monaci et al., 2006). En las alergias mediadas por IgE, la aparición de los síntomas clínicos suelen tener lugar tras una o dos horas de la ingesta del alimento, por lo que se denominan alergias de tipo inmediato. Los síntomas que suelen aparecer incluyen alteraciones de la piel, del tracto gastrointestinal y de las vías respiratorias. Los síntomas cutáneos más comunes son urticaria aguda, angiodema, o una erupción eritematosa pruriginosa. Los síntomas grastrointestinales incluyen vómitos, dolor abdominal y diarrea. Los síntomas respiratorios pueden afectar tanto a las vías respiratorias superiores como inferiores siendo el edema laríngeo y la tos repetitiva los más comunes. En los pacientes que presentan una elevada sensibilidad a los alimentos (1-2% de los individuos alérgicos), la alergia puede llegar a provocar una reacción anafiláctica, que sin un tratamiento sintomático adecuado, puede conducir a la muerte. Las alergias no mediadas por IgE suelen aparecer tras varias horas desde la ingesta del alimento y dan lugar a síntomas gastrointestinales como enteropatías, colitis y lesiones de la mucosa intestinal (Bousoiio, 1999). El diagnóstico de la alergia de tipo inmediato se puede realizar de dos maneras, mediante un diagnóstico clínico, que incluye un historial clínico y un ensayo de provocación, o mediante un diagnóstico patogénico determinando la presencia de IgE específicas para el alimento seleccionado (Esteban et al., 1999). El único tratamiento eficaz comprobado de la alergia alimentaria es evitar la ingesta del alimento sensibilizante, mediante una dieta de eliminación estricta. En las alergias a determinados alimentos, como la soja, la leche o los huevos, las dietas de eliminación seguidas durante uno o dos años, suelen conducir al desarrollo de una tolerancia clínica en aproximadamente un tercio de los casos. Sin embargo, en las alergias a los frutos secos, al pescado o al marisco, la intolerancia clínica suele persistir durante muchos años, o incluso, para siempre (Sampson y McCaskill, 1985; Bock y Atkins, 1990). En situaciones de riesgo, se utilizan fármacos, fundamentalmente 8 antihistamínicos, -adrenérgicos y corticoesteroides, como tratamiento para paliar los síntomas, pero éstos nunca deben sustituir a las medidas preventivas (Taylor, 1986). 2. Alérgenos alimentarios Los alimentos capaces de producir una alergia alimentaria ascienden a un número mayor de 160, si bien más del 95% de las reacciones alérgicas son producidas por ocho alimentos: huevo, cacahuete, leche, frutos secos, soja, pescados, mariscos y trigo (FAO, 1995). Los alergenos alimentarios son proteínas o glicoproteínas con un peso molecular entre 10 y 70 kDa. La mayoría de los alérgenos son estables al calor, en medio ácido y a la acción de las proteasas por lo que suelen ser resistentes al procesado habitual que se lleva a cabo en la industria alimentaria (Taylor y Lehrer, 1996). Los alérgenos alimentarios pueden ser de origen vegetal o animal. La mayor parte de los alérgenos vegetales estan incluidos en tres superfamilias; cupinas, prolaminas y papaínas y se encuentran en frutos secos, leguminosas y frutas, entre otras. Los alérgenos de origen animal pertenecen a un número más limitado de familias y se encuentran principalmente en pescados, crustáceos y moluscos, en el huevo y en la leche (Taylor y Lehrer, 1996). En general, los alimentos suelen contener varias proteínas alergénicas y según su prevalencia se diferencian en alérgenos mayores, cuando un 50% o más de los pacientes alérgicos a ese alimento elaboran IgE específicas, y en alérgenos menores cuando menos del 50% de los pacientes alérgicos elaboran IgE específicas frente al mismo (King et al., 1994). La nomenclatura para denominar a los alérgenos incluye cuatro letras, correspondiendo las tres primeras al género y la cuarta a la especie, y un número que indica el orden en el que se ha identificado cada alérgeno dentro de una especie (Hoffman et al., 1994). La legislación actual sobre etiquetado de alimentos alergénicos tiene como finalidad obligar a mencionar en la etiqueta todos los ingredientes utilizados en su elaboración, y de forma concreta y sin excepción, de aquellos que provocan alergias e intolerancias y que constituyen un riesgo para la salud de las personas sensibilizadas. En el año 2003, se publicó la primera Directiva sobre alimentos alergénicos (Directiva 9 2003/89/CE del Parlamento y del Consejo Europeos (Real Decreto 2220/2004). Posteriormente, se han hecho diversas modificaciones (Directiva 2005/26/CE, Directiva 2006/142/CE, Directiva 2007/68/CE, 65.) en base a las nuevas aportaciones científicas introducidas en los últimos años. Los alérgenos alimentarios reconocidos en la última normativa son: 1. Cereales que contengan gluten (es decir, trigo, centeno, cebada, avena, espelta, kamut o sus variedades híbridas) y productos derivados. 