Repositorio Institucional de Documentos

  EstanciaErasmusenlaUniversidadCatólicadeLovaina. EstudiossobrelashidrofobinasdeclaseII  Autor/es BlancaSantaCeciliaMotilva  Director/es DirectoresUniversidadCatólicadeLovaina:Prof.GuyDerdelinckxy Prof.ChristianMichiels TutoraUniversidadZaragoza:PilarMañasPérez  FacultaddeVeterinaria 2014      Datos del estudiante Apellidos: Santa Cecilia Motilva Nombre: Blanca DNI: 78756809 W Dirección: Avenida de Navarra nº40 1ºA C.P: 50500 Localidad: Tarazona Provincia: Zaragoza Teléfono: 625990429 e-mail: [email protected]   Lista de abreviaturas ∆D Cambios de disipación ∆f Cambios de frecuencia ACN Acetonitrilo BCCM/MUCL Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms CMC Concentración Micelar Crítica FHB Fusarium Head Blight F.avenaceum Fusarium avenaceum F.culmorum Fusarium culmorum FpHyd5 Fusarium poae hydrophobin F.poae Fusarium poae HCl Ácido clorhídrico KCl Cloruro de potasio KDa KiloDaltons M Molar MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight MEB Caldo de extracto de malta MUCL Micoteca Katholic University of Leuven PDA Agar de Patata Dextrosa PDB Caldo de Patata Dextrosa QCM Microbalanza de cristal de cuarzo RPC Cromatografía de fase reversa RP-FPLC Cromatografía líquida rápida de fase reversa rpm revoluciones por minuto SDS Dodecil sulfato sódico T. reesei Trichoderma reesei TFA Ácido trifluoroacético TMM Medio mínimo de Trichoderma Tris Tris(hidroximethil)aminometano WCA Ángulo de contacto del agua   Indice Resumen 1 Abstract 2 Introducción y revisión bibliográfica 3 Justificación y objetivos 17 Materiales y métodos 18 Resultados y discusión 24 Conclusiones 32 Conclusions 33 Identificación de las aportaciones de la asignatura a nivel de aprendizaje 34 Evaluación asignatura y sugerencias de mejora 34 Bibliografía 35  1  Resumen Las hidrofobinas son proteínas de superficie activa producidas por los hongos filamentosos, necesarias para el crecimiento aéreo y la dispersión de esporas de dichos microorganismos. Su característica más importante es su comportamiento anfifílico debido a su estructura en parte hidrofóbica y en parte hidrofílica. Ello les permite interactuar con interfases disminuyendo la tensión superficial y cambiando el comportamiento de las superficies, de hidrófobas a hidrófilas y viceversa. Asimismo, estas proteínas son capaces de formar dímeros, tetrámeros y formas multiméricas. Las hidrofobinas presentan multitud de características interesantes que les permiten tener gran cantidad de posibles aplicaciones. No obstante, estas moléculas pueden interactuar con el CO2 gaseoso de las bebidas carbonatadas y producir gushing. El objetivo de este trabajo es analizar las mejores condiciones para producir hidrofobina de clase II a partir del micelio de Fusarium poae (FpHyd5) y caracterizarla. Los resultados mostraron que la mejor producción de FpHyd5 se llevó a cabo en Richard´s minimal medium con glucosa y el mejor método de extracción fue el que se realizó utilizando tampón 170 mM Tris/HCl. En cuanto a la caracterización de FpHyd5, los datos indican que esta hidrofobina presentó mayor afinidad por las superficies hidrófobas que por las hidrófilas. El área superficial hidrofóbica dentro de su parche hidrofóbico tiene poca accesibilidad para interactuar con superficies sólidas y, por tanto, no forma interacciones hidrofóbicas fuertes. Mediante la medida de los cambios del ángulo de contacto con el agua, se observó que esta hidrofobina es capaz de cambiar el comportamiento de una superficie hidrofílica a hidrofóbica y viceversa. En el análisis microscópico se puso de manifiesto que FpHyd5 formaba cristales con estructuras poco ordenadas en forma de ramas. Además, FpHyd5 formaba polímeros debido a que las hidrofobinas presentan una gran tendencia a autoensamblarse por su carácter anfifílico. Cuando su concentración disminuía, aparecían las formas monoméricas. La adición de FpHyd5 al agua carbonatada mostró la formación de partículas de 100nm que correspondían con la formación de nanoburbujas. Por lo tanto, se puede concluir que se produce la interacción entre FpHyd5 y el CO2. 2  Abstract Hydrophobins are surface active proteins produced by filamentous fungi necessary for aerial growth and spores dispersion. Their most important characteristic is their amphiphilic behaviour due to their structure hydrophobic on the one side and hydrophilic on the other side. This fact allows them to interact with interfaces and drop the surface tension, migrate to hydrophobic-hydrophilic interfaces changing the behaviour of a surface from hydrophobic to hydrophilic and vice versa. Hydrophobins also form dimers, tetramers and multimer forms. Those proteins present a lot of characteristics that permit them to have many possible applications. Despite all the positive properties of hydrophobins, these molecules can interact with gaseous CO2 and cause gushing. The objective of this dissertation is to analyze the best conditions to produce class