Repositorio Institucional de Documentos

Caracterización de la expresión hepática de FSP27 en diversas condiciones experimentales. HERRERA MARCOS, Luis Vte. Tutores: OSADA GARCÍA, Jesús NAVARRO FERRANDO, Mª Ángeles Master en Biología Molecular y Celular. Curso 2013-2014 Memoria Trabajo Fin de Máster. Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página2  Abreviaturas: AOV: Aceite de olive virgen ATGL: Lipasa de triacilglicéridos adipocitaria cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementario CGI-58: Comparative gene identification-58 CIDE: Cell inducing DFF45-like effector CIDEC: Cell inducing DFF45-like effector C CIDE-3: CIDEC CM: Camada CREB: Elementos de unión en respuesta a cAMP C/EBPß: Proteína de unión a la zona potenciadora CAAT DEPC: Dietil pirocarbonato DNA: Ácido desoxirribonucleico EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético FFA: Ácidos grasos libres FSP27: Fat specific protein 27 kDa, CIDEC. HFD: Dieta alta en grasas HPRT: Hipoxantina guanina fosforribosil transferansa HSL: Lipasa sensible a hormonas LD: Gota lipídica LDCS: Sitios de contacto entre gotas lipídicas LDL: Lipoproteina de baja densidad LFD: Dieta baja en grasas MN: Mann-Whitney MUFA: Ácido graso monoinsaturado mRNA: Ácido ribonucleico mensajero PLIN: Perilipina 1 PPIA: Ciclofilina A PUFA: Ácido graso poliinsaturado PT: Propionato de testosterona TBE: Tris Borato EDTA TE: Tris-EDTA TG: Triglicérido Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página3  TRIS: Tris(hidroximetil)aminometano RNA: Ácido Ribonucleico KO: Knot-out qPCR: PCR cuantitativa WT: wild-type, fenotipo salvaje  Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página4  INDICE: Página: I. Resumen 6 II. Introducción 7 III. Antecedentes 8 IV. Objetivos 15 V. Materiales y métodos 16 V. 1 Material Biológico 16 V. 1.1 Cerdos 16 V. 1.1 a) Experimento 1 o cerdos con dieta esteatósica 16 V. 1.1 b) Experimento 2 o cerdos suplementados con fitosteroles 17 V. 1.1 c) Experimento 3 o influencia del tipo de grasa en cerdos ibéricos 18 V. 1.1 d) Experimento 4 o influencia del aceite de oliva en cerdos minipig 18 V. 1.1 e) Experimento 5 o inflamación local en cerdos 19 V. 1.2 Ratas 19 V. 1.2 a) Experimento 6 o efecto de la dieta, tamaño de la camada y testosterona en ratas esteatósicas 19 V. 1.2 b) Experimento 7 o efecto del resveratrol en ratas genéticamente obesas 19 V. 1.2 c) Experimento 8 o efecto del resveratrol en ratas obesas a través de la dieta 20 V. 2 Material Instrumental y reactivos 21 V. 2. 1 Extracción del RNA 21 V. 2. 2 Purificación del RNA 23 V. 2. 3 Retrotranscripción 23 V. 2. 4 PCR cuantitativa (qPCR) 24 Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página5  V. 3 Métodos 25 V. 3. 1. Extracción del RNA 25 V. 3. 2. Purificación del RNA 25 V. 3. 3. Retrotranscripción 26 V. 3. 4. PCR cuantitativa 26 V. 3. 4. a) Diseño de primers 28 V. 3. 4. b) Housekeeping (gen de referencia) 29 V. 3. 4. b) Procedimiento experimental 30 V. 3. 5. Procedimiento matemático 30 V. 3. 6. Análisis estadístico 31 VI. Resultados 32 VII. Discusión de los resultados 39 VIII. Conclusión 42 IX. Agradecimientos 43 X. Bibliografía 44 HerreraMarcos,LuisVte.  Resumen Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página6  I. Resumen: El hígado graso no alcohólico está alcanzando prevalencias del 30% en ciertas poblaciones occidentales. Esta alta incidencia acarrea muchas consecuencias, ya que supone una interrupción del metabolismo hepático conllevando al desarrollo de un amplio abanico de enfermedades metabólicas. La familia de proteínas CIDE está íntimamente relacionada con el desarrollo de estas enfermedades ya que desempeñan un papel crítico en apoptosis y metabolismo lipídico. La familia de proteínas CIDE ha sido sugerida como una nueva diana terapéutica por estar asociadas a muchas enfermedades humanas como cáncer, envejecimiento, diabetes, y obesidad. Por ejemplo FSP27/CIDEC aumenta en varias formas de hígado esteatósico. Por todo lo anterior se postula que estas proteínas pueden constituir un nexo de unión entre el metabolismo energético y la apoptosis. Este trabajo incluye el empleo de varios modelos animales, la rata (Rattus norvegicus) por ser un modelo clásico de experimentación animal y el cerdo (Sus scrofa), por tener unas características anatómicas y funcionales muy semejantes a las humanas. Esto permite establecer mecanismos universales involucrados en la patogenia de la esteatosis y del transporte al hígado de nutrientes. Consecuentemente resulta pertinente validar los hallazgos descritos en roedores en la especie porcina para poder asumir que también confluyen en la especie humana. A través de este trabajo se puede vislumbrar la relación manifiesta entre esteatosis hepática y el aumento de la expresión hepática de FSP27/CIDEC en cerdos, la diferente influencia de las distintas grasas (monoinstaduras, poliinsaturadas o saturadas) en la expresión hepática de CIDEC o como la presencia de colesterol parece ser determintante en la expresión hepática de CIDEC. Además este estudio también recoge la influencia de otros factores como testosterona, inflamación local o resveratrol entre otros en la expresión hepática de CIDEC. HerreraMarcos,LuisVte.  