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Trabajo Fin de Máster VALORACIÓN DE LA PROTECCIÓN CONFERIDA POR DIFERENTES VACUNAS FRENTE A CEPAS DE PASTEURELLA MULTOCIDA AISLADAS EN CONEJO UTILIZANDO EL MODELO RATÓN Autor Celia Sanz Tejero Directores Dra. Ana Belén Fernández Ros Dr. Raúl Carlos Mainar Jaime Facultad de Veterinaria Junio 2014 2 3 ÍNDICE DE CONTENIDOS Página ÍNDICE DE CONTENIDOS 3 RESUMEN 4 ABSTRACT 5 INTRODUCCIÓN 6 Situación del sector cunícola en España 6 1. Pasteurelosis en conejos 7 2. Agente etiológico, Pasteurella multocida 10 2.1. Factores de virulencia 11 2.2. Caracterización de cepas y estudios previos de cepas aisladas en conejo 16 3. Control de la pasteurelosis 18 4. Estudios experimentales de Pasteurella multocida en el modelo ratón 21 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 23 MATERIAL Y MÉTODOS 24 Cepas bacterianas 24 Animales y condiciones de alojamiento 25 Vacunas utilizadas 25 Determinación de la dosis letal 50 26 Diseño experimental 26 Análisis estadísticos 27 Ensayos experimentales 28 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 Ensayo 1 34 Ensayo 2 36 Ensayo 3 39 Ensayo 4 42 CONCLUSIONES 46 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47 4 RESUMEN La pasteurelosis, causada por Pasteurella multocida, es una de las principales enfermedades de la cunicultura industrial, a pesar de lo cual no existe ninguna vacuna comercial para su prevención. El objetivo principal de este trabajo fue valorar la protección conferida por diferentes vacunas elaboradas con cepas de P. multocida aisladas de conejos utilizando un modelo de infección en ratón. Se evaluó la protección conferida por una vacuna basada en exopolisacáridos capsulares frente a una autobacterina, la protección producida por distintas bacterinas frente al desafío con cepas patógenas, y la protección cruzada entre cepas heterólogas de distinto tipo capsular y perfil de virulencia basado en la presencia o ausencia de los genes hgbB y pfhA. El modelo se basó en la letalidad producida por el desafío con distintas cepas patógenas en grupos de 10 ratones vacunados con dos dosis separadas 14 días frente a la letalidad observada en los grupos control sin vacunar. Para el desafío se calculó previamente la DL50 de cada una de las cepas utilizadas y se utilizó la vía intraperitoneal. El modelo se consideró válido para el objetivo planteado. En todos los animales desafiados que murieron durante los ensayos se aisló P. multocida, mientras que no se aisló en ninguno de los animales sacrificados con posterioridad. La protección conferida por algunas autobacterinas resulto del 100% frente a la falta de protección de otras bacterinas elaboradas con cepas heterólogas, aunque esto no se cumplió en todos los casos. La autovacuna a base de exopolisacáridos no resultó efectiva mientras que la autobacterina elaborada con la misma cepa protegió al 100% de los ratones frente al desafío con esa misma cepa. Algunas bacterinas han demostrado ser efectivas frente al desafío con cepas heterólogas pero no ha podido demostrarse una relación entre la protección y el tipo capsular o el perfil de virulencia. La utilización de autobacterinas y bacterinas puede ser muy útil en la prevención de la pasteurelosis del conejo pero se desconoce que componentes bacterianos son los responsables de la inducción de una respuesta inmune protectora. 5 ABSTRACT Pasteurellosis by Pasteurella multocida is one of the main diseases in the rabbit industry. Despite of its importance, there is no commercial vaccine to prevent it. The main aim of this study was to evaluate the protection provided by different vaccines based on different strains of P. multocida isolated from rabbits and using a mouse infection model. We assessed the protection conferred by a vaccine based on capsular exopolysaccharides versus an autobacterin. It was also evaluated the protection conferred by different bacterins when mice were challenged with different pathogenic strains. Last, the prospective cross protection between heterologous strains of different capsular types and virulence profiles based on the presence or absence of hgbB and pfhA genes was also evaluated. The model used was based on comparing estimates of mortality rates caused after the challenge with pathogenic strains in different groups of 10 mice which had been vaccinated twice 14 days of difference, with mortality rates observed in control (unvaccinated) groups. For each challenge dose, LD50 was calculated previously for each of the strains after using the intraperitoneal route. The model was considered valid for the aim of this study. Pasteurella multocida was isolated from all challenged animals that died during the study, while it was not isolated in any of the mice that survived the period of study and were subsequently slaughtered. The protection conferred by some of the autobacterins was 100%, compared to the lack of protection from other bacterins based on heterologous strains, although this finding was not consistently observed. The autovaccine based on exopolysaccharides was not effective, while the autobacterin based on the same whole strain conferred 100% protection to vaccinated mice challenged with that strain. Some bacterins appeared to be effective against a challenge with heterologous strains, but a relationship between protection and capsular type or virulence profile could not be demonstrated. The use of autobacterins and bacterins can be very useful in preventing rabbit pasteurelosis, but it is unknown which bacterial components are responsible for the induction of a protective immune response. 