Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR ! ! ! TRABAJO FIN DE GRADO ! Identificación del sitio de unión de potenciales inhibidores de la FAD Sintetasa de patógenos humanos mediante métodos de Docking. ! ! ! Memoria presentada por DAVID VIZARRAGA REVUELTO, Estudiante de Biotecnología, para optar al título de Biotecnología por la Universidad de Zaragoza. Septiembre 2014 ! ! ! ! ! ! ! ! ! Resumen ! The FAD synthetase (FADs) from prokaryotes is a bifunctional protein that synthesizes FMN and FAD from riboflavin in two consecutive steps. FADs is folded in two modules, each associated with each one of its activities. However, in mammals FMN and FAD are synthesized by two independent proteins. Since FMN and FAD are required in all type of organisms to generate flavoenzymes and flavoproteins, which mediate many essential metabolic processes for maintenance of cell´s life, and the enzyme synthesizing FAD (FMN -adenililtransferasa activity, FMNAT) in mammals does not show sequence and structure conservation regarding to prokaryotic FADS, this activity in FADs has been recognized a potential target for the development of antimicrobials. At the moment, the best characterized prokaryotic FADs is that from Corynebacterium ammoniagenes, CaFADS. In this project we have used different computational methods to evaluate whether the knowledge adquired for CaFADS can be extrapolated to FADs inform human pathogens. We have chosen the enzyme from Streptococcus pneumoniae, SpFADs. Sequential and structural comparison between SpFADs and CaFADs shows very similar folds, with slight conformational changes in some loops that could contribute to the preference as substrate for reduced flavins in SpFADs. However, the substrates binding sites for the FMNAT activity conserve most residues involved in its stabilization, as well as amino acids at the active site are either conserved or show conservative substitutions. The interaction with substrates in the FMNAT site was studied in detail by docking simulations with ATP, FMNred, FMNox, FADred and FADox. In general, these are located at equivalent positions as described in models of CaFADS. However, SpFADs is able to accommodate FMNred, but not FMNox, while the result is less clearly for FAD. A hydrogen bond stabilizes the interaction between the N5 of flavin and the A103 in the reduced state, but not in its oxidized state, It might be responsible for the preference for the reduced form. Finally, we have also employed docking simulations to predict whether a series of compounds in vitro identified sas inhibitors of the FMNAT activity of FAD CaFADS, are also able to bind at FMNAT site of the SpFADs. The obtained results, indicate that it is worthy to experimentally test these compounds as potential inhibitors of SpFADs. ! ! ! ! ! ! 2 ! 1. !Introducción! 1.1.!FLAVINAS Y FLAVOPROTEÍNAS.! 4 1.2.!LA FAD SINTETASA: BIOSÍNTESIS DE FMN Y FAD EN PROCARIOTAS 5 1.3. COMO MODELO DE DIANA TERAPÉUTICA PARA EL DESARROLLO DE ANTIMICROBIANOS 7 1.4. LA FAD SINTETASA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE COMO DIANA TERAPÉUTICALa FAD SINTETASA DE Streptococcus pneumoniae COMO DIANA TERAPÉUTICA 7 2. !Objetivos 3. !Materiales y Métodos 3.1.!FICHEROS DE COORDENADAS! 8 3.2. MÉTODOS UTILIZADOS! ! 8! 11 4. !Resultados 4.1.!COMPARACIÓN ESTRUCTURAL DEL SITIO ACTIVO FMNAT ENTRE CaFADS y SpFADS.! !4.1.1. Superposición de SpFADs y CaFADs! 12! ! 14 4.2.!IDENTIFICACIÓN DE LOS SITIOS DE UNIÓN DE LOS SUSTRATOS DE LA ACTIVIDAD FMNAT DE SPFADS MEDIANTE DOCKING! !! 16 4.3 !COMPUESTOS BIOACTIVOS! 4.3.1.! C2.! ! ! 4.3.2.! C4.! ! 4.3.3.! C5.! 4.3.4. C7.! 4.3.5. C8.! 4.3.6. C11.! 4.3.7. C12.! 4.3.8. C13.! 4.3.9. C27.! 4.3.10. C43. 21 21 22 22 23 24 25 26! 27 28 28 5.!Discusión! 6.!Conclusiones 7.!Referencias. 3 ! 1.INTRODUCCIÓN! ! 1.1 Flavinas y Flavoproteínas! ! Las flavinas son compuestos heterocíclicos que derivan de la 7,8-dimetilisoaloxacina y presentan tres derivados relevantes para los sistemas biológicos: la riboflavina o vitamina B2 (RF, 7,8-dimetil-10-(1’-D-ribitil)-isoaloxacina), riboflavina 5’fosfato o mononucleótido de flavina (FMN) y el flavin adenin dinucleótido fosfatofosfato (FAD) (Figure 1.1.1A). ! ! A!!!!!!B!  ! ! FIGURA 1.1.1 A. ESTRUCTURA MOLECULAR DE DIVERSOS DERIVADOS DEL ANILLO DE ISOALOXACINA. B. FUNCIONES METABÓLICAS DE FLAVOPROTEÍNAS Y FLAVOENZIMAS.! ! FMN y FAD actúan como grupos prostéticos de flavoproteínas y flavoenzimas que participan en procesos metabólicos relevantes en todo tipo de organismos (Figura 1.1.1B), siendo muchas de ellas esenciales para el desarrollo del organismo [1].Por tanto la deficiencia celular de estos cofactores causaría una acumulación de las correspondientes apoproteínas, que serían incapaces de realizar su función metabólica [2-4].! ! Libres en disolución las flavinas pueden encontrarse en dos estados de óxidoreducción: oxidado o quinona y totalmente reducido por dos electrones o hidroquinona. El estado oxidado podría incorporar un solo electrón dando lugar al estado semi-reducido o semiquinona, pero este estado no es estable para las flavinas libres en disolución. Sin embargo, en el interior de muchas proteínas el estado semiquinona se estabiliza considerablemente, convirtiendo a flavoproteínas y flavoenzimas en intermediarios únicos y obligatorios en procesos entre intercambiadores obligatorios de uno y dos electrones. Según el pH en todos estos # 4 estados de óxido-reducción se establece un equilibrio entre las formas aniónicas, catiónicas o neutras (Figura 1.1.2). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! FIGURA 1.1.2. ESTADOS DE OXIDO-REDUCCIÓN Y DE PROTONACIÓN QUE PUEDE ESTABILIZAR EL TRIPLE ANILLO AROMÁTICO DE LAS FLAVINAS.! ! Los cofactores flavínicos presentan también interesantes propiedades espectroscópicas que dependen de su estado de oxidación y protonación, y que se transmiten a las flavoproteínas que los incorporan. Así, en general las flavinas y flavoproteínas en estado oxidado presentan intensas bandas de absorción en el visible (Figura Anexo 1.1.3) con características de fluorescencia particulares para cada flavina [3], mientras que dichas bandas desaparecen en el estado reducido y estas especies dejan de ser fluorescentes. Este hecho ha contribuido a que esta familia de proteínas y enzimas se encuentren entre las mejores caracterizadas desde el punto de vista funcional [2,4]. ! ! 1.2. La FAD Sintetasa: Biosíntesis de FMN y FAD en procariotas! ! La RF es sintetizada de novo por plantas, hongos y la mayoría de microorganismos, sin embargo debe ser ingerida en la dieta en el caso de animales superiores. En todo tipo de organismos la posterior conversión de RF en FMN y FAD tiene lugar a través de dos reacciones secuenciales [4]:! ! 1. Una actividad RF quinasa (RFK) transforma la RF en FMN: ! ! RF+ATP:Mg2+—> FMN+ADP:Mg2+! ! 2. Una actividad FMN adenililtransferasa (FMNAT) transforma FMN en FAD: ! ! FMN+ATP:Mg2+—>FAD + PPi:Mg2+! ! 5 ! En mamíferos y levaduras, ambas actividades están codificadas en genes diferentes, dando lugar a dos proteínas independientes . En procariotas ambas actividades residen en un único gen que codifica para una única proteína bifuncional, la FAD sintetasa (FADS) [4]. La FADS mejor caracterizada es la de Corynebacterium ammoniagenes (CaFADS). Estudios secuenciales y estructurales indican que estas FADS se pliegan en dos módulos (Figura Anexo 1.2.1), cada uno de ellos fundamentalmente relacionado con una de las funciones de la proteína [4]. ! ! ✓Módulo C-terminal (residuos 184-338 en CaFADS): cataliza la conversión de RF en FMN y por ello se le conoce como módulo RFK. Posee una estructura de Barril beta con seis hebras antiparalelas, una hélice alfa y siete bucles que conectan estos elementos estructurales. Presenta alta homología con la proteína que realiza la misma función en mamíferos [5].! ! ✓Módulo N-terminal (residuos 1-183 en CaFADS): cataliza la conversión de FMN a FAD y se le conoce como módulo FMNAT. Presenta un plegamiento alfa/beta de unión a nucleótidos que consiste en una lámina beta paralela con seis hebras beta y cinco hélices alfas.$No presenta homología ni secuencial ni funcional con las enzimas que catalizan la actividad FMNAT en mamíferos, lo que lo convierte en una potencial diana terapéutica para el desarrollo de compuestos bioactivos que inhiban la biosíntesis de FAD en procariotas.! ! Estudios experimentales de titulación han identificado dos sitios de unión para ATP:Mg2+ en CaFADS, uno en cada módulo , y dos sitios de unión para flavinas, de nuevo uno en cada módulo. Aunque actualmente no se ha publicado ninguna estructura cristalográfica que represente estas interacciones se han producido modelos estructurales, que son avalados por diversos experimentos de mutagénesis dirigida [5,6]. ! ! ! 6 ! FIGURA 1.2.2. A. MODELO DE INTERACCIÓN DE ATP Y FMN EN EL MÓDULO FMNAT DE CAFADS. B. DETALLE DEL SITIO DE INTERACCIÓN DE ATP Y RIBITIL DE FMN EN DICHO MÓDULO. 