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Trabajo'Fin'de'Máster' Máster'Oficial'Universitario'en'Salud'Pública'2012>2013' Universidad'de'Zaragoza' ' CONTRIBUCIÓN'AL'ESTUDIO'DE'DETERMINANTES' GENÉTICOS'DE'RESISTENCIA'A'MACRÓLIDOS'Y' LINCOSAMIDAS'EN'BACTERIAS'GRAM'POSITIVAS'POR' PCR'A'TIEMPO'REAL' ' Cristina'Escolar'Miñana' ' ' Tutores:' Dra.%Dª%Mª%Carmen%Rota%García% Dr.%D.%Antonio%Herrera%Marteache% Departamento%de%Producción%Animal%y%Ciencia%de%los%Alimentos% Facultad%de%Veterinaria% Diciembre%2013% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 2 ' ' AGRADECIMIENTOS' ' Al%gobierno%de%Aragón%y%Fondo%Social%Europeo%2007N2010,%a%través% del% Grupo% Consolidado% de% Investigación% “Análisis% y% evaluación% de% la% Seguridad%Alimentaria”%(A01).% También%agradecer%en%primer%lugar%a%las%profesoras%Carmina%Rota%y% Pilar% Conchello% por% su% orientación,% ayuda% y% paciencia% prestada% durante% todo%el%trabajo%y%al%profesor%Antonio%Herrera%por%darme%la%oportunidad%de% realizarlo.% A% todas% las% personas% que% forman% parte%del% área% de% Nutrición% y% Bromatología% del% departamento% de% Producción% Animal% y% Ciencia% de% los% Alimentos%por%el%buen%ambiente%que%se%respira,%que%hace%que%el%trabajo% sea%más%agradable.% Muchas% gracias% a% la% Dra.% Carmen% Torres% por% compartir% sus% conocimientos,%sin%sus%cepas%este%trabajo%no%hubiera%podido%realizarse.% A%Mª%José%Rabanaque%y%Juan%Pablo%Alonso,%por%su%gran%dedicación,% gracias%a%vosotros%este%máster%continua%en%marcha.% Finalmente%a%ti,%yayo,%porque%siempre%te%sentiste%orgulloso%de%tener% una%nieta%veterinaria.% ' ' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 3 INDICE:' 1 RESUMEN''''''''''''''''''''''''……………………………………………….%%%%%%%%%%%5' % 2 INTRODUCCIÓN%%%%%%%%%%%%%%%………………………………………………%%%%%%%%%%%7' 2.1 Macrólidos'y'Lincosamidas'''''''''''' 2.2 Resistencia'antimicrobiana'''''''''''' 2.3 Detección'de'resistencia'a'antibióticos''''%' 2.3.1 Detección'fenotípica'de'resistencia'a'Macrólidos'y'Lincosamidas' 2.3.2 Nuevas'técnicas'moleculares/Detección'genotípica' 2.4 Problemática'de'la'transmisión'de'genes'de'resistencia''''' 2.4.1 Importancia'de'la'transmisión'de'genes'de'resistencia'en'la'cadena' alimentaria' 2.5 Listeria'spp.'y'Listeriosis'' 2.5.1 Resistencia'en'Listeria'spp.'aislada'de'alimentos' % 3 OBJETIVO'''''''''''''''''''''''''''''''''''...………………………………………%%%%%%%'24' % 4 MATERIAL'Y'MÉTODOS'''''''''''………………………………………….%%%%%%%25' 4.1 Cepas'bacterianas' 4.1.1 Cepas'de'referencia' 4.1.2 Cepas'de'Listeria(spp.'estudiadas' 4.1.3 Revivificación' 4.2 Test'de'susceptibilidad'y'resistencia'antimicrobiana'y'test'de' Inducción'“in(vitro”(' 4.2.1 Antibióticos'ensayados' 4.2.2 Test'de'difusión'en'disco' 4.2.3 Protocolo' i. Preparación%del%medio%de%cultivo%y%del%inóculo% ii. Estandarización%del%inóculo% iii. Siembra%de%las%placas% iv. Aplicación%de%los%discos%antibióticos% v. Lectura%e%interpretación%de%resultados% 4.3 Aislamiento'del'ADN'bacteriano'total'y'plasmídico' 4.3.1 Protocolo'de'aislamiento'del'ADN'total' • Método%1:%Extracción%con%PrepMan®)Ultra)% • Método%2:%Extracción%con%Lisostafina%y%Proteinasa%K% 4.3.2 Protocolo'de'aislamiento'del'ADN'plasmídico' 4.3.3 Evaluación'por'espectrofotometría'del'ADN'bacteriano'aislado' % Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 4 4.4 Optimización'de'la'reacción'de'PCR'para'cada'uno'de'los'genes' de'resistencia'ensayados' 4.4.1 Cebadores'seleccionados'' 4.4.2 Protocolo'PCR' 4.4.3 Optimización'de'las'condiciones'de'amplificación'para'cada'grupo' de'cebadores' 4.4.4 Evaluación'de'la'especificidad'de'los'cebadores'seleccionados:'curva' de'fusión' 4.5 Detección'del'producto'amplificado' 4.5.1 PCR'convencional'' 4.5.2 Electroforesis'horizontal'en'gel'de'agarosa' i. Preparación%del%gel% ii. Carga%de%las%muestras% iii. Preparación%de%la%cubeta%de%electroforesis% iv. Tinción%y%visualización%del%gel%en%transiluminador%de%luz%UV% 4.5.3 Purificación'del'ADN'amplificado' 4.6 Confirmación'de'las'secuencias'genéticas'' 4.7 Aplicación'de'la'técnica'RT>PCR'optimizada'para'la'detección' del'gen'lnu'A'en'cepas'de'Listeria'spp.'aisladas'de'alimentos.' % 5 RESULTADOS%%%%%%%%%%%%%%%%…………………………………………………%%%%%%%%%%%%%%45' 5.1 Test'de'difusión'en'disco'( 5.2 Evaluación'del'ADN'total'y'plasmídico'aislado'por' espectrofotometría' 5.3 Optimización'de'la'reacción'de'PCR'para'cada'uno'de'los'genes' de'resistencia'ensayados:''' 5.3.1 Optimización'de'la'temperatura'de'hibridación'y'concentración'de' los'cebadores'en'la'reacción' 5.3.2 Determinación'del'rango'dinámico'de'la'concentración'de'ADN' molde'en'la'reacción'de'amplificación' 5.4 Detección'del'producto'amplificado' 5.4.1 Electroforesis'horizontal'en'gel'de'agarosa'' 5.5 Confirmación'de'las'secuencias'genéticas'' 5.6 Correlación'entre'fenotipo'y'genotipo' 5.7 Caracterización'genética'del'patrón'de'resistencia'antibiótica'a' clindamicina'en'cepas'de'Listeria(spp.(aisladas'de'alimentos' % 6 CONCLUSIONES%%%%%%%%%%%……………………………………………………%%%%%%%%%%%%%69' 7 BIBLIOGRAFÍA%%%%%%%%%%%%%…………………………………………………….%%%%%%%%%%%%%70' %' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 5 1 RESUMEN' El% empleo% generalizado% de% antimicrobianos% en% el% sector% de% los% animales% productores% de% alimentos% y% la% aparición% de% cepas% resistentes% en% seres% humanos% ha% puesto%de%manifiesto%una%gran%preocupación%debido%a%los%problemas%que%esto%conlleva% en% el% tratamiento% de% las% enfermedades% infecciosas.% La% presencia% de% bacterias% resistentes% en% los% alimentos% destinados% al% consumo% humano% supone% un% riesgo% potencial,%no%solo%por%la%transferencia%de%genes%de%resistencia%que%tiene%lugar%entre%los% microorganismos,% sino% también% por% la% adquisición% de% esta% resistencia% por% parte% de% agentes%patógenos%que%pueden%transmitirse%al%hombre%por%medio%de%alimentos.% En% los% últimos% años,% se% ha% visto% incrementada% la% resistencia% a% MacrólidosN LincosamidasNEstreptograminas% (MLS).% Esta% resistencia% puede% ser% debida% a% varios% mecanismos,% y% su% expresión% fenotípica% varía% en% función% de% la% presencia% de% ciertos% genes% de% resistencia.% Una% incorrecta% detección% fenotípica% puede% llevar% al% fracaso% terapéutico,% por% lo% que% la% técnica% molecular% RTNPCR% (Polymerase) Chain) Reaction)% a% tiempo%real,%sirve%de%herramienta%rápida%y%precisa%para%detectar%secuencias%de%genes% específicos%que%codifican%la%resistencia%antibiótica.% %% El%objetivo%del%presente%trabajo%ha%sido%optimizar%la%técnica%de%PCR%en%tiempo% real%(RTNPCR)%para%evaluar%la%aplicación%de%este%procedimiento%de%cara%al%diagnóstico% rápido%de%la%resistencia%a%eritromicina%y%clindamicina%en%bacterias%Gram%positivas,%así% como%caracterizar%genéticamente%la%resistencia%a%clindamicina%en%cepas%de%Listeria%spp.% aisladas%de%alimentos.%% Para%ello%se%han%seleccionado%5%cepas%de%referencia%de%las%cuales%se%conocía%la% presencia%de%ciertos%genes%que%codifican%resistencia%a%antibióticos%del%complejo%MLS% (mef)A,)msr)A,)erm)A,)erm)B)y))lnu)A).%Se%ha%evaluado%el%aislamiento%de%ADN%total%y% plasmídico% mediante% tres% procedimientos% de% extracción,% y% se% ha% utilizado% la% herramienta%RTNPCR%a%tiempo%real%para%la%optimización%de%la%reacción%de%amplificación% de% este% ADN,% confirmándose% posteriormente% las% secuencias% de% los% fragmentos% amplificados.% Por%otra%parte,%se%han%aplicado%las%condiciones%optimizadas%para%el%gen%lnu)A% (resistencia%a%Lincosamidas),%en%23%cepas%de%Listeria)spp.%aisladas%de%alimentos%que%en% estudios%previos%mostraron%fenotipo%resistente%a%este%antibiótico.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 6 Los%resultados%obtenidos%muestran%la%idoneidad%de%la%técnica%molecular%RTNPCR% para% la% detección% de% genes% de% resistencia% a% antibióticos.% Además,% se% ha% podido% comprobar%que%la%resistencia%a%clindamicina%observada%“in)vitro”%en%estas%23%cepas%de% Listeria%spp.%puede%estar%determinada%por%otros%genes%de%resistencia%diferentes%al%gen% lnu%A%o%bien%por%mutación.% %' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 7 2 INTRODUCCIÓN' 2.1 Macrólidos'y'Lincosamidas'' Los% Macrólidos% constituyen% un% grupo% de% antibióticos% caracterizados% desde% el% punto%de%vista%estructural%por%poseer%un%anillo%macrocíclico.%El%mecanismo%de%acción% de% este% grupo% de% antibióticos% es% la% unión% a% la% subunidad% 50% S% del% ribosoma% bacteriano,%inhibiendo%la%síntesis%proteica.% Existen%otro%grupo%de%antibióticos,%que%son%las%Lincosamidas,%que%aunque%poseen% diferencias% estructurales% con% los% Macrólidos,% presentan% un% mecanismo% de% acción% similar%y%están%muy%relacionados%en%sus%mecanismos%de%resistencia%(Portillo%et)al.,% 2000).% Los% antibióticos% que% conforman% el% grupo% de% los% Macrólidos,% se% diferencian% entre% sí% por% el% número% de% átomos% que% conforman% el% anillo% macrocíclico,% lo% que% permite%clasificarlos%en%Macrólidos%de%14,%15%o%16%átomos.%% La%eritromicina%es%el%antibiótico%de%referencia%de%esta%familia%y%fue%descrita% por%primera%vez%en%1952%por%Mcguire%et) al.%(Weisblum%et) al.,%1998).%Su%uso%en%el% hombre% es% cada% vez% más% frecuente,% sobre% todo% por% ser% una% de% las% alternativas% terapéuticas%en%infecciones%estreptocócicas,%cuando%la%penicilina%no%es%efectiva;%bien% porque%el%agente%etiológico%presenta%mecanismos%de%resistencia%a%antibióticos%betaN lactámicos,%o%bien%por%presentar%los%pacientes%problemas%de%alergia%a%la%penicilina% (Portillo%et)al.,%2000).% El% grupo% de% las% Lincosamidas,% incluye% tanto% antibióticos% compuestos% por% productos% naturales,% como% es% el% caso% de% la% lincomicina,% como% derivados% semisintéticos,% siendo% el% caso% de% la% clindamicina% o% la% pirlimicina.% Esta% clase% de% antibióticos%fue%caracterizada%por%primera%vez%en%1960,%y%hoy%en%día%es%usada%para%el% tratamiento% de% un% amplio% espectro% de% infecciones% en% humanos% (Rezanka% et) al.,% 2007).%% Dentro% de% este% grupo,% la% clindamicina% es% uno% de% los% antibióticos% de% elección% para% el% tratamiento% de% las% infecciones% de% piel% y% tejidos% blandos% por% estafilococos% debido%a%su%buena%absorción%oral,%excelente%penetración%y%a%que%no%necesita%ajustarse% la%dosis%en%insuficiencia%renal.%También%se%usa%frente%a%anaerobios%gramNnegativos%y% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 8 protozoos%y%en%el%tratamiento%alternativo%en%pacientes%alérgicos%a%penicilina.%(Marita% morar% et) al.,% 2009).% Además,% es% una% opción% terapéutica% por% vía% oral% en% pacientes% ambulatorios%así%como%para%la%continuación%de%una%terapia%intravenosa%(MerinoNDíaz% et)al.,%2006).% Tanto% Macrólidos% como% Lincosamidas,% no% sólo% se% usan% en% medicina% humana,% sino%que%también%se%emplean%en%veterinaria%con%fines%terapéuticos%y%profilácticos.%Sin% ir% más% lejos,% estos% antibióticos% han% sido% recomendados% para% el% tratamiento% de% las% infecciones% cutáneas% en% los% animales% de% compañía% (Mueller% et) al.