Repositorio Institucional de Documentos

Claudia Sánchez Serrano ECOLOGÍA MEDIOAMBIENTAL DE LEGIONELLA SPP. Estudio de su capacidad antimicrobiana frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas mediante la producción de bacteriocinas. 2012 - 2013 MÁSTER SALUD PÚBLICA TRABAJO FIN DE MÁSTER Universidad de Zaragoza 0. Justificación ....................................................................................................1 00. Objetivos........................................................................................................3 1. Introducción.....................................................................................................5 2. Metodología...................................................................................................35 3. Resultados y discusión..................................................................................62 4. Conclusiones.................................................................................................84 5. Anexos...........................................................................................................85 6. Bibliografía ....................................................................................................96 Índice General GRÁFICO 1. Colonización de las legionelas según puntos de muestreo.......10 GRÁFICO 2. Casos y brotes en Aragón............................................................13 GRÁFICO 3. Esquema transferencia de bacteriocinas.....................................48 GRÁFICO 4. Curva de crecimiento de L. pneumophila.....................................50 GRÁFICO 5. Estabilidad de la actividad enzimática según el pH......................75 GRÁFICO 6. Estabilidad de la actividad enzimática tras someter el extracto a diferentes temperaturas .................................................................................76 GRÁFICO 7. Curva de calibrado concentración BSA........................................77 Índice de Gráficos TABLA 1. Rangos y nombres taxonómicos del género Legionella......................6 TABLA 2. Art. 2 R.D. 865/2003............................................................................9 TABLA 3. Sistemas y fuentes de información complementaria. .......................11 TABLA 4. Evolución temporal, casos y fallecidos 1999-2009 CNE...................12 TABLA 5. Fuentes de infección de brotes y casos de legionelosis..................14 TABLA 6. Características de las formas clínicas provocadas por L. pneumophila......................................................................................................15 TABLA 7. Criterios de valoración cuantitativa sobre dosis infecciosa...............17 TABLA 8. Sensibilidad y especificidad de pruebas diagnósticas.......................18 TABLA 9. Cepas de Legionella estudiadas.......................................................26 TABLA 10. Características de las cepas estudiadas.........................................27 TABLA 11. Procedimiento unidades abritrarias.................................................54 TABLA 12. Ratio P/S e inmunidad a sus legionelinas (L. pneumophila)...........68 TABLA 13. Ratio P/S e inmunidad a sus legionelinas (Legionella spp).............69 TABLA 14. Actividad de Legionella frente a N. lactamica y N. sicca.................70 TABLA 15. Actividad de las legionelinas frente a bacterias gram+...................71 TABLA 16. Resultados de las U.A. de los extractos enzimáticos crudos..........73 TABLA 17. Sensibilidad a diversas enzimas de las legionelinas.......................74 TABLA 18. Características del extracto enzimático crudo.................................77 TABLA 19. Pruebas realizadas de transferencias de bacteriocinas. ................79 TABLA 20. Conexiones en la transferencia de bacteriocinas. Receptora primera Legionella y discos de L. pneumophila..............................................................79 TABLA 21. Conexiones en la transferencia de bacteriocinas. Receptora primera Legionella y discos de L. spp. ...........................................................................80 TABLA 22. Conexiones en la transferencia de bacteriocinas. Receptora primera N. sicca. ...........................................................................................................80 Índice de Tablas IMAGEN 1. Crecimiento Legionella en caldo de cultivo selectivo ....................51 IMAGEN 2. Diluciones del extracto en placa de microtitter...............................54 IMAGEN 3. U.A. extracto crudo de L. cherrii, indicadora N. sicca....................55 IMAGEN 4. Estabilidad del extracto a diferentes temperaturas.........................56 IMÁGENES 5 Y 6. Estabilidad a diferentes pHs................................................57 IMÁGENES 7 Y 8. E. faecalis frente extractos de bacteriocinas.......................72 IMAGEN 9. U.A. del extracto enzimático de L. cherrii frente a N. sicca............74 IMAGEN 10. Estabilidad de la actividad del extracto crudo a diferentes pHs...75 IMAGEN 11. Estabilidad de la actividad a diferentes temperaturas..................76 IMAGEN 12. β-hemólisis del disco de bacteriocinas de L. sainthelensis .........81 Índice imágenes DNA: Ácido Desoxirribonucleico ACS: Agua Caliente Sanitaria CNE: Centro Nacional de Epidemiología BMS: Bristol-Myers Squibb CDC: Centre for Disease Control EWGLI: European Working Group for Legionella Infections EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa BGN: Bacterias Gram Negativas BGP: Bacterias Gram Positivas BL: Bacteriocin Like BLIS: Bacteriocin Like Inhibitory Substance DQ: Detección del Quorum U.A.: Unidades Arbitrarias de actividad Ratio P/S: Ratio producción/sensibilidad Lp1: Legionella pneumophila SG. 1 SG: Serogrupo KDa: Kilo Dalton P.M.: peso molecular U.Z.: Universidad de Zaragoza IUCA: Instituto Universitario de Ciencias Ambientales Abreviaturas "If you´re not failing every now and again, it´s a sign you´re not doing anything very innovative" Woody Allen Claudia Sánchez 0. Justificación Trabajo Fin de Máster Máster Salud Pública Universidad de Zaragoza 1 JUSTIFICACIÓN La importancia histórica y actual del agua en Aragón continúa siendo una seña de identidad y una necesidad cultural y social de primer orden. Los tiempos actuales nos sugieren que frente a las necesidades de cantidad son precisos unos criterios de calidad del agua que permitan ofrecer este factor de desarrollo integral con las debidas garantías en una sociedad moderna. Esta necesidad de un agua de calidad viene determinada para la utilización de abastecimientos urbanos, los usos industriales, las finalidades lúdicas o, finalmente pero no menos importantes, las puramente ambientales. El conocimiento de los factores ambientales permitirá planificar cualquier tipo de actuación sobre el medio ambiente y ofreciendo su uso a finalidades hoy insospechadas pero que requieran un patrón de calidad microbiológico. Los estudios epidemiológicos con valor ecológico son las investigaciones básicas útiles para un conjunto muy importante de ciencias que actúan sobre el medio ambiente. Calidad y cantidad de agua son también caras de una misma moneda científica; pero dos caras que deben llevar un desarrollo armónico y coordinado. Nunca se avanzará si no somos capaces de hibridar estas dos áreas de conocimiento, porque solo así es posible responder a nuestras necesidades sobre el agua. El avance de los conocimientos científico-técnicos y las experiencias acumuladas recomiendan contemplar las innovaciones necesarias para un mayor control de la legionelosis. La prevención y control de la legionelosis mediante la adopción de medidas higiénico-sanitarias implica tomar medidas preventivas que se basarán en la aplicación de dos principios fundamentales: primero, la eliminación o reducción de zonas contaminadas mediante un buen diseño y el mantenimiento de las instalaciones y segundo evitando las condiciones que favorecen la supervivencia y multiplicación de las legionelas, mediante el control de la temperatura del agua y la desinfección continua de la misma. Estas dos medidas preventivas no deben entenderse de manera aislada porque sería abordar un problema complejo desde una perspectiva muy limitada, lo que impediría una actuación coordinada y por lo tanto eficaz sobre el problema. Se considera desde el punto de vista científico la necesidad de coordinar los estudios técnicos de las distintas áreas de conocimiento de una forma eficaz. Ante una situación de casos de legionelosis, las autoridades sanitarias competentes coordinarán las actuaciones de todos los profesionales que intervengan en la investigación de casos y brotes de legionelosis, donde todos los trabajos previos de conocimiento científico del problema sin duda ayudarán a decidir las líneas más eficaces de actuación. Este proyecto también quiere contribuir a mejorar los conocimientos actuales y facilitar la labor de los distintos Departamentos, Organismos y de los Comités del Gobierno de Aragón. La actuación sobre las legionelas no puede reducirse 7 4. BIOFILM - Temperaturas de 0 a 63ºC, multiplicándose entre 20 y 40ºC, y destruyéndose a 70ºC; siendo su temperatura óptima de crecimiento de 35-37ºC - pH de 5 a 8,5 - oxígeno disuelto de 0,2 a 15 mg/ml, etc. La tolerancia al cloro de las legionelas les permite sobrevivir a concentraciones que el mismo cloro elimina a Escherichia coli, demostrándose así, que si en el agua de la red hay E. coli, no se aíslan legionelas, y si la colimetría es negativa, crecen las legionelas. Sólo al alcanzar 2mg/L de cloro, se destruyen el 100% de las legionelas. Legionella es un microorganismo aeróbico estricto, necesita oxígeno para su supervivencia (concentración mayor a 2,2 mg/l) y en general es poco activo. Su supervivencia en el aire es corta debido a la poca resistencia que presentan a la desecación y a los efectos de la radiación ultravioleta. Una característica biológica de esta bacteria es su capacidad de crecer intracelularmente en protozoos y en macrófagos humanos. La presencia de amebas en determinados ambientes e instalaciones es un mecanismo de supervivencia de Legionella en condiciones ambientales desfavorables que hacen más difícil su eliminación. Esta particularidad les confiere una gran resistencia en su hábitat natural, se multiplican en el interior de diversos protozoos de vida libre (5 géneros de amebas) y en el medio libre se encuentran formando parte de complejas biocapas microbianas. La posibilidad de multiplicación intracelular la protege contra la acción de los antibióticos y desinfectantes, de forma que sólo responde a antibióticos capaces de penetrar en las células. Por ello son de gran interés las asociaciones de las legionelas con amebas, ciliados, algas, algunas especies bacterianas e incluso plantas acuáticas como Myriophillum spicatum. Otra asociación es con un organismo eucariote del suelo, Dictyiostelium discoideum, con fase ameba, puede formar agregados, fase mucoide y cuerpos fructificantes. Asimismo, se nutre de bacterias. En general, en su medio natural, la bacteria se encuentra en bajas concentraciones, pero en número suficiente para contaminar circuitos de agua artificiales, en los que el estancamiento de agua, material de corrosión y amebas, le permite formar una biocapa que junto con una temperatura óptima, se multiplica en concentraciones importantes, y una vez dispersadas en el aire, ayudadas por los mecanismos productores de aerosolores, infectan el aparato respiratorio humano. A medida que interaccionan, los microorganismos pueden formar agrupaciones físicas complejas, como los biofilms. Se desarrollan sobre todas las superficies inmersas en los ambientes acuáticos, tanto biológicos, como abióticos (cemento, metal, plástico, piedras). Los biofilms se forman con especial rapidez en sistemas acuáticos en movimiento, donde se ven provistos los microorganismos de una fuente constante de nutrientes. Estos biofilms, 8 representan un gran impacto en la supervivencia microbiana y en la aparición de enfermedades. Por tanto, es importante contemplar cuatro niveles en referencia a los factores de riesgo de esta bacteria: las legionelas planctónicas, legionelas asociadas a las amebas, legionelas aisladas en el biofilm y legionelas asociadas a las amebas en el biofilm. Las legionelas por tanto, se pueden presentar en forma planctónica, o parasitando intracelularmente a protistas de vida