Repositorio Institucional de Documentos

Efecto fenotípico de variantes polimórficas del mtDNA Trabajo Fin de Grado Biotecnología Autora Isabel Franco Castillo Directores Raquel Moreno Loshuertos Patricio Fernández Silva Grupo GENOXPHOS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias 2014 ÍNDICE 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2 2.1. La mitocondria y el DNA mitocondrial 2 2.2. El sistema de fosforilación oxidativa 3 2.3. Variabilidad poblacional del mtDNA 4 2.4. Ratón complástico 6 2.5. Especies reactivas de oxígeno (ROS) 7 3. PRESENTACIÓN Y OBJETIVOS 8 4. MATERIALES Y MÉTODOS 9 4.1. Medidas de la actividad enzimática 9 4.2. Manipulación y análisis de proteínas 10 4.2.1. Electroforesis de proteínas 11 4.2.1.1. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE 11 4.2.1.2. Electroforesis en geles nativos de poliacrilamida “Blue Native” 12 4.2.2. Transferencia de proteínas a membranas de PVDF 13 4.2.3. Inmunodetección de proteínas mediante Western Blot 13 4.3. Manipulación y análisis de DNA 14 4.3.1. Extracción y cuantificación 14 4.3.2. Cuantificación del número de copias de mtDNA 14 4.4. Cultivo celular 15 4.4.1. Líneas celulares 15 4.4.2. Cultivo y siembra celular 15 4.5. Medidas de respiración endógena y desacoplada en fibroblastos inmortalizados 15 4.5.1. Electrodo de oxígeno 15 4.5.2. Medida de respiración endógena y desacoplada 16 4.6. Análisis estadístico 16 5. RESULTADOS 17 5.1. Evaluación de la actividad OXPHOS en homogenados de tejidos de ratones complásticos 17 5.2. Inmunodetección de proteínas mediante Western blot 18 5.3. Evaluación del ensamblaje de supercomplejos en geles nativos de PAA “Blue Native” 19 5.4. Cuantificación del número de copias de mtDNA por Real Time PCR 20 5.5. Evaluación de la actividad OXPHOS en fibroblastos inmortalizados 20 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 22 7. CONCLUSIONES 23 8. BIBLIOGRAFÍA 24 9. ANEXOS 26 1 1. RESUMEN La extensa variabilidad de secuencia del mtDNA humano se ha considerado durante años como el resultado de sustituciones neutras acumuladas a lo largo de la evolución a causa de la deriva genética. Las asociaciones de los haplotipos mitocondriales con diversos fenotipos entre los que se encuentran la motilidad espermática o la longevidad, han hecho cambiar esta idea. La influencia de las variantes polimórficas del mtDNA sobre la función OXPHOS ha sido demostrada en células transmitocondriales humanas y de ratón. Los ratones complásticos, portadores del mtDNA de una estirpe en el entorno nuclear de otra, constituyen una herramienta de estudio muy útil para trasladar los estudios de variabilidad genética mitocondrial a organismos completos. En este TFG se han evaluado distintos parámetros relacionados con la función mitocondrial en muestras procedentes de ratones NZB y su correspondiente línea complástica portadora del mtDNA de C57 (CN: NZBmtC57) que había sido generada previamente en el grupo GENOXPHOS con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos en líneas transmitocondriales. Los resultados obtenidos nos indican que el haplotipo del mtDNA modifica la función OXPHOS a pesar de que existe una respuesta compensatoria de aumento de la biogénesis mitocondrial mediada probablemente por ROS. 1. ABSTRACT The large variability of the human mtDNA sequence has been considered for years the result of neutral substitutions accumulated during evolution due to genetic drift. The associations of mitochondrial haplotypes with diverse phenotypes such as sperm motility or longevity, among others, have changed this concept. The influence of polymorphic variants of mtDNA on the OXPHOS function has been demonstrated in human and mouse transmitochondrial cells. Conplastic mice, which have the nuclear genome of one strain and the mitochondrial genome for another, are useful tools to transfer the mitochondrial genetic variability studies to whole organisms. In this TFG different parameters related to mitochondrial function in samples from NZB mice and their corresponding conplasticline carrying C57 mtDNA (CN: NZBmtC57) have been evaluated. The conplastic line had been previously generated by GENOXPHOS group in order to confirm the results obtained in transmitochondrial cell lines. The results indicate that the mtDNA haplotype modifies the OXPHOS function even though there is a compensatory response, probably mediated by ROS, that increases mitochondrial biogenesis. 