1.3. Cribado de compuestos Bioactivos frente a CaFADS como modelo de diana terapéutica para el desarrollo de antimicrobianos! ! En el trabajo final de master “Caracterización de mutantes de la FADs de procariotas y búsqueda de inhibidores” presentado en Junio de 2013 por Maria Sebastián se llevó a cabo el cribado masivo de una quimioteca comercial de 1040 compuestos utilizando como diana la CaFADS. Se identificaron 50 inhibidores potenciales para la transformación de RF en FAD, de los cuales 15 se identificaron posteriormente como selectivos para la actividad FMNAT frente a la RFK. Algunos de estos compuestos se comprobó que también inhibían el crecimiento celular del correspondiente organismo [7]. ! ! Estos compuestos resultan de gran interés como líderes para el diseño de inhibidores de la síntesis de cofactores flavínicos no sólo en C. ammoniagenes, sino también de microorganismos patógenos para mamíferos. Esto se debe a que afectan a la actividad que tiene lugar en el módulo FMNAT de FADS [9], el cual no presenta homología en mamíferos pero se conserva entre organismos procariotas . ! ! 1.4. La FAD Sintetasa de Streptococcus pneumoniae como diana terapéutica ! ! Por el momento solo se ha descrito la estructura cristalográfica de la FADS de un organismo patógeno. Esta corresponde a Streptococcus pneumoniae, bacteria Gram positiva capaz de causar en humanos tanto infecciones menores (otitis media aguda) como procesos invasivos más severos (sinusitis neumonía, meningitis, septicemia, fiebre sin foco, artritis, peritonitis). Esta bacteria provoca cada año en E.U.A, 3.000 casos de meningitis, 50.000 de bacteremia y 500.000 de neumonía [8]. ! Salvo por la resolución de la estructura de SpFADS, no existe más información al respecto de esta proteína en la literatura. Recientemente esta proteína ha sido producida en nuestro laboratorio, identificándose que cataliza las mismas reacciones que CaFADS [5,6]. Sin embargo, desde el punto de vista mecanístico se ha detectado una diferencia apreciable: SpFADS solo es capaz de actuar sobre el estado reducido de RF y FMN para sus posteriores transformaciones en FMN y FAD, respectivamente. Esto limita de forma considerable la utilización de métodos espectroscópicos de absorción y fluorescencia para llevar a cabo cribados masivos de quimiotecas de compuestos usando SpFADS como diana.! ! 2.OBJETIVO DEL TRABAJO! ! 7 El objetivo de este Trabajo Fin de Grado es evaluar si CaFADS puede ser un buen modelo donde realizar el cribado masivo de compuestos que pudieran ser potenciales inhibidores de SpFADS. Para ello se ha elaborado un protocolo de bioinformática estructural que pretende abordar los siguientes objetivos parciales:! ! 1. Analizar de forma comparativa las estructuras de CaFADs y SpFADs en el módulo FMNAT! 2. Identificar el sitio de unión de los ligados para SpFADs en el módulo FMNAT! 3. Investigar las claves estructurales que rigen la especificidad por la flavina reducida para SpFADs! 4. Evaluar posibles sitios de unión de los inhibidores detectados para la actividad FMNAT de CaFADs en SpFADs! ! ! 3.MATERIALES Y MÉTODOS! ! 3.1 Ficheros de coordenadas:! ! Los ficheros de coordenadas tridimensionales de SpFADs y CaFADs se descargaron del Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) correspondiendo a los códigos PDB 3OP1 para la SpFADs y 2X0K para CaFADs. Los ficheros de coordenadas de los ligandos se obtuvieron principalmente de la base de datos Pubchem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pccompound), que contiene estructuras de moléculas de pequeño tamaño descargables en su forma plana o como ficheros de coordenadas en tres dimensiones. FAD (CID: 643975), ATP (CID: 5957), FMN (CID: 643976), C2(CID: 11102), C4(CID: 5897), C5(CID: 71771), C7(CID: 5281672), C8(CID: 5359476), C11(CID 4488), C12(CID 4044),C13(CID: 3059), C27(CID: 3503) y C43(CID: 4614). FMN y FAD se utilizaron tanto en su forma oxidada y reducida. ! ! 3.2 Métodos utilizados:! ! 