libre, como diferentes especies de amebas. No se ha documentado el crecimiento de Legionella en la naturaleza en ausencia de protozoos, y se cree que éstos como se ha comentado anteriormente, constituyen los huéspedes de la bacteria en el medio ambiente. En la naturaleza, los microorganismos residen frecuentemente en biofilms que consisten en microcolonias bien organizadas envueltas en matrices poliméricas. Dentro de estos biofilms, las microcolonias están separadas mediante canales de agua por donde se eliminan los deshechos y se provee de nutrientes. Esta organización, facilita la comunicación entre los miembros de la microcolonia y permite una alimentación cruzada entre diferentes especies. Además, la conjugación de DNA entre bacterias que ocurre en un porcentaje muy elevado dentro del biofilm, es también un instrumento para la evolución y la adaptación a cambios en el medio ambiente. Dentro del biofilm, las amebas de vida libre constituyen el principal regulador de la población bacteriana y son organismos de interés en la adaptación de las bacterias al interior de células eucariotas. Esta fase de interrelación procariotaeucariota, debe haber permitido la adaptación de Legionella a la supervivencia intracelular en el interior de protozoos y se ofrece así, un posible mecanismo mediante el cual estas bacterias pueden resistir situaciones adversas y propagarse rápidamente en condiciones favorables. Los estudios llevados a cabo sobre los ciclos de infección en protozoos tienden a utilizar como modelo a una ameba de vida libre, Hartmannella vermiformis, a pesar de que otros modelos de protozoos son también eficientes huéspedes. Las bacterias que crecen en el interior del biofilm, son más resistentes a los biocidas al estar protegidas por el mismo. Muchas veces, el uso de biocidas, puede incluso potenciar las cepas patógenas al actuar selectivamente sobre las no patógenas. El uso de cloración en continuo es una de las estrategias más efectivas para la eliminación de biofilms, aunque su erradicación total es muy difícil. También el mantenimiento de la temperatura en los sistemas de ACS a más de 50ºC, o la limitación de su formación en las paredes de los distintos sistemas hídricos con la utilización de materiales específicos o evitando zonas de estancamiento, son buenas técnicas para evitar su formación. Asimismo, es muy importante la investigación de sustancias que bloqueen los mecanismos específicos de invasión legionela-ameba. Los aminoácidos son su principal fuente de energía, habiéndose comprobado que la presencia de otros microorganismos como las algas verde azuladas, favorecen su desarrollo. Es difícil su aislamento in vitro ya que requieren hierro y cisteína. El medio selectivo más empleado para su aislamiento es el CYE (charcoal yeast extract), suplementado con ácido alfa-cetoglutarato. Son de 9 5. FUENTES DE INFECCIÓN crecimiento lento; pueden tardar entre 3 y 5 días en crecer colonias visibles. Estas colonias son pequeñas y con tonalidad azul y textura esmerilada. Aparte de esas asociaciones, se han detectado también antagonismos con especies de familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae, a cuyas bacteriocinas de alto y bajo peso molecular, las legionelas son muy sensibles. Esta competencia se producirá a nivel extracelular, donde tienen ventajas las bacterias de crecimiento rápido. Como se menciona anteriormente, las instalaciones que colonizan las legionelas, amplifican y favorecen el crecimiento, por la acumulación de nutrientes y sedimentos, así como también facilitan su diseminación; el artículo 2 del Real Decreto 865/2003, divide estas instalaciones según la probabilidad de proliferación y dispersión de la bacteria: TABLA 2. Artículo 2 R.D. 865/2003 División de las instalaciones según proliferación y dispersión de la Legionella. 1. Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión a) Torres de refrigeración y condensadores evaporativos. b) Sistemas de ACS con acumulador y circuito de retorno c) Sistemas de agua climatizada con agitación constante y recirculación a través de chorros de alta velocidad o la inyección del aire. d) Centrales humidificadoras industriales 2. Instalaciones con probabilidad menor de proliferación y dispersión a) Sistemas de instalación interior de agua fría o depósitos, cisternas o depósitos móviles y agua caliente sanitaria sin circuito de retorno b) Equipos de enfriamiento evaporativo que pulvericen agua. c) Humectadores d) Fuentes ornamentales e) Sistemas de riego por aspersión del medio urbano f) Sistemas de agua contra incendios g) Elementos de refrigeración por aerosolización al aire libre h) Otros aparatos que acumulen agua y puedan producir aerosoles 3. Instalaciones de riesgo en terapia respiratoria a) Equipos de terapia respiratoria b) Respiradores c) Nebulizadores d) Otros Fuente: Modificado (Datos R.D. 865/2003) 10 6. EPIDEMIOLOGÍA Según un estudio realizado por el Dr. J. Dellundé y la Dra. R. Aranjo del departamento de microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad de Barcelona, casi el 50% de las instalaciones estudiadas, estaban colonizadas por Legionella, de las cuales el 87% eran L. pneumophila, el 25% pertenecientes al SG.1 y el resto a los serogrupos entre el 2-14. GRAFICO 1. Colonización por Legionella según el punto de muestreo Fuente: Prevención y control de Legionella en instalaciones ACS. Universidad de Barcelona Cualquier zona puede actuar como área de amplificación, aunque especialmente se encuentran por debajo de los 60ºC, de aquí que sea tan importante mantener la temperatura por encima de los 60º en todo el recorrido; aún así, no se garantiza la no colonización de legionelas. La legionelosis es una enfermedad ampliamente diseminada. Se han descrito casos en América del Norte, Australia, África y Europa, notificándose más en países industrializados. Se detectan casos esporádicos todo el año, pero con más frecuencia aparecen, al igual que los brotes, en verano y otoño. La proporción de neumonías de origen comunitario causadas por L. pneumophila se estima en torno a un 0,5-5% del total de las mismas. A pesar de que la legionelosis es un problema bien conocido, los datos son muy escasos en los países en desarrollo, ya que no existen redes adecuadas de vigilancia y notificación de casos. Habida cuenta que los entornos de riesgo y las poblaciones vulnerables se encuentran en todo el mundo, es seguro que el problema de la legionelosis no es realmente conocido en estas regiones. En España la vigilancia epidemiológica de la legionelosis se basa en la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica y en otros sistemas y fuentes de información complementarios. Su objetivo es conocer la evolución de la incidencia y de los posibles cambios en el patrón de presentación de la enfermedad en la comunidad, mediante la detección de casos esporádicos, brotes y casos relacionados que permitan identificar las fuentes de infección y 11 tomar las medidas de control adecuadas. A continuación se describen dichos sistemas: TABLA 3. Sistemas y fuentes de información complementarios Quién notifica Periodo tiempo Otros datos Enfermedades de Declaración Obligatoria (EDO) Médicos en ejercicio Semanal Encuesta enviada al CNE Notificación de situaciones epidémicas y brotes Responsables del estudio de la CCAA. Trimestral Informe final al CNE Sistema de Información Microbiológica (SIM) Laboratorios de microbiología clínica. A establecer por la CCAA. Notificación de casos de legionelosis en viajeros en Europa EWGLI: grupo europeo con información recíproca sobre casos de turistas con legionelosis. Información procedente del centro Nacional de Microbiología En casos de brotes: técnicas de tipificación molecular para comparar con cepas ambientales y establecer fuente de infección. Laboratorio de referencia para todo el país. Fuente: Modificado de datos de la CNE En EEUU, según datos de los CDC, entre 8.000 y 18.000 personas son hospitalizadas con legionelosis. Recientemente, los CDC americanos han incluido los viajes como un factor de riesgo para la legionelosis, habiendo detectado que más del 20% de los casos notificados de esta enfermedad se relacionaban con algún tipo de viaje. En Europa, según datos de 2008, se notificaron 5.960 casos de legionelosis en 34 países europeos. El mayor número de casos se registró en Francia (1244), España (1219) e Italia (1107), aunque, las tasas por millón de habitantes fueron mayores en Suiza (28,6), Eslovenia (23,7), Dinamarca (23,3) y los Países Bajos (20,5). En 2009, se declararon en Europa 808 casos de enfermedad concretamente asociados a viajes. Tanto a nivel nacional, como en Aragón, se considera Enfermedad de Declaración Obligatoria, individualizada y urgente desde el año 1996. La aparición de brotes genera alarma social y gran demanda informativa por la alta letalidad en personas de edad avanzada o con patologías previas, y la 12 posibilidad de prevención mediante el control de las instalaciones que utilizan de agua. Normalmente se presenta en forma de casos esporádicos, pero en ocasiones se han detectado casos agrupados y brotes. TABLA 4. Evolución temporal, casos y fallecidos (1999-2009) del CNE. Fuente: CNE Los datos de la tabla anterior, proceden del informe del boletín epidemiológico de 2010 del Centro Nacional de Epidemiología. Al igual que los datos anteriores, muestran al principio un incremento de los brotes y casos, desde 1999 hasta el 2005, esto se debe probablemente a una mejora en la detección y en la notificación de la enfermedad, más que por un aumento de la incidencia real de la legionelosis y a partir de 2006 se estabiliza el crecimiento. En el primer año del que se dispone de datos, 1997, se declararon 201 casos de legionelosis lo que supone una tasa de 0,51 casos por 100.000 habitantes, desde entonces ha presentado una incidencia creciente hasta el año 2001, año en el que se produjo el brote de legionelosis de Murcia, con un gran número de afectados (650 casos confirmados, aunque su letalidad fue inferior (1%) a la de la mayoría de los brotes declarados a escala mundial). Esta tasa de crecimiento anual (52,5%) se explica en parte por la amplia difusión del uso del antígeno en orina como técnica diagnóstica y un mejor diagnóstico, control y prevención de la enfermedad. En el año 2002 la notificación de la enfermedad se estabiliza con 1.461 casos, lo que supone una tasa de incidencia global de 3,60 casos por 100.000 habitantes, en este año el 50% de los brotes afectaron a menos de 3 personas.A partir de aquí los casos inician un descenso paulatino, más evidenciable en el número de casos notificados asociados a brotes. De 1.262 casos y una tasa de 3,19 por 100.000 habitantes en el año 2003, se ha pasado a 1.192 casos y una tasa de 2,89 en el año 2005, 13 En cuanto a la distribución por el tipo de casos se puede observar una disminución de los casos asociados a brotes, más evidente a partir del año 2001 (que incluye el brote acaecido ese año en la ciudad de Murcia) y un continuo incremento de los casos esporádicos. En el caso de Aragón, la incidencia de la legionelosis ha crecido progresivamente. La mejor notificación de casos y el empleo del antígeno específico desde el 2002, pueden influir en este aumento. Pese al ligero incremento en el último año, podemos decir que estas cifras siguen siendo las más bajas observadas en la última década. GRÁFICO 2. Casos y brotes en Aragón de 1997-2005 Fuente: CNE La información relativa al estudio de brotes aporta datos sobre factores de riesgo y mecanismos de transmisión. Desde 1989 a 1997 se declararon 45 brotes de legionelosis (679 casos en total), alguno de ellos con un elevado número de casos, como el ocurrido en un hotel de Granada en 1991, que afectó a 91 personas (BMS 1991), o el ocurrido en Alcalá de Henares, Madrid, en 1996, que afectó a 224 personas (BES 1997, Grupo de trabajo BE de la CAM 1997). Según el ámbito donde se produjeron hubo 37 brotes comunitarios (82%) y 8 hospitalarios (18%) (CNE, datos no publicados). La fuente de infección más frecuentemente relacionada con la aparición de brotes es el agua caliente sanitaria; sin embargo, según datos consultados de la CNE, se asocia un mayor número de casos a las torres de refrigeración. Es de reseñar que en más del 32% de los casos no es posible detectar la fuente de infección. 