% 2008),% y% en% la% actualidad% se% aplican% en% ganado% lechero% ya% sea% para% controlar% y% prevenir% mamitis% subclínicas%o%para%el%tratamiento%de%infecciones%bacterianas%en%lactantes%(Lüthje%et)al,% 2006).' Tampoco%hay%que%olvidar%que%hasta%2006,%se%permitía%en%la%Unión%Europea%el% uso%de%antimicrobianos%en%animales%productores%de%alimentos%a%fin%de%aumentar%su% tasa%de%crecimiento%y%el%rendimiento%de%la%producción.%% De%hecho,%tilosina%y%espiramicina,%antibióticos%del%grupo%de%los%Macrólidos%con% estructura%similar%a%la%eritromicina,%fueron%de%los%últimos%antibióticos%prohibidos%como% promotores%del%crecimiento%animal%(Torres%et)al.%2002).% % Asimismo,%tanto%Macrólidos%como%Lincosamidas%son%algunos%de%los%antibióticos% que%la%Organización%Mundial%de%la%Salud%incluyó%en%la%lista%de%medicamentos%esenciales% para%un%sistema%básico%de%atención%de%salud%de%marzo%de%2011%(WHO,%2011).% 2.2 Resistencia'antimicrobiana'' Desde%la%aparición%de%la%penicilina;%hasta%nuestros%días,%se%han%descrito%diversos% agentes%antimicrobianos,%ya%sean%naturales%o%sintéticos,%con%diferentes%mecanismos%de% acción%y%con%un%espectro%cada%vez%más%amplio.%% El%descubrimiento%de%cada%fármaco%antimicrobiano%nuevo%ha%venido%acompañado,% años% más% tarde,% de% la% aparición% de% microorganismos% resistentes.% Se% trata% de% un% fenómeno%natural%por%el%cual%los%microorganismos%se%vuelven%resistentes%al%efecto%de% los%medicamentos%que%deberían%destruirlos%(INFOSAN%2008).% Las% bacterias% son% resistentes% intrínsecamente% a% uno% o% más% agentes% antimicrobianos% cuando% no% presentan% sensibilidad% al% antibiótico% de% manera% natural.% También% se% puede% adquirir% la% resistencia,% bien% por% cambios% puntuales% en% el% DNA% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 9 (mutación)% o% bien% por% la% adquisición% de% genes% de% resistencia% por% intercambio% de% material%genético%(plásmidos,%trasposones%e%integrones)%entre%especies%relacionadas%o% no% relacionadas% (Becerra% et) al.% 2009).% De% hecho,% muchos% de% los% determinantes% genéticos%de%resistencia%que%ahora%se%encuentran%en%plásmidos%pueden%tener%su%origen% en%el%cromosoma%de%otras%especies%(Livermore,%2003).% La%resistencia%adquirida%se%debe%fundamentalmente%a%tres%mecanismos:% - Inactivación%enzimática%del%antibiótico.%% - Alteración% del% sitio% blanco% impidiendo% la% unión% del% antibiótico% a% su% diana% ribosomal.%% - Modificación%de%la%barrera%de%permeabilidad%a%través%del%eflujo%activo%del% antibiótico.% En%el%caso%de% los%Macrólidos%y%las%Lincosamidas,%al%poseer% un%mecanismo%de% acción% similar,% se% les% agrupa% junto% a% las% Estreptograminas% en% el% complejo% de% antibióticos% MacrolidosNLincosamidasNEstreptograminas% (MLS).% La% razón% de% esta% agrupación% se% basa% originalmente% en% observaciones% empíricas% de% la% bacteriología% clínica%donde%la%resistencia%a%una%clase%de%antibióticos%a%menudo%involucra%resistencia%a% las%otras%dos%clases%(Weisblum,'1995).% La%resistencia%bacteriana%a%este%grupo%de%antibióticos%puede%ser%tanto%intrínseca% como%adquirida.% La% resistencia% intrínseca% se% ha% descrito% en% bacterias% GramNnegativas% de% la% familia% Enterobacteriaceae,% Pseudomonas%spp.y% Acinetobacter%spp,% y% se% debe% principalmente% a% la% baja% permeabilidad% de% la% membrana% externa% ya% que% estos% antibióticos% tienen% un% comportamiento% hidrofóbico% (Mao% et) al.,% 1968,% % Fluit% et) al.,% 2001).% En%cuanto%a%la%resistencia%adquirida,%a%lo%largo%de%los%años%han%sido%detectados% gran% variedad% de% genes% de% resistencia% frente% a% las% tres% clases% de% antibióticos% del% complejo%MLS,%confiriendo%resistencia%a%Macrólidos,%Lincosamidas%y%Estreptograminas% simultáneamente;%y%otros,%que%tan%solo%confieren%resistencia%a%uno%o%dos%antibióticos% de%este%complejo%(Roberts%et)al.,%1999).%Aunque%en%todas%las%especies%bacterianas%no% han% sido% encontrados% todos% estos% mecanismos% de% resistencia% adquiridos,% está% claro% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 16 % Figura'4:'Esquema'de'la'curva'de'fusión'tras'RT>PCR,'para'diferentes'cantidades'de'ADN'' La% temperatura% de% fusión% también% llamada% “melting% temperatura”% (Tm),% es% aquella% en% la% que% se% desnaturaliza% el% 50%% del% ADN,% por% lo% que% cada% fragmento% amplificado% tiene% una% Tm% característica.% Esto% permite% diferenciar% distintos% fragmentos,% ya% que% incluso% los% amplicones% que% difieren% en% un% solo% nucleótido,% pueden% desnaturalizarse% a% diferentes% temperaturas% y% pueden% detectarse% por% sus% picos%de%desnaturalización.%% De% esta% manera,% se% pueden% detectar% diferentes% fragmentos% amplificados% siempre%y%cuando%el%valor%Tm%sea%distinto%entre%ellos.%% Esto,% unido% al% hecho% de% que% la% RTNPCR% se% adapta% para% la% evaluación% de% un% número%grande%de%muestras%al%mismo%tiempo,%hace%de%esta%técnica%una%herramienta% útil%para%detectar%los%genes%que%codifican%ciertas%resistencias%a%antibióticos%y%permite% seleccionar% el% tratamiento% más% adecuado% en% infecciones% causadas% por% microorganismos%multirresistentes,%sobre%todo%en%los%casos%de%resistencia%cruzada%a% los% antibióticos% del% complejo% MLS% en% los% que% los% métodos% de% detección% “in) vitro”% puede%dar%lugar%a%falsos%negativos%(MerinoNDíaz%et)al.,%2007,%RodríguezNHerrera%et)al.,% 2009).% A%pesar%de%todas%estas%ventajas,%es%importante%tener%en%consideración%algunos% factores%que%afectan%a%esta%técnica.% En%primer%lugar,%es%necesario%llevar%a%cabo%la%optimización%de%la%reacción.%Para% ello% se% deben% ensayar% diferentes% concentraciones% de% cebadores% así% como% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 17 temperaturas% de% hibridación% hasta% elegir% aquellas% condiciones% que% maximicen% la% eficiencia%de%la%reacción.% Por%otra%parte%también%hay%que%tener%en%cuenta%la%calidad%y%cantidad%del%ADN% extraído.%Por%ello,%la%extracción%de%los%ácidos%nucleicos%de%la%muestra%juega%un%papel% crítico% y% fundamental% ya% que% se% requiere% una% técnica% que% permita% romper% la% pared% bacteriana,%preservando%el%ADN%diana.% Hoy%en%día%existen%numerosos%métodos%de%extracción%y%productos%comerciales% dirigidos%a%la%extracción%de%ADN%en%diferentes%tipos%de%muestras.%Todos%ellos%llevan%a% cabo% una% lisis% celular% por% medio% de% diferentes% buffers% de% extracción,% así% como% la% inactivación%de%nucleasas%celulares%y%la%separación%de%los%ácidos%nucleicos%de%los%restos% de%células%(Somma%M.,%WHO%2006).% % 2.4 Problemática'de'la'transmisión'de'genes'de'resistencia'' Aunque%la%resistencia%a%los%antimicrobianos%es%un%fenómeno%biológico%natural,% se% convierte% en% un% problema% significativo% para% la% salud% pública% cuando% se% ve% exacerbado%por%el%abuso%y%el%mal%empleo%de%los%antibióticos%en%el%tratamiento%de%las% enfermedades% humanas,% así% como% su% uso% indiscriminado% en% la% ganadería% o% la% agricultura.%% La%resistencia%antimicrobiana%hace%que%se%reduzca%la%eficacia%del%tratamiento,% puesto% que% los% microorganismos% resistentes% no% responden% a% los% tratamientos% habituales,%con%lo%que%los%enfermos%persisten%infectados%por%más%tiempo,%hecho%que%a% su%vez%propicia%la%propagación%de%estos%microorganismos%resistentes%a%otras%personas% (WHO%2012).% Como%ya%se%ha%comentado%anteriormente,%la%resistencia%a%los%antimicrobianos% es%un%fenómeno%antiguo%codificado%por%genes%que%se%transmiten%bien%de%forma%vertical% de% una% generación% de% microorganismos% a% otra,% o% bien% de% forma% horizontal% a% otras% bacterias% que% pueden% ser% de% distinta% especie% e% incluso% género% mediante% la% transferencia%del%material%genético%que%codifica%esa%resistencia.%Esta%última%es%la%forma% más%común%de%transmisión%de%resistencias.%%% Afortunadamente,%la%mayoría%de%los%microorganismos%sensibles%no%se%vuelven% resistentes%fácilmente.%La%resistencia%que%se%observa%hoy%en%la%práctica%clínica%suele% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 18 haberse%desarrollado%en%otra%persona,%animal%o%reservorio%medioambiental%en%alguna% otra%parte%del%mundo%muchos%años%antes%(WHO%2013).%En%el%último%decenio,%la%OMS%ha% emprendido% muchas% iniciativas% para% estudiar% la% resistencia% a% los% antimicrobianos% y% hacerle% frente,% particularmente% en% relación% con% algunas% de% las% enfermedades% más% mortíferas%en%el%mundo%(WHO,%2011).% A%nivel%Europeo,%existe%una%red%de%sistemas%nacionales%de%vigilancia%(EARSNNet)% coordinada% y% financiada% por% el% Centro% Europeo% para% la% Prevención% y% Control% de% Enfermedades%(ECDC),%que%proporciona%datos%de%referencia%sobre%la%resistencia%a%los% antimicrobianos%con%el%fin%de%mitigar%el%riesgo%de%que%sigan%apareciendo%resistencias%y% preservar%la%eficacia%de%todos%los%antimicrobianos.% 2.4.1 Importancia'de'la'transmisión'de'genes'de'resistencia'en'la'cadena' alimentaria' En%los%últimos%10%años,%numerosas%publicaciones%científicas,%han%destacado%la% posible% relación% entre% el% uso% de% antibióticos% en% animales% y% el% incremento% de% resistencias%a%dichos%compuestos%en%bacterias%de%importancia%en%patología%humana%y% animal%(Torres%et)al.,%1998).%% Una% Comisión% mixta% de% la% Organización% de% las% Naciones% Unidas% para% la% alimentación%y%la%Agricultura%(FAO),%la%Organización%Mundial%de%Sanidad%Animal%(OIE)%y% la%Organización%Mundial%de%la%Salud%(OMS)%celebrado%en%Ginebra%en%2003%llegó%a%la% conclusión% de% que% existen% pruebas% claras% de% que% la% aparición% de% microorganismos% resistentes%a%raíz%del%uso%no%humano%de%antimicrobianos%tiene%consecuencias%adversas% para%la%salud%humana%(INFOSAN%2008).% En% 2011,% la% Autoridad% Europea% de% Seguridad% alimentaria% (EFSA)% publicó% una% evaluación%sobre%el%riesgo%de%resistencia%antimicrobiana%transmitida%por%%los%alimentos% y% por%los% animales% destinados% a% la% producción% de% alimentos.% El% panel% de% Peligros% biológicos%(BIOHAZ)%de%EFSA%concluyó%que%el%uso%de%antimicrobianos%en%piensos%para% animales%productores%de%alimentos%es%un%factor%de%riesgo%para%la%extensión%de%estas% cepas%bacterianas%resistentes%(EFSA%2011).% En% el% sector% de% la% producción% animal% se% utilizan% antimicrobianos% para% el% tratamiento% de% infecciones% en% animales% de% forma% individual% o% colectiva.% En% muchas% ocasiones%se%administran%tratamientos%profilácticos%y%metafilácticos%para%prevenir%la% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 19 propagación%de%infecciones%de%animales%enfermos%a%sanos.%Además,%anteriormente,%se% empleaban%antimicrobianos%en%dosis%subterapéuticas,%con%el%objetivo%de%promover%el% crecimiento%animal%(INFOSAN%2008).% Los%agentes%antimicrobianos%utilizados%en%Europa%para%animales%productores%de% alimentos%son%con%frecuencia%los%mismos,%o%pertenecen%a%las%mismas%clases%que%los% utilizados%en%la%medicina%humana%(EFSA%2013).