6 INTRODUCCIÓN Situación del sector cunícola en España La cunicultura, como actividad pecuaria, ha experimentado en los últimos años una importante evolución, alcanzando una considerable relevancia y un creciente interés, siendo España uno de los principales productores mundiales de carne de conejo que, junto con Italia y Francia, forma parte del grupo líder de países a nivel continental. La producción mundial de carne de conejo en 2004 fue de 1.115.000 toneladas. El principal país productor del mundo es China (460.000 t); a continuación se encuentran Italia (222.000 t), España (111.000 t) y Francia (85.200 t). El número aproximado de conejos sacrificados en España en 2004 fue de 90 millones, ocupando la producción de carne de conejo el quinto lugar después de la de porcino, aves, bovino y ovino-caprino. En la actualidad, el conejo se explota económicamente para la producción de carne y también para la producción de piel y pelo, aunque esta segunda aptitud suele ser un producto secundario en la mayoría de los casos. También es utilizado como animal de compañía (razas enanas), de experimentación y para la realización de repoblaciones cinegéticas (conejo silvestre). El censo y el número de explotaciones en España en el año 2014 según los datos del Registro General de Explotaciones Ganaderas (REGA) es de 6.280.625 animales y 3.315 explotaciones. La gran mayoría de éstas se dedican a la producción de gazapos para carne (73,6%). Más de la mitad del censo de animales se encuentra repartido entre tres Comunidades Autónomas: Cataluña (24,2%), Galicia (19,0%) y Castilla León (17,0%). En Cataluña se localiza además el mayor porcentaje de granjas (33,2%). El balance exterior de este tipo de carne ha sido habitualmente favorable para el sector nacional aunque las exportaciones de carne de conejo son poco importantes, alrededor de unas 5.000 toneladas anuales, dirigidas preferentemente hacia otros países de la Unión Europea, entre los que destacan Portugal y Francia. Las importaciones apenas llegan a las 500 toneladas (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente; principales indicadores económicos del sector cunícola en el año 2014). 7 1. Pasteurelosis en conejos Dentro de las enfermedades infecciosas no digestivas más frecuentes en explotaciones de conejos, se encuentra la pasteurelosis (Peeters, 1995; Coudert et al., 1999), la cual se puede definir como la infección clínica o subclínica de cualquier sistema, órgano o tejido por microorganismos del género Pasteurella (Rosell, 2000). La pasteurelosis es la responsable de al menos el 50% de las causas principales de sacrificio de las conejas de reposición (Balençon et al., 1982). Cuando hablamos de la pasteurelosis en conejos, el agente etiológico mayormente involucrado es Pasteurella multocida (P. multocida) (Coudert et al., 2006). En España cerca del 50% de la mortalidad en las explotaciones cunícolas industriales se produce por trastornos respiratorios (Villa et al., 2001), siendo P. multocida el principal agente causal de este tipo de problemas (Rosell, 2000). Además, las infecciones con abscesos producidas por este agente representan la causa principal de eliminación de conejas de cría (Coudert, 1980). La pasteurelosis del conejo se origina por la colonización de las vías respiratorias superiores y, a partir de esta zona, algunas cepas son capaces de invadir otros órganos, desencadenando una gran variedad de signos clínicos que incluyen otitis media y tortícolis (Fox et al., 1971; Snyder et al., 1973; Flatt et al., 1977; Coudert et al., 1986), necrosis del pabellón auricular o de otros órganos (Badiola et al., 1992), meningitis y encefalitis (Kpodekon, 1983), neumonía y pericarditis (Webster, 1926; Badiola et al.,1992), abscesos cutáneos (DiGiacomo et al., 1983), peritonitis (Bjotvedt, 1979; Badiola et al., 1992), metritis (Thigpen et al., 1978; Holmes et al., 1983; Badiola et al., 1992; Johnson y Wolf, 1993), y orquitis (Flatt, 1974). Forma respiratoria Es la forma más común de pasteurelosis en conejo. Engloba un proceso conocido como rinitis o coriza que se caracteriza por secreción nasal mucopurulenta, ruidos y dificultad respiratoria asociada frecuentemente a conjuntivitis (Boucher y Nouaille, 1996; Langan et al., 2000; Rosell, 2000a; Percy y Barthold, 2001). 8 En algunas ocasiones puede ocurrir la progresión de rinitis a neumonía. Los conejos afectados mueren generalmente de forma aguda sin mostrar signos clínicos de enfermedad (especialmente los conejos jóvenes). No obstante, suele detectarse anorexia, letargia, fiebre, disnea, taquipnea y cianosis (Hagen, 1958; Langan et al., 2000). Macroscópicamente las lesiones observadas en una neumonía aguda son: focos de consolidación de color rojo a gris en los lóbulos craneoventrales, con o sin hemorragia, conocido como bronconeumonía catarral aguda. Este proceso puede cronificarse dando lugar a una consolidación generalizada, abscesos, pleuritis y pericarditis fibrinosa e incluso purulenta (Deeb y DiGiacomo, 2000a; Percy y Barthold, 2001). Forma septicémica La septicemia es poco frecuente o rara vez se diagnostica. La muerte se produce entre 24 y 48 horas después de los síntomas iniciales que a menudo son inaparentes. La septicemia puede desencadenar otras formas clínicas: la rinitis, la perineumonía, abscesos, etc. Abscesos Normalmente aparecen en procesos de evolución crónica. Se observan formaciones purulentas en el tejido conjuntivo subcutáneo (únicas o múltiples), frecuentemente localizadas en cabeza, pudiéndose afectar también ganglios linfáticos, glándulas mamarias, articulaciones y vísceras. A partir de esta forma crónica pueden producirse complicaciones de carácter septicémico o respiratorio. Otitis media y encefalitis La extensión de la infección por P. multocida de la nariz al oído medio ocurre probablemente a través de la trompa de Eustaquio. La otitis media puede ser asintomática o, en caso de afección del oído interno, en animal puede desarrollar tortícolis. Pueden observarse signos nerviosos y ataxia si la bacteria se extiende a las meninges. Aparece un exudado de color blanquecino y consistencia cremosa en el oído medio, que puede ser tanto unilateral como bilateral (Deeb et al., 1990b; Deeb y DiGiacomo, 2000a). 