14 7. CLÍNICA TABLA 5. Fuentes de infección de brotes y casos de legionelosis. Fuente: CNE Del total de 1.365 casos en viajeros, declarados por distintos países de Europa a EWGLI en el período 1987-1997, 376 (28%) están relacionados con instalaciones españolas (CNE datos no publicados). En nuestro país, esta información tiene claras repercusiones sociales, económicas y sanitarias (Joseph y cols 1996, Infuso y cols 1997, Galmés y Martínez-Navarro 1997, BES 1998b). Por último, el Laboratorio de Referencia de Legionella ha caracterizado desde 1980, aproximadamente, 2.000 aislamientos de Legionella (300 de origen humano y 2.700 de origen ambiental), provenientes de casi todas las Comunidades Autónomas. De sus resultados se desprende que L. pneumophila serogrupo 1 es el patógeno principal así como el serogrupo más frecuente en el ambiente (Pelaz 1998). Los síndromes clínicos producidos por los miembros de la familia Legionellaceae reciben el nombre de legionelosis. La enfermedad de los legionarios es la neumonía causada por L. pneumoniae, que ha sido detectada en muchos hospitales desde que se presentó la primera epidemia en 1976. El cuadro clínico es muy variable, desde formas asintomáticas, hasta una neumonía grave con fallo multiorgánico, pero clásicamente, se distinguen dos formas clínicas: la infección pulmonar o neumonía por Legionella y la fiebre Pontiac o síndrome global agudo autolimitado. - La fiebre Pontiac se presenta con un cuadro febril con dolores articulares y musculares (artromialgias) y afectación del estado general, fiebre, tos, dolor torácico, diarrea y confusión. En general es una enfermedad FUENTES DE INFECCIÓN DE BROTES Y CASOS DE LEGIONELOSIS Número de brotes (%) Número de casos Agua sanitaria edificios 87 (29,5%) 423 Torre refrigeración 63 (21,3) 1565 Baño burbujas/termal 5 (1,8) 59 Otros 7 (2,4) 32 Resultados negativos 39 (13,2) 168 Desconocido 95 (32,1) 533 TOTAL 296 (100) 2780 15 autolimitada con una clínica leve que evoluciona a la curación. La fiebre de Pontiac es por tanto, una enfermedad febril aguda, no neumónica y autolimitada. Su periodo de incubación es de 24-48 horas, la tasa de ataque es del 95% y su letalidad es del 0%. - Neumonía por Legionella (Enfermedad del legionario). Se presenta con una incidencia entre 1 – 5%. La presentación clínica puede variar desde una neumonía atípica a una forma clásica. Es frecuente la afectación de otros órganos como riñón, hígado, tracto gastrointestinal, sistema nervioso. Los síntomas más frecuentes son: fiebre elevada, tos, dolor muscular, escalofríos, cefalea, dolor torácico, espectoración, diarrea, confusión mental o alteración del estado de conciencia. Su período de incubación es de 2 a 10 días, la tasa de ataque es del 1-5% y la letalidad es del 15-20%, aunque ésta disminuye con un tratamiento precoz con antibióticos. TABLA 6. Características de las formas clínicas provocadas por L. pneumophila Enfermedad del Legionario Fiebre de Pontiac Incidencia 1-5 % 95 % Periodo Incubación 2-10 días 1-2 días Síntomas Fiebre, tos, dolor muscular, escalofríos, dolor de cabeza, dolor torácico, esputos, diarrea, confusión, coma Fiebre, dolor muscular, tos, escalofríos, dolor de cabeza, dolor torácico, confusión Efectos en pulmón Neumonía Pleuritis, Ausencia de neumonía Afección otros órganos Riñón, hígado, tracto gastrointestinal, sistema nervioso Ninguno Proporción casos fatales 15-20% Ausencia Fuente: CNE En los primeros casos, el agente causal fue L. pneumophila, sin embargo cuadros similares se relacionaron con L. feelei, L. anisa y L. micdadei. L. pneumophila es responsable de aproximadamente el 85% de los casos diagnosticados de infección por Legionella spp., en el 15% restante, se aíslan con frecuencia decreciente variable de unos países a otros, L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii, y L. longbeachae. La mayoría de los enfermos con infecciones por estas especies, estaban inmunocomprometidos por tratamiento 16 8. TRANSMISIÓN 8.1. Mecanismo de transmisión 8.2. Mecanismos de patogenicidad con corticosteroides, un transplante o padecían cáncer. Asimismo, en los pacientes con neumonía por L. micdadei, el estado de inmunosupresión es más frecuente que entre los infectados con L. pneumophila. La infección por virus de la inmunodeficiencia humana condiciona un mayor riesgo para L. pneumophila y en menor grado para L. bozemanii, L. feeleii y L. micdadei. La transmisión de las legionelas al hombre requiere la existencia de un reservorio, un mecanismo de diseminación eficiente y un huésped susceptible a la infección. La cantidad de Legionella necesaria para que se produzca infección, va en relación inversa a la virulencia de la cepa y la susceptibilidad del huésped. El mecanismo de transmisión más aceptado es mediante la inhalación de gotículas de agua contaminada y aerosolizada mediante diversos mecanismos (torres de refrigeración, duchas). Una vez en el tracto respiratorio, los macrófagos alveolares fagocitan la Legionella. No obstante, las legionelas son un patógeno intracelular, capaz de multiplicarse en el interior de los macrófagos hasta la ruptura celular. Otro mecanismo que se ha sugerido recientemente, pero que no se considerará de momento 100% fiable, es el que algunos autores consideran el más importante: mediante aspiración de agua contaminada o de secreciones de la orofaringe previamente colonizada por este microorganismo. De este modo la Legionella llega a los pulmones mediante aspiración de legionelas externas que se encuentran en la cavidad oral y escapan del reflejo usual de deglución entrando en el tracto respiratorio. La legionelosis aparece fundamentalmente en personas mayores, con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en personas que toman glucocorticoides y en enfermos transplantados. Otros factores que pueden influir en la susceptibilidad del huésped son: sexo masculino, tabaquismo, alcoholismo, diabetes, cáncer o estar sometido a tratamientos de diálisis. No obstante, los individuos sanos también pueden padecer la enfermedad si han sufrido una exposición a concentraciones suficientemente elevadas del agente infeccioso. 23 11.2. Espectro antimicrobiano de las bacteriocinas 10.4. 11.4. Bacteriocinas en Legionella 10.5. 11.3. Mecanismo de acción de las bacteriocinas 10.3. Generalmente las bacteriocinas son termorresistentes, y en el caso de las bacteriocinas de Legionella, les permitiría mantener su actividad antimicrobiana a temperaturas elevadas de las torres de refrigeración. Las bacteriocinas son también, generalmente estables a pH ácido o neutro, aunque existen excepciones. La estabilidad de las bacteriocinas disminuye a medida que aumenta su purificación. El espectro antimicrobiano de las bacteriocinas parece estar asociado a presencia de receptores apropiados en los microorganismos receptores (Taggs y col. 1976). Sin embargo, la mayoría de las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram-negativas actúan fundamentalmente sobre especies microbianas relacionadas taxonómicamente con ellas, mientras que las bacteriocinas de las Gram-positivas son antagonistas de una mayor diversidad de especies Gram-positivas (Tagg y Col. 1976). Según su espectro animicrobiano, pueden clasificarse en: a) bacteriocinas activas frente a bacterias taxonómicamente relacionadas y b) bacteriocinas con un amplio rango de actividad frente a bacterias también Gram-positivas. Tagg y col. (1976) señalan que la acción de las bacteriocinas sobre las células sensibles ocurre en dos etapas. En la primera fase, la bacteriocina se adsorbe en receptores específicos y no específicos de la célula hospedadora. En ese estadio, las bacteriocinas son sensibles a las proteasas. En una segunda fase, ésta ya es irreversible, la bacteriocina origina alteraciones celulares en las células sensibles de acuerdo con cada tipo de bacteriocina. Estudios ecológicos sobre Legionella spp. son esenciales para entender mejor sus fuentes en el medio natural, el mecanismo de su entrada en los sistemas de agua creados por el hombre y los factores que permiten su supervivencia y crecimiento en los hábitats acuáticos La interacción bacteriana-protozoario contribuye a la amplificación de la población de Legionella en los sistemas de agua, actuando como un reservorio de la infección y contribuyendo a la virulencia del patógeno para infectar células humanas. Legionella es capaz de sobrevivir como organismo libre por largos períodos dentro de los biofilms que se han generado en los sistemas de agua artificial. 24 Como ya he comentado anteriormente, el conocimiento sobre biofilm asociado a la legionela puede dar lugar a medidas de control eficaces para prevenir la legionelosis, pero las nuevas perspectivas en el control de la contaminación por Legionella pueden surgir a partir de las investigaciones sobre las bacterias acuáticas capaces de inhibir el crecimiento de la legionela en sistemas de aguas naturales y artificiales, incluso de la capacidad que tienen ellas, las legionelas, de inhibirse a sí mismas. Basados en el criterio ecológico y al haber comprobado la elevada sensibilidad in vitro de las legionelas a bacilos gram negativos (BGN), pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, y Aeromonas, así como géneros de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus y Salmonella) y en menor grado a bacterias gram positivas(BGP) (géneros Staphylococcus y Streptococcus)1,6, se ha ampliado este estudio con el análisis de la posible actividad de las legionelas sobre diversas cepas de BGN, con los que puede coexistir en el medio hídrico, e incluso en los enfermos con las BGP. Aunque la actividad bacteriocinogénica de las legionelas no había sido detectada con anterioridad, recientemente se ha demostrado que 20 especies del género Legionella y 8 serogrupos de L. pneumophila son productores de bacteriocinas (BL o BLIS, de bacteriocin-like o bacteriocin-like inhibitory substance, respectivamente). Para la caracterización de las bacteriocinas, se proponen 6 puntos (Jacob, F. Lwoff, S., Wollman, E. Ann. Inst. Pasteur. 1953): - Espectro de actividad reducido - Naturaleza proteica - Mecanismo de acción bactericida - Unión a receptores específicos - Codificación por plásmidos que además confieren inmunidad frente a la bacteriocina - Dudas en los gram-positivos. En otro estudio previo, se confirmó en 36 especies y serogrupos de Legionella spp, mostrando una gran variabilidad en el balance entre producción de bacteriocinas y sensibilidad a las mismas. Este llamativo comportamiento de todas las legionelas estudiadas significa una capacidad discriminatoria con valor epidemiológico y ecológico, que proyectan su utilidad para interpretar que las bacteriocinas de las legionelas tienen sobre todo un valor ecológico, y actúan con toda probabilidad como señales, constituyendo por tanto su lenguaje conocido en otras bacterias, es el denominado quórum sensing. La especificidad que poseen las legionelinas se expresa con un carácter discriminatorio. 25 11.4.1. Detección del Quorum sensing (D.Q.) 11.4.2. Bacteriocinas de alto y bajo peso molecular Estos conocimientos pueden servir para encontrar medidas de control más efectivas de la persistencia de las legionelas en el medio ambiente. Las bacteriocinas han sido reconocidas recientemente como señales moleculares con un papel clave para el comportamiento microbiano colectivo. Antes se pensaba que las bacterias eran incapaces de comunicarse o de organizarse en grupo, pero es cierto que la comunicación célula-célula es una actividad fundamental y realizada por la mayoría de las bacterias; se ha demostrado que son capaces de coordinar sus actividades. La caracterización de las moléculas señal de la D.Q. demostró que regulan la expresión de una gran variedad de fenotipos (Fucqua et al.). Las bacterias se comunican por medio de señales moleculares difusibles. La variación de estas señales es amplia, existiendo sistemas de percepción y mecanismos de transducción que convierten la información en cambios de la regulación de los genes. La D.Q. permite, por tanto, a las poblaciones bacterianas regular colectivamente la expresión génica y sincronizar el comportamiento del grupo. La detección del quórum permite el acceso de las bacterias a los nutrientes y la organización de la respuesta defensiva frente a sus competidores, así como optimizar su capacidad para diferenciarse en morfotipos mejor adaptados para sobrevivir en un ambiente hostil. La población bacteriana ocupa un nicho ecológico cerrado, sintetizando constitutivamente un bajo nivel de señales, y que su concentración crece en sincronía con el aumento de la población. El tamaño de las proteínas es medido usualmente en masa molecular, aunque algunas veces se menciona su longitud y diámetro. El peso molecular es la masa de 1 mol de proteína, usualmente se expresa en daltones. La masa se puede determinar con métodos como: la electroforesis, la filtración en gel y la espectrometría de masas. Los métodos de separación de proteínas que se está empleando es la electroforesis en gel de poliacrilamida. Por el resultado de algunas pruebas podemos deducir que éstas tienen muy alto peso molecular, por encima de 14 kDa. Además, podemos comprobar a grosso modo que las bacteriocinas de bajo peso molecular difunden más en el medio que las de alto peso molecular que dan lugar a halos de inhibición más pequeños. 