II hydrophobin from mycelium of Fusarium poae (FpHyd5) and characterize it. Results show that the best production of FpHyd5 was realized in Richard´s minimal medium with glucose and the best method of extraction with 170mM Tris/HCl buffer. In the case of characterization of FpHyd5, the data indicate that this hydrophobin has more affinity for hydrophobic surfaces than hydrophilic surfaces. The hydrophobic surface area of its hydrophobic patch is not uniform so this hydrophobic surface could be little accessible and prevent strong hydrophobic interactions. By measuring changes of WCA, it was obvious that this hydrophobin is able to change the behavior of hydrophilic surface to hydrophobic and vice versa. Microscopic analysis show that FpHyd5 can form crystals with branched structures. FpHyd5 forms polymers in agreement with hydrophobins tends to self-assemble by their amphiphilic character. When the concentration decreases, monomeric forms appear. When FpHyd5 was adding to carbonated water particles of 100nm appears corresponding to the formation of nanobubbles. Therefore, can be conclude that the interaction between FpHyd5 and CO2 is produced. 3  1. Introducción y revisión bibliográfica 1.1 Hidrofobinas Las hidrofobinas son proteínas de superficie activa producidas por hongos filamentosos que resultan necesarias para el crecimiento aéreo y la dispersión de esporas de dichos microorganismos, permitiendo la adhesión del hongo a superficies sólidas (Wösten, 2001). Las hidrofobinas son proteínas extracelulares, con forma globular y que tienen un peso molecular entre 7 y 15 KDa y un diámetro entre 2 y 3 nm. Las hidrofobinas son producidas por Ascomicetos y Basidiomicetos (Linder et al., 2005). La característica más importante de las hidrofobinas es que son capaces de autoensamblarse formando membranas anfipáticas, lo que les permite interactuar con interfases y disminuir la tensión superficial (Linder et al., 2005). El mecanismo de acción para la formación de estructuras fúngicas aéreas fue propuesto por Wösten (2001). (Figura 1) Figura 1. Mecanismo de formación de estructuras fúngicas aéreas (Wösten ,2001) 4  Después de que el micelio se forme sumergido en un medio líquido como medio de crecimiento, el hongo secreta las hidrofobinas al medio en forma de monómeros (Fig.1A). En la figura 1-B se observa el auto ensamblaje de los monómeros en la interfase líquido-aire formando una membrana anfipática, lo cual hace que la tensión superficial disminuya. La Figura 1-C muestra la germinación de una nueva hifa. La capa de hidrofobinas cubre completamente la superficie de la hifa. El lado hidrofílico de la película de hidrofobinas contacta con la pared celular que es hidrofílica, mientras la parte hidrófoba de la capa de hidrofobinas se expone al aire, lo cual permite a la hifa crecer fuera del líquido sin contacto con el aire (Figura 1-D1). Alternativamente, puede suceder que la hifa rompa la membrana de hidrofobinas y la pared celular contacte con el aire (Figura 1-D2) para formar después una nueva monocapa de hidrofobinas que cubra la superficie de la hifa (Figura 1-E). Todas las hidrofobinas comparten la misma estructura primaria que se muestra en la Figura 2. A lo largo de su secuencia de aminoácidos hay ocho residuos de cisteínas unidos por puentes disulfuro (líneas amarillas de la Figura 2). Las cisteínas 2, 3 y 6, 7 aparecen siempre juntas una al lado de la otra en la secuencia de aminoácidos (Linder et al., 2005). El enlace entre la cisteína 1 y 6 y entre la 7 y 8 forma una primera y segunda horquilla β en forma de bucle, mientras que las cisteínas 4 y 5 forman una estructura de α-hélice (Kallio et al., 2007; Kisko, 2008; Linder et al., 2005). Figura 2. Estructura primaria de la hidrofobina de clase II (HFBII) producida por T.reseei (Linder et al., 2005). 1.2 Clases de hidrofobinas Las hidrofobinas se dividen en dos clases en base a su secuencia de aminoácidos y a la solubilidad de los agregados que forman (Linder et al., 2005; Sarlin et al.,2005). Las hidrofobinas de clase I son producidas por ascomicetos y basidiomicetos y presentan una secuencia de aminoácidos más larga (100-125 aminoácidos) que las de clase II (50-10 aminoácidos). Además, la clase I presenta una mayor cantidad de 5  aminoácidos hidrofóbicos y por ello, esta clase de hidrofobinas es más hidrofóbica que la clase II (Hektor and Scholtmeijer, 2005). La estructura de la clase I de hidrofobinas no contiene α-hélice, en su lugar, presenta un gran bucle desordenado y mayor cantidad de láminas β en su parche hidrofóbico que la clase II, lo cual las hace más estables (Figura 4-a)(Kwan et.al, 2006) (Hektor and Scholtmeijer, 2005). La presencia de este bucle desordenado da a las hidrofobinas de clase I la capacidad de formar barritas cilíndricas de dimensiones entre 100-250 nm. Estas estructuras se unen entre sí formando películas muy estables y robustas (Figura 3-a), cambiando la configuración α de su estructura nativa, que