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Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 1 Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína Ofucosiltransferasa Trabajo de Fin de Grado de Biotecnología, Septiembre 2014 Autor Daniel Murciano Trigo Director de proyecto Co-directora de proyecto Ramón Hurtado Guerrero Jessika Valero González Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 2 Indice Índice 2 Resumen 4 Abstract 4 Introducción 5 1. Glicosilación 5 2. Glicosiltranferasas y O-fucosilación 5 3. Tromboespondinas y TSRs 6 Objetivos 8 Materiales y métodos 9 1. Preparación de cultivos y crecimiento celular 9 2. Recogida de muestras 10 3. Purificación 11 3.1. Purificación en columna de níquel del dominio TSR123 11 3.2. Desalting de TSR123 11 3.3. Segunda columna de níquel 12 3.3.1.Purificación en columna de maltosa-GST de TSR123 12 3.3.2. Purificación en columna de maltosa del dominio TSR1 13 4. Filtración en gel 13 4.1. Filtración en gel del dominio TSR123 13 4.2. Filtración en gel del dominio TSR1 14 5. Cristalización 14 6. Pruebas de expresión y purificación de TSR12 y TSR23 15 6.1. Tranformación de células con el DNA 15 6.2. Elaboración de gliceroles y preparación de cultivos 15 6.3. Purificación mediante columna de maltosa 16 Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 3 Resultados 17 1. TSR123 17 1.1. Preparación de cultivos y crecimiento celular 17 1.2. Purificación en columna de níquel 17 1.3. Desalting y cuantificación 18 1.4. Segunda columna de níquel 19 1.5. Purificación en columna de maltosa-GST 20 1.6. Filtración en gel 21 1.7. Cristalización 22 1.8. Segundo proceso de cultivo y purificación de TSR123 23 2. TSR1 24 2.1. Preparación de cultivos y crecimiento celular 24 2.2. Purificación en columna de maltosa 24 2.3. Filtración en gel 25 3. TSR12 y TSR23 26 3.1. Prueba de expresión 26 3.2. Preparación de cultivos y crecimiento celular 26 3.3. Purificación con columna de maltosa y corte con proteasa 27 Discusión 28 Conclusiones 29 Bibliografía 30 Anexo I. Características de las proteínas 32 Anexo II. Relación de abreviaturas 34 Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 4 RESUMEN La O-fucosilación es una modificación post-traduccional que tiene lugar generalmente en un gran número de proteínas de membrana o secretadas. Múltiples estudios han revelado que esta modificación está implicada en la señalización celular y plegamiento de proteínas durante el desarrollo embrionario, así como en el metabolismo del tejido adulto. Entre los diferentes elementos implicados en el proceso de O-fucosilación destacan las glicosiltransferasas (GTs) POFUT1 y POFUT2 las cuales transfieren residuos de fucosa desde GDP-fucosa a sustratos aceptores específicos. Mientras POFUT1 fucosila proteínas conteniendo repeticiones con estructura similar al factor de crecimiento epidermal (EGF). POFUT2 fucosila las repeticiones de tromboespondinas tipo 1 (TSRs). En ambas repeticiones se fucosilan residuos de serina o treonina y están formadas por tres puentes disulfuro. Si bien tanto la estructura cristalina de POFUT2 como la de los dominios TSR ha sido resuelta mediante la difracción por rayos X en múltiples estudios, sigue sin conocerse con precisión el mecanismo de transferencia de cómo la POFUT2 reconoce los TSRs y de por tanto como se fucosilan. En este sentido optimizaremos la expresión y purificación de diferentes dominios TSR para posteriormente caracterizar cualitativa y cuantitativamente la interacción entre estos y la enzima POFUT2. Además, algunos de estos dominios se utilizarán para obtener una estructura cristalina junto con la POFUT2 con el fin de elucidar el mecanismo de reacción de la fucosilación y se cómo esta GT reconoce a sus sustratos aceptores. ABSTRACT O-fucosylation is an important post-translational modification occurring un proteins. Many studies have demonstrated that this modification is involved in cellular signaling and protein folding both in embryonic development and adult tissues. Both glycosyltranferases (GTs), POFUT1 and POFUT2, proteins are responsible of this modification. They transfer residues of fucosa from GDP-fucose to acceptor substrates. While