Repositorio Institucional de Documentos

Directores: José Antonio Aínsa Claver Liliana Isabel Dias Rodrigues Pilar Sainz de la Maza Arnal Máster en Biología Molecular y Celular 2013-2014 Estudio de la actividad de bombas de eflujo de Mycobacterium tuberculosis en un modelo de Escherichia coli Índice Introducción ................................................................................................... 1 Historia de la tuberculosis ............................................................................................ 1 Transmisión, Tratamiento y Vacuna ............................................................................. 2 Mycobacterium tuberculosis ......................................................................................... 3 Resistencias bacterianas a fármacos ............................................................................ 4 Bombas de eflujo .......................................................................................................... 5 Resistencia a fármacos y bombas de eflujo en M. tuberculosis ................................... 7 Objetivos y Justificación .................................................................................. 9 Materiales y Métodos ................................................................................... 11 Cepas bacterianas, plásmidos, medios de cultivo y condiciones de crecimiento ...... 11 Técnicas generales de ácidos nucleicos ...................................................................... 14 Extracción de DNA en E. coli ................................................................................... 14 Extracción de RNA en E. coli .................................................................................... 15 Extracción de plásmidos (Mini-preparación) .......................................................... 16 PCR ......................................................................................................................... 17 Purificación de productos obtenidos tras la PCR .................................................... 18 Generación y transformación de células E. coli competentes.................................... 19 Construcción del mutante oxyR por intercambio alélico en E. coli ............................ 19 Ensayos de susceptibilidad ......................................................................................... 23 Ensayos de cinética de eflujo en cepas de E. coli ....................................................... 24 Determinación de la expresión de los genes de las bombas de eflujo de M. tuberculosis en E. coli .................................................................................................. 24 Análisis proteico de las cepas de E. coli con bombas transportadoras micobacterianas .......................................................................................................... 28 Resultados y Discusión .................................................................................. 31 Estudio de las bombas de eflujo micobacterianas en un modelo de E. coli ............... 31 Ensayos de susceptibilidad para las cepas de E .coli complementadas con bombas de eflujo de M. tuberculosis .................................................................................... 31 Ensayos de cinética de eflujo .................................................................................. 37 Ensayos de expresión génica ................................................................................... 38 Generación y caracterización del mutante oxyR en E. coli ......................................... 40 Ensayos de susceptibilidad a la INH ........................................................................ 44 Ensayos de susceptibilidad tras la complementación con los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7 ........................................................................................................ 45 Determinación de la expresión génica de las bombas Tap, P55 y MmpL7 ............. 45 Análisis del extracto proteico de membrana .......................................................... 45 Conclusiones y Perspectivas .......................................................................... 49 Referencias Bibliográficas ............................................................................. 51 Abreviaturas ABC ATP-binding cassette superfamily Ap Ampicilina BCG Bacilo de Calmette y Guérin CCCP Carbonil cianida m-clorofenilhidrazona CIM Concentración inhibitoria mínima CPZ Clorpromazina DO Densidad óptica DTT DL-Ditiotreitol GapA Deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfatasa H Hora INH Isoniazida Km Kanamicina KO Knock-out LB Luria-Bertani MATE Multidrug and toxic compound extrusion MDR-TB Multidrug resistant tuberculosis MFS Major facilitator superfamily Min Minuto MmpL Membrane protein large PBS Suero fisiológico RIF Rifampicina RND Nodulation-cell division superfamily S Segundo SM Estreptomicina SMR Small multidrug resistance family VP Verapamil WT Wild-type XDR-TB Extensively drug resistant tuberculosis Introducción 1 Introducción Historia de la tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por micobacterias, fundamentalmente por Mycobacterium tuberculosis. En función del órgano afectado, proporciona una gran variedad de cuadros clínicos, por lo que actualmente sigue siendo la segunda causa de mortalidad a nivel mundial después del SIDA (WHO, 2013). Es considerada una de las primeras enfermedades humanas de las que se tiene constancia y a lo largo de la historia, ha recibido multitud de nombres: mal del rey, peste blanca o tisis, entre otros. Es admitido el hecho de que el organismo que produce la tuberculosis, evolucionó a partir de otros microorganismos más primitivos dentro del propio género Mycobacterium. A partir de las micobacterias ancestrales fueron derivando las especies actuales, algunas patógenos de humanos (M. tuberculosis) y otras patógenos de animales (M. bovis, M. caprae, etc). En 1882, Robert Koch consiguió aislar el