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1 Universidad de Zaragoza Trabajo Fin de Grado Departamento de Física de la Materia Condensada UTILIZACIÓN DE CAMPOS MAGNÉTICOS Y NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS PARA LA ORIENTACIÓN DE CÉLULAS NEURONALES Junio 2014 Miren Tamayo Elizalde Directores: Gerardo F. Goya Rossetti Mª Pilar Calatayud Sanz 2 ÍNDICE RESUMEN ............................................................................................................ Pág. 3 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. Pág. 4 Nanotecnología ......................................................................................... Pág. 4 Nanopartículas magnéticas ....................................................................... Pág. 4 Fuerza y energía magnéticas .................................................................... Pág. 7 Respuesta celular a los campos magnéticos ........................................... Pág. 11 OBJETIVOS ....................................................................................................... Pág. 12 METODOLOGÍA ................................................................................................. Pág. 14 Línea celular del experimento .................................................................. Pág. 14 Microscopio óptico ................................................................................... Pág. 15 Microscopía de haz de iones (SEM/FIB Dual Beam) ............................... Pág. 16 Análisis estadístico de la orientación ....................................................... Pág. 17 Diseño y construcción de los aplicadores de campo ................................ Pág. 20 Primer aplicador de imanes ................................................................... Pág. 21 Segundo aplicador de imanes .............................................................. Pág. 25 RESULTADOS ................................................................................................... Pág. 29 Resultados aplicador 1 ............................................................................ Pág. 31 Resultados aplicador 2 ............................................................................ Pág. 35 DISCUSIÓN GENERAL ..................................................................................... Pág. 38 CONCLUSIONES ............................................................................................... Pág. 43 REFERENCIAS .................................................................................................. Pág. 46 ACRÓNIMOS...................................................................................................... Pág. 48 ANEXO ............................................................................................................... Pág. 49 3 RESUMEN Este Trabajo Fin de Grado se centra en el estudio de la capacidad de nanopartículas de magnetita (MNPs) biocompatibles de orientar células cuando éstas las ingieren y son sometidas a un campo magnético estático. Se pretende desarrollar una configuración de campo que optimice la fuerza magnética que actúa sobre estas MNPs absorbidas. El papel de la fuerza es orientar los organismos celulares. Por tratarse de componentes del tejido nervioso, las células empleadas poseen unas ramificaciones cortas e irregulares en el cuerpo celular, en cuya observación nos centraremos para hablar de esa orientación. Tras un estudio teórico previo de los parámetros a optimizar de la fuerza, se simulará el campo magnético mediante un algoritmo de elementos finitos (FEMM). Este método proporcionará resultados numéricos de los diseños de perfiles magnéticos realizados, que servirán como modelo para la construcción de un aplicador de imanes de NdFeB. Se busca reproducir en el laboratorio del INA los valores simulados y terminar haciendo un análisis estadístico del ángulo de la orientación de las células neuronales con el campo magnético, para concluir que tal orientación existe. 4 INTRODUCCIÓN Nanotecnología En los últimos años la Nanotecnología se ha convertido en uno de los campos de estudio más importantes y vanguardistas en variadas disciplinas como Física, Química, Ingeniería y Biología. La Nanotecnología estudia los objetos con tamaños típicamente inferiores a 100 nanómetros, que confieren nuevas propiedades y nuevos comportamientos a las nanoestructuras que con ellas se construyen [1]. Esto sucede porque al reducir las dimensiones de un material, sus propiedades se modifican, como son la conductividad, reactividad, temperatura de fusión y propiedades mecánicas [1]. El área de investigación de la Nanotecnología es multidisciplinar. Se requiere de un trabajo conjunto de las diferentes ramas para llegar a todos los aspectos que esta tecnología engloba. En el trabajo nos centraremos en su aplicación en la Medicina. Puesto que la mayoría de los procesos biológicos naturales se dan a escala nanométrica, se ha demostrado y se espera que lo siga haciendo que la acción conjunta de la Nanotecnología y la Biología resuelva muchos problemas biológicos y dé lugar a nuevas técnicas de diagnóstico y terapia. Nanopartículas magnéticas Dentro de la Nanomedicina podemos destacar el empleo de partículas magnéticas nanométricas. Son partículas con tamaños menores de 100nm y con altos valores de imanación [1, 3]. Destacan por sus numerosas aplicaciones tecnológicas y por sus propiedades magnéticas singulares. Poseen una amplia gama de aplicaciones: producción de materiales más resistentes y ligeros, incremento en la capacidad de almacenamiento de cintas magnéticas, creación de conmutadores más veloces para los ordenadores [1], empleo en ferrofluidos (suspensiones de partículas magnéticas en líquidos), o incluso refrigeración magnética a temperaturas por debajo de las del helio líquido [4]. Centrándonos en las aplicaciones de las nanopartículas (NPs) en el campo de la Nanomedicina podemos citar su utilidad como transportadores de fármacos guiados a un órgano específico [5, 6, 7], para eliminar bacterias y virus [8], inducir la apoptosis celular e inhibir el crecimiento de tumores [9, 10, 11] o para el diagnóstico y terapia del Alzheimer [12]. Dependiendo de la finalidad que se les quiera dar se recubren de películas no tóxicas y biocompatibles que además permitan un transporte selectivo a un objetivo determinado en un área específica [3, 13]. Las NPs pueden unirse a fármacos, proteínas (en algunos casos fluorescentes), enzimas, anticuerpos o nucleótidos que pueden dirigirse a un órgano, tejido o tumor usando campos magnéticos externos, resultando en un mejor contraste en las imágenes de resonancia 5 magnética, reparación de tejidos, desintoxicación de fluidos biológicos y separación celular. Si el campo magnético aplicado es alterno, las NPs se calientan y se puede llegar a provocar la muerte de la célula por hipertermia [3]. Nanopartículas de óxido de hierro En los experimentos que llevaremos a cabo en este trabajo se usarán nanopartículas de magnetita, , en forma de cubos y relativamente grandes, entre 20 y 50 nm (ver figura 2). Se recubren de ácido laúrico que las hacen biocompatibles. Figura 1. Imagen de TEM (microscopio electrónico de transmisión) de los cubos de magnetita. Cuando una partícula está por debajo de su denominado tamaño crítico su estructura magnética está compuesta por un mono-dominio: en esta configuración no existen paredes de dominios magnéticos debido al balance entre la energía magnetostática y magneto-cristalina. En este sentido, el momento total de cada partícula es simplemente la suma de todos los momentos atómicos, por lo que se comporta como un super-spin. A temperaturas finitas (que dependerán del tamaño de la partícula) aparece un nuevo estado denominado superparamagnético, en el que el momento magnético de la partícula fluctúa entre dos orientaciones con mínimos locales de energía. Esto es debido a la naturaleza estocástica de la energía térmica ( , que en el estado superparamagnético iguala o supera a la energía de anisotropía de la partícula: donde es la constante de anisotropía del material, es el volumen crítico de la partícula y es el ángulo entre la imanación y la dirección fácil (determinada por la interacción spin-red y por la forma de la muestra). Para muchos experimentos interesa que el momento magnético fluctúe. Sin embargo, nosotros queremos un momento magnético fijo para poder hablar de unos 6 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14 Frecuencia Tamaño (nm) valores de fuerza y energía magnéticas determinados, que no oscilen. Así, trabajaremos con partículas multidominio en estado ferromagnético. A efectos prácticos podemos decir que se trata de un super-spin, puesto que los momentos (ferro)magnéticos de los diferentes dominios se orientarán con el campo (comportamiento ferromagnético). Para las NPs de magnetita el tamaño crítico a temperatura ambiente es de 10 nm [14, 15] y las que usaremos en los experimentos tienen un tamaño medio de 48,44 nm, con una desviación estándar de 4,11 nm, por lo que, efectivamente, su comportamiento será ferromagnético: Figura 2. Histograma de los tamaños de las NPs de magnetita usadas en los experimentos Estos tamaños de las NPs nos aseguran que sus momentos magnéticos están fijos (partículas bloqueadas) a las temperaturas a la cuales trabajaremos, entre temperatura ambiente, 25˚C y la óptima para el cultivo celular, de 36˚C, temperatura que proporciona la estufa en la que se cultivan. Así, los valores de la energía de anisotropía de las NPs (proporcional al tamaño de la partícula) superarán en todo momento los de la energía térmica, evitando que las fluctuaciones térmicas deriven en oscilaciones de los momentos magnéticos de las MNPs. 7 Fuerza, par de fuerzas y energía magnéticas Si una densidad de corriente se encuentra en una densidad de flujo magnético externo , tenemos que la fuerza que actúa sobre la distribución de corriente es: Si ahora suponemos que la inducción magnética varía lentamente en la región de la corriente, podemos llevar a cabo una expansión en serie de Taylor para encontrar los términos dominantes en la fuerza. Por tanto, desarrollamos en serie alrededor del origen: La componente i-ésima de la fuerza dada por (1) es: con tensor antisimétrico, que cumple que para y para cualquier permutación cíclica, para otras permutaciones y si dos o más índices son iguales. La integral de volumen de se hace cero para corrientes estacionarias, como pueden considerarse los dipolos magnéticos ( ), por lo que la contribución de menor orden la da el segundo término. Además, cuando podemos expresar el momento magnético como y entonces queda Después de diferenciar hacemos tender x a 0 (al origen) y podemos escribirlo vectorialmente: Puesto que generalmente , se tiene que el menor orden de fuerza en una distribución localizada de corriente en un campo magnético externo es [16]: Ahora, basándonos en la relación: 8 desarrollamos la expresión de la fuerza: Como ya hemos dicho, es constante para estas NPs y en ese punto tenemos que , luego queda: Tenemos que la depende de la variación de con las coordenadas [17]. Puesto que diferentes bibliografías emplean indistintamente o a la hora de hablar de campo magnético, teniendo en mente que en realidad son magnitudes diferentes: inducción magnética e intensidad de campo magnético y que su relación está dada por la permeabilidad del material: (escalar, no confundir con momento magnético, vectorial), por costumbre en este trabajo emplearemos la notación para referirnos al campo magnético. Tenemos que la imanación o momento magnético por unidad de volumen se define como: la expresión final de la fuerza queda: Podemos desarrollar esta expresión por componentes para ver la dependencia de la fuerza con el campo y con la derivada del mismo. Según los resultados, veremos qué parámetro deberemos aumentar para que el valor de la fuerza magnética sea máximo. Más adelante expondremos que trabajaremos con campo en dos dimensiones, luego para simplificar, tomamos . Entonces: Observamos que cada componente de la fuerza aparece como suma de los productos cruzados de cada componente del campo por el gradiente de la otra componente. Así si incrementamos cada componente del campo un factor : 9 las derivadas también se verán incrementadas en ese factor: con lo que las componentes de la fuerza, producto de dos factores, se verán incrementadas en el cuadrado de ese factor: Si sólo aumenta la derivada del campo la fuerza aumentará un factor , por lo que concluimos que para conseguir fuerza magnética sobre las NPs máxima hay que maximizar el módulo del campo magnético al que éstas están sometidas. Además, parece más intuitivo y fácil trabajar con valores del campo que con su derivada. Para producir las fuerzas que orientarán nuestro sistema (células eucariotas) buscaremos un campo de módulo alto y más o menos uniforme en