POFUT1 fucosylates epidermal growth factor (EGF) like domains, POFUT2 does it on Thrombospondin Repeats type I (TSRs) domains. Both GTs transfer fucosa to serine and threonine residues on these domains. Thought the crystal structures of POFUT2 and TSR have been resolved by X-ray crystallography, there is not a structure of the complex between POFUT2 and TSR, and thus the recognition mechanism of how POFUT2 recognizes these domains of the catalytic mechanism are not currently known. In this study we will optimized the expression and purification of different TSR domains in order to characterize the interaction between those and POFUT2. Moreover these domains will be co-crystalize with POFUT2 with the aim of obtaining a complex that might unravel the above aspects of POFUT2. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 5 INTRODUCCIÓN 1. Glicosilación La glicosilación es un proceso consistente en la incorporación de moléculas de carbohidratos a otras moléculas biológicas (como por ejemplo azúcares, lípidos o proteínas). Alrededor del 3% del genoma humano está implicado en procesos de glicosilación y más del 50% de las proteínas expresadas se encuentran glicosiladas (Davies et al., 2005). La glicosilación de proteínas en un proceso conservado evolutivamente y observado en todos los organismos desde bacterias hasta el ser humano. Entre las funciones de estos glicanos se encuentran la estabilización de proteínas, el marcaje antigénico, el proceso de señalización celular o el plegamiento proteico. (Luther and Haltiwanger et al., 2009). Además, diversas patologías humanas son causadas por desórdenes en procesos de glicosilación o reconocimiento de carbohidratos; es por ello que el estudio de las glicosiltransferasas (GTs) tiene un gran interés tanto científico como biomédico (Varki et al., 2009). 2. Glicosiltransferasas (GTs) y O-fucosilación Las GTs son enzimas clave encargadas de la transferencia de azúcares a proteínas, lípidos, moléculas orgánicas y otros glicanos. Son enzimas con funcionalidades específicas que participan en multitud de procesos biológicos (Henrissat B. et al., 2008). Entre los diversos procesos de glicosilación proteica se encuentra la O-fucosilación. La O-fucosilación es una modificación post-traduccional directamente implicado en el plegamiento, el desarrollo embrionario y la homeostasis de tejido adulto. (LiraNavarrete, Valero-González, Hurtado-Guerrero et al., 2011). El mecanismo de O-fucosilación es catalizado por las enzimas conocidas como POFUT2 (“Protein O-Fucosyltransferase type 2”) y POFUT1 (“Protein OFucosyltransferase type 1”) que actúan como GTs de inversión mediante la transferencia de moléculas de fucosa a sus sustratos protéicos. Ambas tranfieren residuos de fucosa desde GDP-fucosa a proteínas con motivos ricos en cisteínas, en concreto sobre dominios TSR (“Thrombospondin Repeats type I”) y EGF (“Epidermal Growth Factor-Like”) que actúan como grupos receptores del carbohidrato (Harris and Spellman et al., 1993). Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 6 Figura 1. Esquema de los diferentes componentes de las TSPs 3. Tromboespondinas y TSRs Las tromboespondinas (TSPs) son unas proteínas extracelulares que participan en la comunicación célula-célula y célula-matriz. Su estructura consta de cinco componentes que poseen patrones de expresión específicos en tejidos embrionarios y tejidos adultos, concretamente se ha encontrado una alta expresión de estas proteínas en tejido cardiaco, cartilaginoso y cerebral. Las TSPs interaccionan en la superficie celular con proteínas de membrana tales como integrinas, CD36 y proteoglicanos. Participan tanto en la regulación de la estructura de la matriz extracelular como en el fenotipo celular (Lawler J. et al., 2000). La principal función de las TSPs es a través de los TSRs (Thrombospondin type 1 Repeats) y consiste en la activación del TGF-β (Transforming Growth Factor type β) y son capaces de inhibir la angiogénesis o desarrollo de vasos sanguíneos (Murphy et al., 1992). La estructura de las TSPs consta de 4 dominios: un N-terminal, un dominio de repeticiones tipo 1 (TSR), un dominio de repeticiones tipo 3 y un