bacilo tuberculoso y demostrar su patogenicidad mediante coloración de derivados de anilina, haciéndolo saber finalmente en la Sociedad de Fisiología de Berlín. En 1921, Albert Calmette y Camille Guérin fueron los artífices de la primera vacuna contra la tuberculosis mediante el uso de BCG, una variante atenuada de M. bovis. En 1944, gracias a los esfuerzos por encontrar un fármaco eficaz contra M. tuberculosis, se descubrió la estreptomicina (SM). A partir de este momento, surgieron nuevos medicamentos antituberculosos: ácido para-amino salicílico (1949), isoniazida (INH, 1952), pirazinamida (1954), etambutol (1962) y rifampicina (1963). Todos estos hallazgos transformaron la tuberculosis en una enfermedad curable, sin embargo, la idea de la que esta enfermedad se encontraba controlada se esfumó con la irrupción de la epidemia del SIDA así como con la aparición de casos de tuberculosis multirresistentes. Introducción 2 Transmisión, Tratamiento y Vacuna La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que alrededor de dos mil millones de personas se encuentran infectadas por tuberculosis, con ocho millones de nuevos casos y dos millones de muertes cada año. Por ello, la OMS declaró en 1993 una situación de emergencia global frente a la tuberculosis y los Objetivos del Milenio se han planteado como objetivo para reducir la incidencia y la mortalidad producidas por la tuberculosis (WHO, 2013). La infección se trasmite por vía aérea mediante la inhalación de bacilos tuberculosos. Se estima que, aproximadamente, un tercio de la población está infectado de forma latente por tuberculosis, esto quiere decir, que está infectado por el bacilo, pero sin embargo, no está enfermo y por lo cual es incapaz de transmitir la infección. No obstante, estas personas poseen un mayor riesgo de enfermar por tuberculosis, probabilidad que se ve incrementada si se tiene un sistema inmunitario dañado, como ocurre en casos de infección por el VIH, desnutrición o diabetes. La tuberculosis es una enfermedad curable, donde la forma activa es sensible a los siguientes antibióticos divididos en dos clases: fármacos de primera línea (isoniazida, pirazinamida, etambutol, rifampicina y estreptomicina) y fármacos de segunda línea (etionamida, cicloserina, ácido p-amino salicílico, kanamicina, capreomicina, amikacina, fluoroquinolonas y linezolid). Los primeros son los de mayor actividad bactericida mientras que los segundos son bacteriostáticos, poseen más contraindicaciones y se utilizan en caso de resistencia a los fármacos de primera línea. El tratamiento contra la tuberculosis requiere de un largo periodo en el cual son administrados numerosos fármacos. Se inicia con la toma durante dos meses de rifampicina, isoniazida, pirazinamida y etambutol o estreptomicina, seguidos de cuatro meses con rifampicina e isoniazida. Durante este proceso es muy importante tanto la información, supervisión como el apoyo por parte de un agente sanitario, con el objetivo de garantizar la finalización del tratamiento, crucial para evitar el desarrollo de resistencias a fármacos. Introducción 3 Existe además, una vacuna contra la tuberculosis: el bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Contiene bacilos tuberculosos de origen bovino (M. bovis) atenuados, sin embargo, no ofrece una protección total ya que no previene ni de la infección primaria en adultos ni de la reactivación de la tuberculosis pulmonar latente. No obstante, protege contra las formas diseminadas de la tuberculosis, por lo que es de uso general en aquellos países donde la tuberculosis es común. Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis pertenece al dominio Bacteria, dentro de la clase Actinobacteria, del orden Actinomycetales, del suborden Corynebacterineae y de la familia Mycobacterium (Stackebrandt et al., 1997); agrupándose finalmente en el complejo de Mycobacterium tuberculosis. Es un bacilo delgado recto o ligeramente curvado con bordes redondeados y cuyo tamaño suele oscilar entre 2-5 µm de longitud y 0,2-0,5 µm de anchura. Se caracteriza por ser un microorganismo aeróbico estricto, inmóvil (no posee flagelos), no formador de esporas, con bastantes gránulos citoplasmáticos y ácido-alcohol resistente. Posee una velocidad de crecimiento muy lenta y actividades catalasa y nitrato reductasa. Filogenéticamente pertenece al grupo de bacterias Gram positivas, sin embargo, el alto carácter hidrofóbico de su pared celular, le hace adquirir una leve coloración en la tinción de Gram. Por este motivo, las micobacterias suelen teñirse mediante la tinción de Ziehl-Neelsen. Posee una envoltura de estructura compleja, formada por cápsula, pared celular y membrana plasmática (Brennan, 1989). La cápsula es la capa más externa y se encuentra constituida por ácidos micólicos, proteasas, lipasas y glicolípidos. Posee la función de proteger y se ha visto que es la encargada de interaccionar con componentes del sistema inmunitario, explicándose de esta manera la gran inmunopatología de la tuberculosis (Daffé and Etienne, 1999). La pared celular se Objetivos y Justificación 10  Ensayos de cinética de eflujo en cepas de E. coli que expresan bombas de eflujo de M. tuberculosis Se utilizarán técnicas de acumulación y eflujo de compuestos fluorescentes como el EtBr, para identificar sustratos potenciales de los transportadores estudiados en E. coli.  Determinación de la expresión de los genes de las bombas de eflujo de M. tuberculosis en E. coli El nivel de expresión de los genes para los transportadores Tap, P55 y MmpL7 se efectuará por PCR a tiempo real. De esta forma, se confirmará la expresión o no de los genes micobacterianos en E. coli.  