2 2. INTRODUCCIÓN 2.1. La mitocondria y el DNA mitocondrial Las mitocondrias son orgánulos subcelulares de dimensiones y distribución variable, que se encuentran presentes en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas. Se caracterizan por poseer su propio genoma (mtDNA) así como la maquinaria necesaria para la transcripción y traducción de la información genética que codifica dicho genoma. La mitocondria se compone de dos membranas, la externa, que la separa del citoplasma, y la interna, que define el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. La membrana externa permite el paso de moléculas pequeñas (hasta 10 kDa) mientras la membrana interna constituye una barrera más selectiva, siendo esta restricción de paso indispensable para el mantenimiento del gradiente de protones necesario para la síntesis de ATP. La membrana interna presenta una serie de pliegues denominados crestas que le proporcionan una gran superficie (figura 1). Las mitocondrias son orgánulos plásticos capaces de cambiar de forma en función del estado metabólico de la célula o del tejido en el que se encuentren. Además, son capaces de moverse por el citoplasma asociados a microtúbulos, de fusionarse y de dividirse, generando retículos en función del estado metabólico de la célula. Figura 1: Mitocondria. La imagen de la izquierda corresponde a una mitocondria observada por microscopio electrónico y la imagen de la derecha ilustra las diferentes partes de la mitocondria En la matriz mitocondrial se localizan las moléculas de mtDNA así como las proteínas necesarias para su replicación y transcripción, los ribosomas encargados de la traducción de las proteínas codificadas en dicho genoma, indispensables para la formación de la cadena de transporte electrónico mitocondrial, así como el resto de proteínas implicadas en los procesos metabólicos que tienen lugar en el interior de la mitocondria, entre los que destacan el ciclo de Krebs, la -oxidación de ácidos grasos, el ciclo de la urea o la biosíntesis de pirimidinas. La mayoría de las proteínas implicadas en procesos mitocondriales están codificadas en el DNA nuclear y deben ser importadas a las mitocondrias. Esto convierte a la biogénesis mitocondrial un caso único en la célula animal por estar bajo el control de dos sistemas genéticos distintos 1,2. El mtDNA, que constituye la característica más singular de las mitocondrias, es una molécula circular de doble cadena que se replica y transcribe en la matriz mitocondrial. En mamíferos, cada mitocondria contiene entre 2 y 10 copias de mtDNA y cada célula, 3 alrededor de 103 y 104 copias, dependiendo del tejido y de las necesidades energéticas de la célula. El mtDNA de mamíferos contiene información para 37 genes: 13 proteínas, constituyentes de la cadena de transporte electrónico, y 24 RNAs necesarios para su síntesis (2 RNAs ribosómicos y 22 tRNAs). Entre las características de este segundo genoma celular pueden destacarse las siguientes: el código genético mitocondrial difiere ligeramente del código genético universal, presenta una alta tasa de mutación (10 veces superior a la del DNA nuclear) debido a la exposición del mtDNA a las especies reactivas de oxígeno generadas en el interior de la mitocondria y a la ausencia de sistemas eficientes para su reparación, se transmite por herencia materna, no mendeliana, presenta una particular organización y expresión de sus genes puesto que no existen regiones intrónicas, y además, es posible la existencia de varias formas alélicas del mtDNA en un mismo individuo, pudiendo diferir su