9 Forma genital y mamitis En animales adultos se puede presentar una forma genital que se caracteriza por procesos inflamatorios catarrales o purulentos. Suele ser más frecuente en las hembras (endometritis y mamitis) que en los machos (orquitis, prostatitis). En el caso de las hembras, las bacterias llegan al útero por vía sanguínea como consecuencia de la infección del tracto respiratorio. Las conejas presentan el vientre abultado y eliminan un exudado muco-purulento por la vulva. Además se producen abortos y existe disminución de la fertilidad e incluso la esterilidad. En el macho solamente se puede apreciar un aumento considerable del tamaño de los testículos e incluso abscesos purulentos. Otras localizaciones Se han descrito otras formas de pasteurelosis, tales como la conjuntivitis, osteomielitis mandibular (Hinton, 1978), la peritonitis (Bjotvedt et al., 1979), la osteoartritis tibiotarsal (Hago et al., 1987) y la dacriocistitis (Jones et al., 1988). Estas formas de la enfermedad son casos aislados y casi inexistentes en la producción intensiva. Algunos autores opinan que la capacidad de inducir o no, un determinado cuadro clínico, depende de la cepa (Rosell, 2000) y se ha podido demostrar que un mismo animal puede ser portador de más de una cepa. Aunque el portal de entrada del microorganismo es usualmente la vía respiratoria (Quinn et al., 1994), también se ha descrito la ruta conjuntival, oral, transcutánea y vaginal. Gran parte de los animales de una explotación pueden presentar P. multocida en la mucosa nasal, como portadores aparentes o inaparentes, en una tasa que varía del 20 al 70% (Flat, 1974). La colonización de vías respiratorias altas tiene tasas de prevalencia del 75 al 90% (DiGiacomo et al., 1983; Holmes et al., 1984), con un 3045% de animales con signos clínicos (DiGiacomo et al., 1983). La prevalencia de lesiones neumónicas macroscópicas en animales aparentemente sanos de 8-10 semanas de vida puede llegar hasta el 20% y se han encontrado tasas de otitis media en matadero en el 4% de los animales jóvenes y en el 32% de los adultos (Flatt et al., 1977). 16 membranas mucosas del hospedador y/o reduciendo la eficacia de las defensas de éste. La mayoría de las cepas de P. multocida producen sialidasas (Scharmann et al,. 1970; Drzeniek et al., 1972; White et al., 1995). 2.2. Caracterización de cepas y estudios previos de cepas aisladas en conejo Numerosos estudios abordan las características serológicas de los aislados de P. multocida en conejos (Perreau et al., 1962; Lu et al., 1978,1983; Chengappa et al., 1982; Manning, 1984; Rideaud et al., 1992b; Rideaud y Coudert, 1994; Jaglic et al., 2004). Los serogrupos A, D, B y F se han encontrado en estas cepas. El serogrupo A es el más ampliamente encontrado (Perreau et al., 1962; Chengappa et al., 1982; Lu et al., 1983; Rideau et al., 1992a; Rideau y Coudert 1994); el serogrupo D es poco frecuente y generalmente limitado a granjas pequeñas o instalaciones de laboratorio(Manning, 1984; Jaglic et al., 2004; Virag et al., 2005). En conejos, las características antigénicas no han sido suficientes para caracterizar las cepas de P. multocida de acuerdo con su patogenicidad o su origen epidemiológico. Cepas del mismo serotipo pueden tener diferentes patogenicidades. En los EE.UU. el serotipo A:12 (método de Heddleston) podría ser el más frecuente (Chengappa et al., 1982) y el más patógeno. En lo que respecta a P. multocida en las granjas intensivas de Europa, nunca ha sido posible establecer una relación entre patogenicidad y serotipo. En un estudio de aislados de P. multocida a partir de la mucosa nasal de conejos sanos y de lesiones halladas en conejos muertos, las cepas exhibieron heterogenicidad genética pero sin ninguna correlación con el estado de los conejos muestreados. Esto sugiere que los conejos sanos pueden actuar como reservorios de cepas patógenas de P. multocida (Virag et al., 2005). Recientemente en nuestro país se tipificaron 102 aislamientos de P. multocida a partir de distintos procesos patológicos de conejo (procesos respiratorios, abscesos cutáneos, mamitis, procesos reproductivos y septicemias) que provenían de 24 provincias españolas y Portugal. El serotipo A fue el serotipo capsular más frecuente, englobando casi la mitad de las cepas (48%). El resto de las cepas se distribuyó casi por igual entre los serotipos D (25,5%) y el F (24,5%). En cuanto a la asociación de los serotipos capsulares y los procesos patológicos, los serotipos A y F se aislaron de 17 cualquier tipo de proceso mientras que el serotipo D pareció asociarse a los procesos respiratorios y septicémicos. En ninguno de los aislados se detectó el gen de la necrotoxina de P. multocida (toxA) y tan solo un aislado dio resultado positivo para el gen tbpA, el cual hasta ahora se ha descrito exclusivamente en aislados de P. multocida de rumiantes (Atashpaz et al., 2009). Más del 60% de los aislados fueron positivos al gen hgbB y muchos de ellos negativos tanto al gen hgbB como al tbpA. No se detectó una asociación significativa entre los distintos factores de virulencia testados en el estudio y el proceso patológico. En cuanto a la procedencia geográfica, no se detectaron agrupaciones de serotipos (datos no publicados). En un estudio en Texas (EE.UU.) llevado a cabo entre los años 1977 y 1981 en el cual los aislamientos fueron testados sólo para los antígenos capsulares A o D, los principales serotipos de P. multocida aislados a partir de la cavidad nasal de conejos sanos eran serotipos 12:A (33%), no tipificable:A (50%), y no tipificable:D (10%). Por otra parte, los serotipos más importantes de P. multocida obtenidos de conejos que presentaban rinitis, neumonía, conjuntivitis, otitis o abscesos cutáneos eran 12:A (32%), no tipificable:A (30%), y 3:A (16%). El serotipo 12:A fue el predominante independientemente de si los aislamientos fueron recuperados de animales sanos o enfermos (Lu et al., 1983), tal y como se comprobó en otro estudio en Canadá, a partir de los aislados que se obtuvieron de infecciones respiratorias superiores, bronconeumonías, neumonías fibrinosas agudas, abscesos y otitis media. El 47% eran de tipo 12:A, el 30,5% 3:D y el 12% eran 3:A. El antígeno somático 3 se aisló mayoritariamente de neumonías agudas, mientras que el serogrupo 12:A fue más frecuente en las infecciones del tracto respiratorio superior y en la bronconeumonía crónica localizada (Percy et al., 1984). Como se ha mencionado anteriormente, las cepas del serogrupo F en aislados de conejo se han detectado recientemente cuando se ha dispuesto de la