Análisis de proteínas Se utilizarán técnicas de proteómica para comprobar si las proteínas transportadoras micobacterianas son producidas en E. coli. También se evaluará el proteoma de las cepas de E. coli, para determinar si la producción de proteínas micobacterianas causa alteraciones en su perfil normal proteico. Materiales y Métodos 11 Materiales y Métodos Cepas bacterianas, plásmidos, medios de cultivo y condiciones de crecimiento En este trabajo se han usado las cepas E. coli BW25113 (Tal and Schuldiner, 2009) y E. coli 3AG100 (Jellen-Ritter and Kern, 2001), ambas derivadas de E. coli K-12. Mientras que 3AG100 es una cepa generada a partir de la cepa AG100 con sobreexpresión de la bomba de eflujo AcrAB-TolC como consecuencia de una exposición repetida a una fluoroquinolona (Bohnert et al., 2008), BW25113 es una cepa de referencia utilizada en diversos laboratorios. En las Tablas 1 y 2 se muestra una descripción detallada de las cepas empleadas, así como, de los plásmidos presentes en las mismas (Tabla 3). Derivadas de 3AG100 Descripción Marcador de resistencia Ref. St. 540 Cepa con delección en el gen acrB (ΔacrB) - 1 CVF13 Cepa con el gen acrB reemplazado por el gen mmpL7 (acrB::mmpL7) SM 2 CVF16 ∆acrB con el plásmido pCVF1 Ap 2 CVF17 ∆acrB con el plásmido pCVF2 Ap 2 CVF18 ∆acrB con el plásmido pCVF7 Ap 2 CVF19 Cepa con un gen híbrido de acrB y mmpL7 (acrB615-28::mmpL7 535-48) SM 2 Tabla 1. Cepas derivadas de 3AG100 empleadas en este trabajo. Referencias: 1: Bohnert et al, 2008; 2: Villellas, 2013. Materiales y Métodos 12 Derivadas de BW25113 Descripción Marcador de resistencia Ref. ΔacrB Cepa con delección en el gen acrB (ΔacrB) - 1 ΔemrE Cepa con delección en el gen emrE (ΔemrE) - 1 ΔmdfA Cepa con delección en el gen mdfA (ΔmdfA) Km 1 ΔacrBΔemrE Cepa con delecciones en los genes acrB y emrE (ΔacrB ΔemrE) - 1 ΔemrEΔmdfA Cepa con delecciones en los genes emrE y mdfA (ΔemrE ΔmdfA) Km 1 ΔacrBΔemrEΔmdfA Cepa con delecciones en los genes acrB, emrE y mdfA (ΔacrB ΔemrE ΔmdfA) Km 1 CVF1 Cepa con el plásmido pT7-7 Ap 2 CVF2 Cepa con el plásmido pCVF1 Ap 2 CVF3 ΔemrE ΔmdfA con el plásmido pCVF1 Ap, Km 2 CVF4 ΔacrB ΔemrE ΔmdfA con el plásmido pCVF1 Ap, Km 2 CVF5 ΔmdfA con el plásmido pCVF1 Ap, Km 2 CVF6 ΔmdfA con el plásmido pCVF2 Ap, Km 2 CVF7 ΔemrE con el plásmido pCVF1 Ap 2 CVF8 ΔemrE con el plásmido pCVF2 Ap 2 CVF9 ΔemrE ΔmdfA con el plásmido pCVF2 Ap, Km 2 CVF10 ΔacrB con el plásmido pCVF1 Ap 2 CVF11 ΔacrB con el plásmido pCVF2 Ap 2 CVF12 ΔacrB ΔemrE ΔmdfA con el plásmido pCVF2 Ap, Km 2 CVF14 ΔacrB con el plásmido pET6Ap Ap 2 CVF15 ΔacrB con el plásmido pCVF7 Ap 2 CVF22 ΔemrE con el plásmido pT7-7 Ap 2 Tabla 2. Cepas derivadas de BW25113 empleadas en este trabajo. Referencias: 1: Tal and Schuldiner, 2009; 2: Villellas, 2013. Materiales y Métodos 13 Plásmido Descripción Marcador de resistencia Ref. pT7-7 Vector de expresión bajo el control del promotor T7 en E. coli. Ap 1 pCVF1 Derivado del plásmido pT7-7 con el gen rv1258c (Tap), bajo el control del promotor T7. Ap 2 pCVF2 Derivado del plásmido pT7-7 con el gen rv1410c (P55), bajo el control del promotor T7. Ap 2 pET30aORF6 Vector de expresión bajo el control del promotor T7 en E. coli, tras la inducción con IPTG. Km 3 pET6Ap Derivado de pET30a-ORF6, con KmR inactivado mediante la inserción del fragmento Ω-ApR. Ap 2 pCVF7 Derivado del plásmido pET6Ap con el gen mmpL7 bajo el control del promotor T7, tras la inducción con IPTG. Ap 2 Tabla 3. Descripción de los plásmidos presentes en las cepas de estudio. Referencias: 1: Ninio et al., 2001; 2: Villellas, 2013; 3:Guo et al., 2009. Las cepas se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) en tubos de cristal y/o en placas LB agar a la temperatura de 37˚C en la oscuridad, siendo preciso añadir en determinadas muestras los antibióticos necesarios para un correcto crecimiento, hasta la concentración final que muestra la Tabla 4. El almacenamiento de las cepas se llevó a cabo en congeladores a -80˚C en presencia de glicerol al 15% (w/v). Compuesto Concentración Ampicilina (Ap) 100 µg/ml Kanamicina (Km) 20 µg/ml Estreptomicina (SM) 50 µg/ml Tabla 4. Concentraciones finales de los antibióticos empleados. Materiales y Métodos 14 Técnicas generales de ácidos nucleicos 1. Extracción de DNA en E. coli Reactivos: - Solución de lisis (10 ml): 9,34 ml buffer TE + 600 μl SDS 10% (w/v) + 60 μl Proteinasa K (20 mg/ml) - Cloroformo:Isoamílico (24:1) - EtOH frío (-20˚C) - Buffer TE - RNasa (1 mg/ml) Procedimiento:  Se transfieren 1,4 ml de cultivo, crecido previamente en medio LB, a un eppendorf de 1,5 ml para ser centrifugado durante 3min a máxima velocidad.  Se decanta el sobrenadante y se resuspende el pellet en 600 µl de solución de lisis, gracias a la ayuda del vórtex.  Se incuba durante 1h a 37˚C, se añade un volumen igual de cloroformo:isoamílico y se centrifuga a máxima velocidad durante 5min.  Se transfiere la fase acuosa a un nuevo eppendorf, se completa con un volumen igual de cloroformo y se invierte el tubo. Se centrifuga y se transfiere a un eppendorf nuevo la fase acuosa.  Para precipitar el DNA se añaden 2,5 volúmenes de EtOH frío, se agita y se deja incubar durante 30min o más a la temperatura de -20˚C.  Se centrifuga durante 15min a velocidad máxima, se descarta el sobrenadante y se deja secar al aire libre.  Se resuspende el DNA en buffer TE y se añade 1 μl de RNasa para así conseguir su total digestión dejándolo incubar durante 15min a 37˚C.  Finalmente, se cuantifica el DNA extraído mediante la medida de la absorbancia a 260nm y se almacena a -20ºC. Materiales y Métodos 15 2. Extracción de RNA en E. coli Para la extracción del RNA en las respectivas cepas de E. coli, se hizo uso del kit RNeasy Mini Kit de Qiagen, que contiene columnas RNeasy y los tampones RNA protect, Buffer RLT, Buffer RW1 y Buffer RPE. Reactivos adicionales: - Buffer TE + lisozima: se prepara una alícuota en la que la concentración final de la enzima sea de 3 mg/ml - Buffer RLT + -mercaptoetanol: 10 µl of -mercaptoetanol en 1 ml de RLT Procedimiento:  Se deja crecer E. coli en medio LB hasta alcanzar una DO600 de 0,6. Se transfieren 500 µl a un eppendorf de 1,5 ml junto con 1 ml de RNA protect y se deja incubar a temperatura ambiente durante 5min.  Se centrifuga 10min a 9000rpm y se decanta el sobrenadante. Se resuspende el pellet en 100 µl de buffer TE + lisozima y se deja incubar durante 5min.  Se adicionan 350 µl de buffer RLT + -mercaptoetanol y se agita vigorosamente. Se vierte un volumen igual de etanol y se homogeniza por pipeteo.  