26 12. CEPAS DE ESTUDIO 12.1. Cepas de Legionella estudiadas La familia Legionellaceae incluye un género, Legionella, que a su vez comprende 48 especies y más de 70 serogrupos. L. pneumophila posee 15 serogrupos, siendo el serogrupo 1 el más frecuentemente aislado en pacientes (más del 80 % de los casos confirmados). En nuestro estudio, hemos dispuesto de la siguiente variedad de cepas de Legionella: TABLA 9. Cepas de Legionella estudiadas Fuente: Elaboración propia Se ha trabajado con 20 especies diferentes. La especie Legionella pneumophila origina más del 90% de las infecciones. Esta especie comprende 15 serogrupos. El más patógeno es el serogrupo 1 (52% de las infecciones por Legionella), seguido del serogrupo 6 ( 12%). En total la L. pneumophila causan más del 85 % de las infecciones por Legionella. Las siguientes en importancia estan por debajo del 5 % de las infecciones: L.micdadei, L.bozemanii, L dumoffii, L. gormanii y L. longbeachae. Del serogrupo 1, que es el más frecuentemente aislado en pacientes, disponemos de varias cepas; principalmente hemos estudiado 4 de ellas que son las que figuran en la tabla. Además, de las 19 especies restantes, se han estudiado dos diferentes serogrupos de 4 de ellas. Legionella anisa es una de las especies más frecuentes distinta de L..pneumophila en el medio ambiente y pueden ser adquiridas en hospitales. 27 TABLA 10. Características de las cepas estudiadas Fuente: Elaboración propia Especie Origen Grupo DNA L. pneumophila Ambiental / Clínico L. anisa Ambiental / Clínico 2 L. bozemanii SG. 1 Ambiental / Clínico 2 L. bozemanii SG. 2 2 L. cherrii Ambiental 2 L. dumoffii Ambiental / Clínico 2 L. erythra Ambiental 1 L. feeleii SG. 1 Ambiental / Clínico 3 L. feeleii SG. 2 3 L. gormanii Ambiental / Clínico 2 L. hackeliae SG. 1 Clínico 10 L. hackeliae SG. 2 10 L. israeliensis Ambiental /Clínico 11 L. jamestownensis Ambiental 4 L. jordanis Ambiental / Clínico 7 L. longbeachae SG. 1 Ambiental/ Clínico 2 L. longbeachae SG. 2 2 L. maceachearnii Ambiental/ Clínico L. micdadei Ambiental / Clínico 6 L. oakridgensis Ambiental / Clínico L. parisiensis Ambiental L. sainthelensis Ambiental / Clínico L. steigerwartii Ambiental L. wadsworthii Clínico 28 12.2. Otras bacterias estudiadas 10.6. 12.2.1. Neisseria lactamica Se piensa que L. anisa puede enmascarar la contaminación del agua por L. pneumophila, lo que sugiere que existe un riesgo de infección por L. pneumophila en pacientes inmunocomprometidos. L. bozemanii es menos conocida para los médicos; ya que en ocasiones se trabaja con pruebas específicas para L. pneumophila y no detectan por ejemplo la infección de L. bozemanii, pero ésta puede ser también causante de infección pulmonar como se ha visto en casos de pacientes inmunocomprometidos. El primer caso aislado de L. bozemanii en Europa fue uno de neumonía adquirido por un hombre de 75 años de edad, durante sus vacaciones en Mallorca. A pesar de la ventilación artificial y la eritromicina intravenosa el paciente falleció. El organismo causante fue aislado de una muestra del pulmón obtenido post mortem. El examen de una sola muestra de suero por medio de una prueba de inmunofluorescencia indirecta identificó a L. bozemanii. L. bozemanii serogrupo 2, fue aislada de un paciente, caracterizada como Legionella bozemanii por los datos de DNA y el análisis de ubiquinona, pero variaba fenotípicamente de bozemanii serogrupo 1 por sus características colonias y reacciones serológicas cruzadas. Otra especie causante de enfermedad es la L. micdadei; es la única especie de Legionella ácido-alcohol resistente, pero pierde este carácter al ser cultivada en el laboratorio. Es el agente responsable de la "Neumonía de Pittsburg". L. longbeachae es una especie de la familia Legionellaceae., aislada por primera vez de un paciente en Long Beach, California. Se encuentra predominantemente en el suelo y abono vegetal. Además de la Legionellae, hemos trabajo con otras bacterias como cepas receptoras frente a la acción de las bacteriocinas. Se consideran las principales bacterias indicadoras del estudio: N. lactamica ATCC23970, N. sicca ATCC9913 y E. faecalis ATCC19433. N. lactamica fue descrito por Hollis et al. en 1969 y como N. meningococcoides por Berger en 1970. Las cepas de N. lactamica no se habían descrito en los estudios anteriores a 1969. Debido a la producción de ácido a partir de lactosa no se utilizó como una prueba diferencial para la identificación de Neisseria spp. Antes de la descripción de esta especie, cepas de N. lactamica habrían sido identificados como N. meningitidis. (ver IMAGEN 1) 29 12.2.2. Neisseria sicca 12.2.3. Enterococcus faecalis (ATCC 19433) Diplococos gram negativos, colistina-resistente, crecen en medio selectivo gonocócica, y se caracterizan por su capacidad de producir ácido a partir de glucosa, maltosa, y lactosa, y por su capacidad de producir beta-galactosidasa. Entre las especies de Neisseria, N. lactamica es probablemente el más fácil de identificar las especies. Por lo tanto, con una rara excepción (un conocido, informe no publicado de una cepa lactosa negativa), esta especie no deben ser identificada erróneamente. N. lactamica se aísla con frecuencia de los niños, pero con poca frecuencia en los adultos. Neisseria sicca, descrita como especie por von Lingelsheim en 1908 y considerada un agente comensal de la orofaringe humana, es un diplococo gramnegativo aeróbico, inmóvil y oxidasa positiva. Al igual que todas las especies de este género, requieren de C02 y cierto grado de humedad para crecer a 35 °C. Se cultiva en agar chocolate, agar sangre de cordero y no se desarrolla en Thayer Martin, dado que este medio inhibe el desarrollo de neiserias comensales excepto N. lactamica. La colonia es blanca, opaca, de 1 a 3 mm, adherente; con los días de incubación adquiere una textura rugosa y produce pigmento amarillo verdoso. Entre sus características bioquímicas relevantes se encuentra la producción de ácidos desde sacarosa y fructosa, propiedad que comparte con N. subflava y N. mucosa y que permite diferenciarlas de neiserias patógenas; por último, la reducción de N03 es positiva para esta especie. (ver IMAGEN 2) La sensibilidad in vitro de neiserias comensales se ha mantenido estable a penicilina, ampicilina, cefalosporinas, quinolonas, tetraciclina y macrólidos. Son considerados resistentes a aminoglucósidos y vancomicina. Las infecciones graves por esta especie son inusuales, pero la publicación de casos ha aumentado, especialmente en huéspedes inmunocomprometidos. Podemos encontrar en la literatura médica casos de endocarditis, peritonitis en peritoneo-diálisis, meningitis, artritis séptica, bursitis, osteomielitis, neumonía, abscesos epidurales y bacteriemia. Los casos comunicados plantean que el fallo de tratamiento con vancomicina y aminoglucósidos en diálisis peritoneal debe inducir la sospecha una infección con agentes no típicos. Enterococcus forma parte de la microbiota intestinal del hombre y los animales, es un contaminante fecal de las aguas residuales y puede aislarse en múltiples 30 13. ESTUDIOS PREVIOS RELACIONADOS nichos ecológicos debido a su resistencia a los factores ambientales (Baldausarrii et al, 2005). Se han descubierto 36 especies diferentes, sólo 26 se asocian con infecciones en humanos (Chan y Zorus 2009). Enterococcus faecalis y E. faecium son las especies más comunes y responsables de una amplia variedad de infecciones entre las que se citan infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas quirúrgicas, infecciones del torrente sanguíneo, infecciones del sistema nervioso central, edocarditis, infecciones intraabdominales, hepatobiliares, pélvicas y sepsis neonatal (Baldasarri et al, 2006; Sood et al, 2008; Chen y Zercos, 2009). Enterococcus faecalis es un gram positivo, con forma ovoide. Crece en amplio rango de temperaturas y soporta hasta 60ºC durante 30 minutos. En 1980, Rowbotham describió que el crecimiento de L. pneumophila en medio sólido, se inhibía por algunas especies como Bacillus spp y P. aeruginosa, presentes en muestras orofaríngeas. En el mismo año, Flesher et al. demostraron que varias bacterias aisladas de cultivos orofaríngeos humanos, inhibían específicamente el crecimiento de L. pneumophila. Las bacterias inhibidoras tenían actividad frente a todas las cepas de L. pneumophila ensayadas, incluyendo 5 cepas de L. pneumophila SG.1 y una de cada SG. 2, 3 y 4. Esta sustancia inhibidora no inhibió sin embargo, el crecimiento de 18 patógenos clínicos ni de 12 patógenos de laboratorio. Algunas propiedades de esta sustancia inhibitoria, son que es dializable, resistente al calor y que no precipita con sulfato amónico. Otras sustancias producidas en el tracto superior, no inhibieron L. pneumophila, que además, no podía ser aislada cuando se cocultivaba con Streptococus y Saprophytus. Estas propiedades pueden explicar en parte la dificultad de aislamiento y puede ayudar en la identificación de L. pneumophila. En cuanto a las conclusiones que podemos extraer de estos resultados de las interacciones de las bacterias productoras de bacteriocinas y las legionelas, dada la baja densidad de microorganismos en el agua, parece poco probable que los bacilos gram-negativos lleguen a destruir a las legionelas. Así como también es difícil demostrar que en condiciones naturales las bacterias produzcan bacteriocinas. El género Aeromonas es particularmente importante porque se encuentran muy distribuidas tanto en aguas corrientes como estancadas, incluso en abastecimientos de agua, aun estando cloradas. De todas formas, estas interacciones deberían de darse a nivel extracelular, ya que las legionelas son capaces de infectar amebas multiplicándose intracelularmente, y al romper los protozoos huéspedes es cuando se liberan 31 una gran cantidad de legionelas móviles. Esta complejidad de su asociación con una variedad de algas, amebas, y plantas acuáticas sugieren que “las legionelas saben exactamente lo que están haciendo, nosotros simplemente todavía no lo entendemos.” Durante un estudio del 2005 que buscaba encontrar nuevos tratamientos que disminuyeran el desarrollo de Legionella, encontraron una cepa de Staphylococcus warneri que inhibe el crecimiento de Legionella. Esta actividad se debe a una molécula secretada por S. warneri. Esta molécula muestra una estabilidad térmica alta y su actividad se perdió después de los tratamientos de proteasa, lo que sugiere que podría ser una bacteriocina. Su purificación les llevó a concluir que esta molécula anti-Legionella es un péptido altamente hidrofóbico. Tiene un espectro original y muy específico de actividad, dirigido sólo hacia el género Legionella. Esta fue la primera descripción de un péptido antibacteriano activo contra la Legionella. Fue probado frente a L. pneumophila, L. bozemanii, L. dumoffii, L. longbeachae y L. micdadei. Este espectro de actividad es importante ya que las bacteriocinas generalmente van dirigidas hacia especies relacionadas con la bacteria productora. Resulta que no sólo no es activa frente a cepas cercanas a ella, sino que se ha probado que lo es frente a Legionella, que es una bacteria gram-negativa. Después de estos resultados, esta bacteriocina deberá caracterizarse y secuenciarse antes de iniciar estudios genéticos. También merece la pena estudiar el modo de acción de la bacteriocinas, ya que pueden ser utilizadas como un tratamiento alternativo contra la Legionella. En el año 2008 se publicó un estudio relacionado con el nuestro, sobre el efecto de la interferencia bacteriana sobre el desarrollo del biofilm