2. Crustáceos y productos a base de crustáceos. 3. Huevos y productos a base de huevo. 4. Pescado y productos a base de pescado. 5. Cacahuetes y productos a base de cacahuetes. 6. Soja y productos a base de soja. 7. Leche y sus derivados (incluida la lactosa). 8. Frutos de cáscara, es decir, almendras, avellanas, nueces, anacardos pacanas castañas de Pará, alfóncigos, macadamias o nueces de Australia y productos derivados. 9. Apio y productos derivados. 10. Mostaza y productos derivados. 11. Granos de sésamo y productos a base de granos de sésamo. 12. Dióxido de azufre y sulfitos en concentraciones superiores a 10 mg/kg o 10 mg/l expresado como SO2. 13. Altramuces y productos a base de altramuces. 14. Moluscos y productos a base de moluscos. Sin embargo, aunque en la etiqueta de un alimento se incluyan de forma adecuada todos los ingredientes, existe la posibilidad de que contenga una pequeña cantidad de un componente alergénico sin estar incluido, debido a la presencia de los denominados “alérgenos ocultos”. Se consideran “alérgenos ocultos” aquellos presentes en un producto alimentario, normalmente en muy baja concentración, que pasan de forma desapercibida para el consumidor e incluso para el productor, y cuya presencia puede deberse a errores en la formulación, a deficiencias en la limpieza de las líneas de producción o a problemas de contaminación cruzada durante el transporte o el procesado, entre otros. Por ello, algunos fabricantes utilizan un etiquetado preventivo 16 2.2. Obtención de antisueros En este trabajo se han obtenido antisueros en conejos frente a las proteínas Ara h1 y Ara h2, según el siguiente protocolo. A cada conejo se le inyectó por vía subcutánea 1 mg de proteína disuelta en 0,5 ml de tampón fosfato potásico 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4 (SSF), y emulsionados con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Transcurrido un mes, se repitió la misma inoculación, pero utilizando adyuvante incompleto de Freund. A los 15 días se extrajo una pequeña cantidad de sangre mediante punción en la vena auricular externa y se determinó la presencia de anticuerpos por inmunodotting y western-blotting como se describe en los apartados 2.3 y 2.5. Si resultaba positiva, se extraía sangre y si era negativa se repetía la inoculación de la proteína con adyuvante incompleto. Para las extracciones de sangre sucesivas, se dejó recuperar a los animales durante 30 días, repitiendo las inoculaciones con adyuvante incompleto a los 15 días de cada extracción. La sangre obtenida se dejó coagular espontáneamente a temperatura ambiente y se mantuvo una noche a 4 ºC, tras lo cual se centrifugó a 500 g durante 15 minutos, y posteriormente se congeló en alícuotas a –20°C hasta su uso. 2.3. Inmunodotting Las muestras (1 μL) se aplicaron sobre una hoja de nitrocelulosa y se dejaron secar. Posteriormente, la hoja de nitrocelulosa se incubó con una solución de ovoalbúmina al 5% (p/v) en SSF, a temperatura ambiente durante 2 horas en agitación, con el objeto de saturar todos los puntos de unión de proteínas de la nitrocelulosa. A continuación, la hoja de nitrocelulosa se incubó con una dilución apropiada del antisuero correspondiente en ovoalbúmina al 3% (p/v) en SSF, a temperatura ambiente durante 2 horas en agitación suave. La hoja se lavó 5 veces con SSF y se incubó con IgG anti-IgG de conejo conjugadas con peroxidasa, diluidas en ovoalbúmina al 3% (p/v), en SSF a temperatura ambiente durante 2 horas. La hoja se lavó como en la etapa anterior, y para el revelado se incubó con 6 mg de 4-cloro-1-naftol disuelto en 2 ml de metanol, 8 ml de SSF y 10 μl de H2O2 al 30%. 