Introducción Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página7  II. Introducción: El hígado graso no alcohólico está alcanzando prevalencias del 30% en ciertas poblaciones occidentales [1]. Esta alta incidencia acarrea muchas consecuencias, ya que supone una alteración del metabolismo hepático conllevando al desarrollo de un amplio abanico de enfermedades metabólicas (diabetes, obesidad, esteatosis hepática y enfermedades cardiovasculares). La familia de proteínas CIDE está íntimamente relacionada con el desarrollo de éstas y han sido sugeridas como una nueva diana terapéutica para desórdenes metabólicos [2]. Dado que las proteínas de la familia CIDE (incluyendo CIDEC/FSP27) tienen un papel crítico en apoptosis y metabolismo lipídico, están asociadas a muchas enfermedades humanas como cáncer, envejecimiento, diabetes y obesidad [3]. Por ejemplo CIDEC/FSP27 y CIDEA aumentan su expresión en varias formas de hígado esteatósico [4]. Las funciones de las proteínas CIDE pueden proponernos un nexo entre el metabolismo energético y la apoptosis. El empleo de varios modelos animales para caracterizar molecularmente la esteatosis hepática resulta muy interesante por permitir también su abordaje terapéutico. Sin embargo, ningún modelo animal reproduce exactamente el proceso humano. La utilización de varios modelos animales, con diferentes peculiaridades del metabolismo lipoproteico cuya respuesta esperada será diferente, permitirá desentrañar los mecanismos involucrados en la patogenia de la esteatosis y del transporte al hígado de nutrientes, así como en la patogenia y protección de la aterosclerosis. Por ello, en este trabajo se estudiaron dos especies distintas, la rata (Rattus norvegicus) por ser un modelo clásico de experimentación animal y el cerdo (Sus scrofa). La elección de esta segunda especie es debido a que sus características anatómicas y funcionales son muy semejantes a las humanas. Consecuentemente resulta pertinente validar los hallazgos descritos en roedores en la especie porcina y así establecer mecanismos universales de esteatosis hepática que confluyan también en la especie humana. HerreraMarcos,LuisVte.  Antecedentes Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página8  III. Antecedentes: La familia CIDEs (cell inducing DFF45-like effectors) es una familia de proteínas proapoptóticas que apareció tras el descubrimiento de los factores 40 y 45 de fragmentación del DNA (DFF40/45), un complejo heterodímero, ejecutor y regulador de la fragmentación del DNA, paso clave para la apoptosis celular [3, 5]. Se observó que estas dos proteínas contenían un dominio común llamado CIDE, que daba lugar a una interacción proteica de un residuo de unos 90 aa. A raíz de ello se identificaron proteínas que contenían CIDE en base a su secuencia homologa. Hasta la fecha 5 proteínas que contienen CIDE han sido identificadas en mamíferos (DFF40, DFF45, CIDEA, CIDEB Y CIDEC/FSP27) también se han descrito variantes tras el splicing para Cidec, (Cide-3α) y para DFF45 (DFF35) [3]. Los primeros estudios bioquímicos defendían que todas las proteínas que contuviesen CIDE estarían involucradas en la apoptosis. Sin embargo, varios estudios posteriores demostraron que Cidea, Cideb y Cidec/Fsp27 están involucradas en el metabolismo lipídico [3, 4, 6]. Las tres proteínas CIDE poseen un dominio CIDE-N en el extremo N terminal evolutivamente conservado (este dominio también está presente en la nucleasa proapoptótica DFF40 y en su compañera inhibidora la proteína DFF45) y un domino CIDE-C que es único de la familia CIDE (Fig. 1) [3,7]. El dominio CIDE-N de CIDEA, CIDEB y FSp27/CIDEC posee una homología de 39, 29, y 38% respectivamente con DFF45. El dominio CIDE-C de CIDEA y de CIDEB posee una homología con FSP27/CIDEC del 54 y 53% respectivamente [8]. Esta alta homología no impide a CIDEC tener interacciones proteicas específicas ausentes en otros miembros de su familia. Fig. 1 Estructura esquemática de la familia CIDE en humana [5, 7]. HerreraMarcos,LuisVte.  Antecedentes Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página9  FSP27 (Fat specific protein 27), al que a partir de ahora me referiré como CIDEC, es un miembro importante de la familia CIDE, más que por su función como proteína proapoptótica, por su implicación en el metabolismo lipídico y en la regulación del peso corporal. Por ello, está considerado como un gen candidato para el estudio de la obesidad humana y en la diabetes tipo 2 [9]. El gen CIDEC humano contiene una región codificante de 717 pares de bases que codifican 238 aminoácidos. Éste muestra alta similitud con los modelos de rata y de cerdo. CIDEC, en cerdo, se localiza en el cromosoma 13q31, mientras que en rata se localiza en el cromosoma 4q42. Con respecto a su distribución en los tejidos se ha demostrado que se expresa en diversos