es soluble, a una configuración β muy estable e insoluble. Estas estructuras son muy difíciles de disolver y sólo son solubles en ácidos fuertes tales como ácido fórmico (FA) y ácido trifluoroacético (TFA) debido a que forman autoensamblados muy compactos (Linder, et al., 2009). Figura 3. Imagen de microscopía de fuerza atómica de las estructuras de auto ensamblaje de las hidrofobinas (A) Barritas cilíndricas de S. commune (SC3) (hidrofobina de clase I) (B) Película formada por barras de T. reesei HFBI en la interfase aire / agua (hidrofobina de clase II) (Linder et al., 2005) Las hidrofobinas de clase II son producidas solamente por ascomycetos. La estructura de este tipo de hidrofobinas está formada por una α-hélice y cuatro láminas β. Esas láminas β forman una estructura central de β-barril que consta de dos bucles (Figura 4b) (Linder et al., 2005). La clase II forma agregados como agujas o fibrillas que se disocian muy fácilmente (figura 3-B), siendo solubles en etanol al 60% o en sodio dodecil sulfato (SDS) caliente al 2% (Linder et al., 2005). 12  Figura 10. Representación del mecanismo de producción de gushing. Las hidrofobinas de clase II inhiben la disolución completa del CO2 (gas) y forman nanoburbujas. (Decker et al., 2010) Esta hipótesis explica que en una bebida carbonatada que contiene hidrofobinas de clase II, la disolución completa del CO2 gaseoso se ve inhibida por la presencia de estas proteínas. Este fenómeno es la base del gushing primario que se explica en detalle a continuación. Debido a la naturaleza anfifílica de las hidrofobinas, estas moléculas ascienden a la interfase agua-aire y forman una capa cristalina en la interfase . Esta propiedad de las hidrofobinas hace que la tensión superficial disminuya. Según la ley de Henry, en una botella de bebida carbonatada cerrada, las moléculas de CO2 se encuentran en equilibrio entre la forma soluble y la gaseosa. Cuando el CO2 (gas) intenta entrar a la solución, prefiere hacerlo por aquel sitio donde la tensión superficial sea menor, que será la superficie de la bebida cubierta por hidrofobinas. Dado que las moléculas de CO2 gaseoso son hidrófobas, éstas interactuarán con el parche hidrófobo de las hidrofobinas y no se solubilizarán. Debido a los movimientos que sufre la botella, la monocapa de hidrofobinas formada en la interfase atrapa el CO2 interactuado con él y dando lugar a unas formas esféricas llamadas nanoburbujas. Estas estructuras se estabilizan y dispersan en el líquido, manteniendo su forma hasta la apertura de la botella. La presión en el interior de una botella de cerveza es de alrededor de 4 bar, cuando se abre la botella, la presión desciende de repente (de 4 bar a 1 bar), lo cual provoca un aumento en el volumen de estas nanoburbujas dando lugar a su explosión. Este fenómeno se denomina nano-bomba. Esta explosión proporciona suficiente energía para romper los enlaces de hidrógeno entre el CO2 y las moléculas de agua (Figura 11), 13  originando una reacción en cadena y provocando la salida espontánea de espuma de la botella. Este efecto es dependiente de la temperatura (a temperaturas bajas, la cantidad de gushing es mucho menor que a temperaturas altas) (Deckers , 2013). Figura 11. Enlace de hidrógeno entre las moléculas de CO2 y de agua. Los átomos de oxígeno están representados en rojo, los de hidrógeno en gris y los de carbono en negro (adaptado de Chaplin, 2012). El gushing se ha observado también en otras bebidas carbonatadas como el champán y el vino espumoso (Zoecklein,1999) así como en la sidra (Wilson et al.,1999), refrescos e incluso el agua mineral (Fischer, 2001). Sin embargo, el gushing que parece ser más relevante es el que sucede en la cerveza (Pellaud , 2002). Se han estudiados varios métodos preventivos y curativos con el fin de controlar el gushing primario. Algunos métodos preventivos consisten en el tratamiento de los campos de cebada con fungicidas o el desarrollo de granos de cebada resistentes a hongos y a la fusariosis de la espiga FHB. Durante el proceso de malteado, la limpieza o clasificación por tamaño de los granos antes de malteado, así como la inhibición del crecimiento de Fusarium spp. con tratamientos químicos o bacterias ácido lácticas como Lactobacillus plantarum (Lowe & Arendt, 2004 ;Laitila et al., 2002; Mauch et al., 2010) y levaduras como Pichia anomala (Laitila et al., 2007; Sarlin, 2012) se han probado, con resultados prometedores como métodos de prevención. Los métodos curativos consisten en reducir o eliminar la presencia de hidrofobinas en las bebidas carbonatadas. Se ha estudiado el uso de enzimas proteolíticas para resolver el problema del gushing (Aastrup et al., 2003). También se ha demostrado que el gushing disminuye si se aumenta la concentración de lúpulo en la cerveza (Curtis et al., 1961). Ácidos 14  grasos mono o poliinsaturados, como ácido linoleico también pueden inhibir el gushing (Sarlin, 2012), (Shokribousjein , Z. et al. , 2014). • Gushing secundario: es un tipo de gushing con menor relevancia, causado por defectos durante la fabricación de la cerveza o tratamiento incorrecto de la misma. Este tipo de gushing se atribuye a una serie de factores que incluyen, oxalato de calcio, iones metálicos, agentes tensioactivos (compuestos que disminuyen la tensión superficial o tensión interfacial entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido) o isomerizado de lúpulo (Kitabatake, 1981; Carrington et al., 1972; Franke, 1995; Gardner et al., 1973; Kieninger, 1976; Outtrup, 1980;. Sandra et al., 1973; Weideneder, 1992; Zepf, 1998). En este trabajo, el gushing primario será el principal tipo de gushing estudiado. 