17 2.4. SDS-Electroforesis Las muestras a analizar se diluyeron hasta una concentración de 1-2 mg/ml con tampón Tris 10 mM, pH 8 que contenía EDTA 1mM y bromoferol. Posteriormente, a 90 μL de muestra, se le añadieron 10 μL de SDS al 25% (p/v, en agua destilada) y se mantuvieron en un baño a 100°C durante 5 minutos. Las muestras se aplicaron en geles comerciales de acrilamida de 20%. Las electroforesis se realizaron en un Phast System (Pharmacia, Uppsala, Suecia) siguiendo las recomendaciones que el fabricante establece para cada tipo de geles. Una vez finalizada la electroforesis, las bandas de proteínas se tiñeron con el colorante Phast Gel Blue R. Esta solucion colorante contenía 0,65g de Azul de Coomasie R, 300 ml de metanol, 100 ml de ácido acético y 500 ml de agua destilada. Los geles se cubrieron totalmente con el colorante y se pusieron en agitación durante una hora, después se retiró el colorante y se añadió una mezcla de decolorante para aclarar los geles. El decolorante se preparó con 250 ml de metanol, 80 ml de ácido acético, 20 ml de glicerina y 650 ml de agua destilada. Los geles permanecieron en la mezcla de decolorante hasta que quedaron incoloras las zonas del gel donde no había bandas de proteína. 2.5. Western-blotting Una vez finalizada la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando un equipo de transferencia MilliBlot-SDE Transfer System (Millipore, Bedford, MA, EEUU). Para ello, se recortaron seis láminas de papel de filtro Whatmann 3MM y una membrana de nitrocelulosa de similares dimensiones al gel de electroforesis. Cada uno de los papeles de filtro permaneció sumergido en uno de los siguientes tampones: un papel en tampón Tris 0,3 M, 10% metanol, pH 10,4 (ánodo I), dos papeles en tampón Tris 25 mM, 10% metanol, pH 10,4 (ánodo II) y tres papeles en tampón Tris 25 mM, glicina 4 mM, 20% metanol, pH 10,4 (cátodo). La membrana de nitrocelulosa se humedeció en agua destilada. En el sistema de transfer se colocaron encima de la unidad del ánodo y en este orden el papel de filtro del ánodo I, los del ánodo II, la membrana de nitrocelulosa, el gel de electroforesis y los papeles de filtro del cátodo. Después, se colocó la unidad del cátodo y la transferencia se realizó utilizando una intensidad de 2 mA/cm2 durante 45 minutos. Una vez transferidas las proteínas a la membrana, la nitrocelulosa se incubo como se ha indicado en el caso del inmunodotting. 18 2.6.Técnica de ELISA no competitivo indirecto Esta técnica se ha usado para titular los antisueros. Para ello, las placas se tapizaron con 120 μl/pocillo de una solución de proteína Ara h1 o Ara h2 (5 μg/ml) en tampón carbonato sódico 0,01 M, pH 9,6. Tras la incubación a 4°C durante toda la noche, las placas se lavaron 5 veces con 300 μl/pocillo de PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBST), y se incubaron con 300 μl/pocillo de una solución de ovoalbúmina al 2% (p/v), en tampón PBS a temperatura ambiente durante 2 horas, con el objeto de saturar todos los puntos de unión de proteínas. Posteriormente, las placas se lavaron 5 veces con PBST y después, las placas se incubaron con 100 μl/pocillo de diferentes diluciones del antisuero correspondiente, a 37°C durante 1 hora. Tras 5 lavados con PBST, se añadieron 100 μl/pocillo de una dilución adecuada de IgG de cabra anti-IgG de conejo marcadas con peroxidasa en tampón PBS, que se mantuvieron a 37°C durante 1 hora, y se lavaron de nuevo 5 veces con PBST. Por último, se añadieron 100 μl/pocillo de una solución del sustrato comercial que contenía TMB, y tras 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 μl/pocillo de H2SO4 2M. La absorbancia de los pocillos se midió a 450 nm en un lector de placas Multiskan MS (Labsystem, Helsinki, Finlandia). 2.7. Preparación y extracción de las muestras de chocolate con cacahuete Tras eliminar la cáscara y pelar los cacahuetes tostados que habían estado almacenados en atmósfera protectora, se trituraron con una picadora, hasta obtener una pasta fina y homogénea. Se pesaron 3 g del chocolate negro puro en polvo desengrasado y una cantidad de cacahuete triturado para obtener porcentajes de cacahuete en chocolate de 1%, 0,5%, 0,1% y 0,05% (p/p). Después, se añadieron 30 ml de tampón borato 0,01M, pH 8.0 y la mezcla se incubó a 60ºC durante 30 minutos en agitación. A continuación, las muestras se clarificaron por centrifugación a 3.000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras retirar la fase lipídica superior con una espátula, se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 10.000 g a 4ºC durante 10 minutos. En el caso de no ser analizado inmediatamente, este sobrenadante se congeló a -20°C hasta su uso. La extracción de las muestras se realizó también con el tampón borato conteniendo como bloqueantes distintos porcentajes de gelatina (0,5-8%, p/p) o leche en polvo (15%, p/p). 