de L. pneumophila. En la ecología de la Legionella pneumophila, y las legionelas en general, la relación con la microbiota humana y con otras bacterias, especialmente en los biofilms, juega un papel crucial. Alrededor de 80 bacterias estudiadas, el 66,2% de las mismas resultaron activas frente a L. pneumophila. Las especies P. aeruginosa y P. fluorescens, como ya hemos comentado en estudios anteriores, son las mejores productoras de bacteriocinas y presentan el mayor efecto negativo en la formación de biofilm. Acinetobacter, es de las pocas que no produce ningún efecto antagonista y es la única que mejora la formación del biofilm. Las bacteriocinas por tanto, pueden contribuir a la determinación del destino de las legionelas en los nichos ecológicos. Un estudio realizado por Guerrieri et al., demuestra que las interacciones observadas son características importantes de la ecología de la L. pneumophila y cuyo conocimiento puede servir para encontrar medidas de control más efectivas de la persistencia del microbio en el medio ambiente. Según este estudio, ninguna de las cepas de Legionella producen BLS. De las 80 bacterias acuáticas estudiadas, sólo 37 eran activas frente a L. pneumophila, 16 inhibían las legionelas, y otras cepas acuáticas y 11 cepas 32 eran activas sólo frente a otras bacterias acuáticas. Las productoras de bacteriocinas estaban distribuidas uniformemente por las especies y al menos una cepa de cada especie inhibía el crecimiento de la legionela. Las cepas de L. pneumophila eran más sensibles que las otras bacterias acuáticas y no se observó diferencia entre los serogrupos en términos de sensibilidad frente a bacteriocinas. Un estudio realizado por William E. Maher et. al, reveló los subtipos de un grupo de cepas ambientales y clínicas de L. pneumophila SG. 1, subtipificados por análisis de plásmidos. Mediante la combinación de estas técnicas de plásmidos con los anticuerpos monoclonales, las 16 cepas resultaron ser diferentes. Los perfiles de plásmidos y las reacciones a anticuerpos monoclonales de cepas seleccionadas eran estables a pesar de los pasos en serie (más de 100). La disociación observada de los perfiles de plásmidos y la reactividad de anticuerpos monoclonales sugiere que para la tipificación se podría recurrir el uso de ambas técnicas. Otro estudio de Samrakandi MM, estudia las diferencias genéticas y fenotípicas entre diferentes cepas de L. pneumophila. Perfiles de proteínas de membrana y la electroforesis en gel de campo pulsado de L. pneumophila SG.1 han dado lugar a patrones muy diferentes. Estudios posteriores se han dedicado a estudiar diferencias entre los diferentes tipos de legionelas. Hay un estudio de M. Swanson que estudia los diferentes rasgos de virulencia entre L. pneumophila y L. micdadei. Mientras la mayoría de las enfermedades del legionario se han atribuido a L. pneumophila, L. micdadei puede causar una infección similar en personas inmunodeprimidas. De acuerdo a los 7 rasgos principales relacionados con la virulencia, concluyen que L. micdadei elude los lisosomas y se replica en macrófagos tan eficientemente como L. pneumophila a pesar de carecer tanto de citotoxicidad dependiente del contacto y de su sensibilidad al sodio regulado. Hay muchas diferencias fenotípicas para las dos especies; utilizan diferentes estrategias para colonizar los macrófagos alveolares. La aplicación de marcadores epidemiológicos para tipificar Legionella pneumophila o spp. incluye anticuerpos monoclonales, ribotipia, amplificación con iniciadores arbitrarios, electroforesis en campo pulsado y el método de amplificación de los fragmentos obtenidos tras la digestión de ADN cromosómico. Sin embargo, se puede observar aislamientos clínicos y ambientales indiferenciables por estos métodos moleculares por lo que se aplica otra técnica, que es una modificación de la clásica bacteriocinotipia, ya que determina la sensibilidad de las legionelas a una serie de bacteriocinas producidas por otras especies de legionelas, destacando la capacidad discriminatoria entre especies y serogrupos. De esta forma podemos diferenciarlas interespecíficamente e intraespecíficamente, llegando a METODOLOGÍA 38 2.1. Medios de cultivo en agar y medio líquido d. Una vez ahí, ir alejando el porta lentamente hasta visualizar la preparación. e. Finalizada la observación, girar el revólver, retirar el porta y bajar el soporte. f. Limpiar adecuadamente el soporte y la lente empleada. Los medios de cultivo son un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es considerable y por ello también la variedad de medios lo es. A continuación describo los medios utilizados en este proyecto. El agar es un agente solidificante utilizado en medios de cultivo bacteriológicos y en otras aplicaciones (cultivo de tejido, difusión inmunológica, estudios nutricionales, etc.). El agar es un poligalactósido que se obtiene a partir de algas rojas marinas. La mayoría de microorganismos son incapaces de degradarlo. Las concentraciones más habitualmente utilizadas en los medios de cultivo bacteriológicos son de 13-20 g/l para medios sólidos y 5-7 g/l para medios semi-sólidos. En las distintas aplicaciones, se precisan distintos grados de pureza. En este estudio se han utilizado principalmente tres tipos de medios de cultivo de agar: 2. MEDIOS DE CULTIVO METODOLOGÍA 39 COLUMBIA AGAR WITH 5% SHEEP BLOOD Descripción: Medio con alto contenido nutricional en el cultivo de microorganismos exigentes. s. También es útil para la observación de reacciones de hemólisis. Difco Laboratories, Michigan, USA Componentes: Digerido pancreático de caseína…...10,0 g Peptona N º 3... …….…………………5,0 g Extracto de levadura.......................... 5,0 g Infusión músculo corazón 500 g …….3,0 g Almidón .................. …………………..1,0 g Cloruro de Sodio.................................5,0 g Agar......................... ………………...15,0 g Bacterias cultivables: Para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. - Corynebacterium jeikeium Observaciones: Este medio se ha utilizado principalmente para los controles de los cultivos de Legionella y de los discos de bacteriocinas. Condiciones de cultivo: Cultivo en aerobiosis durante 24 horas en estufa a 36ºC. METODOLOGÍA 40 AGAR MUELLER-HINTON Descripción: Es un medio general que permite el desarrollo de gran variedad de microorganismos. Se preparara en el laboratorio, para el aislamiento y crecimiento de bacterias y ensayos de sensibilidad a los antibióticos y bacteriocinas. CULTIMED (Panreac Química S.L.U.) Componentes (g/l): Almidón .................................1,5 g Infusión de Carne ................. 2,0 g Peptona de Caseína Hidr .... 17,5 g Agar……………………….…17,0 g pH: 7,4±0,2 Aspecto: polvo fino Color: Beige pH: 7,4±0,2 . Procedimiento seguido según recomendaciones del fabricante: - Suspender 38 g en 1 l de agua destilada - Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto. - Esterilizar en autoclave a 1 atmósfera de presión, 121ºC durante 15 minutos. - Distribución en placas y dejar enfríar en cámara bajo luz U.V. Bacterias cultivables: Para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. - E. faecalis - E. faecium - N. lactamica - N. sicca Observaciones: Se ha utilizado principalmente para la determinación de la “concentración mínima inhibitoria” (CMI) por la técnica de diluciones seriadas. Condiciones de cultivo: Cultivo en aerobiosis durante 24 horas en estufa de 25 o 36ºC. METODOLOGÍA 41 AGAR LEGIONELLA GVPC Descripción: medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Legionella. Es un medio de color negro uniforme y sensibilidad muy alta. MAIM S.L. Componentes: (g/l) Extracto de Levadura........ 10.00 Carbón Activado...................2.00 Agar Bacteriológico............13.00 ACES ……….................….10.00 KOH Alfa-Cetoglutarato ...............1.00 L-Cisteína ............................0.40 Pirofosfato Férrico ...............0.25 Polimixina B .................79200 UI Glicina .................................3.00 Cicloheximida ......................0.08 Vancomicina ........................0.01 . Bacterias cultivables: Para el aislamiento y cultivo de Legionella. Condiciones de cultivo: Cultivo en ambiente de 5% de aerobiosis de CO2 aaerobiosis durante 48-96 horas a 36ºC. Para conseguir estas condiciones, introducimos las placas en una jarra especial. Colocamos las placas a incubar en una gradilla. Sobre las placas colocamos 2 velas encendidas y un recipiente con agua estéril (para proporcionar humedad al ambiente). Colocamos dicha gradilla en una jarra. Una vez cerrada, la vela consumirá todo el oxígeno, y se apagará consiguiendo de esta manera una atmósfera con un 5% de CO2. METODOLOGÍA 42 CALDO DE CULTIVO DE LEGIONELLA Descripción: Medio líquido para el aislamiento y cultivo de Legionella. Componentes (g/l): Extracto de levadura…………………...10 g / Cultimed Panreac α-cetoglutarato …………………………..1 g / Sigma Buffer ACES……………………………10 g / Sigma KOH 1N L-cisteína……………………………….0,4 g / Sigma Aldrich Pirofosfato férrico ……………………0,25 g / Sigma Aldrich Agua destilada ………………….1 l (apróx.) . Procedimiento: - Disolver 10 gramos de levadura y 1 gramo de α-cetoglutarato en 850 ml. de agua y llevar a ebullición. - Disolver 10 gramos del buffer ACES en 100 ml de agua caliente y ajustar el pH a 6,9 con KOH 1N. Añadimos a la preparación anterior. - Autoclavar 15 minutos a 121ºC. - Dejar enfriar (o calentar si se ha enfriado antes) a 50ºC. - Disolver 0,4 gramos de L-cisteína y 0,25 gramos de pirofosfato férrico en 10 ml de agua, cada uno. - Filtrar con filtro de 0,22um primero la L-cisteína y después en otro tubo el pirofosfato férrico; se añaden al caldo en cámara de seguridad.. - Volver a ajustar el pH con KOH estéril. Observaciones: A partir del caldo de cultivo se centrifuga y filtra para obtener el extracto crudo. Condiciones de cultivo: Cultivo durante 48-96 horas en estufa de 36ºC. Para conseguir unas condiciones estrictas, introducimos los matraces en jarras,. En la misma jarra, introducimos varias velas encendidas. Una vez cerrada, la vela consumirá todo el oxígeno, y se apagará consiguiendo de esta manera una atmósfera con un 5% de CO2. METODOLOGÍA 43 2.2. Condiciones de cultivo - Todos los cultivos fueron incubados a 36ºC en incubadora aeróbica HERAEUS modelo B6. - En ocasiones se utilizaron los 25º bien para la desecación de discos de bacteriocinas o para favorecer la pigmentación de los cultivos de Neisseria lactamica. - En el caso de cultivo de Legionella, como se ha comentado previamente, se incubaron en atmósfera de 5% de CO2. METODOLOGÍA 44 3.1. Siembra Aparatos y Material - Placas BCYE-α - Asa desechable de Drigalsky - Cloroformo - Tubos estériles - Estufa 25º - Estufa 36º - Nefelómetro DINKO Mc. F colorimeter - Lámpara U.V. Método Uno de los métodos utilizados para comprobar la actividad de las bacteriocinas de Legionella pneumophila, frente a si mismas, y de otras especies de Legionella así como de otras bacterias, es el método de difusión en agar a partir de discos de bacteriocinas producidas en medio BCYE-α y concentradas por desecación a 25ºC. Para considerar válidos los discos de bacteriocinas de BCYE-α, es necesario seguir un procedimiento estricto en el que se asegure ha habido un correcto crecimiento de legionela con su correspondiente producción de bacteriocionas, así como evitar toda contaminación posterior a la siembra, que pueda falsear nuestros resultados. Para ello, debe de seguirse el siguiente método: - Se parte de una siembra de Legionella, obtenida a partir de cepas de colección conservadas a -70ºC en leche descremada. Como máximo se utilizarán durante 10 días y conservadas a 4ºC. - Una vez descongelada cada cepa, se procede a su siembra en BCYEALFA, incubándose a 36º, con 5% de CO2, durante 3-4 días. A partir de colonias aisladas se efectúa la resiembra en placas del mismo medio con un inóculo de 0,5 McFarland ajustado con nefelómetro “DINKO Mc.F colorimeter”. En cada placa se siembran 100 µl, distribuyéndose uniformemente en su superficie con asa de Drigalsky, llevándose a la estufa de cultivo e incubándose de nuevo de 2-4 días. - Esta siembra deberá pasar por los pertinentes controles de pureza, como la resiembra en agar sangre, para comprobar que no ha crecido ninguna otra bacteria. - Se sembrará cada cepa de Legionella por placa. 3. PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE DISCOS DE BACTERIOCINAS METODOLOGÍA 45 3.2. Preparación de discos 3.3. Selección de discos - Una vez se considera que es óptimo el crecimiento de la cepa sembrada, ya puede procederse a la elaboración de los discos. - Se retira la siembra con portas esmerilados siguiendo la técnica de Gillies y Govan modificada y en condiciones de esterilidad. - Una vez se ha retirado el crecimiento bacteriano, se procede al tratamiento con cloroformo según el método de Bauerfeind (REF); sometemos la placa a la acción de los vapores de cloroformo, colocándola boca abajo y sobre papel de filtro impregnado en el cloroformo durante 20 minutos. - Una vez el cloroformo ha actuado (se puede observar en la degradación del plástico), volvemos a cerrar la placa que llevamos a la estufa para que se evaporen los restos de tricolorometano. - Este es el momento de realizar los tacos, bien con sacabocados o con tubos de vidrio dependiendo del tamaño del disco que queremos hacer de 8 y 10 mm de diámetro. Antes de realizar los tacos, flameamos o usamos material estéril. Los tacos deben de realizarse antes de que el medio empiece a desecarse ya que con el medio desecado resulta más difícil y costosa la preparación de los discos. - Una vez hemos obtenido los tacos, se deja la placa en estufa a 25º hasta lograr su desecación. - Con este sistema se pretende concentrar las bacteriocinas en estructura laminar; el disco. El medio pasa de tener un volumen, a transformarse en una lámina, lo que refleja la concentración que se ha conseguido. - Una vez obtenidos los discos, los sometemos al tratamiento con H2O2 y a 20 minutos de radiación ultravioleta para asegurar la esterilidad. Éste método de esterilización es el que tras diversas pruebas se ha comprobado como el más eficaz, ya que además de suprimir el H2O2, es el único desinfectante probado que carece de efecto residual. - Se probarán los discos frente a bacterias indicadoras de las que ya se conoce su resistencia o sensibilidad. - Se considerará que el disco está en condiciones cuando: sea estéril, y además el resultado de la inhibición obtenida, corresponda con los resultados previamente logrados. Cuando se cumplan estas condiciones se dará por válido y se procederá a su conservación en viales de tapón roscado debidamente identificados con el nombre de la especie de Legionella de la que se trata, así como el lote al que pertenece y la fecha de elaboración. METODOLOGÍA 46 - Los discos que muestren irregularidades bien en la forma, tamaño, color o textura, serán eliminados. - No se mezclarán discos de una misma especie procedentes de diferentes placas; los discos se conservarán por lotes como ya se ha comentado. Aparatos y material - Jarras Anaerocult MERCK de 12 cm de diámetro - Asas de siembra estériles deshechables - Asas de Drigalsky deshechables - Pipetas VoluMate Liquisystems de Mettler Toledo. - Tubos estériles - Nefelómetro DINKO Mc. Farland colorimeter - Estufa 36ºC - Guantes y mascarilla Método - En placas de BCYE-α sembramos las cepas de colección de Legionella que queremos probar como receptoras. - Cuando éstas cepas hayan crecido, se procede a inocularlas en tubos con 10 ml de agua bidestilada esterilizados. El inóculo debe de realizarse para obtener una turbidez estándar 0,5 Mc. Farland, medida con el nefelómetro X. - Se preparan todos los inóculos que requerimos para las pruebas con cada una de las bacterias receptoras, recientemente sembradas y crecidas. Estos inóculos los sembramos por sectores en placas de BCYE-α para comprobar que efectivamente crecen de manera semiconfluente. - A las 24-48 horas el inóculo ha debido de crecer ya que se ha tomado en su fase exponencial de rápido crecimiento. - Una vez comprobamos que crece adecuadamente, procedemos a realizar las pruebas. Previamente se habrán preparado los discos que queremos usar según el protocolo descrito en el apartado 3 de la metodología. - Identificamos debidamente la placa: base receptora, discos de bacteriocinas y fecha de preparación de la prueba. - Con pipeta sembramos en una placa de BCYE-α, 100 µl del inóculo preparado y probado previamente. - Éstos 100 µl se extienden con asa de plástico de Drigalsky por toda la placa de cultivo. 4. PRUEBAS DE ACTIVIDAD DE LEGIONELLA FRENTE A SÍ MISMA METODOLOGÍA 47 5.1. Técnica - Una vez sembrado el inóculo, colocamos los ocho discos adecuadamente preparados y esterilizados sobre el medio y la base receptora. Las placas se mantienen a 4ºC durante 18 horas para la predifusión de las bacteriocinas. - Colocamos las placas en jarra con un pequeño recipiente de agua estéril para dar humedad al medio, así como 2 velas para el porcentaje de CO2 adecuado para el crecimiento de la Legionella. - Esperamos de 24-72 horas para comprobar el crecimiento y los halos de inhibición. - El resultado es que las bacteriocinas han difundido en el medio alrededor del disco, y algunas de ellas inhiben el crecimiento de la base receptora. Como técnica complementaria y para corroborar que efectivamente los discos que dan un halo de inhibición pequeño se tratan de bacteriocinas de alto peso molecular, y que las de halo de inhibición grande son bacteriocinas de bajo peso molecular, realizamos el siguiente experimento: Sembramos tal y como lo hacemos habitualmente la base de legionella que vamos a enfrentar a los discos. Sobre la superficie de una placa de medio BCYE-α, colocamos la membrana de diálisis esterilizada y con pinzas estériles se extiende con asa Drigalsky para que haga contacto con el medio. A continuación, sobre la membrana colocaremos 2 discos de bacteriocinas que han dado halo pequeño (bacteriocinas de alto peso molecular), incapaces de atravesar la membrana de diálisis. Además, se colocan otros dos discos que daban halos grandes (bajo peso molecular), cuyas bacteriocinas deben ser permeables, difundiéndose en el medio de cultivo durante la predifusión en nevera a 4ºC durante 48-20 horas. Ya está la placa en condiciones para retirar la membrana con pinzas y proceder a la siembra de una cepa indicadora (L. oakridgensis). Tras la incubación a 36ºC durante 2-3 días se podrá comprobar los halos de las 2 bacteriocinas de bajo peso molecular, contrastando con la ausencia de inhibición de las 2 cepas que proceden de bacteriocinas de alto peso molecular. Es una nueva perspectiva estudiar la transferencia de las bacteriocinas desde las legionelas a diversas bacterias receptoras. Para ello, hemos ensayado discos conteniendo bacteriocinas de legionelas activas seleccionadas 6. TRANSFERENCIA DE BACTERIOCINAS 5. PESO MOLECULAR DE LAS BACTERIOCINAS METODOLOGÍA 54 TABLA 11. Procedimiento unidades arbitrarias. 1 2 3 4 5 Extracto 1 20 µl de extracto 20 µl de agua 20 extracto 20 µl de agua 20 µl de agua 20 µl de agua Extracto 2 20 µl de extracto 20 µl de agua 20 extracto 20 µl de agua 20 µl de agua 20 µl de agua Fuente: Elaboración propia - Una vez están realizadas las diluciones, se procede a impregnar los 20 µl del extracto sobre cada disco colocado en la placa sembrada con la bacteria indicadora. - Se deja en pre-difusión durante la noche a 4ºC y posteriormente se incuba a 36ºC, hasta el día siguiente. IMAGEN 2. Diluciones del extracto en placa de microtitter Fuente: Elaboración propia METODOLOGÍA 55 7.5. Características de la sustancia inhibitoria para comprobar que son bacteriocinas Por último se procede a la lectura de la placa y se comprueba cuál es la máxima dilución a la que tienen actividad inhibidora los extractos ensayados. IMAGEN 3. U.A. extracto crudo de L. cherrii, indicadora N. sicca. Fuente: Elaboración propia Las bacteriocinas presentan una serie de propiedades bioquímicas comunes como son, la sensibilidad a la acción de ciertas enzimas proteolíticas y su tolerancia a temperaturas elevadas y condiciones de pH bajo. Debido a su naturaleza proteica, todas las bacteriocinas son inactivadas por una o más enzimas proteolíticas, incluyendo aquellas de origen pancreático (tripsina y  - quimotripsina) y algunas de origen gástrico, como la pepsina y proteinasa K. La termotolerancia de las bacteriocinas de las BAL es generalmente elevada, aunque puede reducirse significativamente después de su purificación (Davey y Richardson, 1981; Barefoot y Klaenhammer, 1983). Esta característica de termorresistencia parece estar estrechamente relacionada con su estructura molecular; normalmente compuesta por péptidos pequeños que no presentan estructura terciaria. Algunas bacteriocinas termolábiles, poseen mayor peso molecular que reflejan probablemente una estructura molecular más compleja. Dadas éstas características, para comprobar que la inhibición del extracto preparado, se debe a la acción de las bacteriocinas, se someten pequeñas cantidades de extracto, a un amplio rango de temperaturas y pHs, y determinamos de nuevo su actividad con el método de difusión en agar. METODOLOGÍA 56 7.5.1 Estabilidad al calor Material - Baño GFL - Tubos eppendorf - Micropipeta - Puntas de micropipeta Método Las muestras activas se reparten en tubos eppendorf que se cierran herméticamente y se calientan en baño de agua a diferentes temperaturas, dejando luego enfriar a temperatura ambiente. A continuación se determina la actividad residual frente a la bacteria indicadora comparando con un blanco no calentado. Se prepara, para cada muestra, 15 tubos con 50 µl de extracto en cada uno. - Tres tubos se someterán a 80ºC. - Tres tubos a 90ºC. - Tres tubos a 100ºC. Para cada una de estas temperaturas, se sacarán los tubos en diferentes momentos: uno a los 5 minutos, otro a los 10 y el último a los 20. - De cada uno de estos tubos se toman 20 µl y se colocan sobre disco de papel como se ha indicado antes con el método de difusión en agar sobre bacteria indicadora, en este caso, E. faecalis, N. lactamica o N. sicca. IMAGEN 4. Estabilidad extracto a diferentes temperaturas Fuente: Elaboración propia METODOLOGÍA 57 7.5.2 Estabilidad al pH Las muestras activas se les ajusta el pH a los valores deseados (desde pH3 hasta pH 11) mediante adición de tampones preparados. - NaOH 0,5N - HCl 0,2N En placa de microtitter: 1. Se colocan 50 microlitros en cada pocillo (del 2-11) 2. Se mide el pH del extracto, normalmente tiene un pH de 6.9-7.0, ese pocillo será al que no se le añada nada. 3. A partir de aquí añadimos NaOH 0,5N o HCl 0,2M en cada uno de los pocillos para subir y bajar el pH hasta alcanzar el pH que le corresponda de acuerdo a su sitio (desde pH 3 a pH 11). Una vez se tiene en los pocillos el extracto ajustado a los pHs que se buscan, se siembra la placa con inóculo de bacteria indicadora, en este caso por ejemplo de N. lactamica, sobre la que pondremos discos con los extractos, correspondientes a los diferentes pocillos. Se colocan sobre cada disco unos 20 µl del extracto, identificando el pH al que se encuentra el extracto, o bien empapando el disco de papel en el pocillo y colocando posteriormente sobre la placa ya sembrada. IMÁGENES 5 y 6. Estabilidad a diferentes pH Fuente: Elaboración propia METODOLOGÍA 58 7.5.3 Sensibilidad a las enzimas / Tratamiento enzimático Los sobrenadantes con actividad inhibitoria, neutralizados y esterilizados por filtración, se someten a la acción de diferentes enzimas:  Proteasas inespecíficas: pronasa E y proteinasa K (Boehringer Mannheim)  Proteasas específicas: tripsina y α-quimotripsina (Merck) Las enzimas que se han empleado para estos ensayos son: 1. Proteasa XXI: Obtenida de caldo de cultivo de S. griseus y purificada, de la casa “Sigma”. 2. Proteasa XIV: también denominada Pronasa. Es una mezcla comercialmente disponible de proteinasas aisladas del fluido extracelular de Streptomyces griseus. 3. Proteinasa K: también proteasa K o endopeptidasa K. Es una serina proteasa de amplio espectro. La enzima fue descubierta en 1974 en los extractos del hongo Engyodontium (anteriormente Tritirachium album). Es capaz de digerir la queratina natural (pelo), de ahí el nombre "proteinasa K". 