una pequeña región de menos de 1 mm. Por el principio de mínima energía que cumple todo sistema suponemos que los momentos magnéticos de las NPs se orientarán en una dirección tal que se minimice energía dada por: con ángulo que forman momento y campo magnéticos. El valor mínimo de la energía se corresponde con el estado más estable de la partícula. La expresión de U presenta módulo máximo con signo negativo cuando , esto es, para . En efecto, conocíamos el resultado de que la posición de mínima energía es aquella en la que momento magnético se alinea en el sentido del campo. En tal caso: De igual manera, para una densidad de corriente en un campo magnético externo podemos definir el momento o par de fuerzas dado con la expresión 16 problema con el programa de ordenador, puesto que su visión al microscopio era buena. Como hemos comentado y vemos en la siguiente imagen, el microscopio está conectado a un ordenador y posee una cámara que permite ver la muestra en la pantalla del mismo y tomar fotografías, las cuales estudiaremos para obtener las direcciones de las ramificaciones. Figura 5. Microscopio óptico empleado, asociado a un software (Jenoptik Optical Systems) En el Anexo de muestran fotografías de las células y sus ramificaciones, tomadas con los diferentes aumentos del microscopio óptico. Microscopía de haz de iones (SEM/FIB Dual Beam) Se trata de una técnica de haz de iones focalizados (FIB por sus siglas en inglés) que emplea un haz de iones, generalmente Ga+, que es acelerado (por una diferencia de potencial) hacia un punto de la muestra, de forma análoga al haz de electrones focalizados del microscopio de barrido o SEM (Scanning Electron Microscope). Sin embargo, estos iones son mucho más masivos que los electrones, por lo que al impactar sobre la superficie de la muestra, arrancan material de ésta. De esta manera podemos hacer un corte transversal en la muestra y observar, en nuestro caso, el interior de la célula, para comprobar si ha ingerido MNPs. Además del haz de iones, el equipo incorpora un SEM, de ahí que también se le conozca como Dual beam. Esto permite emplear el haz de electrones para hacer la imagen de la muestra a la vez que ésta se está cortando con el haz de iones. El cañón de iones está inclinado 52˚ con respecto al de electrones, que está vertical. Figura 6. Cañones del dual beam 17 El equipo puede llevar a cabo espectroscopía de dispersión de energía de rayos X (EDX), que permite determinar la composición elemental de la muestra (ver apartado Resultados). Las muestras a estudiar deben ser preferiblemente planas y obligatoriamente conductoras, para que se descarguen al conectarlas a tierra. Si no se descarga correctamente, la muestra se desplaza (puesto que repele el cañón de electrones) y se dificulta su estudio. Por ello las células, previamente fijadas a un porta con productos específicos, se recubren con una capa de platino. Es necesario controlar el voltaje de aceleración de ambos cañones para no dañar la muestra. En el Anexo aparecen imágenes tomadas con este microscopio de barrido. Análisis estadístico de la orientación El trabajo se basa en hacer estadística de una variable angular, que representa la orientación de las células en estudio. Tras la primera noche que pasan las células con MNPs en una estufa a 36˚C, sometidas al acción del imán, se llevan a analizar al microscopio óptico, asociado a un software que permite guardar fotografías de la muestra en estudio. Antes de cultivar células en su interior y realizar la preparación de la muestra, se marca el recipiente de cultivo en su base, con dos líneas paralelas separadas la misma distancia que la diagonal a estudiar. Había que hacer coincidir, siempre que se dejase el recipiente con cultivo celular sobre el soporte de imanes, esas marcas con los límites de la zona de estudio. Además, estas señalizaciones permitían localizar con el microscopio óptico sin dificultades el área en la cual las células habían estado bajo los efectos del imán, que será donde tomaremos fotografías para después analizarlas. Así, colocamos el frasco de cultivo sobre la platina del microscopio con la diagonal marcada en posición horizontal. Sabemos entonces que el campo magnético tiene dirección perpendicular a estas líneas, por lo que su dirección al mirar las células bajo el microscopio será la vertical. Se espera que las células presenten esa misma orientación. Valiéndonos del microscopio óptico observaremos cómo, en un primer análisis cualitativo de la zona de interés, efectivamente, los cúmulos de MNPs que no se desprendieron al lavar con PBS la muestra se orientan en el sentido del campo, hecho que nos permite en todo momento ser conscientes de su dirección. Esto era de esperar. Tenemos que ver cómo responden al campo las MNPs que se encuentran en el interior o superficie de las células. 18 Figura 7. Fotografías tomadas con el microscopio óptico con el objetivo 10x En la figura se ha señalado la dirección del campo magnético con los dos sentidos posibles. A la hora de observar con el microscopio conocíamos el sentido del campo gracias a las líneas que habíamos dibujado en la base del matraz que señalaban la zona que había sido impuesta a campo intenso (campo perpendicular a ellas). Debido a la simetría del problema sólo interesa la dirección del campo, pues ambos sentidos llevan a una misma orientación de las células. En cada experimento haremos fotografías de la diagonal a estudiar y, conociendo la dirección del campo magnético, posteriormente pasaremos a analizar esos datos con el programa ImageJ, con el que obtendremos el ángulo de orientación de las ramificaciones celulares con respecto al campo. Con los datos que nos proporcione el programa haremos un histograma para los ángulos, entre -90˚ y 90˚ con respecto a la dirección del campo. Será necesario hacer equivalencias de ángulos, que con la simetría de nuestro sistema aparecen entre los cuadrantes primero y segundo y entre el tercero y el cuarto. En el caso ideal este histograma debería ser una función delta de Dirac en el ángulo 0: todas las células que han ingerido MNPs se han orientado paralelas al campo. Sin embargo, veremos cómo en medios biológicos existen numerosos factores de los cuales depende que una célula ingiera o no NPs, presente más o menos resistencia a desplazarse, responda de manera específica ante una fuerza mecánica... Con lo que tomaremos como válido un ajuste del histograma a una distribución gaussiana o normal. 