Se transfieren 700 µl de lisado a una columna RNeasy y se centrifuga 15s a 10000rpm. Se descarta el sobrenadante, se añaden 700 µl de buffer RW1 a la columna y se centrifuga. Se descarta el sobrenadante, se añaden 500 µl de buffer RPE a la columna y se centrifuga (x2).  Se añaden 500 µl de buffer RPE y se centrifuga 2min a 10000rpm.  Se saca la columna, se introduce en un eppendorf de 2 ml y se centrifuga a máxima velocidad durante 1min.  Se repite el paso anterior, pero añadiendo 30 µl de agua libre de RNasa a la columna y se centrifuga. De esta manera se consigue la elución del RNA al eppendorf.  Finalmente, se cuantifica el RNA extraído mediante la medida de la absorbancia a 260nm y se almacena a -20ºC. Materiales y Métodos 16 3. Extracción de plásmidos (Mini-preparación) Reactivos: - Solución I (50 ml): - 1 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 - 1,25 ml TRIS 1 M pH 8,0 - 5 ml Glucosa 0,5 M - 42,75 ml H2O - Solución II (10 ml): - 7 ml H2O - 1 ml SDS 10% (w/v) - 2 ml NaOH 1 M - Solución III (100 ml): - 60 ml KAc 5 M - 11,5 ml HAc glaciar - 28, 5ml H2O - NaAc 3 M - EtOH absoluto frío (-20˚C) - RNasa (1 µg/ml) - H2O estéril Procedimiento:  Se centrifugan 1,4 ml de cultivo, crecido previamente en medio LB, a 10000rpm durante 3min. Se descanta el sobrenadante, se resuspende el pellet en 100 µl de Solución I y se deja incubar durante 5min.  Se añaden 200 µl de Solución II, se mezcla suavemente invirtiendo el tubo hasta que el contenido tenga un aspecto viscoso y se deja incubar en hielo 5min.  Se añaden 150 µl de Solución III fría y se deja incubar en hielo 5min.  Se centrifuga a 12000rpm durante 10min y se transfiere el sobrenadante a un eppendorf nuevo. Materiales y Métodos 17  Se añaden 0,1 volúmenes de NaAc y 2 volúmenes de EtOH, se invierte el tubo y se incuba 30min a -20˚C. Se centrifuga a 12000rpm durante 5min y se elimina el EtOH.  Se deja secar el precipitado al aire libre, se resuspende el pellet en 50 µl de H2O estéril y se añade 1µl de RNasa para incubarlo a 37˚C durante 15min.  Finalmente, se cuantifica el plásmido extraído mediante la medida de la absorbancia a 260nm y se almacena a -20ºC. 4. PCR La reacción en cadena de la polimerasa o Polimerase Chain Reaction (PCR) consiste en la amplificación de fragmentos de DNA comprendidos entre dos zonas determinadas del genoma cuya secuencia es conocida. Mezcla: - H2O: 16,75 µl - 5x MyTaq buffer (Bioline): 5 µl - Cebador directo (25 µM): 0,5 µl - Cebador inverso (25 µM): 0,5 µl - MyTaq DNA polimerasa (Bioline): 0,25 µl El volumen final por pocillo es de 23 µl, a los cuales han de añadirse 2 µl del DNA que se desee amplificar. Programa PCR: - Fase inicial de desnaturalización: 1min a 95˚C - 35 ciclos compuestos por tres fases: - Desnaturalización: 30s a 95˚C - Annealing: 30s a 56/58˚C (en función de los cebadores usados). - Elongación: 1min a 72˚C - Fase final de elongación: 10min a 72˚C - Almacenamiento: ∞ 4˚C Materiales y Métodos 18 Para verificar las PCR realizadas, se realizan geles de agarosa al 1% con SybrGreen. Como marcador de pesos moleculares se usa el 100pb DNA Ladder, el cual proporciona el siguiente patrón de bandas: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000 y 3000 pb. Finalmente, se enciende el dispositivo a la corriente durante 40min a 120V. 5. Purificación de productos obtenidos tras la PCR Para la purificación de los productos obtenidos tras la PCR, se hizo uso del kit High Pure PCR Product Purification Kit de Roche, que contiene columnas High pure filter tuve y los tampones Binding buffer, Wash buffer y Elution buffer. Procedimiento:  Tras las PCR, se juntan 100 µl en un eppendorf al cual se le añaden 500 µl Binding buffer.  Se transfiere a una columna High pure filter tuve y se centrifuga 1min a velocidad máxima.  Se descarta el contenido de la columna y se añaden 500 µl Wash buffer. Se centrifuga y se descarta el contenido de la columna.  Se añaden 200 µl Wash buffer, se centrifuga y se descarta el contenido de la columna.  Se traspasa la columna a un eppendorf de 1,5ml, se añaden 50 µl de Elution buffer y se centrifuga 1min a velocidad máxima. De esta manera, se consigue que el producto purificado se eluya al eppendorf.  Se cuantifica el producto purificado mediante la medida de la absorbancia a 260nm y se almacena a -20ºC. Materiales y Métodos 19 Generación y transformación de células E. coli competentes Generación de células competentes:  Se deja crecer E. coli en medio LB hasta que alcance una DO600 de 0,6 y se detiene el crecimiento en hielo durante 10min.  Se centrifugan las células 5min a velocidad máxima y se lavan con 1 ml, dos veces con H2O estéril y una vez con glicerol al 10% (w/v).  Se vuelve a centrifugar, se reparte el contenido en alícuotas de 50 µl y se almacenan a -80˚C. Transformación de células competentes:  Se mezclan 150 µl de células competentes con 100 ng del plásmido o con 500 ng del producto purificado en cubetas de 0,2cm (Bio-Rad) preenfriadas a 4˚C y se les da un pulso eléctrico (2,5kV, 25μF, 200Ω) en un GenePulser XcellTM (BioRad). Las células se recogen en 900 µl de LB y se incuban durante 1h a 37˚C.  Se plaquean 100 µl de los controles (cuando proceda) y de las diluciones: 100, 10-1 y 10-2 del experimento de transformación en presencia de los antibióticos necesarios y se mantienen durante toda la noche en la estufa a 37ºC. Construcción del mutante oxyR por intercambio alélico en E. coli Gracias a la metodología del intercambio alélico, es posible reemplazar una secuencia cromosómica por un gen de resistencia a antibióticos, generado por PCR, usando cebadores con extensiones homólogas correspondientes al gen que se desea deleccionar (Datsenko and Warnner, 2000), siendo en este caso el gen oxyR (Figura 3). Materiales y Métodos 26 Una vez finalizada la reacción, se obtiene la curva de melting del producto amplificado y se verifica si se ha obtenido un único producto o si se han formado productos inespecíficos. 