Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS MÁSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR 2013-2014 Directores: Dr. Javier Naval Dra. Isabel Marzo Autora: Beatriz Aragón Aranda Análisis del mecanismo de acción de nuevos fármacos para el posible tratamiento de neoplasias hematológicas Efecto del inhibidor de CK2, CX-4945, en células de mieloma múltiple 1 ÍNDICE 1.1 Muerte celular 4 1.1.1 Apoptosis o muerte celular programada ..................................................... 6 1.1.1.1 Moléculas implicadas en el proceso de apoptosis: efectores intracelulares. .......................................................................................... 7 1.1.1.2 Vía extrínseca ....................................................................................... 11 1.1.1.3 Vía intrínseca o mitocondrial ................................................................ 13 1.1.2 Necrosis programada ................................................................................ 14 1.2 Mieloma múltiple 16 1.2.1 Definición, incidencia y epidemiología .................................................... 16 1.2.2 Biología del mieloma múltiple ................................................................. 17 1.2.2.1 Estadios del mieloma múltiple .............................................................. 17 1.2.2.2 Inmunofenotipo ..................................................................................... 17 1.2.2.3 Alteraciones genéticas en el mieloma ................................................... 18 1.2.2.4 Microambiente medular en el mieloma ................................................ 18 1.2.3 Fisiopatología del mieloma múltiple ........................................................ 19 1.2.4 Farmacoterapia del mieloma múltiple humano ........................................ 19 1.2.5 CX-4945 (Silmitasertib) ........................................................................... 20 1.2.6 Inhibidores de mTOR ............................................................................... 22 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ................................................................. 23 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 24 3.1 Cultivos celulares 24 3.1.1 Materiales y medios de cultivo celulares .................................................. 24 3.1.2 Líneas celulares utilizadas ........................................................................ 24 3.1.3 Mantenimiento de cultivos celulares ........................................................ 24 3.1.4 Congelación y descongelación de líneas celulares ................................... 25 3.1.5 Aislamiento de células vivas mediante centrifugación en gradiente de densidad .................................................................................................. 26 3.2 Estudios de proliferación, citotoxicidad, apoptosis y necrosis celular 26 3.2.1 Materiales y reactivos para estudios de proliferación y citotoxicidad. ..... 26 3.2.2 Fármacos citotóxicos y citostáticos .......................................................... 27 3.2.3 Contaje y determinación de la viabilidad celular ..................................... 27 2 3.2.4 Determinación de la proliferación celular ................................................ 28 3.2.5 Citómetro de flujo ..................................................................................... 28 3.2.5.1 Análisis de la expresión de proteínas de membrana ............................. 29 3.2.5.2 Determinación simultánea del potencial mitocondrial (ΔΨm) y la translocación de fosfatidilserina. .......................................................... 30 3.3 Análisis de la expresión de la fragmentación del ADN mediante tinción nuclear con Hoechst 33342 31 3.4 Análisis de la expresión de proteínas 32 3.4.1 Materiales y reactivos ............................................................................... 32 3.4.1.1 Reactivos para la extracción e inmunoprecipitación de proteínas ........ 32 3.4.1.2 Materiales y reactivos para la electroforesis de proteínas y transferencia a membranas. ........................................................................................ 32 3.4.1.3 Anticuerpos y reactivos inmunoquímicos utilizados en Western-blot . 33 3.4.2 Métodos de análisis de proteínas por Western-Blot ................................. 34 3.4.2.1 Extracción y fraccionamiento de lisados celulares totales con detergentes ............................................................................................ 34 3.4.2.2 Separación de proteínas celulares mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS ........................................................................ 34 3.4.2.3 Transferencia de las proteínas a membranas de PVDF ........................ 35 3.4.2.4 Análisis de proteínas por inmunotransferencia ..................................... 35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................... 37 4.1 Estudio del mecanismo de apoptosis inducido por CX-4945. 37 4.1.1 Determinación de la IC50 del CX-4945 en líneas de mieloma múltiple .. 37 4.1.2 Efecto de CX-4945 en la apoptosis en las diferentes líneas celulares ...... 38 4.1.3 Efecto de los inhibidores de los diferentes tipos de muerte. .................... 40 4.2 Estudio del efecto de la sobreexpresión de Mcl-1 y Bcl-xL en mieloma en la sensibilidad de apoptosis 43 4.3 Implicación de las caspasas en la apoptosis inducida por CX-4945 45 4.3.1 Efecto de los inhibidores de caspasas sobre la apoptosis inducida por CX4945......................................................................................................... 45 4.3.2 Análisis de la activación de caspasas inducida por CX-4945 .................. 48 4.3.3 Análisis de la secuencia de activación de las caspasas inducidas por CX4945......................................................................................................... 50 4.4 Implicación de la vía extrínseca en la apoptosis inducida por CX4945 51 3 4.4.1 Análisis de la expresión de Apo2L/TRAIL y FasL inducida por CX-4945. ................................................................................................................. 51 4.4.2 Expresión de DR4, DR5, DcR1 y DcR2 en la membrana plasmática de las células de mieloma. ................................................................................. 52 4.4.3 Contribución de DR4 y DR5 a la señal apoptótica por Cx-4945. ............ 53 4.5 Análisis del uso potencial del CX-4945 en terapia combinada 54 5. CONCLUSIONES............................................................................................ 56 6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 57 4 1. INTRODUCCIÓN Las células de un organismo no viven indefinidamente y la duración de su vida depende del tipo celular. Hay células cuyo periodo de vida es largo, como las musculares y las neuronas, mientras que la vida de otras es efímera, como algunas células sanguíneas y epiteliales. El número de células en un organismo adulto permanece constante gracias a la existencia de un balance entre la pérdida, la renovación y la diferenciación. El recambio celular en los tejidos de un organismo se fundamenta en el mantenimiento de un equilibrio (homeostasis) entre la proliferación y la muerte celular a fin de garantizar la población adecuada en cada momento (Xiao-Fang Tian 2013). 1.1 Muerte celular La muerte celular es un proceso que está estrechamente relacionado no solo con el desarrollo fisiológico normal de los tejidos, sino también, con mecanismos de defensa de varios tipos de enfermedades. Según el comité de nomenclatura de muerte celular (NCCD, Nomenclature Committe on Cell Death) se habla de muerte celular cuando una célula ha perdido la integridad de membrana plasmática, cuando el núcleo se ha fragmentado o cuando los cuerpos apoptóticos han sido fagocitados (Kroemer G 2009). La muerte celular puede ser clasificada de acuerdo a sus características morfológicas (apoptosis, necrosis, muerte celular autofágica o muerte celular asociada con mitosis), de acuerdo a criterios enzimáticos (con o sin participación de nucleasas o de diferentes tipos de proteasas como caspasas, calpainas o catepsinas), de acuerdo a aspectos funcionales (muerte celular programada o accidental, fisiológica o patológica) o de acuerdo a características inmunológicas (inmunogénicas o no inmunogénicas). Es por ello, que el NCCD ha propuesto una clasificación y definición actualizada de las diferentes modalidades de muerte celular que se han descrito hasta el momento y que, brevemente, se describen a continuación (L Galluzzi 2012). - Apoptosis: muerte celular programada caracterizada por el redondeamiento de las células, la retracción de pseudópodos, la reducción del volumen celular y nuclear (pinosis), fragmentación nuclear y formación de cuerpos apoptóticos, sin la perdida de la integridad de la membrana plasmática. - Necrosis: muerte celular caracterizada por un aumento del volumen de los orgánulos y del citoplasma, moderada condensación de la cromatina y rotura de la membrana plasmática, con la consecuencia pérdida del contenido intracelular. 