dominio C-terminal (Figura 1). Las repeticiones de trombospondinas o TSR (“Thrombospondin type 1 Repeats”) son unas secuencias que se encuentran en numerosas proteínas humanas y que suelen ser fucosiladas en residuos de serina/treonina (Chun-I Chen et al., 2012). Más de 40 proteínas humanas contienen las secuencias consenso TSR dependientes de la fucosilación por POFUT2 (Hofsteenge et al., 2001). El dominio TSR se caracteriza por estar formado por una irregular y dos hojas beta regulares: A, B y C (Figura 2). Nosotros estudiaremos los dominios TSR123 de la trombospondina 1 humana (Tan et al., 2002). En esta estructura se observa un asa en el “loop” formado entre los TSRs 2-3 y otro loop entre los TSRs 1-2 que corresponde a la región donde se produce la O-fucosilación, concretamente en el residuo de serina o treonina de la secuencia CX2-3(S/T)CX2G (Tucker et al., 2004). Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 7 Figura 2. Estructura 3D de los TSRs con las cadenas ACB del TSR tipo 1. Estudios realizados en ratones “knock out” para el gen de POFUT2 han demostrado que la O-fucosilación de los TSRs es crítica para procesos embrionarios tales como la restricción de la transición del tejido epitelial, correcto modelaje del mesodermo y localización correcta del endodermo (Du et al., 2010). En la actualidad no se conoce ninguna enfermedad asociada directamente con un defecto genético en el locus de POFUT2 en H.sapiens. Hoy en día se está estudiando más a fondo la O-fucosilación de proteínas, la interacción entre GTs y sus sustratos y el mecanismo de reconocimiento específico de las secuencia consenso de fucosilación. Recientemente se ha obtenido la primera estructura cristalina de HsPOFUT2 sola y en complejo con el donor GDP-fucosa, cuyo estudio sugiere que la especificidad del reconocimiento del enzima no radica en la totalidad del TSR sino en una estructura 3D inusual de una pequeña parte del TSR (Chen et al., 2012). Por tanto, el estudio de la estructura de los TSR y de su interacción con la proteína POFUT2 permitirá conocer mejor el mecanismo reconocimiento de los TSRs por parte de la POFUT2 además de entender el mecanismo de la O-fucosilación. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 8 OBJETIVOS El presente trabajo tiene como objetivo optimizar la expresión y purificación el dominio TSR123, así como sus subdominios TSR1, TSR12 y TSR23 para su estudio por separado y observar como son reconocidos y fucosilados por POFUT2. Los objetivos específicos comprenden:  Expresar y purificar estos dominios usando la cepa de Rossetta Gammi (DE3) de E. coli.  Co-eluir la proteína TSR123 junto con la proteína POFUT2 mediante la técnica de filtración en gel su posterior cristalización. Los resultados obtenidos en este trabajo podrán servir para futuros estudios que permitan la cristalización del complejo POFUT2-TSR123 o POFUT2 como dominios simples de TSR o dobles, o estudios cinéticos y termodinámicos entre ambas proteínas. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 9 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Preparación de cultivos y crecimiento celular. Tanto la proteína TSR123 como el dominio TSR1 con los que trabajamos fueron obtenidos de bacterias congeladas con glicerol a -80ºC que contenían los vectores basados en pMALc2x para la expresión de las mismas. Estos vectores aportan una cola de ocho histidinas que facilitará la purificación de la proteína usando una columna de níquel, así como una proteína de unión a maltosa (MBP) que facilitará la sobreexpresión y la purificación mediante una columna de maltosa. La proteína con el vector estaba insertada en cepas de Rossetta-Gammi 2 (DE3) de E. coli. Estas cepas tienen la cualidad de formar puentes disulfuro citoplasmáticos que mejoran la expresión proteica, así como solubilizar altos porcentajes de proteína (Kuroki M. et al., 2014). A las muestras de glicerol se les había añadido el antibiótico tetraciclina para favorecer la formación de los puentes disulfuro en el citoplasma y ampicilina como marcador de selección positivo del plásmido. La concentración de los antibióticos fue de 100 μg/ml para la ampicilina y 10 μg/ml para la