tipificación genética molecular de los genes de la cápsula (Jaglic et al., 2004; Virag et al., 2005). En varias explotaciones de la República Checa durante el período comprendido entre 2001 y 2004 se analizaron una serie de aislamientos por PCR para determinar el antígeno capsular. A parte de los aislados identificados como serogrupos A (58,4%) y D (8,3%), el 33,3% de los aislamientos se identificaron como miembros del serogrupo F. Este serogrupo había sido principalmente asociado hasta ahora con las infecciones de aves. Posteriormente en el año 2008, este mismo grupo de investigadores estudió el papel del serogrupo F de P. 18 multocida, induciendo la enfermedad en conejos. Tres grupos de conejos libres de Pasteurella fueron desafiados por vía intranasal, subcutánea y por vía oral respectivamente. Seis conejos de cada grupo fueron inmunosuprimidos con dexametasona. Las observaciones en este estudio indicaron que, además de los serogrupos A y D, el serogrupo F también podía ser altamente patógeno para los conejos y por lo tanto, podría ser causante de pérdidas económicas considerabes en producción (Jaglic et al., 2008). También en el continente americano se han hecho estudios sobre la tipificación de cepas de P. multocida. Por ejemplo en México, de un total de 34 aislamientos de P. multocida de conejos y de otros animales domésticos con problemas respiratorios se obtuvo un aislado de ovejas que resultó pertenecer al serogrupo capsular D, mientras que el resto de los aislados de conejos, ovejas, vacas, cerdos, cabras y patos pertenecieron al serogrupo capsular A. Este fue el primer informe del tipo capsular A de P. multocida aislada a partir de conejos y patos en México (Soriano-Vargas et al., 2011). Por otra parte en granjas de conejos con síntomas respiratorios en São Paulo (Brasil), el 45,6 % de los aislados pertenecían a tipo capsular A y el 54,34 % de los aislamientos fueron no tipificables. Ninguna de las cepas albergaba genes toxA o pfhA (Porfida Ferrerira et al., 2012). 3. Control de la Pasteurelosis Las manifestaciones clínicas y las pérdidas de productividad pueden controlarse mediante la utilización de antibióticos y quimioterápicos, aplicados generalmente en el agua de bebida o en piensos medicados (Rosell et al., 2000). La mayoría de aislamientos de P. multocida son sensibles a penicilina, un antibiótico que por sus características no puede utilizarse por vía oral y se reserva para la intervención parenteral a hembras y machos de alto valor. Las tetraciclinas por vía intramuscular o subcutánea (oxitetraciclina o tetraciclina), los derivados de nitrofuranos y aminoglucósidos (estreptomicina o DH-estreptomicina, gentamicina) y las quinolonas (flumequina o enrofloxacina) han dado resultados más o menos exitosos (Coudert et al., 2006). La tilmicosina es otro de los quimioterápicos con una elevada actividad frente a P. multocida pero por sus características miocardiotóxicas, solo puede ser utilizada por vía subcutánea (Rosell et al., 2000). 19 Sin embargo el tratamiento antibiótico de Pasteurella es caro, largo e ineficaz debido a la cada vez mayor resistencia a los antibióticos de la bacteria. El ácido hialurónico presente en la cápsula del microorganismo puede prevenir que ciertos medicamentos puedan penetrar en las bacterias (Beckenlehner et al., 1992). Algunos autores han descrito recidivas frecuentes de la enfermedad después de los tratamientos (Broome y Brooks, 1991) o la ineficacia de los tratamientos antibióticos (Jaslow et al., 1981; Mähler et al., 1995). Las medidas higienico-sanitarias a tomar para prevenir y controlar la pasterelosis consisten en el control de la humedad, la temperatura y la ventilación de la explotación, controlar la densidad de animales, adecuada limpieza y desinfección de jaulas, suelos y paredes, evitar situaciones estresantes, cuarentena de todos los animales que se introducen y eliminación de enfermos (Astorga et al., 1997). Uno de los problemas prácticos básicos de la pasteurelosis en las granjas es la existencia de un elevado número de animales portadores inaparentes, cuyo control debe hacerse mediante medidas inmunoprofilácticas. En España no existe ninguna vacuna comercial registrada frente a P. multocida en conejos. Se han llevado a cabo numerosos estudios experimentales con vacunas. Sin embargo, la efectividad de dichas vacunas en condiciones de campo nunca ha sido demostrada. La inmunización intranasal de conejos con una vacuna realizada a partir de la toxina termolábil de P. multocida (PMT), estimuló el desarrollo de anticuerpos frente a PMT en el suero y en las superficies de la mucosa de las vías respiratorias. Esta respuesta se consiguió mejorar utilizando la toxina del cólera (CT), un potente adyuvante para el sistema inmune de la mucosa (Suckow et al., 1995). También la vacunación intranasal de conejos con proteínas externas de membrana (OMP) de P. multocida (A:3) que expresan proteínas reguladas por el hierro (IROMP) en combinación con la toxina del cólera (CT) como adyuvante, estimuló la respuesta de anticuerpos tanto en la mucosa como en el suero. Además esta vacuna fue capaz de estimular la inmunidad frente a la neumonía producida por Pasteurella realizando un desafío experimental (Confer et al., 2001). 