1) Método de acoplamiento molecular (docking): es un método de simulación computacional que permite predecir si dos moléculas biológicas interaccionan y, caso de que lo hagan, las conformaciones y orientaciones que maximizan la interacción minimizando la energía de formación del complejo. Intentan predecir el mejor acoplamiento entre dos moléculas [9].! ! En el caso del docking proteína-ligando el método consiste en simular el espacio conformacional del ligando y evaluar todas sus posibles interacciones sobre la # 8 proteína (receptor). Como resultado se obtiene un conjunto de estructuras correspondientes a posibles complejos proteína-ligando que hay que calificar y clasificar en función de su energía libre y del conocimiento estructural y funcional que se disponga del receptor y el ligando. ! ! Hay cuatro enfoques generales para realizar una simulación de acoplamiento molecular:! A. Acoplamientos rígidos o Complementariedad de forma: Eliminan grados de libertad de rotación de enlaces. Se basan en las propiedades geométricas tanto de la proteína como del ligando. Se gira aleatoriamente la molécula pequeña y se buscan las posiciones en la que encaje mejor. En general, se define el receptor como un área de superficie molecular accesible al ligando y el ligando como una superficie molecular que ha de coincidir con el receptor para alcanzar una pose y orientación adecuadas. Estos métodos tienen la ventaja de un menor coste computacional para la generación de las poses y su rápida clasificación, pero tienen el inconveniente de no tener en cuenta la dinámica entre los átomos de proteína y ligando implicados en la interacción.! B. Métodos semiflexibles: Se suele aplicar tras los métodos rígidos, enfocados a las posiciones de unión descubiertas con el procedimiento anterior. Se introduce libertad de giro a los enlaces del ligando, y a algunas cadenas laterales de la proteína. Introduce dinamismo al sistema aproximándolo notablemente a la realidad. El coste computacional aumenta de forma moderada.! C. Métodos flexibles: Se selecciona la región de la proteína en la que se va a estudiar la interacción (generalmente con forma de caja) y se liberan todos los enlaces rotables. Esto permite evaluar cambios conformacionales a nivel local que mejoran notablemente la predicción, aumentando moderadamente el coste computacional.! D. Dinámica Molecular: Es más complejo, consume gran cantidad de recursos y requiere de mucho más tiempo de simulación. Sirve para refinar el resultado final y obtener una predicción más fina.! ! ! 9 ! ! ! ! ! FIGURA3.2.1 ACOPLAMIENTO MOLECULAR ENTRE UNA PROTEÍNA Y SU LIGANDO 4.2. Identificación de los sitios de unión de los sustratos de la actividad FMNAT de SpFADs mediante docking! ! 4.2.1 ATP! ! En la Tabla 4.2.1 del Anexo Tablas se resumen los resultados del docking del ligando ATP sobre la estructura de SpFADS en función de los clusters identificados por SwissDock, las poses de cada cluster y la media de los valores ΔG para la interacción de las poses en cada cluster. Los clusters 1, 2, 3 y 7 son aquellos donde el sitio de unión de ATP se asemeja más al esperado por comparación con el modelo de CaFADs, destacando entre ellos el 2. En este cluster el anillo de adenina se internaliza en la misma cavidad que lo hace en CaFADs, mientras que los fosfatos quedan en el entorno del posible sitio activo (Figura 4.2.1.1). ! FIGURA 4.2.1.1: INTERACCIÓN SPFADS:ATP SEGÚN CLUSTER 2. EL ATP SE MUESTRA EN VARILLAS CON SUS ÁTOMOS COLOREADOS POR TIPO DE ÁTOMO (CARBONOS EN VERDE) A. LA PROTEÍNA SE MUESTRA EN SUPERFICIE DE POTENCIAL ELECTROESTÁTICO (AZUL REGIONES CON POTENCIAL POSITIVO, ROJO REGIONES CON POTENCIAL NEGATIVO). B. LA PROTEÍNA SE MUESTRA EN MODELO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA Y SE RESALTAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO LOS AMINOÁCIDOS QUE CONTRIBUYEN A LA ESTABILIZACIÓN DEL ATP; H30, H33, Y25, D128, S163, S164, T165 Y R168.! ! Los resultados muestran varios residuos que pueden contribuir a estabilizar este ligando. Y25 contribuye a estabilizar la porción ribosa y el fosfato-α del ATP. H30 y H33 aparecen como dos residuos fundamentales para la estabilización del sustrato ATP, proporcionando diversas interacciones con la adenina del ATP (como NE2 de ambas histidinas con N4 de la adenina). El motivo S163/S164/T165 también# 16 A B contribuye a la estabilización del ligando: los grupos hidroxilo y N de S163 y S164 contribuyen a la estabilización de la ribosa del ATP, mientras que T165 estabiliza la posición de los fosfatos β y γ. A esta última estabilización contribuye también la cadena lateral de R168. Finalmente, el residuo D128 se estabiliza sobre el anillo de ribosa mediante puentes de hidrogeno con el N2. Con la excepción de Y25 y D128, todos estos residuos se encuentran conservados con respecto a CaFADS, y parecen realizar funciones similares en la estabilización del ATP. Además, H30, H33, S163, S164, T165 y R168 se encuentran altamente conservadas en las secuencias de la mayoría de FADS (Figura Anexo 4.1.1.3). ! ! Así, entre los residuos implicados en la interacción con ATP, los dos únicos