% De% una% forma% o% de% otra,% la% exposición% prolongada% a% dosis% bajas% de% antimicrobianos%ha%dado%lugar%a%una%presión%selectiva%de%bacterias%resistentes%en%la% microbiota,%ya%sean%patógenas,%comensales%o%bacterias%del%medio%ambiente%(Torres%et) al.,%2002).%% Además,% esta% resistencia% que% tiene% lugar% en% los% animales% destinados% a% la% producción% de% alimentos,% se% puede% propagar% al% humano% no% sólo% a% través% de% los% alimentos%y%el%agua%sino%también%a%través%de%la%contaminación%del%medio%ambiente%o% del%contacto%directo%con%los%animales%(EFSA%2013).% En%el%último%informe%científico%de%la%Agencia%Europea%de%Seguridad%Alimentaria% (EFSA)%y%el%Centro%Europeo%de%Prevención%y%Control%de%Enfermedades%(ECDC)%sobre%la% resistencia%antimicrobiana%basado%en%datos%recogidos%a%los%largo%del%2011,%tanto%las% cepas%de%Salmonella%como%de%Campylobacter%aisladas%a%partir%de%casos%humanos,%así% como% de% animales% productores% de% alimentos% y% de% alimentos% en% la% Unión% Europea,% presentaban%resistencia%de%forma%regular.%Este%hecho%también%se%observa%en%bacterias% indicadoras/comensales% como% Escherichia) coli) y) Enterococos% aislados% de% animales% y% alimentos.% Por% todo% ello,% es% motivo% de% preocupación% la% reciente% aparición% de% resistencias%antimicrobianas%en%bacterias%transmitidas%por%alimentos,%y%más%aun%si%se% trata%de%microorganismos%patógenos%que%puedan%causar%enfermedades%en%humanos.% (EFSA%2013).% La%participación%de%la%OMS%en%cuestiones%relacionadas%con%la%resistencia%a%los% antimicrobianos%transmitida%por%los%alimentos%se%remonta%a%1990,%y%su%interés%creció%a% partir% de% 1997,% cuando% se% identificaron% problemas% médicos% derivados% del% uso% de% antimicrobianos% en% la% producción% de% ganado% (INFOSAN,% 2008).% Ya% en% 2001,% la% OMS% publicó% los% principios% mundiales% para% la% contención% de% la% resistencia% a% los% antimicrobianos% en% los% animales% destinados% al% consumo,% fijando% un% marco% de% recomendaciones% para% reducir% el% uso% excesivo% o% indebido% de% antimicrobianos% en% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 20 animales% productores% de% alimentos% con% miras% a% proteger% la% salud% humana% (WHO,% 2001).%% Durante% los% últimos% diez% años,% la% FAO,% la% OIE% y% la% OMS% han% abordado% conjuntamente%la%cuestión%del%riesgo%de%aparición%y%propagación%de%microorganismos% resistentes% asociados% al% uso% de% antimicrobianos% en% animales,% elaborado% directrices% para%el%uso%responsable%y%prudente%de%los%antimicrobianos%en%animales%productores%de% alimentos%(INFOSAN,%2008).% En% Europa,% a% raíz% de% las% conclusiones% de% diversos% informes% y% dictámenes% científicos,%se%ha%adoptado%una%decisión%que%establece%una%serie%de%normas%detalladas% para% la% vigilancia% y% la% notificación% % de% la% resistencia% a% los% antibióticos% en% bacterias% zoonóticas%(Salmonella%spp.,%%Campylobacter)jejuni%y%Campylobacter)coli)%y%comensales% (Escherichia)coli,%Enterococcus)faecalis%y%Enterococcus)faecium).%El%objetivo%es%%llevar%a% cabo% un% seguimiento% armonizado% a% partir% de% muestras% de% animales% destinados% a% la% producción% de% alimentos% así% como% directamente% de% distintos% alimentos,% dando% prioridad%a%los%más%implicados%desde%el%punto%de%vista%de%la%salud%pública.%(Decisión% 2013/652/UE)% % 2.5 Listeria'spp.'y'Listeriosis'' En% las% últimas% tres% décadas,% la% listeriosis% se% ha% convertido% en% los% % países% desarrollados% en% una% de% las% principales% zoonosis% emergentes% de% transmisión% alimentaria.% Según% indica% el% último% informe% de% fuentes% y% tendencias% de% zoonosis% y% agentes%zoonóticos%de%la%Agencia%Europea%de%Seguridad%Alimentaria%(EFSA,%2013),%en%el% 2011%se%confirmaron%en%la%Unión%Europea%1476%casos%de%listeriosis%en%humanos.%En%ese% mismo%año,%había%tenido%lugar%3%brotes%de%listeriosis%de% origen%alimentario.%Uno%de% ellos,%fue%un%brote%en%el%hogar%que%afecto%a%11%personas,%todas%fueron%hospitalizadas%y% de% todas% ellas,% 4% fallecieron.% El% alimento% vehículo% identificado% fue% un% queso% de% elaboración%casera.%Los%otros%dos%brotes%de%listeriosis%afectaron%a%5%personas%en%total,% (todas%fueron%hospitalizadas)%y%fueron%vinculadas%a%productos%de%panadería%y%mezcla% de%alimentos%(EFSA%2013).% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 21 El%género%Listeria%comprende%un%grupo%de%bacterias%Gram%positivas%que%lo%forman%% diez% especies,) aunque% es) Listeria) monocytogenes% la% única% especie% patógena% para% el% hombre,%responsable%de%producir%listeriosis.%% Listeria) spp.% está% ampliamente% extendida% en% el% ambiente,% especialmente% en% el% suelo,%plantas%y%forrajes,%aunque%también%se%puede%encontrar%en%personas%y%animales% (domésticos% y% salvajes).% La% principal% vía% de% transmisión% a% los% seres% humanos% y% los% animales% es% a% través% del% consumo% de% alimentos% y% piensos% contaminados% respectivamente,%(el%99%%de%las%infecciones%por%Listeria%son%atribuidas%a%la%ingestión%de% alimentos% contaminados,% Ruiz% Bolivar% et) al.,% 2008).% También% se% puede% transmitir% directamente%del%animal%a%las%personas%así%como%de%persona%a%persona,%aunque%estos% casos%son%menos%frecuentes.%Este%microorganismo%se%caracteriza%por%la%capacidad%que% tiene%de%multiplicarse%a%temperaturas%de%refrigeración%2N4ºC,%lo%que%hace%vulnerables% aquellos%alimentos%listos%para%el%consumo%así%como%los%que%presentan%una%larga%vida% útil%(fiambres%y%productos%cárnicos,%quesos%blandos,%pescados%ahumados…).% La% listeriosis% afecta% principalmente% a% personas% vulnerables% como% son% inmunodeprimidos,% personas% mayores,% embarazadas% y% recién% nacidos.% Los% síntomas% varían% desde% una% leve% diarrea% a% graves% infecciones% caracterizadas% por% septicemia% y% meningoencefalitis%pudiendo%causar%la%muerte%(OIE,%2004;%OMS,%2004).% Aunque%es%una%enfermedad%relativamente%poco%común,%su%gravedad%y%el%hecho%de% que% esté% muy% fuertemente% asociada% a% alimentos,% la% sitúan% actualmente% entre% las% enfermedades%transmitidas%por%alimentos%de%mayor%relevancia%social%y%económica.% De% todas% las% zoonosis% bajo% vigilancia% en% la% Unión% Europea,% listeriosis% fue% la% enfermedad%más%severa%con%un%93,6%%de%casos%hospitalizados%y%134%fallecidos%(tasa%de% mortalidad%12,7%)%(EFSA%2013).% Actualmente,% el% tratamiento% de% referencia% para% la% listeriosis% se% basa% en% una% asociación% sinérgica% de% altas% dosis% de% aminopenicilinas% (ampicilina% o% amoxicilina)% y% gentamicina,% aunque% la% rifampicina,% vancomicina,% Linezolid,% y% carbapenemes% se% han% propuesto%como%posibles%alternativas,%también%trimetoprim%es%generalmente%utilizado% en%caso%de%intolerancia%a%los%betaNlactámicos%(Morvan%et)al.,%2010).%%% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 22 2.5.1 Resistencia'a'antibióticos'en'Listeria'spp.'aislada'de'alimentos' Ya%desde%1988,%numerosos%estudios%han%revelado%la%existencia%de%cepas%de%Listeria% spp.%aisladas%de%humanos,%cadenas%de%producción%de%alimentos%o%del%medio%ambiente% resistentes%a%uno%o%más%antibióticos%mediante%test%“in)vitro”%(Morvan%et)al.,%2010).%% Años%antes,%ya%se%habían%publicado%trabajos%acerca%de%plásmidos%móviles%en%este% género% (PérezNDiaz% J.C.% et) al.,% 1982),% pero% fue% con% la% aparición% de% estas% cepas% multirresistentes,%cuando%se%empezó%a%estudiar%la%transferencia%de%elementos%móviles% que%codifican%resistencia%a%varios%antibióticos%(Vicente%M.F.%et)al.,%1988).% De%hecho,%varios%trabajos,%muestran%que%esta%transferencia%horizontal%de%material% genético%es%relativamente%común,%y%no%solo%entre%especies%de%Listeria%sino%también%con% otras%bacterias%GramNpositivas%relacionadas%evolutivamente%como%Enterococcus%spp.%o% Streptococcus%spp.%(PoyartNSalmeron%et%al.%1990,%Slade%et%al.,%1990,%Facinelli%et%al.%1991,% Roberts%et%al.,%1996,%Tsakaris%et%al.,%1997,%Charpentier%et%al.,%1999).% Con%el%paso%de%los%años,%se%han%descritos%varios%tipos%de%plásmidos%y%transposones% así% como% diversos% genes% que% codifican% resistencia% a% antibióticos;% sobre% todo% a% tetraciclinas,% puesto% que% es% la% resistencia% más% frecuente% en% Listeria) monocytogenes% aislada%de%humanos%(Charpentier%et)al.,%1999).% Existen% numerosos% estudios% acerca% de% la% sensibilidad% y% resistencia% “in) vitro”% a% antibióticos% como% clindamicina% o% eritromicina,% pero% sólo% un% número% limitado% de% trabajos%se%han%centrado%en%los%determinantes%genéticos%de%resistencia%a%Macrólidos%y% Lincosamidas%en%Listeria%spp.,%especialmente%en%aislados%no%humanos.% En% 1996% se% describió% por% primera% vez% el% gen% erm% C% en% cepas% de% L.) innocua%y% L.) monocytogenes%aisladas%de%alimentos%que%presentaron%un%MIC%de%eritromicina%elevado% (256%mg/ml)%(Roberts%et%al.%1996).% En% 2005,% se% realizó% un% estudio% de% genes% de% resistencia% en% cepas% de% Listeria) monocytogenes%aisladas%del%ambiente%de%4%granjas%de%vacuno%lechero,%en%las%que%se% analizó%el%gen%erm)B%como%determinante%genético%de%resistencia%a%eritromicina.%Todas% las%cepas%analizadas%eran%susceptibles%a%este%antibiótico,%y%ninguna%presentó%este%gen% (Srinivasan%et)al.,%2005).% En% otro% estudio% llevado% a% cabo% entre% 1996% y% 2006,% en% cepas% de% Listeria) monocytogenes%aisladas%de%alimentos%y%medio%ambiente%en%Francia,%se%detectó%el%gen% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 23 erm%B%en%las%dos%únicas%cepas%que%presentaron%resistencia%a%eritromicina%“in)vitro”.%En% este%mismo%estudio%también%se%analizó%la%presencia%de%los%genes%erm%A,%erm%C,%erm%TR,) mef%A%y%msr%A,%pero%ninguno%fue%detectado%(Granier%et)al.,%2011).% Aunque%la%resistencia%adquirida%en%cepas%de%Listeria%spp.%no%implica%antibióticos% clínicamente%importantes,%la%posibilidad%de%transferencia%de%genes%de%resistencia%en% este%género%tan%ubicuitario,%refuerzan%la%necesidad%de%una%vigilancia%epidemiológica%de% los%patrones%de%resistencia.% Además,% siendo% que% la% listeriosis% es% una% enfermedad% con% tasas% de% hospitalización%muy%elevadas,%es%conveniente%llevar%a%cabo%una%vigilancia%continuada% de%la%resistencia%emergente%de%este%patógeno,%para%así%poder%contribuir%a%la%garantía% de%seguridad%en%el%tratamiento%eficaz%de%la%listeriosis%humana,%sobre%todo%en%los%casos% en%los%que%la%resistencia%puede%estar%enmascarada.%% % %' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 24 3 OBJETIVOS' 3.1 Optimización%del%método%PCR%a%tiempo%real%para%la%detección%de% determinantes%genéticos%de%resistencia%a%Macrólidos%y%Lincosamidas%en% bacterias%Gram%positivas.% 3.2 Evaluación%de%la%aplicación%de%la%técnica%PCR%a%tiempo%real%para%el% diagnóstico%rápido%de%resistencia%a%Macrólidos%y%Lincosamidas%% 3.3 Caracterización%genética%de%la%resistencia%a%clindamicina%en%cepas%de% Listeria)spp.%aisladas%de%alimentos.