1.5 Género Fusarium Fusarium es un gran género de hongos filamentosos ampliamente distribuidos en el suelo y que crecen en asociación con las plantas. Algunas especies producen micotoxinas en cultivos de cereales que pueden afectar a la salud humana y animal si entran en la cadena alimentaria. Las principales toxinas producidas por esta especie son las fumonisinas y los tricotecenos . Fusarium se encuentra contaminando la cebada, el trigo y otros granos. Esta especie causa fusariosis de la espiga (FHB), La FHB es una enfermedad importante en el grano que aparece especialmente en las zonas húmedas y semi -húmedas (Schroeder y Christensen , 1963) . Fusarium graminearum es la especie más frecuentemente implicada en la FHB , pero hay otras especies como F. avenaceum , F. culmorum y F. poae que también pueden causarla. Las especies de Fusarium producen micotoxinas , tales como vomitoxina (deoxinivalenol , DON) (Bai et al., 2001) y estas micotoxinas pueden pasar a la cerveza a través del proceso de elaboración produciendo pérdidas económicas (Schwarz et al., 1995; WolfHall y Schwarz, 2002 ) . También se sabe que las especies de Fusarium son capaces de producir hidrofobinas de clase II y por lo tanto capaces de provocar gushing (Sarlin et al., 2005) . Fusarium poae crece con mayor frecuencia en lugares fríos y húmedos, pero produce mayor cantidad de biomasa en zonas más cálidas. Este hecho sugiere que Fusarium poae se adapta más a las condiciones agroambientales durante la formación del grano que otras especies de Fusarium como F. graminearum y F. culmorum . ( Rohácik y Hudec , 2005) . F. poae produce un micelio aéreo denso en PDA (agar patata dextrosa), 15  que presenta un color que va de blanco a rosado (Figura 12). El color de la parte inferior de la colonia es generalmente blanco o amarillo. El hongo suele producir un aroma afrutado característico similar al acetato de amilo (Stenglein ,S.A. , 2009) . Figura 12. Fusarium poae en PDA 1.6 Hidrofobinas de Fusarium Se han identificado cinco genes que codifican hidrofobinas en Fusarium verticillioides. HYD1, HYD2 y HYD3 codifican hidrofobinas de clase I, mientras que HYD4 y HYD5 codifican la clase II. (Fuch, U.U et al., 2004). En el caso de Fusarium graminearum, cinco genes no caracterizados se analizaron con el fin de demostrar que presentaban una secuencia similar a la de otras hidrofobinas conocidas. Cuatro de ellos, FG01763.1, FG01764.1, FG03960.1 y FG09066.1, fueron clasificados como genes que codifican hidrofobinas de clase I y uno, FG01831.1, como un gen que codifica una hidrofobina de clase II (Sarlin et al., 2011). En este trabajo se estudia Fusarium poae, ya que se ha identificado un gen putativo correspondiente con la producción de las hidrofobinas de clase II (Figura 13) (Sarlin et al., 2012). Figura 13. Secuencia de aminoácidos de la hidrofobina de Fusarium poae (FpHyd5), Fusarium graminearum (FgHyd5) y Fusarium verticillioides (FvHyd5) (Sarlin et al., 2011;.. Fuch et al., 2002) FpHyd5QAYVPCTGLYGSSQCCATDVLGVANLDCGTPPSVPANATDFSAVCAEIGQRARCCVLPILDQGILCNTPTGVQD FgHyd5 QAYIPCSGLYGTSQCCATDVLGVADLDCGNPPSSPTDADNFSAVCAEIGQRARCCVLPILDQGILCNTPTGVQD FvHyd5 QAYIPCSGLYGTSQCCATDVLGVADLDCGNPPSTPANATDFSAVCSAIGQRARCCVLPILDQGILCNTPTGVQD 16  De momento no hay información en la literatura científica acerca de la producción y caracterización de hidrofobinas de Fusarium poae. En esta investigación se tratará de extraer, purificar y caracterizar una hidrofobina de clase II producida por el hongo filamentoso Fusarium poae. Se determinarán los parámetros de producción, así como los métodos de extracción. La hidrofobina purificada se caracterizará realizando los siguientes análisis: adsorción de FpHyd5 a superficies hidrófobas e hidrófilas utilizando la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), ángulo de contacto con el agua (WCA), microscopía óptica y electrónica de barrido, análisis del tamaño de partícula en solución acuosa y en agua carbonatada. 