cambios remarcables con respecto a CaFADS corresponden a la sustitución de V23 por Y25 y N125 por D128 en SpFADS. El reemplazamiento de V23 por Y25 supone tanto un aumento en el volumen de esta cadena lateral, como en el tipo de interacciones que la tirosina puede establecer con respecto a la valina. Este hecho podría relacionarse con una diferente estabilización de los fosfatos ATP entre estas dos enzimas. Sin embargo, el cambio más relevante corresponde al reemplazamiento de N125 por D128. N125 en CaFADS ha sido identificado como el residuo catalítico para la actividad FMNAT, sugiriendo que interacciona tanto con el fosfato-α del ATP como con el fosfato del FMN . Durante la catálisis se espera que la forma de ATP activa sea ATP:Mg2+, por tanto un D128 podría reemplazar a la N125 en este papel en SpFADs. La presencia de Mg2+ seguramente desplazará la posición de D128 observada en nuestro docking hacia el fosfato-α de ATP [12,13]. ! ! 4.2.2. FMNred y FADred! ! ! ! En las Tablas 4.2.2.1 y 4.2.2.2 del Anexo Tablas se resumen los resultados del docking para los ligandos FMNred y FADred sobre la estructura de SpFADS. Los clusters 0 y 6 de la tabla 4.2.2.1 del anexo Tablas son aquellos que mejor encajan con el sitio esperado para la unión de FMN en el módulo FMANT al comparar con CaFADS. En ambos casos, el anillo de FMNred queda estabilizado en una cavidad equivalente a aquella donde se une en CaFADS, y la diferencia fundamental entre ambos es la posición del fosfato del FMNred. En el cluster 0 este se sitúa en el entorno de D128, mientras que en el 6 se proyecta hacia el exterior de la proteína (Figura 4.2.2.1). El cluster 0 es el que mejor se adecuaría a lo esperado, ya que en las condiciones de la reacción el ATP es ATP:Mg2+. Como se ha indicado anteriormente este ion podría estabilizar la carga de D128, situando el fosfato del FMN de una forma similar a lo observado en el modelo de CaFADs [12,13].! ! 17 ! FIGURA 4.2.2.1: INTERACCIÓN SPFADS:FMNRED. SUPERFICIE DE POTENCIAL ELECTROESTÁTICO PARA LA INTERACCIÓN DE LOS CLUSTERS A. 6. Y B. 0. C Y D. MODELO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA PROTEÍNA DONDE SE RESALTAN EN VARILLAS AMARILLAS LOS AMINOÁCIDOS QUE CONTRIBUYEN A LA ESTABILIZACIÓN DEL FMNRED; F56, F98, F102, F110, D128, Y129, Y LOS ÁTOMOS DE LA CADENA PRINCIPAL DEL BUCLE A103-T105, T130K136. C. MUESTRA EN ESFERAS LOS RESIDUOS AROMÁTICOS QUE ESTABILIZAN EL TRIPLE ANILLO DE FLAVINA. D. MUESTRA EL RESTO DE RESIDUOS QUE INTERVIENEN EN LA INTERACCIÓN. EN TODOS LOS CASOS! ! ! En el caso del docking del producto de la reacción de adenilización, FADred, debido ! a que ninguno de los clusters encajaba las regiones de los nucleótidos de adenina y flavina simultáneamente según posiciones similares al modelo de CaFADs, se decidió estudiar la región de cada nucleótido por separado. La parte del nucleótido de adenina se analizó a partir de los resultados del cluster según Tabla 4.2.2.2 del anexo Tablas donde eligió el cluster 2 por la situación del anillo de ribosa en comparación con el modelo de CaFADs (Figura 4.2.2.2). La parte del triple anillo de flavina se analizó a partir de los resultados correspondientes al cluster 19 según Tabla 4.2.2.2 del anexo Tablas.! ! El análisis del mejor modelo de docking de FMNred a SpFADS indica que en el acoplamiento de esta molécula contribuyen las cadenas laterales de F56, F98, F102, F110, D128, Y129, y los átomos de la cadena principal de los bucles A103-T105 y T130-S133. El análisis del cluster 19 para la interacción con FADred, indica que estos mismos residuos se encuentran también estabilizando la parte correspondiente al nucleótido de flavina de esta molécula, mientras que el análisis del cluster 2 indica que el nucleótido de adenina del FADred se encuentra estabilizado por interacciones equivalentes a aquellas descritas para ATP en 3.2.1, a excepción de las establecidas con S163, S164, T165 y R168, ya que ahora los fosfatos del FAD se encuentran internalizados en el sitio activo.! Así, en general, los átomos de la cadena principal del bucle T130-K136 contribuyen a estabilizar la posición de FMNred y del nucleótido de flavina FADred, # 18 A B C D estableciendo puentes de hidrógeno con los átomos polares del anillo de pirimidina del triple anillo de flavina y con la estabilización del fosfato del FADred y FMNred con enlaces O-O, mientras que el bucle A103-T105 establece puentes de hidrógeno con N4H y O4 del triple anillo aromático. Destacar que el puente de hidrógeno que se establece