19 Otro lote de muestras se extrajo con tampón que contenía PVPP. En este lote, previamente las muestras se incubaron con hexano en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugaron a 3000 g durante 10 minutos. Tras eliminar la fase orgánica, se añadió a la fase acuosa PVPP para obtener una concentración final de 0,11nM. Tras 30 minutos de incubación a 60ºC, las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante. 2.8. Preparación de estándares Los estándares de las proteínas Ara h1 y Ara h2 usados en las técnicas de ELISA, se prepararon en tampón borato 0,01M, pH 8 que contenía BSA 0,5% y 0,05% de timerosal. Para cada proteína, los estándares se prepararon a una concentración 50 veces mayor a la usada en los ensayos, y se guardaron en alícuotas congeladas hasta su uso. Para la realización del ensayo, los estándares se diluyeron 1/50 en PBS sin o con agentes bloqueantes. 2.9. Técnica de ELISA competitivo indirecto Las placas se tapizaron cómo se ha indicado en la sección 2.6. Posteriormente, se lavaron 5 veces con PBST y se incubaron con 50 μl/pocillo de una dilución adecuada del antisuero correspondiente y 50 μl/pocillo de las muestras o estándares, a 37°C durante 1 hora. Tras 5 lavados con PBST, se añadieron 100 μl/pocillo de una dilución adecuada de IgG de cabra anti-IgG de conejo marcadas con peroxidasa en tampón PBS, que se mantuvieron a 37°C durante 1 hora. Finalmente se añadieron 100 μl/pocillo de una solución del sustrato comercial que contenía TMB, y tras 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 μl/pocillo de H2SO4 2M y la absorbancia de los pocillos se midió a 450 nm. 20 Figura 1: Esquema de la técnica de ELISA de tipo competitivo indirecto. S S S S 1º: Tapizado de pocillos con la proteína diana 2º:Incubación con el estándar o la muestra y con el suero antiproteína diana 3º: Incubación con el conjugado Sustrato de la peroxidasa S Proteína diana Anticuerpo anti-proteína diana Conjugado: IgG antiIgG de conejo conjugados con peroxidasa 4º: Incubación con el sustrato de la peroxidasa S S S SS S S S 1º: Tapizado de pocillos con la proteína diana 2º:Incubación con el estándar o la muestra y con el suero antiproteína diana 3º: Incubación con el conjugado Sustrato de la peroxidasa S Proteína diana Anticuerpo anti-proteína diana Conjugado: IgG antiIgG de conejo conjugados con peroxidasa 4º: Incubación con el sustrato de la peroxidasa 21 Resultados y discusión 1. Determinación de la concentración de proteína La concentración de proteína presente en la muestra de cacahuete tostado utilizada en este trabajo se determinó mediante un test comercial que utiliza el ácido bicinconínico. Este método combina la reacción de reducción de los iones cúprico (Cu 2+) a cuproso (Cu 1+) inducida por las proteínas en medio alcalino (reacción de Biuret) con la posterior interacción entre el ión cuproso formado con el ácido bicinconínico que forman un complejo de color púrpura intenso. Este complejo soluble muestra una máximo de absorbancia a 562 nm, cuya intensidad aumenta al aumentar la concentración de proteína. En la Figura 2 se muestra la curva estándar obtenida con albúmina sérica bovina utilizada como patrón, que fue lineal en un rango de concentraciones entre 20 y 2000 µg/ml. Al interpolar los valores de la absorbancia de diferentes diluciones de la muestra de cacahuete y multiplicar por el inverso de la dilución de cada una se obtuvo una concentración de 13,6 mg/ml, lo que corresponde a una concentración de 136 mg/g de cacahuete. Si se considera que la concentración media de proteína del cacahuete es del 27%, en el extracto obtenido se han solubilizado aproximadamente el 50% de las proteínas presentes. Figura 2. Curva patrón obtenida para la albúmina sérica bovina (BSA) utilizando el test del ácido bicinconínico. y = 1.359,598x - 189,224 R² = 0,992 0 500 1.000 1.500 2.000 2.500 0 0,5 1 1,5 2 BSA (mg/ml) Absorbancia (570 nm) 22 2. Obtención y caracterización de los antisueros. Los antisueros anti-proteína Ara h1 y Ara h2 se obtuvieron por inoculación en conejos de las proteínas purificadas. La inmunorreactividad y especificidad de los antisueros obtenidos se comprobaron por las técnicas de inmunodotting y westernblotting. En la Figura 3 se muestran los resultados obtenidos en el inmunodotting utilizando un antisuero anti-proteína Ara h2. Se observa una mancha coloreada en los puntos de la nitrocelulosa donde se aplicaron las proteínas Ara h2 y el extracto de cacahuete y no donde se aplicaron las proteínas lácteas, indicando la presencia de anticuerpos frente a dicha proteína. Se observa también reacción en el punto donde se