20 La vacunación oral es una forma simple y eficiente para inducir inmunidad frente a patógenos infecciosos que colonizan las superficies mucosas. En otro estudio realizado por Suckow en 1996, se utilizaron microesferas de alginato que incorporaban en su interior extracto de tiocianato de potasio (PTE) de P. multocida como inmunógeno. De esta forma los antígenos quedaban protegidos de la degradación enzimática del tracto digestivo. La administración de estas microesferas en el agua potable estimuló de forma significativa los niveles de anticuerpos anti-PTE en suero y en los lavados nasales de los conejos. Además se desarrolló una inmunidad protectora frente al desafío vía intranasal con P. multocida. El extracto de tiocianato de potasio (PTE) producido por P. multocida con el serotipo D:3,12,15 se utilizó en un estudio de campo para vacunar conejos libres de Pasteurella y posteriormente introducirlos en una explotación con pasteurelosis endémica con el serotipo A:3. La vacuna estimuló la inmunidad protectora frente a la cepa heteróloga, obteniéndose unos mejores resultados administrando la vacuna por la vía subcutánea en comparación con la vía intramuscular (Suckow et al., 2008). En un estudio reciente en Egipto se ha evaluado el efecto protector de los propóleos como adyuvantes ya que, debido a sus propiedades biológicas y farmacológicas (antimicrobianos, antiinflamatorios, antioxidantes, antiparasitarios, estimulantes de la inmunnidad) ha crecido el interés por su uso en combinación con las vacunas. En este estudio se demostró que con un extracto etanólico de propóleos administrado por vía subcutánea tanto sólo, como combinado con una bacterina inactivada con formol de P. multocida, se mejoraron las condiciones generales de salud de los conejos además de reducir la gravedad de los signos clínicos adversos, las tasas de mortalidad, y los cambios histopatológicos asociados con el desafío de los conejos con una cepa de P. multocida (Nassar et al., 2013). Por los variables resultados obtenidos con una bacterina estándar y por los mejores resultados aportados por las autobacterinas (vacunas bacterianas producidas con las cepas de los microorganismos aislados de la explotación donde se aplican), parecería que los antígenos básicos para neutralizar la infección por P. multocida han de ser algunos componentes minoritarios de las estructuras superficiales de la bacteria. Además hay que tener en cuenta la existencia de una gran variedad de cepas en las explotaciones, como ha podido demostrarse (Badiola et al., 1996). 21 4. Estudios experimentales de Pasteurella multocida en el modelo ratón Los modelos con grandes animales son costosos y requieren instalaciones especializadas para experimentación, por ello varios modelos de animales pequeños han sido ampliamente empleados para estudiar las diferentes enfermedades. La lista incluye ratones, ratas y conejos que se han utilizado para evaluar diferentes estrategias terapéuticas. Son asequibles, de fácil cuidado y manejo, y no requieren grandes espacios para el mantenimiento. Además, pueden utilizarse suficientes animales en un solo estudio para llevar a cabo el análisis estadístico. En este sentido se han realizado numerosos estudios en los cuales los ratones han demostrado ser sensibles a este agente. En 1973 F.M. Collins ya describió que los ratones CD-1 libres de patógenos específicos eran altamente susceptibles a la infección por P. multocida. Utilizó para su ensayo la cepa 5A aislada de pavos y la introdujo por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o aerógena. La mayoría de las cepas aviares encapsuladas causantes del cólera aviar, también son virulentas para ratones por ello este modelo se ha utilizado para los ensayos experimentales de las vacunas contra P. multocida (Collins 1973). Posteriormente utilizó esta misma cepa para estudiar la respuesta inmune de ratones infectados de forma experimental (Woolcock y Collins 1976). Durante los años 80 poco se sabía acerca de la septicemia hemorrágica, una enfermedad infecciosa reconocida desde hace años que afecta a bovinos y búfalos y está causada por serotipos particulares de P. multocida. Este desconocimiento era debido principalmente a la falta de modelos animales adecuados. Para estudiar la enfermedad se empleó también el modelo ratón, el cual permitió evaluar la dosis infectiva, la cinética de infección, la patología de la enfermedad y la resistencia a la reinfección utilizando ratones BALB/c (Ramdani et al., 1989). Gracias a este modelo se pudieron realizar otros estudios posteriores relacionados con esta enfermedad: en 2002 se realizó un estudio cuyos objetivos fueron la construcción de mutaciones definidas en los genes aroA de dos cepas de P. multocida con el serotipo B:2 para ponerlas a prueba en un modelo ratón experimental y así determinar su grado de atenuación y sus propiedades de protección, así como para comparar los derivados mutantes con las cepas parentales para la propagación y persistencia en el hospedador (Tabatabaei et al,.2002). Más 22 adelante en 2005 se utilizó el modelo ratón para evaluar la eficacia inmunoprotectora de una vacuna obtenida a partir de las OMPs de P. multocida utilizando el serotipo de la septicemia hemorrágica (B:6) combinada con adyuvantes mejorados frente a un desafío homólogo (Basagoudanavar et al., 2006). 23 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS La pasteurelosis, causada por Pasteurella multocida, es una de las principales enfermedades de la cunicultura industrial. Dada la inexistencia de vacunas comerciales frente a P. multocida en conejos, la única alternativa actual de inmunoprofilaxis descansa en la utilización de autovacunas, bacterinas elaboradas con cepas aisladas de una explotación para ser aplicadas en dicha explotación. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante la aplicación de las mismas no siempre han sido satisfactorios. El objetivo principal de este trabajo es valorar como mejorar los resultados de las autovacunas frente a P. multocida de conejos basándonos para ello en un modelo animal previamente establecido como válido, el modelo ratón. Los objetivos específicos han sido: -Establecer y ajustar un modelo ratón bajo las condiciones de nuestro laboratorio basado en la letalidad producida por cepas de P. multocida aisladas de conejo. -Valorar la eficacia de una autovacuna basada en una bacterina convencional frente a una autovacuna basada en la introducción de antígenos en liposomas en dicho modelo animal. -Valorar la protección conferida por distintas bacterinas elaboradas con distintas cepas frente al desafío con una cepa virulenta. -Valorar la protección cruzada conferida por una vacuna elaborada con una cepa frente al desafío con cepas de distinto tipo capsular y perfil de virulencia. 