17  2. Justificación y objetivos Dentro de las hidrofobinas de clase II, las que mejor se han estudiado y caracterizado son las HFBI y HBII producidas por Trichoderma reesei (Askolin et al., 2001, 2004, 2005; Bailey et al., 2002; Hakanpää et al., 2004, 2006; Kisko et al., 2005, 2008; Linder et al., 2002; Nakari-Setälä et al., 1996, 1997; Paananen et al., 2003; Szilvay et al., 2007). Otras hidrofobinas de clase II de la especie Fusarium como las hidrofobinas de Fusarium verticillioides (Fuch, UU et. al, 2004) y Fusarium graminearum, también han sido investigadas (Sarlin et.al, 2011). Sin embargo, apenas hay estudios sobre la caracterización de la hidrofobina de clase II de Fusarium poae (FpHyd5). Por ello, el objetivo general de este trabajo fue producir y caracterizar FpHyd5. Para ello se plantearon los siguientes objetivos parciales: • Estudiar las condiciones de producción y de extracción de FpHyd5. Para ello, F. poae se cultivó en diferentes medios de cultivo y las hidrofobinas se extrajeron mediante dos métodos, con el fin de estudiar en qué condiciones experimentales se producía y detectaba hidrofobina. • Caracterizar algunas propiedades de interés de la hidrofobina de clase II de Fusarium poae (FpHyd5), incluyendo: o su capacidad de adhesión a superficies hidrófobas e hidrófilas o su capacidad de modificar el comportamiento de una superficie de hidrófoba a hidrófila y vice versa o su capacidad de formar polímeros y estructuras cristalinas o su capacidad de interaccionar con el CO2 formando nanoburbujas y teniendo potencial para producir gushing. 18  3. Materiales y métodos 3.1 Cepas de hongos, medios de cultivo y condiciones de crecimiento Fusarium poae MUCL 6114, de la colección de microorganismos BCCM / MUCL, se inoculó en diferentes caldos de cultivo: caldo de patata dextrosa (PDB), extracto de malta (MEB), medio mínimo de Trichoderma (TMM) (Nakari-Setälä et al., 1997) con glucosa, TMM con fructosa, TMM con lactosa, TMM con celulosa, el caldo de cebada y medio mínimo de Richard con glucosa, lactosa o quitina en Erlenmeyer de 75 mL con agitación a 75 rpm durante 4-6 días a una temperatura de 25 ºC. Fussarium poae también se cultivó en diferentes medios sólidos: agar de patata dextrosa (PDA), agar de cebada y agar de cerveza. La composición de todos los medios de cultivo se muestra en el anexo 1. Todos estos medios de cultivo fueron autoclavados a 121 ºC durante 15 minutos a una presión de 1,5 bares. 3.2 Extracción de las hidrofobinas El micelio se separó del cultivo líquido por centrifugación (8000 × g durante 15 min a 4 °C; modelo Beckman J2-21). A continuación, las hidrofobinas se extrajeron a partir del micelio usando dos métodos diferentes: tampón 170 mM Tris / HCl (pH 9) con un 1% de SDS y etanol al 60%. La extracción con Tris/HCl se llevó a cabo mezclando el micelio con tres veces el peso del micelio de tampón con 1% de SDS, a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación continua a 40 rpm. Después, el SDS se precipitó añadiendo 10 ml de una solución 2 M de KCl. La mezcla se centrifugó (8.000 × g durante 15 min a 4 ° C; modelo Beckman J2-21) y se desechó el precipitado para obtener el extracto de micelio crudo. La extracción etanólica se realizó añadiendo al micelio tres veces el peso del micelio de etanol al 60%, a una temperatura de 25 ºC durante 1 hora con agitación ocasional. Por último, el micelio se descartó por centrifugación (8000 × g durante 15 min a 4 °C; modelo Beckman J2-21) para obtener finalmente el extracto de micelio. En la Figura 14 se muestra un esquema de los dos procedimientos utilizados. 19  Figura 14. Métodos para la extracción de FpHyd5 del micelio 3.3 Purificación de hidrofobinas La muestra de extracto de micelio crudo se filtró a través de un filtro hidrófilo de poliestersulfona (Millipore) y después se inyectó (50 ml) en una columna de fase inversa RP-FPLC (cromatografía líquida de fase inversa). La resina de la columna grande fue de 30 RPC y la columna pequeña de 15 RPC. La elución se realizó con un gradiente lineal de ACN que contenía 0,1% de TFA a una velocidad de flujo de 10 mL/min. La elución se controló por detección ultravioleta a 214 nm. Los procedimientos cromatográficos se realizaron en el sistema de flujo Bio-Rad Biologic Duo. Las fracciones positivas (entre 35-50% de ACN) se recogieron, se liofilizaron y redisolvieron en agua desionizada para realizar el resto de los experimentos. 3.4 Identificación de hidrofobinas La identificación se llevó a cabo con el quipo MALDI-TOF (Bruker Daltonics,Ultraflex, GmbH). MALDI-TOF es una técnica de ionización suave usada en espectrometría de masas, que permite el análisis de biomoléculas (Figura 15). 20  Figura 15. Fundamento del MALDI-TOF En esta técnica, la muestra se mezcla con una solución matriz en exceso (matriz de ácido α-ciano-hidroxicinámico) sobre una superficie de metal. Cuando el disolvente se evapora, la muestra y la matriz cocristalizan. Esta preparación se somete a pulsos cortos de láser en alto vacío, provocando la ionización de la muestra. Después de esto, TOF lleva a cabo la determinación de la masa en una región de alto vacío por una medida muy precisa del período de tiempo que les cuesta a los iones atravesar el espacio desde la fuente que los genera hasta su impacto con el detector. Para los experimentos, 1 µl de muestra se colocó sobre la placa diana y se mezcló con 1 µl de la solución matriz. El peso molecular teórico de FpHyd5 (7,534KDa) (www.uniprot.org) se comparó con el peso molecular obtenido en los resultados de MALDI-TOF de nuestra muestra. 