4. Lisozyma: también conocida como muramidasa o glycanhydrolase Nacetylmuramide, son glucósido hidrolasas. Éstas son enzimas que dañan las paredes celulares de las bacterias. Puesto que lo que se pretende con esta prueba es aproximar la naturaleza proteica del inhibidor, en un principio conviene emplear endoproteasas que sean bastante inespecíficas, tales como la tripsina o la proteasa XIV de Streptomyces griseus (Sigma), esterilizadas por filtración. Estos ensayos se pueden realizar en medio sólido, o bien en medio líquido y a ser posible en preparaciones purificadas o semipurificadas. En medio líquido a una muestra con actividad, se le adiciona la enzima correspondiente a una concentración de 2,5 mg/ml, incubándose a 37ºC durante 2-3 h, transcurridas las cuales se determina actividad residual de la muestra tratada, comparando con una muestra activa. Se debe emplear un control de la enzima a la misma concentración. Una vez hechas las pruebas de actividad descritas anteriormente y anotados los halos de inhibición en las tablas de sensibilidad, realizaremos un análisis de dichos resultados. METODOLOGÍA 59 Para caracterizar la enzima inhibidora, debemos conocer en primer lugar la concentración de proteínas que tiene el extracto, según la concentración que encontremos, concentrarlo para posteriormente correrlo en electroforesis. De entrada sabemos que es una enzima secretada y su peso molecular aproximado. Para conocer la concentración de dicho extracto, realizamos el siguiente procedimiento: 1. Pesamos 6 mg de albúmina bovina y le añadimos 6 ml de agua, para obtener un “stock” de concentración 1mg/ml. 2. Diluimos en primer lugar al 1:10 (1ml de solución, 9 de agua) y a continuación al 1:4. De esta forma ya obtenemos la concentración deseada, que es 25 µg/ml. 3. Se preparan 7 tubos para cada una de las concentraciones: a. Blanco, 0 µg/ml (800 µl de agua) b. 25 µg/ml (800 µl de stock) c. 20 µg/ml (640 µl de stock y 160 µl de agua) d. 15 µg/ml (480 µl de stock y 320 µl de agua) e. 10 µg/ml(320 µl de stock y 480 µl de agua) f. 5 µg/ml (160 µl de stock y 640 µl de agua) g. 1 µg/ml (32 µl de stock y 768 µl de agua) 4. El espectrofotómetro que se va a manejar en la práctica es del tipo convencional de haz simple. Se enciende el espectrofotómetro y se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro a 540 nm. 5. Se colocan en una gradilla con 7 tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 7 con un rotulador permanente al agua. 6. Colocamos en cada uno de los tubos del espectofotómetro, 0,80 ml de cada una de las preparaciones anteriores, más 0,2 ml del DYE REAGENT CONCENTRATE. 7. Se tapa con papel parafilm y se invierte dos o tres veces para mezclar. 8. Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua termostatizado a 37 ºC, dejándose que se desarrolle el color durante 15 min. 9. Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente 10. Se procede a medir en el espectrofotómetro siguiendo las normas expresadas anteriormente. Se ajusta el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 6. 8. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS METODOLOGÍA 60 11. · Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio. Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo. 12. Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada uno de los tubos de ensayo y se anotan los resultados medidos por el espectofotómetro con los que realizaremos la recta. 13. Realizamos también las mediciones del extracto que deseamos conocer su concentración, así como de su blanco, que en este caso será el un extracto crudo que no tenga actividad. 14. En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína estándar calculada de cada uno de los tubos, para cada método ensayado. Se ajustan los puntos obtenidos por el método de mínimos cuadrados a una recta, incluyendo el punto 0,0. Se representan la rectas ajustada en el papel milimetrado. 15. Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema Para la evaluación de resultados, se diferenciarán los enfrentamientos entre las propias legionelas y los producidos entre legionelas y otras bacterias. - Entre cepas pertenecientes a especies del género Legionella: o Diferenciación interespecíficas (especies) o Diferenciación intraespecíficas (serogrupos) - Entre legionelas y otras bacterias con las que comparten nicho ecológico. De cada una de las especies de Legionella, hay aproximadamente 30 pruebas realizadas. De estas 30 pruebas, debemos conocer el número que han dado resultado positivo y las que han dado negativo; a partir de aquí, puede conocerse su ratio de producción/sensibilidad. Para ello, se distingue entre el comportamiento de la Legionella como receptora (sensibilidad) y como productora (actividad inhibitoria). 9. MÉTODO DE EVALUACIÓN DE RESULTADOS METODOLOGÍA 61  Porcentajes: o Se hallan los porcentajes de producción y sensibilidad de cada una de las legionelas, como productoras y como receptoras. o Calcular el ratio de producción/sensibilidad.  Ratio P/S > 1  Cepas de especies y/o serogrupos más productoras  Ratio P/S < 1  Cepas de especies y/o serogrupos más sensibles.  Ratio >> 1  Cepas de especies y/o serogrupos productoras y resistentes.  Ratio << 1  Cepas de especies y/o serogrupos poco productoras y muy sensibles.  Ratio = 1  Cepas de especies y/o serogrupos equilibradas. Algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados, son las siguientes: 1. Es posible que una sóla bacteriocina por bacteria pueda provocar la lisis. 2. Podría haber relación entre la resistencia y los receptores de la cepa base. Si no tiene receptores, no puede ser inhibida. Un único receptor podría ser suficiente para ser inhibida. 3. En la masa microbiana (crecimiento) debe de haber al menos 1 bacteriocina por cada una de las células bacterianas para que surjan los halos de inhibición carentes de colonias. 4. Se puede afirmar que en la zona inhibida no hay legionelas vivas si no muertas, además de poder corroborar que en el disco que preparamos hay suficientes bacteriocinas para antagonizar nuevas siembras de legionelas en medio BCYE-alfa. Claudia Sánchez 3. Resultados Trabajo Fin de Máster Máster Salud Pública Universidad de Zaragoza CONTENIDO: 1. RATIOS DE TABLAS PRODUCCIÓN/ SENSIBILIDAD 1.1. Legionella pneumophila 1.2. Legionella spp. 2. CLASIFICACIÓN EN PATRONES DE PRODUCCIÓN/ SENSIBILIDAD 2.1. Producción alta y muy baja sensibilidad 2.2. Producción baja y alta sensibilidad 2.3. Producción alta y alta sensibilidad 2.4. Producción media y alta sensibilidad 2.5. Producción y sensibilidad similares 3. DIFERENCIAS INTERESPECÍFICAS E INTRAESPECÍFICAS 4. ACTIVIDAD DE LAS LEGIONELAS FRENTE A OTRAS BACTERIAS 4.1. Frente a bacterias gram + 4.2. Frente a bacterias gram – 5. CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS DSE BACTERIOCINAS 5.1. Unidades arbitrarias (U.A.) 5.2. Naturaleza proteica 5.3. Estabilidad al pH 5.4. Tratamiento térmico 5.5. Conclusiones de la caracterización 6. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS DEL SOBRENADANTE 7. RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE BACTERIOCINAS 8. OTRAS INTERACCIONES DISTINTAS A LA INHIBICIÓN DE LA BACTERIA RESULTADOS 62 1. RATIOS DE LAS TABLAS PRODUCCIÓN/SENSIBILIDAD 1.1. Legionella pneumophila Se ha comparado la producción de bacteriocinas y sensibilidad a las mismas, de cepas pertenecientes a la especie Legionella pneumophila (SG. 1 (5 estirpes), SG.2-SG.14 (1 por cada serogrupo) y 19 especies distintas del género Legionella, entre ellas L. bozemanii (SG. 1 y SG. 2), L. feeleii (SGs. 1 y 2), L. haeckeliae (SGs. 1 y 2) y L. longbeachae (SGs. 1 y 2). Después de calcular a través del método descrito en la metodología, los porcentajes de producción y sensibilidad de cada una de las legionelas como productoras y receptoras, hemos obtenido los siguientes ratios, que nos servirán como análisis previo de los resultados: - L. pneumophila SG.1 1289: 1,37  Muy productora y algo sensible. - L. pneumophila SG.1 2189: 1,14  Menos productora y menos sensible que la 1289 pero igualmente equilibrada. - L. pneumophila SG.1 Knoxville: 0,59  Dentro del SG.1, la menos productora y la más sensible; la menos competitiva. - L. pneumphila SG.1 Philladelphia: 1,35  De características similares a la 1289 y 2189. - L. pneumophila SG.1. 4573: 1,24  Hay pocos datos; más productora que sensible. - L. pneumophila SG. 2: 0,79  Bastante sensible y algo productora. - L. pneumphila SG. 3: 0,88  Cepa equilibrada en cuanto a su producción y sensibilidad. - L. pneumophila SG. 4: 0,25  Serogrupo poco productor y muy sensible. Poco competitivo. - L. pneumophila SG. 5: 0,26  De similares características al serogrupo 4. - L. pneumophila SG. 6: 1,51  Serogrupo competitivo; alta productividad y relativamente baja sensibilidad. - L. pneumophila SG. 7: 2,34  Serogrupo de muy elevada productividad y baja sensibilidad. - L. pneumophila SG. 8: 4,21  El 100% de las pruebas realizadas con discos de SG.8 han dado inhibición. En cuanto a su faceta como receptora, es bastante resistente. RESULTADOS 69 Tabla 13. Ratio P/S e inmuinidad a sus legionelinas (Legionella spp.) Especie y serogrupo Ratio P/S Inmunidad a sus legionelina(s) L. anisa 0,17 NO L. bozemanii SG. 1 0,44 NO L. bozemanii SG. 2 0,89 NO L. cherrii 0,77 NO L. dumoffii 0,715 NO L. erythra 0,69 NO L. feeleii SG. 1 0,811 SÍ L. feeleii SG. 2 1,011 SÍ L. gormanii 0,96 NO L. hackeliae SG. 1 4,16 SÍ L. hackeliae SG. 2 1,06 SÍ L. israeliensis 1,15 NO L. jamestownensis 1,28 NO L. jordanis 2,22 SÍ L. longbeachae SG. 1 0,44 SÍ L. longbeachae SG. 2 1,15 SÍ L. maceachearnii 0,16 NO L. micdadei 0,72 NO L. oakridgensis 0,86 NO L. parisienses 1,34 SÍ L. sainthelensis 0,28 NO L. steigerwartii 0,16 SÍ L. wadsworthii 0,74 NO Fuente: Elaboración propia RESULTADOS 70 4. ACTIVIDAD DE LAS LEGIONELAS FRENTE A OTRAS BACTERIAS 4.1. Actividad de Legionella vs bacterias gram negativas Se han realizado pruebas de bacteriocinas de Legionella frente a cepas de bacterias de hábitat orofaringe gram negativos (N. lactamica y N. sicca) así como también frente a gram-positivos de origen hídrico (E. faecalis 19433). Se han realizado muchas pruebas con N. lactamica y N. sicca como receptoras, y aunque se han obtenido buenos resultados, la actividad inhibitoria de la Legionella sobre estas cepas es limitada, tal como se muestra en la siguiente tabla. TABLA 14. Actividad de Legionella spp. sobre Neisseria lactamica (ATCC2397) y Neisseria sicca (ATCC9913). Fuente: Elaboración propia Base: Neisseria lactamica (ATCC 2398) Base: Neisseria sicca (ATCC9913) L. pne. SG. 1 INHIBE Y BLOQUEA PIGMENTO L. anisa INHIBE L. pne. SG. 6 NO TIENE ACTIVIDAD L. gormanii INHIBE L. bozemanii SG. 1 BLOQUEA PIGMENTO L. jamestownensis INHIBE L. bozemanii SG. 2 BLOQUEA PIGMENTO L. micdedei NO TIENE ACTIVIDAD L. cherrii NO TIENE ACTIVIDAD L. parisienses NO TIENE ACTIVIDAD L. dumoffii NO TIENE ACTIVIDAD L. wadsworthii NO TIENE ACTIVIDAD L. feeleii SG. 2 NO TIENE ACTIVIDAD L. oakridgensis INHIBE Y BLOQUEA PIGMENTO L. oakridgensis INHIBE Y BLOQUEA PIGMENTO RESULTADOS 71 4.2. Actividad de Legionella vs bacterias gram positivas TABLA 15. Actividad Legionella frente a bacterias gram positiva Fuente: Elaboración propia Tal como puede observarse en la tabla, se probaron discos frente a S. pneumoniae, S. pyogenes y S. epidermidis; para ninguno de estas bases produjeron inhibición los discos probados Sin embargo, esta actividad fue distinta para la base de E. faecalis ATCC 19433. Este enterococo se enfrentó a varios extractos crudos filtrados de L. bozemanii SG.2 (extractos B4, B4(-10º)), a varias cepas de L. pneumophila. (1289, 4173, 225 y 223) y a L. jamestownensis. Los extractos B4 son de L. bozemanii SG. 2, el segundo conservado a menos 10ºC. Las cepas de L. pneumophila son cepas propias de colección bien de origen clínico (1289, 4573) o de origen ambiental, en este caso de la residencia militar "Los Castillejos" (223 y 225). Los únicos que mostraron actividad fueron los extractos B4 (-70º) y B4 (-10º), con un halo de 26 mm cada uno. S. pneumonia 13 S. pyogenes Lp1 Knox 0 L. bo-2 0 Lp1 Knox 0 L. bo-2 0 Lp1 Phila 0 L. cherrii 0 Lp1 Phila 0 L. cherrii 0 UZ2189 0 L. dumoffii 0 UZ2189 9 L. dumoffii 0 UZ1289 0 L. erythra 0 UZ1289 0 L. erythra 0 SG. 6 0 L. feeleii 1 0 SG. 6 0 L. feeleii 1 0 SG. 13 0 L. feeleii 2 0 SG. 13 0 L. feeleii 2 0 L. bo-1 0 L. gormanii 0 L. bo-1 0 L. gormanii 0 L. anisa 0 L. hackeliae 1 0 L. anisa 0 L. hackeliae1 0 S. pneumonia 14 S. epidermidis Lp1 Knox 0 L. bo-2 0 Lp1 Knox 0 L. bo-2 0 Lp1 Phila 0 L. cherrii 0 Lp1 Phila 0 L. cherrii 0 UZ2189 0 L. dumoffii 0 UZ2189 0 L. dumoffii 0 UZ1289 0 L. erythra 0 UZ1289 0 L. erythra 0 SG. 6 0 L. feeleii 1 0 SG. 6 0 L. feeleii 1 0 SG. 13 0 L. feeleii 2 0 SG. 13 0 L. feeleii 2 0 L. bo-1 0 L. gormanii 0 L. bo-1 0 L. gormanii 0 L. anisa 0 L. hackeliae1 0 L. anisa 0 L. hackeliae1 0 RESULTADOS 72 5. CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS DE BACTERIOCINAS A partir de aquí se continuaron haciendo pruebas con el extracto de L. bozemanii SG.2 y otros tantos. A continuación se muestran las imágenes de algunas pruebas realizadas con estos extractos. IMÁGENES 7 y 8. E. faecalis ATTC19433 frente extractos de bacteriocinas de Legionella. Fuente: Elaboración propia Se ha caracterizado el extracto enzimático de las siguientes cepas: Extractos de bacteriocinas de Legionellas caracterizados L. pneumophila SG. 1 UZ1289 L. pneumophila SG. 1 225 L. bozemanii SG. 1 L. bozemanii SG. 2 L. cherrii L. erythra L. feeleii SG. 1 L. feeleii SG. 2 L. parisiensis L. steigerwartii L. longbeachae SG. 2 L. micdade A continuación se detalla la caracterización del extracto enzimático crudo, centrifugado y filtrado de las cepas de L. pneumophila SG.1 (Knoxville) y L. bozemanii SG.2 (ATCC35545) tras cultivo en medio líquido durante 4 días a 36ºC, con un 10% de CO2. RESULTADOS 73 5.1. Unidades arbitrarias (U.A.) Para dicha caracterización se han seguido los planteamientos de Jacob, F; una contribución clave para la caracterización de las bacteriocinas producidas por E. coli, denominadas colicinas: 1. Espectro de actividad reducido 2. Naturaleza proteica 3. Mecanismo de acción bactericida 4. Unión a receptores específicos 5. Codificación por plásmidos que además confieren inmunidad frente a la bacteriocinas. 