proporción relativa dependiendo del tejido. En una misma célula o tejido puede existir heteroplasmia (presencia de más de un tipo de mtDNA) u homoplasmia (presencia de mtDNAs idénticos). Pueden encontrarse distintos grados de heteroplasmia y es necesario alcanzar un determinado porcentaje de DNA mutado para que se manifiesten los efectos patológicos de la mutación. La investigación sobre las mitocondrias y el DNA mitocondrial ha experimentado un gran impulso en los últimos años debido a varios descubrimientos tales como: las enfermedades provocadas por mutaciones en el DNA mitocondrial 3, el posible rol de este genoma en el proceso de envejecimiento 4 y la carcinogénesis 5 así como la implicación de la mitocondria en el proceso de apoptosis 6, entre otros. 2.2. El sistema de fosforilación oxidativa El sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS), compuesto por la cadena de transporte electrónico mitocondrial y la ATP sintasa es el encargado de producir el 90% de la energía utilizada por la célula. El piruvato obtenido en la glucólisis, los ácidos grasos o los aminoácidos son importados a la matriz mitocondrial donde, tras una serie de reacciones de oxidación, se transforman en acetil-coenzima A. La oxidación de este grupo mediante las reacciones que constituyen el ciclo de Krebs, genera NADH y FADH2 que serán utilizados por la cadena de transporte electrónico como equivalentes de reducción. Los electrones de las moléculas de NADH y FADH2 son movilizados a través de los distintos complejos que forman la cadena respiratoria mitocondrial hasta llegar al complejo IV, donde son cedidos al oxígeno molecular, generando un gradiente de protones que es utilizado por la ATP sintasa o complejo V para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi. Los electrones procedentes del NADH pasan secuencialmente a través del complejo I, la ubiquinona, el complejo III y el citocromo c para llegar al complejo IV que, finalmente, se los cederá al oxígeno molecular generando H2O. De forma alternativa, los electrones del FADH2, producido por la succinato deshidrogenasa o complejo II o por otras enzimas como la glicerol-3-P deshidrogenasa, la ETF-ubiquinona oxidorreductasa (primera enzima de la -oxidación de los ácidos grasos) o la dihidroorotato deshidrogenasa (enzima implicada en la biosíntesis de pirimidinas), 4 pasan a la ubiquinona para que los transporte al complejo III y lleguen hasta la reducción del oxígeno molecular. En los complejos I, III y IV de la cadena de transporte electrónico, se produce un bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermembrana que genera un gradiente de pH o potencial de membrana que es aprovechado por la ATP sintasa o complejo V para impulsar la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi, completándose de este modo el proceso de fosforilación oxidativa. El ATP generado en este proceso, es utilizado en los distintos tejidos para mantener las necesidades energéticas celulares. Así, aquellos tejidos que tengan mayor requerimiento de ATP serán los más afectados en el caso de producirse fallos en su generación. Figura 2: Esquema del sistema de fosforilación oxidativa. En la imagen se observan los complejos de la cadena respiratoria y se señalan los puntos donde se produce bombeo de protones al espacio intermembrana. 2.3. Variabilidad poblacional del mtDNA Haplogrupos mitocondriales Desde que se conoció su secuencia completa en 1981, el mtDNA humano se ha utilizado como herramienta para el estudio de la evolución y la genética de poblaciones. Este hecho viene motivado por varias razones. La primera de ellas es la alta tasa de mutación que presenta el mtDNA, muy superior a la del DNA nuclear, otra es su herencia de tipo materno que permite reconstruir la historia evolutiva sin la complejidad que añade la recombinación biparental que se produce en el caso del DNA nuclear. Los linajes de mtDNA se han distribuido radialmente desde África hasta los distintos continentes durante la historia. En