tetraciclina. Para poder obtener una mayor cantidad de muestra de proteína sembramos una alícuota de estas muestras de glicerol en un medio de cultivo rico que favorezcan el crecimiento de las bacterias que contienen la proteína de trabajo. Para preparar los medios de cultivo se utilizó el medio 2xTY que se compone de: 16g de triptona, 10g de extracto de levadura, 5g de NaCl y NaOH para equilibrar el pH del cultivo hasta un valor final de 7. Con esta fórmula se prepararon precultivos de 100 ml en matraces de 250ml y cultivos de 2 litros en matraces de 5 litros. Tanto los precultivos como los cultivos se autoclavaron a 120ºC durante 20 minutos para su esterilización. A estos medios también se les añadirían los antibióticos tetraciclina y ampicilina a una concentración de 10 μg/ml y 100 μg/ml respectivamente tras la esterilización. En los matraces correspondientes a los precultivos se les añadió una muestra de 30 μl de Rossetta Gammi 2 (DE3) transformadas con nuestro plásmido y se dejaron crecer en un agitador a 160rpm y 37ºC de temperatura durante un periodo de 16-20 horas con el objetivo de alcanzar una densidad celular óptima correspondiente a un valor de absorbancia de 0,6unidades a 600 nm. A cada matraz de cultivo de 5 litros se le añadieron ampicilina y tetraciclina y 100 ml del precultivo preparado del día anterior. Estos matraces se incubaron en un agitador a 160rpm y 37ºC de temperatura comprobando su densidad óptica a intervalos de una hora hasta conseguir una absorbancia de 0,6 unidades. (transcurridas aprox. 4 horas). Como muestra de blanco para las mediciones de absorbancia se utilizó una alícuota de cultivo al que se habían añadido los antibióticos pero no la muestra celular. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 16 Como variación del método de expresión descrito hasta ahora se tomaron muestras de cultivo de ambas proteínas antes de inducirlas con IPTG junto con alícuotas de “pellet” y alícuotas de sobrenadante tomadas tras la inducción con IPTG de las muestras de ambos dominios con el objetivo de comprobar la expresión de las construcciones. 6.3. Purificación mediante columna de unión a maltosa. En el caso de los dominios TSR12 y TSR23, queríamos demostrar si podíamos cortar la construcción de la proteína unida a la proteína de fusión (MBP) por lo que el primer paso de purificación consistió en pasar las muestras por una columna de maltosa. Siguiendo los pasos descritos anteriormente en el apartado 3.4.2 pasamos ambas muestras por una columna de unión a maltosa recogiendo las fracciones correspondientes al flujo a través de la columna, lavado y eluído de la columna. Las muestras obtenidas fueron analizadas por electroforesis en gel de acrilamida al 15% junto con una alícuota de sobrenadante y otra de “pellet” tomadas antes de la purificación. La fracción correspondiente al eluído fue cuantificada mediante el método de Bradford para calcular el volumen de proteasa de precisión que debíamos añadir para una proporción 1:10 y la mezcla la dejamos cortar durante un fin de semana. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 17 Figura 3. Picos UV columna de níquel TSR123. RESULTADOS 1. TSR123. 1.1.Preparación de cultivos y crecimiento celular. Se prepararon 3 matraces de 5 litros de capacidad con 2 litros de cultivo 2xTY en cada uno y sus correspondientes matraces de 250ml con 100ml de precultivo. Durante el cultivo de las muestras en los matraces de 5 litros se realizaron 3 medidas de absorbancia a la hora, dos horas y 4,5 horas respectivamente: Tras 4,5 horas el valor de absorbancia era el adecuado (0,63) para inducir las muestras con IPTG. Después de centrifugar todo el medio de cultivo para desechar el sobrenadante recogimos un volumen de 30ml de “pellet”, a los que añadimos 30ml de solución A, 1mg de lisozima, 3μl de benzonasa y un vial de inhibidor de proteasa para iniciar el proceso de rotura celular. 