aplicó la proteína Ara h1, lo que indica probablemente que la fracción purificada de proteína Ara h1 contiene también una pequeña cantidad de Ara h2. En los westernblotting se observa reacción de los antisueros con sus respectivas proteínas en las fracciones purificadas y en el extracto de cacahuete, lo que indica que son específicos para la proteína frente a la que se han obtenido. Figura 3: Inmunodotting obtenido utilizando un antisuero anti-proteína Ara h2 de: 1: Proteína Ara h1 (2 mg/ml) 4: Proteína Ara h2 (2mg/ml) 2: Extracto de cacahuete 5: Alfa-lactalbúmina (2 mg/ml) 3: Lactoferrina (2 mg/ml) 1 2 3 4 5 23 Figura 4: Electroforesis (a) y western-blotting (b, c) utilizando un antisuero antiproteína Ara 1(b) y Ara h2 (c) de: 1. Extracto de cacahuete 2. Proteína Ara h1 3. Proteína Ara h2 La determinación del título de los antisueros se realizó utilizando una técnica de ELISA de tipo no competitivo indirecto. El título de un antisuero corresponde al inverso de la dilución correspondiente al 50% de la máxima absorbancia obtenida. En la Figura 5 se muestra el ejemplo de una curva de titulación obtenida con un antisuero anti-Ara h2, cuyo título fue de 1/6.000. El título de los antisueros obtenidos frente a las proteínas Ara h1 y Ara h2 en las distintas sangrías de los diferentes conejos varió entre 1/2.500 y 1/75.000. Figura 5. Curva de titulación de un antisuero obtenido frente a la proteína Ara h2. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 Absorbancia (450 nm) -Log [c] Ara h2 Ara h1 24 3. Desarrollo de técnicas de ELISA competitivo indirecto para la determinación de las proteínas Ara h1 y Ara h2. Para desarrollar las técnicas de ELISA en placa de tipo competitivo indirecto, se probaron distintas concentraciones de proteína fijadas a la placa, distintas soluciones de bloqueo de los pocillos y distintas diluciones de los antisueros y del conjugado. Las condiciones óptimas para la realización de este test se han indicado en la metodología. Las curvas de calibración obtenidas para la determinación de las proteínas Ara h1 y Ara h2 utilizando esta técnica se muestran en la Figura 6. En las gráficas se representa la absorbancia a 450 nm de los estándares en PBS frente al logaritmo de la concentración de proteína. Las rectas obtenidas fueron lineales en un rango de concentraciones entre 50 ng/ml y 10 µg/ml (r2 ≥0,98). La concentración de las proteínas Ara h1 y Ara h2 en las muestras analizadas se determinó por interpolación de los valores de la absorbancia en las curvas de calibración obtenidas en cada placa. Estos resultados son comparables con los indicados en otros trabajos, que han mostrado rectas de regresión lineales en un rango de concentraciones entre 10 y 1000 ng/ml para las proteínas Ara h1 y Ara h2 (Pomés et al., 2004; Schmitt et al., 2004). La concentración de las proteínas Ara h1 y Ara h2 estimada en el cacahuete extraído con tampón borato ha sido de 6,98 y 4,97 mg/g de cacahuete, respectivamente. Figura 6. Curvas de calibración obtenidas para la determinación de las proteínas Ara h1 (a) y Ara h2 (b) mediante las técnicas de ELISA tipo competitivo indirecto. Los estándares contenían las proteínas Ara h1 y Ara h2 en PBS. y = -2,397x + 4,849 R² = 0,989 1,0 2,0 3,0 4,0 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 Log Ara h1 (ng/ml) Absorbancia (450 nm) a y = -1,866x + 5,147 R² = 0,996 1,0 2,0 3,0 4,0 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Log Ara h2 (ng/ml) Absorbancia (450 nm) b 25 4. Análisis de las muestras de chocolate comerciales por las técnicas de ELISA Diversas muestras de chocolate en tableta, chocolate en polvo a la taza y cacao puro desengrasado se adquirieron en el supermercado y se analizaron utilizando las técnicas de ELISA en placa desarrolladas (Figura 7). Como puede observarse, la absorbancia de las muestras se encontró dentro de un rango entre 0,13 y 0,75 para el ELISA de la proteína Ara h1 y entre 0,20 y 0,41 para la Ara h2, no existiendo una clara tendencia en función del tipo de muestra analizado. Estos resultados indican que el chocolate interfiere considerablemente en los ensayos, debido probablemente a la presencia de taninos y otros polifenoles que interaccionan con la proteína fijada en los pocillos impidiendo su reacción con los anticuerpos y/o interaccionan con los anticuerpos dificultando la reacción de éstos con la proteína fijada en el pocillo (Pomés et al., 2004). Por ello, todas las muestras de chocolate analizadas tienen unos valores de absorbancia menores