6. Dudas en los gram-positivos Dado los resultados obtenidos en la caracterización de dichos extractos enzimáticos, se ha comprobado su naturaleza proteica (inactivación por 7 proteasas; no por lisozima), estabilidad al pH (valores 3-11) y su termoresistencia a 80º, 90º y 100º durante 20 minutos. A continuación se muestra la valoración de la actividad de 16 cepas de Legionella spp. crecidas en BYE (alfa-ceto-ACES-L.cist.piro Fe) expresada en unidades arbitrarias, enfrentadas a las cepas indicadoras utilizadas en el estudio E. faecalis ATCC19433 y N. sicca ATCC9913. Tabla 16. Resultados de las U.A. de los extractos enzimáticos crudos. Fuente: Elaboración propia RESULTADOS 74 5.2. Caracterización del extracto: naturaleza proteica IMAGEN 9. U.A. del extracto enzimático de L. cherri frente a N. sicca. Fuente: Elaboración propia Para conocer la naturaleza proteica se ha sometido el extracto crudo enzimático a la acción de 7 proteasas y la lisozima. Dado que las bacteriocinas son compuestos inhibidores de naturaleza peptídica, la inactivación por proteasas es uno de los primeros criterios para definir una sustancia antimicrobiana como bacteriocina. Tabla 17. Sensibilidad de los extractos de L. pn. SG. 1 (Knoxville) y L. bozemanii SG. 2 a las enzimas. Fuente: Elaboración propia Características del extracto enzimático crudo Proteasa K XXI Proteasa XIV Proteinasa K Papaína Pronasa K Tripsina α-quimo tripsina Lisozima + + + + + + + - RESULTADOS 75 5.3. Caracterización del extracto: estabilidad al pH 5.4. Tratamiento térmico A continuación se muestra la estabilidad de la actividad de los extractos de L. bozemanii SG. 2, L. cherrii y L. erythra al someterse a un rango de pHs entre 3 y 11. IMAGEN 10. Estabilidad de la actividad del extracto crudo a diferentes pHs frente a la base receptora N. sicca. Fuente: Elaboración propia GRÁFICO 4. Estabiliidad de la actividad enzimática a diferentes pHs. Fuente: Elaboración propia Estos mismos extractos se sometieron a diferentes temperaturas tal como se describe en la metodología y éstos fueron los resultados: pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 bozemanii 2 20 19 19 20 20 29 18 17 16 20 cherrii 22 18 18 26 20 18 20 28 22 26 erythra 20 16 18 22 20 18 20 20 14 11 0 5 10 15 20 25 30 35 Halo de inhibición Estabilidad de la actividad enzimática según pH RESULTADOS 76 IMAGEN 11: Estabilidad de la actividad tras someterse a diferentes temperaturas. Fuente: Elaboración propia GRÁFICO 5. Estabilidad de la actividad de los extractos sometidos a diferentes temperaturas. Fuente: Elaboración propia 80º 5` 80 º 10` 80º 20` 90º 5` 90º 10` 90º 20' 100º 5' 100º 10` 100º 20` L. cherrii 24 24 24 24 24 24 31 26 32 L. erythra 20 18 22 20 20 22 24 40 50 L. bozemanii SG. 2 30 24 22 24 20 20 18 20 20 0 10 20 30 40 50 60 Halo de inhibición Estabilidad de la actividad enzimática según Tª y tiempo de exposición RESULTADOS 77 5.5. Conclusiones de la caracterización 6. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL EXTRACTO ENZIMÁTICO CRUDO (Sobrenadante) Podemos deducir estas posibles respuestas a los planteamientos de Jacob, F., Lwoff, S., Wollman, E.: 1. Espectro de actividad no es reducido sino amplio, más parecido al de las arqueobacterias. 2. Naturaleza proteica: SÍ 3. Mecanismo de acción bactericida: SÍ 4. Unión a receptores específicos 5. Codificación por plásmidos que además confieren inmunidad frente a la bacteriocinas.: 6. Dudas en los gram-positivos: muy limitada en las legionelas. Tabla 18. Características del extracto enzimático crudo. Fuente: Elaboración propia Tal como se indica en la metodología y a través de una curva de calibrado con BSA, se han obtenido los siguientes resultados: Gráfico 7. Curva de calibrado concentración BSA Fuente: Elaboración propia RESULTADOS 78 7. RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE BACTERIOCINAS La medición realizada con el espectofotómetro, dio lo siguientes resultados: Ésto, puede deberse a que el medio tiene proteínas, que una vez cultivado las pierde por procesos de crecimiento y metabólicos de la bacteria. Por tanto, éste blanco no sería el más adecuado para este experimento. De momento, tomamos el dato del espectofotómetro relativo al sobrenadante de L. bozemanii SG. 2 (B4 a 4ºC) para estimar la concentración de un extracto activo. Por tanto, y a través de la curva de calibrado, calculamos la concentración de proteínas de dicho extracto y estimamos que está alrededor de 7 µg/ml. Una vez conocida la concentración del extracto, deducimos que lo mejor sería concentrar éste extracto por precipitación; se precipitarán las proteínas por el agregado de un solvente orgánico (acetona). Una vez concentrado se procederá a la electroforesis. Paralelamente a la muestra concentrada, se correrá el caldo de cultivo de extracto de levadura, concentrado, para desestimar las proteínas que sean del propio medio. Las transferencias de la actividad de bacteriocinas producidas por legionelas frente a otras especies, incluídos serogrupos, que se hace a partir de los halos de inhibición, se han probado frente a cepas de bacterias de hábitat orofaringe gram negativos (N. lactamica y N. sicca) así como también frente a grampositivos de origen hídrico (E. faecalis ATCC19433). 1. Utilizando como receptora primera, la cepa L. pneumophila SG.1 UZ2189 se comprueba la actividad de L. dumoffi, L. feeleii SG. 1, L. israelensis, L. jordanis, L. longbeachae SG.1 y L. wadsworthii. De estas 7 cepas al aplicar los discos frente a la indicadora N. sicca, la segunda receptora, seran activas 5 especies excepto L. hackeliae SG. 2 y L. longbeachae SG. 1. 2. Al comparar el comportamiento de E. faecalis ATCC19433 como receptora tercera, frente a L. feeleii SG. 1, L. hackeliae SG. 2, L. longbechae SG. 1 y L. wadsworthii, estas cuatro especies presentaban actividad inhibidora. CONCLUSIONES 85 6. Dada la baja densidad de microorganismos en el agua, resulta poco probable la lisis de las legionelas planctónicas (libres), pero el contacto con otras bacterias en los biofilms, pueden implicar fenómenos de competición. 7. El extracto de 16 cepas de Legionella spp. tratado con proteasas pierde totalmente su actividad inhibitoria demostrando que la sustancia es proteinácea: 7.1. Tiene un espectro antimicrobiano amplio que incluye BGP y BGN. 7.2. Tiene unas propiedades físico-químicas adecuadas para resistir tratamientos por calor y cambios de pH. 7.3. Poseen un tamaño molecular de alrededor de 14 kDa, que es superior al P.M. de otras bacteriocinas estudiadas en otros trabajos que tenían alrededor de 1,5-2 KDa. 8. Además de antagonizar el crecimiento de legionelas y otras bacterias, influyen también en las reacciones metabólicas de otras bacterias anulando por ejemplo la pigmentación o produciendo hemólisis, y la posible repercusión en la virulencia de algunas bacterias. 9. De las especies y serogrupos estudiados, sólo 11 cepas poseen inmunidad a las legionelinas estudiadas, en tanto que todas las cepas producían bacteriocinas aunque en un grado variable. 10. Se ha demostrado la posibilidad de estudiar estas bacteriocinas de legionelas con otras bacterias indicadoras pertenecientes a las especies N. lactamica, N. sicca y E. faecalis, distintas a las legionelas, facilitando así, el trabajo en el laboratorio, excluyendo el uso de medio BCYE-α. Claudia Sánchez 5. Anexos Trabajo Fin de Máster Máster Salud Pública Universidad de Zaragoza ANEXOS 85 ANEXO 1. Siembras por agotamiento de las principales cepas receptoras de laboratorio (N. sicca, N. lactamica, E. faecalis). E. faecalis ANEXOS 86 ANEXO 2. Actividad de L.pneumophila sg.1 (2 cepas), sg.8, sg.11, y sg.14, L. maceachearnii y L. wadsworthii frente a L. jamestownensis, como receptora ANEXO 3. Actividad de diferentes serotipos de L. pneumophila [#1,#5,#6,#7,#8,#9,#10#14 ], L. anisa , frente a L. pneumophila SG.1(Philadelphia). 1 2 3 7 4 8 6 5 DISCOS. 1. L. pneumophila SG. 8 2. L. pneumophila SG. 14 3. L. longbeachae SG. 2 4. L. pneumophila SG. 1 (UZ4890) 5. L. pneumophila SG. 1 (UZ1289) 6. L. pneumophila SG. 11 7. L. maceachearnii 8. L. wadsworthii DISCOS. 1. L. pneumophila SG. 1 (UZ1289) 2. L. pneumophila SG. 7 3. L. pneumophila SG. 8 4. L. pneumophila SG. 9 5. L. anisa 6. L. pneumophila SG. 14 7. L. pneumophila SG. 6 8. L. pneumophila SG. 10 1 2 3 4 1 6 6 5 1 2 4 3 5 6 7 8 ANEXOS 87 ANEXO 4. Actividad de 2 cepas de Lpn1[UZ2189, UZ4890], Lpn SG.#7, #8, #9, #13, #14 y L. jordanis* frente a L. hackeliae SG. 2. ANEXO 5. Actividad antagonista entre L. bozemanii sg. 1, L. bozemanii sg 2 y L. jordanis. DISCOS. 1. L. pneumophila SG. 13 2. L. pneumophila SG.1 (UZ2189) 3. L. pneumophila SG. 9 4. L. pneumophila SG. 8 5. L. pneumophila SG. 7 6. L. pneumophila SG. 14 7. L. jordanis 8. L. pneumophila SG. 1 (UZ4890) 1 3 2 8 6 7 4 5 1 1. L. bozemanii SG1: doble inhibición por sí misma y por L. bozemanii SG.2. ¡¡¡Sinergia entre bacteriocinas de alto PM [halo pequeño] y bajo PM [halo grande]!!! 2. L. bozemanii SG. 2: autoinmune, activa frente a L. bozemanii SG. 1 y L. jordanis, por bacteriocinas de bajo PM. 3. L. jordanis: autoinmune, y sensible a L. bozemanii SG. 2, producen halo grande [bajo PM]. 1 2 3 ANEXOS 88 ANEXO 6. Idéntica actividad de 9 cepas de Legionella spp sobre 2 de Stahylococcus aureus [UZ68015 y ATCC25923] la primera de origen clínico y la segunda de origen ambiental ANEXO 7. Actividad inhibidora de los Extractos Crudos [3 días en medio líquido, centrif.104 y Fitrar] L. pneumophila SG. 1 (#1-3) y L. bozemanii SG.2(# 4-7) vs E. faecalis 19433. 1 2 6 4 5 3 7 ANEXOS 89 ANEXO 8. Tras la concentración de los extractos de L.pneumophila SG. 1(sn) y L.bozemanii SG. 2 (sn) incrementan los halos de inhibición. ANEXO 9. Actividad de 8 cepas de Legionella spp frente a Neisseria gonorrhoeae 1 2 5 8 1 6 4 7 3 DISCOS. 1. L. pneumophila SG. 1 (Philadelphia) 2. L. pneumophila SG.1 (Knoxville) 3. L. anisa 4. L. bozemanii SG. 1 5. L. micdadei 6. L. bozemanii SG. 2 7. L. pneumophila SG. 5 8. L. pneumophila SG. 12 ANEXOS 90 ANEXO 9. Póster publicado en Noviembre 2013 para las Jornadas del IUCA sobre las interacciones bacterianas de Legionella frente a otras especies. ANEXOS 91 ANEXO 9. Póster publicado en Noviembre 2013 para las Jornadas del IUCA sobre la caracterización del extracto enzimático crudo. ANEXOS 92 ANEXO 10. Abstract presentado en Noviembre 2013 para las Jornadas del IUCA sobre las interacciones bacterianas de Legionell. BIBLIOGRAFÍA 99 30. Guerrieri E., Bondi M., Sabia C., de Niederhausern S., Borella P., Messi P. Effect of Bacterial Interference on Biofilm Development by Legionella pneumophila. Curr. Microbiol (2008) 57:532-536. September 2008. 31. Guerreri E., Moreno Bondi, Paola Borella, Patrizia Messi. Influence of aquatic microorganisms on Legionella pneumophila survival. New Microbiologica, 30. 247-251; 2007. 32. Héchard Y., Ferraz S., Bruneteau E., Steinert M., Berjeaud J-M. Isolation and caracterization of a Staphylococcus warneri strain producing an antiLegionella peptide. FEMS Microbiology Letters 252 (2005) 19-23. 33. Heng NCK et al. The diversity of bacteriocins in gram-positive bacteria. Ecology and evolution. P. 49. 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