tejidos, fundamentalmente en tejido graso blanco y marrón. Pero también se encuentra en altas concentraciones en intestino, tejido linfático y cerebro. Además, los niveles de m-RNA en tejido adiposo e hígado son significativamente más altos en cerdos obesos que en sus congéneres [9,10]. CIDEC (cell-inducing DFFA-like effector C)) también conocido como FSP27 o CIDE-3, está presente en gran cantidad en la superficie de las gotas lipídicas (LD) y está demostrado que la sobreexpresión de Cidec induce la acumulación de gotas lipídicas y su fusión. Además, promueve la acumulación de triglicéridos no sólo en adipocitos sino también en algunas células no lipídicas (musculo, hígado, fagocitos,…) [3, 8, 10-13]. En el estudio de las funciones de CIDEC, varios grupos han descrito tanto en cultivos celulares como en los adipocitos blancos de ratones deficientes en CIDEC que se presentaban gotas lipídicas más pequeñas, mayor metabolismo oxidativo mitocondrial, y lipólisis aumentada [2, 10, 11, 13], además en los ratones KO se observaron niveles de glucosa y leptina más bajos, resultando en un aumento de la sensibilidad a la insulina y mayor resistencia a una dieta que induce obesidad [4, 11, 14, 15]. Mientras que algunos autores comentan que la expresión ectópica de CIDEA o CIDEC puede significativamente aumentar el tamaño de la gota lipídica en adipocitos [2, 4]. Otros estudios demuestran que la expresión ectópica de CIDEA, CIDEB y CIDEC induce potencialmente apoptosis en células de mamífero [5, 7]. En este último caso se relacionaba la sobreexpresión con su localización mitocondrial. Sin embargo, no se ha descrito su presencia en mitocondria, solamente en gotas lipídicas o en retículo endoplasmático [2, 8]. HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página16  V. Material y Métodos: V.1 Material Biológico: Los animales pertenecientes a los experimentos 1, 3, 4 y 5 se albergaron en las instalaciones del Servicio General de Apoyo a la Investigación en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza con la aprobación del Comité ético de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza y acorde a la legislación vigente. V.1.1Cerdos (Sus scrofa): V.1.1.a) Experimento 1 o cerdos con dieta esteatósica: En este estudio se utilizaron 29 cerdos machos cruce de Landrace x Large White de 3 meses de edad. Estos cerdos se subdividieron en 5 grupos. El primer grupo de 3 animales recibió la dieta control del cerdo durante tres meses. El segundo grupo de 3 animales recibió una dieta capaz de inducir hígado graso durante tres meses. Esta dieta esteatósica especial es deficiente en metionina y colina y suplementada en colesterol, colato, grasa saturada, grasa parcialmente hidrogenada y fructosa [24]. El tercer grupo estuvo constituido por cinco animales y el estudio duró 3 meses. Se alimentó a todos ellos con la dieta esteatósica y el último mes se les administró 10 mg de melatonina /kg/ día. El cuarto grupo, formado por otros seis animales, consumieron la dieta esteatósica durante 4,5 meses. Durante el último mes se les administró melatonina a la misma dosis que el grupo anterior. El quinto grupo estuvo constituido por 12 animales (tres de ellos fallecieron a lo largo del estudio). El estudio se prolongó durante 2 meses. Todos ellos recibieron la HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página17  misma dieta esteatósica y durante el último mes a 4 de ellos se les administró melatonina con dosis 10 mg/kg/día. La toma de muestras se realizó al sacrificio con edad variable entre 4 y 7 meses de edad en función del grupo al que pertenezca. A los cerdos se les indujo anestesia general y fueron mantenidos con propofol. El abdomen fue abierto a través de la línea alba mediante laparotomía. Las muestras hepáticas fueron obtenidas al final del procedimiento a partir del lóbulo cuadrado de los cerdos [24]. Tras su obtención, se introdujeron en nitrógeno líquido para su conservación y se almacenaron a -80 ºC. V.1.1.b) Experimento 2 o cerdos suplementados con fitosteroles: Este estudio, compuesto por 32 cerdos de 10 semanas de edad a inicio del estudio se llevó a cabo en la granja experimental “Mas de Bover” (Constantí, Tarragona) que pertenece a la unidad de nutrición animal IRTA. Los animales se estabularon en grupos de 6, el espacio disponible cumplía los estándares para esta categoría de animal con temperatura y humedad controladas. Los animales disponían de agua y alimento ad libitum. El alimento fue formulado para asegurar que todos los grupos experimentales recibieran una cantidad de alimento similar teniendo en cuenta la distinta cantidad de MAYMO® (fórmula compuesta por fitosteroles: fundamentalmente β-sitosterol) que recibían cada grupo experimental. Se establecieron cuatro grupos experimentales: T-1: Dieta basal T-2: Dieta basal + 120 ppm de MAYMO® T-3: Dieta basal + 240 ppm de MAYMO® T-4: Dieta basal + 2400 ppm de MAYMO® Fig 3. Imagen tomada durante la biopsia, Obsérvese diferencia de color hígado estatósico (izquierda) frente bazo (derecha). HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página18  Los animales se sacrificaron tras 56 días de estudio y se tomó muestra de músculo longuísimo dorsal, hígado, riñón, linfonodos mesentéricos. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC. V.1.1.c) Experimento 3 o influencia del tipo de grasa en cerdos ibéricos Este estudio fue realizado con 18 cerdos de raza ibérica con peso a inicio de estudio de 30 kg y se les tuvo en un periodo de adaptación hasta alcanzar los 55 kg. Después de obtener un peso de 55 kg se reasignaron en grupos de 6 individuos y recibieron una de las tres dietas isoenergéticas, isonitrógenas y libres de colesterol. Las dietas contenían 21 g lípidos/kg y estaban suplementadas al 3% con grasas saturadas, grasas monoinsaturadas (MUFA) en la dieta enriquecida con aceite de aceite de oliva o grasas polinsaturadas (PUFA) en las dietas enriquecidas en aceite de girasol. El alimento fue proporcionado ad libitum. Para formular la dieta se siguió las mismas pautas ya publicadas [25]. El experimento duró 42 días, hasta que los animales alcanzaron un peso vivo de 95 kg. Sin apenas diferencias en las ganancias medias diarias entre los grupos. Después de una noche de ayuno, la toma de muestras se llevó a cabo en el matadero. Se tomaron muestras de sangre, hígado y duodeno. Las muestras de hígado fueron congeladas en nitrógeno liquido y almacenadas a -80 ºC [25]. V.1.1.d) Experimento 4 o influencia del aceite de oliva virgen en cerdos minipigs Este estudio se realizó con 10 cerdos enanos, también llamados minipigs. Se dividieron en 2 grupos, uno que recibió una dieta control y el otro grupo que recibió la misma dieta suplementada con AOV (aceite de oliva virgen) al 25% y con colesterol al 0,3%. Tras la obtención de la muestra se introdujeron en nitrógeno líquido para su conservación y se almacenaron a -80 ºC. HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página19  V.1.1.e) Experimento 5 o inflamación local en cerdos: Este estudio consistía en provocar una inflamación local con una inyección de turpentina (0,5 ml/kg) y observar el efecto que tenían los mediadores de la inflamación (IL-6 y TNFα) sobre el hígado. El estudio se compone de 12 cerdos machos Landrace x Large White de entre 28 y 39 kilos de peso. A 10 animales se les indujo la inflamación subcutánea con turpentina. Después de 8 horas y 48 horas se obtuvo la muestra de 3 y 7 animales respectivamente. Como control 2 animales fueron inyectados con el mismo volumen de solución salina. Las muestras se obtuvieron mediante sacrificio de los animales y se obtuvo muestra de hígado y de plasma [26]. Las muestras fueron congeladas inmediatamente con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC. V.1.2 Rata (Rattus norvegicus): V.1.2.a) Experimento 6 o efecto de la dieta grasa, tamaño de camada y testosterona en ratas: Para realizar este experimento se trabajó con muestras de RNA facilitadas por el grupo del doctor Manuel Tena Sempere de la Universidad de Córdoba. Este estudio está compuesto por 80 ratas hembras. Estas se dividen en diversos grupos de 10 animales en función de: LFD 12 cm HFD 12 cm LFD 4 cm HFD 4 cm LFD 12 cm PT HFD 12 cm PT LFD 4 cm PT HFD 4 cm PT Si han recibido propionato de testosterona (PT) o no. Si han ingerido dieta alta (HFD) o baja en grasas (LFD) Si pertenecen a partos de 4 o 12 crías por madre. Teniendo todos los factores en cuenta hay 8 grupos distintos [27]. V.1.2. b) Experimento 7 o efecto del resveratrol en ratas genéticamente obesas Para realizar este experimento se trabajó con muestras de RNA facilitadas por el grupo de la doctora Mª del Carmen Puy Portillo de la Universidad del País Vasco. HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página20  El primer estudio se realizó con ratas genéticamente obesas [28]. Se trabajó con 30 machos Zucker (fa/fa) con 6 semanas de edad y peso aproximado de 213 gramos, obtenidos de Harlan Ibérica ( Barcelona, SPAIN) y estabulados de acorde a las guías de la Unión Europea de cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas fueron alojadas individualmente en cajas metabólicas de policarbonato (Tecniplast Gazzada, Buguggiate, Italy) en una habitación con temperatura constante entre 22 y 28 ºC con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas. Después de 6 días de periodo de adaptación, las ratas fueron distribuidas al azar en 2 grupos experimentales, un grupo control alimentado con una dieta estándar de laboratorio (Panlab, Barcelona, Spain) y un grupo resveratrol, administrado oralmente (15 mg/kg de peso vivo por día) a través de un catéter orogástrico durante 6 semanas. El resveratrol estaba diluido en 1 ml de solución de etanol al 20%. Las ratas del grupo control recibieron el vehículo. Todos los animales tenían libre acceso al alimento y al agua. La ingesta y el peso fueron medidos diariamente. Al final del periodo experimental y después de un periodo de ayuno de 6-8 horas, los animales fueron sacrificados mediante desangrado cardiaco bajo condiciones