5 - Autofagia: es un tipo celular que ocurre en ausencia de condensación de la cromatina, pero que va acompañada de una vacuolización masiva autofágica del citoplasma. Otras modalidades de muerte-: - Catástrofe mitótica: muerte celular que ocurre durante o justamente después de una mitosis fallada. Se acompaña de alteraciones morfológicas como micronúcleo (cromosomas o fragmentos de cromosomas que no han sido bien repartidos entre las células hijas) o multinucleación (presencia de dos o más núcleos con tamaños heterogéneos, debido a una deficiente separación durante la citocinesis). - Cornificación: es una muerte celular programada, específica de la epidermis, morfológica y bioquímicamente diferente a la apoptosis. Este proceso permite la formación de corneocitos, que son queranocitos muertos con una mezcla de proteínas y lípidos necesarios para la resistencia mecánica, elasticidad y estabilidad estructural de la epidermis. - Anoikis: apoptosis inducida por la pérdida de adhesión al sustrato o a otras células. - Entosis: define una modalidad de muerte celular en la que una célula es internalizada por otra célula vecina, y posteriormente, desaparece mediante degradación lisosomal. - Partanatos: muerte celular particular con la participación de las enzimas poli-ADPribosa polimerasa (PARP), responsables del daño en DNA. - Piroptosis: esta forma de muerte ha sido descrita principalmente en macrófagos, los cuales presentan características morfológicas tanto de la apoptosis como de la necrosis. - Netosis: tipo de muerte celular llevada a cabo por neutrófilos y eosinófilos, los cuales en respuesta a varios estímulos, pueden ejercer funciones antiinfecciosas, a través de la generación de trampas extracelulares (NETs, neutrophil extracelular traps) que están compuestos por cromatina nuclear y proteínas, tanto nucleares como citoplasmáticas. Como se aprecia, existen muchos tipos de muerte celular, pero solo algunos de ellos tienen importancia desde el punto de vista farmacológico, a la hora de inducir muerte celular en células tumorales. Por lo que este proyecto, se centra fundamentalmente en los mecanismos de muerte celular por apoptosis y necrosis, específicamente necroptosis. 6 1.1.1 Apoptosis o muerte celular programada La muerte celular programada es el principal mecanismo de supresión tumoral, es un proceso de protección para eliminar células dañadas que pueden ser perjudiciales para el organismo. El término apoptosis proviene del griego antiguo apo-TOE-sis, que significa desprendimiento de las hojas del árbol en otoño. Kerr y Wylllie, en 1972, (Kerr J. F. R. 1972), retomaron el término y lo aplicaron a la pérdida de las células por los tejidos para la supervivencia del huésped. Se ha observado que este tipo de muerte celular es vital en la homeostasis tisular (Mueller 2003) porque cuando se altera, se produce enfermedades degenerativas como la enfermedad del Alzheimer, Huntington, daño isquémico, desórdenes autoinmunes y varios tipos de cáncer. La célula apoptótica sufre una serie de cambios morfológicos que definen el proceso (Figura 1.1). La adhesión celular y los contactos intercelulares disminuyen y se producen una pérdida de estructuras especializadas de la superficie celular. En la membrana plasmática, que inicialmente se mantiene integra, se producen cambios en la distribución de los fosfolípidos (externalización de la fosfatidilserina) y se forman protrusiones, proceso conocido como burbujeo. El volumen celular disminuye y el citoplasma se condensa. El núcleo se reduce y la cromatina se compacta, adquiriendo una distribución marginal alrededor de la envoltura nuclear, con agregación de poros nucleares y disolución focal de la lámina nuclear. Las proteínas del citoesqueleto se desensamblan y la función mitocondrial se reduce. Finalmente, la célula colapsa, produciéndose una escisión en múltiples estructuras, denominadas cuerpos apoptóticos, constituidos por partes del citoplasma y orgánulos rodeados de membrana plasmática. Todo este proceso ocurre sin liberación del contenido citoplasmático u orgánulos subcelulares al medio exterior ya que, a diferencia de la muerte celular Figura 1.1. Esquema representativo de dos vías de muerte, la necrosis y la apoptosis. 7 por necrosis, no se produce rotura de la membrana plasmática. En el ámbito fisiológico, los cuerpos apoptóticos son retirados del espacio extracelular por células fagocitarias, y por tanto, no cursa ningún proceso de respuesta a daño celular o inflamación (Savill J 2000). La apoptosis puede activarse a través de dos vías de señalización: - La vía intrínseca o mitocondrial, se desencadena en respuesta a una amplia variedad de estímulos de muerte que son generados dentro de la célula, como activación de oncogenes, daño del DNA, niveles altos de especies reactivas de oxígeno (ROS) o infecciones virales (Conradt B 2005). La mitocondria es el principal orgánulo implicado en esta vía apoptótica. - La vía extrínseca es mediada por la unión ligandos mortales, como FasL, Apo2L/TRAIL, TNF-α, a sus receptores específicos en la membrana plasmática, como Fas, TRAILR o TNFR, respectivamente. Ambas vías de activación de la apoptosis eventualmente convergen en la activación de enzimas proteolíticas llamadas caspasas que median rápidamente el desmantelamiento de las proteínas celulares y la estructura de la célula. 1.1.1.1 Moléculas implicadas en el proceso de apoptosis: efectores intracelulares. La apoptosis es un proceso controlado estrictamente y regulado por la interacción de un gran número de proteínas, entre las que se distinguen dos grupos o familias ampliamente estudiadas: las proteínas de la familia Bcl-2 (anti-apoptóticas, pro-apoptóticas y “solo BH-3”) y las caspasas. Familia de proteínas Bcl-2 Los miembros de esta familia tienen actividades opuestas que median la muerte celular y también están implicados en otros procesos como tumorigénesis y respuesta celular a la terapia antitumoral. En dependencia de cómo afecta al proceso de muerte celular, se describen dos tipos de proteínas: anti-apoptóticas, si lo bloquean (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-B), y pro-apoptóticas, entre las que se incluyen Bax, Bak y también aquellas que contienen solo el dominio BH3 (Figura 1.2). Una característica estructural común a los miembros de esta familia es la presencia de regiones homólogas a la proteína Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) denominadas BH (Bcl-2 Homology; 8 BH1-BH4). Los dominios BH carecen de actividad enzimática y están implicadas en los procesos de asociación de cadenas polipeptídicas. Las proteínas anti-apoptóticas contienen los cuatro dominios BH, excepto Mcl-1, que carece del dominio BH4. Los dominios BH1, BH2, y BH3 forman una cavidad hidrofóbica que permite la interacción con las proteínas solo-BH3. Además, poseen un dominio hidrofóbico C-terminal que facilita su inserción en la membrana externa mitocondrial, donde se encuentran generalmente, aunque también se pueden encontrar en el citosol o unidas a la membrana del retículo endoplasmático. Cuando se sobreexpresan, cada una de estas proteínas protegen a las células contra una variedad de estímulos apoptóticos. Por otro lado, las proteínas pro-apoptóticas se dividen en dos subtipos: las multidominio o efectoras y las “solo BH3”. Las proteínas multidominio (Bax, Bak), poseen los dominios BH1, BH2 y BH3, y están presentes en la mayoría de los tejidos. En las células normales, estas proteínas existen como monómeros inactivos, Bax en el citosol y Bak asociado en la membrana externa mitocondrial. Durante la apoptosis, Bax es translocada a la membrana, y ambas sufren cambios conformacionales que les permiten oligomerizar y formar el poro mitocondrial, lo cual desencadena diferentes acontecimientos a nivel mitocondrial y celular. Las proteínas “solo BH3”, como su nombre índica, se caracterizan por poseer solo el dominio BH3, el cual es necesario y suficiente para inducir apoptosis (Shibue T 2006). Las proteínas BH3 juegan un papel crucial como sensores del estrés celular y su activación constituye la primera diana del daño mitocondrial. Dependiendo de las características moleculares peculiares de sus respectivos dominios BH3, estas proteinas podrían interaccionar tanto como Mcl-1, Bcl-2 o BclxL (Bim y Puma), inactivando su acción protectora, como con Bax y Bak (todas ellas), induciendo su oligomerización. Figura 1.2. Familia de las proteínas Bcl-2. Se subdividen en tres grupos: antia-poptóticas, pro-apoptóticas y “sólo BH3”.Modificación de (Roset Ramon 2007). 15 que contiene dominios DD y tiene actividad de tirosina quinasa (Galluzzi Lorenzo 2009). Ésta se transloca a la mitocondria interfiriendo con ANT (Adenine nucleotide translocase), componente del megacanal mitocondrial, lo que conlleva una disfunción mitocondrial, un incremento en la producción de ROS (reactive oxygen species) y una activación de la quinasa JNK (C-Jun Nterminal kinase). Aunque el orden de las etapas posteriores a la activación de RIP-1 no se conoce bien, se han descrito varias alteraciones como una activación de la fosfolipasa A2, de lipooxigenasas y de la esfingomielasa ácida. Otro tipo de muerte programada es la mediada por PARP-1 como parte de la respuesta al daño producido en el DNA, por falta de nutrientes o energía, o en respuesta a una infección por patógenos. Esta vía puede desarrollar una función complementaria o reforzar a la apoptosis. La enzima PARP-1 participa en el mantenimiento de la estabilidad genómica y se activa cuando se produce una rotura en una cadena de DNA. Para reparar dicha mella, esta enzima recluta a factores encargados de la reparación del DNA uniendo unidades de ADP-ribosa a proteínas asociadas a la cromatina. Aunque el mecanismo molecular no se conoce demasiado, si la reparación falla, los efectos finales que conducen a este tipo de muerte celular se pueden resumir en la activación de dos rutas: una produce un colapso energético y la otra, a través de RIP y JNK, a una disfunción mitocondrial y liberación del factor AIF. Figura 1.6. Representación de la muerte celular por necrosis. 16 1.2 Mieloma múltiple 1.2.1 Definición, incidencia y epidemiología El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia hematológica que afecta a un clon de células plasmáticas diferenciadas las cuales se expanden y se infiltran en la médula ósea, conduciendo a citopenias, reabsorción ósea y producción, en la mayora de los casos, de una inmunoglobulina monoclonal característica. El MM cursa de forma heterogénea, por lo cual algunos pacientes mueren en algunas semanas tras su diagnóstico, mientras que otros sobreviven durante más de 10 años (Fonseca R 2009). El MM es la segunda neoplasia hematológica más frecuente, después del linfoma no Hodgkin. Constituye, aproximadamente, el 10 % de todas las neoplasias hematológicas, y el 1 % de todos los canceres y causa el 2 % de las muertes por cáncer. En Europa tiene una incidencia de 4,56,0/100000/año con una edad media de diagnóstico entre 63 y 70 años, y con una mortalidad de 4,1/100000/año (Rajkumar 2011). Todavía no se conoce la etiología del MM, pero se cree que entre los factores de riesgo podrían ser: estimulación inmune crónica, desórdenes autoinmunes, exposiciones prolongadas a radiaciones ionizantes, pesticidas, herbicidas y dioxinas. El mieloma múltiple se compone de células plasmáticas diferenciadas, con alteraciones génicas y generalmente derivadas de un solo clon inicial, las cuales comienzan a proliferar de modo descontrolado acumulándose en la medula ósea. Estas células malignas reciben el nombre de mielomatosas, cuya característica principal es la producción y secreción de una proteína monoclonal a la sangre denominada proteína M, para-proteína o proteína en pico. Se trata de un componente o fragmento Fab de una inmunoglobulina con una secuencia peptídica y estructura proteína anormal. Las células mielomatosas constituyen tumores localizados en la médula ósea, los plasmocitomas, los cuales pueden ser únicos o más frecuentemente múltiples (de ahí el nombre de mieloma múltiple). Además de la médula ósea, también pueden afectar al hueso o incluso desarrollarse fuera de él, pasando a sangre y dando lugar a una leucemia de células plasmáticas. 17 1.2.2 Biología del mieloma múltiple 1.2.2.1 Estadios del mieloma múltiple El mieloma múltiple surge a partir de una célula B normal de un centro germinal. Al menos, el 30-50% del mieloma múltiple maligno parece surgir de la gammapatía monoclonal benigna de significado incierto (GMSI o MGUs) desde el cual evolucionan a mieloma medular, pudiendo pasar o no por un estadio de mieloma “latente” asintomático. Inicialmente, el mieloma múltiple se limita a la médula ósea (intramedular), pero con el tiempo el tumor puede adquirir la capacidad de crecer en lugares extramedulares (tales como sangre, líquido pleural y la piel). Alguno de estos múltiples mielomas extramedulares puede establecer líneas celulares inmortalizadas in vitro (Figura 1.7). La transición de GMSI a mieloma múltiple intramedular se manifiesta por un aumento del número de células de mieloma múltiple en múltiples focos, angiogénesis asociado y destrucción ósea osteolítica. 1.2.2.2 Inmunofenotipo Las células mielomatosas presentan un inmunofenotipo variable de unos pacientes a otros, que generalmente difieren del de las células plasmáticas normales. Durante el proceso de diferenciación a células tumorales, las células plasmáticas pierden algunos antígenos y ganan otros. Respecto a las células plasmáticas normales, las células tumorales ganan la expresión de CD138 y CD56, aunque se ha observado pérdida de CD56, asociada a un mal pronóstico de la enfermedad. Por otra parte, las células del mieloma múltiple pierden la expresión de CD19 y Figura 1.7. Estadios del mieloma múltiple. Modificación de (Leif 2002) 18 expresan menor proporción de CD38 que las células plasmáticas normales. La expresión de CD45, un marcador específico de linfocitos, es muy heterogéneo, porque aunque la mayoría de las células tumorales lo pierden, hay un porcentaje de pacientes que lo presentan. Tras lo expuesto, podríamos definir un patrón CD138(-), CD38(++), CD56(-), CD19(+), CD45(-) para las células plasmáticas normales y un patrón de CD138(+), CD38(+), CD56(+), CD19(-), CD45(+/-) para las células mielomatosas. Por lo tanto, la gran variabilidad en cuanto a la expresión de antígenos de superficie, supone una gran dificultad a la hora de caracterizar la enfermedad. 1.2.2.3 Alteraciones genéticas en el mieloma El aumento de las alteraciones cromosómicas con la progresión de la enfermedad parece indicar que el paso de la gammapatía de significado incierto (MGUS) a mieloma múltiple y a leucemia de células plasmáticas requiere mutaciones adicionales que faciliten la proliferación y la supervivencia. Para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas es muy importante el estudio de estas mutaciones y de las vías de señalización alteradas. Algunas de estas mutaciones son: mutaciones en Ras (proteínas G pequeñas asociadas a membrana que se unen a nucleótidos de guanina (GTP y GDP) y poseen actividad GTPasa), sobreexpresión de Bcl-2, mutaciones e la proteína del retinoblastoma (Rb) y mutación en un gen de resistencia a múltiples drogas (MDR). 1.2.2.4 Microambiente medular en el mieloma Las células del mieloma múltiple establecen un gran número de interacciones en la médula ósea. En este microambiente las células interaccionan con las proteínas de la matriz extracelular y las células del estroma de la médula ósea, lo cual induce proliferación, resistencia a apoptosis y migración de las células MM. Además, éstas interacciones son cruciales en la resistencia a drogas, lo que se conoce como “resistencia a fármacos mediada por adhesión celular” (Bommert K 2006). Tras la adhesión de las células de mieloma al estroma de la médula ósea, se induce secreción de una serie de citoquinas por las células del estroma, que son las siguientes: interleukina-1β (IL1β), interleukina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral β (TNF-β). La más importante de todas 19 ellas es la IL-6, la cual regula la proliferación y la supervivencia de las células del MM e inhiben su apoptosis. 1.2.3 Fisiopatología del mieloma múltiple El crecimiento descontrolado de células mielomatosas trae aparejado la siguiente fisiopatología: destrucción ósea (lesiones osteolíticas y osteoporosis), efectos asociados a esta destrucción (hipercalcemia, fracturas óseas), insuficiencia de la médula ósea (anemia, leucopenia, trombocitopenia, etc), hipervolemia e hiperviscosidad, supresión de la producción de inmunoglobulinas normales, insuficiencia renal y afectación secundarias a otros órganos como hígado, tejido nervioso (Brian 2006). A veces la enfermedad puede permanecer asintomática durante muchos años siendo el dolor óseo el cuadro de presentación más común. 1.2.4 Farmacoterapia del mieloma múltiple humano Los objetivos fundamentales del tratamiento son mejorar la calidad de vida y aumentar la supervivencia. Por muchos años, el melfalán (introducido en 1962) y la prednisona han sido los principales quimioterapéuticos usados para combatir el mieloma multiple, seguido del transplante de células madre, el cual ha estado reservado para un número reducido de pacientes. El tratamiento de la enfermedad ha evolucionado rápidamente en las últimas décadas con el desarrollo y utilización de nuevos fármacos, como la talidomida, lenalidomida y bortezomib (Laubach JP 2010). La talidomida fue empleada en el tratamiento de las nauseas del embarazo durante los años 50, y fue posteriormente retirada del mercado en 1961 por sus efectos teratógenos. Posteriormente se estudio sus efectos anti-angiogénicos, confirmando efectos beneficiosos en pacientes con recaída y mieloma refractario, siendo actualmente como terapia estándar para estos casos (García-Sanz 2006) . Se desconoce el mecanismo de acción exacto de la talidomida, pero se propone que inhibe la síntesis del TNF-α, previene los daños causados en el DNA por radicales libres, suprime la angiogénesis, estimula la inmunidad celular y altera la expresión de moléculas de adhesión. El bortezomib fue el primer inhibidor del proteasoma evaluado en ensayos clínicos, siendo aprobado por la FDA, para el tratamiento de pacientes con mieloma, en 2003. El bortezomib es un 20 ácido dipeptidil borónico que inhibe la subunidad 26S del proteasoma de forma reversible y especifica. En la actualidad existen varios tratamientos alternativos para el MM. Se usan unos u otros en función del estadio del tumor en el momento del diagnóstico, además de otros factores como la edad, indicadores de pronóstico y patologías concominantes.. 1.2.5 CX-4945 (Silmitasertib) CX-4945 es la primera molécula, disponible por vía oral, que inhibe a la proteína CK2 (casein kinase 2) en ensayos clínicos para el cáncer (Figura 1.8). CX-4945 fue optimizado como un inhibidor competitivo de la holoenzima CK2 (Ki=0,38 nM) (Pierre F 2011). Este potente inhibidor ha sido recientemente introducido en la fase I clínica en pacientes con canceres sólidos avanzados y en pacientes con mieloma múltiple (Buontempo F 2013). La protein kinasa CK2, es una proteína Serin / Treonina quinasa generalmente presente en las células como una enzima tetramérica compuesta de dos subunidades catalíticas (α y/o α ') y dos (β) subunidades reguladoras (Son YH 2013) Es una proteína altamente conservada, constitutivamente activa, independiente de ningún segundo mensajero ni eventos de fosforilación (Borgo C 2013). Tiene la capacidad de fosforilar a un número notable de sustratos. Está implicada en varios procesos celulares, tales como ciclo celular, la expresión génica, la síntesis de proteínas, la transducción de señales y el metabolismo; sin embargo, su principal función se considera que es favorecer la supervivencia e inhibir la apoptosis. Esta hipótesis se basa en observación de que muchos sustratos de CK2 son proteínas implicadas en la muerte celular y en la supervivencia, y lo que es más importante, que la reducción de la actividad o expresión CK2 (inducida mediante tratamiento de células con inhibidores específicos o por la tecnología de interferencia de ARN, respectivamente) provoca la muerte celular, principalmente mediante la apoptosis (Zanin Sofia 2012). Figura 1.8. Estructura química del CX-4945: 5 - [(3-clorofenil) amino]-benzo [c] -2,6-naftiridina-8carboxílico. Modificación de (Ku Jeong Min 2013) 21 De acuerdo con la función anti-apoptótica de la CK2, las células tumorales, que se caracterizan por una rápida proliferación y una apoptosis defectuosa, expresan altos niveles de CK2 (Quotti Tubi Laura 2013). En este sentido, una propiedad peculiar de CK2 es la capacidad para proteger las células de la apoptosis. Se cree que esta acción depende de varios mecanismos (Figura 1.9) - CK2 interfiere en la estabilidad y funcionalidad de las proteínas supresoras de tumores PML y PTEN mediante fosforilación de residuos de serina críticos sobre estas proteínas haciéndolas menos activas: en el caso de PML mediante el aumento de la degradación mediada por proteasoma y en el caso de PTEN a través de la estabilización de una forma menos activa de la molécula. - CK2 fosforila a moléculas anti-apoptóticas contribuyendo a la protección de la apoptosis. La fosforilación de CK2 a BID inhibe su procesamiento por caspasa-8, y por lo tanto, de la muerte celular. - CK2 regula positivamente cascadas promotoras del crecimiento, tales como la PI3K/AKT, el NF-kappa B, la vía JAK / STAT y las vías de señalización β-catenina/Wnt con el resultado de dirigir el destino de la célula hacia supervivencia y en contra la muerte celular programada. Figura 1.9. Implicación de la proteína quinasa CK2 en las vías de señalización asociadas a tumores. Modificación de (Piazza F1 2012) 22 CX-4945 tiene un efecto pro-apoptótico en las células cancerígenas humanas y el tratamiento con este inhibidor actúa de las siguientes formas: - La actividad anti-proliferativo de CX-4945 se correlaciona con mRNA y los niveles de proteínas de CK2α, pero no con la subunidad catalítica CK2α´,ni con la subunidad reguladora CK2β ni con el estado mutacional de PI3K/Akt o PTEN. - CX-4945 inhibe la señal de PI3K/Akt directamente bloqueando la fosforilación de Akt en la Serina 129 por CK2 en lugar de a través de la activación de PTEN. - El tratamiento con CX-4945 causa reducción de fosforilación de p21 (T145) aumentando los niveles totales de p21 y p27, e induciendo la actividad de la caspasas-3 y -7. - EL tratamiento con CX-4945 induce arresto del ciclo celular. 1.2.6 Inhibidores de mTOR La quinasa mTOR (mammalian Target of Rapamycin) es clave en la regulación del crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia. Numerosos estudios han demostrado que el bloqueo de mTOR reduce el crecimiento tumoral. La vía de señalización (PI3K)/AKT/mTOR está frecuentemente activada en cánceres humanos por lo que mTOR se ha validado como diana terapéutica. mTOR es la subunidad catalítica de dos complejos multiméricos llamados mTORC1 y mTORC2, los cuales regulan el crecimiento celular, metabolismo, proliferación y supervivencia (de la Puente Pilar 2014). 23 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS El trabajo recogido en este Máster pretende contribuir a una mejor caracterización de los mecanismos mediante los cuales, nuevos fármacos (CX-4945), inducen apoptosis en líneas celulares del mieloma múltiple (MM), una neoplasia hematológica que afecta a las células B plasmáticas. Aunque en los últimos años se han introducido nuevos agentes quimioterapéuticos para tratar este tipo de cáncer, la esperanza de vida habitual se sitúa entre los 3 y 5 años, por lo que es urgente el identificar nuevos fármacos dirigidos a dianas moleculares definidas, que mejoren el tratamiento de esta enfermedad y mejore la esperanza de vida. Nuestro grupo de investigación comenzó sus estudios en el campo de la apoptosis en 1994, y tiene una amplia experiencia en el estudio de este fenómeno celular. Se han estudiado diversos fármacos antitumorales capaces de inducir apoptosis en celulares tumorales, principalmente de células procedentes de neoplasias hematológicas como leucemias y mieloma múltiple, aunque también en células de tumores sólidos como colon, páncreas y mama. Uno de estos fármacos podría ser el inhibidor de la serin/treonin quinasa CK2, CX-4945, que se encuentra en ensayos clínicos de fase I. La enzima CK2 es una quinasa constitutivamente activa en las células de mieloma múltiple, aunque también puede inducirse por señales de estrés. CK2 fosforila a varios factores de transcripción como NF-kB, c-myc y STAT3 que están implicados en la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. En el presente trabajo los objetivos que nos marcamos para este nuevo fármaco: - Evaluar la capacidad de inducción de muerte celular tras el tratamiento con CX-4945 en células del mieloma múltiple (MM). - Caracterizar el mecanismo de apoptosis inducido por el CX-4945 en células de MM. - Estudiar el efecto que la sobre-expresión de Mcl-1 y Bcl-xL tiene en la apoptosis inducida por el inhibidor de CK2 en células de mieloma múltiple - Caracterizar la fase de ejecución del mecanismo de la apoptosis causado por CX-4945 y de dependencia de la acción de las caspasas. - Evaluar la contribución de los receptores mortales a la apoptosis inducida por CX-4945 en mieloma múltiple - Evaluar la combinación de CX-4945 con otros fármacos, como el inhibidor de mTOR, para mejorar la capacidad de inducción de apoptosis en células del mieloma múltiple. 24 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Cultivos celulares 3.1.1 Materiales y medios de cultivo celulares Durante este proyecto de Máster se empleó para el mantenimiento de las células en suspensión el medio de cultivo RPMI 1640, de Gibco™, Invitrogen (Barcelona, España). Este medio se suplementó con 10 % se suero fetal bovino (SFB) de Sigma™ Aldrich (Madrid, España), además se le adicionó otros productos como L-glutamina 2 mM de Gibco y antibióticos (Penicilina 100 U/ml y Estreptomicina 100 µg/ml) de PAN ™, Biotech. Los frascos de cultivo empleados, así como el resto del material plástico estéril (placas de 6, 12, 24 o 96 pocillos, tubos Falcon, pipetas, etc) procedieron de TPP, Suiza. Los tubos criogénicos fueron de Nunc, Dinamárca. El dimetilsulfóxido (DMSO) procedió de Sigma. Para esterilizar el material se utilizó el autoclave de Autester, Mod 4376, Selecta (España). Las células fueron cultivadas en un incubador de CO2 termostatizado de Heraeus Cell (Alemania). 3.1.2 Líneas celulares utilizadas Las líneas celulares utilizadas en este trabajo han sido: RPMI 8226, U266 (clon B1), MM.1S, NCI-H929. La línea original RPMI 8226 fue amablemente proporcionada por la Dra. Martine Amiot (INSERM U463, Nantes, Francia), las células MM.1S por el Dr. Atanasio Pandiella (Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca, España), las líneas U266 y NCI-H929 por el Dr. Antonio Campos Caro (Hospital Puerta del Mar, Cádiz, España). Se utilizaron también líneas celulares derivadas de la línea RPMI obtenidas en nuestro laboratorio, las cuales son RPMI/vector pLZR, RPMI/Mcl-1, RPMI/Bcl-xL. 3.1.3 Mantenimiento de cultivos celulares Todas las líneas celulares se cultivaron rutinariamente en frascos de cultivo de 25 cm2 (volumen máximo de células en suspensión 15 ml) ó 75 cm2 (volumen máximo de células en suspensión 40 ml) con tapón de filtro. Estas células de mieloma se sembraron a una densidad de mínima de 3 x 105 cél/ml y se cultivaron en medio completo con 10% SFB. Las células se cultivaron en un incubador termostatizado, a 37 ºC, en aire saturado de humedad y con un 5% de CO2. A los 3 o 4 días de cultivo, alcanzadas densidades entre 8-12 x 105 31 La existencia de sondas que emiten a longitudes de onda diferentes, tanto para analizar la exposición de PS como el potencial de membrana mitocondrial, nos permite medir ambos parámetros simultáneamente en una misma célula sin que interfieran entre ellas. Para realizar este doble marcaje, se prepara una mezcla con 100 μl de ABB (Annexin Binding Buffer), 0,5 μl de TMRE y 1 μl de Anexina DY634. El volumen de cada componente de la mezcla es por cada muestra a analizar. Las células (6x105 cel/ml), tratadas y control, se someten a una centrifugación a 3500 r.p.m durante 1 minuto para resuspender posteriormente con 100 μl de la mezcla el precipitado obtenido. Este volumen se transvasa a tubos de citómetro para incubarlos durante 15 minutos a 37 ºC y en oscuridad, favoreciendo así la entrada de la sonda TMRE a las mitocondrias y la unión de la Anexina a la fosfatidilserina translocada en la membrana. Pasado este tiempo de incubación, las muestras se diluyen con 200 μl de tampón ABB y se analizan las señales del TMRE y Anexina DY634 en los canales FL2 y FL4 respectivamente, de un citómetro de flujo. Se consideran células apoptóticas aquellas que son Anexina DY634 positivo y TMRE negativo. Los resultados obtenidos por citometría se analizaron utilizando programas informáticos Cell Quest y Weasel. 3.3 Análisis de la expresión de la fragmentación del ADN mediante tinción nuclear con Hoechst 33342 Durante la muerte celular programada se produce una compactación y fragmentación del material celular, que puede ser fácilmente detectada usando colorantes que tiñen específicamente la cromatina nuclear. El reactivo utilizado para la visualización de la condensación de la cromatina y la fragmentación del núcleo, aspectos indicadores de la apoptosis, fue la sonda Hoechst 33342. Inicialmente se prepararon cubreobjetos cubiertos de polilisina según el siguiente protocolo: se eligieron cubreobjetos redondos de 13 mm de diámetro, primero se lavaron en etanol y se dejaron secar al aire. Una vez secos, se les añadió a cada cubre 150 μl de una solución 0.1% (p/v) de poli-LLys en H2O y se incubaron durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo, con una micropipeta se eliminó todo el exceso de polilisina, para una posterior utilización, y se lavaron los cubreobjetos en agua destilada. Se dejaron secar con la cara de polilisina hacia arriba y se guardaron en una placa de 24 pocillos hasta su utilización. 32 Tras los correspondientes tratamientos, las células (15x105) se centrifugaron a 1500 r.p.m durante 5 minutos, se resuspendieron en 600 μl de PBS y se volvieron a centrifugar a la misma velocidad. En este caso, se resuspenden con 300 μl de paraformaldehído 4% y se dejan durante 15 minutos a 4 ºC. Pasado este tiempo, se centrifuga a 5000 r.p.m durante 2 minutos y se resuspenden con 500 μl de PBS. Esta solución de células fijadas se añade sobre los cubreobjetos tratados con polilisina presentes en la placa de 24 pocillos. Para favorecer la adhesión de las células a los cubreobjetos, la placa se centrifuga a 1200 r.p.m durante 5 minutos. Se elimina la solución sobrante de los pocillos por aspiración. Se preparó una mezcla de Hoechst 33342 diluido en Mowiol a una concentración de 5 μg/mg y se colocó una gota de esta mezcla en cada portaobjeto, sobre los cuales se colocaron los cubres ya secos con la cara tratada hacia abajo. Finalmente, se dejaron secar durante 12-24 horas, y se conservaron a 4 ºC hasta su análisis. Las preparaciones fueron visualizadas en un microscopio de fluorescencia (E600/E400, Nikon) provisto de un equipo de fotografía digital (DXM1200F, Nikon) y se analizaron con el programa de fotografía Nikon ACT-1. 3.4 Análisis de la expresión de proteínas 3.4.1 Materiales y reactivos 3.4.1.1 Reactivos para la extracción e inmunoprecipitación de proteínas Para la obtención de proteínas de extractos celulares se utilizaron los siguientes productos: Triton X-100, Tris/HCl, EDTA, ortovanadato sódico (Na3VO4), pirofosfato sódico (Na2P2O5), fluoruro de fenilmetilsulfonio (PMSF), fluoruro sódico (NaF), leupeptina, β-mercaptoetanol, azul de bromofenol procedentes de Sigma (Madrid, España). El cloruro de sodio (NaCl) y el dodecilsulfato de sodio (SDS) fueron proporcionados por Merck y el glicerol por Scharlau. El cóctel de inhibidores de proteasas procedió de Roche. 3.4.1.2 Materiales y reactivos para la electroforesis de proteínas y transferencia a membranas. Para la electroforesis de proteínas se emplearon los siguientes productos: persulfato amónico (APS) procedente de Serva (Heilderberg, Alemania), solución 30% acrilamida/bisacrilamida, 33 N,N,N,N´-tetrametiletilendiamina (TEMED) y rojo Ponceau procedieron de Sigma y el marcador de peso molecular coloreado “Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder” fue suministrado por Thermo Scientific. Las cantidades utilizadas de cada producto para la elaboración de un gel al 14% de poliacrilamida son mostradas en la tabla 3.2. Resolving (gel inferior) Stacking (gel superior) Acrilamida/Bisacrilamida 2,3 ml 325 μl 1.5M Tris-HCl pH 8.8 1,25 ml ------ 0.5M Tris-HCl pH 6.8 ------ 630 μl Agua destilada 1,37 ml 1,5 ml 10% SDS 50 μl 25 μl Persulfato sódico (APS) 100 μl 100 μl (TEMED) 10 μl 10 μl En la transferencia de proteínas a membranas se utilizaron: membranas de PVDF (HybondP) y papel adsorbente (Amersham Hybond blotting paper) que fueron proporcionadas por GE Healthcare, metanol (grado HPLC) procedente de Panreac y Tween 20 y glicina obtenidos de Sigma. 3.4.1.3 Anticuerpos y reactivos inmunoquímicos utilizados en Westernblot La Tabla 3.3 contiene la información referente a los anticuerpos empleados en la inmunotransferencia (Western Blot). Anticuerpo Tipo, Especie, Origen Dilución Proveedor Caspasa 3 Pc, conejo 1/1000 Cell Signaling Caspasa 3 activa Pc, conejo 1/1000 Cell signaling Caspasa 6 Mc, conejo 1/1000 Cell signaling Caspasa 8 Mc, ratón, clon 5F7 1/500 MBL Caspasa 9 Mc, ratón 1/1000 MBL XIAP Mc, ratón, clon 28 1/250 BD Biosciences Bid Pc, cabra, AF860 1/1000 R&D Systems FasL Ratón 1/1000 BD Biosciences TRAIL Ratón 1/1000 BD Biosciences β-actina Mc, ratón, clon AC-15 1/10000 Sigma 34 Los anticuerpos secundarios dirigidos contra las IgGs de conejo, ratón o cabra, marcados con fosfatasa alcalina o con peroxidasa, procedieron de Sigma (Madrid, España) y se usaron una dilución 1:10000. Los reactivos utilizados para el revelado por quimioluminiscencia (ECL) fueron sustrato quimioluminiscente para la detección de HRP procedente de Thermo Scientific y KPN. Mientras que los films usados para dicho revelado fue Hyperfilm ECL, de GE Healthcare. Tanto el líquido revelador como fijador procedió de Sigma. 3.4.2 Métodos de análisis de proteínas por Western-Blot 3.4.2.1 Extracción y fraccionamiento de lisados celulares totales con detergentes Tras someter a las células a diversos tratamientos, se tomaron 7x105 células en microtubos y se centrifugaron a 1500 r.p.m durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el precipitado con 1 ml de PBS y se sometió de nuevo a una centrifugación a 4500 r.p.m durante 1 minuto. Tras esta centrifugación, el precipitado obtenido fue resuspendido con 20 μl de solución de lisis 1x y se incubaron durante 20 minutos en hielo. Esta solución de lisis está compuesta por: Tritón X-100 al 1% (v/v), Tris/HCl 1M pH 7.6, EDTA 0.5M, ortovanadato sódico 0.5M, pirofosfato sódico 0.5M, fluoruro de sodio 1M, cloruro de sodio 2M y glicerol 10%. Pasado este tiempo de incubación, se centrifugó de nuevo a 10000 r.p.m durante 10 minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante, al cual se le añadió solución de carga concentrado 3x, con la siguiente composición: Tris/HCl 150mM pH7.4, SDS 3%, molibdato de sodio 0.3mM, pirofosfato sódico 30 mM, fluoruro de sodio 30mM, glicerol 30% (v/v), β-mercaptoetanol 30% (v/v) y azul de bromofenol 0.06% (v/v). Finalmente los lisados celulares se calentaron a 100 ºC en un baño seco (Selecta) durante 5 minutos y se guardaron a -20 ºC hasta su utilización. 3.4.2.2 Separación de proteínas celulares mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS La separación de proteínas celulares en función de su peso molecular se realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida que contenían SDS al 0.1%. El porcentaje de poliacrilamida usado durante este trabajo fue de 14% (Tabla 3.2). Las electroforesis se realizaron en cubetas de electroforesis de BioRad. Tanto los geles como el tampón de electroforeses (buffer running) (Tris, Glicina y SDS pH 8,6) fueron hechos en el laboratorio. 35 Las muestras de lisados se calentaron a 100 ºC durante 5 minutos, se centrifugaron a 10000 r.p.m durante 30 segundos y se cargaron en los pocillos del gel (10 μl/pocillo), también se cargó en un pocillo 8 μl marcador de peso molecular. La electroforesis se llevó a cabo con un voltaje de 180V, 20 mA/gel, durante 2 horas, de forma continua. 3.4.2.3 Transferencia de las proteínas a membranas de PVDF Las proteínas separadas en el gel se transfirieron a una membrana de PVDF, previamente activada en metanol, utilizando un tampón de transferencia compuesto por: Tris/HCl 48 mM pH 8.3, glicina 39 mM, SDS 0.037% y metanol 20 % (v/v). La trasferencia se realizó en un equipo de transferencia semiseca de BIO-RAD a 20 V y 400 mA durante 2 horas. La eficacia de la transferencia se verificó tiñendo la membrana con rojo Ponceau. 3.4.2.4 Análisis de proteínas por inmunotransferencia Las proteínas celulares fijadas en las membranas de nitrocelulosa se analizaron con la ayuda de anticuerpos específicos (Tabla 3.3), y los pesos moleculares relativos a las proteínas se calcularon en relación al marcador de peso molecular estándar coloreado utilizado en la electroforesis. Tras la tinción con rojo de Ponceau, la membrana de PVDF se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% (w/v), disuelta en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitación constante. Una vez bloqueada, se llevó a cabo tres lavados consecutivos y en agitación, durante 10 minutos cada uno, con una solución de lavado denominada Tampón B que contenía disueltos en PBS pH 7.4, Tween 20 0.1% y timerosal (1g/l). Posteriormente, para detectar la proteína deseada, se incubó durante toda la noche en la cámara fría y en agitación, con el anticuerpo primario específico. Para los anticuerpos primarios se preparó una solución de Anticuerpo que contenía PBSTween, Acida sódica al 0,05% y BSA 5%, en la que se añadió la cantidad de anticuerpo según su factor de dilución. Finalizada la incubación, la membrana se sometió a dos lavados consecutivos, en agitación, durante 10 minutos con Tampón B. Tras los lavados, se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa (diluido en tampón B con un 2% de leche desnatada en polvo) durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitación suave. La concentración utilizada 36 del anticuerpo secundario fue 0.2 μg/ml. Finalmente se retiró la solución de anticuerpo y se lavó la membrana 3 veces durante 10 minutos con tampón B. Después haber lavado correctamente para evitar la aparición de fondo oscuro, la membrana se incubó durante 5 minutos, bien con una solución de luminol, específica para los anticuerpos secundarios con HRP (peroxidasa de rábano) o bien con sustrato específico para los anticuerpos con PA (fosfatasa alcalina). Tras la incubación, la membrana se transfirió a una funda de plástico transparente encajada dentro de un cassette de revelado radiológico, eliminando por presión el exceso de mezcla de revelado y las posibles burbujas formadas. En un cuarto oscuro, con iluminación para revelado fotográfico, se colocó una película radiográfica Hyperfilm sobre la funda que contenía la membrana, y se expuso durante un tiempo determinado, entre 5 a 15 minutos, que varió dependiendo del anticuerpo utilizado. Pasado este tiempo, el film se reveló mediante inmersión seriada en el líquido revelador, agua destilada y liquido fijador. La preparación de estos líquidos se realizó según las instrucciones del fabricante. Tras el revelado las películas se dejaron secar al aire. 37 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Estudio del mecanismo de apoptosis inducido por CX-4945. En este primer apartado se caracterizó el efecto de CX-4945 en líneas celulares del mieloma múltiple. En concreto, se utilizaron las línea celulares NCI-H929, MM.1S, RPMI 8226 y U266. 4.1.1 Determinación de la IC50 del CX-4945 en líneas de mieloma múltiple Se realizaron ensayos de dosis-respuesta durante 24h, mediante el método de MTT (apartado 3.2.4). 010 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 MM.1S U266 NCI-H929 RPMI 8266 CX-4945, M Células viables (% respecto al control) Como se aprecia en la figura 4.1, el CX-4945 indujo una clara reducción de la proliferación celular en todas las líneas, siendo mucho más drástica en la línea celular MM.1S, por lo que esta fue la más sensible con una concentración inhibitoria del 50 % de la proliferación (IC50) de 2,17 μM de CX-4945 a las 24h, seguido de la línea NCI-H929, con una IC50 14,5 μM del fármaco. Las más resistentes fueron las líneas celulares RPMI 8266 y U266 con un IC50 de 35 μM y 40 μM de CX4945, respectivamente. Este fármaco, en comparación con otros utilizados en el tratamiento del mieloma múltiple como Sorafenib (inhibidor de la quinasa Raf) y BMS-214662 (inhibidor de farnesil-transferasas no peptídico), muestra unas IC50 mucho mayores para las líneas celulares estudiadas. En cuanto al Figura 4.1.- Sensibilidad a CX-4945 en las células de mieloma. Las líneas celulares se incubaron con concentraciones crecientes de CX-4945 durante 24h. La proliferación celular se estimó por el método del MTT. Los resultados mostrados con la media ± error estándar de 7 determinaciones individuales y están expresados como porcentaje de viabilidad relativa respecto a las células control (sin CX-4945). 38 Sorafenib, la IC50 se encuentra en el rango de concentración entre 5-8 μM, mientras que el BMS214662, muestra valores de IC50 menores, siendo la línea más sensible en este caso NCI-H929 con IC50 de 50 nM, seguido de RPMI 8226 con 0.2 nM. La más resistente fue U266, con IC50 de 0.8 nM (Gómez Benito 2006), (Ramirez Labrada 2013). 4.1.2 Efecto de CX-4945 en la apoptosis en las diferentes líneas celulares Debido a la naturaleza del método del MTT, los resultados no permitían concluir inequívocamente si el CX-4945 tiene un efecto citostático o citotóxico sobre las líneas celulares de mieloma. Para determinar si el CX-4945 inducía muerte celular se realizaron tanto curvas dosisrespuesta como tiempo-respuesta, midiendo la inducción de apoptosis, la cual se determinó por citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de células en las que había exposición de fosfatidilserina (PS) mediante el fluorocromo Anexina V-DY634 y el porcentaje de la caída del potencial de membrana mitocondrial mediante el TMRE. Estas características son eventos claros de la apoptosis celular temprana. En primer lugar se realizaron curvas dosis-respuesta para las líneas celulares MM.1S, U266 y NCI-H929, incubando dichas líneas con dosis crecientes de CX-4945 durante 24h. 24 h 010 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 MM.1S U266 NCI-H929 CX-4945, M Células con m bajo (% del total) 24h 010 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 MM.1S U266 NCI-H929 CX-4945, M Células Anexina V-DY634 (% del total) Como se muestra en la Figura 4.2, en las tres líneas celulares estudiadas se observa que el Figura 4.2.- Ensayo de la apoptosis con diferentes concentraciones de CX-4945, curva dosis-respuesta. Las líneas celulares MM.1S, NCI-H929 y U266 fueron incubadas con concentraciones crecientes de CX-4945 durante 24 h. Pasado este tiempo, se analizó mediante citometría de flujo la caída del potencial mitocondrial (ΔΨ), representado en la figura A) y la exposición de fosfatidilserina (Anexina V+) representado en la figura B). Los resultados son la media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes. A) B) 39 CX-4945 provoca una caída del potencial mitocondrial y una exposición de fosfatidilserina de membrana de forma dependiente a la dosis. Las células de mieloma U266 y NCI-H929, a partir de las dosis 20 μM de CX-4945 no se observa un aumento de muerte celular, incluso a dosis de hasta 50 o 60 μM del fármaco, por lo que en relación con los datos obtenidos en el ensayo MTT, indican una combinación de un efecto citostático y un efecto citotóxico. En cambio, la línea celular MM.1S, la citotoxicidad es muy alta por lo que la inhibición observada en el test podría corresponder íntegramente a un efecto citotóxico. Con estos datos obtenidos para cada línea celular se concluye que el CX-4945 induce apoptosis en todas las líneas de mieloma usadas, siendo la más sensible a este fármaco la línea celular MM.1S, seguida de NCI-H929, y la más resistente la línea U266. En segundo lugar, para medir también la muerte celular en células de mieloma múltiple inducida por el compuesto CX-4945, se realizó curvas tiempo-respuesta. Para ello, se incubó las líneas celulares de mieloma múltiple MM.1S, U266, NCI-H9299 y RPMI 8226 con sus respectivos IC50 del fármaco, y se midió tanto la caída del potencial de membrana como la exposición de fosfatidilserina a diferentes tiempos. 048 16 24 48 048 16 24 48 048 16 24 48 048 16 24 48 0 20 40 60 80 100 MM.1S U266 NCI-H929 RPMI 8226 Tiempo (h) Células con m bajo (% del total) 048 16 24 48 048 16 24 48 048 16 24 48 048 16 24 48 0 20 40 60 80 100 MM.1S U266 NCI-H929 RPMI 8226 Tiempo (h) Células Anexina V-DY634 (% del total) Como representa la figura 4.3, en todas las líneas celulares estudiadas, durante las 8 primeras horas, se produce de forma progresiva, una exposición de fosfatidilserina y una caída del Figura 4.3.- Ensayo de la apoptosis con concentración fija de CX-4945 a diferentes tiempos, curva tiemporespuesta. Las líneas celulares fueron incubadas, a diferentes tiempos (0, 4, 8, 16, 24, 48 h) con su respectivas IC50 del fármaco, que son las siguientes: 4 μM MM.1S, 30 μM U266, 15 μM NCI-H929 y 30 μM RPMI 8226. Después de cada tiempo, mediante el citómetro de flujo, se midió la caída del potencial mitocondrial (ΔΨ), representado en la figura A) y la exposición de fosfatidilserina (Anexina V+) representado en la figura B). Los resultados son la media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes. A) B) 40 potencial mitocondrial poco significativa. Se observa que a las 16 horas es cuando se produce una brusca caída del potencial y una gran exposición de fosfatidilserina, aumentando progresivamente a las 24 y 48 horas. No todas las líneas celulares se comportan de la misma manera a 16 h. La línea celular más sensible, MM.1S, presenta a ese tiempo un 80 % de apoptosis, mientras que las otras líneas celulares, requieren ente 24 y 48 h para alcanzar esos porcentajes. Se puede concluir, tanto por las curvas dosis-respuesta como por las curvas tiemporespuesta, que el fármaco CX-4945 induce apoptosis en todas las líneas celulares de mieloma múltiple usadas, y que la línea más sensible es MM.1S. 4.1.3 Efecto de los inhibidores de los diferentes tipos de muerte. Los resultados obtenidos hasta ahora indican que el fármaco CX-4945 induce muerte celular en las células de mieloma múltiple analizadas. La apoptosis es el principal mecanismo de muerte celular programada, pero existen otras formas de muerte celular descritas como la necrosis programada o necroptosis (L Galluzzi 2012). Para caracterizar el tipo de muerte, se trataron las líneas celulares de mieloma múltiple con CX-4945, previa incubación de diferentes inhibidores como Z-VAD-fmk, Necrostatina-1, Necrosulfonamida o la combinación de ellos, una hora antes de adicionar el CX-4945. El Z-VADfmk (Z-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona) es un inhibidor general de las caspasas, por lo que inhibe la muerte celular por apoptosis, la cual está controlada genéticamente y es ejecutada por caspasas. La Necrostatina-1 (Nec-1) es un inhibidor de la enzima quinasa Rip1 (receptor-interacting protein 1), impidiendo que se active la vía de muerte celular necroptosis. La necrosulfonamida (NSA) inhibe también la necroptosis por modificación covalente de MLKL (mixed lineage kinase domain like), la cual forma parte integral de la maquinaria de señalización de necroptosis por debajo de la activación de Rip1 y Rip3 (Ting Pan 2014). En este experimento se incubaron las líneas celulares MM.1S, U266, NCI-H929 y RPMI 8226 con Z-VAD-fmk 30 μM, Nec-1 30 μM y NSA 1 μM una hora antes de tratar las células con CX-4945 durante 24 horas. También se estudiaron los efectos de las combinaciones de Z-VAD-fmk con cada inhibidor de necroptosis. Las concentraciones de CX-4945 utilizadas para cada línea celular fueron sus respectivas IC50. 47 fmk. El inhibidor de caspasa-8 (IETD) produce una inhibición mayor que con el inhibidor de caspasa-9 (LEHD). Estos resultados sugieren que la caspasa-8 contribuye a la caída de potencial mitocondrial en ambas líneas celulares. No obstante, la inhibición producida por IETD es menor que la producida por Z-VAD-fmk, indicando que otras caspasas también están implicadas en el proceso. En el caso de las U266, el inhibidor de la caspasa-3, DEVD, también reduce la caída del potencial mitocondrial causada por CX-4945, por lo que en estas células podría ser la acción conjunta de ambas caspasas la causante de la apoptosis. En la línea RPMI 8226, el único efecto significativo se observó con el inhibidor de la caspasa-8, aunque no se llegó al nivel de protección del Z-VAD-fmk, lo que sugiere que algunas otras caspasas, no analizadas en este trabajo, podrían participar también en la apoptosis inducida por CX-4945 en esta línea celular. Respecto al mecanismo por el que se activa la caspasa-8 en respuesta al CX-4945 una hipótesis es la producción de ligandos mortales que actuarían de modo autocrino sobre las células induciendo apoptosis a través de la vía extrínseca, como ha sido propuesto para otros fármacos (Quan Chen and Hussein 2001). Otra posibilidad es que las alteraciones en la señalización celular provocadas por el CX-4945 induzcan la activación de la caspasa-8 sin necesidad de que los ligandos mortales se unan a sus correspondientes receptores (Clancy Lauren 2005). En el caso de la línea celular NCI-H929, el inhibidor de la caspasa-8 potencia la muerte celular, en comparación con las células tratadas con CX-4945. Este hecho se podría relacionar con lo observable en la Figura 4.4, en la que la necrostatina inhibía algo la muerte celular. Por lo tanto, si se inhibe la caspasa-8 se puede potenciar la necroptosis debido a la activación del necroptosoma (Green 2008). Por lo tanto, según los resultados obtenidos con los inhibidores específicos de caspasas, el CX-4945 puede inducir una muerte celular de forma diferente dependiendo del modelo celular empleado. Por un lado, en las RPMI 8226 y las U266 se induce una muerte dependiente en gran medida de la activación de las caspasas, más específicamente, de las que forman parte de la vía extrínseca de la apoptosis o de la necroptosis, mientras que en la línea MM.1S, predomina una vía independiente de caspasas, y en la línea NCI-H929 podría existir contribución de la necroptosis. 48 4.3.2 Análisis de la activación de caspasas inducida por CX-4945 Puesto que los resultados de los experimentos con inhibidores indicaban un papel importante de las caspasas en la apoptosis inducida por CX-4945 en algunas de las líneas celulares de mieloma, se decidió profundizar en el papel de varias de estas enzimas. Se analizó por Western-blot la activación de las principales caspasas iniciadoras y ejecutoras, tanto de la vía intrínseca como de la vía extrínseca, tras el tratamiento con CX-4945, en varias líneas celulares de mieloma múltiple. En primer lugar se analizó la activación de las caspasas-8 y -3 tras el tratamiento con concentraciones crecientes de CX-4945 en la línea celular MM.1S durante 24h. Como se había observado en los experimentos anteriores (Figura 4.7), esta línea celular, al ser incubada con el inhibidor de caspasas, Z-VAD-fmk, no mostraba una disminución significativa de la muerte producida por el CX-4945, por lo que se pensó que podría tener inhibidas las caspasas. Por esta razón, se analizó la activación de varias de ellas. La figura 4.8, muestra que CX-4945 induce el procesamiento de las procaspasas -8 y -3, puesto que en ambas se reduce los niveles de la proenzima y por la aparición en ambas de la forma activa. Por lo que se puede concluir que en la línea celular MM.1S, CX-4945 induce la activación de las caspasas pero su actividad no es esencial para la muerte celular. En segundo lugar, se analizó la expresión de caspasas tras el tratamiento con CX-4945 con una concentración fija y a diferentes tiempos. Este experimento se realizó tanto en la línea celular MM.1S como en las NCI-H929. Figura 4.8.- Activación de las caspasas inducidas por CX-4945. Las células se trataron con concentraciones crecientes de CX-4945 durante 24h. Transcurrido este tiempo, se realizaron los extractos de proteínas totales y se analizó la activación de las caspasas mediante electroforesis e inmunotransferencia, utilizando anticuerpos específicos. La cantidad de la muestra cargada se normalizó mediante la detección de la βactina. 49 La figura 4.9 A), representa la activación de las caspasas en la línea celular MM.1S tratada con CX-4945 con una concentración fija a diferentes tiempo de incubación. Se analizaron también controles sin tratar para cada tiempo de incubación. Para las caspasas iniciadoras, tanto la caspasa-8 como la caspasa-9, se observa en la muestra tratada, que a las 8 h se comienza a producir una disminución de los niveles de proenzima y una aparición de la forma activa. Este mismo hecho ocurre en la caspasa ejecutora, la caspasa-3. También fue analizada la proteína XIAP que es un inhibidor de las caspasas. Durante la apoptosis se libera de las mitocondrial al citosol la proteína proapoptótica Smac/DIABLO, un inhibidor de XIAP (Apartado 1.1.1.1, Figura 1.5). En la figura 4.9 A) se observa que a tiempos largos se produce disminución de los niveles de XIAP, lo que contribuye a una mayor activación de las caspasas (Almagro M.C 2012). En la Figura 4.9 B) se analizan los niveles de expresión de las caspasas en la línea celular NCI-H929, observándose el mismo patrón que en las células MM.1S. A partir de las 8 h comienza a reducirse tanto de la caspasa-8 como de la caspasa-3, la cantidad de proenzima y aumenta la caspasa activada de ambas. Por lo que se puede concluir que aunque su actividad no sea esencial para la muerte celular en estas líneas, las caspasas que forman parte de ella no están inactivadas. Figura 4.9.- Activación de las caspasas inducidas por CX-4945. La línea celular MM.1S (A) y NCI-H929 (B) se trató 6 μM y 20 μM de CX-4945, respectivamente, y fue incubado a diferentes tiempos, a 0, 4, 8, 12 y 24h. Transcurrido este tiempo, se realizaron los extractos proteicos totales y se analizó la activación de las caspasas mediante electroforesis e inmunotransferencia, utilizando anticuerpos específicos. La cantidad de la muestra cargada se normalizó mediante la detección de la β-actina. B) A) 50 4.3.3 Análisis de la secuencia de activación de las caspasas inducidas por CX-4945. Se analizó la expresión de las principales caspasas iniciadoras y ejecutoras, tanto de la vía intrínseca como de la vía extrínseca, tras el tratamiento con CX-4945 y con inhibidores específicos de caspasas, en la línea de mieloma múltiple, U266, con el fin de determinar el orden en el que se produce la activación de las mismas. En primer lugar se analizó, en la línea celular U266, la expresión de la caspasa-8 y -3 tras el tratamiento con una concentración fija de CX-4945, 30 μM, a diferentes tiempos de concentración. En segundo lugar, se incubó las células de U266, no solo con CX-4945 a la misma concentración sino también con el inhibidor de caspasa-9 (LEHD), y se observó a los mismos tiempos la expresión de la caspasa-8, específica de la vía extrínseca y la proteína proapopttótica Bid, la cual es procesada y activada por la casapasa -8 sin respuesta a la unión de ligandos mortales. Bid sirve también como ligando directo molecular entre la activación de la caspasa-8 y la maquinaria mitocondrial de muerte. Por último, se incubaron las células con CX-4945 a la misma concentración y en este caso con el inhibidor de la caspasa-8 (IETD), para analizar la expresión de la caspasa -9, principal iniciadora de la vía mitocondrial de apoptosis. La Figura 4.10 A, muestra que el tratamiento con CX-4945 de las células U266, produce la activación de la caspasa-8 y la caspasa-3 a diferentes tiempos. Se observa, que a las 8 h, al igual que ocurría en los experimentos anteriores, comienza a reducirse la cantidad de procaspasas y aumentar Figura 4.10.- Activación de las caspasas inducidas por CX-4945 e inhibidores de caspasas. La línea celular U266 se trató solo con 30 μM deCX-4945 (A) o en combinación con 30 μM de inhibidor de caspasas -8 (IETD) (B) o con 30 μM del inhibidor de caspasa -9 (LEHD) (C), los cuales fueron incubados a diferentes tiempos, a 0, 4, 8, 16 y 24h. Transcurrido este tiempo, se realizaron los extractos totales y se analizó la activación de las caspasas mediante electroforesis e inmunotransferencia, utilizando anticuerpos específicos. La cantidad de la muestra cargada se normalizó mediante la detección de la β-actina. A) B) C) 51 la cantidad de caspasa procesada, tanto de las iniciadoras como de las ejecutoras. Además se observa, en la Figura 4.10 B, que la inhibición de la caspasa 9 con LEHD, no evita la activación de la caspasa 8 ni el procesamiento de la proteína proapoptótica Bid, sobre todo a partir del tiempo 8 h. En cambio, la Figura 4.10 C, en las que las células se trataron con inhibidor de caspasa 8, no se observa activación de la caspasa-9 a las 8 h, sino que comienza a observarse esta activación a tiempo más largos. Estos resultados indican que la activación de la caspasa-8 ocurre antes y es necesaria para la activación de la caspasa-9. 4.4 Implicación de la vía extrínseca en la apoptosis inducida por CX4945 La principal vía apoptótica independiente de mitocondrias esta iniciada por la activación de receptores mortales como Fas o TRAIL-R tras la unión de sus ligandos, Apo2L/TRAIL y FasL, respectivamente (Aroui et al., 2009). Apo2L/TRAIL es un ligando de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) capaz de inducir apoptosis, vía extrínseca, tras la unión a sus receptores mortales en membrana. Existen dos receptores de muerte pro-apoptóticos (DR4 y DR5, que contienen dominios DD (Death Domain) intracelulares implicados en la transducción de la señal y dos receptores señuelos (DcR1 y DcR2) funcionalmente inactivos, bien porque carecen del dominio DD (DcR1) o lo tienen mutado (DcR1) (Figura 1.4). En algunos casos se ha propuesto que el efecto apoptótico de algunos fármacos antitumorales depende en parte de la producción autocrina de estos ligandos mortales (Quan Chen and Hussein 2001). Los resultados de la activación de caspasas parecían sugerir que este mecanismo podría estar implicado en la acción de CX-4945 en las células U266, por lo cual decidimos explorar esta vía. 4.4.1 Análisis de la expresión de Apo2L/TRAIL y FasL inducida por CX-4945. Los resultados anteriores podrían indicar que CX-4945 induce la vía extrínseca a través de un bucle autocrino de ligandos mortales en las células U266. Por ello se decidió analizar la producción de TRAIL y la posible implicación de este sistema en la apoptosis inducida por CX4945 en dichas células. 