3.5 Cuantificación Las concentraciones de proteína de las fracciones purificadas se cuantificaron midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro ND-2000 (Thermo Scientific), llamado Nanodrop. 21  3.6 Adsorción de FpHyd5 a superficies hidrofílicas e hidrofóbicas usando QCM Esta técnica se basa en la habilidad del cristal de cuarzo de vibrar cuando se pasa a través de él una corriente eléctrica. En el caso de la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), el cristal se introduce dentro de una cámara cerrada donde una solución ya sea de proteínas, azucares o ácidos grasos se inyecta con un flujo y una temperatura constante. El cristal de cuarzo puede ser hidrofóbico o hidrofílico, lo cual es muy útil para saber cómo interactúan las moléculas al hacer contacto con esta superficie. Al pasar la solución por el cristal, estas moleculas van a interactuar con el cristal adsorbiéndose a la superficie de este. Al adsorberse las moléculas al cristal estas hacen que la frecuencia fundamental del cristal cambie, las variaciones en la frecuencia se usan para saber con bastante precisión la cantidad de masa adsorbida en el cristal. En conjunto con la medición de la frecuencia, la microbalanza también mide la disipación de energía durante el proceso de adsorción. La disipación en este caso nos dice de que manera se está disipando la energía durante el proceso, una mayor disipación se traducirá como una adsorción en forma de monocapa de tipo elástico y flexible, mientras que una disipación pequeña representa una monocapa rígida. La correlación entre la masa de proteína adsorbida a superficies hidrofílicas o hidrofóbicas y la frecuencia se obtiene por la ecuación de Sauerbrey (Sauerbrey, 1959): Δm = −C Δf /n, donde Δm es la masa adsorbida, n es el número de armónicos (n = 3), y C (17,7 ng/cm2/Hz) es la sensibilidad de masa constante (Hook et al., 1998). Todas las mediciones se realizaron en modo estático a una velocidad de flujo de 50 µL/min a 20 °C con una concentración de hidrofobinas de 0,3 mg /mL. Las medidas de los cambios de la frecuencia y la disipación se controlaron a diferentes armónicos (del 3 al 9). 3.7 Modelo de homología Los modelos estructurales de las hidrofobinas se elaboraron a partir de su secuencia aminoacídica utilizando el programa PyMol. Este programa predice la conformación más probable de una proteína. En este caso se realizó la simulación del parche 28  hidrófilas en la superficie hidrofóbica, representado en rojo en la figura 19). Aunque el área de la superficie hidrófoba dentro del parche hidrófobo (228 nm 2) no difiere demasiado de la superficie de HFBI (216 nm2) y de HFBII (248 nm2), la distribución de ese área en el parche hidrofóbico de FgHyd5 no es uniforme, lo que hace que estas pequeñas islas hidrófilas (flechas moradas figura 19) en la zona hidrófoba resten fuerza al parche hidrofóbico. Esto podría explicar el resultado obtenido anteriormente en el que se muestra que la adsorción de masa para FpHyd5 es menor en comparación con la masa adsorbida por HFBII sobre superficies hidrofóbicas. Figura 20. Diferencias en los parches hidrofóbicos de FgHyd5, HFBI y HBII. Los aminoácidos hidrofóbicos del parche hidrofóbico se representan en color rojo y los aminoácidos hidrófilos en verde. Los modelos se hicieron usando Pymol. 4.4 Ángulo de contacto del agua Dependiendo de la naturaleza del cristal donde se deposita la gota de agua, la gota tenderá a contraerse o extenderse para minimizar o maximizar su área de contacto con la superficie y así obtener un estado energético favorable. Una superficie es hidrófila cuando una gota de agua depositada sobre ella se expande para maximizar la superficie de contacto. Sin embargo, si la gota de agua se contrae y adquiere una forma esférica repeliendo la superficie, dicha superficie será hidrófoba. Los resultados obtenidos de las medidas de los ángulos de contacto del agua antes y después de la adsorción de la hidrofobina FpHyd5 aparecen en la Tabla 2. 29  Tabla 2. Ángulo de contacto del agua en cristales hidrófilos e hidrófobos antes y después de la adsorción de FpHyd5. Cristal hidrófilo Cristal hidrófobo Hidrofobina Ángulo antes de la adsorción Ángulo después de la adsorción Ángulo antes de la adsorción Ángulo después de la adsorción FpHyd5 20,5⁰ 45,3⁰ 74,7⁰ 41,4⁰ La hidrofobina de Fusarium poae (FpHyd5) fue capaz de cambiar el comportamiento de una superficie hidrofóbica a hidrofílica y viceversa, debido a su carácter anfipático. Como puede verse en la Tabla 2, en el caso del cristal hidrófilo, el ángulo de contacto del agua aumentó después de la adsorción de la hidrofobina, lo que muestra que la superficie se volvía más hidrófoba, debido a que la hidrofobina se uniría a la superficie por el lado hidrófilo, dejando su lado hidrófobo hacia el exterior. En los cristales hidrófobos, el ángulo disminuyó debido a que la superficie se volvía más hidrófila, siguiendo el mismo mecanismo explicado para el cristal hidrófilo. El cambio de ángulo fue más grande en el caso del cristal hidrofóbico que para el cristal hidrófilo, ya que FpHyd5 tiene más afinidad por las superficies hidrofóbicas. 