% % %' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 25 4 MATERIAL'Y'MÉTODOS' El% material% utilizado% en% este% trabajo% aparece% reseñado% con% cada% una% de% las% metodologías%utilizadas.% 4.1 Cepas'bacterianas' 4.1.1 Cepas'de'referencia' Para% la% detección% de% los% genes% de% resistencia% a% Macrólidos% (eritromicina)% y% Lincosamidas% (clindamicina),% se% han% utilizado% 5% cepas% bacterianas:% 3%Staphylococcus) aureus,) 1) Staphylococcus) pseudintermedius) y) 1) Streptococcus) agalactiae,% cedidas% amablemente%por%la%Dra.%Carmen%Torres,%del%área%de%Bioquímica%y%Biología%molecular% de%la%Universidad%de%la%Rioja,%y%que%contienen%los%siguientes%genes%de%resistencia:% Tabla'2:'Cepas'de'referencia,'genes'y'resistencia'antibiótica' CEPA'BACTERIANA' GEN' ANTIBIOTICO' RESISTENTE' Streptococcus)agalactiae% mef)A) NEritromicina% Staphylococcus)aureus)C2548% erm)A) NEritromicina% NInducción%a%Clindamicina% Staphylococcus)pseudintermedius)C2381% erm)B) NEritromicina% NInducción%a%Clindamicina% Staphylococcus)aureus)C2929% msr)A) NEritromicina% Staphylococcus)aureus)C5425% lnu)A) NClindamicina% Estas% cepas% fueron% enviadas% en% diferentes% medios% de% cultivo:% Agar% Mueller% Hinton%y%Mueller%Hinton%suplementado%con%5%%de%sangre%desfribinada.% Una%vez%en%nuestro%laboratorio,%se%procedió%a%su%revivificación%e%identificación% bioquímica%del%siguiente%modo:% 1)%Resuspensión%de%una%colonia%en%10%ml%de%caldo%BHI%(Brain%Heart%Infusion,% MERCK)%estéril,%homogeneización%e%incubación%a%37ºC%12N24%horas.% 2)%Homogeinización%de%los%tubos%BHI%incubados%y%siembra%por%agotamiento%en% TSA%%(Trypticase%Soy%Agar,%OXOID)%e%incubación%a%37ºC%12N24%horas.% A%partir%de%una%colonia,%se%realizó%la%identificación%mediante%la%galería%API%20% strep%y%API%Staph%(Biomerieux®),%que%permiten%hacer%una%identificación%bioquímica%de% especies%de%los%géneros%Streptococcus)y)Staphylococcus.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 32 extracción% de% ADN% genómico% total% para% la% detección% de% genes% de% resistencia% en% las% distintas%cepas%de%referencia.) En%primer%lugar%se%utilizó%el%método%PrepMan®) Ultra)Sample)Preparation)Reagent) Protocol%en%todas%las%cepas;%y%posteriormente,%se%probó%el%método%de%extracción%con% Lisostafina%y%proteinasa%K%en%aquellas%pertenecientes%al%género%Staphylococcus.% Por% otra% parte,% se% ha% utilizado% un% único% método% de% extracción% para% el% ADN% plasmídico,%Plasmid)MiniPrep)Kit®.% 4.3.1 Protocolo'de'aislamiento'del'ADN'total' • Método'1:'Extracción'con'PrepMan®(Ultra(' Para%la%extracción%de%ADN%se%utilizó%el%producto%comercial%PrepMan®)Ultra)Sample) Preparation) Reagent) Protocol%siguiendo%el%protocolo% recomendado%por%el%fabricante% (Applied)Biosystem).% - A%partir%de%1%ml%de%cultivo%bacteriano%homogenizado%en%eppendorf%estéril%de% 1,5%ml,%se%centrifuga%a%13000%rpm%durante%3%minutos%en%un%equipo%Beckman) coulter)TM.% - Tras%la%centrifugación%se%elimina%el%sobrenadante%con%micropipeta%esteril%y%se% añaden% 200% µl% de% PrepMan®) Ultra) Sample) Preparation) Reagent) (Applied) Biosystems),%resuspendiéndose%el%“pellet”%cuidadosamente.%% - Se%%homogeniza%en%vortex%durante%30%segundos,%y%se%mantiene%a%100ºC%durante% 10%minutos%en%un%termoblock%(Block)Heater/SBH)130/Stuart®).)% - Posteriormente% se% lleva% a% temperatura% ambiente% durante% 2% minutos,% tras% lo% cual%se%procede%a%una%nueva%centrifugación%a%13000%rpm%durante%10%minutos.%% - Se% recoge% el% sobrenadante% que% contiene% la% solución% de% ADN,% se% alicuota% en% eppendorf% estéril% de% 0,2% ml% marcado% adecuadamente% y% se% conserva% en% congelación%a%N20ºC%hasta%su%amplificación%por%PCR.%% % Para% el% control% negativo% de% la% extracción% se% utiliza% 1% ml% de% caldo% BHI% estéril% sometiéndolo%al%mismo%proceso%de%extracción.% • Método'2:'Extracción'con'Lisostafina'y'Proteinasa'K' Para% la% extracción% de% ADN% en% cepas% del% género% Staphylococcus% se% utilizaron% varios%reactivos:%% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 33 - Lysostaphin%obtenida% de% % Staphylococcus%staphylolyticus%a% una% concentración% de%1mg/ml%(SigmaNAldrich®)%%% - Proteinasa%K%a%una%concentración%de%2mg/ml%(Bioron®).%% - Tampón%TrisNHCl%0,1M%pH8.% - Agua%miliQ%estéril.% El% protocolo% llevado% a% cabo,% fue% el% recomendado% por% la% Sociedad% Española% de% Enfermedades%Infecciosas%y%Microbiología%Clínica%para%Sthapylococcus%spp.% %A% partir% de% una% colonia% aislada% en% medio% TSA,% se% resuspende% en% un% eppendorf% estéril%de%1,5ml%con%45µl%de%agua%miliQ%y%5µl%de%lisostafina.%% - Se%homogeneiza%en%vortex%para%dejar%incubando%a%37ºC%durante%10%minutos%en% un%termoblock%(Block)Heater/SBH)130/Stuart®).% - Posteriormente%se%añaden%45µl%de%agua%miliQ,%5µl%de%proteinasa%K%y%150µl%de% TrisNHCl.% - Se% homogeneiza% en% vortex% y% se% incuba% a% 60ºC% durante% 10% minutos% y% posteriormente%a%100ºC%durante%5%minutos%en%el%termoblock.% - Tras%la%incubación,%se%centrifuga%a%12000rpm%durante%3%minutos%en%un%equipo% Beckman)coulter)TM.% - Por% último,% se% recoge% el% sobrenadante,% (aproximadamente% 200µl)% en% un% eppendorf%estéril%de%0.2ml%marcado%adecuadamente.%Esta%solución%de%ADN%%se% conserva%en%congelación%a%N20ºC%hasta%su%amplificación%por%PCR.% Para%el%control%negativo%de%la%extracción%se%realiza%el%mismo%procedimiento%sin% resuspender%ninguna%colonia%en%el%primer%paso.%%% 4.3.2 Protocolo'de'aislamiento'del'ADN'plasmídico' Para% la% extracción% de% ADN% plasmídico% se% empleó% el% kit% comercial) Plasmid) MiniPrep)Kit®)que%incluye%los%siguientes%componentes:% - Buffer%Resuspensión%(contiene%RNAse)) - Lysis%Solución) - Binding%Solución%) - Wash%Solución) - Buffer%elución) - Micro%spin%columns) Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 34 - Tubos%de%elución%(1,7ml)) El%protocolo%que%se%ha%seguido,%es%el%recomendado%por%el%fabricante%(Norgen) Biotek)Corporation):% - A%partir%de%1,5ml%de%cultivo%bacteriano%homogeneizado%en%eppendorf%estéril%de% 1,5ml,%se%centrifuga%a%14000rpm%durante%30%segundos%en%un%equipo%Beckman) coulter)TM.% - Tras% la% centrifugación,% se% elimina% el% sobrenadante% cuidadosamente% con% micropipeta%estéril%y%se%añaden%200µl%del%buffer%para%resuspender%el%pellet.% - Se% homogeneíza% en% vortex% y% se% deja% a% temperatura% ambiente% durante% 5% minutos.% - Se% añaden% 250µl% de% lysis% Solución% que% permite% la% lisis% de% las% células% bacterianas% y% se% mezcla% el% contenido% por% inversión% de% los% tubos% sin% usar% vortex.%En%este%paso% la% solución% debe%quedar%clara%y% viscosa% y% no% se% debe% sobrepasar%los%5%minutos%ya%que%el%ADN%puede%desnaturalizarse.% - Posteriormente% se% añaden% 350µl% de% binding% Solución,% y% se% mezcla% inmediatamente% por% inversión.% En% este% paso% la% solución% debe% adquirir% turbidez,% y% en% él% se% produce% la% precipitación% de% las% proteínas% y% del% ADN% genómico.% - Una%vez%mezclado%el%contenido,%se%centrifuga%10%minutos%a%14000%rpm.% - El% sobrenadante% obtenido% tras% la% centrifuga,% se% transfiere% a% las% columnas% unidas%a%los%tubos%de%los%que%dispone%el%kit,%y%se%centrifuga%1%minuto%a%14000% rpm.%En%este%paso,%el%ADN%plasmídico%se%unirá%a%las%columnas.% - El%líquido%que%queda%en%el%tubo%tras%la%centrifuga%se%desecha%y%se%colocan%las% columnas%en%un%nuevo%tubo.% - Se% añaden% 600µl% de% Wash% Solución% a% las% columnas,% permitiendo% limpiar% nuestra%solución%de%ADN%de%aquellos%componentes%que%anteriormente%han% precipitado,%y%%se%centrifuga%1%minuto%a%14000rpm.% - El% líquido% que% queda% en% el% tubo% se% desecha% y% se% vuelve% a% centrifugar% la% columna%en%el%mismo%tubo%durante%2%minutos%a%14000rpm.%% - Finalmente% se% desecha% el% tubo% con% el% líquido% centrifugado% y% se% guarda% la% columna%junto%con%el%tubo%de%elución%(1.7ml)%que%incluye%el%kit.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 35 - La%elución%del%ADN%que%se%encuentra%en%la%columna%se%realiza%añadiendo%50µl% de%buffer%elución%al%centro%de%la%columna%evitando%tocar%la%pared%y%se%deja%1% minuto%a%temperatura%ambiente.% - Se%centrifuga%la%columna%junto%con%el%tubo%de%elución%2%minutos%a%14000rpm.% - El% sobrenadante% se% recoge% en% un% eppendorf% estéril% de% 0.2ml% marcado% adecuadamente.%Esta%solución%de%ADN%%se%conserva%en%congelación%a%N20ºC% hasta%su%amplificación%por%PCR.% Para%el%control%negativo%de%la%extracción%se%utiliza%1,5%ml%de%caldo%BHI%estéril% sometiéndolo%al%mismo%proceso%de%extracción.% 4.3.3 Evaluación'por'espectrofotometría'del'ADN'bacteriano'aislado' Una% vez% extraído% el% ADN,% se% mide% su% concentración% y% pureza% en% un% espectofotómetro)NanoDrop) ™) 2000) UVZVis) que% utiliza% una% fracción% mínima% de% la% cantidad% de% muestra.% Los% resultados% de% la% absorbancia% se% analizan% con% el% software% Nanodrop)2000/2000c)Versión)1.3.1.) Antes%de%iniciar%la%lectura%de%las%muestras,%es%necesario%calibrar%el%equipo.%Para%ello% se%limpia%el%pedestal%(punto%de%medición)%con%agua%milliQ%y%papel%y%se%cargan%2%µl%de% agua% milliQ% para% que% sean% medidos.% Como% blanco,% se% emplea% el% buffer% donde% se% encuentra%el%ADN%para%cada%método:%% - Método%1:%PrepMan®)Ultra)Sample)Reagent% - Método%2:%Tris%HCl%0,1M%pH%8% - Extracción%ADN%plasmídico:%Buffer%elución.%% El%protocolo%seguido%para%medir%la%absorbancia%consistió%en%agregar%un%volumen%de% 2% µl% de% solución% de% ADN% bien% homogeneizada% con% micropipeta,% en% el% pedestal% del% nanodrop,%repitiendo%el%procedimiento%para%cada%muestra.% La% concentración% del% ADN% viene% expresada% en% µg/ml,% y% su% cuantificación% se% ha% realizado%midiendo%la%absorbancia%a%260%nm%(absorbancia%máxima%del%ADN).%% [ADN]%µg/ml%=%A260%x%50%x%Factor%Dilución% % Teniendo%en%cuenta%que%una%unidad%de%absorbancia%(UA)%corresponde% aproximadamente%a%50%µg/ml%de%ADN%de%doble%cadena.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 36 La%pureza%de%la%muestra%se%determinó%a%partir%de%la%relación%A260/A280.%La%calidad% óptima%de%ADN%tiene%lugar%cuando%esta%relación%se%encuentra%entre%1,7N2,0.%Valores% por% encima% de% 2,0% indican% contaminación% con% ARN;% mientras% que,% resultados% por% debajo% de% 1,7,% indican% contaminación% con% proteínas% u% otros% contaminantes% que% absorben%fuertemente%cerca%de%los%280nm.% 4.4 Optimización'de'la'reacción'de'PCR'para'cada'uno'de'los'genes'de' resistencia'ensayados' 4.4.1 Cebadores'seleccionados'' Para% la% amplificación% del% ADN% molde% se% han% seleccionado% las% secuencias% de% cebadores%de%la%bibliografía%consultada,%que%amplifican%diferentes%genes%de%resistencia% para%los%antibióticos%objeto%de%estudio%(eritromicina%y%clindamicina).% La% tabla% 6% muestra% las% secuencias% de% los% oligonucleótidos% utilizados% que% han% sido%obtenidas%de%la%bibliografía%consultada.