19 En cada experimento y cada día (realizaremos un total de 4, con dos soportes de imanes diferentes, como veremos) se tomaron una media de 30 fotografías, lo que daba un análisis de unos 200 prolongaciones. Este número fluctuaba en cada experimento, puesto que las condiciones de concentración de las muestras eran diferentes y la localización de prolongaciones celulares más o menos complicada (no se tomaban imágenes de cúmulos o aglomeraciones de células sin dendritas, pues de ellas no sacábamos información útil). Como sabemos, el ajuste será mejor cuanto mayor sea el número de datos analizados, pero, como hemos dicho, este número estará limitado por el estado de la muestra. Analizaremos los resultados que nos dé el programa Image J dibujando en un histograma la frecuencias de aparición de los diferentes ángulos. Ajustaremos la curva a una distribución normal o gaussiana, dada por Origin de la siguiente forma: Figura 8. Fórmula y parámetros de ajuste de la distribución normal de Origin El único parámetro que fijaremos será , puesto que puede haber algún rango de ángulos en el que ninguna ramificación se oriente (representaremos los ángulos en grupos de 20˚). Los valores de los parámetros restantes saldrán de un ajuste por iteraciones. Compararemos los resultados de este ajuste (sus parámetros) para los diferentes experimentos que realizaremos con distintos aplicadores de imanes y para cada una de las medidas de cada experimento, correspondientes al número de noches que las células estuvieron con imán. Podríamos igualmente haber hecho un tratamiento estadístico de la longitud de las ramificaciones con y sin MNPs, expuestas y no expuestas a campo... Sin embargo, ello llevaría a excederse en la extensión de esta memoria y no se encuentra entre los objetivos de este trabajo, por lo que nos remitimos a los resultados obtenidos en el TFM elaborado el año pasado en el propio INA sobre el tema: la presencia de hierro en el interior celular favorece el crecimiento de las prolongaciones [22] y el sometimiento de células a campo magnético favorece igualmente su crecimiento [21], luego la combinación de ambos supone la elongación máxima de las ramificaciones. La presencia de campo sin MNPs no afecta al tamaño de estas prolongaciones. 20 Diseño y construcción de los aplicadores de campo El primer paso del trabajo es simular numéricamente los valores de campo magnético que se logran con diferentes configuraciones de fuentes de campo (en nuestro caso, imanes permanentes de NdFeB). Para optimizar el campo estático se realizan simulaciones mediante el método de elementos finitos (FEMM) utilizando un enfoque bidimensional, que es la geometría de los cultivos celulares. El método consiste en descomponer el problema (en este caso, un problema magnético) en un número N de regiones (N >> 100), cada una con una geometría simple (por ejemplo, triángulos). En cada región el algoritmo del programa resuelve las ecuaciones de Maxwell pertinentes para obtener valores para el campo magnético, valiéndose de una aproximación numérica a la solución "verdadera" de las ecuaciones de Maxwell. Este método ha demostrado ser completamente eficaz para el diseño de aplicadores de campo estático utilizados en orientación neuronal. En las simulaciones se lograron como veremos gradientes de campo magnético de hasta 30 T/m, que se mostraron eficaces en ensayos in vitro previos. En este TFG se pretende mejorar el diseño del aplicador de imanes anterior, mostrado en las figuras siguientes: Figura 9. Soporte de imanes antiguo y resultados de FEMM En la zona central entre imanes se consigue un campo más o menos uniforme de módulo 0,19 T, siendo el gradiente del mismo de 0,19 T/m. Ese área de estudio tenía una anchura de 2 mm y proporcionó superficie suficiente para encontrar medidas con las cuales hacer un buen tratamiento estadístico, por lo que se tomó como referencia. Sin embargo, cuanto menor era la distancia entre imanes más intenso era el módulo del campo magnético entre ambos. Sabiendo que las células Bv2 tienen tamaños de alrededor de , una zona de estudio de las mismas de 1 mm de ancho parecía razonable. 21 PRIMER APLICADOR DE IMANES Diseño del primer aplicador Tras varios diseños menos efectivos o cuya construcción requería una mayor complejidad, optamos por una estructura de cuadrupolo. De esta manera, reconduciendo el flujo magnético mediante piezas de hierro puro (material de alta permeabilidad magnética), lo concentrábamos en la zona en la cual estudiaríamos la orientación de las células. Para su diseño y simulación previas teníamos la restricción del tamaño de los imanes, puesto que se trataba de imanes comerciales de NdFeB de tamaños y formas estandarizados (pedir algo más específico lleva mucho tiempo). El proveedor de los imanes es la empresa Supermagnete, de Alemania. Las configuraciones más efectivas, a la par que sencillas (el soporte para los imanes y las piezas de hierro se construirían por un técnico del propio INA), presentaban disposiciones simétricas, por lo que los cuatro imanes serían idénticos y cuadrados. Consultando en la web de la empresa los tamaños disponibles y llevándolos a la simulación de FEMM, terminamos eligiendo imanes cuadrados de 15x15x8 mm: Figura 10. Primer soporte de imanes nuevo En la simulación, los imanes y piezas de hierro puro estaban rodeadas de aire. En la implementación práctica del diseño se empleará poliamida 6 (nylon). En un principio el aplicador tendrá una altura homogénea de 8 mm, puesto que es la altura impuesta por los imanes. A la hora de colocar los imanes y terminar el montaje, las piezas triangulares de hierro de la diagonal de estudio se atraían con fuerza, por lo que tuvimos que colocar un material "aislante" magnético entre ellas. No había plástico en ese momento en el taller, por lo que colocamos latón, que tiene permeabilidad magnética despreciable, para separar las piezas imanadas. Comprobamos en las figuras sacadas de FEMM cómo las líneas de campo magnético describen un ciclo más o menos cerrado, luego las pérdidas deberían ser 22 0246810 12 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 B (y=0) B (T) x (mm) -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 B (x=0) B (x=5,30 mm) B (x=10,60 mm) B (T) y (mm) mínimas. El propósito del anillo de hierro es, precisamente, cerrar el flujo magnético, de forma que el campo producido por los imanes llegue, sin haberse visto disminuido, a la zona deseada: la diagonal