24 MATERIAL Y MÉTODOS Cepas bacterianas Las cepas de P. multocida utilizadas para este estudio fueron obtenidas a partir de muestras tomadas por veterinarios clínicos de procesos patológicos de conejos que llegaron al laboratorio Exopol para su diagnóstico entre los años 2010 y 2012 procedentes de distintas regiones de España (Tabla I). Las muestras se cultivaron a 37ºC en agar sangre Columbia (OXOID PB5039A) y las cepas obtenidas fueron identificadas como P. multocida mediante pruebas bioquímicas estandarizadas, incluyendo la producción de catalasa, oxidasa e indol, actividad ureasa, citrato y TSI (Triple Sugar Iron) (Quinn et al, 1994). Todas las cepas fermentaban el TSI, sin producción de gas ni de ácido sulfhídrico y eran Catalasa +, Oxidasa +, Indol +, Urea - y Citrato -. Tabla I. Cepas utilizadas y origen. a La letra indica el serotipo capsular y los números romanos el perfil de virulencia. Nueve de las 12 cepas utilizadas se caracterizaron genéticamente por PCR para determinar la presencia de genes codificadores del serotipo capsular y de determinados factores de virulencia. Esta caracterización incluyó los genes toxA, tpbA, hgbB, pfhA y Cepaa Origen 70336 Proceso respiratorio 67576 Septicemia 69193 Proceso respiratorio 74622 AII Proceso respiratorio 73739 AII Proceso respiratorio 76918 AI Proceso reproductivo 76939 AIII Absceso cutáneo/mamitis 76236 AIV Proceso respiratorio 75039 DII Septicemia 76849 FI Proceso respiratorio 73688 FII Absceso cutáneo/mamitis 76154 FIII Septicemia 25 se realizó en el Departamento de Sanidad Animal de la Universidad Complutense de Madrid. En función de la detección de los factores de virulencia las cepas se caracterizaron en los perfiles de virulencia que se muestran en la Tabla II. Tabla II. Perfiles de virulencia observados en las distintas cepas de P. multocida. Animales y condiciones de alojamiento Se utilizaron hembras de ratones Hsd: ICR (CD-1) (Harlan Ibérica, Barcelona, Spain) con un peso de 25-30gr. que se alojaron en jaulas de 10 individuos cada una. Los animales se alimentaron con un pienso comercial para ratones y agua ad libitum. Los ratones tuvieron un período de adaptación en las instalaciones de una semana antes de ser utilizados para los diversos estudios. El animalario presentaba unas condiciones ambientales controladas: se mantuvo una temperatura de 24-25ºC con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad además de un sistema de extracción de aire. Vacunas utilizadas Se elaboraron bacterinas con las siguientes cepas de P. multocida: 70336, 67576, 69193, 74622 AII, 73739 AII, 76918 AI, 76939 AIII, 76236 AIV, 75039 DII, 76849 FI, 73688 FII y 76154 FIII. Para ello cada una de las cepas de P. multocida fue descongelada a temperatura ambiente y sembrada en placas de agar sangre. A continuación las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Una vez comprobada la pureza de la cepa, el crecimiento obtenido en cada placa se recogió con asa de Drigalsky en 3 ml de PBS (Phosphate buffered saline) creando una suspensión densa y homogénea a partir de la cual se sembraron nuevamente placas de agar sangre en función de la cantidad de bacterina necesaria. Estas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. El crecimiento de todas las placas cultivadas se recogió de nuevo en PBS. La suspensión bacteriana final se homogeneizó y, para calcular la concentración, se llevó a cabo un recuento de las bacterias viables mediante diluciones en base 10 y siembra de dichas PERFIL toxA + tbpA A+ hgbB+ pfhA + I - - + + II - - + - III - - - + IV - - - - 32 RESULTADOS Y DISCUSIÓN El modelo animal utilizado en este estudio, basado en la letalidad producida en ratones al ser inoculados con cepas de P. multocida aisladas de procesos patológicos de conejos, ha demostrado ser válido, pues se ha conseguido producir letalidad en al menos 50% de los ratones de los grupos controles con todas las cepas utilizadas. Este modelo es por tanto válido también para estudiar la protección conferida por las vacunas utilizadas frente a P. multocida, como ya demostraron otros autores anteriormente en ratones (Ryu et al., 2000; Basagoudanavar et al., 2006; Garrido et al., 2008). Otras especies animales utilizadas en modelos de infección experimental para el estudio de vacunas frente a P. multocida son los pollos para el estudio del cólera aviar (Wu et al., 2007) o los conejos (Suckow et al., 1995, 1996; Confer et al., 2001; Nassar et al., 2013). El modelo conejo también se ha utilizado para realizar estudios experimentales sobre la patogenicidad de determinadas cepas de P. multocida de tipo capsular F (Jaglic et al., 2008). Sin embargo estos modelos son mucho más difíciles de realizar de forma experimental por la infraestructura necesaria y el coste. En todos los animales de este estudio que habían sido desafiados con alguna cepa de P. multocida y que murieron durante los 7 días post-inoculación se aisló P. multocida de al menos uno de los órganos internos muestreados. No se aisló P. multocida en ninguno de los animales sacrificados después de una semana desde el desafío. Esto demuestra que murieron por la infección y aquellos animales que no murieron fueron capaces de superarla. Las dosis letales obtenidas para cada una de las cepas utilizadas en los diferentes ensayos fueron muy variables tal y como se muestra en la tabla VII. La DL50 de cuatro cepas (70336, 76918 AI, 76236 AIV y 75039 DII) fue inferior a 500 ufc. Dada la dificultad de establecer la DL50 real y considerando que en el primer ensayo 500 ufc permitió valorar la protección conferida por las vacunas utilizadas, se utilizó para esas cepas una dosis de desafío de 500 ufc. 33 Tabla VII: dosis letal 50 para las distintas cepas utilizadas. La DL50 calculada por otros autores para cepas de P. multocida de distintas enfermedades como la septicemia hemorrágica bovina o el cólera aviar, también ha sido muy variable entre cepas (Woolocock et al., 1976; Tabatabaei et al., 2001; Ali et al., 2004; Herath et al., 2010). Esta variabilidad puede deberse a la diferencia en el grado de patogenicidad entre cepas o la vía de inoculación utilizada. En este sentido, en un estudio realizado por Collins en 1973 se describen las dosis de desafío con la misma cepa de P. multocida cuando se administraba la bacteria por diferentes vías de inoculación: infección intravenosa 10-104 bacterias; infección intraperitoneal 