este tiempo, se han ido acumulando mutaciones en el mtDNA que aparecen con alta frecuencia en la población y se conocen 5 como secuencias polimórficas del mtDNA específicas de los distintos continentes. Estudios de fragmentos polimórficos de restricción (RFLP) del mtDNA de un amplio rango de poblaciones humanas han puesto de manifiesto la existencia de un número estable de polimorfismos en regiones codificantes del mtDNA llamados haplogrupos mitocondriales 7,8. La extensa variabilidad de secuencia que presenta el mtDNA humano se ha considerado como el resultado de sustituciones neutras que se han ido acumulando a lo largo de la historia de las mujeres en lugares geográficos discretos y a causa de la deriva genética. Sin embargo, varios trabajos han hecho cambiar esta forma de pensar puesto que se han encontrado asociaciones entre haplogrupos mitocondriales y diversos fenotipos como son la motilidad espermática9, la longevidad10,11, la penetrancia de enfermedades ligadas al mtDNA12 o la predisposición a una variedad de complejos fenotipos como la adaptación al frío o las enfermedades mitocondriales13. A pesar de que todos los genes codificados en el mtDNA están implicados en la biogénesis del sistema OXPHOS, los estudios llevados a cabo utilizando líneas celulares portadoras de distintos haplotipos de mtDNA humanos habían concluido que la capacidad respiratoria no se veía influenciada, de manera sustancial, por ninguna de las variantes ensayadas14. Trabajos más recientes han aportado evidencia de que variantes polimórficas de mtDNA influyen sobre la capacidad respiratoria de células en cultivo, aunque estas diferencias se ven enmascaradas por un aumento de la biogénesis mitocondrial mediada por ROS (Especies reactivas de oxigeno)15. También se ha relacionado la variabilidad genética mitocondrial con la cinética de ensamblaje de los complejos de la cadena de transporte electrónico16. Todas estas observaciones, reevaluadas utilizando una simulación estadística, nos llevan a concluir que los haplogrupos mitocondriales en humanos no siempre conllevan un fenotipo neutro. Variantes genéticas mitocondriales en ratón En el año 1981 se obtuvo la primera secuencia completa de un mtDNA de ratón. Desde su publicación fueron describiéndose nuevas secuencias que mostraban discrepancias que podían ser debidas tanto a polimorfismos existentes entre las distintas estirpes de ratón, como a mutaciones adquiridas tras 40 años de cultivo de la línea celular. Tras la revisión de la secuencia de la línea LA9 en el año 200317 y tras descartar algunos cambios que se debían a errores de la primera secuenciación, se llegó a la conclusión de que sólo las secuencias de NZB/B1NJ y MilP divergían mucho de la considerada hasta entonces como secuencia de referencia. A partir de ese momento, la secuencia de C57BL/6J pasó a considerarse la secuencia de referencia para el mtDNA de ratón. A excepción de las estirpes NZB/B1NJ y MilP las secuencias de los mtDNAs de los ratones consanguíneos utilizados en los laboratorios, son muy similares. Los mtDNAs de las estirpes Balb/cJ y CBA/J son idénticos entre sí18 y difieren de las líneas derivadas de C3H/He y NOD/LtJ en un único locus, en el gen del mt-Tr, posición 982117. Esta 6 diferencia se debe a la variación en la longitud de una región de repeticiones de nucleótidos de adenina en el bucle DHU del tRNAArg que parece ser una región muy polimórfica en el mtDNA de ratón19 y que es la responsable de que el número de pares de bases de este genoma varíe entre 16299 y 16301. Además de este locus, otras estirpes de ratón difieren del grupo anterior en tan sólo una (AKR/J y SKH2/J), dos (SAMR1 y C57BL/6J), cuatro (SAMP1) o cinco (SAMP8) posiciones más. Además no existen variaciones de secuencia en las regiones no codificantes del mtDNA. Al igual que en el caso de las variantes polimórficas humanas, se han encontrado asociaciones de los distintos haplotipos del mtDNA de ratón con diversos fenotipos. Así, se ha descrito que las variantes