de estudio, marcada en la figura 10 con un rectángulo azul. En esa diagonal, que presenta campo paralelo y uniforme de alto módulo, estudiaremos la orientación de las células. En el momento en el que aparece la zona de material de baja permeabilidad magnética (latón, en este caso) entre las dos piezas de hierro (conductoras magnéticas), algunas líneas de campo salen de una pieza de hierro y llegan a la otra describiendo trayectorias curvilíneas (parabólicas) en el eje Z. Es gracias a esto que, si colocamos un material magnético en a zona, se verá afectado por estas líneas de campo. Figura 11. Cómo las líneas de campo pasan de un polo magnético a otro Exportamos de FEMM valores numéricos del campo y los representamos con Origin, obteniendo las siguientes gráficas para el campo magnético en el eje Y para los valores de X marcados con círculos negros sobre la diagonal de la figura 10 (x=0, 5.30, 10.60 mm) y los de la componente X para Y=0: Figura 12. Campos según los ejes X e Y para diferentes posiciones en el montaje de imanes primero Vemos que el campo en el eje X es prácticamente constante e igual a 1,7 T a lo largo de toda la diagonal (las gráficas sólo muestran media diagonal, pero ésta es simétrica con respecto al centro). En la coordenada Y los valores de los campos para inicio (x=0), posición media (x=5.30 mm) y final (x=10.60 mm) de la mitad de la diagonal son de 1,2 T, 1,5 T y 1,7 T respectivamente. El más uniforme es el correspondiente al punto medio de la semidiagonal, donde las líneas de flujo magnéticas son paralelas. Teniendo en cuenta que con el soporte de imanes anterior (empleado el año pasado) se había conseguido un campo de 0,9 T, vemos que hemos llegado casi a duplicar el módulo del mismo. Observamos también que existen 23 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 dB/dy (x=0) dB/dy (x=5,30 mm) dB/dy (x=10,60 mm) dB/dy (T/m) y (mm) 0246810 12 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 dB/dx (y=0) dB/dx (T/m) x (mm) variaciones de los valores del campo en los extremos de las semidiagonales. Ello llevará a que la derivada del campo con la posición sea no nula: Figura 13. Valores de las derivadas del campo con la posición Observamos que en los extremos de la semidiagonal se alcanzan valores del gradiente del campo en el eje Y de hasta 30 T/m. El gradiente en X alcanza un valor máximo de 2 T/m. En la zona media el gradiente en ambas coordenadas es prácticamente nulo. Podemos concluir aquí que en estos puntos la fuerza magnética que actúa sobre las NPs será nula, puesto que uno de sus factores (el gradiente) lo es. Sin embargo, vimos en el análisis de esta fuerza que se descomponía en sumandos que englobaban términos cruzados de campo y gradiente en diferentes coordenadas, luego a nada que uno de ellos sea distinto de cero, existirá una fuerza magnética no nula actuando sobre las MNPs. En los experimentos que realizamos no distinguimos zonas de estudio dentro de la diagonal, por lo que no podemos corroborar la magnitud de la fuerza en cada zona y compararlas. Construcción del primer aplicador El soporte final quedó de la siguiente manera: Figura 14. Primer soporte de imanes 24 En la imagen comprobamos que el aplicador tiene además una "tapa" superior que permite fijar la posición de la placa de Petri (placa de 3 cm de diámetro donde crece el cultivo celular). Es importante que la placa no se mueva en todo el experimento, puesto que teniendo en cuenta el tamaño micrométrico de las células, cualquier mínima variación de la posición del frasco con respecto al aplicador de imanes resultará en una fuerza de magnitud diferente actuando sobre las células. Aunque el propósito del anillo de hierro era que no se escapasen líneas de flujo, al colocar el aplicador sobre una superficie metálica se notaba cierta atracción, lo que hacía pensar que se escapaban más líneas de flujo de las deseadas. Este efecto se debe probablemente a que los imanes sobresalían con respecto a las piezas de hierro que debían reconducir el flujo, luego parte del mismo se perdía en todas las direcciones del espacio. Comprobamos la efectividad del diseño estudiando el comportamiento de una pequeña cantidad de ferrofluido (MNPs de hierro disueltas en agua) dentro de una placa de Petri, recipiente que utilizaremos para cultivar y estudiar las células Bv2 con este soporte de imanes Figura 15. Ferrofluido sometido a soporte de imanes En la figura última observamos cómo dos imanes o las piezas triangulares de hierro anexas a ellas están en contacto cuando en teoría no deberían estarlo, puesto que la diagonal perpendicular a la de estudio debería estar vacía de ferrofluido (puesto que no la atraviesan líneas de campo) y se observan MNPs en un extremo de la misma. En un principio usamos una placa de Petri graduada. Queríamos valernos de las marcas para comparar el crecimiento de grupos concretos de células. Sin embargo, estas placas no funcionaron bien puesto que los grabados se encontraban en su superficie interior, la misma a la que se pegaban las células, con lo que éstas tendían a colocarse a lo largo de las marcas. Al mirar la muestra al microscopio se observaban células coincidiendo con las líneas y ello dificultaba la distinción de sus prolongaciones. Además, comprobamos que en una noche las células se desplazaban mucho, por lo que era difícil estudiar la evolución de una célula individual o de un grupo de células concreto, puesto que sus posiciones variaban mucho. Figura 16. Placa de Petri graduada en su superficie interna 25 SEGUNDO APLICADOR DE IMANES Diseño del segundo aplicador Habíamos detectado fallos en el primer diseño de imanes: se escapaba una cantidad no despreciable de flujo magnético del anillo y dos piezas supuestas separadas estaban en contacto, por lo que los valores del campo en la zona de estudio eran menores que los estimados. Procedimos por tanto a diseñar un nuevo soporte. Utilizamos imanes de NdBFe cúbicos, de 12x12x8 mm. La simulación con FEMM fue la siguiente: Figura 17. Segundo soporte de imanes nuevo Los materiales con los que fue diseñada esta simulación fueron los mismos que para el anterior (hierro puro e imanes de NdFeB). Se aumentó la anchura del anillo de hierro para asegurar que no se escapase, en teoría, ninguna línea de campo. Los valores del campo magnético en el eje Y para diferentes posiciones de X (marcadas en la figura 22) correspondientes al inicio (x=0) de la semidiagonal, mitad y final de la misma (x=4.24 y 8.48 