entre el protón en la posición N4 del anillo de flavina en estado reducido y el grupo carbonilo de A103 podría ser determinante para la estabilización de la forma reducida de esta flavina en el sitio activo. También los grupos carbonilo de F102 y L105 contribuyen a estabilizar la posición de O4 del anillo de flavina.! ! ! ! En cuanto a las cadenas laterales de los aminoácidos implicados en la interacción con FMNred y el nucleótido de flavina de FADred la naturaleza aromática de las cadenas laterales de F56, F98, F102, F110 y Y129 claramente contribuye a la estabilización del triple anillo aromático. Además Y129 también estabiliza la cadena de ribitil mediante un apilamiento. Todos estos aminoácidos se encuentran conservados con respecto a CaFADS, con la excepción de Y129 que era una valina, favoreciendo la estabilización por puentes de hidrógeno del triple anillo aromático y de F110 que era una tirosina (ver apartado 3.1.2). El fosfato de FMNred, o el equivalente en FADred, resulta estabilizado por puentes de hidrógeno con la cadena principal D128-Y129, situándose en las proximidades del D128. Así, esta simulación prueba que la cadena lateral de este residuo podría actuar como residuo catalítico en la transferencia del grupo adenil-fosfato desde ATP:Mg2+ a FMN. ! ! 4.2.3. FMNox y FADox! ! 19 B A C D FIGURA 4.2.2.2: INTERACCIÓN SPFADS:FADRED. SUPERFICIE DE POTENCIAL ELECTROESTÁTICO PARA LA INTERACCIÓN DE LOS CLUSTERS A. LOCALIZACIÓN DEL NUCLEÓTIDO DE ADENINA Y B. LOCALIZACIÓN DEL NUCLEÓTIDO DE FLAVINA. C Y D MUESTRAN EN MODELO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA PARA A Y B RESPECTIVAMENTE. EN C Y D SE RESALTAN EN VARILLAS LOS AMINOÁCIDOS QUE CONTRIBUYEN A LA ESTABILIZACIÓN DEL FADRED; H30, H33, F56, F98, F110, A103, L104, D128, Y129 Y EL BUCLE T130-K136. Como se explico anteriormente la SpFADs va a tener preferencia por los ligandos reducidos, en este apartado se estudiaran ambos ligandos oxidados para su comprensión.! ! Para el FMNox, el docking no proporciono ningún resultado coherente, todos los clusters estaban mal posicionados: en el medio del centro activo, zona del ATP. El que mas se acerco a la posición del FMN fue el que se muestra en la Figura 4.2.3.1.B, donde se ve el anillo de flavina en su correcta posición pero la cadena esta apuntando al exterior del centro activo.! FIGURA 4.2.3.1: POTENCIAL ELECTROSTÁTICO DEL FMN. A. FMNRED B.FMNOX! ! Con el FADox ocurrió algo muy curioso y es que encajaba mejor el FADox que el FADred (Figura 4.2.3.2), esto podría ser bien por que el docking es un método estadístico y el FMNox podría encajar allí aunque invivo por numerosos factores no sea factible o bien que la reacción en FMNAT sea reversible como pasaba para la de CaFADs ( FAD+ADP—> FMN+ATP) y que el ligando oxidado sea uno de sus productos, aunque esto ultimo aun no se ha estudiado. Las interacciones que existen con el ligando oxidado son las mismas vistas en el apartado 3.2.2 para el FADred, con la excepción del A103 que antes interaccionaba mediante puentes de hidrogeno con el N4, ahora interaccionará directamente con el N4, aunque la distancia entre ambos átomos es bastante alejada y puede que no interaccionen y el FADox este menos estabilizado que el FADred. Aun con todo se debería estudiar experimentalmente si el FADox es un sustrato de la reacción.! ! FIGURA 4.2.3.2: POTENCIAL ELECTROSTÁTICO DEL FAD. A. FADRED B.FADOX" 20 A B A B 4.3 COMPUESTOS BIOACTIVOS! ! Dadas las similitudes entre CaFADS y SpFADS se ha procedido a identificar si algunos de los compuestos que se han identificado como potenciales inhibidores de la actividad FMNAT de CaFADS Tabla 4.3 del Anexo [7], con objeto de predecir si podrían ser inhibidores de la actividad FMNAT en SpFADs. Para evaluar esta posibilidad se ha simulado su unión SpFADS con los diferentes compuestos mediante el método de docking.! ! 