anestésicas, utilizando una inyección intraperitoneal de una sobredosis (45 mg/kg) de pentobarbital sódico. Se recogió muestra de tejido hepático. Las muestras fueron congeladas inmediatamente con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC. V.1.2. b) Experimento 8 o efecto del resveratrol en ratas obesas a través de la dieta: Para realizar esta experimento se trabajó con muestras de RNA facilitadas igualmente por el grupo de la doctora Mª del Carmen Puy Portillo. Este estudio se realizó con ratas obesas a través de la dieta [29]. El experimento se llevó a cabo con 16 machos Sprague-Dawley obtenidos de Harlan Ibérica (Barcelona, SPAIN) y estabulados de acorde a las guías de la unión europea de cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas fueron alojadas individualmente en cajas metabólicas de policarbonato (Tecniplast Gazzada, Buguggiate, Italy) en una habitación con temperatura constante (22 + 2 ºC) con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas. Después de 6 días de periodo de adaptación, las ratas fueron distribuidas al azar en 2 grupos experimentales: grupo control (n=8) o grupo tratado con resveratrol (n= 8) y alimentadas con una dieta obesogénica (4.6 kcal/g) proporcionada por Harlan Ibérica HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página21  (TD.06415) durante 6 semanas. El Resveratrol se añadió a la dieta en cantidad suficiente para asegurar una dosis de 30 mg/kg de peso vivo al día. Todos los animales tenían libre acceso al alimento y al agua. La ingesta y el peso fueron medidos diariamente. Al final del periodo experimental y después de un periodo de ayuno de 12 horas, los animales fueron sacrificados mediante desangrado cardiaco bajo condiciones anestésicas (clorhidrato). El hígado fue disecado, pesado e inmediatamente congelado. V.2 Material instrumental y reactivos: V.2.1. Extracción del RNA Reactivos • Agua destilada y desionizada: Agua milli-Q cuya resistividad sea superior a 18 MΩ en un recipiente limpio de RNAsas. • Agua tratada con dietilpirocarbonato (agua DEPC). Por cada litro de agua destilada y desionizada se le añadió 0,5 ml de DEPC. Se agitó vigorosamente hasta solubilizar bien el DEPC. Y se dejó que actuara durante una noche para posteriormente destruirlo mediante autoclavado durante 1 hora a 1 atm. Cada vez que se ha usado, se ha autoclavado durante 20 min a 1 atm. • Solución descontaminante de DEPC al 0,05%. • SDS al 10%. Se humectaron 100 g de sodio dodecil sulfato en 700 ml de agua tratada a 60 ºC durante una noche, el día posterior se completó el volumen a 1000 ml. • EDTA 0,5 M pH 8,0. Se pesaron 186,1 g EDTA Na2.2H2O y se disolvieron en 800 ml de agua tratada. Se agitó en un agitador magnético limpio de RNAsas. Se añadió 20 g de NaOH. Una vez disuelto, se verificó que el pH en una alícuota. Posteriormente se completó a 1 l con agua tratada. Se autoclavó cada vez que se usó durante 20 min. a 1 atm. • TRIS/HCl 1 M pH 8,0. 121,1 g de Tris base se disolvieron en 800 ml de agua tratada. Se añadió 54 ml de HCl concentrado. Se verificó el pH en una alícuota. HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página22  Posteriormente se completó a 1 l con agua tratada. Se autoclavó cada vez que se usó durante 20 min a 1 atm. • TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA. Se tomó 10 ml de Tris/HCl 1 M pH 8,0 para RNA y 2 ml del EDTA 0,5 M, Posteriormente se completó a 1 l con agua tratada.. Se autoclavó cada vez que se usó durante 20 min a 1 atm. • Cloroformo. (Sigma®). • Isopropanol. (Sigma®). • Etanol al 75%: • Reactivo de extracción: Tri-reagent®. (AMBION®). Almacenar a 4 ºC. • Nieve carbónica o nitrógeno líquido. • Hielo picado. • TBE. Se pesó 10,8 g de TRIS base y disolvió en 800 ml de agua tratada. Una vez disueltos, se añadió 40 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0. Posteriormente se disolvió 5,5 g de ácido bórico y se completó el volumen a 1 l con agua tratada. Posteriormente se autoclavó. • Bromuro de etidio. (SIGMA®) Almacenar a 4 ºC • Gel de agarosa de RNA al 1% en TBE. 0,5 g de agarosa en 50 ml de tampón TBE. Se fundió en microondas, evitando la evaporación del tampón, hasta que la solución no tenía ninguna partícula de agarosa flotando. Se dejó enfriar un poco y se añadió bromuro de etidio al 0,5 µg /ml. Después se dejó gelificar en la cubeta con los peines puestos. • Tampón de carga de RNA.: Azul de bromofenol al 0,25%; xileno cianol al 0,25%, EDTA 1 mM y glicerol al 50% en agua tratada Material: El material de RNA es específico para este uso • Vidrio y metal. Se descontaminó de RNAsas por esterilización a 180 ºC durante 8 h. • Plástico y barras de agitación. Se trataron durante al menos media hora en la solución descontaminante de DEPC y después se autoclavaron durante una hora para inactivar el DEPC. • Nanodrop™ 1000 HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página23  V.2.2. Purificación del RNA: Reactivos almacenados a –20 ºC: El kit (AMBION® de Life technologies™) está compuesto por los siguientes reactivos: • TURBO Dnase (2 unidades/μl) (120 μl). • 10x TURBO DNase Buffer (600 μl). • DNase Inactivation Reagent (600 μl). • Nuclease-Free Water, o agua DEPC (1,75 ml). Material: • Termociclador (S1000™ Thermal Cycler, BIO-RAD®). • Nanodrop™ 1000.  V.2.3. Retrotranscripción: Reactivos almacenados a –20 ºC: El kit (First Strand cDNA Synthesis kit, Thermo Scientific) está compuesto por los siguientes reactivos: • Oligo (dT) 12-18 (500 μg/ml). • 1 μl dNTP Mix (10 mM cada uno). • M-MuLV Reverse Transcriptase (20 U/μl).* • RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μl). • Agua destilada estéril. Material: • Termociclador ( S1000™ Thermal Cycler, BIO-RAD®)  Fig 5. Termociclador ( S1000™ Thermal C y cler, BIO-RAD®) http://www.bio-rad.com/webroot/web /images/lsr/products/amplification_pcr/product_detail/g lobal/lsr_S1000.jpg Fig 4. Nanodrop ™ 1000. http://openwetware.org/ images/e/ee/NanoDrop1000.jpg HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página24  V.2.4. PCR cuantitativa (qPCR): Reactivos: • Agua filtrada de PCR. • Kit de SYBR®Green (SYBR®Green, Applied Biosystems™). • Cebadores o Primers específicos para los genes a estudiar. Material: • Puntas autoclavadas sin ningún posible contaminante • Placas de tubos de 200 µl aptos para uso RT-PCR. • Tapas de tubos optical caps. • Real Time PCR system, Step One plus™.  Fig 6. Step One plus™ Real time PC R system https://tools.lifetechnologies.co m /content/sfs/prodImages/high/StepOne_big.jpg HerreraMarcos,LuisVte.  Materialymétodos Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página25  V.3 Métodos: V.3.1. Extracción del RNA: El RNA ha sido aislado usando Trigent ® reagent (AMBION ® ). Se homogeneizó unos 100 mg de cada una de las muestras de tejido hepático de con el Ultraturrax en 1 ml de Trigent ® reagent. Tras un lavado con Cloroformo (0,2 ml) se recogió la fase acuosa superior en un Eppendorf ® y se precipitó el RNA con isopropanol y centrifugado. Tras decantar el sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol al 75% y volvió a centrifugar. Se decantó el etanol al 75% y se resuspendió el RNA en agua DEPC (dietilpirocarbonatada). Finalmente se midió su concentración con el nanodrop™. (Fijándose en el ratio de absorbancia 260/280 que nos da una referencia sobre la calidad de nuestro RNA). Posteriormente, a fin de verificar la integridad de la muestra se hizo una electroforesis de la muestra en un gel de agarosa al 1%. V.3.2. Purificación del RNA Tras la extracción del RNA han podido quedar restos de DNA genómico en la muestras que pueden interferir en la qPCR. Para evitarlo, se realizó el tratamiento del RNA con una DNAsa que en una etapa posterior se elimina de la muestra. Fig. 8: Gel de a g arosa del 2º g rupo de cerdos esteatósicos tras extraccion del R N A t o tal 18183184185186187 Fig 7. RNA solubilizado en la fase superior, tras lavado con clorformo. Fase inferior, roja. HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página32  VI. Resultados: Experimento 1 o cerdos con dieta esteatósica: En este estudio se puede observar la fuerte influencia de la esteatosis en la expresión del gen que codifica la proteína CIDEC. Gráfica 1. Efecto de la esteatosis inducida por la dieta en cerdos en la expresión hepática a nivel de mRNA de CIDEC normalizando con 18S y medido mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola. (*: P < 0.02 vs control)        HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página33  Experimento 2 o cerdos suplementados con fitosteroles  Gráfica 2 Efecto de la administración de fitosteroles en cerdos en la expresión a nivel de mRNA de CIDEC normalizando con HPRT y medido mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola. (*: P< 0.05 vs control).  Gráfica 3 Efecto de la administración de fitosteroles independientemente de la dosis en cerdos en la expresión hepática a nivel de mRNA de CIDEC normalizando con HPRT y medido mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola. (*: P < 0.02 vs control) HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página34  En el experimento 2 se observa como una alimentación suplementada con fitosteroles reduce significativamente la expresión de CIDEC. Algo que ya sucede con la dosis más baja de 120 ppm. Dosis más altas no producen más efecto, aunque el mismo se mantiene. Experimento 3 o influencia del tipo de grasa en cerdos ibéricos  Gráfica 4. Efecto del tipo de grasa en cerdos ibéricos en la expresión hepática a nivel de mRNA de CIDEC normalizando con PPIA y medido mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola. (*: P < 0.04, **: P < 0.02) La expresión hepática de CIDEC mostró diferencias significativas por efecto de la saturación de los ácidos grasos proporcionados en la dieta. Se obtuvieron cambios significativos al comparar la dieta suplementada con PUFA frente a la dieta con grasa saturada (**: P < 0.02 vs saturada), y al comparar la dieta suplementada con PUFA frente a la suplementada con MUFA (*: P < 0.04 vs MUFA). HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página35  Experimento 4 o influencia del aceite de oliva virgen en cerdos minipigs Cuando se comparó la administración de una dieta enriquecida en AOV con la dieta estándar del cerdo, se observó que la expresión de CIDEC disminuyó significativamente en este modelo animal.  