mm) y los valores del campo en el eje X para Y=0 se muestran en las gráficas siguientes: 32 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 Frecuencia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 2 . Tenemos por tanto unas desviaciones algo altas que esperamos que disminuyan para experimentos siguientes. Factores a mejorar del experimento 1 Como ya habíamos comentado, tuvimos problemas con las placas de Petri graduadas del experimento. Resultaba en ocasiones difícil distinguir las prolongaciones celulares de las líneas grabadas en la base del matraz. Además, el crecimiento de las células Bv2 no fue el óptimo en estos recipientes, ya que apenas desarrollaron ramificaciones. Se observó también una gran densidad de células en la segunda medición (tras la segunda noche), que sumado al problema de las marcas de grabado, dificultó la localización de las prolongaciones para tomar fotografías de las mismas. Consideramos que de ahí se deriva que el segundo histograma tenga un peor ajuste. Sin embargo, conviene comprobar que este hecho no se repite, puede que la orientación de las células sea más efectiva a corto que a largo plazo. Resultados y discusión del experimento 2 Repetimos el experimento con el mismo aplicador de imanes pero esta vez con una placa de Petri no graduada. Queremos probar si, mejorando las condiciones que fallaron en el experimento anterior, conseguimos disminuir el valor de la desviación estándar del ajuste normal de la distribución de los ángulos. En esta ocasión cultivamos una pequeña cantidad de células desde el viernes, que estuvieron en incubación (sin NPs) todo el fin de semana, para así adelantar un día el proceso, por lo que pudimos hacer tres días de mediciones (fotografías), con sus correspondientes análisis de la orientación celular con el campo. Los resultados fueron: Figura 27. Histograma y ajuste de los datos del experimento 2 tras 1 noche con imán 33 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 2 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 Frecuencia Ángulo Tres noches con imán Ajuste normal Exp 2 Figura 28. Histograma y ajuste de los datos del experimento 2 tras 2 noches con imán Figura 29. Histograma y ajuste de los datos del experimento 2 tras 3 noches con imán En un análisis cualitativo previo de los histogramas concluimos que el primero vuelve a ser el que mejor resultados da. Comprobamos, con la ayuda de los parámetros del ajuste normal, que la distribución para el primer día está centrada en , que es prácticamente 0˚ y la desviación estándar es de . Estos resultados son sorprendentemente buenos. Sin embargo, los de la segunda noche son peores: y . Siguen empeorando con el paso del tiempo, puesto que tenemos que los de la tercera noche son: y . El segundo día de análisis había un número de células muy elevado que dificultaba la extensión de sus ramificaciones y, por tanto, el estudio al microscopio. 34 Factores a mejorar del experimento 2 Para el siguiente experimento debíamos probar con una cantidad de células bastante menor, pero recordamos que debía ser lo suficientemente grande como para que las células no se encontrasen aisladas y pudieran interaccionar entre sí. Con los dos primeros experimentos pudimos comprobar que las células crecían mal en las placas de Petri, no desarrollaban sus ramificaciones. De manera simultánea estábamos realizando un experimento paralelo con el aplicador de imanes empleado el año anterior y en él hacíamos crecer las células en T25 (capacidad de 25 cm2). Los resultados del crecimiento de las Bv2 en los T25 eran mucho mejores. Esto puede deberse a que la composición o rugosidad del material con el que están fabricados ambos fuera diferente. Decidimos por tanto hacer otro diseño del soporte de imanes que requiriese el uso del T25 como recipiente para el cultivo celular: Figura 30. Frasco empleado en los experimentos con el segundo montaje de imanes 35 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 Frecuancia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 3 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 3 RESULTADOS APLICADOR 2 Con este segundo aplicador volvimos a llevar a cabo otros dos experimentos, volviendo a observar y a analizar la orientación de las células con MNPs tras una y dos noches de incubación con imán. Resultados y discusión del experimento 3 Tras una y dos noches de incubación de las células sobre el aplicador de imanes se toman fotografías y del análisis de su orientación salen los siguientes histogramas: Figura 31. Histograma y ajuste de los datos del experimento 3 tras 1 noche con imán Figura 32. Histograma y ajuste de los datos del experimento 3 tras 2 noches con imán Observamos que una vez más se obtiene un resultado que concuerda mejor con lo esperado la primera noche que la segunda. Comparamos los parámetros del 36 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 Frecuencia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 4 ajuste: el primer histograma está mejor centrado aunque tiene una desviación estándar algo mayor: y , mientras que el pico del segundo está más alejado del 0 pero tiene una deviación menor: y . Recordamos que en los experimentos anteriores hablábamos de desviaciones estándar de 50 y ahora rondan el valor de 40. Factores a mejorar del experimento 3 Para realizar este experimento cambiamos el frasco de cultivo, pasamos de usar placa de Petri a una botella T25. Volvimos a tener problemas de concentración excesiva de células. En muchas de las fotografías tomadas en este experimento y sobre todo en las medidas tras la segunda noche, no podrían diferenciarse y localizar prolongaciones celulares, por lo que las fotografías quedaban invalidadas y el número de sucesos a analizar se veía menguado. Reduciríamos, para el próximo experimento, la concentración de células a cultivar, esperando que las ramificaciones creciesen más y mejor. Resultados y discusión del experimento 4 Es el último experimento que realizamos. Sembramos una cantidad menor de células, con lo que éstas crecieron mejor y el análisis de la orientación de sus prolongaciones fue más fácil y efectivo. Los resultados que obtuvimos de las orientaciones tras una y dos noches de incubación fueron: Figura 33. Histograma y ajuste de los datos del experimento 4 tras 1 noche con imán 37 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 4 Figura 34. Histograma y ajuste de los datos del experimento 4 tras 2 noches con imán Observamos que la frecuencia de aparición de prolongaciones de células con orientación paralela al campo (0˚) es la que más destaca en ambos histogramas. Además, los dos están centrados prácticamente en el cero. Los parámetros del ajuste para cada uno de los histogramas son, para el primero: y y para el segundo: y . Luego vemos que los picos tienen una desviación mínima del centro ( ˚) y las desviaciones estándar no se alejan mucho del típico de la gaussiana. Seguimos con desviaciones en torno a 40 frente al 50 de los experimentos realizados con el otro montaje de imanes. 