2. Obtención de cDNA a partir de RNA Se realiza una genoteca a partir del RNA extraído de las cepas de interés. Para ello, primero se cuantifica el RNA y en función de su concentración se determina el volumen (x) que se utilizará en la reacción para alcanzar una concentración final de 1µg/µl. A continuación, se prepara la siguiente mezcla: - RNA: x µl - Random primers (0,5 µg/ml) (Invitrogen): 5 µl - dNTPs (10 mM): 0,5 µl - H2O RNase-free: Se completa con el volumen necesario de H2O hasta los 11 µl. Es recomendable preparar esta mezcla conjunta, repartir en distintos eppendorf y completar con el RNA correspondiente. A continuación, se introducen en el termociclador durante 5min a 65˚C con el objetivo de romper todo tipo de estructura secundaria. Mientras transcurre este tiempo se procede a preparar la siguiente mezcla: - Reverse Transcriptase Buffer 5x (Invitrogen): 4 µl - DTT (0,1 M) (Sigma): 1 µl - Actinomicina D: 2 µl - RNaseOut Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen): 1 µl - Supercript III Reverse Transcriptase (Invitrogen): 1 µl Es aconsejable preparar esta mezcla conjunta y luego repartir 9 µl en cada eppendorf, los cuales ya poseen los 11 µl previos. Materiales y Métodos 27 A continuación, se introducen los eppendorf en el termociclador con el siguiente programa:  5min a 25˚C  2h a 50˚C  15min a 70˚C  4˚C ∞ Una vez terminado el programa se recomienda congelar los cDNAs y diluirlos 1:20 antes de volver a emplearlos. 3. RT-qPCR Mezcla: - H2O: 3,5 µl - FastStart Sybr Green Master Mix (Roche): 5 µl - Cebador directo (25 µM): 0,5 µl - Cebador inverso (25 µM): 0,5 µl Es recomendable preparar la mezcla conjunta para todos los pocillos en un eppendorf de 200 µl, teniendo además en cuenta que es aconsejable hacer triplicados. A continuación, se reparten 29 µl de esta mezcla junto con 1,5 µl del cDNA correspondiente. Se le da un pulso con el vórtex y se dividen 10 µl en cada pocillo de la placa. Se tapa con un adhesivo, se le da otro pulso ahora con la centrífuga y se introduce en el termociclador con el siguiente programa:  10min a 95˚C  40 ciclos compuestos por dos fases:  3s a 95˚C  30s a 60˚C Materiales y Métodos 28 Análisis proteico de las cepas de E. coli con bombas transportadoras micobacterianas Para comprobar si las proteínas transportadoras micobacterianas son producidas e incorporadas en la membrana plasmática de E. coli, se emplearon técnicas basadas en la proteómica. Para ello se procedió a la visualización del perfil proteico en geles SDSPAGE. 1. Análisis del contenido proteico total en E. coli Tratamiento de la muestra: Se transfiere 1 ml de cultivo, crecido previamente en medio LB, a un eppendorf de 1,5 ml para ser centrifugado durante 3min a máxima velocidad. Se lava el pellet con 1 ml de PBS y se centrifuga en las mismas condiciones. Se resuspende la muestra en 20 µl de tampón de carga y se hierve a 100˚C durante 10min en un termobloque. Reactivos: - Gel separador (12%): - 3,2 ml H2O - 4 ml Acrilamida/bis-acrilamida (30%/0.8% w/v) - 2,6 ml Tris-HCl 1,5 M pH:8,8 - 100 µl SDS 10% (w/v) - 10 µl TEMED - 100 µl Persulfato amónico (AP) 10% (w/v) - Gel concentrador: - 2,975 ml H2O - 670 µl Acrilamida/bis-acrilamida (30%/0.8% w/v) - 1,25 ml Tris-HCl 0,5 M pH:6,8 - 50 µl SDS 10% (w/v) - 5 µl TEMED - 50 µl Persulfato amónico 10% (w/v) Materiales y Métodos 29 - Tampón de carga: - 743 µl Tris 0,5 M pH:6,8 - 0,0025% Azul de bromofenol - 2,3 ml Glicerol 87% (w/v) - 375 µl -Mercatoetanol - Tampón de electroforesis (1 L): - Tris-HCl 25 mM - Glicina 200 mM - SDS 0,1% (w/v) - Solución de fijación: - 50 ml MeOH - 10 ml HAc - 40 ml H2O - Solución de teñido: - 45 ml MeOH - 10 ml HAc - 45 ml H2O - 0.025% Azul de coomasie - Solución de desteñido: - 90 ml MeOH - 20 ml HAc - 90 ml H2O Procedimiento:  Con ayuda de una pipeta se va vertiendo el gel separador en el molde de los geles, completando las 2/3 partes. Se rellena con isopropanol para igualar el frente y se deja solidificar durante 30min. Transcurrido el tiempo se vierte el gel concentrador y se introduce el peine de los pocillos.  Una vez polimerizado, se retiran los peines, se introduce en la cubeta de electroforesis y el tampón de electroforesis se vierte en los reservorios exteriores e interiores del dispositivo. Posteriormente, se cargan las muestras junto con el marcador de pesos moleculares PageRuler Plus Prestained Protein Materiales y Métodos 30 Ladder, el cual proporciona el siguiente patrón de bandas: 10, 15, 25, 35, 55, 70, 100, 130 y 250pb. Finalmente, se enciende el dispositivo a la corriente durante 40min a 120V.  Se saca el gel del dispositivo y se pone en contacto durante 30min con la solución de fijación, se tiñe el gel durante 1h con la solución de tinción y se deja durante toda la noche destiñendo. 2. Análisis de la fracción de proteínas de membrana de E. coli Tratamiento de la muestra:  Se transfiere 1 ml de cultivo, crecido previamente en medio LB, a un eppendorf de 1,5 ml para ser centrifugado a 4˚C durante 5min a 14000rpm. Se lava el pellet con 500 µl de PBS y se centrifuga en las mismas condiciones.  Se resuspende la muestra en 500 µl de Tris pH 7,5 + NaCl 50 mM y se somete a descargas de ultrasonidos a 4˚C con 3 pulsos de 30-45s con ciclos de 30s de intervalo.  Se centrifuga durante 5min a 4000rpm para eliminar las células no rotas.  Se recoge el sobrenadante y se ultracentrifuga 1h a 100000xg y a 4˚C. El sobrenadante son las proteínas citosólicas mientras que el pellet, las de membrana. Este se resuspende en 100 µl de PBS + 30 µl de tampón de carga y se hierve a 100˚C durante 10min en un termobloque.  