a los del blanco y por tanto dan un resultado positivo a la presencia de cacahuete. Este resultado no se puede descartar en el caso de las muestras adquiridas en tableta, pues en todas ellas se indica la posible presencia de trazas de frutos secos, al ser elaboradas en las mismas líneas de procesado que se elabora el chocolate con frutos secos. Sin embargo, las muestras de chocolate en polvo a la taza y de chocolate puro están exentas de contaminantes de frutos secos, pues no se elaboran productos con frutos secos en sus líneas de procesado. Además, en la etiqueta de estas muestras no se indica la eventual presencia de trazas de frutos secos. Estos resultados ponen de manifiesto la dificultad de trabajar con una matriz como el chocolate, en la que es necesario probar la adición al medio de extracción de reactivos que bloqueen la interacción inespecífica entre los componentes del chocolate y las proteínas diana y/o los anticuerpos usados en los ensayos. 32 8. Determinación de las proteínas Ara h1 y h2 en muestras de chocolate enriquecidas con diferentes porcentajes de cacahuete Las proteínas Ara h1 y Ara h2 se han determinado en muestras de chocolate enriquecidas con diversas proporciones de cacahuete. Todas las muestras se extrajeron con tampón borato que contenía los agentes bloqueantes seleccionados: gelatina al 5% y leche en polvo al 1%. La cuantificación de las proteínas se ha realizado utilizando tanto una curva patrón con los estándares diluidos en PBS como una curva con los estándares diluidos en chocolate conteniendo el porcentaje de cada bloqueante seleccionado (5% de gelatina y 1% de leche en polvo) (Figura 15). Se ha considerado relevante incluir ambas curvas con el objeto de disminuir los valores de la absorbancia de los estándares, que resultan en una reducción del alto background que produce esta matriz alimentaria. Como muestran las gráficas, la absorbancia de los estándares es menor en presencia de ambos bloqueantes, siendo el efecto más marcado en el ensayo de la proteína Ara h2. Además, la absorbancia fue menor en presencia de gelatina para la proteína Ara h1 y en presencia de leche en polvo para la proteína Ara h2. Estos resultados ponen de manifiesto que el efecto de los bloqueantes depende de la proteína diana y de los anticuerpos usados en cada ensayo. Figura 15. Curvas de calibración obtenidas para la determinación de las proteínas Ara h1 (a) y Ara h2 (b) mediante las técnicas de ELISA tipo competitivo indirecto. Los estándares contenían las proteínas Ara h1 y Ara h2 en PBS (●), en PBS conteniendo chocolate y gelatina al 5% (●) y en PBS conteniendo chocolate y leche en polvo al 1% (●). 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Absorbancia (450 nm) Log Ara h1 (ng/ml) a 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1.5 2.5 3.5 4.5 Absorbancia (450 nm) Log Ara h2 (ng/ml) b 33 En la Figura 16 se muestran los resultados obtenidos en el análisis de las muestras de chocolate con diferentes proporciones de cacahuete. Como puede observarse, la concentración de proteína estimada en las muestras de chocolate es mayor cuando se usa la curva de los estándares diluidos en PBS (Figuras b y d) que las de los estándares en chocolate con bloqueantes (Figuras a y c), hecho que es esperable teniendo en cuenta las diferencias en la absorbancia de los estándares de cada curva, como se ha mostrado en la Figura 15. Por otra parte, cuando se utiliza la curva patrón de los estándares en PBS (Figuras b y d), las muestras de chocolate extraídas con gelatina dan concentraciones menores de la proteína Ara h1 que las extraídas con leche en polvo. Sin embargo, las muestras extraídas con gelatina dan valores de concentración de la proteína Ara h2 ligeramente mayores a las muestras extraídas con leche en polvo. Estos resultados indican que el efecto de un determinado agente bloqueante depende de la proteína diana y/o de los anticuerpos usados en cada ensayo, como ya se ha indicado anteriormente. Figura 16: Análisis de muestras de chocolate conteniendo diferentes porcentajes de cacahuete mediante las técnicas de ELISA competitivo indirecto basadas en la determinación de las proteínas Ara h1 (a, b) y Ara h2 (c, d). Las muestras se extrajeron con tampón que contenía un 5% de gelatina (■,■) o un 1% de leche en polvo (■,■). La cuantificación de proteína se ha realizado utilizando las curvas de los estándares diluidos en PBS (■,■) o en PBS con chocolate y un 5% de gelatina (■) o con chocolate y leche en polvo al 1% (■). 