38 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 Frecuencia Ángulo Sin MNPs sin imán -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Frecuencia Ángulo Con MNPs sin imán DISCUSIÓN Es importante hacer controles paralelos a los experimentos, para así comparar cómo crecen las células y cuál es su orientación si están o no sometidas a los efectos de un imán o si tienen o no MNPs en su interior. Debemos tener un cultivo de referencia para comprobar si los cambios introducidos producen modificaciones apreciables en las células. Recordamos que en los experimentos las muestran eran células con MNPs sometidas a campo magnético. Así, es necesario hacer los siguientes controles:  Células con MNPs sin campo  Células sin MNPs sin campo  Células sin MNPs con campo No dio tiempo a realizar este último control, puesto que requería el uso del aplicador y ello impedía que pudiera llevarse a cabo un experimento para estudiar la orientación de las células esa misma semana. Sin embargo, partiendo de que la célula per se no tiene componentes que presenten comportamientos magnéticos, deducimos que su respuesta al campo será nula o, a lo sumo, no apreciable. Los resultados de los experimentos del TFM del año pasado corroboran este resultado, por lo que lo supondremos válido también para el nuestro. No obstante hay estudios que presentan datos contrarios, exponiendo que las células se orientan perpendiculares al campo [21]. Puesto que las medidas experimentales llevadas a cabo el pasado año en el INA no daban prueba de esta orientación, no la tomaremos como válida. Mostramos los resultados de uno solo de cada uno de los controles que realizamos, ya que todos ellos tuvieron resultados equivalentes: las ramificaciones de las células que no se exponen a los efectos de un campo magnético, independientemente de que hayan o no ingerido MNPs, presentan orientaciones random o aleatorias, sin existir una dirección preferente: Figura 35. Controles del experimento 39 No tiene sentido realizar un ajuste normal de estas gráficas puesto que la distribución es continua y uniforme: no existe una dirección preferente. Con estos controles comprobamos que las MNPs no afectan a la orientación de una célula que no está bajo influencia de un campo magnético. De igual modo vimos que el campo magnético propiciaba el crecimiento de prolongaciones en las células, siempre y cuando tuvieran MNPs en su interior. Para tener una visión global de la evolución de los resultados de los experimentos agrupamos los histogramas (mostrados todos en la página siguiente) y los parámetros relevantes de sus ajustes. En total tenemos 4 experimentos, tres de ellos con dos tandas de datos y otro con tres. Compararemos los valores del pico de la gráfica o centro de la distribución gaussiana y los valores de la desviación estándar de la misma: Centro Desv. Estándar Exp 1 Una noche 7,27 53,35 Dos noches 16,75 58,19 Exp 2 Una noche 1,3 30,42 Dos noches 14,95 42,72 Tres noches -20,61 51,21 Exp 3 Una noche -4,37 40,79 Dos noches 10,08 37,85 Exp 4 Una noche 5,06 40,79 Dos noches -5,15 41,53 Tabla 1. Valores de los parámetros relevantes de los ajustes de los histogramas Vemos que el centro del ajuste se aleja del cero conforme avanza el número de noches que las células pasan bajo el imán. A su vez la desviación estándar se hace más grande, ensanchándose en las gráficas la función distribución de los ángulos. Definitivamente, salen mejores resultados en las primeras noches. Lo comprobamos agrupando todos los histogramas para apreciar a simple vista la evolución de los resultados de los diferentes experimentos: 40 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 1 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 35 Frecuencia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 1 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 Frecuencia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 2 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 2 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 Frecuancia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 3 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 3 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 Frecuencia Ángulo Una noche con imán Ajuste normal Exp 4 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 Frecuencia Ángulo Dos noches con imán Ajuste normal Exp 4 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 Frecuencia Ángulo Tres noches con imán Ajuste normal Exp 2 Figura 36. Histogramas de la orientación de las células con MNPs sometidas a campo tras cada noche de cada experimento 41 Observando las gráficas comprobamos que, dentro de un mismo experimento, las células se alinean mejor con el campo tras la primera noche, notándose peores orientaciones en las noches sucesivas. Como ya hemos comentado, esto puede deberse a errores en el tratamiento de los datos, relacionados con la gran cantidad de células que se observaba tras la segunda noche. De hecho, fijándonos en los ejes de ordenadas de las gráficas, podemos comprobar que el número total de sucesos analizados para un mismo experimento disminuye en la segunda (y tercera) noche(s) con respecto a la primera (y segunda). Las zonas de aglomeraciones de células eran mayores y más numerosas conforme éstas crecían y se reproducían. Así, el número de ramificaciones analizadas en esos experimentos era menor y ello lleva a fluctuaciones estadísticas debidas a un bajo número de sucesos. No debemos descartar, sin embargo, la posibilidad de que sea un comportamiento típico de las células y que verdaderamente presenten algún mecanismo biológico de respuesta a un campo magnético. Puede que la estadística que hemos hecho haya sido suficiente y que los resultados reflejen correctamente la respuesta celular al campo magnético. Si nos fijamos en la evolución de las distribuciones vemos que hay una disminución de la desviación