% Tabla'6.'Cebadores'utilizados'para'la'amplificación'de'los'genes'de'resistencia' ¹pb:%pares%de%bases% 4.4.2 Protocolo'PCR' Para%la%amplificación%del%ADN%diana%mediante%la%reacción%en%cadena%de%la% polimerasa,%se%preparó%una%mezcla%de%reacción%en%un%volumen%final%de%25%µl,%en%la%que% se%incluyen:%% GEN' SECUENCIA' pb¹' FUENTE' mef(A( (Macrolide)Efflux)) (F)%AGTATCATTAATCACTAGTGC% (R)%TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG% 345% NMorvan%et)al.,%2010% msr(A%% (Macrolide)Streptogramin) Resistance)% (F)%GCAAATGGTGTAGGTAAGACAACT% (R)%ATCATGTGATGTAAACAAAAT% % 401% NMorvan%et)al.,%2010% erm(A%% (Erytromycin)Ribosome) Methylase)% (F)%CTTCGATAGTTTATTAATATTAGT% (R)%TCTAAAAAGCATGTAAAAGAA% % 645% NMorvan%et)al.,%2010% erm(B%% (Erytromycin)Ribosome) Methylase)% (F)%GAAAAGGTACTCAACCAAATA% (R)%AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC% % 636% NMorvan%et)al.,%2010% lnu(A%% (Lincomycin)NucleotidylZ tranferasa)% (F)%GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGG% (R)%GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGATC% 323% NLina%et)al.,%1999.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 37 - 12,5%µl%de%FastStart%SYBR%Green%Master%(Roche)Applied)Science)% - 0,5%µl%de%cada%uno%de%los%cebadores%(reverso%e%inverso)% - 9%µl%de%agua%milliQ%estéril%% - 2,5%µl%de%solución%de%ADN%diana.% La% concentración% óptima% de% cada% grupo% de% cebadores% y% de% ADN% molde,% fue% establecida%experimentalmente.% Para%comenzar%con%la%reacción%de%amplificación%es%necesario%realizar%el%cálculo% del% volumen% correspondiente% para% el% número% de% reacciones% que% van% a% tener% lugar,% incluyendo%controles%negativos%tanto%de%la%extracción%de%ADN,%como%de%la%PCR.%% A%continuación%se%mezclan%todos%los%componentes%de%la%reacción%para%obtener% un% "master% mix"% en%un% eppendorf% estéril% de% 1,5ml,% y%posteriormente% se% distribuyen% 22,5µl%en%cada%tubo%de%reacción.% Se% utilizaron% tiras%de%8%tubos%de%0.2ml%específicos% para%PCR%a%tiempo%real,%con%tapa%óptica%(Ibian®).%% El%ADN%diana%se%adiciona%en%el%último%momento%a%cada%tubo%preparado%y%se% homogeneíza% en% vortex.% En% el% caso% del% control% negativo% de% la% PCR,% se% incluye% agua% milliQ%estéril.%% Este%proceso%se%lleva%a%cabo%en%una%cabina%de%flujo%laminar%vertical%(MiniZV/PCR,) Telstar).% Una% vez% preparados% todos% los% tubos,% se% colocan% en% el% termociclador% previamente%programado.% La%amplificación%se%lleva%a%cabo%en%un%Termociclador%de%ADN%(Mini)OpticonTM) RealZTime) PCR) Detection) System,) BioZRad),%con%un%programa%de%proceso%optimizado% experimentalmente%para%cada%grupo%de%cebadores%objeto%de%estudio.%% Para%evitar%la%formación%de%productos%inespecíficos%durante%el%tiempo%que%se% tarda%en%preparar%la%reacción%antes%de%poner%los%tubos%en%el%termociclador%y%durante%el% primer% ciclo% de% calentamiento,% % se% ha% utilizado% el% protocolo% "Hot% Start".% En% este% protocolo,% la% enzima% taq% polimerasa% está% desactivada,% por% lo% que% el% programa% por% defecto% comienza% con% el% calentamiento% a% 94ºC% durante% 5% minutos% que% permite% la% activación%de%ésta.%Un%calentamiento%equivocado%en%este%paso,%puede%resultar%en%un% fracaso%para%la%técnica%de%PCR.% Posteriormente%comienza%el%ciclo%de%reacciones%caracterizado%por%los%pasos%de:%% - Desnaturalización%a%94ºC%durante%1%min% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 38 - Hibridación%=%gradiente%de%50%a%65ºC%durante%1%minuto,%en%este%paso%la%Tº%ha% sido%ensayada%experimentalmente.% - Extensión%a%72ºC%durante%2%min.% Este%ciclo%se%repite%35%veces,%dando%lugar%a%2!"%copias%de%la%región%de%ADN%que% deseamos%amplificar%siempre%y%cuando%la%reacción%se%realice%en%las%condiciones%más% óptimas.% Finalmente% tiene% lugar% una% incubación% adicional% durante% 10% min% a% 72ºC% para% completar% la% extensión% del% cebador% después% del% último% ciclo.% El% último% paso,% es% la% llamada% “melting% curve”% donde% se% incrementa% la% temperatura% de% 50ºC% a% 95ºC% con% lectura% cada% 0,5ºC% durante% 2% segundos.% En% este% paso% se% obtiene% la% temperatura% de% fusión%(Tm),%a%la%que%se%desnaturaliza%el%50%%del%ADN.% 4.4.3 Optimización'de'las'condiciones'de'amplificación'para'cada'grupo' de'cebadores' La% temperatura% de% hibridación,% la% concentración% de% oligonucleótidos% y% la% concentración% de% ADN% molde% para% cada% grupo% de% cebadores% se% ha% determinado% experimentalmente.%% Para%evaluar%la%concentración%de%cada%cebador%en%la%reacción%se%han%ensayado% tres%concentraciones%diferentes,%1%µM,%%0,4%µM%y%0,2%µM.%% Los% cebadores% adquiridos% (TIB% MOLBIOL)% vienen% deshidratados,% por% lo% que% ha% sido% necesario% resuspender% cada% uno% en% agua% milliQ% al% volumen% señalado% por% el% fabricante,%para%obtener%la%concentración%de%100µM.% A% partir% de% aquí,% se% han% hecho% alícuotas% de% cada% cebador% a% diferentes% concentraciones%como%se%puede%observar%en%la%siguiente%tabla.% Tabla'7.'Diluciones'realizadas'para'cada'concentración'ensayada.' Concentración' inicial' Dilución' Relación'cebador'+'agua'milliQ' Concentración' final' Concentración'en' la'reacción'(25µl)' 100µM% 1:2% 7,5µl%cebador%+%7.5µl%agua%milliQ% 50%µM% 1%µM% 1:5% 3µl%cebador%+%12µl%agua%milliQ% 20µM% 0,4%µM% 1:10% 1,5µl%cebador%+%13.5µl%agua%milliQ% 10%µM% 0,2%µM% La% temperatura% óptima% de% hibridación% para% cada% grupo% de% cebadores% se% ha% determinado% con% la% ayuda% de% la% herramienta) Gradient) calculator) % del% programa%% Supports)Opticon)MonitorTM)Version)3.1.%% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 39 El% rango% de% temperatura% de% hibridación% ensayado% para% cada% grupo% de% cebadores%fue%en%función%de%la%temperatura%sugerida%por%el%fabricante%(tabla%8).%% Para% la% selección% de% los% valores% óptimos% de% temperatura% de% hibridación% y% concentración% de% cebadores% se% ha% utilizado% el% criterio% de% mayor% producto% final% (Endpoint),% menor% valor% de% Ct% (Threshold) cycle)% y% no% formación% de% productos% inespecíficos.% Tabla'8.'Temperaturas'recomendadas'para'cada'grupo'de'cebadores'y'rango'ensayado.' % mef(A( msr(A( erm(B( erm(A( lnu(A( Tº'sugerida' Forward% 51,4ºC% 64ºC% 56,6ºC% 55,2ºC% 72,1ºC% Reverse% 57,3ºC% 54,1ºC% 57,8ºC% 52,1ºC% 69,9ºC% Rango'ensayado' 50>60ºC' 55>65ºC' 50>60ºC' 50>60ºC' 50>60ºC' %Para% evaluar% la% eficiencia% de% la% amplificación% (capacidad% de% la% reacción% de% duplicar% el% número% de% copias% de%las% cadenas% de% ADN% o% ADNc% en% cada% ciclo)% se% han% calculado%las%eficiencias%a%partir%de%la%pendiente%de%la%curva%estándar%obtenida%después% de%realizar%diluciones%seriadas%del%ADN%molde%de%acuerdo%a%la%siguiente%fórmula:% E=10[N1/pendiente]%N1% Así%mismo%se%evaluó%el%intervalo%dinámico%y%el%coeficiente%de%correlación%lineal% r2%de%la%curva%estándar%obtenida.% %Los%intervalos%de%concentraciones%de%ADN%ensayadas%fueron%diluciones%seriadas% de%1/2%a%partir%del%ADN%aislado.% 4.4.4 Evaluación'de'la'especificidad'de'los'cebadores'seleccionados:'curva' de'fusión' Cada%sistema%de%PCR%optimizado%se%ha%aplicado%a%todas%las%cepas%de%referencia% para%comprobar%su%sensibilidad%y%especificidad.%El%producto%amplificado%de%cada%una%de% ellas% se% evaluó% mediante% el% análisis% de% la% curva% de% fusión% programada% al% final% del% proceso%de%amplificación.% En%este%paso,%la%caída%de%la%fluorescencia%indica%la%desnaturalización%del%50%%del% producto%final,%que%difiere%en%función%de%la%secuencia.%Este%paso,%permite%diferenciar% los%fragmentos%de%ADN%amplificado,%en%función%de%la%temperatura%de%fusión%(Tm)%a%la% que%éste%se%desnaturaliza.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 40 4.5 Detección'del'producto'amplificado' 4.5.1 PCR'convencional'' Las% condiciones% de% amplificación% optimizadas,% han% sido% utilizadas% para% la% amplificación%del%ADN%aislado%de%cultivo%puro%de%cada%una%de%las%cepas%de%referencia% mediante%PCR%convencional.' En%este%caso,%a%diferencia%de%la%PCR%a%tiempo%real,%%se%usan%12,5%µl%de%FastStart% Taqman®% Probe% Master% (Roche) Applied) Science)% y% el% protocolo% incluye% los% mismos% pasos%a%excepción%de%la%desnaturalización%final%(melting%curve).%% En%cada%ensayo%se%incluyen%control%negativo%de%la%extracción%y%control%negativo% de%la%PCR%(agua%milliQ%estéril).% % El% producto% amplificado% fue% cuantificado% por% espectrofotometría% a% 260% nm% de% acuerdo% con% el% protocolo% previamente% descrito% y% mantenidos% a% –20ºC% % hasta% su%% análisis%por%electroforesis%horizontal%en%gel%de%agarosa.% 4.5.2 Electroforesis'horizontal'en'gel'de'agarosa' Después%de%la%amplificación%del%ADN%mediante%PCR%convencional,%se%verificó%el% amplicón% generado% para% cada% gen% y% su% peso% (pb)% mediante% electroforesis% en% gel% de% agarosa.% La%electroforesis%se%realiza%en%geles%de%agarosa%de%separación%hasta%1500%pares% de%bases%en%una%cubeta%de%electroforesis%(WideZmini)Subcell)GT)base,)BioZRad).%Se%ha% utilizado% una% fuente% de% alimentación% (PowerPac) Basic) Power) Supply) 100Z120/220V,) BioZRad).%% Las%muestras%de%ADN%almacenadas%en%congelación%a%N20ºC%se%prepararan%en%el% momento%previo%a%la%carga%en%el%gel%de%agarosa.%% i. Preparación'del'gel' Se%disuelven%1,5%gr.%de%agarosa,%(Molecular)Biology)Grade,)Bioron),%en%100ml%de% Buffer%TBE%1x%(tampón%tris%Borato%EDTA%10x%diluido,%BioNRad)%%con%una%concentración% final%de%1,5%.%El%preparado%se%calienta%con%un%hornillo%eléctrico%hasta%llevar%a%su%punto% de%ebullición%y%se%deja%enfriar.%% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 41 Una% vez% atemperado% a% 65ºC,% se% vierte% en% el% molde% y% se% deja% polimerizar% la% agarosa% a% temperatura% ambiente.% Posteriormente,% % se% agrega% el% buffer% de% electroforesis% TBE% 1x% en% la% cubeta% y% se% vierte% el% gel% de% agarosa% de% tal% manera% que% quede%cubierto%con%el%buffer,%y%que%los%pocillos%queden%situados%próximos%al%cátodo.% Todos% los% geles% de% electroforesis% utilizados% son% de% 10% cm% x% 15% cm% x% 1cm% y% con% capacidad%para%15N20%muestras.% ii. Carga'de'las'muestras' En% un% segmento% de% lámina% de% parafina% se% coloca% 1µl% de% tinte% de% carga% (Gel% Loading%Buffer%II%2x,%Bioron),%por%cada%muestra%que%vamos%a%cargar.%Cada%una%de%las% muestras%de%ADN%%se%mezcla%con%el%tinte%en%proporción%5:1%(v/v),%mezclando%5µl%de% ADN%con%1µl%de%tinte.% Posteriormente%se%carga%cada%muestra%preparada%en%cada%uno%de%los%pocillos% del%gel,%dejando%el%pocillo%central%libre%para%cargar%en%último%lugar%7µl%del%marcador%de% peso%molecular%(100bp)DNA)Ladder,%Bioron),%que%nos%permite%determinar%el%tamaño%de% los%amplicones%de%ADN%entre%100%y%1000%bp.' iii. Preparación'de'la'cubeta'de'electroforesis' Posteriormente%se%prepara%la%cubeta%de%electroforesis%y%se%programa%la%fuente% con%un%voltaje%de%90V%de%acuerdo%al%peso%molecular%de%nuestras%secuencias%de%ADN% amplificadas% (entre% 300% y% 700pb).% El% tiempo% de% electroforesis% fue% de% entre% 30% y% 40% minutos% de% acuerdo% a% la% posición% adoptada% por% el% indicador% de% azul% de% bromofenol/xylene%cianol.% iv. Tinción'y'visualización'del'gel'en'transiluminador'de%luz'UV% Finalizada%la%electroforesis,%se%desensambla%el%gel%y%se%tiñe%en%una%solución%de% SYBR%Green%10.000x%(Sigma).