1.2. Purificación en columna de níquel. Después de la sonicación disponíamos de 30ml de muestra de proteína que hicimos pasar por la columna de níquel para su purificación. El análisis de la muestra por el software UNICORN del sistema AKTA nos dio dos picos de conectividad UV con el siguiente patrón (Figura 3): El primer pico correspondía a todas las proteínas que no se habían unido a la columna de níquel, mientras que el segundo pico indicaba la presencia de nuestra proteína en la muestra de eluído. El volumen total de eluído fue de 60ml, que concentramos en concentradores Millipore de 10kDa hasta un volumen final de 30ml. Fracción eluida Fracción de flujo a través de la columna Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 18 1.3. Desalting y cuantificación. Los 30 ml de muestra de proteína obtenidos en el paso anterior se inyectaron en una columna de desalting de 50 ml para eliminar todo el imidazol de solución. La ventaja del desalting frente a la diálisis como método de eliminación de sales y para cambiar el medio de las proteínas es que el desalting es un proceso que se realiza a gran velocidad con respecto a la diálisis, lo que impide un cambio de conformación indeseado de las proteínas, por ello este es el método de elección para cambiar el medio a uno sin imidazol. Tras el desalting obtuvimos 45 ml de muestra de proteína que cuantificamos por el método de Bradford a 595 nm en el espectrofotómetro Cary 100 Bio UV-Vis obteniendo una medida de absorbancia de 0,32 con una muestra de 1μl de proteína. Previamente fue realizada una calibración del reactivo Bradford comercial obteniendo un valor de absorbancia de 0.086 para 1 μl de BSA de concentración 1mg/ml en 1 ml de reactivo de Bradford. Por tanto se puede realizar la cuantificación de proteína mediante la fórmula: [ ]proteína = Absproteína / 0,086. 0,32 = 0,086c  c = 0,32/0,086 = 3,72 mg/ml de proteína, en 45ml  167mg/proteína Para cortar nuestra muestra se añadieron 1,67 mg de proteasa de precisión (PP) de una solución de 4 mg/ml para tener una proporción 1:100. Las muestras se dejaron reaccionando a 4ºC durante 48 horas. En trabajos anteriores se había comprobado que el corte de la proteína mediante proteasa de precisión no resultaba muy efectivo, por lo que en este caso se realizaron diferentes pruebas: corte en la solución Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y corte en la solución Tris 25 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. El motivo por el cual se optó por realizar estas pruebas fue el de minimizar la aparición de oligómeros, de cuya aparición se tiene constancia según trabajos anteriores. De esta manera se pretendía optimizar el corte con la proteasa de precisión Se realizó un análisis por electroforesis en gel de acrilamida al 15% de una muestra control cortada (A), una muestra cortada con solución 150mM NaCl (B) y una muestra cortada con solución 500mM NaCl (C). Las bandas que aparecen en el gel representan la proteína de unión a maltosa (40kDa), la proteína TSR123 (20kDa) y el complejo MBP-TSR123 (60kDa) (Figura 4). Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 19 Figura 5. Picos UV segunda columna de níquel TSR123 Figura 4. Gel acrilamida tras columna de níquel TSR123. Se observó el mismo patrón para las bandas B y C (50% de corte) por lo que comprobamos que la proteasa de precisión no cortaba mejor a una mayor concentración de sal. 1.4. Segunda columna de níquel. Los 45 ml de muestra obtenida tras el desalting volvieron a ser inyectados en el sistema AKTA para una segunda purificación con columna de níquel. En este paso se pretende eliminar la proteína de fusión MBP-8His y parte de la fracción no cortada de nuestra proteína. El software UNICORN nos dio un patrón de picos de conectividad similar al anterior, recogimos los tubos 4-7 (correspondientes a la fracción flujo a través de la columna) y los tubos 10-14 (correspondientes a la fracción eluída). El resto de picos correspondían a problemas de entrada de aire o suciedad en el circuito (Figura 5). Fracción de flujo a través de la columna Fracción eluída 60kDa. MBP+TSR123 40kDa. MBP 20kDa. TSR123 A B C Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 20 Figura 6. Gel acrilamida tras segunda columna de níquel TSR123. Se tomó una alícuota de ambas fracciones y se analizó por electroforesis en gel de acrilamida al 15% (Figura 6). La banda de proteína apareció en todas las fracciones de flujo a través de la columna (F). Al no obtuvimos muestra en el eluído (E) no fue necesario realizar otro desalting. 