4.5 Análisis microscópico Las Figura 21 muestra las fotografías de microscopía óptica de la hidrofobina FpHyd5 (a) y la de la hidrofobina HFBI (b) (Shokribousjein,Z, 2014) a efectos comparativos. 30  Figura 21. Imágenes de microscopio óptico de FpHyd5 (a) y HFBI (b) (Shokribousjein,Z, 2014). Las barras de escala indican un tamaño de 10μm para FpHyd5 y 20 μm para HFBI . Como se muestra en la figura 20, FpHyd5 formaba estructuras cristalinas ramificadas. La concentración de FpHyd5 era de 0,3 mg/mL, mientras que la de HFBI fue de 0,15mg/mL. HFBI forma cristales más compactos que FpHyd5 y además, estos cristales están más unidos en el caso de HFBI aunque su concentración es menor que en el caso de FpHyd5. 4.6 Análisis del tamaño de partícula Figura 22. Análisis del tamaño de partícula de FpHyd5 en agua destilada a diferentes concentraciones Se prepararon diferentes concentraciones de FpHyd5 en agua destilada para estudiar su influencia en la distribución del tamaño de partícula (Figura 22). Para concentraciones de 0,1 mg/mL de FpHyd5, el 10% de las partículas presentaron un tamaño entre 1 y 31  100 nm y el resto de las partículas se encontraron formando polímeros (tamaño de partícula > 100nm). A concentraciones de 0,2 mg/mL de FpHyd5, el 10% de las partículas se encontraban en forma de monómeros y el resto de las partículas formaron formas intermedias y polímeros. Por último, a concentraciones de 0,3 mg/mL de FpHyd5, el 100% de las partículas aparecían como polímeros. Se puede observar que en todas las concentraciones hubo formas poliméricas presentes (tamaño de partícula>100nm) debido a que las hidrofobinas presentan una gran tendencia a autoensamblarse por su carácter anfifílico. Cuando la concentración disminuye, aparecen las formas monoméricas. Figura 23. Análisis del tamaño de partícula de FpHyd5 en agua con CO2 en las dos partes diferentes en que se dividió la muestra(interfase y resto del líquido). Como puede verse en la figura 23, las muestras de FpHyd5 en agua carbonatada mostraron que en la parte de la interfase existió formación de algunos polímeros (de acuerdo con la idea de que las hidrofobinas tienden a migrar a la interfase), y formación de partículas de 100nm que corresponden con la formación de nanoburbujas (Deckers, 2013). Por lo tanto, puede concluirse que existe interacción entre la hidrofobina FpHyd5 y el CO2. 4.7 Prueba del gushing La prueba del test de Calsberg doblemente modificado arrojó resultados negativos para la muestra de FpHyd5, a todas las concentraciones utilizadas. Es decir, tras el tiempo de agitación establecido, no se produjo la salida masiva de espuma, y con ello, la pérdida de peso esperable. Estos resultados indicarían que, aunque la interacción entre la hidrofobina y el CO2 se produce, de acuerdo a los resultados anteriormente mostrados, ésta sería de una intensidad insuficiente para formar el número de nanoburbujas necesario para producir gushing. 32  Conclusiones Este estudio se puede dividir en dos partes: la primera parte trata sobre la optimización de la producción, extracción del micelio y purificación de la clase II de hidrofobinas de Fusarium poae y la segunda parte, consiste en el estudio de algunas propiedades de esta hidrofobina con el fin de caracterizarla. Las conclusiones más importantes de este estudio son las siguientes: • Fusarium poae produce hidrofobina FpHyd5 cuando crece en medio mínimo de Richard´s con glucosa. De los dos métodos utilizados, la extracción con tampón 170 mM Tris/HCl y 1% de SDS fue más eficaz. • La hidrofobina FpHyd5 presenta una mayor afinidad por superficies hidrófobas que por superficies hidrófilas ya que los valores de masa de FpHyd5 adsorbida son mayores para superficies hidrófobas que para superficies hidrófilas. • La hidrofobina FpHyd5 probablemente tiene un parche hidrofóbico menos uniforme (con islas hidrofílicas dentro del área hidrófoba), comparado con otras hidrofobinas como HFBI o HFBII. Este hecho podría explicar que FpHyd5 presente menor afinidad por superficies hidrofóbicas que HFBI y HFBII. • Esta hidrofobina es capaz de cambiar el comportamiento de una superficie hidrófila a hidrófoba y viceversa, debido a su carácter anfipático. • La hidrofobina FpHyd5 puede formar cristales con estructuras ramificadas. • En medio líquido y a bajas concentraciones, las hidrofobinas FpHyd5 forman monómeros y cuando la concentración aumenta, las hidrofobinas son capaces de formar polímeros y formas intermedias. • Existe interacción entre la hidrofobina FpHyd5 y el CO2 formándose nanoburbujas, ya que se observa aparición de nanopartículas de 100nm. Las hidrofobinas presentan propiedades interesantes que les permiten tener muchas posibles aplicaciones. FpHyd5 mostró una buena capacidad para interactuar con las superficies sólidas y la posibilidad de autoensamblarse en las interfases agua-aire. Esta hidrofobina presenta más afinidad por superficies hidrófobas por lo que podría ser utilizado como un buen agente tensioactivo y emulsionante en la elaboración de alimentos, así como para el recubrimiento de materiales quirúrgicos e implantes médicos o para la inmovilización de enzimas (Linder et al., 2005). 