4.3.1 C2! ! El docking de C2 sobre la estructura de SpFADS devolvió un conjunto de 34 clusters con valores de ΔG entre -11,46 y -7,59 kcal/mol. Estos clusters se encontraron mayoritariamente en el dominio FMNAT. Debido a su gran tamaño en varios de estos clusters este compuesto ocupa simultáneamente los sitios de unión ATP, sitio catalítico y/o sitio de unión al sitio catalítico de la flavina. Estos cluster se pueden agrupar en dos representativos! ! FIGURA 4.3.1: INTERACCIÓN DE C2 CON SPFADS. A. SITIO DE UNIÓN DEL ATP Y FOSFATOS, B. SITIO DE UNIÓN DE LA FLAVINA Y FOSFATOS. ALGUNOS DE LOS AMINOÁCIDOS QUE INTERACCIONARÍAN CON C2 EN CADA LOCALIZACIÓN SE MUESTRAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO. A Y25, G32, H33, D70, L71, F127, D128, Y129, P154 Y S164. B. K61, L64, F98, D128, T130, S133, S163, S164 Y T165. C2 SE MUESTRA EN VARILLAS CON CARBONOS EN VERDE.! ! La primera agrupación ocuparía las zonas de unión del ATP y fosfatos durante la ! catálisis. Dicha interacción es la más frecuente y con un valor de ΔG más negativo. En ella C2 interacciona con Y25, G32, H33, D70, L71, F127, D128, Y129, P154 y S164 (Figura 4.3.1.A). La segunda ocupa la zona de unión de los fosfatos y del triple anillo de flavina. C2 se estabilizaría por interacción con los residuos aromáticos de # 21 A B este sitio, así como con K61, L64, D128, T130, S133, S163, S164 y T165 (Figura 4.3.1.B). Estos resultados indican que C2 podría ser buen inhibidor de SpFADs en el sitio FMNAT.! ! 4.3.2 C4! ! Los resultados del docking proporcionaron un total de 12 clusters para la interacción de C4 con SpFADS, con valores de ΔG entre -7 y -3,09 kcal/mol. La mayoría de los clusters se situaron en tres posiciones del módulo FMNAT. ! ! FIGURA 4.3.2: INTERACCIÓN DE C4 CON SPFADS. A. SITIO DE UNIÓN EN EL CENTRO ACTIVO. B. SITIO DE UNIÓN DE ATP. ALGUNOS DE LOS AMINOÁCIDOS QUE INTERACCIONARÍAN CON C4 SE MUESTRAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO: A. G24, Y25, D27, S163 Y S164. B. G24, Y25 Y EL BUCLE D128-T130. C4 SE MUESTRA EN VARILLAS CON CARBONOS EN VERDE.! ! El primer grupo corresponde al resultado más frecuente. En él C4 se situaría en el sitio de unión del ATP del módulo FMNAT. En las poses correspondientes a este grupo G24, Y25, D27, S163 y S164 contribuirían a la estabilización de C5 (Figura 4.3.2 A). En el segundo grupo C4 se localiza en el centro activo. Esta posición es la que presenta valores de ΔG más negativos, y por lo tanto sería la más probable según los resultados del docking. G24, Y25 y el bucle D128-T130 estabilizarían esta posición. (Figura 4.3.2.B). C4 podría ser un potencial inhibidor de la actividad FMNAT de SpFADs al competir con la unión del ATP y de ambos sustratos en el sitio activo.! ! 4.3.3 C5 ! ! Los resultados del docking para la interacción de C5 con SpFADS proporcionaron un total de 41 clusters, con valores de ΔG entre -15 y -2,05 kcal/mol. Los clusters que se sitúan en el centro activo para la actividad FMNAT se pueden agrupar principalmente en dos.! ! ! 22 A B FIGURA 4.3.3: INTERACIÓN DE C5 CON SPFADS. A. SITIO DE UNIÓN DEL ATP, ESTABILIZADO POR EL BUCLE G24F26, H30, G32, H33, D128, Y129, P154, V155 Y EL BUCLE K161-S164. B. SITIO DE UNIÓN DE LA FLAVINA. ESTABILIZADO POR F56, F98 Y F102, F110, P60, L64, A103 Y CON EL BUCLE T130-K136. ALGUNOS DE LOS AMINOÁCIDOS QUE INTERACCIONARÍAN CON C5 EN CADA LOCALIZACIÓN SE MUESTRAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO. C5 SE MUESTRA EN VARILLAS CON CARBONOS EN VERDE.! ! El primer grupo corresponde al resultado más frecuente. El C5 se situaría en el sitio de unión del ATP del módulo FMNAT (Figura 4.3.3.A), probablemente compitiendo con la unión de este nucleótido o con el extremo fosfato del FMN. En las poses correspondientes a este grupo el bucle G24-F26, H30, G32, H33, D128, Y129, P154, V155 y el bucle K161-S164 contribuyen a su estabilización. Como se ha establecido anteriormente estos residuos juegan un papel en la estabilización de ATP. En el segundo grupo el C5 se localizaría en la región propuesta para la interacción del triple anillo de flavina. Esta posición presenta una ΔG más negativa, lo que podría hacerla más favorable. En esta posición C5 se estabiliza por interacciones de apilamiento con aminoácidos aromáticos como F56, F98 y F102, F110, con otros aminoácidos como P60, L64, A103 y con el bucle T130-K136 (Figura 4.3.3.B). Estas predicciones sugieren que C5 se unirá preferiblemente al módulo FMNAT de SpFADS, y que competiría por los sitios de interacción de FMN y ATP. Por tanto, podría ser un buen inhibidor para la actividad FMNAT de SpFADs.! ! 4.3.4 C7! ! El docking de C7 sobre la estructura de SpFADS devolvió un conjunto de 41 clusters con valores de ΔG entre -7,38 y -5,39 kcal/mol. Los clusters se encontraron repartidos por igual en los módulos RFK y FMNAT de la enzima. Sin embargo, C7 sólo afecta a la actividad FMNAT de CaFADS, por lo que limitaremos el análisis a este módulo. Entre los cluster que se observan en el módulo FMNAT de SpFADs encontramos dos agrupaciones en el sitio activo para esta actividad.! ! 