1.5. Purificación en columna de maltosa-GST. Los 20 ml obtenidos de muestra de proteína de la columna de níquel se inyectaron en el sistema AKTA para ser purificados mediante columnas de maltosa y GST. En este paso queremos eliminar las proteínas no cortadas unidas a las proteínas de fusión MBP mediante la columna de maltosa y la proteasa de precisión mediante la columna de GST. Recogemos la fracción de lavado de las columnas y obtenemos 15 ml de muestra de proteína que concentramos en concentradores Millipore de 10kDa hasta un volumen final de 3 ml. También se recogió la fracción de eluído para un posterior análisis. La muestra de cuantificó por método de Bradford con un valor de absorbancia de 0,34. 0,34/0,086 = 3,92 mg/ml  en 3ml de proteína = 11,78 mg de proteína. Nota: esta medida de concentración se podría realizar mediante el método cuantificación por absorbancia a 280nm (espectro en el que se miden las proteínas) ya que en este punto la muestra ya debe de contener proteína pura. La medición se realiza con 120 μl de la solución en la que se encuentran las proteínas y 1 μl de muestra de proteína. El cálculo de moles se realiza mediante la fórmula de Beer-Lambert utilizando el coeficiente de extinción molar de TSR123 (19500 M-1.cm-1) y la masa molecular de la proteína (5740 Da). 60kDa. MBP+TSR123 40kDa. MBP 20kDa.TSR123 F F F F E E E Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 21 Figura 7. Picos UV co-elución POFUT2 y TSR123. 1.6. Filtración en gel. Para la filtración en gel necesitábamos co-eluir la proteína POFUT2 con la TSR123 en una proporción molar 1:5. Para ello disponíamos de una muestra de 5,6mg de POFUT2 (PM = 45000 Da) y 11,78 de nuestra muestra de TSR123 (PM = 20000 Da). Calculamos los moles de cada proteína: n (POFUT2): 5,6/45000 = 0,12 mmol n (TSR123): 11,78/20000 = 0,6 mmol Con estos datos comprobamos que teníamos una proporción molar POFUT2/TSR123 de 1:5 que era exactamente la misma a la que queríamos co-eluir las proteínas en la filtración en gel. Tras la filtración en gel el software UNICORN nos dio un patrón de tres picos de UV (Figura 7): -El primero correspondía a oligómeros formados de TSR123 (O). -El segundo correspondía al complejo POFUT2-TSR123 (C). -El tercero correspondía a monómeros de TSR123 (M). Se recogieron las tres fracciones de la filtración y se analizaron por electroforesis en gel de acrilamida al 15%. En este gel también se analizó la muestra de eluído (E) obtenida de la columna de maltosa-GST (Figura 8). En las muestras de oligómeros de TSR123 también aparecen restos de la POFUT2. Oligómeros TSR123 POFUT2 y TSR123 Monómeros TSR123 Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 22 Figura 8. Gel acrilamida tras co-elución de POFUT2 y TSR123. Figura 9. Placa de gota colgante para POFUT2 y TSR123 La muestra de POFUT2 más TSR123 se concentró hasta 1 ml de volumen realizando un cambio de solución a Tris 25mM sin NaCl con el objetivo de utilizarla para cristalización. La muestra de monómeros de TSR123 también se concentró (1 ml) y cambió de solución para su posterior uso en otros experimentos. 1.7. Cristalización El último paso del estudio sobre la TSR123 trataba de intentar cristalizar la proteína unida a la POFUT2 en el complejo co-eluído mediante la filtración en gel. Una de las técnicas utilizadas para la cristalización fue la de hanging-drop o gota colgante en una placa de 24 pocillos. En la preparación del líquido madre incluimos variaciones del precipitante (PEG3350 y PEG5000) y de una sal de tiocianato de sodio (KSCN) que proporcionaba unas condiciones en las que se habían observado buenos resultados de cristalización. Basándonos en este esquema, las composiciones del líquido madre variaron en la concentración de PEG según las filas A-D: A (100 μl), B (150 μl), C (200 μl) y D (250 μl). En las columnas 1-3 se utilizó PEG3350 y en 4-6 PEG5000. O C C C M E 45 kDa. POFUT2 20 kDa. TSR123 C Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 23 Las composiciones de líquido madre variaron en concentración de KSCN según las columnas 1-3 y 4-6: 1,4 (50 μl), 2,5 (100 μl), 3,6 (150 μl). Todos los pocillos se rellenaron con agua MQ hasta un volumen final de 500 μl. De este líquido se tomó una gota de 1 μl que se mezcló con 1 μl de nuestra muestra de POFUT2-TSR123 a una concentración de 5mg/ml (medido por método de Bradford) para formar la gota colgante sobre cada uno de los pocillos de la placa. Nota: en este punto se miden de nuevo las muestras por método de Bradford ya que al tener una muestra de varias proteínas o un complejo proteico no es útil el método de cuantificación a 280nm al no conocer la proporción exacta en la que se encuentran las dos proteínas. 