polimórficas del gen del mt-Tr parecen modular el fenotipo de sordera (Age related Hearing Loss, AHL) producido por mutaciones en el gen nuclear Cdh2319. Además, experimentos con embriones portadores de dos variantes de mtDNA (NZB/B1NJ y Balb/cJ) demostraron que algunos órganos (hígado y riñón) acumulaban sistemáticamente el mtDNA de NZB/B1NJ mientras otros como la sangre o el bazo preferían el de Balb/cJ y otras no acumulaban ninguno de ellos20. Este hecho parece indicar la existencia de genes nucleares específicos de tejidos importantes para la interacción entre los genomas nuclear y mitocondrial. Por último, ratones con diferente mtDNA (CBA o NZB) difieren sustancialmente en su capacidad de aprendizaje, en su desarrollo sensorial y en su anatomía cerebral debido, en gran medida, a su haplotipo mitocondrial21. Como en humanos, hasta el año 2006 tampoco se había podido demostrar la influencia de de los haplotipos del mtDNA de ratón sobre la respiración celular. Trabajos del grupo GENOXPHOS han demostrado que la eficiencia del sistema OXPHOS está modulada por haplotipos mitocondriales del tRNAArg, codificado en el gen mt-Tr. Las variantes polimórficas en este gen afectan al tamaño del bucle de dihidrouridina (DHU) en el tRNA maduro, produciendo bucles de entre 5 y 7 nucleótidos18. El análisis de una nueva variante de mt-Tr, identificada de ratones C3H, dio como resultado que es el tamaño del bucle DHU del tRNA, y no la secuencia, el responsable de las diferencias en la respiración celular. También se confirmó que la variante de siete nucleótidos induce una síntesis de proteínas deficiente, lo que conduce a un mal funcionamiento del sistema OXPHOS22. Sin embargo, esta deficiencia se ve enmascarada por ROS, que actúa como segundo mensajero, induciendo la biogénesis mitocondrial y compensando así la deficiencia. 2.4. Ratón complástico Los ratones complásticos constituyen una herramienta de estudio muy útil para trasladar los estudios de variabilidad genética mitocondrial a organismos completos23. Se pueden definir como ratones con un genoma nuclear procedente de una línea y un genoma mitocondrial procedente de otra línea distinta. Esto se consigue mediante un mínimo de 10 retrocruzamientos entre una hembra donadora del material genético mitocondrial y un macho que aporta el genoma nuclear. Hasta la fecha, se han publicado varios trabajos en los que se utilizan este tipo de ratones que han permitido demostrar que el mtDNA afecta a la capacidad de aprendizaje 7 y la función cognitiva21, modifica la susceptibilidad a padecer enfermedades como la esclerosis autoinmune experimental (EAE) o influye en conductas relacionadas con la ansiedad lo que se relaciona con observaciones hechas en humanos donde se asocian determinados haplogrupos con enfermedades como la esclerosis múltiple y conductas bipolares, respectivamente23. También se ha observado la influencia de determinadas variantes no patológicas en la capacidad reproductiva y en el desarrollo de enfermedades como las autoinmunes, la diabetes mellitus tipo 2, neurodegenerativas o la colitis ulcerosa. 2.5. Especies reactivas de oxígeno (ROS) Aunque la función más conocida de la mitocondria es la generación de ATP a través de la fosforilación oxidativa, el gradiente electroquímico generado mediante la transferencia de electrones de un complejo a otro de la cadena de transporte y el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, puede disiparse en forma de calor, a través de las proteínas UCP, o bien liberar electrones para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden actuar como segundos mensajeros intracelulares regulando la función celular y en especial la biogénesis mitocondrial o provocar efectos tóxicos en la célula dependiendo de su concentración24. En la actualidad existe evidencia de que los organismos vivos no sólo se han adaptado a la coexistencia con los radicales libres sino que han desarrollado mecanismos para usarlos de una manera ventajosa18. Entre las