102-104 bacterias; infección subcutánea 102-103 bacterias e infección aerógena 105-107 bacterias. Cepa DL50 70336 <500 74622AII 40.000 73739 AII 5.000.000 76918 AI <500 76939 AIII 40.000 76236 AIV <500 75039 DII <500 76849 FI 5.000.000 73688 FII 5.000.000 76154 FIII 5.000.000 34 Ensayo 1 La mortalidad de G1 y G3 (vacunados con autobacterina combinada con exopolisacáridos o sola, respectivamente) fue del 10 y el 0% respectivamente, mientras que la mortalidad del G2 (vacunados solo con exopolisacáridos en aluminio) y el grupo control fue del 100% (Gráfico 1), lo que nos da un índice de protección muy alto (0,9 y 1) para G1 y G3 y nulo para G2. Gráfico 1. Resultados de mortalidad en el ensayo 1. Las diferencias entre el G1 y el grupo control, entre el G3 y el grupo control, entre el G1 y el G2 y entre el G2 y G3 fueron estadísticamente significativas (P<0.01). Gráfico 2. Resultados del índice de protección en el ensayo 1. 35 Los resultados obtenidos en este primer ensayo indican que la mayor eficacia vacunal se obtiene con las vacunas que incluyen la autobacterina (G1 y G3), la cual incluye en la vacuna todos sus componentes. Por el contrario, la vacuna a base de exopolisacáridos solos no confirió ningún tipo de protección. Los exopolisacáridos bacterianos son hidratos de carbono creados por la propia bacteria en su citosol, que posteriormente expulsa al exterior, lo que incluye los polisacáridos capsulares, considerados como importantes factores de virulencia en el caso de P. multocida (Boyce et al., 2000). Los exopolisacáridos ayudados de los adyuvantes adecuados pueden ser inmunógenos. De hecho, vacunas elaboradas con exopolisacáridos incluidos en liposomas frente a Staphylococcus aureus sí han funcionado obteniéndose tasas de protección elevadas (Amorena et al., 1994). Sin embargo en nuestro caso, los exopolisacáridos de P. multocida incluidos en liposomas no indujeron ningún tipo de protección. Es de destacar que sin embargo no afectan negativamente a la protección inducida por la bacterina cuando se aplican simultáneamente, lo que puede tener una importante implicación en la prevención de patologías del conejo. Las autovacunas frente a S. aureus compuestas por los exopolisacáridos de esas bacterias e incluidos en liposomas se utilizan habitualmente en veterinaria y su utilización es frecuente en conejos. Según estos resultados sería factible una vacuna combinada a base de exopolisacáridos en liposomas de S. aureus y una bacterina de P. multocida que podría aplicarse al mismo tiempo con un único pinchazo. 36 Ensayo 2 La mortalidad del G1 (vacunado con la autobacterina) fue del 10% mientras que las mortalidades de los G3 y G4 (vacunados con otras bacterinas de P. multocida) fue de 90 y 100% respectivamente (Gráfico 3). La mortalidad del grupo control fue del 100%, lo que nos da un índice de protección muy elevado para el G1 (0,9) mientras que para G3 y G4 el índice de protección fue muy bajo o nulo (0,1 y 0) (Gráfico 4). Gráfico 3. Resultados de mortalidad en el ensayo 2. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas entre el G1 y el grupo control; entre el G1 y el G3 y entre el G1 y el G4 (p<0.01). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el resto de grupos. Gráfico 4. Resultados del índice de protección en el ensayo 2. 37 Como se muestra en el gráfico 5, el grupo G2 mostró un tiempo medio de supervivencia (2,2 días) significativamente inferior (P<0,001) al resto de los grupos (G1=5,5, G3=5,6 y G4=4). También se observaron diferencias significativas entre los grupos vacunados G1 y G4. Gráfico 5. Probabilidad de supervivencia de los ratones de cada grupo. Cuando se realizó el ensayo las cepas utilizadas estaban sin caracterizar. Lo único que se conocía de ellas era el tipo de patología de la que provenían y que habían sido aisladas de animales provenientes de distintas explotaciones sin relación alguna entre ellas. Mientras que la cepa del G3 se aisló de un caso de septicemia, la cepa del G4 se aisló de una neumonía, al igual que la cepa de desafío en este ensayo (70336). Los resultados de este ensayo indicaron que la protección se produjo únicamente con la cepa homóloga. Las cepas heterólogas no fueron capaces de inducir una protección cruzada. Algunos autores (Gyles et al., 2004) han llegado a la conclusión de que la vacunación con bacterinas tiene muchas desventajas ya que éstas no tienen la capacidad de producir protección cruzada con otros serotipos, dan lugar a una inmunidad corta e ineficaz y los animales inmunizados todavía sufren brotes de enfermedades. Además, producen inflamación en el punto de inoculación. Sin embargo en nuestros ensayos ningún animal vacunado con estas bacterinas a base de cuerpos bacterianos completos e hidróxido de aluminio como adyuvante presentó reacción inflamatoria en el punto de inoculación, ni síntomas de afección generalizada. La ausencia de vacunas comerciales frente a P. multocida para conejos y los resultados obtenidos en estos ensayos nos 1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 días Supervivencia (%) GRUPO G1 G2 G3 G4 38 llevan a pensar en la utilidad de las autobacterinas como método inmunoprofiláctico para esta especie animal, aunque sería necesario estudiar tanto el índice de protección en conejos como la duración de la inmunidad en los mismos. Antes de eso, consideramos importante ampliar el estudio en el modelo ratón con otras cepas caracterizadas previamente. 