1.8. Segundo proceso de cultivo y purificación de TSR123. El segundo proceso de cultivo y purificación de la proteína TSR123 siguió los mismos pasos que el primero, con intención de purificar más cantidad de proteína y volver a coeluirla con POFUT2 para repetir las pruebas de cristalización. Se prepararon 6 litros de cultivo de proteína obteniendo un volumen de “pellet” de 30 ml que, tras el proceso de rotura celular, se purificaron mediante columna de níquel. En este punto ocurrió un problema con los gradientes de solución A  solución B que nos obligó a repetir el proceso perdiendo parte de proteína. Tras la purificación realizamos un desalting de la muestra eluída de la columna de níquel y obtuvimos un volumen final de 25 ml. La cuantificación mediante el método de Bradford nos dio una medida de absorbancia de 0,4. 0.4/0.086 = 4,65 mg/ml en 25 ml  4,65x25 = 116 mg proteína A esta muestra le añadimos 1,16 mg de proteasa de precisión para obtener la proporción 1:100 y se dejó cortando todo un fin de semana a 4ºC. El análisis de las muestras cortadas y sin cortar se realizó por electroforesis en gel de acrilamida al 15%. En la segunda columna de níquel ocurrió otro problema debido a que se tomó la fracción eluída en lugar de la fracción flujo a través de la columna (recordamos que en este paso la proteína se encuentra en esta fracción) por lo que al desechar esta fracción se desechó prácticamente toda la muestra de proteína. La comprobación de este error se dio tras la purificación mediante columna de maltosaGST en la no apareció banda de proteína en ninguna de las bandas de electroforesis, por lo que tuvimos que interrumpir el proceso en este punto al no disponer de muestra de proteína con la que trabajar. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 24 2. TSR1 2.1.Preparación de cultivos y crecimiento celular Se prepararon 4 litros de cultivo de TSR1 con sus correspondientes precultivos. Las mediciones de la absorbancia durante la incubación a 160rpm y 37ºC fueron las siguientes. A las 4 horas la medida de absorbancia (0,58) era óptima para inducir los cultivos con IPTG. Tras la lisis celular los 15ml de “pellet” se congelaron para utilizarlos más adelante. Se tomaron alícuotas de los precultivos de TSR1 para conservarlas en glicerol a -80ºC. 2.2. Purificación en columna de maltosa. En el caso de la proteína TSR1 el protocolo no incluye la purificación con columna de níquel ya que la construcción del gen no tenía colas de histidinas, por lo que el primer paso de purificación de los 15ml de “pellet” descongelado fue la columna de maltosa. Las muestras fueron filtradas previamente con un filtro no-estéril de 0,45 μm. En la purificación con columna de maltosa no necesitamos utilizar el sistema AKTApurifier ya que no es necesario realizar un gradiente de concentraciones de diferentes soluciones tampón (columna de níquel) ni esta columna es tan sensible como para necesitar un control estricto de flujo/presión como la columna de GST, por lo que acoplamos la columna a un sistema de bomba para su utilización. La columna fue lavada con 10 volúmenes de agua MQ y equilibrada con 5 volúmenes de solución Tris 25mM, NaCl 150mM, pH 7,5. En este caso, la fracción de nuestra proteína se encuentra unida a la MBP, por lo que la fracción que queremos obtener es la eluída, que será la que se habrá quedado unida a la columna. Al pasar los 15 ml de muestra de proteína obtenemos la fracción flujo a través de la columna, después comenzamos a pasar la solución de equilibrado y comprobamos mediante reactivo de Bradford la muestra que va saliendo hasta que la reacción no de color azul (indica que ya no hay presencia de proteínas), el volumen obtenido fue de aproximadamente 80 ml y corresponde a la fracción lavado. La muestra de lavado se conservó para su análisis por electroforesis. Para eluir la proteína utilizamos una solución Tris 25mM, NaCl 150mM, maltosa 10mM, pH 7,5. La fracción eluída también fue comprobada con reactivo de Bradford para asegurarnos que no quedaba proteína unida a la columna. El volumen final de eluído fue de 25 ml. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 25 Figura 10. Gel acrilamida tras columna de maltosa TSR1. Figura 11. Picos UV filtración en gel de TSR1. Mediante el método de Bradford cuantificamos la muestra eluída, dándonos un valor de absorbancia de 0,12. 0,12/0,086 = 1,39 mg/ml en 25 ml  1,39x25 = 34,64 mg de proteína. A esta muestra se añadió PP en una proporción 1:10 para producir el corte de la proteína de unión a maltosa. El análisis de varias muestras de lavado (L) y eluído (E) se realizó mediante electroforesis en gel de acrilamida del 10% (Figura 10). 2.3. Filtración en gel Los 25 ml de muestra de eluído de la proteína TSR1 se concentraron hasta un volumen de unos 2 ml y se inyectaron al sistema AKTA para realizar una filtración en gel. En este caso el objetivo no era co-eluir la proteína con POFUT2 sino simplemente utilizar la columna de filtración como medio de purificación. Durante el proceso observamos cuatro picos de UV: uno correspondiente a la MBP y otro correspondiente a la TSR1 y dos correspondientes a las fracciones con el resto de proteínas de la muestra (Figura 11). E L 40kDa. MBP+TSR1 TSR1 MBP E L L L Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 32 ANEXO I. Características de las proteínas. POFUT2 Secuencia: EKKFLLYDVNFGEGFNLRRDVYMRVANTVRSLRDSGENYILVLPPWGRLHHW KRMEVALSWRLFFDLESLNRFIPVIEFEDFLDENRPIDQVIYLQHYAEGWGTEY VRKFEKRSCLPPAESHYKQVEEFKWKGWFYSYEDVYSRNFQCVSIQGDSGTLK DLLKHSNFSESTSIMVDRAETILHEHYGEVDYWKARRSMRYSNDLVDVADAFR KKYLDSDDKRDKTKLVDDWTKEKPRRTAIGGPYLGIHWRRRDFLYAKKAQLP TIPGTAKILQDLCKKLDLQKIYLATDAPDQEVDELKALLNGELEVYRFTDTQKL NDGQIAIIDQYLCAHAAYFIGSYESTFTFRIQEDREIIGFPISTTFNRLCPDTEPTCE QPAKWKIVY PI/Mw: 6.07 / 45604.70 Coeficiente de extinción molar (ε): 88155 M-1cm-1 TSR123 Secuencia: GPGSADDGWSPWSEWTSCSTSCGNGIQQRGRSCDSLNNRCEGSSVQTRTCHIQ ECDKRFKQDGGWSHWSPWSSCSVTCGDGVITRIRLCNSPSPQMNGKPCEGEAR ETKACKKDACPINGGWGPWSPWDICSVTCGGGVQKRSRLCNNPTPQFGGKDC VGDVTENQICNKQDCPIDG PI/Mw: 6.82 / 19126.12 Coeficiente de extinción molar (ε): 49500 M-1cm-1 TSR1 Secuencia: GPGSADDGWSPWSEWTSCSTSCGNGIQQRGRSCDSLNNRCEGSSVQTRTCHIQ ECD Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 33 PI/Mw: 4.65 / 6038.40 Coeficiente de extinción molar (ε): 16500 M-1cm-1 TSR12 Secuencia: GPGSADDGWSPWSEWTSCSTSCGNGIQQRGRSCDSLNNRCEGSSVQTRTCHIQ ECDKRFKQDGGWSHWSPWSSCSVTCGDGVITRIRLCNSPSPQMNGKPCEGEAR ETKACKKDACPI PI/Mw: 7.61 / 12847.16 Coeficiente de extinción molar (ε): 33000 M-1cm-1 TSR23 Secuencia: KRFKQDGGWSHWSPWSSCSVTCGDGVITRIRLCNSPSPQMNGKPCEGEARETK ACKKDACPINGGWGPWSPWDICSVTCGGGVQKRSRLCNNPTPQFGGKDCVGD VTENQICNKQDCPIDG PI/Mw: 8.29 / 13105.74 Coeficiente de extinción molar (ε): 33000 M-1cm-1 Nota: todos los puntos isoeléctricos, pesos moleculares y coeficientes de extensión molar de las proteínas se han obtenido a partir de sus respectivas secuencias mediante la herramienta ProtParam de EXPASY®. Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa Murciano Trigo, Daniel 34 ANEXO II. Relación de abreviaturas. APS: Persulfato amónico. BSA: Bovine Serum Albumin. EGF: Epidermal Growth Factor-Like. GDP: Guanosina Difosfato. GST: Glutation-S-Transferase. IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido. LB: Lysogeny Broth. MBP: Maltose Binding Protein. MQ: MiliQ. Mw: Molecular Weight. PEG: Polietilen Glicol. PI: Punto Isoeléctrico. PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride. POFUT: Protein O-Fucosyltransferase. PP: Precission Protease. TEMED: N,N,N',N'--‐tetrametiletilenodiamina. TGF-β: Transforming Growth Factor type β. TSP: Thrombospondin. Tris: Tris(hidroximetil)aminometano. TSR: Thrombospondin Repeats type I. SDS: Dodecilsulfato de sodio. SOC: Super Optimal broth with Catabolite repression.