0 2 4 6 8 10 1 0,5 0,1 0,05 0 Ara h2 (mg/ml) Cacahuete (%) a 0 2 4 6 8 1 0,5 0,1 0,05 0 Ara h2 (mg/ml) Cacahuete (%) b 0 1 2 3 4 5 1 0,5 0,1 0,05 0 Ara h2 (mg/ml) Cacahuete (%) c 0 4 8 12 16 20 1 0,5 0,1 0,05 0 Ara h2 (mg/ml) Cacahuete (%) d 34 En la Tabla 3 se muestra la relación entre los valores de concentración de las proteínas Ara h1 y h2 obtenidos en la muestra de chocolate con un 0,05% de cacahuete y la muestra sin cacahuete. Esta relación es mayor para las muestras extraídas con gelatina al 5% que con leche en polvo al 1%. Esta relación interesa que sea lo más alta posible para asegurar que no se detectan falsos positivos. Por ello, considerando los resultados obtenidos en este ensayo, se deduce que la extracción de las muestras con tampón con un 5% de gelatina resulta la más adecuada para determinar la presencia de cacahuete en muestras de chocolate, aún cuando en estas condiciones sigue habiendo problemas de interferencias con la matriz, como han mostrado también otros autores al usar este bloqueantes (Pomés et al., 2004, Stephan y Vieths, 2004, Wen et al., 2005). El realizar los cálculos utilizando una determinada curva patrón dependerá de lo relevante que se considere obtener unos bajos valores de concentración en las muestras sin cacahuete. Tabla 3. Relación entre los valores de concentración de las muestras de chocolate con y sin un 0,05% de cacahuete extraídas con tampón conteniendo como bloqueante gelatina al 5% o leche en polvo al 1%. Curva estándar Choc + Bloq PBS Choc + Bloq PBS Proteína Ara h1 Ara h1 Ara h2 Ara h2 Bloqueante Gelatina 5% 3,6 2,2 4 9 Leche polvo 1% 1,7 1,3 1,3 1,2 En conjunto, los resultados de este trabajo preliminar indican que las técnicas desarrolladas permiten detectar la adición de un 0,05% de cacahuete en cacao puro desengrasado en las condiciones ensayadas. No obstante, habría que realizar más pruebas para determinar con precisión el valor cut-off por encima del cual una muestra se consideraría positiva para la presencia de cacahuete, así como determinar los parámetros usuales de validación de los tests desarrollados en la matriz alimentaria estudiada. Además, dada la diferente composición de los otros formatos de chocolate comerciales (tableta, chocolate a la taza, etc) que incluyen ingredientes como manteca de cacao, azúcar y espesantes, entre otros, sería conveniente estudiar si la metodología desarrollada en este trabajo se puede aplicar para la detección de cacahuete en dichas muestras. 35 Conclusiones 1. La inoculación de las proteínas Ara h1 y Ara h2 en conejos da lugar a la obtención de antisueros específicos que reaccionan con las proteínas correspondientes por las técnicas de inmunodotting y de western-blotting. 2. Las rectas estándar obtenidas para las técnica de ELISA de tipo competitivo indirecto son lineales en un rango de concentraciones entre 50 ng/ml y 10 µg/ml, para las proteínas Ara h1 y Ara h2. 3. El chocolate produce interferencias en los ensayos de ELISA en placa, que pueden reducirse añadiendo al medio de extracción de la muestra agentes bloqueantes, tales como la gelatina y la leche en polvo. La mejor concentración de bloqueante ha sido de 5% y de 1% para la gelatina y la leche en polvo, respectivamente. El efecto de bloqueo ha resultado ser comparativamente mucho menor cuando se usa PVPP como bloqueante. 4. Las técnicas desarrolladas en este trabajo permiten detectar la adición de un 0,05% de cacahuete en muestras de chocolate, obteniéndose mejores resultados en el rango de concentraciones de cacahuete más bajos cuando se usa gelatina como agente bloqueante. 36 Conclusions 1. Inoculation of Ara h1 and Ara h2 proteins in rabbits give specific antiserum which react with the corresponding proteins by inmunodotting and western-blotting. 2. Calibration curves were obtained for the indirect competitive ELISA techniques developed for Ara h1 and Ara h2 proteins, which were linear over a range of concentrations between 50 ng/ml and 10 μg/ml. 3. The chocolate causes interferences in the immunoassays that can be reduced by adding to the extraction medium blocking agents such as gelatin and milk powder. The best blocking concentration was found to be of 5% and 1% for gelatin and milk, respectively. The blocking effect has been found to be comparatively less efficient than using PVPP. 4. ELISA techniques developed in this work can detect the addition of 0.05% peanut in chocolate samples, obtaining the best results in the low concentration range of peanut when we using gelatin as a blocker. 