Se centrifuga a 14000rpm durante 1min y se carga en el gel preparado previamente. Resultados y Discusión 31 Resultados y Discusión Estudio de las bombas de eflujo micobacterianas en un modelo de E. coli 1. Ensayos de susceptibilidad para las cepas de E .coli complementadas con bombas de eflujo de M. tuberculosis Uno de los principales objetivos era averiguar si las bombas Tap, P55 y MmpL7 pertenecientes a M. tuberculosis e implicadas en la resistencia intrínseca a varios compuestos (Aínsa et al., 2008; De Rossi et al., 2006), eran capaces de expresarse en E. coli y complementar la ausencia de las propias bombas de eflujo presentes en este microorganismo. Para llevar a cabo dicho propósito, se compararon los niveles de resistencia a varios fármacos empleando las cepas E. coli deleccionadas en sus bombas con las complementadas con bombas de M. tuberculosis gracias a la introducción de los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7. Los fármacos empleados en este estudio fueron las siguientes: INH, la cual tiene un papel muy importante en la terapia contra la tuberculosis; doxorrubicina, descrita por ser sustrato de bombas de eflujo RND tales como AcrB y MmpL7 (Eicher et al., 2012); EtBr, sustrato común de diversas bombas de eflujo (Rodrigues et al., 2011); vancomicina, un antibiótico al que la bomba de eflujo P55 de M. tuberculosis confiere resistencia intrínseca (Villellas, 2013) y tres inhibidores indirectos de las bombas de eflujo clorpromazina (CPZ), carbonil cianida m-clorofenilhidrazona (CCCP) y verapamil (VP), los cuales actúan preferentemente sobre la fuerza protón-motriz o a nivel de los canales de calcio (Ramón-García et al., 2006). En la Tabla 6, en las cepas derivadas de la estirpe 3AG100, se puede observar como al realizar estos ensayos con determinados fármacos tales como la INH, VP, vancomicina, CPZ y CCCP, no se encontraron diferencias apreciables respecto a las CIM. Una diferencia de CIM se toma como significativa, cuando ésta represente al menos un cambio de 4 veces respecto a la cepa control. Resultados y Discusión 32 No obstante, en el caso de la doxorrubicina y del EtBr se obtuvieron resultados coherentes con lo que se ha descrito en otros artículos, debido a que ambos compuestos son sustratos de la bomba AcrB. De esta manera, al suministrar doxorrubicina y deleccionar la bomba AcrB en la cepa 3AG100, se observó una bajada bastante considerable de la CIM, la cual no se consiguió recuperar ni tras la incorporación de los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7 ni tras el reemplazamiento cromosómico del gen acrB por el gen híbrido de acrB y el que codifica la proteína transportadora MmpL7. En el caso del reemplazamiento cromosómico total del gen de la bomba AcrB por el gen completo de la proteína transportadora MmpL7, se obtuvo una CIM mayor que no alcanza nuestro criterio para ser considerada significativa, pero que sin embargo, podría estar sugiriendo una cierta expresión de la bomba micobacteriana MmpL7 en E. coli. En el caso del EtBr, al deleccionar la bomba AcrB en la cepa 3AG100, ocurre algo similar a lo descrito anteriormente. Se contempló una disminución bastante significativa de la CIM, sin embargo, en este caso, al complementar la cepa con los plásmidos pCVF1, pCVF2 o al reemplazar la bomba AcrB por la proteína transportadora MmpL7, de manera total o parcial, se percibió un aumento de la CIM que tampoco resulta significativo. En el caso de la complementación de la cepa con pCVF7, se observó un ligero aumento en la CIM, lo cual podría estar sugiriendo una expresión de la bomba micobacteriana MmpL7 en E. coli. En la Tabla 7, con las cepas de E. coli derivadas de BW25113, se puede apreciar como al realizar los ensayos de susceptibilidad con determinados fármacos tales como la INH, VP, vancomicina y CCCP, no se hallaron diferencias apreciables respecto a las CIM. Además, cuando la cepa BW25113 se complementó con los plásmidos pT7-7 y pCVF1, no se observaron diferencias relevantes respecto de la cepa wild-type, sugiriendo que estas construcciones no interfieren sobre el metabolismo de la cepa. Sin embargo, en el caso de la doxorrubicina y del EtBr se obtuvieron resultados coherentes con lo que se ha descrito en otros artículos, debido a que ambos compuestos son sustratos de la bomba AcrB. Resultados y Discusión 33 Al proporcionar doxorrubicina y deleccionar la bomba AcrB en la cepa BW25113, se advirtió una caída bastante significativa de la CIM y mucho más notoria en el caso del doble knock-out AcrB EmrE y del triple knock-out AcrB MdfA EmrE. Esta disminución no se logró recuperar en ninguno de los tres casos, sino que además en la cepa BW25113 ΔacrB al complementar la cepa con los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7, se observó una bajada leve de la CIM que resulta inexplicable; en cualquier caso, este descenso no se puede considerar significativo. Por el contrario, cuando se deleccionaron individualmente las bombas MdfA y EmrE, no se encontraron diferencias relevantes respecto a las CIM del wild-type, lo sugiere que la doxorrubicina no es sustrato de estas bombas. En el caso del inhibidor CPZ, al deleccionar la bomba AcrB en la cepa BW25113, se observó una bajada significativa de la CIM, la cual también se hizo evidente en el doble knock-out AcrB EmrE y el triple knock-out AcrB MdfA EmrE. Esto lo que podría estar sugiriendo es que la CPZ es sustrato de la bomba AcrB. Esta disminución de la CIM no se recuperó tras la complementación de las cepas con los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7. Por el contrario, cuando se deleccionaron individualmente las bombas MdfA y EmrE, no se encontraron diferencias significativas respecto a las CIM del wild-type, lo cual está insinuando que la CPZ no es sustrato de estas bombas. Al suministrar EtBr y deleccionar la bomba AcrB en la cepa BW25113, se apreció una bajada bastante relevante de la CIM, así como en el caso del doble knock-out AcrB EmrE y del triple knock-out AcrB MdfA EmrE, siendo en esta última mucho más visible. Sin embargo, esta disminución no se consiguió recuperar, tras la transformación de la cepa con los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7. Por el contrario, cuando se deleccionaron individualmente las bombas MdfA y EmrE, no se encontraron diferencias significativas respecto a las CIM del wild-type, lo cual está sugiriendo que la EtBr no es sustrato de estas bombas. A pesar de ello, cuando se adicionó EtBr al doble knock-out MdfA EmrE, se percibió una disminución de la CIM respecto del wild-type, lo cual podría indicar que la eliminación de estas bombas, aunque no estén