%Para%ello%se%diluyen%40µl%de%SYBR%%Green%en%400ml%de% tampón%TBE%1x%obteniendo%una%concentración%final%de%1x%en%la%que%se%sumerge%el%gel% durante% 40% minutos% en% agitación% constante.% Las% bandas% se% visualizan% bajo% luz% ultravioleta% en% un% analizador% de% imágenes% Gel) Doc) 2000% (BIONRAD)% empleando% el% software%de%adquisición%de%imágenes%Quantity)One)v.4.4.0,)BioNRad.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 48 Por%último,%la%cepa%S.)aureus) C5425)presenta%fenotipo%L%(figura%10B),%es%decir,% resistencia%a%Lincosamidas%y%susceptibilidad%a%Macrólidos,%que%aunque%es%inusual%y% raramente% se% detecta% en% cepas% de% origen% humano,% recientemente% se% ha% visto% aumentado%entre%cepas%de%Staphylococcus%de%origen%animal%(Lozano%et)al.,%2012).%% Además,%se%observa%que%esta%cepa%presenta%un%DNtest%negativo,%por%lo%que%en% este%caso%no%hay%inducción%de%clindamicina%sobre%eritromicina,%posiblemente%porque% clindamicina,% a% diferencia% de% eritromicina,% es% un% débil% inductor% de% resistencia% (Steward%et)al.,%2005).% 5.2 Evaluación'del'ADN'total'y'plasmídico'aislado'por' espectrofotometría' En%las%tablas%10,%11%y%12%se%muestran%los%valores%de%absorbancia%obtenidos%tras%la% lectura%%espectrofotométrica%a%260%y%280%nm,%así%como%el%cálculo%del%ratio%A260/A280%y% la%concentración%estimada%de%ADN%a%partir%de%dichos%valores%para%cada%método%de% extracción%ensayado.% Tabla'10.'Concentración'de'ADN'y'pureza'estimada'por'espectrofotometría'para'cada'cepa' ensayada'con'el'método'1'de'extracción'de'ADN'total:'PrepMan®(Ultra' CEPA'BACTERIANA' A260(1)' A280(2)' A260/A280' [ADN]' µg/ml' Streptococcus)agalactiae) 3,212% 1,720% 1,9% 164% Staphylococcus)aureus)C2548) 3,349% 1,579% 2,1% 167% Staphylococcus)pseudintermedius)C2381) 3,279% 1,747% 1,9% 164% Staphylococcus)aureus)C2929) 3,959% 2,011% 2,0% 198% Staphylococcus)aureus)C5425) 3,695% 1,835% 2,0% 185% (1)%A260%=%Absorbancia%a%260%nm% (2)%A280%=%Absorbancia%a%280%nm% 'ND%=%No%Determinado% ' ' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 49 ' Tabla'11.'Concentración'de'ADN'y'pureza'estimada'por'espectrofotometría'para'cada'cepa' ensayada'con'el'método'2'de'extracción'de'ADN'total:'Lisostafina'y'Proteinasa'K' CEPA'BACTERIANA' A260' A280' A260/A280' [ADN]' µg/ml' Staphylococcus)aureus)C2548) 0,723% 0,416% 1,7% 36% Staphylococcus)pseudintermedius)C2381) 0,308% 0,175% 1,8% 16% Staphylococcus)aureus)C2929) 0,733% 0,418% 1,8% 367% Staphylococcus)aureus)C5425) 0,215% 0,118% 1,8% 11% 'En%este%caso,%la%cepa%de%Streptococcus)agalactiae)no%ha%sido%extraída%por%este% método,%ya%que%es%específico%para)el%género%Staphylococcus.%% Tabla'12.'Concentración'de'ADN'y'pureza'estimada'por'espectrofotometría'para'cada'cepa' ensayada'con'el'método'de'extracción'de'ADN'plasmídico' CEPA'BACTERIANA' A260' A280' A260/A280' [ADN]' µg/ml' Streptococcus)agalactiae) 0,185% 0,104% 1,8% 9% Staphylococcus)aureus)C2548) 0,297% 0,150% 2,0% 15% Staphylococcus)pseudintermedius)C2381) 0,078% 0,046% 1,7% 4% Staphylococcus)aureus)C2929) 0,146% 0,089% 1,6% 7% Staphylococcus)aureus)C5425) 0,286% 0,150% 1,9% 14% En%todos%los%casos%se%puede%observar%que%los%ratios%A260/A280%calculados%para% cada%método%de%extracción%y%cepa,%están%comprendidos%aproximadamente%entre%1,7%y% 2,0,% indicando% la% buena% pureza% del% ADN% extraído.% También% se% puede% ver% que% la% cantidad%de%ADN%extraído%es%suficiente%para%llevar%a%cabo%la%reacción%de%amplificación.% 5.3 Optimización'de'la'reacción'de'PCR'para'cada'uno'de'los'genes' de'resistencia'ensayados:''' 5.3.1 Optimización'de'la'temperatura'de'hibridación'y'concentración'de' los'cebadores'en'la'reacción' Las%tablas%13,%14,%15%16%y%17%muestran%los%resultados%de%la%optimización%de%la% temperatura%de%hibridación%y%la%concentración%de%cada%cebador%en%la%reacción%de% amplificación%del%ADN%bacteriano%de%las%5%cepas%de%referencia.%% Ambos% parámetros% se% seleccionaron% en% función% del% valor% Ct% menor% y% Endpoint%mayor%determinados%a%partir%de%la%curva%de%amplificación%obtenida%por%PCR% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 50 a%tiempo%real.%Con%estos%criterios,%se%seleccionó%la%concentración%0,4%µM%para%los% cebadores%de%los%genes%mef)A,%msr)A,%erm%B%e%lnu)A%y%1%µM%para%los%cebadores%del% gen%erm)A.%% En%cuanto%a%la%temperatura%de%hibridación,%se%seleccionó%51ºC%en%el%caso%del% gen%erm)A,%54ºC%para%los%genes%msr)A%y%erm%B,%58ºC%para%el%gen%mef)A%y%59ºC%para%el% gen%lnu)A.% Tabla'13.'Gradiente'de'temperatura'de'hibridación'ensayado'y'resultados'obtenidos'en'la' amplificación'del'ADN'de'la'cepa'Streptococcus(agalactiae(con'los'cebadores'para'el'gen'mef(A'a' distintas'concentraciones' ' mef(A'(1µM)' mef(A'(0,4µM)' mef(A'(0,2µM)' Gradiente'de' temperatura' (ºC)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' 60,0' 19,66% 0,211% 20,65% 0,1993% 26,77% 0,1262% 59,3' 17,9% 0,25025% 18,88% 0,25995% 23,62% 0,19685% 58,0' 17,62% 0,29125% 17,95' 0,31875' 21,52% 0,2953% 56,2' 18,0% 0,249% 18,245% 0,2857% 20,79% 0,3015% 54,0' 18,05% 0,2805% 18,33% 0,34145% 21,26% 0,3162% 52,1' 18,75% 0,2609% 18,745% 0,3358% 20,71% 0,3924% 50,8' 18,22% 0,30705% 19,685% 0,31625% 21,81% 0,3158% 50,0' 19,02% 0,25005% 19,46% 0,2937% 21,8% 0,277% (1)'Ct:'ciclo'umbral'o'Threshold(cycle'' (2)'Endpoint:'punto'final'de'la'reacción'de'amplificación' ' ' Tabla'14.'Gradiente'de'temperatura'de'hibridación'ensayado'y'resultados'obtenidos'en'la' amplificación'del'ADN'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C2929(con'los'cebadores'para'el'gen'msr(A'a' distintas'concentraciones' ' msr(A'(1µM)' msr(A'(0,4µM)' Gradiente'de' temperatura'(ºC)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' 65,0' N% N% N% N% 64,0' N% N% N% N% 62,0' N% N% N% N% 59,3' 21,78% 0,1295% 22,145% 0,163% 55,9' 15,44% 0,2503% 15,23' 0,2463% 53,1' 17,62% 0,2128% 15,245' 0,3029' 51,1' 18,33% 0,224% 15,895% 0,3392' 50,0' 24,12% 0,158% 19,755% 0,242% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 51 - No'amplificación' ' ' Tabla'15.'Gradiente'de'temperatura'de'hibridación'ensayado'y'resultados'obtenidos'en'la' amplificación'del'ADN'de'la'cepa'Staphylococcus(pseudintermedius(C2381(con'los'cebadores'para'el' gen'erm(B'a'distintas'concentraciones' ' erm(B'(1µM)' erm(B'(0,4µM)' erm(B'(0,2µM)' Gradiente'de' temperatura' (ºC)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' 60,0' N% N% N% 0,0212% N% N% 59,3' 27,52% 0,1385% 23,63% 0,1609% N% N% 58,0' 20,68% 0,257% 19,77% 0,2422% 32,61% 0,0688% 56,2' 20,15% 0,22% 18,59% 0,2451% 26,42% 0,1629% 54,0' 19,57% 0,317% 17,82' 0,30' 27,57% 0,2006% 52,1' 21,49% 0,28% 18,09% 0,298% 30,08% 0,1481% 50,8' 23,59% 0,262% 18,75% 0,2509% 29,19% 0,16613% 50,0' 26,53% 0,0953% 21,3% 0,255% 31,47% 0,1001% % ' Tabla'16.'Gradiente'de'temperatura'de'hibridación'ensayada'y'resultados'obtenidos'en'la' amplificación'del'ADN'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C2548(con'los'cebadores'para'el'gen'erm(A'a' distintas'concentraciones' ' erm(A'(1µM)' erm(A'(0,4µM)' Gradiente'de' temperatura'(ºC)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' 60,0' N% N% N% N% 59,3' N% N% N% N% 58,0' 26,69% 0,1029% N% N% 56,2' 18,36% 0,1554% 21,23% 0,149% 54,0' 15,75% 0,2082% 17,45% 0,193% 52,1' 15,68' 0,2675' 16,83% 0,269% 50,8' 15,97% 0,2972' 19,35% 0,1893% 50,0' 20,26% 0,193% 20,82% 0,1947% % ' ' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 52 Tabla'17.'Gradiente'de'temperatura'de'hibridación'ensayado'y'resultados'obtenidos'en'la' amplificación'del'ADN'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C5425(con'los'cebadores'para'el'gen'lnu(A'a' distintas'concentraciones' ' lnu(A'(1µM)' lnuA'(0,4µM)' Gradiente'de' temperatura'(ºC)' Ct(1)' Endpoint(2)' Ct(1)' Endpoint(2)' 60,0' 12,9% 0,2854% 12,78% 0,2678% 59,3' 12,36% 0,378% 11,65' 0,52175' 58,0' 12,35% 0,3868% 11,92% 0,47755% 56,2' 12,32% 0,3444% 12,6% 0,34985% 54,0' 12,55% 0,4595% 13,17% 0,2934% 52,1' 13,25% 0,26925% 12,75% 0,4738% 50,8' 13,43% 0,32675% 13,14% 0,3151% 50,0' 13,66% 0,23775% 12,99% 0,3233% % 5.3.2 Determinación'del'rango'dinámico'de'la'concentración'de'ADN' molde'en'la'reacción'de'amplificación' La%tabla%18%muestra%el%intervalo%de%concentración%de%ADN%ensayado%de%cada% cepa%obtenido%mediante%diluciones%seriadas%1/2.% Tabla'18.'Intervalo'de'concentraciones'(ng/reacción)'ensayadas'de'cada'cepa'y'método'de'extracción' Método'de' extracción' Streptococcus) agalactiae) mef(A( Staphylococcus) aureus)C2929) msr(A( Staphylococcus) pseudintermedius) C2381) erm(B( Staphylococcus) aureus)C2548) erm(A( Staphylococcus) aureus)C5425) lnu(A) ADN%total% met%1:% PrepMan®% Ultra% 411%–%1.605% 494.8%N%0.96% 400.75%–%0.37% ND% 462%–%0.451% ADN%total% met%2:% Lisostafina% ND% 91.5%–%0.09% 40%N%0.078% 90.25%N%0.088% 31.25%–%0.0305% ADN% Plasmídico% 22.5%–%0.088% 18.25%N%0.0712% 9.75%N%0.019% ND% 36%–%0.035% ND:%NO%DETERMINADO% El% intervalo% dinámico% de% ADN% molde% para% la% amplificación% de% cada% gen% de% resistencia% antimicrobiana% se% estableció% a% partir% de% la% eficiencia% y% coeficiente% de% correlación% lineal% determinados% a% partir% de% la% recta% construida% con% diluciones% seriadas%de%ADN%molde,%las%cuales%se%muestran%en%las%figuras%11,%12,%13,%14%y%15.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 53 En%el%caso%de%la%cepa%S.)aureus)C2548,)sólo%se%consiguió%amplificar%el%gen%erm)A% extrayendo%el%ADN%con%el%método%2%de%extracción%de%ADN%total,%por%lo%que%sólo%se% pudo%establecer%el%rango%dinámico%con%el%ADN%obtenido%por%este%método.%% El%análisis%de%las%curvas%estándar%tomando%como%intervalo%todo%el%rango%de% concentraciones%ensayadas,%revelaron%en%algunos%casos%coeficientes%de%correlación% lineal%algo%bajos%y%valores%de%eficiencia%por%debajo%de%70%.%Para%alcanzar%valores%más% altos% de% r2% y% eficiencias% de% entre% 70% y% 120%,% se% han% eliminado% del% rango% algunas% concentraciones% como% se% muestra% en% las% figuras% 11,% 12,% 13,% 14% y% 15,% donde% los% puntos%rojos%representan%las%concentraciones%de%ADN%que%no%han%sido%consideradas,% mientras%que%los%puntos%negros%indican%las%concentraciones%de%ADN%que%determinan% el%rango%dinámico.% A)% %B)% %% Figura'11.'Curvas'estándar'obtenidas'de'la'amplificación'del'gen'de'resistencia'mef(A'en'la'cepa' Streptococcus(agalactiae.(A)'ADN'total'met'1:'PrepMan®'Ultra,'B)'ADN'plasmídico' %En% la% figura% 11% A% y% B,% se% muestra% la% curva% estándar% obtenida% tras% la% amplificación%del%gen%mef)A%en%la%cepa%Streptococcus)agalactiae%con%los%dos%métodos% de%extracción%ensayados%para%esta%cepa.%% % El%intervalo%dinámico%se%establece%entre%103%y%1,6%ng/reacción%para%el%ADN% total%y%entre%2,8%y%0,35%ng/reacción%para%el%ADN%plasmídico.