39 Ensayo 3 En el grafico 6 se muestra la mortalidad producida en los grupos vacunados con las bacterinas elaboradas con cepas de distinto serotipo capsular y perfil de virulencia y en el grupo control sin vacunar, tras el desafío con la cepa de P. multocida 74622 de serotipo capsular A y perfil de virulencia II. El G1 fue vacunado con la autobacterina. Gráfico 6. Resultados de mortalidad en el ensayo 3. Al comparar el grupo control con cada uno de los grupos vacunados, solamente se vieron diferencias estadísticamente significativas con el G2 (vacunado con la bacterina 73739 AII) y el G5 (vacunado con la bacterina 76236 AIV) (p<0.01). No hubo diferencias estadísticamente significativas en el resto de las comparaciones. La mortalidad de G2 y G5 fue 0% siendo por tanto su índice de protección 1. Los grupos G2 y G5 son los grupos con máximo tiempo medio de supervivencia, porque todos los ratones sobrevivieron más allá de los 7 días del experimento. No hay diferencias significativas entre el resto de los grupos. En este ensayo elegimos para el desafío de todos los grupos una cepa de tipo capsular A y perfil de virulencia II por ser una de las combinaciones mayoritarias encontradas en un estudio de caracterización de cepas de P. multocida aisladas de conejo realizado por la Universidad Complutense de Madrid (48% del total de cepas caracterizadas fueron de tipo capsular A y 48,50% tuvieron un perfil de virulencia II). Cada uno de los grupos se vacunó con una bacterina distinta, elaborada con cepas de tipo capsular y perfil de virulencia distintos a la cepa de desafío, excepto el grupo 1 para 40 el que se utilizó una autobacterina elaborada con la misma cepa del desafío. En este caso la autobacterina (G1) no presentó los mejores índices de protección tal y como habíamos demostrado en los dos ensayos anteriores con una cepa diferente. Hubo dos grupos (G2 y G5) que indujeron una protección del 100%. El G2 fue vacunado con una cepa distinta a la del desafío pero que comparte con ella el tipo capsular A y el perfil de virulencia II. El G5 se vacunó así mismo con una cepa distinta a la del desafío pero que presentaba tipo capsular A y perfil de virulencia IV. Lo esperable en este ensayo era que la autobacterina tuviese los mejores índices de protección y que hubiese protección cruzada entre cepas del mismo tipo capsular y/o el mismo perfil de virulencia. La primera hipótesis no se ha cumplido. Sin embargo sí podemos afirmar que los grupos con mayor protección presentaban el mismo tipo capsular (A) que la cepa de desafío. Sin embargo en otros grupos vacunados con bacterinas de cepas de tipo capsular A como son los grupos 3 y 4, no se ha encontrado un índice de protección significativo. En base a estos resultados podemos afirmar que no se produce protección cruzada en base al tipo capsular, aunque sí que se produce protección cruzada entre algunas cepas. Tampoco se ha encontrado relación entre el perfil de virulencia y la protección. P. multocida posee diversos factores de virulencia que han demostrado tener un papel en la patogénesis del proceso que provoca. Sin embargo, la base molecular de esta patogenicidad aún no ha sido establecida (Verma et al., 2013). Los perfiles de virulencia utilizados en este estudio contemplan la presencia o ausencia de los genes hgbB y pfhA, que codifican un factor de adquisición del hierro y una adhesina respectivamente. La cepa de desafío utilizada en este ensayo con perfil de virulencia tipo II, es positiva para el gen hgbB y negativa para el pfhA, para el que son positivas los perfiles I y III. Sin embargo, ninguna las vacunas elaboradas con cepas tipo I (G3 y G7) o tipo III (G4 y G9) han protegido frente al desafío. Sin embargo, el G5 vacunado con una vacuna elaborada con una cepa tipo IV, carente de ambos genes si ha conferido protección significativa, lo que descarta a ambos factores como candidatos a utilizarlos para la inmunización activa. Las bacterinas incluyen la bacteria completa en la vacuna, la cual presenta una gran cantidad de sustancias en su composición capaces de comportarse como antígenos. Se sabe que el componente capsular por sí solo no es antigénico por su naturaleza química (Fenwick, 1995) y hace imposible la producción de anticuerpos (Carter, 1955; 41 Namioka y Murata, 1961) aunque es ampliamente aceptado que la cápsula está relacionada con la resistencia a la fagocitosis, (Harmon et al., 1991). Sí se ha demostrado en términos generales que las bacterias que tiene cápsula son más virulentas que las variantes acapsuladas (Snipes et al., 1987; Tsuji y Matsumoto, 1989: Jacques et al., 1993). Por este motivo deberíamos pensar que hay otros componentes que no han sido caracterizados en las cepas utilizadas para este estudio, que sí podrían actuar como inmunógenos, como por ejemplo el lipopolisacárido, el cual estimula la inmunidad humoral considerándose que los anticuerpos que se producen frente a él son protectores. Las proteínas de exterior de membrana (OMPs) están relacionadas con el potencial patógeno de las bacterias y por lo tanto, también poseen propiedades inmunogénicas (Kennet et al., 1993; Srivastava, 1998a; Borkowska-Opacka y Kedrak, 2002). Los anticuerpos monoclonales producidos contra las OMPs son capaces de proteger pasivamente conejos y ratones contra la infección de P .multocida, observándose una fuerte protección cuando se utilizan cepas homólogas y una protección limitada frente a cepas heterólogas (Lu et al., 1991). Las OMPs reguladas por el hierro son potentes antígenos así como factores de virulencia esenciales durante el proceso de infección (Ratledge et al., 2000). La DL50 previamente calculada para la cepa de desafío 74622AII fue de 40.000 ufc/ratón, aunque la dosis real inoculada en el desafío fue de 89.000 ufc/ratón. A pesar de ello, la mortalidad en el grupo control no fue mayor del 50%. Por el contrario, la mortalidad de la cepa 70336 utilizada en los ensayos 1 y 2 fue del 100% para una dosis de infección de 500 ufc/ratón. Por lo tanto, cabe pensar que la virulencia de la cepa de este ensayo, al menos para los ratones, es significativamente menor que la de la cepa 70336 y por lo tanto es posible que no haya sido buena candidata para el estudio. 48 Boucher S., Nouaille L., 1996. Maladies des lapins. Paris, France: Agricole éditeur. 255 p. Boyce J.D., Adler B., 2000. The capsule is a virulence determinant in the pathogenesis of Pasteurella multocida M1404 (B:2). Infect. Immun. 68:3463-3468. Broome R. L., Brooks D.L., 1991. Efficacy of enrofloxacin in the treatment of respiratory pasteurellosis in rabbits. Lab. Anim. Sci. 41:572-576. Carter G.R., 1995. Studies on Pasteurella multocida. I A hemagglutination test for the identification of serological types. Am. J. Vet. Res. 16:481-484. Carter G.R., Chengappa M.M., 1981. 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