Gráfica 5. Efecto de la administración de AOV en cerdos minipigs en la expresión hepática a nivel de mRNA de CIDEC normalizando con PPIA y medido mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola (**P < 0.01 vs control). HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página36  Experimento 5 o inflamación local en cerdos: En este estudio no se obtuvieron diferencias significativas con respecto a los controles mediante inyección subcutánea de turpentina. Control 8h 48h Fsp27 1.0 ± 0.2 0.9 ± 0.7 1.1 ± 0.8 Tabla 1. Efecto de una inflamación local frente al control en la expresión hepática de CIDEC a nivel de mRNA, normalizado con PPIA, y mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola Experimento 6 o efecto de la dieta, tamaño de la camada y testosterona en ratas Este estudio deja patente una fuerte influencia de la testosterona en la expresión de Cidec. Donde los grupos que han recibido propionato de testosterona tienen una expresión más elevada que los que no han recibido testosterona. Sin embargo no obtuvieron efecto alguno el efecto del porcentaje de grasa en la dieta ni el tamaño de la camada. LFD 12 cm HFD 12 cm LFD 4 cm HFD 4 cm LFD 12 cm PT HFD 12 cm PT LFD 4 cm PT HFD 4 cm PT Fsp27 1.2 ± 0.9 1.1 ± 0.5 1.6 ± 0.8 1.7 ± 1.0 18 ± 17a 21.7 ± 12b 15.0 ± 14c 9.1 ± 7.1d Tabla 2. . Efecto de la administración de propionato de testosterona en la expresión hepática de Cidec a nivel de mRNA, normalizado con Ppia, y mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola (a LFD 12 cm vs. LFD 12 cm PT: P<0.01, b HFD 12 cm vs. HFD 12 cm PT: P<0.01, c LFD 4 cm vs LFD 4 cm PT: P < 0.0001, d HFD 4 cm vs HFD 4 cm PT: P < 0.0009).  HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página37  Experimento 7 o ratas genéticamente obesas Este experimento muestra de manera significativa el efecto protector del resveratrol frente a la esteatosis hepática en ratas Zucker.  Gráfica 6. Efecto de la administración de resveratrol a través de la dieta en ratas Zucker en la expresión hepática de Cidec a nivel de mRNA, normalizado con 18S, y mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola. (*: P < 0.05 vs control). HerreraMarcos,LuisVte.  Resultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página38 Experimento 8 o ratas obesas a través de la dieta. Este experimento muestra de manera muy significativa como el resveratrol induce la expresión del gen Cidec en este diseño experimental.  Gráfica 7. Efecto de la administración de resveratrol con una dieta obesogénica en la expresión hepática de Cidec a nivel de mRNA, normalizado con 18S, y mediante qPCR. Resultados expresados como media ± desviación estándar. Análisis estadístico fue llevado a cabo por el test de MN de una cola (**: P < 0.01 vs control)  HerreraMarcos,LuisVte.  Discusiónderesultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página39  VII. Discusión de resultados: A través de los resultados presentados en este trabajo se pueden atisbar algunos aspectos de la influencia de las grasas de la dieta en la expresión hepática de CIDEC. Además este estudio también recoge como otras circunstancias (inflamación local o adición de testosterona o resveratrol) influyen en el metabolismo lipídico hepático. Todo esto contribuye a reforzar una rama de la ciencia llamada nutrigenómica, la cual estudia cómo influye la dieta en la expresión de los genes. La administración de una dieta esteatósica en cerdos aumenta significativamente la esteatosis hepática (datos no mostrados) y la expresión hepática de CIDEC frente al grupo control, estos resultados corroboran los obtenidos por otros investigadores que observaron que los niveles de mRNA en tejido adiposo e hígado son significativamente más altos en cerdos obesos que en sus congéneres [4, 9, 10]. Por otro lado una alimentación suplementada con fitosteroles reduce significativamente la expresión de CIDEC. Tanto al comparar todos los individuos frente a los controles, o únicamente aquellos que recibieron la dosis más baja (120 ppm). Además estos resultados muestran que un aumento de la dosis de fitosteroles no supone una mayor respuesta a partir de 120 ppm. Está demostrado que los fitosteroles en la dieta reducen la absorción del colesterol [31]. De esta manera reducen la cantidad de lípidos que alcanzan el hígado y en consecuencia el número de lípidos que el hígado almacena. Este principio es el mismo que el utilizado por algunos productos lácteos comerciales a los que se les añade fitosteroles [32]. Al estudiar el efecto del tipo de grasa en ausencia de suplementación de colesterol en la dieta observamos un aumento significativo de la expresión hepática de CIDEC en el grupo de grasa monoinsaturada frente al grupo de grasa poliinsaturada. Estos resultados podrían ser consecuentes con los niveles observados de trigliceridemia publicados por algunos autores ya que se observa un nivel de TG mayor con la administración de una grasa monoinsaturada [25]. Por otro lado es lógico observar que la dieta enriquecida en grasas PUFA provoque una expresión hepática de CIDEC significativamente menor que la saturada. HerreraMarcos,LuisVte.  Discusiónderesultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página40  Sin embargo, la administración de una dieta suplementada con aceite de oliva virgen al 25% y un 0,3% de colesterol en cerdos reduce la expresión de CIDEC frente al control de manera muy significativa. Este resultado se muestra en alta discordancia con resultados obtenidos en el experimento del efecto de tipo de grasa en la expresión hepática de CIDEC. Puede que estas diferencias se deban a diferencias raciales de los cerdos y/o a la presencia de colesterol en la dieta. No obstante, debido a que el número de animales de cada grupo en este estudio es mayor, y que aporta resultados mucho más sólidos (P < 0,01) es lógico considerar que el AOV reduce la expresión de CIDEC a través de su efecto en el metabolismo lipídico. Estos resultados confirman en cerdo los resultados obtenidos en ratón con aceite de oliva virgen al 10% [33] e implican que pudiese ser el responsable un componente minoritario del aceite de oliva virgen. De hecho el escualeno aumenta su expresión hepática en estos ratones (datos no mostrados). Igualmente, en este estudio el aporte de grasa monoinsaturada fue muy superior al del estudio anterior. Al estudiar el efecto de la inflamación sobre la expresión hepática de CIDEC no se observaron cambios significativos a pesar de que CIDEC pertenece a una familia relacionada con procesos proapoptóticos. Puede que esto sea debido a que el estudio provoque una forma inflamatoria local en la que la alteración hepática únicamente se vea reflejada en la secreción de mediadores inflamatorios [26], sin que ello perturbe el metabolismo lipídico hepático. Entrando a discutir los resultados obtenidos en los grupos de ratas no cabe duda alguna de que el efecto de la testosterona se trata de uno de los resultados más llamativos de este trabajo y posiblemente también el más difícil de explicar. La testosterona tiene un efecto tan fuerte en la expresión de Cidec que oculta el efecto de cualquier otro factor recogido en el estudio. Sería muy interesante ahondar en este hecho, y estudiar este efecto ya que también se ha estudiado el efecto sexo en el experimento de cerdos fitosteroles sin que se mostrase significativo (datos no mostrados en este trabajo). Este efecto que muestra la testosterona puede estar debido a que la testosterona como derivado del colesterol, interaccione con ligandos que normalmente interaccionan con el colesterol, y activara de esta manera rutas relacionadas con el metabolismo del colesterol que estimulen la expresión de Cidec. HerreraMarcos,LuisVte.  Discusiónderesultados Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página41 En cuanto al efecto del resveratrol en la expresión hepática de Cidec en obesidad genética los resultados obtenidos se muestran bastante lógicos y esperables. Este antioxidante natural que aparece en el vino tinto parece ser beneficioso en este modelo de obesidad genética. Seguramente sea debido a su efecto antioxidante sobre las lipoproteínas [34]. Este efecto ayuda a la movilización de grasas y repercute en el almacenaje hepático de lípidos a largo término porque promueve un tipo de almacenaje más fluido reduciendo la expresión de Cidec. Al estudiar el efecto del resveratrol sobre la expresión hepática de Cidec en obesidad inducida por la dieta, paradójicamente la expresión de Cidec aumenta, pero no podemos concluir que aumente también la esteatosis hepática ya que como Portillo y cols [29] demuestran el resveratrol disminuye el contenido de triglicéridos, y aumenta la tasa de oxidación mitocondrial y peroxisomal en este mismo estudio. Esto reincide en la idea de que no siempre hay correlación entre la transcripción de un gen y su traducción a proteína y nos lleva a obtener resultados aparentemente contradictorios. Llegados a este punto, habría que profundizar en el estudio de la expresión de CIDEC a nivel proteico. C IDE C Fig. 24. Cuadro resumen de los resultados obtenidos en este trabajo  HerreraMarcos,LuisVte.  Bibliografía Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página48  33 Natalia Guillén, María A. Navarro, Carmen Arnal, Enda Noone, José M. Arbonés-Mainar, Sergio Acín, Joaquín C. Surra, Pedro Muniesa, Helen M. Roche and Jesús Osada “Microarray analysis of hepatic gene expression identifies new genes involved in steatotic liver “ Physiol Genomics (2009). 37:187-198, First published Mar 3, 2009; doi:10.1152/physiolgenomics. 90339.2008 34 Baur JA, Sinclair DA. “Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence.” Nat Rev Drug Discov. (2006) Jun;5 (6):493-506. Epub 2006 May 26. .   Másterbiologíacelularymolecular. 2013‐2014 Página49 