% % Los% valores% de% r2% y% eficiencias% obtenidas% en% este% caso,% se% muestran% en% la% siguiente%tabla.' ' ' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 54 Tabla'18.'Rango'dinámico'determinado'en'la'reacción'de'amplificación'optimizada'para'el'gen'mef( A'a'partir'de'ADN'aislado'de'la'cepa'Streptococcus(agalactiae' Cepa/gen' Streptococcus)agalactiae)mef(A) Método'de' extracción' ADN%total%met%1:%PrepMan®% Ultra' ADN%total%met%2:% Lisostafina' ADN%Plasmídico% Intervalo' dinámico' 103%–%1,6%ng/reacción% ND% 2,8%–%0,35%ng/reacción% r2' 0,986% ND% 0,948% Eficiencia'(%)' 81%% ND% 84,5%% ND:%NO%DETERMINADO% % A)% %B)%'C)%'% Figura'12.'Curvas'estándar'obtenidas'de'la'amplificación'del'gen'de'resistencia'msr(A'en'la'cepa' Staphylococcus(aureus(C2929,(A)'ADN'total'met'1:'PrepMan®'Ultra,'B)'ADN'total'met'2:'Lisostafina'C)' ADN'plasmídico' %En% la% figura% 12% A,% B% y% C,% se% muestra% la% curva% estándar% obtenida% tras% la% amplificación% del% gen% msr) A% en% la% cepa% S.) aureus) C2929) con% los% tres% métodos% de% extracción%ensayados.%%% % El%intervalo%dinámico%se%establece%entre%61,8%y%7,7%ng/reacción%para%el%ADN% total%con%el%primer%método%de%extracción,%entre%22,9%y%7,7%ng/reacción%para%el%segundo% método%de%extracción,%y%entre%4,6%y%0,29%ng/reacción%para%el%ADN%plasmídico.% % Los% valores% de% r2% y% las% eficiencias% para% cada% curva% estándar% establecida% se% muestran%en%la%siguiente%tabla.' Tabla'19.'Rango'dinámico'determinado'en'la'reacción'de'amplificación'optimizada'para'el'gen'msr(A'a' partir'del'ADN'aislado'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C2929' Cepa/gen'' Staphylococcus)aureus)C2929'msr(A) Método'de' extracción' ADN%total%met%1:% PrepMan®%Ultra' ADN%total%met%2:% Lisostafina' ADN%Plasmídico% Intervalo' dinámico' 61,8%–%7,7%ng/reacción% 22,9%–%7,7%ng/reacción% 4,6%–%0,29%ng/reacción% r2' 0,968% 0,975% 0,988% Eficiencia'(%)' 97,8%% 92,39%% 88,5%% %% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 55 A) 'B)% %C)%' Figura'13.'Curvas'estándar'obtenidas'de'la'amplificación'del'gen'de'resistencia'erm(B'en'la' cepa'Staphylococcus(pseudintermedius(C2381,(A)'ADN'total'met'1:'PrepMan®'Ultra,'B)'ADN' total'met'2:'Lisostafina'C)'ADN'plasmídico' %En% la% figura% 13% A,% B% y% C,% se% muestra% la% curva% estándar% obtenida% tras% la% amplificación%del%gen%erm)B%en%la%cepa%S.)pseudintermedius)C2381)con%los%tres%métodos% de%extracción%ensayados.%% % En%el%caso%de%la%extracción%del%ADN%total%con%PrepMan%Ultra%®,%se%ha%partido% de% la% dilución% 1:4% como% concentración% más% alta,% ya% que% no% hay% amplificación% por% encima%de%100%ng/reacción.%% % Para%la%extracción%del%ADN%total%con%lisostafina,%también%se%ha%partido%de%la% dilución%1:4%como%concentración%más%alta,%debido%a%que%la%amplificación%del%ADN%sin% diluir% y% de% la% dilución% 1:2% tuvo% lugar% en% ciclos% tardíos% y% apenas% se% obtuvo% producto% amplificado,%por%lo%que%no%se%han%tenido%en%cuenta%en%la%curva%estándar.% % El% intervalo% dinámico% para% este% gen% se% ha% establecido% entre% 23,7% y% 3% ng/reacción% para% el% ADN% total% con% el% primer% método% de% extracción,% entre% 10% y% 1,3% ng/reacción%para%el%segundo%método%de%extracción,%y%entre%1,2%y%0,15%ng/reacción%para% el%ADN%plasmídico.% % Los%valores%de%r2%y%eficiencia%se%muestran%en%la%siguiente%tabla.' Tabla'20.'Rango'dinámico'determinado'en'la'reacción'de'amplificación'optimizada'para'el'gen'erm(B'a' partir'del'ADN'aislado'de'la'cepa'Staphylococcus(pseudintermedius(C2381% Cepa/gen' Staphylococcus)pseudintermedius)C2381)erm(B'') Método'de' extracción' ADN%total%met%1:% PrepMan®%Ultra' ADN%total%met%2:% Lisostafina' ADN%Plasmídico% Intervalo' dinámico' 23,7%–%3%ng/reacción% 10%–%1,3%ng/reacción% 1,2%–%0,15%ng/reacción% r2' 0.946% 0,961% 0,986% Eficiencia'(%)' 73.2%% 96,41%% 84%% % % Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 56 % Figura'14.'Curva'estándar'obtenidas'de'la'amplificación'del'gen'de'resistencia'erm(A'en'la'cepa' Staphylococcus(aureus(C2548,(extracción'ADN'total'met'2:'Lisostafina' %En%la%figura%14,%se%muestra%la%curva%estándar%obtenida%tras%la%amplificación%del% gen% erm) A% en% la% cepa% Staphylococcus) aureus) C2548) con% el% método% de% extracción% ensayado%para%esta%cepa.%% % %El%intervalo%dinámico%establecido%para%este%gen%ha%sido%de%entre%90,3%y%5,6% ng/reacción.% En% este% caso,% las% dos% concentraciones% más% altas% no% se% han% tenido% en% cuenta%en%la%curva%estándar%debido%a%que%la%amplificación%de%estas%muestras%tuvo%lugar% en%ciclos%tardíos%y%apenas%se%obtuvo%producto%amplificado.% % Los%valores%de%r2%y%la%eficiencia%obtenida%para%el%gen%erm)A,%se%muestran%en%la% siguiente%tabla.% Tabla'21.'Rango'dinámico'determinado'en'la'reacción'de'amplificación'optimizada'para'el'gen'erm(A'a' partir'del'ADN'aislado'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C2548' Cepa/gen' Staphylococcus)aureus)C2549'erm(A) Método'de' extracción' ADN%total%met%1:% PrepMan®%Ultra' ADN%total%met%2:% Lisostafina' ADN%Plasmídico% Intervalo' dinámico' ND% 90,3%–%5,6%ng/reacción% ND% r2' ND% 0,97% ND% Eficiencia'(%)' ND% 74,99%% ND% % % A) 'B) C) ' Figura'15.'Curvas'estándar'obtenidas'de'la'amplificación'del'gen'de'resistencia'lnu'A'en'la'cepa' Staphylococcus(aureus(C5425,(A)(ADN'total'met'2:'Lisostafina'B)'ADN'plasmídico' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 57 %Por%último,%en%la%figura%15%A,%B%y%C,%se%muestra%la%curva%estándar%obtenida%tras% la% amplificación% del% gen% lnu% A% en% la% cepa% S.) aureus) C5425) con% los% tres% métodos% de% extracción%ensayados.%% % En%el%caso%de%la%extracción%del%ADN%total%con%PrepMan%Ultra%®,%se%ha%partido% de% la% dilución% 1:4% como% concentración% más% alta,% ya% que% no% hay% amplificación% por% encima%de%100%ng/reacción.%El%intervalo%dinámico%establecido%ha%sido%de%23,1%a%0,09% ng/reacción%con%unos%valores%de%r2%y%eficiencia%de%0,992%y%81,47%%respectivamente.%% % En%el%caso%de%la%extracción%del%ADN%total%con%lisostafina,%se%obtiene%un%valor% de% r2% de% 0,99% y% una% eficiencia% de% 86,51%% para% todo% el% intervalo% de% concentraciones% estudiadas%de%31,3%a%0,0305%ng/reacción.% % Para%el%ADN%plasmídico,%se%obtiene%una%r2%de%0,983%y%una%eficiencia%de%80,9%,% quedando%por%tanto%establecido%el%intervalo%dinámico%entre%36%y%0,0703%ng/reacción.% % En%la%siguiente%tabla%se%muestran%los%valores%de%r²%y%las%eficiencias%en%cada% curva%estándar%para%el%gen%lnu%A%con%los%diferentes%métodos%de%extracción.% Tabla'22.'Rango'dinámico'determinado'en'la'reacción'de'amplificación'optimizada'para'el'gen'lnu(A'a' partir'del'ADN'aislado'de'la'cepa'Staphylococcus(aureus(C5425' ' Staphylococcus)aureus)C5425'lnu(A) ' ADN%total%met%1:% PrepMan®%Ultra' ADN%total%met%2:% Lisostafina' ADN%Plasmídico% Intervalo' dinámico' 23,1%–%0,09%ng/reacción% 31,3%–%0.031%ng/reacción% 36%–%0.07%ng/reacción% r2' 0,992% 0,99% 0,983% Eficiencia'(%)' 81,47%% 86,51%% 80,9%% %De%esta%manera,%a%partir%de%todos%los%intervalos%dinámicos%establecidos%para% cada%gen%y%método%de%extracción,%y%con%el%objetivo%de%normalizar%la%cantidad%de%ADN% en%la%reacción%de%amplificación,%se%ha%seleccionado%la%concentración%de%10%ng/reacción% cuando% trabajamos% con% ADN% total,% y% 1% ng/reacción% cuando% lo% hacemos% con% ADN% plasmídico.%%% Además,%se%ha%observado%en%algún%caso%(erm)B)e)lnu)A),%que%el%ADN%extraído% con%este%método,%no%se%ha%amplificado%cuando%la%concentración%de%ADN%ha%sido%mayor% de% 100ng% en% la% reacción.% Esto,% ha% podido% deberse% a% que% la% pureza% del% ADN% no% es% absoluta,%y%puede% que% existan% contaminantes% inhibidores%de%la%reacción.% Por% lo% que% sólo%se%ha%podido%llevar%a%cabo%la%reacción%de%amplificación%cuando%la%muestra%de%ADN% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 64 ' Figura'26.'Genes'msr(A(y'erm(B,'Extracción'ADN'total'método'2:'lisostafina.'' Carril'3:'erm(B,'carril'7:'msr(A.' ' % Figura'27.'Genes'erm(A(y(lnu(A.(( Carril'4:'erm(A(Extracción'ADN'total'método'2:'lisostafina.' Carriles'6,'7'y'8:(lnu(A'Extracción'ADN'total'método'1:'PrepMan®,'Extracción'ADN'total'método'2:' lisostafina'y'ADN'plasmídico'respectivamente' La% figura% 25,% 26% y% 27% muestran% las% bandas% de% ADN% para% el% peso% molecular% esperado%de%los%genes%mef)A,%msr)A,%erm)B,)erm)A)y)lnu)A%tras%su%purificación.% 5.5 Confirmación'de'las'secuencias'genéticas'' La%tabla%26%muestra%los%resultados%de%la%secuenciación%para%cada%amplicón.%Estas% secuencias%de%bases%nitrogenadas%fueron%comparadas%con%las%depositadas%en%la%base% de%datos%del%NCBI%a%través%de%la%herramienta%BLAST.%% ' ' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 65 Tabla'26.'Resultados'del'análisis'de'las'secuencias'de'bases'nitrogenadas'obtenidas'a'partir'de'la' secuenciación'de'cada'uno'de'los'amplicones' GEN' SECUENCIA' IDENTIDAD' EXPECT' mef)A) PrepMan®% Ultra% GAGCGATATTTTTTACTTACAGAAAACAGGATCTGCGATGGTCTTGTCTATGGCTTC ATTAGTAGGTTTTTTACCCTATGCGATTTTGGGACCTGCCATTGGTGTGCTAGTGGA TCGTCATGATAGGAAGAAGATAATGATTGGTGCCGATTTAATTATCGCAGCAGCTG GTGCAGTGCTTGCTATTGTTGCATTCTGTATGGAGCTACCTGTCTGGATGATTATGA TAGTATTGTTTATCCGTAGCATTGGAACAGCTTTTCATACCCCAGCACTCAATGCGG TTACACCACTTTTATACCC% 300/305% 98%% 2eN147% mef)A) Plasmídico% TATCGATATTTTTTACCTTACAGAAAACAGGATCTGCGATGGTCTTGTCTATGGCTT CATTAGTAGGTTTTTTACCCTATGCGATTTTGGGACCTGCCATTGGTGTGCTAGTGG ATCGTCATGATAGGAAGAAGATAATGATTGGTGCCGATTTAATTATCGCAGCAGCT GGTGCAGTGCTTGCTATTGTTGCATTCTGTATGGAGCTACCTGTCTGGATGATTAT GATAGTATTGTTTATCCGTAGCATTGGAACAGCTTTTCATACCCCAGCACTCAATGC GGTTACACCACTTTTATACCCAGAAGAA% 307/312% 98%% 2eN151% msr)A) PrepMan®% Ultra% GSKRCTTGWCACCGATAGAGGGATTGWTGTTCTCCTAAAGTGCAAATGGCATACT ATCGTCAACTTGCTTATGAAGCYWYGCGTGACGTTTCATTATTGCAATATTTAATG GATGAAACGGATTCATCAGAATCATTCAGTAGAGCTATTTTAAATAACTTGGGTTT AAATGAAGCACTTGATCGTTCTTGTAATGTTTTGAGTGGTGGGGAAAGAACGAAA TTATCGTTAGCAGTATTATTTTCAACGAAAGCGAATATGTTAATTTTGGATGAACCA ACTAATTTTTTAGATATTAAAACATTAGAAGCATTAGAAATGTTTATGAATAAATAT CCTGGAATCATTTTGTTTC% 335/342% 98%% 6eN168% msr)A) Lisostafina% TGACATTTACACCAATAGAGGGATTGATTGTTCTCCTAAAGTGCAAATGGCATACT ATCGTCAACTTGCTTATGAAGACATGCGTGACGTTTCATTATTGCAATATTTAATGG ATGAAACGGATTCATCAGAATCATTCAGTAGAGCTATTTTAAATAACTTGGGTTTA AATGAAGCACTTGATCGTTCTTGTAATGTTTTGAGTGGTGGGGAAAGAACGAAATT ATCGTTAGCAGTATTATTTTCAACGAAAGCGAATATGTTAATTTTGGATGAACCAAC TAATTTTTTAGATATTAAAACATTAGAAGCATTAGAAATGTTTATGAATAAATATCC TGGAATCATTTTGTTTACATCACATGATA% 364/367% 99%% 0,0% msr)A) Plasmídico% TKRCATTACACCGATAGAGGGATTGATTGTTCTCCTAAAGTGCAAATGGCATACTA TCGTCAACTTGCTTATGAAGACATGCGTGACGTTTCATTATTGCAATATTTAATGGA TGAAACGGATTCATCAGAATCATTCAGTAGAGCTATTTTAAATAACTTGGGTTTAA ATGAAGCACTTGATCGTTCTTGTAATGTTTTGAGTGGTGGGGAAAGAACGAAATTA TCGTTAGCAGTATTATTTTCAACGAAAGCGAATATGTTAATTTTGGATGAACCAACT AATTTTTTAGATATTAAAACATTAGAAGCATTAGAAATGTTTATGAATAAATATCCT GGAATCATTTTGTTTCATCCACATGATA% 353/356% 99%% 1eN179% erm)B) PrepMan®% Ultra% AGCATGAACAGTAACCGATACCGAGKGAATTGATTGKTCYCCKAAGTGCRMATGK MATACYATCACCGRCTTGCTTATGTAGAATGCAWGACGTTTGTTATTGACAGATTT CWAGTCTGAAACKCATTCRACAAAATCATTCAGAAGAGCTATGTYAMATAACTTG GGTTGAATGAAGCACTTGATCTTYCCTGWMATGYTKAGAGAGRWGATTGAAGAA AGAAATCCTYACYATTWRAGYWCTTTWCTWATWAAGCAAGTGKKTTTTKTAAGC CTKGCCCCWSACATCTATCAGATTGTAAAAGAAGGATTCCATAGAAATGYTTATGA ATWCATATCCTGCAATCATTTTGCTTGMYCCCATGATCTCGATTCAGCAATTGCTTA AGCTGCCAGCGGAATGCTTTCATCCTAAACCAAAAGTAAACAGTGTCTTAATAAAA CTTACCCGCCATACCACAGATGTTCCAGATAAATATTGGAAGCTATATACGTACTTT GTTTCAAAATGGGTCAATCGAGAATATCGTCAACTGTTTACTAAAAATCAGTTTCAT CAAGCAATGAAACACGCCAAAGTAAACAATTTAAGAACCGTTACT% 236/237% 99%% 1eN117% erm)B) Lisostafina% CAAATTAAAAGAACCGATACCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGCATTTAA CGACGAAACTGGCTAAAATAAGTAAACAGGTAACGTCTATTGAATTAGACAGTCAT CTATTCAACTTATCGTCAGAAAAATTAAAACTGAACATTCGTGTCACTTTAATTCAC CAAGATATTCTACAGTTTCAATTCCCTAACAAACAGAGGTATAAAATTGTTGGGAG TATTCCTTACCATTTAAGCACACAAATTATTAAAAAAGTGGTTTTTGAAAGCCATGC GTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTCTACAAGCGTACCTTGGATATTCA CCGAACACTAGGGTTGCTCTTGCACACTCAAGTCTCGATTCAGCAATTGCTTAAGCT GCCAGCGGAATGCTTTCATCCTAAACCAAAAGTAAACAGTGTCTTAATAAAACTTA CCCGCCATACCACAGATGTTCCAGATAAATATTGGAAGCTATATACGTACTTTGTTT CAAAATGGGTCAATCGAGAATATCGTCAACTGTTTACTAAAAATCAGTTTCATCAA GCAATGAAACACGCCAAAGTAAACAATTTAAGTACCCGTTACT% 602/604% 99%% 0,0% % % Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 66 erm)B) Plasmídico% AGAAATTCAAAGAACCGATACCGTTTACGAATTGGAACAGGTAAAGGGCATTTAA CGACGAAACTGGCTAAAATAAGTAAACAGGTAACGTCTATTGAATTAGACAGTCAT CTATTCAACTTATCGTCAGAAAAATTAAAACTGAACATTCGTGTCACTTTAATTCAC CAAGATATTCTACAGTTTCAATTCCCTAACAAACAGAGGTATAAAATTGTTGGGAG TATTCCTTACCATTTAAGCACACAAATTATTAAAAAAGTGGTTTTTGAAAGCCATGC GTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTCTACAAGCGTACCTTGGATATTCA CCGAACACTAGGGTTGCTCTTGCACACTCAAGTCTCGATTCAGCAATTGCTTAAGCT GCCAGCGGAATGCTTTCATCCTAAACCAAAAGTAAACAGTGTCTTAATAAAACTTA CCCGCCATACCACAGATGTTCCAGATAAATATTGGAAGCTATATACGTACTTTGTTT CAAAATGGGTCAATCGAGAATATCGTCAACTGTTTACTAAAAATCAGTTTCATCAA GCAATGAAACACGCCAAAGTAAACAATTTAAGTACCGTTAC% 602/606% 99%% 0,0% erm)A) Lisostafina% TTGGAAAAAAAGAAACAACTGTTATTCACGGGTTACCCACTTATAACAAAAAAAAA AAGGGTACTTTTTGTAGTCCTTCTTTGAAATCAATGTTCCGATGTCGTTCAAGAACA ATCAATACAGAGTCTACACTTGGCTTAGGATGAAAATATAGTGGTGGTACTTTTTT GAGCATTTTTATATCCATCTCCACCATTAATAGTAAACCCAAAGCTCGTTGCAGATT TTGCAATCTTTTCGCAAATCCCTTCTCAACGATAAGATAGCTATATTTAGCCTGACTT TCAAAGGTAATTCTTTTGACAATATCCGTACTGATGTTATAAGGAATATTACCATAT ATCTTATAGTTTATATGTTTTGGGAAGGAAAATTTTAAAATATCCGTTTGGATCCCT TTTAAATTCTTCGGGGGGTTTAACCGTTCCTTAGGCCCTTGAAATAAGCCTCCATTC ATTTCTAAAGCCGGAACTGATCCAATCCATTTGGATAGGTCTTTGGAAAAATGGCC TTTTCCTGAACCCAATTCCAATAAGTTGGCCTGGTTAATGGAATTTCGGGGAGTCA AAAATTCTTTTAAATTCCTTTAAAAAA% 515/575% 90%% 0,0% lnu)A) PrepMan®% Ultra% ACCCAAGGAGGACACAGAGATATAGATATAGATTTTGACGCTCAACACACTCAAA AAGTTATACAAAAATTAGAAGATATCGGATACAAAATAGAAGTTGATTGGATGCCT TCACGTATGGAACTTAAGCATGAAGAATATGGGTATTTAGATATTCATCCTATAAA TCTAAATGATGATGGATCAATTACCCAAGCAAACCCAGAAGGTGGTAATTATGTTT TCCAAAATGACTGGTTTTCAGAAACTAATTACAAAGGTCGAAAAATACCATGTATT TCAAAAGAAGC% 99%% 4eN144% lnu)A) Lisostafina% GAAAAATTGGGGTTAGGAGAGGCCAGAGAAAGAGATTAGATATAGATTTTGACG CTCACACACTCAAAAAGTTATACAAAAATTAGAAGATATCGGATACAAAATAGAAG TTGATTGGATGCCTTCACGTATGGAACTTAAGCATGAAGAATATGGGTATTTAGAT ATTCATCCTATAAATCTAAATGATGATGGATCAATTACCCAAGCAAACCCAGAAGG TGGTAATTATGTTTTCCAAAATGACTGGTTTTCAGAAACTAATTACAAAGGTCGAA AAATACCATGTATTTCAAAAGAAG% 99%% 2eN136% lnu)A% Plasmídico% CCCCAAGGAGAAACAGAGATATAGATATAGATTTTGACGCTCAACACACTCAAAAA GTTATACAAAAATTAGAAGATATCGGATACAAAATAGAAGTTGATTGGATGCCTTC ACGTATGGAACTTAAGCATGAAGAATATGGGTATTTAGATATTCATCCTATAAATC TAAATGATGATGGATCAATTACCCAAGCAAACCCAGAAGGTGGTAATTATGTTTTC CAAAATGACTGGTTTTCAGAAACTAATTACAAAGGTCGAAAAATACCATGTATTTC AAAAGAAGCA% 99%% 1eN143% El% alineamiento% de% las% secuencias% obtenidas% con% las% depositadas% en% la% base% de% datos,%produjo%numerosas%alineaciones%con%una%similitud%de%entre%90%%y%99%%como%se% puede% observar% en% la% tabla% 26.% Estas% secuencias% corresponden% a% fragmentos% del% genoma%que%codifican%los%genes%de%resistencia%objeto%de%este%estudio.% Por%otra%parte,%el%valor%de%“expect”,%informa%del%número%de%alineamientos%que%han% podido%deberse%al%azar,%por%lo%que%en%este%caso,%con%valores%de%entre%0.0%y%1eN117,% podemos%decir%que%todos%los%alineamientos%son%debidos%a%una%relación%biológicamente% significativa%y%por%tanto%se%confirma%la%identidad%de%nuestros%amplicones.% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 67 5.6 Correlación'entre'fenotipo'y'genotipo' Al% relacionar% los% resultados% obtenidos% en% el% test% “in) vitro”% con% los% resultados% obtenidos%mediante%RTNPCR%en%las%5%cepas%de%referencia,%se%observa%que%sí%existe%una% relación%entre%ambos.% La% cepa% de% Staphylococcus) aureus) C5425,) posee)el% gen% lnu% A% responsable% de% la% inactivación% de% Lincosamidas% (Morar% et) al.,%2009),) y% a% su% vez,) es% la% única% cepa% que% presenta% resistencia% a% clindamicina% y% sensibilidad% a% eritromicina.% El% resto% de% cepas% presentan%genes%que%confieren%resistencia%a%eritromicina,%y%los%resultados%del%test%“in) vitro”%muestran%sensibilidad%a%clindamicina%y%resistencia%a%eritromicina.%% En% cuanto% a% los% resultados% del% test% de% inducción,% sólo% las% cepas% Staphylococcus) aureus)C2548%y%Staphylocccus)pseudintermedius)C2381)portadores%de%los%genes)erm)A% y%erm) B%respectivamente,%responsables%de%la%resistencia%a%clindamicina%inducida%por% eritromicina% mediante% el% mecanismo% de% metilación% ribosomal,% presentan% un% DNtest% positivo% y% fenotipo% 𝑖𝑀𝐿𝑆!,% mientras% que% las% cepas% Streptococcus) agalactiae) y) Staphylococcus) aureus) C2929% presentan% DNtest% negativo% y% fenotipo% MS!% ya% que% los% genes%mef)A%y%msr)A%respectivamente,%confieren%resistencia%a%Macrólidos%de%14%y%15% átomos% (eritromicina)% mediante% el% mecanismo% de% expulsión% activa% (Leclercq% et) al.,% 2002,%%Roberts%et)al.,%1999).% 5.7 Caracterización'genética'del'patrón'de'resistencia'antibiótica'a' clindamicina'en'cepas'de'Listeria(spp.(aisladas'de'alimentos' En% la% tabla% 27% se% muestran% los% valores% de% absorbancia% obtenidos% tras% la% lectura%% espectrofotométrica%a%260%y%280%nm,%%así%como%el%cálculo%del%ratio%A260/A280%para%cada% una%de%las%cepas%analizadas.%% Tabla'27.'Concentración'de'ADN'y'pureza'estimada'por'espectrofotometría'para'cada'cepa' ensayada'con'el'método'1'de'extracción'de'ADN'total:'PrepMan®(Ultra% CEPA% [ADN]'µg/ml(1)% A260/A280(2)% L.(innocua( 1% 198,6% 1,7% L.(innocua( 2% 165,4% 1,8% L.monocytogenes( 3% 157,1% 1,9% L.(innocua( 5% 152,3% 1,9% L.(innocua( 8% 210,8% 1,7% Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 68 L.monocytogenes( 9% 173,7% 1,8% L.(innocua( 11% 125,2% 1,9% L.(innocua( 12% 123,8% 2,0% L.(innocua( 13% 150,1% 1,9% L.(innocua( 16% 155,5% 2,0% L.(innocua( 17% 163,3% 1,9% L.(innocua( 18% 179,6% 1,9% L.(innocua( 19% 151,4% 1,9% L.monocytogenes( 22% 173,0% 1,9% L.monocytogenes( 23% 158,0% 1,9% L.(innocua( 14% 218,0% 1,8% L.monocytogenes( 25% 177,4% 1,8% L.(innocua( 27% 204,6% 1,8% L.(innocua( 66% 162,7% 1,9% L.(innocua( 68% 206,6% 1,9% L.(innocua( 70% 150,5% 2,0% L.(innocua( 71% 180,0% 1,9% L.(innocua( 72% 142,0% 2,0% (1)%[ADN]%µg/ml%=%Concentración%de%ADN%% (2)%A260/A280'='Relación%absorbancia%260%nm/absorbancia%280%nm%% Podemos%comprobar%que%en%todas%las%cepas%se%obtiene%cantidad%suficiente%de%ADN% para%su%posterior%amplificación%(123,4%a%218%µg/ml)%y%de%buena%calidad%(A260/A280%=%1,7% –%2,0).% El%gen%de%resistencia%a%clindamicina%lnu%A,%no%ha%sido%detectado%en%ninguna%de%las% 23%cepas%estudiadas.%En%todos%los%casos%se%comprobó%el%buen%funcionamiento%de%la% técnica%con%amplificación%de%los%controles%positivos.% La%resistencia%demostrada%“in)vitro”%a%este%antibiótico%por%estas%cepas,%podría%ser% debida%a%la%adquisición%de%otros%genes%de%resistencia%o%bien%producida%por%mutación.% % % % % % Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 69 6 CONCLUSIONES* % - Los% métodos% de% extracción% ensayados% han% permitido% extraer% ADN% total% y% plasmídico,% de% forma% sencilla,% rápida% y% eficiente,% a% partir% de% distintos% microorganismos%que%presentan%diferencias%en%su%pared%celular.'' - El% método% optimizado% de% PCR% a% tiempo% real% permite% la% detección% y% diferenciación% de% determinantes% genéticos% de% resistencia% a% Macrólidos% y% Lincosamidas% (genes:% mef) A,) msr) A,) erm) A,) erm) B,) lnu) A);% en% base% a% la% temperatura%de%fusión%(Tm),%con%mayor%sensibilidad,%rapidez,%y%menos%riesgo%de% contaminación%que%las%técnicas%moleculares%convencionales.'% - La% buena% correlación% entre% los% resultados% obtenidos% mediante% los% métodos% fenotípicos%(DNtest)%y%genotípicos%permiten%deducir%el%mecanismo%de%resistencia% a%los%antibióticos%del%complejo%MLS,%contribuyendo%a%seleccionar%el%tratamiento% antimicrobiano% más% adecuado% sobre% todo% en% los% casos% en% los% que% el% antibiograma%limita%su%interpretación.%% - Los% resultados% obtenidos% demuestran% que% la% resistencia% “in) vitro”% a% clindamicina% en% 23% cepas% de) Listeria% spp.% aisladas% de% alimentos,% puede% estar% determinada%por%otros%mecanismos%de%resistencia%diferentes%al%producido%por% el% gen)lnu% A% o% por% mutación;% por% ello% sería% conveniente% evaluar% otros% determinantes%genéticos%de%resistencia%a%este%antimicrobiano.'' - La% técnica% RTNPCR% puede% constituir% una% herramienta% muy% útil% que% permite% estudiar% la% distribución% de% los% determinantes% genéticos% de% resistencia% a% los% antibióticos% tanto% en% bacterias% zoonóticas% como% en% comensales% aisladas% de% alimentos,% facilitando% el% seguimiento% y% la% vigilancia% de% la% aparición% de% resistencias%a%los%antibióticos%en%la%medida%en%que%supongan%una%amenaza%para% la%salud%pública.%' - Los%resultados%obtenidos%pueden%ser%útiles%para%que%la%herramienta%multiplex% RTNPCR%permita%la%detección%simultánea%de%varios%de%estos%genes%de%resistencia% en% una% misma% reacción% de% amplificación,% y% por% lo% tanto% puede% servir% como% herramienta%para%la%detección%de%resistencias%antimicrobianas%como%parte%del% diagnóstico%microbiológico.%' Trabajo%fin%de%máster,%Diciembre%2013% 70 7 BIBLIOGRAFÍA* NCANSFM%2011.%Comité%de%l´antibiogramme%de%la%Société%Française%de%microbiologie,% Recommandations%2011.% NCLSI% 2011.% Clinical% and% Laboratory% Standards% Institute.% Performance% standards% for% antimicrobial%susceptibility%testing;%TwentyNFirst%informational%supplement.%M100NS21.% Clinical%and%Laboratory%Standards%Institute;%2011.% NBecerra%G.,%Plascencia%A.,%Luévanos%A.,%Dominguez%M.,%Hernandez%I.%Mecanismo%de% resistencia%a%antimicrobianos%en%bacterias.%Enf%Inf%Microbiol%2009,%29%(2):70N76.%% NBülent% Bozdogan,% Latifa% Berrezouga,% MingNshang% Kuo,% David% A.% Yurek,% Kathleen% A.% Farley,%Brian%J.%Stockman,%and%Roland%Leclercq%(1999).%A%New%Resistance%Gene,%linB,% Conferring% Resistance% to% Lincosamides% by% Nucleotidylation% in% Enterococcus) faecium) HM1025.%Antimicrobial%Agents%and%Chemotherapy,%Apr.%1999,%p.%925–929.% NCharpentier% E,% Courvalin% P.% Antibiotic% resistance% in% 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