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INACTIVACIÓN MICROBIANA POR PULSOS ELÉCTRICOS DE ALTO VOLTAJE JORGE TREMÍN PUYOD 2013/2014 1 Índice Resumen………………………………………………………………………………...1 Resumen en ingles………………………………………………………………………2 1. Introducción……...………………………………………..………………………..4 1.1. Mecanismo de acción de los PEAV…………………………………………...5 1.2. Factores que afectan a la inactivación microbiana en los PEAV…………...6 1.2.1. Parámetros de procesado………………………………………………6 1.2.2. Características del medio de tratamiento……………………………10 2. Justificación y objetivos…………………………………………………………..12 3. Materiales y métodos………………………………………………………….......12 3.1. Medios y reactivos……………………………………………………………12 3.2. Microorganismos……………………………………………………………..13 3.2.1. Obtención de la suspensión…………………………………………...13 3.2.2. Curva de crecimiento………………………………………………….13 3.3. Determinación de la concentración máxima no inhibitoria……………….14 3.4. Tratamiento de PEAV……………………………………………………….15 3.4.1. Generador de pulsos eléctricos……………………………………….15 3.4.2. Cámara de tratamiento……………………………………………….15 3.4.3. Metodología para la aplicación de los tratamientos PEAV a diferente temperatura……..………………………………………….....16 3.5. Incubación y recuento de supervivientes……………………………………17 3.5.1. Recuento de supervivientes…………………………………………...17 3.6. Análisis de resultados………………………………………………………...17 4. Resultados y discusión…………………………………………………………….18 4.1. Inactivación de E. coli O157:H7 por PEAV con pulsos de microsegundos………………………………………………………………..19 4.1.1. Generación de daño subletal debido a la aplicación de tratamientos PEAV……………………………………………………...24 4.2. Inactivación de E. coli O157:H7 por PEAV con pulsos de milisegundos…………………………………………………………………..27 4.2.1. Generación de daño subletal debido a la aplicación de tratamientos PEAV……………………………………………………...30 4.3. Comparación de los modelos de microsegundos y milisegundos en la eficacia letal de los tratamientos………………………………………32 5. Conclusiones……………………………………………………………………….38 5.1. Conclusiones en ingles………………………………………………………..39 6. Aportaciones al aprendizaje……………………………………………………...39 7. Bibliografia………………………………………………………………………...41 ANEXO I………………………………………………………………………………43 ANEXO II……………………………………………………………………………...45 2 Resumen En este trabajo se ha investigado por primera vez el efecto de la anchura del pulso en el rango de mili y microsegundos en la inactivación de Escherichia coli O157:H7 en un tampón de pH 3,5 al aplicar tratamientos de pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) a distintas temperaturas (desde los 20 hasta los 40ºC). Ello ha requerido la utilización de dos equipos distintos aplicando pulsos de mili y microsegundos de distintas intensidades del campo eléctrico (de 4 a 10 kV/cm en el caso de los milisegundos y de 15 a 25 kV/cm para los microsegundos) y energía específica. Los resultados han mostrado que la inactivación incrementó con la intensidad del campo eléctrico, la temperatura y la energía aplicada tanto cuando se aplicaron pulsos de mili y microsegundos. De los tres factores investigados, la temperatura fue la que más influyó sobre todo cuando se aplicaron pulsos de milisegundos, estando condicionado dicho efecto con la intensidad y la energía aplicadas. Cuando se compararon tratamientos de la misma energía específica aplicada, los tratamientos de microsegundos fueron más eficaces letalmente que los milisegundos a temperaturas inferiores a los 27ºC, mientras que a temperaturas superiores, los milisegundos produjeron un mayor nivel de inactivación. Estos resultados suponen una novedad ya que hasta la fecha se había comprobado, pero únicamente a temperatura ambiente, que era preferible aplicar tratamientos cortos y de alta intensidad del campo para producir una mayor inactivación microbiana. La posibilidad de aplicar tratamientos PEAV a temperaturas controladas y constantes ha permitido observar este efecto. En cualquier caso y para confirmar estos resultados, se hace necesario determinar si la muerte microbiana observada se debe al efecto de los tratamientos PEAV y no a un efecto combinado de los PEAV con especies químicas que se podría haber producido como consecuencia del uso de pulsos de anchura superior a 20 microsegundos como se ha indicado en la literatura. 3 Resumen en ingles The present work studies the electric pulse width in the Escherichia coli O157:H7 inactivation in a mili and microseconds grade for the first time, applying treatments in a pH 3.5 tampon media with high voltage pulsed electric fields (HVPE) with temperature variations (20ºC to 40ºC). It has been required the use of two different equipment to apply different electric field intensities (4 to 10 kV/cm in the case of milliseconds and 15 to 25 kV/cm in the case of microseconds) and specific energies. The results have shown that the inactivation was higher with the intensity of the electric field, the temperature and the applied energy in the case of milliseconds and microseconds. The temperature was the most influent factor, especially with milliseconds, and was influenced by the intensity and energy applied. When the treatments with the same specific energy were compared, the microsecond treatments were more lethally efficient than millisecond treatments in temperatures lower than 27ºC. On the other hand, when the temperature was over 27ºC the millisecond treatments were more effective than the microsecond ones. These results have a substantial difference compared to the data collected in the literature. These data show that, under an ambient temperature, the short treatments with a high intensity were more efficient in order to achieve a high microbial inactivation. That has been possible due to the possibility to apply HVEP under controlled and constant temperatures. Despite of that it is necessary to investigate if the microbial death is due to the HVEP effect and it isn’t to the combined actions of HVEP and chemicals species liberated when pulses with a width higher than 20 microseconds were used. 4 1. Introducción Actualmente existe una demanda cada vez más fuerte por parte de los consumidores exigiendo alimentos seguros y con un perfil organoléptico óptimo que se asemeje al del producto fresco. Es por esto que a lo largo de las últimas décadas se ha apostado por la investigación de los tratamientos de conservación no térmicos (altas presiones hidrostáticas, radiaciones ionizantes, etc…), destacando los los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV) como tratamiento para productos líquidos sensibles al calor como los zumos de frutas principalmente (A. Rivas et al., 2005; E. Puértolas et al., 2010). El tratamiento por PEAV es un método de conservación capaz de inactivar células vegetativas de microorganismos, pero no esporos de ahí que su aplicación se centre en la pasteurización de alimentos líquidos ácidos (José Á. Guerrero-Beltrán et al., 2010). Este método consiste en situar el producto a tratar en una cámara provista de dos electrodos a los que se les aplica pulsos de alto voltaje durante periodos de tiempo del orden de microsegundos o milisegundos. De esta forma se induce un campo eléctrico de alta intensidad en el alimento que se encuentra entre los electrodos (Barbosa-Cánovas y Sepúlveda, 2005). Es este campo el que produce un fenómeno denominado electroporación en la membrana citoplasmática de células procariotas y eucariotas (Barbosa-Cánovas et al., 1998). Esta formación de poros de la membrana celular puede ser temporal o permanente, dependiendo de la intensidad del campo eléctrico suministrado, permitiendo aplicar esta tecnología a la consecución de diferentes objetivos. La electroporación temporal se utiliza, por ejemplo, en la biotecnología con el objetico de introducir pequeñas moléculas como oligonucleótidos o plásmidos en el interior de las células. A lo largo de los últimos años se ha utilizado esta tecnología en la medicina clínica para avanzar en el tratamiento de distintos tipos de cáncer facilitando la entrada de los medicamentos en las células tumorales (Shutao Wang et al., 2012). Por el contrario, la formación de poros permanentes se utiliza para mejorar la transferencia de masa del interior al exterior de la célula y así extraer componentes intracelulares de interés cuando se aplica sobre células eucariotas (Henry Jaeger et al., 2011; B.I.O. Ade-Omowaye et al., 2001; Vorobiev & Lebovka, 2008). La electroporación permanente de la membrana citoplasmática de células procariotas produce la inactivación de la célula a temperaturas inferiores que los métodos tradicionales térmicos de conservación (Claudia Siemer et al., 2014; Gianpiero 5 Pataro et al., 2014; M.B. Fox et al., 2008), permitiendo la obtención de alimentos inocuos y seguros obviando la degradación organoléptica que producen los tratamientos de conservación por calor. Actualmente, en el campo de los PEAV, se da por hecho que los pulsos aplicados con una intensidad menor (10 kV/cm) y durante un periodo de tiempo mayor (milisegundos) tienen una eficacia letal y una eficiencia energética mucho menor que los pulsos que se aplican con una intensidad mayor (20-30 kV/cm) y un corto periodo de tiempo (microsegundos). A pesar de que estas afirmaciones se dan como válidas no existen datos directamente comparables que las respalden, convirtiendo esto en una teoría que necesita de respaldo experimental (Saulis et al., 2012). 1.1 Mecanismo de acción de los PEAV La letalidad derivada de la aplicación de pulsos eléctricos así como la mejora de la extracción de compuestos del interior de células es consecuencia de un fenómeno denominado electroporación. Este mecanismo consiste en la aparición de poros en la membrana citoplasmática de las células permitiendo la salida de compuestos citoplasmáticos al exterior de la misma. Esto se puede explicar mediante la teoría electromecánica que dicta que cuando se expone la célula a un campo eléctrico se produce un cúmulo de iones con cargas opuestas a cada lado de la membrana citoplasmática. Esto produce un aumento del potencial transmembrana que, si el campo eléctrico suministrado es suficientemente intenso, aumentará hasta valores cercanos a 1 V lo que producirá la formación de poros en la membrana (Teissié et al., 2002). Cundo se produce este efecto se dice que se está aplicando un campo eléctrico crítico por lo que los poros serán irreversibles. En el caso de que el campo eléctrico suministrado no permita alcanzar un potencial transmembrana de 1 V los poros formados serán reversibles. Figura 1.1. Esquema del mecanismo de permeabilización mediante PEAV. E es el campo eléctrico aplicado y Ec es el campo eléctrico crítico. (Extraído de Saldaña 2011). E Electrodo positivo Electrodo negativo Célula + + + + - - - - Electrocompresión E < Ec E > Ec Célula intacta Electroporación E Electrodo positivo Electrodo negativo Célula + + + + - - - - Electrocompresión E < Ec E > Ec Célula intacta Electroporación 6 1.2. Factores que afectan a la inactivación microbiana por PEAV Igual que ocurre con otras tecnologías que actúan inactivando microorganismos, la resistencia microbiana a los PEAV depende de muchos factores. Con objeto de establecer las condiciones de procesado que permitan obtener alimentos estables y seguros es necesario conocer cómo influyen estos factores en la inactivación microbiana. Dichos factores se pueden clasificar en tres grupos: parámetros de procesado, características de los microorganismos y características del medio de tratamiento. A continuación, se comentarán aquellos factores de interés en este trabajo. Tabla 1. Factores que afectan a la inactivación microbiana por PEAV Parámetros de procesado Características microbianas Parámetros del producto Intensidad del campo eléctrico Condiciones de crecimiento Composición Duración del pulso - Composición del medio Conductividad Número de pulsos - Temperatura Fuerza iónica Temperatura inicial - Concentración de oxígeno pH Temperatura final Fase de crecimiento Aw Forma del pulso - Tiempo de incubación Configuración de la cámara Condiciones de recuperación - Volumen - Composición del medio - Gap - Temperatura - Flujo a - Tiempo de recuperación - Frecuencia - Concentración de oxígeno - Energía específica - Tiempo de permanencia a a Para tratamientos continuos (Extraído de Wouters et al., 2001) 1.2.1 Parámetros de procesado Son numerosos los parámetros inherentes al procesado que afectan a la inactivación microbiana por la aplicación de pulsos eléctricos. Entre ellos podemos destacar por su importancia la intensidad del campo eléctrico, el tiempo de tratamiento (Álvarez et al., 2003; Huang et al., 2009), la energía específica (Heinz et al., 2001), la forma, la anchura y la frecuencia de los pulsos eléctricos y la temperatura del medio. - Intensidad del campo eléctrico suministrado La intensidad del campo eléctrico (E) se puede definir como la diferencia de potencial aplicada entre dos electrodos (v) donde se coloca el alimento por unidad de longitud (d), y suele expresarse en kV/cm: (Ec. 1.1) 𝐸 = V d 7 Como hemos descrito anteriormente la intensidad del campo eléctrico aplicado debe ser superior al campo eléctrico crítico para que se formen poros irreversibles y, por lo tanto, se produzca efecto letal en el microorganismo. Se ha observado que suministrando campos eléctricos de 5 kV/cm se producía letalidad con ciertos microorganismos y bajo condiciones concretas de tratamiento, pero los campos que se suelen utilizar oscilan entre los 10 y los 30 kV/cm. - Forma del pulso Existen dos tipos de pulsos que difieren entre sí en la forma de los mismos (figura 1.2). Por un lado existen los pulsos de caída exponencial en los que comienzan a intensidad elevada pero esta va decreciendo a lo largo de la anchura del pulso, y por otro lado, los pulsos de onda cuadrada aplican la intensidad máxima del campo eléctrico a lo largo de toda la anchura del pulso (Góngora-Nieto et al., 2002). Actualmente los pulsos más utilizados son los pulsos de onda cuadrada, debido a que la energía liberada se aplica a intensidades de campo más o menos homogéneas durante toda la duración del pulso, produciendo efecto letal en su totalidad y, permitiendo controlar el tiempo y el voltaje aplicado. En estos pulsos, el tiempo en el que se aplica más o menos constante el voltaje es lo que se define como anchura del pulso. Esto difiere de los pulsos de caída exponencial en los que parte de esta energía se aplica a intensidades demasiado bajas como para que se produzca letalidad y, por lo tanto, solo contribuye al calentamiento del producto. (Wouters et al., 1999) Figura 1.2. Representación de pulso de onda cuadrada (e) y de pulso de caída exponencial (a) (Extraído de Góngora-Nieto et al., 2002). 8 - Tiempo de tratamiento El tiempo de tratamiento (t) se define como el tiempo total efectivo durante el cual se aplica el campo eléctrico y se calcula multiplicando el número de pulsos (n) suministrados por la anchura del pulso (τ): (Ec. 1.2) 𝑡 = τ × n Si bien en la actualidad se suelen aplicar pulsos del orden de microsegundos en los que se aplican intensidades de campo elevadas (20-30 kV/cm) con el fin de inactivar microorganismos, el efecto de la anchura del pulso en la letalidad de estos tratamientos no está totalmente aclarada. Algunos autores han observado que el efecto letal de un tratamiento no depende de la anchura del pulso aplicado (Hülsheger y col., 1981; Raso y col., 2000; Álvarez y col., 2003). Por el contrario, Aronsson y col. (2001) observaron una mayor inactivación de diferentes microorganismos cuando aplicaban la misma intensidad de campo y tiempo de tratamiento con pulsos más anchos. Wouters y col. (1999) determinaron que el efecto de la anchura del pulso dependía de la intensidad de campo eléctrico. Así, mientras que a 36 kV/cm la anchura del pulso no influía sobre la inactivación de Listeria innocua, a 28 kV/cm observaron una mayor inactivación cuando aplicaron pulsos más anchos. Los resultados obtenidos por Aronsson y col. (2001) y Wouters y col. (1999) fueron obtenidos con tratamientos en los que la temperatura final de la muestra superaba los 40º C, siendo mayor la temperatura final cuanto más ancho era el pulso aplicado. Estas temperaturas, como más adelante se indica, pueden potenciar el efecto letal de los pulsos eléctricos e influir en el efecto de la anchura del pulso sobre la inactivación microbiana. Martín-Belloso y col. (1997ab) obtuvieron mayores niveles de inactivación de E. coli en huevo líquido y leche desnatada cuando, a una misma intensidad de campo y sin superar los 37º C, aplicaban pulsos más anchos. Por otra parte, se ha observado que para un consumo energético constante, pulsos cortos y de alta intensidad son más efectivos que los pulsos de mayor anchura y menor intensidad del campo (Schoenbach y col., 1997; Heinz y col., 1999; Vernhes y col., 2002). Los pulsos de menor anchura presentan además otras ventajas adicionales ya que evitan el calentamiento excesivo de la muestra y reducen el posible paso de material del electrodo al medio de tratamiento o la posible formación de compuestos químicos (Sale y Hamilton, 1967; Sale y Hamilton, 1968; Mizuno y Hori, 1988; Lubicki y Jayaram, 1997). Ho y Mittal (2000) observaron que en sus condiciones de trabajo, pulsos de más de 20 µs de anchura podrían dar lugar a fenómenos de electrolisis. Como 15 durante 48 horas a 37ºC obteniéndose la curva correspondiente (figura 3.3). Según los datos obtenidos consideramos que la concentración de E. coli empieza a disminuir a partir de una concentración de cloruro sódico de un 4% (figura 3.3). Figura 3.3. Curva de inhibición de crecimiento de E. coli O157H7 por presencia de sal en el medio de cultivo. 3.4 Tratamiento de PEAV 3.4.1 Generador de pulsos eléctricos El estudio se realizó con dos generadores de pulsos eléctricos, uno preparado para suministrar tratamientos en microsegundos y otro en milisegundos. El correspondiente a los tratamientos en microsegundos fue suministrado por la empresa Scandinova (modulator PG, Scandinova, Uppsala, Suecia) y se describe con detalle en el Anexo I. El equipo es capaz de generar pulsos de onda cuadrada de 3µs de duración, de hasta 30 kV de voltaje y 200 A de intensidad, a una frecuencia de hasta 200 Hz. En el caso de los tratamientos con milisegundos, se utilizó un equipo (Coustest y col.,2013) que aplica pulsos cuadrados de 1ms y campos de 4 a 10 kV/cm (2.6 a 16 kJ/kg/pulso) a un frecuencia de 0.2 Hz. Su esquema eléctrico y descripción se detalla en el Anexo I. 3.4.2. Cámara de tratamiento Dados los objetivos de esta investigación, fue necesario utilizar un sistema de termostatación de la cámara de tratamiento que permitiera aplicar tratamientos a distintas temperaturas en condiciones isotérmicas. Para ello, se utilizó la cámara de tratamiento descrita por Saldaña et al. (2010) modificándose el sistema de termostatación y el procedimiento para la aplicación de los tratamientos, según estudios anteriores realizados en este centro (Condón, 2013), para poder evaluar la influencia de la temperatura en el efecto letal de los PEAV en un amplio rango de trabajo. 0 20 40 60 80 100 0123456 Porcentaje de supervivientes Porcentaje de sal 16 Figura 3.6. Esquema de la cámara de tratamiento estática de electrodos paralelos termostatados (Saldaña, 2012). La cámara está constituida por un tubo de polietileno cerrado en sus extremos por dos cilindros de acero inoxidable de 1,6 cm de diámetro y 4 cm de longitud. La distancia de separación entre los electrodos era de 2,5 mm, lo que da un volumen efectivo de tratamiento de unos 0,5ml. El interior de los electrodos es hueco, de manera que se pueden atemperar haciendo circular aceite dieléctrico de baja conductividad (1,4 µS/cm) a distintas temperaturas (figura 3.6) que se termostata haciendo pasar el aceite por un intercambiador de calor. 3.4.3. Metodología para la aplicación de los tratamientos de PEAV a diferentes temperaturas. Para la aplicación de los tratamientos de PEAV a distintas temperaturas, 10 µl de la suspensión microbiana se añadían a 990 µl del medio de tratamiento previamente atemperado a la temperatura de trabajo en un incubador de placas microtiter (Incubador FX, A.F. ingeniería S.L., Valencia). De esta manera, se conseguía un calentamiento prácticamente instantáneo de los microorganismos a la temperatura de trabajo. La suspensión atemperada se introducía con una jeringuilla estéril en la cámara de tratamiento que, a su vez, tenía los electrodos atemperados a la temperatura de trabajo. De esta manera, en un tiempo de alrededor de 30 segundos, la suspensión microbiana estaba acondicionada a la temperatura a la que se aplicaban los tratamientos de PEAV a distintas temperaturas. Tras el correspondiente tratamiento de PEAV, se extraía el contenido de la cámara de tratamiento con una jeringuilla estéril y se procedía a su dilución con el diluyente a temperatura ambiente. Para este estudio, se aplicaron campos eléctricos que variaban desde los 15 hasta los 25 kV/cm, aplicando entre 10 y 100 pulsos de 3 µs de anchura de pulso a una frecuencia de 0,5 Hz. El medio de tratamiento fue tampón McIlvaine de pH 3,5 de 1 mS/cm de conductividad eléctrica y termostatado a 20, 30 y 40ºC. (figura 3.7 en Anexo II) 2,5mm 40mm Ø 16 mm 17 3.5. Incubación y recuento de supervivientes Tras realizar las correspondientes diluciones decimales de las muestras en agua de peptona, se sembraron 0,1 ml en placas Petri a las que se adicionaba TSA+YE. Las muestras se recogieron por duplicado para realizar una segunda siembra en medio TSA+YE con el porcentaje de sal obtenido en los experimentos de concentración máxima no inhibitoria. Tras la siembra, las placas se incubaron a 36±1ºC durante 24 horas las TSA+YE y 48 horas las de TSA+YE y sal. Tiempos más largos de incubación no afectaban al número de microorganismos recuperados tras el tratamiento. 3.5.1. Recuento de supervivientes El recuento de los microorganismos se efectuó mediante un contador automático de colonias (mod. Protos, Analytical Measuring Systems, Cambridge, Reino Unido) (figura 3.8), adaptado para el contaje de placas densamente pobladas en anteriores investigaciones (Condón et al., 1996). 3.6 Análisis estadísticos de los resultados La letalidad de los tratamientos aplicados (PEAV) se determinó a partir del logaritmo decimal de la fracción de supervivientes. Dicha fracción de supervivientes se obtuvo como el cociente entre los recuentos de los microorganismos supervivientes en las muestras tratadas y en las no tratadas. Para investigar la influencia de la temperatura (T), el campo eléctrico (E), y la energía aplicada, así como sus posibles interacciones, en la inactivación por PEAV de E. coli O157:H7 se utilizó un diseño experimental de composición central y los resultados fueron analizados mediante regresión múltiple aplicando el método de superficie de respuesta. Todos los experimentos se realizaron al menos por duplicado. La función de respuesta de las variables ensayadas se estableció en base a componentes lineales, cuadráticos y sus interacciones según la siguiente expresión:    k ji jiij k iiii k iii XXXXY  1 2 1 0 Figura 3.8. Contador automático de colonias 18 Donde Y es la variable de respuesta; Xi y Xj son factores independientes; β0 es la ordenada en el origen; βi son los coeficientes de las relaciones lineales; βij los coeficientes de las relaciones cuadráticas; βij los coeficientes de las relaciones de interacción; y k el número total de factores independientes. Los términos de la ecuación final obtenida fueron analizados estadísticamente en base a los valores F de cada término. A continuación se aplicó el procedimiento de regresión paso a paso hacia atrás, eliminando del modelo aquellos parámetros que no eran estadísticamente significativos (P>0,05), mediante un análisis de varianza. Los análisis estadísticos (cálculo de los parámetros R2, error cuadrático medio (ECM), el cálculo de los intervalos de confianza para el 95%, así como los ajustes de los modelos, fueron llevados a cabo con los programas informáticos Excel XP (Microsoft Corporation, Seattle, Washington DF, EE.UU) y GraphPad PRISM® (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.). El diseño de composición central, el ajuste de los modelos obtenidos a partir de este diseño, la estimación de los coeficientes y la evaluación del nivel de significancia de los modelos se llevaron a cabo mediante el software Design-Expert 6.0.6 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, EE.UU.) 4. Resultados y discusión De forma general, la utilización de los PEAV como sistema de inactivación de microorganismos con el objetivo de pasteurizar alimentos líquidos, principalmente zumos, consiste en la aplicación de pulsos de anchura del orden de microsegundos y de intensidades por encima de los 10 kV/cm. Existen datos en la literatura que muestran que tratamientos con una anchura de pulso corta y una alta intensidad son más efectivos letalmente que tratamientos que administran pulsos de mayor anchura y menor intensidad de campo. Sin embargo, estos estudios se han realizado en el rango de microsegundos y campos por encima de los 10 kV/cm no existiendo datos comparables cuando se utilizan pulsos en el rango de milisegundos y menores intensidades de campo eléctrico. El debate ha surgido ya que en otras aplicaciones de los PEAV como es la extracción de componentes intracelulares de interés para la industria alimentaria, se pueden aplicar ambos tipos de pulsos, de microsegundos y altas intensidades del campo, o de milisegundos e intensidades inferiores a 10 kV/cm. La utilización de bajas intensidades y largos pulsos se ha planteado ya que los equipos que generan este tipo de pulsos son más económicos y, por tanto, con mayor viabilidad de aplicación industrial. 19 Esto es especialmente notable cuando los PEAV se aplican con el fin de pasteurizar alimentos líquidos en los que los tratamientos son muchos más intensos y los requerimientos de potencia de los equipos mayores. No obstante, si bien se ha estudiado el efecto de los PEAV para permeabilizar células eucariotas aplicando pulsos de distinta anchura (mili o microsegundos) y campo eléctrico, no existen datos en la literatura que permitan comparar la eficacia letal de tratamientos aplicados con mili o microsegundos sobre células procariotas como los microorganismos. De ahí la importancia de este trabajo que va a permitir por primera vez comparar la eficacia letal sobre microorganismos de pulsos de mili y microsegundos aplicados a distintas intensidades del campo eléctrico y número de pulsos para aplicar la misma energía en ambos casos y así poder comparar bajo las mismas condiciones experimentales los resultados. Además se ha incluido como variable la temperatura del medio que es un factor crítico, como se ha indicado en la introducción, en la eficacia letal del proceso. Para ello en esta investigación se ha utilizado Escherichia coli O157H7 como microorganismo de referencia utilizando como medio de tratamiento tampón McIlvaine de pH 3.5. Esto fue elegido de esta manera debido a que este microorganismo posee una resistencia elevada al tratamiento con pulsos eléctricos en este medio. El pH, como se ha comentado anteriormente, influye en los tratamientos con PEAV. Este valor de pH se ha tomado debido a que guarda estrechas similitudes con el pH que podemos encontrar en muchos alimentos, especialmente, en los zumos, que son los principales sujetos de estos tratamientos (Condón 2012). En primer lugar se presentarán los resultados obtenidos aplicando, a distintas temperaturas, tratamientos de microsegundos e intensidades del campo eléctrico por encima de 10 kV/cm en cuanto a su eficacia letal y daño generado en la población de E. coli O157:H7. Posteriormente, se mostrarán los resultados obtenidos con los tratamientos de milisegundos e intensidades inferiores a 10 kV/cm. Finalmente, se compararán los resultados obtenidos con ambos equipos y se discutirá el mayor o menor efecto letal de tratamientos de mili y microsegundos. 4.1. Inactivación de E. coli O157:H7 por PEAV con pulsos de microsegundos La Tabla 4.1 muestra los datos de inactivación de E. coli O157:H7 obtenidos en tampón de pH 3,5 tras la aplicación de tratamientos PEAV de campo eléctrico entre 15 y 25 kV/cm y 6,8 y 180 kJ/kg a distintas temperaturas en combinaciones establecidas en base al diseño experimental. Como se observa, y de forma general, la inactivación 20 incrementó con la intensidad del campo eléctrico, con la temperatura del medio de tratamiento y con la energía aplicada. T Campo Energía Ciclos Log de inactivación 20 15 67,5 0,84327306 20 15 6,75 0,86124398 20 20 66 0,93270691 20 25 187,5 1,26807051 20 25 18,75 0,98992301 30 25 103,125 1,03788208 30 15 37,125 0,81653323 30 20 120 1,03454876 30 20 66 0,99743305 30 20 66 1,02895052 30 20 12 0,94942874 40 15 67,5 1,80434222 40 15 6,75 1,26271868 40 20 66 2,00595658 40 25 187,5 2,84397323 40 25 18,75 1,84790835 Tabla 4.1 Datos de inactivación de E. coli O157:H7 obtenidos en tampón de pH 3,5 tras la aplicación de tratamientos PEAV de distinto campo eléctrico, energía y temperatura A partir de estos datos y con el fin de describir con más precisión el efecto de cada uno de los parámetros investigados, se llevó a cabo una regresión múltiple permitiendo obtener la siguiente ecuación matemática: 𝐿𝑜𝑔 𝑆(𝑡) = 3.857 − 0.266 × 𝑇 + 4.81 ×10−3 × 𝑇2+ 8.78 ×10−4 × 𝑇 × 𝐸 + 1.23 ×10−4 × 𝑇2× 𝑊 (Ecuación 4.1) donde Log10 S(t) son los ciclos logarítmicos de inactivación; T la temperatura de tratamiento (ºC); E la intensidad del campo eléctrico suministrado (kV/cm); y W la energía específica de tratamiento suministrada (kJ/kg). La tabla 4.2 muestra los coeficientes y el intervalo de confianza de los mismos para cada una de las variables del modelo así como el valor F de cada parámetro indicando su significancia en el modelo. Como se observa, la temperatura fue el factor que más influyó en la eficacia letal del tratamiento afectando incluso cuadráticamente. El campo eléctrico y la energía influyeron en menor medida estando condicionado su efecto a la temperatura de tratamiento (interacciones T*E y T*W). Por otro lado, la tabla 4.3 muestra la bondad del ajuste de la ecuación obtenida. Los índices R2, R2 ajustado y el error estándar indican que el modelo describe adecuadamente los datos experimentales. Esta bondad del ajuste, se observa más gráficamente en la Figura 4.1 21 donde se muestra la relación entre los valores obtenidos experimentales y los estimados con el modelo. Como se observa los datos estimados del modelo se alinean dobre la línea de equivalencia. Figura 4.1 Relación entre los valores obtenidos experimentales y los estimados con el modelo. Gracias a la ecuación desarrollada, se construyeron las Figuras 4.2, 4.3 y 4.4. La figura 4.2 muestra la gráfica de superficie respuesta que relaciona la influencia de la temperatura y de la energía específica aplicada en la inactivación de E. coli O157:H7 obtenida por ejemplo a 25 kV/cm. Gráficas similares se obtuvieron a otras intensidades de campo eléctrico dentro del rango investigado. Como se observa, la inactivación incrementó linealmente con la energía, pero cuadráticamente con la temperatura como quedaba indicado en la Ecuación 4.1. Esto significa que existen temperaturas que al aplicar PEAV apenas tienen efecto sobre la inactivación; sin embargo, a partir de un determinado valor (alrededor de los 27ºC), la inactivación incrementa notablemente. Por ejemplo de 1 ciclo logarítmico a 20ºC hasta casi los 3 log a 40 ºC. Log = b0 + b1*Tª + b2*Tª*Tª + b3*Tª*E + b4*Tª*W -95% 95% VIF b0 3,857 2,545 5,168 b1 -0,266 -0,359 -0,173 98,89 b2 0,00481 0,00329 0,00634 97,03 b3 0,000878 0,000200 0,00155 3,383 b4 0,000123 7,44391E-05 0,000171 1,413 |R| 0,979 R2 0,958 R2 adjusted 0,943 Error estandar 0,134 Tabla 4.2 Coeficientes, intervalos de confianza y valores F de cada parámetro del modelo. Tabla 4.3 Bondad del ajuste 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 DATOS ESTIMADOS DATOS OBSERVADOS 22 Figura 4.2 Gráfica de superficie-respuesta obtenida aplicando la ecuación 4.1 que relaciona los ciclos logarítmicos de inactivación con la energía y la temperatura de tratamiento PEAV aplicados a 25 kV/cm.. De modo similar a lo presentado en la figura 4.2, la figura 4.3 presenta la gráfica de superficie respuesta que relaciona la influencia de la intensidad del campo eléctrico y de la temperatura en la inactivación de E. coli O157:H7 obtenida por ejemplo a 180 kJ/kg. Gráficas similares se obtuvieron a otras energías aplicadas dentro del rango investigado. Como se observa, de nuevo la inactivación incrementó cuadráticamente con siendo 27ºC la temperatura a partir de la cual este factor influyó notablemente. Por otro lado, la intensidad del campo eléctrico también incrementó en la inactivación microbiana sin embargo este efecto fue poco marcado a bajas temperaturas siendo algo más notable a temperaturas de 40ºC. Figura 4.3 Gráfica de superficie obtenida aplicando la ecuación 4.1 que relaciona los ciclos logarítmicos de inactivación conseguidos al aplicar distintos campo eléctricos y temperatura con tratamientos PEAV de 180 kJ/kg.. 20,0 22,2 24,4 26,7 28,9 31,1 33,3 35,6 37,8 40,0 0,0 1,0 2,0 3,0 15,0 17,2 19,4 21,7 23,9 Tª Ciclos log inactivación Campo 2,0-3,0 1,0-2,0 0,0-1,0 23 Finalmente, la ecuación 4.1 también ha permitido obtener la Figura 4.4. Esta figura corresponde a la gráfica de superficie respuesta que relaciona la influencia de la intensidad del campo eléctricos y de la energía específica aplicada en la inactivación de E. coli O157:H7 obtenida por ejemplo a 40ºC. Como se observa, la inactivación incrementó linealmente con la energía y con la intensidad del campo eléctrico. La inactivación varió de los 1,5 ciclos logarítmicos a las intensidades del campo y energía aplicados hasta más de 2,5 ciclos logarítmicos a 25 kV7cm y 180 kJ/kg. Gráficas y conclusiones similares se obtuvieron a otras temperaturas dentro del rango investigado. Figura 4.4 Gráfica de superficie obtenida aplicando la ecuación 4.1 con una temperatura constante de 40ºC que relaciona los ciclos logarítmicos de inactivación con la energía y el campo suministrado. En resumen, se observa que la temperatura es el factor que más ha influido en la inactivación de E. coli O157:H7 dentro del rango de condiciones investigadas. Como ya se ha indicado en la introducción, la aplicación de pulsos eléctricos a temperaturas subletales se está investigado como estrategia para incrementar la eficacia letal de estos tratamientos PEAV o para reducir la intensidad de los mismos para conseguir un determinado nivel de inactivación microbiana en alimentos. Así como se observa, un tratamiento que inactiva 1,5 ciclos logarítmicos (180 kJ/kg a 25 kV/cm) a 27ºC, permitió inactivar casi 3 log cuando el mismo tratamiento se aplicó a 40ºC. Este mayor eficacia letal de los tratamientos PEAV a mayores temperaturas se ha achacado a la influencia de la temperatura en la transición de fase de los fosfoslípidos de la membrana citoplasmática de una estructura de gel a líquido-cristalina, lo que puede afectar a la estabilidad de la membrana celular (Jayaram y col., 1993; Saldaña y col., 2010) 24 4.1.1 Generación de daño subletal debido a la aplicación de tratamientos PEAV Los resultados obtenidos mediante la siembra de microorganismos en un medio no selectivo se corresponden con el objetivo de recuperar el mayor número de células que hayan sobrevivido al tratamiento, tanto vivas como dañadas. Con las mismas características que las originales y sin sobreestimar la efectividad letal del tratamiento. En este estudio, también se ha investigado si los tratamientos con PEAV causan daño subletal en los microorganismos que se detecta cuando se recuperan los micoorganismos en una medio selectivo donde sólo crecen microorganismos vivos no dañados por los tratamientos. La diferencia entre los ciclos de inactivación determinados con un medio no selectivo y otro selectivo se usó para calcular este daño subletal. Así y de forma paralela al estudio realizado en el apartado anterior, se investigó la recuperación de E. coli O157:H7 tras la aplicación de PEAV en un medio selectivo (TSA-EL con un 3% de NaCl). En este caso, en la tabla 4.1.1 se muestra no la inactivación obtenida al recuperar los microorganismos en el medio selectivo, sino los ciclos logarítmicos de células dañadas tras la aplicación de los distintos tratamientos. Tª Campo Energía CICLOS DE DAÑO SUBLETAL 20 15 67,5 0,30 20 15 6,75 0,01 20 20 66 0,77 20 25 187,5 1,34 20 25 18,75 0,86 30 25 103,125 2,08 30 15 37,125 0,81 30 20 120 2,15 30 20 66 1,60 30 20 66 1,32 30 20 12 0,81 40 15 67,5 1,28 40 15 6,75 1,74 40 20 66 1,36 40 25 187,5 0,12 40 25 18,75 0,24 Tabla 4.1.1 Número de células dañadas de E. coli O157:H7 en tampón de pH 3,5 tras la aplicación de tratamientos PEAV de distinto campo eléctrico, temperatura y energía específica. De forma general, se observa que en los tratamientos de intensidad intermedia es donde mayor número de células dañadas se detecta. Con el fin de describir con más 31 de la energía, es el parámetro que menos influencia tiene en la generaicón del daño de forma similar a lo que sucedía en la ecuación obtenida para los microsegundos. Por otro lado, la tabla 4.1.3 muestra la bondad del ajuste de la ecuación obtenida. Los índices R2, R2 ajustado y el error estándar indican que el modelo describe adecuadamente los datos experimentales aunque los índices son inferiores a los obtenidos en otros modelos, pero similares a los del daño generado por los microsegundos. Independientemente de esto, el modelo sirve para identificar qué factores y en qué rango se genera la mayor cantidad de daño, y, por tanto, las condiciones en las que se pueden desarrollar procesos combinados que aumenten la eficacia letal del proceso. A partir de la ecuación 4.4, se pueden obtener las siguientes gráficas de superficierespuesta en las que se describe la relación entre la temperatura y el campo eléctrico a una energía específica de, por ejemplo, 750 kJ/kg (figuras 4.2.1). Como se observa, el campo eléctrico tiene mucho efecto en la generación de daño a bajas temperaturas y menos a temperaturas más elevadas. En el caso de la temperatura, esta afecta en gran medida especialmente a los 27-28ºC a bajas intensidades del campo eléctrico, mientras que a los campos más altos, el daño se genera cuanto menos es la temperatura. Estos resultados tienen cierta similitud con los obtenidos en microsegundos en los que a las temperaturas indicadas y a campos menores es donde mayor daño se observa. Al igual que antes, sería en estas condiciones en las que se debería desarrollar procesos combinados que permitan inactivar a las células dañadas incrementando la eficacia letal de los tratamientos. Es decir, independientemente de la anchura de pulso aplicada, la generación de daño celular se produce en mayor medida a unas temperaturas aproximadas de unos 27 ºC y a intensidades intermedias o bajas de campo eléctrico y daño = b0 + b1*T + b2*E + b3*W + b4*T*T + b5*T*E + b6*T*W + b7*E*E + b8*T*T*E + b9*T*E*E + b10*T*W*W -95% 95% VIF b0 -30,01 -40,17 -19,84 b1 1,861 1,255 2,467 1152,5 b2 5,507 3,258 7,757 1152,6 b3 0,0018 0,000178 0,00350 21,77 b4 -0,026 -0,03608 -0,01724 1049,1 b5 -0,284 -0,382 -0,186 3893,4 b6 -9,81E-05 -0,000161 -3,49E-05 37,49 b7 -0,163 -0,304 -0,02255 896,40 b8 0,00351 0,00224 0,00478 1499,3 b9 0,00449 0,000240 0,00875 1078,9 b10 2,93E-08 2,85E-09 5,57E-08 14,36 R2 0,849 R2 adjusted 0,755 Error estandar 0,398 Tabla 4.2.2 Coeficientes, intervalos de confianza y valores F de cada parámetro del modelo. Tabla 4.2.3 Bondad del ajuste 32 energía en los rangos investigados. La existencia de una temperatura, a partir de la cual se observan distintos comportamiento independientemente de la anchura de pulso aplicado, podría indicar que a esas temperaturas se estaría produciendo cambios estructurales que condicionarían la viabilidad celular dependiendo de las condiciones de recuperación tras los tratamientos. Figura 4.2.1 Gráfica de superficie obtenida aplicando la ecuación 4.4 que relaciona el número de células dañadas al aplicar distintos campos y temperaturas con una energía de 750 kJ/kg. 4.3 Comparación de los modelos de microsegundo y milisegundos en la eficacia letal de los tratamientos Una vez descritos los modelos realizados para cada experimento, microsegundos y milisegundos, se hizo una comparación entre ambos con el fin de determinar cuál de los dos tipos de pulsos pueden resultar más beneficiosos, es decir, que permitan obtener la mayor inactivación con el menor consumo energético o con el menor tiempo de tratamiento. De este modo, se van a realizar comparaciones entre tratamientos en los que se hayan aplicado las condiciones más similares o determinar el nivel de inactivación de determinados tratamientos. En cualquier caso, y antes de realizar este análisis, hay que destacar que la temperatura es el parámetro que más ha influenciado en la eficacia letal del proceso independientemente de la anchura del pulso aplicado, estando muy condicionado por la intensidad del campo eléctrico sobre todo cuando se aplicaron milisegundos. En primer lugar, se ha determinado el nivel de inactivación alcanzado con distintos niveles energéticos aplicados con mili o microsegundos. Necesariamente, la Campo 33 intensidad del campo eléctrico es distinta para ambos casos ya que se estarían extrapolando resultados fuera del rango de los modelos desarrollados. Las figuras 4.5.1, 4.5.2 y 4.5.3 muestran los ciclos de inactivación estimados tras la aplicación de tratamientos PEAV con mili y microsegundos de 10 y 25 kV/cm, respectivamente, de distinto nivel energético y temperaturas del medio 20, 30 y 40 ºC. Figura 4.5.1, 4.5.2 y 4.5.3 Ciclos logarítmicos de inactivación conseguidos aplicando tratamientos de milisegundos (10 kV/cm) y microsegundos (25 kV/cm) de distinta energía y a temperaturas de 20, 30 y 40 ºC. Como se observa, en todos los casos la inactivación se incrementó con la energía aplicada. Dependiendo de la temperatura de tratamiento, el efecto de los mili y microsegundos fue diferente: a 20ºC, los microsegundos fueron más eficaces letalmente que los milisegundos, ya que permiten una mayor inactivación para un mismo nivel energético aplicado, mientras que a 30 y 40ºC, los milisegundos serían de elección. Es decir, tratamientos de alta intensidad y corta duración serían más adecuados para la inactivación microbiana a temperaturas más bajas, mientras que a temperaturas Energía Energía Energía Ciclos de inactivación Ciclos de inactivación Ciclos de inactivación 20 ºC 30 ºC 40 ºC 34 mayores, parecen más eficaces tratamientos de menor intensidad del campo eléctrico y mayor tiempo. Con el fin de determinar con mayor precisión la temperatura a partir de la cual los milisegundos son más eficaces letalmente que los microsegundos, se ha construido la figura 4.5.4. En ella, se muestran las combinaciones energía-temperatura a campos de 25 y 10 kV/cm para tratamientos aplicados con micro y milisegundos respectivamente, a partir de los cuales, se consiguen 2 ciclos logarítmicos de inactivación. Como se observa, hasta aproximadamente los 27ºC los tratamientos aplicados con microsegundos resultan más eficaces letalmente, mientras que a temperaturas superiores, serían los milisegundos los más adecuados. Los resultados obtenidos a menores temperaturas concuerdan con los datos existentes en la literatura. Sin embargo, debido a que es la primera vez que se realiza un estudio como este a distintas temperaturas de procesado, se ha podido observar que cuando la temperatura es más elevada, los milisegundos resultan más eficaces desde un punto de vista de inactivación microbiana. Por otro lado, esta gráfica también permite observar que el efecto de la temperatura es mucho más marcado al aplicar milisegundos que microsegundos. Así un incremento de la temperatura reduce notablemente el consumo energético del proceso cuando se aplican milisegundos más que cuando se aplican microsegundos. Un aumento de 10ºC la temperatura de tratamiento permitiría disminuir unos 1000 kJ/kg la energía necesaria para reducir 2 ciclos logarítmicos la población de E. coli O157:H7 con pulsos de milisegundos de 10 kV/cm, mientras que con microsegundos esta reducción sería de unos 150 kJ/kg a 25 kV/cm. Figura 4.5.4 Condiciones para 2 log con micro a 25 kV/cm y milisegundos con 10 kV/cm. 35 Si bien parece ser más ventajoso el uso de los milisegundos, los requerimientos energéticos son excesivamente elevados si se considera su aplicación industrial en la que los tratamientos se aplican de forma continua, a diferencia de este estudio que se ha hecho de forma discontinua para evitar un incremento de la temperatura del medio que puede influir en los resultados, y en la que toda la energía aplicada se transforma en calor debido al efecto Joule. Es por ello que se estima, que la máxima energía a aplicar seria entre 200 y 250 kJ/kg con el fin de que la temperatura final del proceso no sea tan elevada que produzca la muerte microbiana por el calor y no por los PEAV. Con el fin de comparar con mayor detalle el efecto de los PEAV en un rango de trabajo aplicable a escala industrial y en un amplio rango de condiciones para comparar el efecto de aplicar tratamientos de mili y microsegundos, se ha obtenido la gráfica de la figura 4.5.5. En ella, se muestra la energía necesaria para inactivar 1 y 2 ciclos logarítmicos de la población de E. coli O157:H7 a distintas intensidades del campo eléctrico y a temperaturas de 20 y 40 ºC respectivamente, utilizando pulsos de mili y microsegundos. Como se observa, el campo eléctrico afecta en gran medida en la eficacia letal de los tratamientos cuando se aplican en milisegundos permitiendo reducir notablemente el coste energético del proceso. No obstante, para conseguir la inactivación a 20 ºC, la aplicación de microsegundos requiere niveles energéticos mucho menores que con milisegundos. En el caso de los milisegundos, se requieren niveles superiores a 100 kJ/kg mientras que con microsegundos, inferiores a este valor. No obstante, cuando la temperatura de trabajo fue superior, la aplicación de milisegundos podría resultar interesante ya que se podría reducir tanto el coste energético del proceso como la intensidad de tratamiento debido al mayor efecto sensibilizante de la temperatura frente a los PEAV al aplicar milisegundos. Si bien estos resultados son de gran interés práctico sería muy interesante realizar experimentos a mayores niveles de inactivación (aumentando la intensidad de los tratamientos o la temperatura del medio de tratamiento) aunque en esas circunstancias se podrían alcanzar temperaturas que podrían producir daño celular o incluso la inactivación por calor de los microorganismos. Si bien cuando se aplican temperaturas más elevadas, el uso de pulsos de milisegundos podría resultar de mayor interés con el fin de inactivar microorganismos. Sin embargo se ha de considerar que el tiempo de tratamiento aplicado es superior que cuando se utilizan microsegundos. Para evidenciar esta circunstancia, la figura anterior 36 se ha reconstruido (figura 4.5.6) representando el número de pulsos aplicado con ambos tipos de pulsos considerando la energía aplicada con cada pulso de una determinada intensidad del campo eléctrico (1 pulso de 1 milisegundo de 10 kV/vm libera 16 kJ/kg, frente a los 2 kJ/kg aplicados cono 1 pulso de 3 microsegundos de 25 kV/cm), así como el tiempo de tratamiento aplicado expresado en milisegundos (figura 4.5.7). Si bien, debido a la mayor energía liberada por pulso de milisegundo, el número de pulsos a aplicar es menor que con microsegundos para aplicar el mismo nivel de energía, cuando se determina el tiempo de tratamiento, las diferencias entre aplicar mili y microsegundos se hacen notables. Así, y como se observa en la figura, el tiempo a aplicar con los pulsos de milisegundos es entre 10 y 100 veces superior que en el caso de los microsegundos. Por ejemplo, para inactivar 1 ciclo logarítmico de E. coli O157:H7 en tampón de pH 3.5 a 20ºC se hacen necesarios aplicar 100 kJ/kg con tratamientos de 4544 milisegundos (4.5 pulsos de 1000 microsegundos/pulso) de 11.6 kV/cm, o 343 microsegundos (115 pulsos de 3 microsegundos/pulso) de 17 kV/cm. Para 2 ciclos a 40 ºC, los tratamientos serían de unos 250 kJ/kg aplicados con 21039 microsegundos (21 pulsos de 1000 microsegundos/pulso) de 9 kV/cm, o 395 microsegundos (132 pulsos de 3 microsegundos/pulso) de 25 kV/cm. Si bien el tiempo de tratamiento es mucho más largo en el caso de los milisegundos, el menor número de pulsos y la menor intensidad del campo eléctrico a mayores temperaturas de procesado resultarían de gran interés a la hora de aplicarlos a nivel industrial ya que los equipos deberían tener menos potencia para generar numerosos pulsos de alta intensidad del campo eléctrico que como ya se ha indicado en la introducción, tienen una mayor dificultad técnica para diseñarse y, sobre todo, un mayor coste de los equipos. Sin embargo, se hace necesario evaluar en flujo continuo su potencial comparado de nuevo con la ya demostrada eficacia letal de pulsos de mayores intensidades del campo eléctrico y menores anchuras de pulso. 37 Figura 4.5.5 a) Combinaciones de energía específica y campo eléctrico a 20 y 40ºC para inactivar 1 (líneas continuas) y 2 ciclos logarítmicos (líneas discontinuas), respectivamente, de E. coli O157:H7 aplicando pulsos de mili (en rojo) y microsegundos (en verde). b) Combinaciones de energía específica y campo eléctrico a 20 y 40ºC para inactivar 1 (líneas continuas) y 2 ciclos logarítmicos (líneas discontinuas), respectivamente, de E. coli O157:H7 aplicando pulsos de mili (en rojo) y microsegundos (en verde). c) Combinaciones de energía específica y campo eléctrico a 20 y 40ºC para inactivar 1 (líneas continuas) y 2 ciclos logarítmicos (líneas discontinuas), respectivamente, de E. coli O157:H7 aplicando pulsos de mili (en rojo) y microsegundos (en verde). Pero quizás, el mayor inconveniente de la utilización de los milisegundos frente a los microsegundos es que los primeros pueden contribuir al desarrollo de especies químicas reactivas por fenómenos de electrolisis que se desarrollan cuando se aplican pulsos de anchura superior a los 20 microsegundos, además de producir el deterioro más rápido de los electrodo pudiéndose liberar partículas que pasen al alimento, incrementar la temperatura del medio de tratamiento, etc. (Sale y Hamilton, 1967; Sale y Hamilton, 1968; Mizuno y Hori, 1988; Lubicki y Jayaram, 1997; Ho y Mittal 2000). Si bien en esta investigación la temperatura del medio se ha controlado gracias al uso de una cámara termostatada en la que el máximo incremento de temperatura es de 4ºC, no se ha investigado el desarrollo de las posibles reacciones de electrólisis o liberación de compuestos ( en el desarrollo de este trabajo, se ha detectado una notable oxidación de a) b) c) 38 los electrodos de acero inoxidable utilizados al aplicar tratamientos de milisegundos, frente a la inexistente oxidación de los mismos al aplicar pulsos de microsegundos) que puedan estar afectando a la sensibilidad de los microorganismos a los PEAV y, por tanto enmascarando el efecto real de los tratamientos aplicados con milisegundos. Este es un aspecto que queda pendiente por investigar. 5. Conclusiones Las conclusiones obtenidas tras la realización de este trabajo y estudio de los datos expuestos anteriormente se pueden resumir en las siguientes: La inactivación obtenida con la aplicación de tratamientos de pulsos eléctricos de alto voltaje en el orden de microsegundos y milisegundos varía dependiendo de la modulación de parámetros de procesado como la energía suministrada, la intensidad de campo eléctrico y la temperatura de tratamiento. Concretamente al aumentar la temperatura se consigue una mayor inactivación, al igual que en el caso de la intensidad de campo y energía. Sin embargo la temperatura posee un efecto mayor en la inactivación obtenida que el resto de parámetros, sobre todo al traspasar el umbral de 27ºC y siendo más notable en el caso de los milisegundos. En el caso del daño subletal, este es mayor cuanto menor es la intensidad de tratamiento, es decir, cuanto menor es la temperatura y el resto de parámetros de proceso. De nuevo, se detecta mayor daño subletal a temperaturas próximas a los 27ºC independientemente de que se apliquen mili o microsegundos. En cuanto a la eficacia letal de tratamientos PEAV aplicados con pulsos de mili o microsegundos, se puede concluir que la aplicación de tratamientos con pulsos eléctricos en el orden de milisegundos produjo una eficacia letal mayor que en el caso de los microsegundos para un mismo nivel energético aplicado cuando la temperatura del medio era superior a 27 ºC. Por debajo de esta temperatura se ha confirmado lo descrito en la literatura: tratamientos de mayor intensidad y menor duración son más eficaces letalmente que los de baja intensidad y larga duración. En cualquier caso, la aplicación de tratamiento de milisegundo va a requerir tiempos de procesado más largos y la posibilidad de la generación de fenómenos de electrolisis que podrían afectar a la viabilidad de los microrganismos entre otros efectos 39 5.1. Conclusions These are the final conclusions of the current study: The obtained inactivation with the application of pulsed electric fields treatment in the range of microseconds or milliseconds depended on the applied energy, the electric field intensity and the treatment temperature. An increment of the temperature, electric intensity field and the applied energy produced a higher inactivation. This effect was higher with the variation of the temperature (Tª>27ºC) and in the millisecond range. Concerning the sublethal damage, this was higher when the treatment intensity was lower. Again this difference was more notable when the temperature was near 27ºC, both in milli and microseconds The lethal efficacy of the treatment in milliseconds was higher with temperatures greater than 27 ºC. Under that value the results confirmed the literature theories: treatments with higher intensity and lower duration are more lethal efficiently than treatments with lower intensity and higher duration. In any case the milliseconds treatments require longer processing times and, therefore, increases the probability of electrolysis problem that can affect the viability of microorganism. 6. Aportaciones de aprendizaje Con la realización de este proyecto he podido mejorar el desarrollo de algunas competencias transversales, las cuáles considero útiles para mi formación y posterior incorporación al mercado laboral, estas son:  Capacidad de adaptación a situaciones nuevas. La elaboración de un proyecto como estudiante me ha supuesto el enfrentarme a situaciones como nuevos ambientes de trabajo.  Capacidad de organización y planificación autónoma del trabajo  Dominio de aplicaciones informáticas relativas al ámbito de estudio. Para desarrollar los resultados he tenido que utilizar softwares informáticos, es el caso del programa Essential Regression de Excel, del cual había adquirido conocimientos muy básicos durante asignaturas anteriores.  Capacidad de comunicación correcta oral y escrita en castellano y capacidad de leer en inglés. Parte de la literatura científica consultada para la 40 redacción de este proyecto se encontraba en inglés lo que me ha hecho ampliar mis conocimientos en el idioma.  Capacidad de aplicación de los conocimientos teóricos a situaciones experimentales. Una de las principales consignas para poder trabajar en el laboratorio es haber adquirido antes los conocimientos teóricos necesarios, los cuales me han sido aportados durante estos años por las asignaturas de esta titulación.  Capacidad de transmitir información. La elaboración de un informe científico principalmente persigue el objetivo de transmitir información y es por lo que esta competencia queda justificada.  Adquisición de nuevos conocimientos en un área específica de mi titulación. La Tecnología de los Alimentos es una rama de la titulación que se divide en varios campos, en mi caso, la tecnología de los Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje me ha permitido adquirir conocimientos basados en tecnologías para conservar alimentos alternativas a las más tradicionales, como pueden ser el calor, el frío o la deshidratación.  Capacidad de realización y planificación de una propuesta científica. Junto con mi director de proyecto desarrollé una metodología experimental para llevar a cabo este trabajo en el laboratorio; considerando todos los parámetros necesarios para conseguir los objetivos de este trabajo.  Capacidad de interpretación de resultados. Esta es una de las competencias más trabajadas a los largo de la titulación, ya que en asignaturas previas he tenido que realizar informes de los resultados obtenidos en prácticas y en prototipos de alimentos (Practicum Planta Piloto). Con este trabajo he tenido la oportunidad de profundizar en la adquisición de ciertas competencias específicas de los 6 perfiles profesionales de la titulación: 1. Procesado de alimentos: - Identificar y valorar los problemas asociados a los diferentes alimentos y a su procesado y proponer aquellas medidas necesarias para solventarlos. - Conocer e interpretar los fundamentos de los procesos de la industria alimentaria, así como los aspectos técnicos más novedosos de cada proceso y/o producto, relacionados con su composición, funcionalidad, procesado, etc.