23 A B FIGURA 4.3.4: LOCALIZACION DE C7 EN SPFADS. A. SITIO DE UNIÓN DE LA FLAVINA, B. SITIO DE UNIÓN DEL ATP. ALGUNOS DE LOS AMINOÁCIDOS QUE INTERACCIONARÍAN CON C7 SE MUESTRAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO.: A. Y25, F56, P60, F98, EL BUCLE F102-L105, F110 Y EL BUCLE Y129S133. B: G24, G32, H30, H33, EL BUCLE D128-T130, P154 Y V155. C7 EN VARILLAS CON CARBONOS VERDES EN A Y ROSAS EN B.! ! El primer grupo correspondería a la unión de C7 en el sitio de unión de la flavina. Esta posición corresponde a los valores de ΔG más negativos y en ella C7 estaría estabilizado por Y25, F56, P60, F98, el bucle F102-L105, F110 y el bucle Y129S133. Es de destacar que A103 era un residuo que particularmente estabilizaba la posición N5 en las flavinas reducidas (Figura 4.3.4.A). El segundo grupo corresponde a la unión del C7 en el sitio del ATP. Esta posición es la más abundante entre los clusters obtenidos para el módulo FMNAT. En ella C7 se estabiliza por interacciones con G24, G32, H30, H33, el bucle D128-T130, P154 y V155, residuos que antes se había mencionado contribuirían a la estabilización del sustrato ATP y, particularmente, por D128, residuo que podría actuar como catalítico en SpFADS (Figura 4.3.4.B). En resumen, el compuesto C7 podría ser un posible competidor al interaccionar con el sitio de unión del ATP, el sitio catalítico y el sitio de unión de la flavina en el módulo FMNAT, y podría por tanto inhibir esta actividad. ! ! 4.3.5 C8! ! El docking de C8 sobre la estructura de SpFADS devolvió un conjunto de 12 clusters con valores de ΔG entre -7,85 y -6 kcal/mol. Los clusters se encontraron repartidos por igual en los módulos RFK y FMNAT de la enzima, pero experimentalmente se ha probado que C8 sólo afecta a la actividad FMNAT en CaFADS. Entre los cluster que se observan en el módulo FMNAT de SpFADs uno, muy poblado, corresponde al sitio de unión del ATP y los fosfatos de los ligandos flavínicos, siendo el que presenta el valor de ΔG más negativo. C8 se estabilizaría mediante interacciones con G24, Y25, G28, P60, G126, D128, Y129, I162, S163 y T165 (Figura 4.3.5). Por tanto, C8 # 24 A B podría ser un buen inhibidor competitivo del sustrato ATP para la actividad FMNAT, ya que podría bloquear tanto el sitio de unión del ATP como el centro catalítico.! FIGURA 4.3.5: INTERACCIÓN DE C8 EN EL SITIO DE UNIÓN DEL ATP Y SITIO CATALÍTICO. ALGUNOS DE LOS AMINOÁCIDOS QUE INTERACCIONAN CON C8 SE MUESTRAN EN VARILLAS CON LOS CARBONOS EN AMARILLO: G24, Y25, G28, P60, G126, D128, Y129, I162, S163 Y T165. C8 SE MUESTRA EN VARILLAS VERDES! ! ! 4.3.6 C11! ! El docking de C11 sobre la estructura de SpFADS devolvió un conjunto de 46 clusters con valores de ΔG entre -7,89 y -5,36 kcal/mol. Los clusters se encontraron repartidos por igual en los módulos RFK y FMNAT de la enzima, pero C11 sólo afecta a la actividad FMNAT en CaFADS. Entre los cluster que se observan en el módulo FMNAT de SpFADs encontramos tres agrupaciones en el sitio activo para esta actividad, que en conjunto completan toda la cavidad de interacción con los sustratos. ! La primera posición corresponde al sitio de unión del ATP. Dicha posición es la más repetida en los resultados de docking y en ella C11 se encuentra estabilizado por interacciones con H30, G32, H33, G126, el bucle V152-V155 y el bucle I162-S164 (Figura 4.3.6.A). La segunda posición corresponde al sitio de unión de los fosfatos tanto de ATP como de las flavinas y en ella C11 se estabiliza con el bucle G24-F26, H33, L36, G126 y el bucle D128-T130 (Figura 4.3.6.B). Muchos de estos aminoácidos estabilizan los fosfatos en el centro activo. La tercera posición corresponde al sitio de unión del anillo de flavina, siendo la posición que proporciona los valores de ΔG más negativos. En esta posición C11 se estabiliza entre el bucle L23-Y25, el bucle M54-F56, F98, F102, A103, L105, F110 y el bucle F131-G132 (Figura 4.3.6.C). Por tanto, C11 podría actuar como inhibido de la actividad FMNAT al ocupar de forma competitiva los sitios de interacción de sus sustratos. ! ! 25 7. Referencias ! 1. Mansoorabadi, S.O., C.J. Thibodeaux, and H.W. Liu, The diverse roles of flavin coenzymes--nature's most versatile thespians. J Org Chem, 2007. 72: 6329-6342. ! ! 2. Fraaije, M. W. & Mattevi, A. 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(2012) Role of key residues at the flavin mononucleotide (FMN):adenylyltransferase catalytic site of the bifunctional riboflavin kinase/flavin adenine dinucleotide (FAD) synthetase from Corynebacterium ammoniagenes, Int J Mol Sci. 13, 14492-14517. ! 32 ! ! ! ! ! ! ! 32