estándar conforme mejorábamos las condiciones de los experimentos. Podemos por tanto decir que el desarrollo de los experimentos ha resultado positivo. No obstante, para concluir que las condiciones (concentración de células, matraz de cultivo y soporte de imanes empleados) en las que se ha realizado el último experimento son las idóneas, habría que repetirlas más veces y ver si los resultados siguen siendo buenos. Además, convendría volver a realizar los experimentos con otra línea celular diferente (se emplean con frecuencia las PC12) y con MNPs de distinto material (cobalto, por ejemplo) para corroborar la bondad de los resultados. Existen distintas hipótesis que puedan justificar la orientación celular tras su exposición a un campo magnético. Hay artículos que exponen que las células (sin NPs) bajo efecto de un campo tienden a orientarse perpendiculares al mismo, debido a la polaridad de la interacción microtúbulo-actina, a gradientes de iones que aparecen en su interior y a la acción conjunta de diversas proteínas y factores de adhesión [18, 19, 21]. Otra idea personal puede ser la de que existan mecanismos biológicos en el interior del organismo por los que éste se oponga a la modificación de su estado, puesto que una célula (y en concreto, también sus ramificaciones) crece en una determinada dirección por motivos específicos de alimento, efectos de cargas, interacción con otras células... Podemos suponer (seguimos haciendo hipótesis) que ante un campo magnético de módulo alto las MNPs se orientan antes de que estos procesos se activen, por lo que tras una noche obtenemos buenos resultados de la orientación de las células con el campo, pero van empeorando conforme esos mecanismos van cobrando fuerza. Podemos concluir finalmente que las prolongaciones de las células con MNPs se orientan de manera apreciable en el sentido del campo. El mecanismo mediante el cual se orientan sigue sin ser claro hoy en día. Se conoce, como hemos dicho, que la fuerza magnética que actúa sobre las MNPs de la ramificación induce procesos biomecánicos en su interior. Se dan entonces de manera simultánea muchos y complicados procesos que requieren altos conocimientos de biología molecular o celular. Desde nuestro punto de vista de la Física podemos decir que la forma en que 48 ACRÓNIMOS A continuación se muestran, ordenados por orden alfabético, los acrónimos que aparecen en la memoria, junto con su correspondiente significado. Bv2 Línea celular de macrófagos del SNC DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium). Suero proteico para cultivo celular EDX Espectrometría de Dispersión de rayos X FEMM Finite Element Method Magnetics FIB Microscopía de haz de iones INA Instituto de Nanociencia de Aragón MNP Nanopartícula magnética NdFeB Neodimio Hierro Boro NP Nanopartícula PC12 Línea celular de la médula suprarrenal de la rata SEM Microscopio Electrónico de barrido SNC Sistema Nervioso Central SNP Sistema Nervioso Periférico TEM Microscopio Electrónico de Transmisión TFG Trabajo Fin de Grado TFM Trabajo Fin de Máster 49 ANEXO Células Bv2 en el microscopio óptico Aumento 10x: Con este objetivo teníamos una visión más general de la muestra. Pudimos observar cómo las células Bv2 tienden a aglomerarse. Por ello es complicado determinar la cantidad idónea a sembrar. Podíamos comprobar la dirección del campo magnético en la zona entre imanes gracias a la orientación de los cúmulos de MNPs (zonas más oscuras). 50 Aumento 20x: Fue el objetivo que más usamos, puesto que permitía la fácil diferenciación de las ramificaciones de las células. En las siguientes imágenes puede observarse una tendencia de las prolongaciones de las células a la orientación vertical, la misma que la del campo. También se observa que las MNPs forman clusters que se orientan en esta dirección. Volvemos a ver protuberancias en los extremos de algunas ramificaciones, que hacen pensar que son las MNPs, que de alguna manera "tiran" de estas prolongaciones en el sentido del campo. En las siguientes imágenes puede verse que los núcleos celulares más grandes son los que más cantidad de MNPs tienen. Puede que fueran los más grandes y por ello ingirieran más partículas o al revés, que el hecho de ingerir partículas con hierro activase su crecimiento. Hay estudios que hablan de esto, pero los resultados no siguen un patrón claro. De hecho, vimos que muchas células en cuyo interior se apreciaban grandes cúmulos de MNPs, como se muestra en la imagen de la derecha, estaban "explotadas" en la dirección del campo. Podemos pensar que las MNPs fuerzan a la célula a orientarse en esa dirección y terminan incluso sobrepasando su límite de elasticidad: 51 Aumento 40x: Con este aumento parecían diferenciarse ensanchamientos en zonas determinadas de la ramificación, que asociamos con la presencia de MNPs dentro de él. Células Bv2 en el FIB Con este microscopio observamos tres muestras diferentes: células Bv2 cultivadas sin MNPs, células con MNPs que no habían estado bajo influencia de imán y células con MNPs sometidas a imán. 52 Observamos partículas en la superficie de la células. Se distinguían porque eran más brillantes que el material celular y se presentaban en aglomeraciones. Comprobamos que, por sus dimensiones, se trataba en efecto las partículas de magnetita con las que habíamos sembrado las células: Supusimos que, al tener MNPs pegadas a su superficie, también las habría ingerido y estarían en su interior. Procedimos a cortar la prolongación celular pero no encontramos partículas: 53 Detectamos protuberancias en las ramificaciones de estas células pero al cortarlas no encontramos MNPs, por lo que los ensanchamientos de las ramificaciones no eran único síntoma de que hubieran ingerido partículas. A la izquierda, célula sin MNPs y a la derecha células con MNPs: Comprobamos una vez más la tendencia que tienen estás células Bv2 a alinearse. En la izquierda las células no tienen NPs, por lo que la interacción que surge 54 de esa alineación no es magnética. A la derecha sí que habían sido sembradas con MNPs, por lo que la interacción puede (o no) ser magnética. En la muestra en la cual las células con MNPs habían estado sobre el aplicador de imanes creímos encontrar la zona de la diagonal en la que el campo magnético era uniforme e intenso. Teníamos como referencia la orientación de los cúmulos de MNPs y distinguimos un posible área de anchura similar a la de la diagonal de estudio, marcada en la siguiente imagen: