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Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos Memoria para optar al título de graduada en Biotecnología de Alejandra Tamayo Durán Director Manuel Arruebo Gordo Universidad de Zaragoza Facultad de Ciencias Departamento de Ingeniería Química, Instituto de Nanociencia de Aragón Curso 2013-2014 Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos ÍNDICE 1. Resumen 2. Antecedentes 2.1. Infección de dispositivos intravasculares 2.2. Reservorios de acceso venoso de larga duración 2.3. Quitosano 2.3.1. Obtención de la quitina y el quitosano 2.3.2. Características de la quitina y el quitosano 2.3.3. Propiedades físico-químicas del quitosano 2.3.4. Propiedades funcionales del quitosano 2.3.5. Aplicaciones del quitosano 3. Objetivo y planteamiento 4. Materiales y métodos 4.1. Impresión en 3D de un prototipo de Reservorio de Acceso Venoso 4.2. Síntesis de películas de quitosano 4.3. Recubrimiento de los reservorios mediante Dip-coating 4.4. Estudio de la adhesión del quitosano sobre el reservorio 4.4.1. Ganancia de peso 4.4.2. FTIR: Espectrometría Infrarroja con Transformada de Fourier 4.4.3. XPS: Espectroscopía de fotoelectrones emitidos por rayos X 4.4.4. Microscopía electrónica de barrido 4.5. Recubrimiento de los reservorios mediante Dip-coating con quitosano y un cromóforo 4.6. Cinética de liberación del cromóforo 4.7. Recubrimiento de los reservorios mediante Dip-coating con quitosano y un antibiótico 4.8. Ensayo biológico 5. Resultados y discusión 5.1. Síntesis de películas de quitosano 5.2. Recubrimiento de los reservorios mediante Dip-coating y estudio de la adhesión del quitosano 5.2.1. Ganancia de peso 5.2.2. FTIR 5.2.3. XPS 5.2.4. SEM 5.3. Cinética de liberación del cromóforo 5.4. Ensayo biológico 6. Conclusiones 7. Bibliografía 8. Anexo A 9. Anexo B Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 1 1. RESUMEN Se conocen numerosos casos en los que una amplia variedad de dispositivos médicos como catéteres, stents, prótesis, reservorios de acceso venoso, etc, se infectan tras su implantación en el cuerpo del paciente. Esto se debe a que durante este proceso, los microorganismos que habitan de forma habitual en el interior del cuerpo del paciente o en su epidermis o en la del personal médico sin las debidas medidas de prevención o que proceden de otras fuentes como material quirúrgico y equipos o líquidos de infusión contaminados, colonizan el tejido interno alrededor del dispositivo. Esta colonización puede provocar una infección localizada que en muchas ocasiones deriva en problemas más graves como bacteriemia en la que la infección se transloca al torrente sanguíneo, generando así complicaciones más severas que en la mayoría de los casos conllevan a la retirada del dispositivo médico infectado y a la reimplantación de un nuevo dispositivo con el consiguiente perjuicio para el paciente tras el sometimiento a una nueva cirugía y el consecuente elevado coste terapéutico. Como posible solución a este extendido problema, se plantea el desarrollo de una película polimérica que recubra el dispositivo en cuestión y que presente la capacidad de almacenar un antibiótico que será liberado localmente tras la implantación. De esta manera, junto con el tratamiento vía oral que se administra al paciente, se conseguiría reducir o evitar el riesgo de infección del dispositivo y se conseguirá una liberación local del antimicrobiano deseado. Abstract It is known that there are many cases in which a wide variety of medical devices such as catheters, stents, prosthesis, central venous access devices, etc. get infected after their implantation into the patient’s body. This is caused because during surgery, the microorganisms that inhabit regularly inside the patient´s body or on the epidermis of the own patient or the medical staff performing the surgery colonize the implanted device. Other potential sources of contamination are the use of non sterile surgical material, equipment or intravenous solutions. This colonization might cause a located infection that in many times could derive in a more serious problem like bacteraemia in which the infection spreads through the bloodstream leading in many cases to life threatening scenarios. After an implant is infected the current protocol is the removal of the infected medical device and the reimplantation of a new one, with the subsequent detriment of the patient’s quality of life after undergoing through a new surgery and the high therapeutic cost associated. As a possible solution to this extended problem is the development of a polymeric film that covers the mentioned device being able to store an antibiotic that would be released locally after implantation. In this way, altogether with the treatment that is administrated to the patient after and during surgery, this drug-eluting coating on the medical device will enable to reduce or avoid the risk of infection and also the side effects characteristic of the systemic administration of the drug will be reduced thanks to a local release of the desired antimicrobial at the target site. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 2 2. ANTECEDENTES Cada año, millones de pacientes en todo el mundo contraen infecciones durante la asistencia médica que reciben complicándose así su tratamiento y atención. Estas infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria también se denominan infecciones nosocomiales y constituyen un problema importante en la seguridad del paciente durante su ingreso hospitalario. Según datos aportados por la Organización Mundial de la Salud, más de 1,4 millones de personas en el mundo contraen infecciones en el hospital [1]. 2.1. Infección de dispositivos intravasculares Hoy en día, en los hospitales de todo el mundo la utilización de dispositivos intravasculares es imprescindible en la práctica clínica habitual. Alrededor de 150 millones de estos dispositivos se implantan cada año en pacientes de hospitales norteamericanos para una gran variedad de usos [2]. Sin embargo, uno de los principales problemas asociados a esta práctica es su infección, ya que constituye la principal causa de bacteriemia nosocomial y aunque la mortalidad asociada suele ser baja, de menos del 5%, llevan consigo una elevada morbilidad y coste económico [3]. Son muchos los tipos de infecciones asociadas a los dispositivos de acceso venoso pero de entre todas las complicaciones que pueden surgir, la más importante es la bacteriemia o la fungemia [4]. De manera general, los principales agentes implicados en estas infecciones son Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus, seguidos de otros microorganismos como Candida y otros hongos, enterococos, estreptococos, diferentes especies de Bacillus y algunas micobacterias [4-8]. Los patógenos relacionados con dichas infecciones pueden proceder de diferentes fuentes tales como, la flora cutánea del paciente o del personal que lo atiende y manipula los dispositivos y el material médico sin las debidas medidas de prevención, de líquidos de infusión y equipos contaminados o por diseminación hematógena derivada de una infección localizada en algún lugar alejado del cuerpo del paciente [4, 9]. En muchas ocasiones, se consigue frenar la infección mediante la administración de antibióticos. Sin embargo, en otros casos, estos tratamientos no son efectivos contra la infección, de manera que se debe proceder a la retirada del dispositivo. Para evitar llegar hasta este punto, se estudia la forma de prevenir o reducir en mayor medida el riesgo asociado, como por ejemplo: utilizar medidas estrictas de asepsia [10], uso de antibióticos y desinfectantes tópicos administrados localmente, tratamiento mediante sellado antibiótico [11] o revestir los dispositivos con plata [12] o con antimicrobianos [13-16]. Además de los catéteres, existen otros dispositivos de acceso venoso utilizados en la práctica clínica, como son los reservorios. En el transcurso de este trabajo, se va a utilizar prototipos similares a estos últimos por ser de más fácil manejo que los catéteres. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 3 2.2. Reservorios de acceso venoso de larga duración [17] Es habitual que surja la necesidad de acceder al sistema venoso central del paciente de forma reiterada y prolongada para administrar medicamentos y nutrición parenteral o realizar extracciones de sangre frecuentemente. Para evitar lesionar al paciente se recurre a la implantación de sistemas de acceso venoso prolongado (SAVP), denominados comúnmente reservorios. Estos dispositivos que se implantan por técnica quirúrgica (Figura 1, B), constan de una cámara de inyección, confeccionada con un material de acero quirúrgico (titanio) o poliéster plástico, que incluye una membrana de silicona con capacidad autosellante (Figura 1, A) [17]. 2.3. Quitosano El quitosano es un biopolímero natural que se obtiene a partir de la quitina. La quitina, uno de los principales componentes estructurales de artrópodos (insectos y crustáceos), moluscos y hongos, es uno de los polímeros naturales más abundantes, después de la celulosa. 2.3.1. Obtención de la quitina y del quitosano En general, la quitina se obtiene por métodos químicos a partir de conchas de crustáceos que incluyen tratamientos con álcalis y ácidos, con modificación de condiciones como la temperatura, tiempo de reacción o la concentración de álcalis y ácidos, entre otros. En cuanto al quitosano, hay diferentes procedimientos destinados a su obtención a partir de quitina, pero el método más ampliamente utilizado es la reacción de conversión de quitina en quitosano por N-desacetilación alcalina. Consiste en dejar libre el grupo amino del carbono 2 mediante un tratamiento con álcali fuerte a altas temperaturas. Este proceso consiste en someter la quitina a una solución concentrada de hidróxido de sodio o potasio (40-50%) a una temperatura de 100ºC o más. De esta manera, se hidroliza la mayoría de los grupos acetilos del polímero. No obstante, este proceso nunca alcanza el 100% de manera que el quitosano es un copolímero de 2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucosa y 2-amino-2-deoxy-β-D-glucosa (Figura 2) [18]. A. B. Figura 1. A. Esquema de un SAVP. B. Puntos donde más frecuentemente se sitúan los reservorios. Figura 2. Desacetilación de la quitina y su producto quitosano Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 4 El grado de desacetilación, el peso molecular medio y la composición de las cadenas del quitosano dependen de la fuente y el método de obtención, por lo tanto, este polímero puede presentar propiedades estructurales, físico-químicas, biológicas y funcionales diferentes. 2.3.2. Características de la quitina y el quitosano La quitina está formada por unidades de 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucosa unidas por enlaces β(1→4). Cuando ésta se somete a desacetilación, se obtiene el quitosano, un copolímero formado por unidades de 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucosa y 2-amino-2-deoxy-β-D-glucosa unidos por enlace β(1→4). La proporción entre estos dos polímeros es lo que se denomina grado de desacetilación, DD (del inglés degree of deacetylation). 2.3.3. Propiedades físico-químicas del quitosano  Peso Molecular. Puede ser muy variable. En el mercado se dispone de quitosano comercial de peso molecular bajo, medio y alto (Tabla 1) [12]. En este proyecto se utilizará el quitosano de peso molecular medio.  Grado de desacetilación. Representa el porcentaje de grupos amino que quedan libres en la molécula de quitosano (Tabla 1) [12]. El DD, junto con el peso molecular Mw (del inglés molecular weight), son los principales parámetros de caracterización del quitosano que determinan sus propiedades funcionales. Tabla 1. Grado de deacetilación medio y peso molecular medio de diferentes quitosanos probados Quitosano Bajo Medio Alto DD (%) 86±3 89±2 85±3 Peso molecular medio (kDa) 369±4 1278±8 2520±9  Naturaleza policatiónica. En presencia de ciertos ácidos, los grupos amino libre pueden ser protonados adquiriendo así carga positiva que otorga al quitosano comportamiento de policatión.  Estructura rígida. La formación de numerosos enlaces por puentes de hidrógeno entre las cadenas de quitosano, le confiere estabilidad térmica y rigidez. El quitosano se descompone a 170ºC [19], degradándose antes de fundirse.  Insoluble a pH neutro o alcalino. El quitosano es insoluble en agua o en disoluciones con pH básico. Sin embargo, se disuelve con facilidad en soluciones diluidas de la mayoría de los ácidos orgánicos (en general, en aquellas soluciones ácidas con pH menor a su pKa ≈ 6-7 [20]).  Higroscópico. Posee la capacidad de absorber agua (absorber humedad del medio circundante). Esta capacidad se debe a la presencia de gran cantidad de grupos OH terminales que forman puentes de hidrógeno con las moléculas de agua del medio. De esta manera, se incorpora líquido en el interior de la matriz, produciéndose así su hinchamiento. En este principio se basa el éxito de este proyecto. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 5  Carácter filmogénico. En las propiedades filmogénicas del quitosano, juegan un importante papel los grupos hidroxilo y amino de sus cadenas gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre ellos. Cuando el quitosano se disuelve en ácido, los grupos amino se protonan y estos puentes de hidrógeno se disocian, produciéndose así el hinchamiento de la película. Basándose en este principio, en 1974, Muzzarelli [21], planteó un procedimiento para obtener películas de quitosano. Se trata del método de evaporación del solvente. En este proyecto es este método el que se va a utilizar para llevar a cabo los recubrimientos de los dispositivos médicos elegidos, ya que por experiencia previa se ha observado que se obtiene una película más homogénea y la compleja geometría de la pieza condiciona el procedimiento a utilizar. Sin embargo, existe una amplia variedad de procedimientos tales como compresión, extrusión, precipitación, spin-coating y casting, entre otros. 2.3.4. Propiedades funcionales del quitosano  Biocompatible. Material capaz de interaccionar con los tejidos de un sistema vivo sin causar daños, efectos tóxicos o reacciones biológicas por parte del huésped que lo aloja.  Biodegradable. Material que no genera productos dañinos como resultado de su degradación. Los enlaces β(1→4) de la quitina y el quitosano son degradados in vivo por la enzima lisozima presente en el organismo humano [22, 23] y los subproductos de degradación se incorporan fácilmente a distintas rutas metabólicas o son excretados [24].  No tóxico (baja toxicidad). Presenta una baja toxicidad lo que lo hace un biomaterial ideal para una gran cantidad de usos y aplicaciones en medicina, industria, etc.  Acción antibacteriana de amplio espectro. La actividad antimicrobiana del quitosano depende del microorganismo pero lo más ampliamente extendido es que tiene un efecto inhibitorio. En cuanto al mecanismo de acción antimicrobiana de este polímero, los investigadores proponen tres posibles acciones [25, 26]: A. Carácter catiónico: relacionado con la protonación de los grupos amino del quitosano disuelto en soluciones ácidas. Estos grupos amino NH3+ cargados positivamente, interaccionan con la membrana celular con carga negativa de las bacterias provocando así distintos efectos dañinos para el microorganismo. B. Agente quelante: a pH ácido forma complejos con metales como Cu2+,Co2+, Fe2+, Mg2+,Ni2+ y Zn2+, además de cationes divalentes. De esta manera, desestabiliza la membrana celular, inhibe el crecimiento microbiano, la producción de toxinas y la disponibilidad de nutrientes esenciales para los microorganismos. C. Penetración al interior de la célula: fragmentos de quitosano de bajo peso molecular pueden penetrar en el interior de los microorganismos, impedir su crecimiento, inhibir gran variedad de enzimas e interferir en la transcripción del ADN en ARNm. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 6 2.3.5. Aplicaciones del quitosano Gracias a sus beneficiosas características y propiedades, el quitosano se está convirtiendo en una valiosa herramienta en muchos campos distintos como pueden ser la veterinaria y la medicina así como en diferentes ámbitos de la industria que incluyen la alimentación, la agricultura, cosmética, etc. En medicina se usa para:  DES: Drug Eluting Stent. Son stents que liberan un fármaco lentamente para bloquear la proliferación celular y evitar el crecimiento excesivo de tejido y el estrechamiento del stent (restonosis intra-stent). Sheng Meng et al. (2009) han desarrollado un recubrimiento formado por quitosano y heparina con el fin de resolver este problema [27].  Encapsulación de fármacos. El quitosano puede actuar como vehículo para encapsular un fármaco, de manera que el fármaco queda protegido y se libera de forma controlada o sostenida y es absorbido por el epitelio. Numerosos estudios han elaborado distintos sistemas de encapsulación de fármacos utilizando quitosano de diferentes pesos moleculares y en distintas concentraciones combinado con agentes entrecruzantes y otros polímeros [28-31].  Sistema de liberación de fármacos. Consiste en utilizar películas de quitosano para recubrir comprimidos o dispositivos y como sistema de liberación controlada de fármacos. El desarrollo de películas de quitosano para recubrir dispositivos junto con el quitosano como sistema de liberación de fármacos, son los dos aspectos que en combinación, van a ser estudiados en este proyecto. 3. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO El objetivo de este trabajo consiste en depositar sobre un dispositivo médico de una manera estable y sin despegarse, una película de un polímero con capacidad higroscópica de absorber un antibiótico diluido en agua. El dispositivo elegido es un reservorio de acceso venoso prolongado y el polímero seleccionado para su recubrimiento es el quitosano por sus beneficiosas características y propiedades tales como biodegradabilidad, biocompatibilidad, baja toxicidad y acción antibacteriana. En cuanto al antibiótico seleccionado se trata del ciprofloxacino puesto que es un antimicrobiano de amplio espectro que actúa frente a bacterias Gram positivas y negativas. Para desarrollar esa película polimérica cargada con el fármaco, se lleva a cabo un proceso de recubrimiento por inmersión o dip-coating. Posteriormente, el reservorio recubierto de quitosano y cargado con el fármaco será ensayado con un cultivo de Staphylococcus aureus con el propósito de evaluar la capacidad antimicrobiana de la pieza. El motivo de elegir este microorganismo, se debe a que junto con Staphylococcus epidermidis, son los agentes bacterianos más utilizados en los estudios relacionados con la traumatología y cirugía ortopédica, por ser los principales causantes de las infecciones nosocomiales. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 7 La finalidad de desarrollar este dispositivo es que una vez implantado en el paciente, libere el antibiótico que almacena la película del polímero depositada sobre la superficie de la pieza, ejerciendo así un efecto protector contra la flora microbiana que haya podido acceder al dispositivo para colonizar su superficie. De este modo, se consigue evitar o reducir localizadamente el riesgo de infección en las primeras horas de la implantación que constituyen el punto más crítico. Al representar una administración de antibiótico localizada las dosis necesarias para erradicar la potencial infección serían, de esta manera, menores que las necesarias cuando dicho antibiótico se aplica sistémicamente. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Impresión en 3D de un prototipo de Reservorio de Acceso Venoso Para poder llevar a cabo este proyecto, era necesario contar con un dispositivo médico sobre el que desarrollar el recubrimiento. En este caso, se decidió utilizar un reservorio de acceso venoso de larga duración. Dado que el dispositivo original usado hoy en día en clínica tiene un precio elevado, entre 300 y 600 euros, y dado el elevado número de piezas necesarias para realizar el estudio, fue necesario desarrollar un prototipo, réplica del original aunque no funcional (Figura 3), mediante una impresora 3D (ver anexo A, Equipos). Se utilizan tres materiales distintos para la impresión de los reservorios, a los que se denominarán A, B y C a lo largo del trabajo (ver anexo A, Especificaciones de los materiales para fabricar los prototipos). Se desconoce con exactitud la naturaleza de dichos materiales debido a las políticas de privacidad y patentes de la empresa que los aporta. No obstante se sabe que son algún tipo de metacrilato. 4.2. Síntesis de películas de Quitosano En primer lugar se llevó a cabo la síntesis de una película de quitosano (ver anexo A, Reactivos), por el método de evaporación del solvente [12]. A. B. Figura 3. A. Prototipo de reservorio de acceso venoso obtenido a partir de una impresora en 3D.B. Reservorio de acceso venoso original utilizado como modelo. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 14  Control positivo: reservorio sin recubrir que se pone en contacto con el cultivo bacteriano para comprobar que en condiciones normales existiría crecimiento. Añadir a un bote 40 mL de TSB y la concentración necesaria del cultivo de 109 UFC/mL para obtener una concentración final de 102 UFC/mL y depositar una pieza sin recubrir.  Control negativo: reservorio sin recubrir que se pone en contacto con medio de cultivo sin inocular para comprobar que el reservorio se encuentra estéril y no habría crecimiento. Añadir a un segundo bote 40 mL de TSB y depositar una pieza sin recubrir.  Control negativo del antibiótico: para comprobar el poder bactericida del antibiótico. Añadir a un tubo con 2 mL de TSB, la cantidad necesaria de ciprofloxacino filtrado para alcanzar una concentración de 100 µg/mL.  Triplicado de las piezas: tres reservorios recubiertos con quitosano y cargados con ciprofloxacino para estudiar la capacidad de la película de polímero de liberar el antibiótico y reducir o impedir el crecimiento bacteriano. Añadir a 3 botes 40 mL de TSB y la concentración necesaria del cultivo de 109 UFC/mL para obtener una concentración final de 102 UFC/mL. Depositar en cada bote las tres piezas recubiertas de quitosano y cargadas con el antibiótico. Quinto día Tras la incubación de los reservorios con el cultivo de S. aureus, se procede a hacer diluciones decimales de cada cultivo para plaquear y contar el número de células viables presentes (hasta 107 UFC/mL) con el objetivo de conocer cuántos ciclos logarítmicos se ha conseguido reducir con los reservorios de acceso venoso recubiertos de quitosano y cargados con ciprofloxacino, con respecto al control positivo. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Síntesis de películas de Quitosano Mediante el método de evaporación del solvente se obtiene una película de quitosano de aspecto homogéneo, libre de poros, plástico, transparente y fácilmente quebradizo (Figura 6). El espesor de la película depende de la cantidad de solución que se vierta en la placa de Petri. Figura 6. Película de quitosano sintetizado a partir del método de evaporación del solvente. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 15 5.2. Recubrimiento de los reservorios mediante Dip-coating y estudio de la adhesión del quitosano Tras realizar el dip-coating de las piezas con el hidrogel de quitosano, se ha estudiado si el polímero se ha depositado eficientemente sobre la superficie del reservorio mediante ganancia de peso y técnicas analíticas como son FTIR, XPS y SEM. 5.2.1. Ganancia de peso  Dip-coating con quitosano En primer lugar se llevo a cabo dip-coatings de 2 y 4 recubrimientos para verificar si a mayor número de capas se incrementaba el espesor de la película. No se observó este efecto ya que se obtuvo una ganancia de peso similar con 2 capas y con 4, lo que podría deberse a que existe un espesor máximo de la película que tiene estabilidad en el soporte. Es decir, si se intentan depositar muchas capas una encima de la otra, al final el propio peso hace que la fuerza de adhesión con el soporte no sea suficiente para mantener la película adherida. Por lo tanto, se descartó realizar dip-coating de más de dos capas y de ahí en adelante se realizan todos de dos recubrimientos. De manera general, llevando a cabo dos recubrimientos invirtiendo la pieza como se ha comentado anteriormente, se consigue duplicar la ganancia de peso con respecto a la realización de un único recubrimiento (Tabla 2). Tabla 2. Promedios y desviaciones estándar de las ganancias de peso en las piezas recubiertas con quitosano de los tres tipos de soporte utilizados Pieza Nº de recubrimientos Promedio Desviación estándar Piezas recubiertas de quitosano 1 0,012 0,005 2 0,024 0,012  Dip-coating con quitosano y rodamina En todas las piezas se han realizado dos recubrimientos y se ha tomado una medida del peso tras cada uno de ellos. En promedio, se observa que tras el segundo recubrimiento se consigue una mayor ganancia de peso con respecto al primero, aproximadamente del doble, tal y como ocurría en el caso anterior con el recubrimiento de quitosano solamente. (Tabla 3). Tabla 3. Promedios y desviaciones estándar de las ganancia de peso para blancos sin recubrir y piezas recubiertas de quitosano y cargadas con rodamina Pieza Nº de recubrimientos Promedi o Desviación estándar Blanco 1 0,008 0,005 2 0,020 0,012 Piezas recubiertas de quitosano y rodamina 1 0,014 0,013 2 0,02 0,009 Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 16  Dip-coating con quitosano y ciprofloxacino En este caso, se realiza el dip-coating con quitosano y ciprofloxacino. Como en los dos casos anteriores, se observa, en promedio, una mayor ganancia de peso tras el segundo recubrimiento que tras el primero (Tabla 4). Tabla 4. Promedios y desviaciones estándar de las ganancias de peso para blancos sin recubrir y piezas recubiertas de quitosano y cargadas con ciprofloxacino Pieza Nº de recubrimientos Promedio Desviación estándar Blanco - - - Pieza recubierta 1 0,019 0,011 2 0,024 0,009 Con estos resultados se puede concluir que con el dip-coating con quitosano, con quitosano + rodamina y con quitosano + ciprofloxacino, llevando a cabo dos recubrimientos, se obtiene una ganancia de peso similar en los tres casos. Al añadir el ciprofloxacino o la rodamina al hidrogel de quitosano para cargar la película depositada, se observa una ganancia de peso similar que la conseguida depositando la película de quitosano sin ser cargada con ningún compuesto añadido. De manera que, prácticamente la totalidad en la ganancia de peso adquirida se debe a la aportación de la película de quitosano depositada, excepto con la pieza blanco de rodamina puesto que se observa interacción con el soporte. De manera general, en todos los dip-coatings que se han llevado a cabo, tanto con quitosano solo como con quitosano y rodamina o ciprofloxacino, se puede decir que la heterogeneidad en la ganancia de pesos puede deberse a que la velocidad de extracción de la bomba peristáltica utilizada variaba de unos recubrimientos a otros ya que era difícil ajustar la misma velocidad en todas las ocasiones. En el futuro se plantea utilizar una bomba automatizada para minimizar el error de las bombas peristálticas. 5.2.2. FTIR  Espectros del quitosano y los polímeros sin recubrir Para poder identificar en los reservorios recubiertos con quitosano los picos que le corresponden, es necesario obtener los espectros del quitosano (ver anexo B, Resultados, Figura 1) y los reservorios sin recubrir (blancos, ver anexo B, Resultados, Figura 2). I. Asignación de los principales picos en el espectro del quitosano:  El pico amplio en torno a 3500-3300 cm-1 corresponde al stretching del enlace O-H y NH [34, 35].  El pico de la amina primaria se localiza alrededor de 1640-1560 cm-1 y el de la amina secundaria alrededor de 1550-1450 cm-1 [36].  El pico de la amida se localiza a en torno a 1645-1653 cm-1. La presencia de un grupo amida se debe a que el quitosano elegido no tiene un grado de desacetilación del 100%, es decir, hay una mezcla de quitosano y de quitina que es la que contribuye a la aparición del grupo amida [35].  La banda correspondiente al stretching C-H se encuentra entre 2864-2900 cm-1 [35, 37]. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 17 1800 1600 1400 1200 Wavenumber (cm-1) Figura 7. Comparación de los espectros del quitosano (azul), y la pieza de polímero A antes (rojo) y después (negro) del recubrimiento. Se observa una nueva banda a 1568 cm-1 correspondiente a la reacción entre los grupos amino del quitosano y los grupos carboxilo del acrilato. II. Asignación de los picos en el espectro de los polímeros sin recubrir: los espectros de los tres blancos de los diferentes polímeros tienen un aspecto similar. Presentan bandas asociadas a los acrilatos (Tabla 5). Tabla 5. Asignación de los picos en el espectro de los polímeros A, B y C sin recubrir Banda (cm-1) Asignación Polímero B Polímero C Polímero A 1726 1724 1724 C=O stretching [41] 1638 1638 1638 acrylate double bond stretching [41] 1450 1450 1450 distortion vibration of CH2 [42] 1389 1389 1389 distortion vibration of CH2 [42] 1158 1158 1158 C–O stretching [43]  Espectros de los polímeros recubiertos En los tres tipos de polímeros recubiertos, aparece un nuevo pico a aproximadamente 1568 cm-1 (Figuras 7-9). Esta banda corresponde al estiramiento asimétrico de los grupos carboxilos e indica la reacción que ha tenido lugar entre los grupos amino del quitosano y los grupos carboxílicos del acrilonitrilo del soporte [38, 39]. Esta banda es la evidencia del éxito de la deposición del quitosano en los polímeros a través de la reacción entre los grupos amino del quitosano y los grupos carboxílicos del acrilato [40]. 5.2.3. XPS La composición atómica de la superficie del polímero analizada por XPS señala que el ratio atómico N/C para los polímeros sin recubrir A, B y C es 0.008, 0.022 y 0.011 respectivamente (Tabla 6). La presencia de nitrógeno en los polímeros se asocia al grupo R-CN en la superficie [44]. Sin embargo, sólo para el polímero B la composición de N superficial es superior al 1 at. % Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 18 Tras el recubrimiento con quitosano, este ratio se incrementa 3,3 y 7,2 veces para el polímero A y C, respectivamente. Sin embargo, no se observa incremento para el polímero B. A pesar de que los espectros de los polímeros sin recubrir son similares, se desconoce exactamente la 1800 1600 1400 1200 Numero de onda (cm-1) chitosan Pol B blanco PolB Ch Figura 8. Comparación de los espectros del quitosano (azul), y la pieza de polímero B antes (rojo) y después (negro) del recubrimiento. Se observa una nueva banda a 1568 cm-1 correspondiente a la reacción entre los grupos amino del quitosano y los grupos carboxilo del acrilato. 1800 1600 1400 1200 Numero de onda (cm-1) Pol C B chitosan Figura 9. Comparación de los espectros del quitosano (azul), y la pieza de polímero C antes (rojo) y después (negro) del recubrimiento. Se observa una nueva banda a 1568 cm-1 correspondiente a la reacción entre los grupos amino del quitosano y los grupos carboxilo del acrilato. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 19 causa de esta diferencia con respecto a los otros dos polímeros. Probablemente esa diferencia se deba a la distinta naturaleza de cada uno de los polímeros sustrato. Lo que se observa mediante FTIR es que tras enlazarse el quitosano sobre el polímero la dirección del desplazamiento de la banda en torno a 1724 cm-1 atribuida a la vibración del enlace C=O es distinto en el caso del polímero A y C y en el caso del polímero B indicativo de una distinta química de superficie para cada polímero. El ajuste de los picos de nitrógeno, un pico alrededor de 400 eV muestra la presencia de grupos R-CN mencionados anteriormente en los polímeros sin recubrir [40]. Después del recubrimiento con quitosano, aparecen dos picos nuevos, uno en torno a 400.1-400.7 eV perteneciente al grupo amida y otro en torno a 401.5-402.0 eV perteneciente al grupo amina protonado. El pico a 399 eV podría estar relacionado con el grupo NH2 del quitosano, el pico a 400 eV se atribuye a la amida y/o al enlace C-N y el pico a 401 eV a la amina protonada. El ajuste de los picos de nitrógeno (Tabla 7) muestra claramente la presencia de quitosano por la incorporación de las aminas libres y protonadas al polímero base. La aparición del pico correspondiente a los –NH3+ se debe al quitosano. Tabla 6. Espectro general de los tres polímeros recubiertos y sin recubrir Energía de enlace (eV) % Atómico N/C C 1s O 1s N 1s Blanco polímero A 284.9 86.91 531.7 12.39 400.0 0.70 0.008 Polímero A recubierto 284.9 78.19 532.8 17.27 399.5 4.54 0.058 Blanco polímero B 284.9 80.94 532.1 17.22 400.2 1.83 0.022 284.9 87.12 532.0 11.12 399.7 1.76 0.020 Polímero B recubierto 284.9 82.27 532.2 16.24 399.9 1.48 0.018 284.9 85.84 531.7 12.68 399.7 1.48 0.017 Blanco polímero C 284.9 81.20 532.3 17.91 400.2 0.89 0.011 Polímero C recubierto 284.9 79.86 532.6 17.46 400.1 2.68 0.036 Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 20 Tabla 7. Deconvolución del N 1s para los tres polímeros sin recubrir y recubiertos [46] Muestra Energía de enlace (eV) % atómico Grado de desacetilación -NH2 amina -HN-C=O Amida y/o C-N [47] -NH3+ Amina protonada Polímero A sin recubrir 399.9 100 % - - Polímero A recubierto 399.4 67% 400.1 18% 401.5 15% 82% Polímero B sin recubrir 400.1 100% - - Polímero B recubierto 399.7 62% 400.7 13% 401.9 25% 87% Polímero C sin recubrir 400.1 100% - - Polímero C recubierto 399.8 70% 400.1 13% 402.0 17% 87% El valor del grado de desacetilación, se calcula con la suma de la concentración atómica de los grupos amino y amino protonados. Como era de esperar, ese valor es similar en los tres polímeros recubiertos. Este valor es aproximado porque el pico de NH2 podría tener también contribución del polímero base [45]. 5.2.4. SEM En las imágenes obtenidas por con el microscopio electrónico de barrido (ver anexo B, Resultados), no se puede apreciar la película de quitosano adherida. Esto podría deberse a que su espesor es inapreciable para esta técnica. Sin embargo, la presencia de quitosano queda evidenciada con los resultados de XPS y FTIR mostrados anteriormente. 5.3. Cinética de liberación del cromóforo Como se ha mencionado anteriormente, el objetivo de recubrir el reservorio con quitosano y cargado con un cromóforo, que se utiliza como molécula modelo, es detectar, de una manera fácil y sencilla con espectrometría de UV-Visible, la cantidad de compuesto que la película de quitosano es capaz de liberar al medio. Sin embargo, este ensayo no es del todo representativo ya que al finalizar la liberación, se sigue observando que la pieza está coloreada. Esto se debe a que el cromóforo ha interaccionado con el soporte o bien covalentemente o por puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas, etc. Por lo tanto en el caso de la rodamina, se obtiene una idea aproximada de la cantidad que la película de quitosano libera al medio pero no la máxima cantidad que es realmente capaz de liberar, ya que una gran mayoría ha reaccionado químicamente con el soporte (Figura 10). Idealmente una fisisorción débil sería ideal para producir una total liberación del fármaco utilizado. Sin embargo, la prueba con el cromóforo indica que la interacción de éste con el polímero es fuerte y que no se libera completamente de los dispositivos. Otra hipótesis sería el hecho de que se hubiese alcanzado la saturación en el medio de liberación. Al haberse alcanzado ésta, la liberación del cromóforo residual quedaría impedida por estar en equilibrio. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 21 En ambos ensayos de liberación, tanto para el polímero A como para el B, se observa el efecto del aumento de la concentración de rodamina en el medio durante los primeros 10 minutos y posteriormente sigue aumentando pero más lentamente, estabilizándose así los valores, probablemente por haberse alcanzado la saturación en el medio de liberación. En el caso del polímero A, contradictoriamente se observa que el blanco ha captado y libera mayor cantidad de rodamina al medio. Al contrario que lo que ocurre con el polímero B que se observa más claramente el efecto de la película de quitosano en dos de las tres piezas (Figura 11). 5.4. Ensayo biológico Una vez que se han obtenido los reservorios recubiertos de quitosano y cargados con el antibiótico, se ha procedido a enfrentarlos a un cultivo de 102 UFC/mL de Staphylococcus aureus durante 24 horas a 37ºC. Tras dicha incubación se procede a realizar el método de diluciones seriadas y recuento en placa. Figura 10. Reservorios recubiertos de quitosano y cargados con rodamina antes (izquierda) y después (derecha) del ciclo de liberación. Tras la liberación se sigue apreciando color en la pieza debido a la interacción química entre la rodamina y el soporte. Figura 11. Cinética de liberación del polímero A y B respectivamente, de un blanco sin quitosano y bañado en rodamina y piezas recubiertas de quitosano y cargadas con rodamina. Se observa el aumento de la concentración del cromóforo en el medio en función del tiempo. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 22  Incubación de las piezas Tras las 24 horas de incubación a 37ºC de los reservorios con un cultivo de 102 UFC/mL de Staphylococcus aureus, en el control positivo se observa turbidez en el medio, evidencia de que ha habido crecimiento, lo que era de esperar. Sin embargo, el control negativo que carecía de inoculación bacteriana, también se observa crecimiento. Este hecho se debe a que el método de esterilización elegido no ha sido efectivo. Industrialmente la esterilización por rayos gamma es habitual, sin embargo no disponemos en nuestro laboratorio de dicha posibilidad. La esterilización mediante radiación ultravioleta se ha demostrado que no es completamente eficiente en la eliminación de la contaminación microbiana. Igualmente el uso de una estufa Pasteur (calor seco) está limitada ya que los polímeros soporte no pueden resistir las condiciones de esterilización (160ºC, 2h) sin fundirse. El autoclavado también comprometería la estabilidad del polímero. Por ello se pensó que el uso combinado de radiación ultravioleta junto con vapores de etanol sería suficiente para esterilizar la superficie. Sin embargo no lo fue. Es importante puntualizar que algunos de los polímeros utilizados en impresoras 3D son autoclavables, sin embargo su coste es muy elevado. En el futuro se diseñará un sistema de esterilización con etanol líquido, evaporación de los restos del alcohol y sellado para asegurar su esterilización. En cuanto al cultivo de las piezas recubiertas, no se observa turbidez en el medio lo que a priori evidencia el éxito de la liberación del antibiótico por parte de la película de quitosano depositada sobre la superficie de los reservorios (Figura 12). Además, el hecho de que en el control negativo haya aparecido crecimiento cuando no debería de haberlo, da más peso al poder antimicrobiano del reservorio ya que éste ha sido capaz de inhibir el crecimiento de S. aureus así como de todas aquellas especies que se encontraban presentes en el reservorio contaminado. No obstante aunque a priori no se observe turbidez en el medio, es necesario llevar a cabo un recuento en placa por el método de las diluciones seriadas para determinar cuantitativamente el número de células viables presentes en el cultivo. Además, como se ha mencionado anteriormente, se lleva a cabo un segundo ensayo biológico en las mismas condiciones que las anteriores para tratar de solucionar el problema de la esterilización y verificar el éxito del primer ensayo. En esta ocasión, los resultados obtenidos son los que eran de esperar desde el principio. Se observa turbidez en el control positivo pero no en el control negativo, así como en las tres piezas recubiertas y cargadas, evidenciando de nuevo el éxito de la película de quitosano y cargada de ciprofloxacino (Figura 13).  Diluciones seriadas y recuento en placa Para comprobar si el efecto de los reservorios recubiertos ha sido bactericida o de inhibición del crecimiento, se ha procedido a llevar a cabo el método de diluciones seriadas y recuento en placa para determinar el número de ciclos logarítmicos que se ha conseguido reducir con respecto al control positivo en ambos ensayos (Figura 14). En ambos ensayos, se ha conseguido una reducción considerable de la carga microbiana de 108 UFC/mL hasta 102 UFC/mL (6-log) en el mejor de los casos. Con estos resultados y los Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 23 anteriormente expuestos de ganancia de peso, FTIR y XPS, se pone de manifiesto el éxito de las películas de quitosano depositadas sobre la superficie de los reservorios y cargadas con ciprofloxacino. Para un cultivo de 106 UFC/mL, la MIC del ciprofloxacino es de 5 µg/mL y la MBC es de 50 µg/mL. Sin embargo a los hidrogeles de quitosano se les añadió la cantidad necesaria de antibiótico para alcanzar una concentración final de 100 µg/mL. Esta concentración es significativamente más alta teniendo en cuenta que se va a enfrentar el dispositivo recubierto y cargado a un cultivo de 102 UFC/mL. El motivo de utilizar una concentración de ciprofloxacino 2 veces mayor que la MBC es asegurar que el poco antibiótico que cargara la película de quitosano fuese suficiente para ejercer, al menos, un efecto inhibitorio sino bactericida sobre el cultivo de S. aureus. Figura 12. Primer ensayo biológico. Cultivo de 102 UFC/mL de Staphylococcus aureus tras 24 h a 37ºC en presencia de reservorios de acceso venoso con y sin recubrimientos. De izquierda a derecha se muestra el control positivo, control negativo y las piezas recubiertas con quitosano y cargadas con ciprofloxacino A, B y C respectivamente. Se observa crecimiento en el control positivo como era de esperar, y también en el control negativo en el que no se debería observar crecimiento. Este hecho podría deberse a un mal método de esterilización. En las piezas A, B y C no se observa turbidez en el medio, lo que significa que el ciprofloxacino liberado al medio ha conseguido eliminar o reducir la carga microbiológica del cultivo. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 30 2. Reactivos  Quitosano: suministrado por Sigma-Aldrich, de peso molecular medio y grado de desacetilación entre 75 y 85%.  Ácido acético: suministrado por Sigma-Aldrich, de 99-100% de pureza.  Hidróxido de sodio: suministrado por Sigma-Aldrich, pastillas anhidras de ≥98% de pureza.  Rodamina B isotiocianato: suministrado por Sigma-Aldrich. Mezcla de isómeros  Ciprofloxacino: suministrado por RT Pharma  PBS 10X: suministrado por Sigma-Aldrich, pH ≈7,4. Se debe diluir para conseguir PBS al 1X.  TSA: suministrado por Panreac Química S.A.U. Soja Triptona (TSA), Agar, medio deshidratado. Se debe diluir en agua miliQ.  TSB: suministrado por Panreac Química S.A.U. Soja triptona (TSB), caldo, medio deshidratado. Se debe diluir en agua miliQ.  Etanol absoluto: suministrado por AppliChem Panreac.  Pastillas liofilizadas de S. aureus: suministrado por Ielab. Staphylococcus aureus ATCC 6538 5 unidades rango alto, concentración >100 ufc/pastilla. 3. Equipos  Impresora 3D: el modelo utilizado es el Objet Eden 350V, procedente del Departamento de Ingeniería de Diseño y Fabricación de la Escuela de Ingeniería y Arquitectura de la Universidad de Zaragoza. Es una impresora de alta gama cuya principal característica es que es capaz de trabajar con muy buena precisión dimensional y con diferentes materiales con superficies lisas, paredes delgadas y formas complejas. Impresora 3D Objet Eden 350V Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 31  Sistema de dip-coating: mecanismo de dip-coating basado en un sistema de vasos comunicantes y una bomba peristáltica. Gracias a la bomba, los vasos van vaciándose de manera que el dispositivo a recubrir se va quedando al descubierto.  FTIR: el modelo utilizado es el Bruker Vertex 70 equipado con detector DTGS y accesorio ATR Goleen Gate diamond, del Instituto de Nanociencia de Aragón. Cada espectro se obtiene mediante reflectancia total atenuada usando 40 barridos con una resolución de 2cm-1 en el rango de 4000-400 cm-1. Espectrómetro FTIR Bruker Vertex 70 Sistema de vasos comunicantes y bomba peristáltica utilizado para llevar a cabo el dip-coating. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 32  XPS: el modelo utilizado es el Axis Uktra DLD (Kratos Technology) del Instituto de Nanociencia de Aragón. El espectro se excita mediante una fuente monocromática Al Kα (1486.6 eV) a 15 kV y 10 mA. En el análisis de cada una de las regiones se utiliza una energía de paso de 20 eV. El espectro general se mide con una energía de paso de 160 eV. El análisis de los picos se obtiene con el software CasaXPS, usando como funciones de ajuste, la suma de las funciones de ajuste Lorentziano y Gaussiano después de restar la línea base. Las energías de enlace están referenciadas al estándar interno del C 1s (284.9 eV).  Espectrofotometría UV-visible: el modelo utilizado es el Varian Cary 50 probe del Instituto de Nanociencia de Aragón. Se trata de un espectrofotómetro de un único haz, con lámpara de Xenon flash, mediciones de muestra de hasta 3 abs, resolución <1,5 nm y rango de longitudes de onda entre 190-1100 nm. Espectroscopio de fotoelectrones emitidos por rayos X modelo Axis Uktra DLD Espectrofotómetro UVVisible modelo Varian Cary 50 probe Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 33 Estructura química de la Rodamina B isotiocianato  SEM ambiental o ESEM: el modelo utilizado es el QUANTA FEG 250 de la marca FEI. Utiliza una fuente de emisión de campo. Las imágenes se toman a diferentes presiones, unas a 100 Pa en las que se utiliza un detector de electrones secundarios para fase gas llamado GSED (gaseus secondary electron detector) y otras a 70 Pa con utilizando un detector específico para bajo vacío (no superior a 120 Pa) llamado LFD (Large field detector). 4. Estructuras químicas Microscopio electrónico de barrido modelo HITACHI S2300. Estructura química del ciprofloxacino Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 34 9. ANEXO B 1. Resultados 1.1. Espectros de FTIR del quitosano y los polímeros sin recubrir 3000 2000 1000 distortion vibration of CH2 Pol A Numero de onda (cm-1) Pol C Pol B C-H stretching C=O stretching acrylate double bond stretching Figura 2. Espectro FTIR del material con el que se ha fabricado cada polímero (blancos) y asignación de cada pico. Como ya se ha mencionado anteriormente, los tres reservorios están fabricados en distintos tipos de metacrilatos (A, B y C) y tienen espectros similares. Polímero A Polímero B Polímero C 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Numero de onda (cm-1) 3362 3298 Stretching O-H y N-H 2916 2872 stretching C-H 1653 amida 1591 bending N-H de la amina 1421 CH2 bending 1377 CH3 symmetrical deformation 1058 O-H stretching 1026 skeletal vibration of C-O stretching Figura 1. Espectro FTIR del quitosano (peso molecular medio) y asignación de cada pico. Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 35 1.2. Gráficos de deconvolución del N 1s Estudio de la coordinación de los átomos. Se estudian los orbitales del nitrógeno para conocer las distintas formas en las que puede encontrarse en el polímero. 2000 1500 1000 distortion vibration of CH2 Pol A Numero de onda (cm-1) Pol C Pol B C=O stretching acrylate double bond stretching C-O stretching Figura 3. Espectro FTIR del material con el que se ha fabricado cada polímero (blancos) y asignación de cada pico. Ampliado el rango de 1000 a 2000 cm-1. 404 402 400 398 396 CS/Pol A Pol A 402,0 400.1 Binding energy (eV) 399.8 Figura 4. Deconvolución N 1s del polímero A sin recubrir (arriba) y recubierto con quitosano (abajo). Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 36 408 406 404 402 400 398 396 Polimero B Binding energy (eV) Blanco B Figura 5. Deconvolución N 1s del polímero B sin recubrir (abajo) y recubierto con quitosano (arriba). 415 410 405 400 395 390 Polimero C Binding energy (eV) Blanco C Figura 6. Deconvolución N 1s del polímero C sin recubrir (arriba) y recubierto con quitosano (abajo). Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 37 1.3. Imágenes de Microscopía electrónica de barrido Desarrollo de recubrimientos antimicrobianos sobre dispositivos médicos 38 Figura 7. Imágenes de microscopía electrónica de barrido, tomadas a distintos aumentos, de la superficie de reservorios de acceso venoso fabricados con el polímero A, sin recubrir (izquierda) y recubiertos de quitosano (derecha). En el polímero recubierto se aprecian deposiciones irregulares de lo que podría ser quitosano.