52 Se analizó la expresión de las principales ligandos mortales, tanto FasL como TRAIL, tras el tratamiento con CX-4945, en la línea de mieloma múltiple, U266. Las células se trataron con una concentración fija de CX-4945, 30 μM, y se incubaron a diferentes tiempos, 0, 4, 8, 16, 24 horas. La Figura 4.11 muestra que tras el tratamiento con CX-4945, aumenta la expresión de los ligandos mortales, siendo a las 24 h, el aumento más significativo el ligando mortal TRAIL. A tiempos cortos, sin embargo se observó mayor inducción de FasL. Esto conduce a pensar, que tal vez, el CX-4945 aumente indirectamente la secreción de estos ligando por la propia célula y la activación de la vía extrínseca, como se ha descrito para otros fármacos (Quan Chen and Hussein 2001). Para comprobar esta hipótesis, se comprobó la expresión de los receptores mortales y su acción en la muerte inducida por CX-4945. 4.4.2 Expresión de DR4, DR5, DcR1 y DcR2 en la membrana plasmática de las células de mieloma. La expresión en la membrana de receptores de TRAIL (DR4 y DR5) en las células U266 se analizó por citometría de flujo. Figura 4.12.- Expresión en la membrana de los receptores Apo2L/TRAIL. Las células U266 (2x105 células) se incubaron con los anticuerpos monoclonales de ratón anti-DR4-PE, anti-DR5-PE, anti-DcR1-PE o anti-DcR2-PE. Como control de usó una IgG1-PE de ratón. Posteriormente se analizaron por citometría de flujo. Figura 4.11.- Expresión de los ligandos mortales tras el tratamiento con CX-4945. La línea celular U266 se trató con 30 μM deCX-4945 y se incubó a diferentes tiempos, 0, 4, 8, 16 y 24h. Transcurrido este tiempo, se realizaron los extractos de proteínas totales y se analizó la expresión de los ligandos mortales FasL y TRAIL mediante electroforesis e inmunotransferencia, utilizando anticuerpos específicos. La cantidad de la muestra cargada se normalizó mediante la detección de la β-actina. 53 El análisis mostró que las células U266 expresaban ambos receptores, siendo la expresión mayor para el receptor DR4 que para el DR5. Estos datos confirman los obtenidos en el artículo (Gómez-Benito María 2007) y demuestran que las células U266 utilizadas en este trabajo no han perdido la expresión de los receptores de TRAIL. 4.4.3 Contribución de DR4 y DR5 a la señal apoptótica por Cx-4945. Para determinar la contribución de los receptores mortales a la transducción de la señal apoptótica inducida por CX-4945 en la línea celular U266, se utilizaron quimeras recombinantes solubles específicas para cada receptor, Fc-R1 (DR4), Fc-R2 (DR5) y anti-FasL (Fas-Fc´), las cuales interaccionan con TRAIL y FasL, previniendo la interacción a sus respectivos receptores. control M CX-4945  30 CX + DR4+DR5 CX + Fas-Fc´ CX +IETD 0 20 40 60 U266 Células con m bajo (% del total) Los resultados obtenidos indicaron que ninguna de las quimeras utilizadas redujo la apoptosis inducida por CX-4945. Esto puede deberse a dos hechos, primero, a que las quimeras no hayan funcionado correctamente, o segundo, que realmente no se lleve a cabo la activación de la vía extrínseca por TRAIL. Para comprobar si las células U266 son sensibles a la vía Fas y si la quimera funcionaba correctamente, se procedió al siguiente experimento, en el que las células se trataron con tres concentraciones diferentes de CH11, un anticuerpo monoclonal anti-Fas, que tiene función agonista sobre las células, produciendo apoptosis. Además, se combinó este anticuerpo con Fas-Fc, la quimera de Fas, el cual se une a CH11, impidiendo la unión al receptor y la posterior activación. Figura 4.13.- Contribución de DR4, DR5 y FasR a la apoptosis inducida por CX-4945. Las células U266 se trataron con 30 μM de CX-4945 en combinación de las quimeras DR4 y DR5, la quimera de Fas, y como control, con inhibidor de la caspasa 8, IETD. Pasada las 24 horas se analizó por citometría de flujo. 54 control M CX-4945  30 g/ml  CH11 1 CH11 500 ng/ml CH11 100 ng/ml g/ml Fas-Fc´  CH11 1 CX + IETD 10 20 30 40 50 U266 . Células con m bajo (% del total) En la Figura 4.14 se observa que el tratamiento de las células U266 con CH11 provoca una caída del potencial mitocondrial menor que la producida por el tratamiento con 30 μM de CX-4945 indicando que estas células son moderadamente sensibles a la vía Fas. Además se observó que la quimera de Fas (Fas-Fc´), reduce parcialmente la apoptosis inducida por CH11. En conjunto estos resultados, parecen indicar que la vía Fas funciona correctamente en las células U266, pero no contribuye al efecto tóxico de CX-4945. En cuanto a la vía TRAIL, estudios previos del grupo había demostrado la sensibilidad de las células a este ligando (Gómez-Benito María 2007), pero los resultados con las quimeras (Figura 4.13) parecen descartar que esta vía contribuya a la apoptosis inducida por CX-4945. Por lo tanto, la activación de la caspasa-8 observada en las primeras etapas del tratamiento con este fármaco podría estar provocada bien por la trimerización de los receptores en ausencia de sus ligandos (Mundle SD 2002), bien por otra vía como la formación del ripoptosoma en la que también se ha descrito que se activa esta caspasa-8. 4.5 Análisis del uso potencial del CX-4945 en terapia combinada En la práctica habitual se suelen emplear combinaciones de fármacos con diferentes dianas terapéuticas para obtener mejores resultados y evitar la aparición de células resistentes y las recaídas. En este trabajo se ha analizado el efecto citotóxico del CX-4945 combinado con un fármaco inhibidor específico del mTOR, el PP242. Se estudió el efecto de dos concentraciones fijas del inhibidor de mTOR (PP242) en combinación con concentraciones crecientes de CX-4945, en dos líneas celulares del mieloma múltiple, U266 y NCI-H929, para analizar si el CX-4945 tenía algún efecto sinérgico en la apoptosis inducida por PP242. Figura 4.14.- Sensibilidad al anticuerpo citotóxico anti-Fas (CH11). Las células U266 se trataron con diferentes concentraciones de CH11, con CH11 a concentración fija, en combinación con Fas-Fc´ y con el inhibidor de caspasa-8. Pasado el tiempo de incubación se analizó por citometría de flujo. 55 010 20 30 40 50 0 20 40 60 80 U266 U266 + 1 mM PP242 U266 + 1.5 mM PP242 CX-4945, M Células con m bajo (% del total) 010 20 30 40 50 0 20 40 60 80 NCI-H929 NCI-H929 + 1 mM PP242 NCI-H929 + 1.5 mM PP242 CX-4945, M Células con m bajo (% del total) Como muestra la Figura 4.16, en ambas líneas celulares, la adición del inhibidor del mTOR en combinación con CX-4945 reduce, de manera significativa, la acción apoptótica del CX-4945 sin combinar. La hipótesis inicial era que puesto PP242 inhibe mTOR y CX-4945 inhibe CK2, la combinación de ambos produciría un aumento de la apoptosis. Sin embargo, los resultados obtenidos indican claramente que PP242 tiene un efecto antagónico con el de CX-4945. En estudios recientes de ha demostrado que el bloqueo de mTOR resulta en una retroalimentación negativa que activa las vías de superviviencia Akt y Ras/Raf/MEK/ERK lo que podría reducir la apoptosis (Carracedo Arkaitz 2008). Puesto que la molécula CK2 está implicada en la activación de dichas vías, al ser inhibida por CX-4945, se reduciría la supervivencia y se aumentaría la apoptosis. Nuestros resultados parecen indicar sin embargo que la combinación de ambos inhibidores prevalece el posible efecto protector de PP242 sobre la inhibición de las vías de señalización por el CX-4945. Figura 4.16.- Efecto de la combinación del tratamiento en las células de mieloma múltiple de PP242 (48h) seguido de CX-4945 (24h). Las dos líneas celulares se incubaron 24h con dos concentraciones fijas de PP242 seguidas de 24 h mas con concentraciones crecientes de CX-4945. Después de 48 h de incubación se midió la caída del potencial mitocondrial (ΔΨ), en las líneas celulares U266 (A), y en NCI-H929 (B). Los resultados son la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. A) B) 56 5. CONCLUSIONES  El CX-4945 es capaz de inducir apoptosis en todas las líneas celulares de mieloma múltiple analizadas.  A las 8 horas de incubación de las líneas de MM con CX-4945 comienza a caer el potencial mitocondrial (ΔΨm) y exponerse la fosfatidilserina, siendo máximo estos fenómenos a las 24 h o 48 h, dependiendo de la línea celular.  La sobreexpresión de las proteínas Mcl-1 y bcl-xL no es suficiente para evitar completamente la muerte en la línea celular RPMI 8226 tras el tratamiento con CX4945.  En todas las líneas celulares del mieloma múltiple, excepto MM.1S, se reduce con el inhibidor general de caspasas, Z-VAD-fmk, la apoptosis inducida por CX-4945.  La necroptosis podría contribuir parcialmente a la muerte inducida por CX-4945 en las líneas MM.1S y NCI-H929.  Las líneas celulares de mieloma múltiple U266 y RPMI 8226, la apoptosis inducida por CX-49445 es dependiente de caspasas, y que la caspasa-8 parece ser la iniciadora.  El tratamiento con CX-4945 en la línea celular MM.1S induce apoptosis independiente de caspasas, aunque estas no están inactivadas  El tratamiento con CX-4945 induce la expresión de Apo2L/TRAIL y FasL.  La unión de estos ligandos a sus receptores mortales no contribuye significativamente la apoptosis inducida por CX-4945.  La combinación de los inhibidores de mTOR de nueva generación con CX-4945 disminuye la actividad citotóxica de esta droga.