involucradas en el transporte de este sustrato, podrían afectar a la viabilidad de la cepa. Resultados y Discusión 34 En definitiva, el hecho de que las bombas Tap, P55 y MmpL7 micobacterianas no complementen el fenotipo de las cepas de E. coli deleccionadas en el gen acrB, puede ser debido a que estas proteínas no se estén expresando o en caso de que lo estén haciendo se produzcan de una manera no funcional. Hay que tener en cuenta que la membrana bacteriana de M. tuberculosis es distinta en composición a la de E. coli y esto podría afectar al anclaje de las proteínas de M. tuberculosis en la membrana de E. coli, y/o a su actividad o a la interacción con otras proteínas. Resultados y Discusión 35 CIM (µg/ml) Compuestos Cepas INH Doxorrubicina Verapamil Vancomicina CPZ CCCP EtBr 3AG100 >200 50 >500 >100 25 12,5 70 ΔacrB >200 3,1 >500 >100 25 6,25 4,1 ΔacrB pCVF1 [CVF16] >200 3,1 250 >100 25 25 8,7 ΔacrB pCVF2 [CVF17] >200 3,1 250 >100 25 25 8,7 ΔacrB pCVF7 [CVF18] >200 3,1 500 >100 25 6,25 17,5 acrB::mmpL7 [CVF13] >200 1,56 >500 >100 25 6,25 8,7 acrB615-28mmpL7 [CVF19] >200 6,25 250 >100 25 25 8,7 Tabla 6. CIM de distintos compuestos para 3AG100 y derivados. Resultados y Discusión 42 A continuación, se intentó eliminar los productos inespecíficos de la reacción de amplificación con los cebadores OxyR1 y OxyR2, variando las condiciones experimentales de temperatura y de concentración de los cebadores (Figura 16). Figura 16. Electroforesis tras la modificación de las condiciones experimentales de temperatura de annealing y concentración de cebadores. Se puede concluir que las condiciones idóneas para amplificar el fragmento oxyR-P1Km-P2-oxyR con los cebadores OxyR1 y OxyR2 son las siguientes: una concentración final de plásmido pKD4 de 3,68ng/µl, una concentración de 25 µM para los cebadores y una temperatura de annealing de 63˚C. A continuación, se procedió a la purificación del fragmento amplificado oxyR-P1-KmP2-oxyR, para introducirlo en las células competentes de BW25113/pKD46. Para la transformación, se siguió el protocolo de electroporación previamente descrito, incluyendo además un control positivo y un control negativo. El primero se realizó añadiendo a los 150 µl de células competentes 1 µl del plásmido pKD4 mientras que al control negativo no se le adicionó nada. Tras plaquear y dejar incubar durante toda la noche, se obtuvieron colonias en la placa correspondiente a la transformación de las células competentes BW25113/pDK46 con el producto oxyR-P1-Km-P2-oxyR. En la electroporación de las células competentes BW25113/pDK46 con el plásmido pKD4 (control positivo) también se obtuvieron colonias. En los dos casos, se podían observar dos tipos de colonias distinguibles por el tamaño. En el control negativo también se obtuvieron colonias, y en este caso, todas eran de pequeño tamaño. 1 2 3 4 5 Carril: 1Marcador 100pb 225 µM y 58˚C 325 µM y 63˚C 45 µM y 58˚C 55 µM y 63˚C pKD4 1:20 y Cebadores OxyR1 y OxyR2 1,6Kb Resultados y Discusión 43 En este momento, se asumió que las colonias grandes eran producto de la transformación, ya que se obtuvieron tanto en la placa correspondiente a la transformación como en el control positivo, mientras que en el control negativo no aparecieron colonias con esta morfología. A partir de las colonias grandes, se realizaron nuevos cultivos y se procedió a la verificación del intercambio alélico mediante PCR. Para ello, se realizaron dos PCR, unas con los cebadores OxyR_Fw vs OxyR_Rv y la otra con OxyR_Rv vs Tn 5D. Tal y como muestra la Figura 17, en todas las colonias se había producido el intercambio alélico, ya que se obtuvieron las bandas esperadas de 1,7Kb y 410pb, respectivamente. En conclusión, se ha obtenido el mutante con la delección en oxyR. Figura 17. Electroforesis para comprobar la transformación tras la realización de las PCR con los cebadores OxyR_Fw vs OxyR_Rv y OxyR_Rv vs Tn 5D. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Carril: 1Marcador 7Colonia 5 2Colonia 1 8Colonia 6 3Colonia 2 9Colonia 7 4Colonia 3 10Colonia 8 5Colonia 4 11Blanco 6Marcador 1,7Kb 1,7Kb 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 410pb 410pb Carril: 1Marcador 7Colonia 5 2Colonia 1 8Colonia 6 3Colonia 2 9Colonia 7 4Colonia 3 10Colonia 8 5Colonia 4 11Blanco 6Marcador Resultados y Discusión 44 1. Ensayos de susceptibilidad a la INH Tras construir el mutante knock-out en el gen oxyR, se realizaron ensayos de susceptibilidad a la INH para verificar la sensibilidad a este compuesto. Estos se efectuaron por macrodilución, ya que fue imposible hacerlo crecer en un volumen más pequeño, seguramente debido al desencadenamiento de una respuesta frente al estrés como consecuencia de la escasez de oxígeno y nutrientes. En las Figuras 18 y 19 se puede observar que el mutante oxyR en E. coli BW25113 es sensible a la INH, tal y como se esperaba. Mientras que para la cepa wild-type la CIM para la INH es >200 µg/ml, para el KO es de 50 µg/ml. Figura 18. CIM para E. coli BW25113 respecto a la INH. Figura 19. CIM para E. coli BW25113 KO en oxyR respecto a la INH. 1 5 4 3 2 5 4 3 2 1 Falcon: 1-BW25113: 200 µg/ml INH 2BW25113: 100 µg/ml INH 3BW25113: 50 µg/ml INH 4BW25113: 25 µg/ml INH 5Control de crecimiento (sin INH) Falcon: 1BW25113 KO oxyR: 200 µg/ml INH 2BW25113 KO oxyR: 100 µg/ml INH 3BW25113 KO oxyR: 50 µg/ml INH 4BW25113 KO oxyR: 25 µg/ml INH 5Control de crecimiento (sin INH) Resultados y Discusión 45 2. Ensayos de susceptibilidad tras la complementación con los plásmidos pCVF1, pCVF2 y pCVF7 Tras comprobar que el mutante era más sensible a la INH que la cepa original BW25113, se llevó a cabo la complementación del mismo con los plásmidos pCVF1 (Tap), pCVF2 (P55) y pCVF7 (MmpL7). Lo que se pretende es verificar si la introducción de estos plásmidos altera la sensibilidad a la INH, ya que es conocido que la bomba MmpL7 es responsable del eflujo de este fármaco en M. smegmatis (Pasca et al., 2005). Antes de llevar a cabo los ensayos de susceptibilidad se comprobó mediante electroforesis que las cepas habían sido transformadas con éxito (resultados no mostrados). Los resultados obtenidos en los ensayos de susceptibilidad a INH tras la complementación del mutante oxyR con las proteínas micobacterianas no rindieron diferencias significativas respecto al KO, poniéndose así de manifiesto que estas bombas pertenecientes a M. tuberculosis no contribuyen al transporte de INH en E. coli, ni siquiera en el caso de la complementación con la bomba MmpL7. 