37 Identificación de las aportaciones que, en materia de aprendizaje, han supuesto la realización de esta asignatura Tras realizar este proyecto he podido alcanzar un conjunto de competencias propias del título, que considero útiles para desarrollar mi posterior actividad profesional en el mercado laboral sobretodo en el análisis de alimentos, tales como: - Buscar, analizar y sintetizar información científica sobre un tema en particular, y utilizarla en mi proyecto personal en el diseño del trabajo experimental y en la discusión de los resultados obtenidos. Además, me ha permitido mejorar mi nivel de inglés científico, ya que prácticamente toda la bibliografía se encontraba en ese idioma. - Mejorar la capacidad de trabajo de manera autónoma en el laboratorio. Gracias al trabajo de fin de grado he podido conocer más a fondo algunas de las técnicas analíticas que he estudiado en la carrera, y además aprender el manejo de equipos específicos. Realizando este trabajo he tenido que aprender a trabajar de manera autónoma, ya que he tenido que preparar personalmente los reactivos y realizar los experimentos sin la presencia del profesor. Todo ello me ha servido para desenvolverme y adquirir destreza en el trabajo sistemático de un laboratorio controlando todas las condiciones de manejo de reactivos, materiales, equipos, etc. - Aprendizaje de diversas técnicas inmunoquímicas. Con la realización de este este proyecto he aprendido a desarrollar técnicas inmunoquímicas y aplicarlas en el ámbito del control alimentario. Ello me permitirá poder realizar mejor el trabajo tanto en los laboratorios donde estas técnicas se usan de manera rutinaria como en los laboratorios que se dedican al desarrollo de este tipo de técnicas. - Trabajar en equipo. La realización de este proyecto también ha supuesto una experiencia estimulante desde un punto de vista personal. A pesar de que he tenido que trabajar autónomamente en el laboratorio, he contado en todo momento con el apoyo y asesoramiento de los miembros del equipo de trabajo en el que me he integrado. - Elaborar resultados y obtener conclusiones. A partir de los análisis experimentales que he realizado, he aprendido a elaborar los resultados de forma sistemática, utilizando programas informáticos, y a presentarlos para poder extraer de ellos unas conclusiones. 38 Evaluación de la asignatura y sugerencias de mejora El trabajo de fin de grado supone un aliciente académico, con el se aprenden muchas competencias transversales tales como trabajar de forma autónoma, analizar y sintetizar información, resolver problemas y realizar análisis que se podrían encuadrar dentro de un contexto profesional. Por todo ello, considero esta asignatura una de las más importantes del Grado porque ayuda a desarrollar habilidades y destrezas que se necesitan para encaminarse al mercado laboral. Con este trabajo he aprendido que el obtener unos resultados en un trabajo de investigación no es una tarea sencilla, y que se precisa mucha perseverancia, dedicación y paciencia para poder alcanzar los objetivos que se han planteado. La única sugerencia de mejora que aporto sería que para conseguir un mejor aprovechamiento se necesitaría más tiempo del invertido para realizar el trabajo de fin de grado, ya que el curso académico es muy intensivo y no permite dedicar el tiempo que requeriría un trabajo de esta envergadura. Por lo tanto considero que una de las limitaciones de este estudio es el tiempo. También considero que el trabajo de fin de grado debería tener más peso en créditos en el grado, por su importancia, su implicación para el estudiante y como he comentado anteriormente por el tiempo invertido para realizarlo. 39 Bibliografía  Alvarado, M. y Pérez, M. 2006. Study of food allergy in the Spanish population. Allergology and Immunopathology, 34, 185-193.  Bock, S.A. y Atkins, F.M. 1990. Patterns of food hypersensitivity during sixteen years of double-blind, placebo-controlled food challenges. Journal of Paediatrics, 117, 561-567.  Bousoiio, C. 1999. Mesa redonda: Alergia e intolerancia alimentaria. Principales formas clínicas de presentación. Boletín Pediátrico, 39, 148-151.  Burks, W. 2008. Peanut allergy. Lancet 371: 1538–46.  Bush, R.K., y Hefle, S.L. 1996. Food allergens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 36, S119-S163.  Deibel, K., Trautman, T., DeBoom, T., Sveum, W.H., Dunaif, G., Scott, V.N. y Bernard, D.T. 1997. 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