33  Conclusions This study can be divided in two parts: the first part about optimization of production, extraction from mycelium and purification of class II hydrophobin from Fusarium poae and the second one some properties of this hydrophobin were studied in order to characterize it. The most important conclusions of this study are: • Fusarium poae produces hydrophobins when it is grown in Richard's minimal medium with glucose. The best extraction of FpHyd5 was performed with 170 mM Tris/HCl buffer. • The FpHyd5 hydrophobin has more affinity for hydrophobic surfaces than hydrophilic surfaces because the values of mass of FpHyd5 adsorbed to hydrophobic surfaces are higher than hydrophilic surfaces. • FpHyd5 probably has a less uniform hydrophobic patch (with hydrophilic islands within the hydrophobic area) compared with other hydrophobins such as HFBI or HFBII. This fact could explain that FpHyd5 shows lower affinity for hydrophobic surfaces than HFBII and HFBI. • This hydrophobin is able to change the behavior of a hydrophilic surface to hydrophobic and viceversa, due to its amphipathic character. • FpHyd5 hydrophobin can form crystals with branched structures. • In liquid medium at low concentrations, FpHyd5 forms monomers and when the concentration increases, the hydrophobins are capable of forming polymers and intermediate forms. • Interaction between FpHyd5 and CO2 is produced and the nanobubbles formed because 100nm nanoparticles were observed. Hydrophobins present interesting properties which permit them to have many possible applications. FpHyd5 showed a good ability to interact with solid surfaces and selfassembling at water-air interface. This hydrophobin present more affinity for hydrophobic surfaces so it could be used like a good surfactant and emulsifier in food processing as well for coating of surgical materials and medical implants, and inmobilization of enzymes (Linder et al., 2005). 34  Identificación de las aportaciones de la asignatura a nivel de aprendizaje Esta estancia en el extranjero realizando mi trabajo de fin de grado ha supuesto para mí un gran enriquecimiento tanto académico como personal. El aprendizaje ha sido muy positivo a todos los niveles: trabajo en equipo, formación multidisciplinar, perfeccionamiento del inglés, conocimiento más amplio en temas de investigación, resolución de diversos problemas e integración en otro país con gente de diversos lugares del mundo entre otros. Para la realización de este trabajo, ha sido fundamental el conocimiento adquirido en las asignaturas de Microbiología de los Alimentos y Biotecnología Alimentaria, así cómo Análisis de Alimentos, cursadas a lo largo del Grado. He aprendido a buscar y clasificar gran cantidad de bibliografía, así como numerosas nuevas técnicas analíticas. También he aprendido a ser mucho más independiente y a saber trabajar en equipo así como a organizar y planificar el trabajo de manera eficiente. Evaluación asignatura y sugerencias de mejora Es una asignatura que requiere mucho trabajo, esfuerzo y dedicación pero, bajo mi punto de vista, es una de las asignaturas más interesantes y más imprescindibles de la carrera, donde te sometes a una situación lo más cercana posible a la realidad laboral e integras los distintos conocimientos adquiridos durante todo el grado. Además, en la Universidad de Lovaina esta asignatura me ha obligado a redactar el trabajo científico en inglés y exponerlo y defenderlo públicamente, también en inglés, ante un tribunal, lo cual ha supuesto un reto personal importante.  35  Bibliografía - Aastrup, S. (2004) Gushing factors are already present in barley allowing early detection of gushing risk. Proc. Eur. Brew. Con. Congr, Dublin, Fachverlag Hans Carl: Nürnberg. - Askolin, S., Nakari-Setälä, T., and Tenkanen, M. (2001). Overproduction,purification, and characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFBI. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57: 124–130. - Askolin, S., Penttila, M.,Wosten, H.A.B., NakariSetälä, T.,( 2005). The Trichoderma reesei hydrophobin genes hfb1 and hfb2 have diverse functions in fungal development. FEMS Microbiol. Lett. 253, 281–288 - Askolin, S., Turkenburg, J.P., Tenkanen, M., Uotila, S., Wilson, K.S., Penttilä, M., and Visuri, K. 2004. 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