3. Determinación de la expresión génica de las bombas Tap, P55 y MmpL7 Tal y como se hizo en los experimentos anteriores con las cepas derivadas de 3AG100 y BW25113, se trató de detectar la expresión de los genes que codifican las bombas de eflujo Tap, P55 y MmpL7 en el mutante de E. coli con la delección en oxyR. Se observó la expresión génica de las bombas Tap y P55, sin embargo, no se detectó la expresión de MmpL7 (resultados equivalentes a los mostrados en las Figuras 11, 12 y 13). 4. Análisis del extracto proteico de membrana Finalmente, tras comprobarse que las bombas micobacterianas Tap y P55 sí que se estaban transcribiendo dentro de E. coli, se quiso comprobar si finalmente se estaban sintetizando dentro de su pared bacteriana. Resultados y Discusión 46 Para ello, se extrajeron las proteínas totales de E. coli y se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. Sin embargo, en estas condiciones, no se observó ninguna diferencia significativa en los perfiles proteicos de la cepa wild-type (BW25113) respecto a sus derivados el mutante oxyR y las cepas que llevaban los plásmidos que expresan las proteínas Tap y P55 (resultados no mostrados). A continuación, se procedió a extraer solo las proteínas de membrana de estas mismas cepas, asumiendo que al eliminar las proteínas citosólicas sería más probable observar alguna diferencia en el perfil de proteínas de membrana. En estas condiciones, en las cepas complementadas con los plásmidos pCVF1 (Tap) y pCVF2 (P55), cabía esperar la presencia de una nueva proteína correspondiente a la expresión de dichas proteínas micobacterianas. Mientras que Tap posee un peso molecular de 43KDa, el de P55 es de 55KDa. Como muestra la Figura 20, los perfiles proteicos de expresión siguen siendo muy similares, pero ahora se observa una banda más intensa en la cepa complementada con el plásmido que expresa la bomba Tap, que según el tamaño estimado para esta banda, pudiera corresponder con la expresión de esta proteína. Figura 20. Electroforesis del extracto proteico de membrana. El recuadro mostrado en el carril 4, representa la banda que se recortó y se mandó a secuenciar. A continuación, se recortó la banda que se muestra en el gel y se mandó a secuenciar a al Servicio Científico-Técnico de Proteómica del IACS. Los resultados obtenidos tras la Carril: 1Marcador 2BW25113 3BW25113 KO oxyR 4BW25113 KO oxyR + tap 5BW25113 KO oxyR + p55 1 2 3 4 5 35KDa 55KDa Resultados y Discusión 47 identificación gracias al MALDI TOF, mostraron la presencia de cinco proteínas todas ellas pertenecientes a E. coli y con un peso molecular similar al de la proteína Tap. Sin embargo, la proteína Tap no fue identificada por esta técnica en esta muestra, lo cual no permite comprobar que esté presente en la muestra. Conclusiones y Perspectivas 49 Conclusiones y Perspectivas  Al complementar las cepas de E. coli (derivadas de BW25113 o de 3AG100) deleccionadas en la bomba AcrB con las proteínas micobacterianas Tap y P55, no se alteran los niveles de resistencia a los sustratos de AcrB doxorrubicina y EtBr.  Las bombas micobacterianas Tap y P55 no suplen las deficiencias causadas por la delección de los transportadores MdfA y EmrE en E. coli BW25113.  El inhibidor CPZ es un sustrato de la bomba AcrB en E. coli BW25113.  La expresión de las proteínas micobacterianas Tap y P55 en la cepa de E. coli deleccionada en la bomba AcrB, no altera los niveles de acumulación de EtBr.  Los genes que codifican las proteínas transportadoras Tap y P55 clonados, respectivamente, en los plásmidos pCVF1 y pCVF2 se expresan en E. coli.  El mutante de E. coli deleccionado en el gen oxyR muestra mayor sensibilidad a la INH que la cepa original. Sin embargo, las bombas micobacterianas Tap y P55 no son capaces de alterar esta sensibilidad.  No se ha podido verificar la producción de la proteína Tap en E. coli mediante análisis del extracto proteico de membrana.  El gen que codifica la bomba MmpL7 de M. tuberculosis no se expresa a partir del plásmido pCVF7.  La sustitución en el cromosoma de E. coli 3AG100 del gen acrB por el gen híbrido de acrB y mmpL7 o por el gen mmpL7 completo, produce un fenotipo similar a la delección del gen acrB. En definitiva, las distintas aproximaciones utilizadas en este trabajo (sobreexpresión de genes en plásmidos, complementación de cepas deficientes en transportadores, sustitución de genes cromosómicos, utilización de distintos fondos genéticos) no han Conclusiones y Perspectivas 50 permitido por el momento desarrollar un modelo rápido para estudiar la función y/o los sustratos de las bombas de eflujo de micobacterias. Por ello, se requieren más estudios e investigaciones en las que se optimice la síntesis de las proteínas micobacterianas en E. coli, se asegure su funcionalidad y el correcto anclaje en la membrana, entre otros factores. En la actualidad existen pocas publicaciones destinadas a sintetizar proteínas micobacterianas en otro microorganismo que no pertenezca al género Mycobacterium, por lo que este trabajo abre nuevos horizontes mostrando una primera aproximación a ello. Referencias Bibliográficas 51 Referencias Bibliográficas 1. Aínsa, J.A., Blockpoel, C.J., Otal, I., Young, D.B., De Smet, K.A.L., and Martín, C. 1998. Molecular cloning and characterization of Tap, a putative multidrug efflux pump present in Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium tuberculosis. Journal of Bacteriology 180(22): 5836–5843. 2. Barry, C.E. 3rd., Lee, R.E., Mdluli, K., Sampson, A.E., Schroeder, B.G., Slayden, R.A., and Yuan, Y. 1998. Mycolic acids: structure, biosynthesis and physiological functions. 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