importantes funciones fisiológicas que implican a los radicales libres o sus derivados se encuentran la regulación del tono vascular, la regulación de funciones controladas por la concentración de oxígeno, la potenciación de la transducción de señales de receptores de membrana entre los que están los receptores de antígeno de los linfocitos y las respuestas frente al estrés oxidativo que aseguran el mantenimiento de la homeostasis redox24. Sin embargo, la implicación de los radicales libres en patología25 hace que se produzca un delicado balance entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de los mismos. Figura 3: Generación y consecuencias de ROS en la mitocondria. Las diferencias entre la producción de NADH y el uso de ATP pueden alterar la cadena de transporte de electrones (complejos I-IV) y modular la producción de ROS. De acuerdo con MorenoLoshuertos et al., el haplotipo de mtDNA también puede influir en la generación de ROS a niveles basales en la célula. Aunque las ROS han sido percibidas tradicionalmente como agentes tóxicos que contribuyen a la patología celular, hay evidencias que sugieren que también influyen en la homeostasis celular26 14 rábano, en PBS-T+0,01% leche en polvo). Tras lavar la membrana varias veces con PBS-T (2 lavados de 10 minutos y 4 más de 5 minutos) se procedió a la detección de las proteínas de interés mediante la reacción de la peroxidasa de rábano conjugada con el anticuerpo secundario usando el kit EZ-ECL de Biological Industries y siguiendo las recomendaciones del fabricante. Con el fin de eliminar los anticuerpos unidos a las proteínas fijadas en la membrana y hacer posible la reutilización de esta en otra inmunodetección, la membrana se sumergió en solución de stripping (2-mercaptoetanol 100 mM, SDS 2%, Tris-HCl 1 M pH=6.7) y se incubó a 58ºC durante 30 minutos. A continuación, la membrana se lavó con PBS-T (3x 10 minutos) y se guardó a 4ºC para su posterior uso. 4.3. Manipulación y análisis de DNA 4.3.1. Extracción y cuantificación Las muestras de DNA se extrajeron a partir de homogenados de tejidos utilizando el kit comercial “QIAamp® DNA Mini Kit”, de la casa comercial Qiagen. Una vez extraído el DNA, se estimó su concentración mediante el sistema NanoDrop, que es un espectrofotómetro capaz de cuantificar muestras micro-volumétricas. 4.3.2. Cuantificación del número de copias de mtDNA La cuantificación del número de copias de mtDNA por célula se lleva a cabo mediante PCR a tiempo real (Real Time PCR) y se compara con el contenido en nDNA. Para ello utilizamos un sistema capilar de Roche, modelo “LightCycler2.0” para el que se utilizó el kit “LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I” de Roche. En cada capilar se mezclan los siguientes compuestos: H2O 12.5 l Primer Mix (5 M cada uno) 0.5 l Master Mix 4 l DNA (3ng/ l) 3 l El primer mix contiene los oligos directos (forward) y reversos (reverse) a una concentración de 5 M cada uno. La secuencia de los oligos, cuya eficiencia había sido demostrada previamente en el grupo GENOXPHOS, se recoge en la tabla S6 del anexo 1. Los cálculos de la cantidad relativa del mtDNA se obtuvieron a partir de la diferencia entre los Ct mitocondrial y nuclear. El Ct (cycle threshold) se define como el ciclo a partir del cual la intensidad de emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo y es el punto donde se quiere adquirir los datos de amplificación. El Ct es inversamente proporcional al número de copias de DNA, es decir, a mayor cantidad de DNA, menor Ct. Nº Copias mtDNA/nDNA = 2(2 Ct) ΔCt= Ct nuclear-Ct mt 15 El programa de amplificación se detalla en la tabla S7 del anexo 1. Los valores de número de copias de mtDNA se representan como % de un control que se analizó en todas las PCRs para poder comparar los resultados de distintas reacciones. 4.4. Cultivo celular 4.4.1. Líneas celulares Las células con las que se ha trabajado son fibroblastos de ratón generados en el grupo mediante explante de piel de la oreja de ratones NZB y NZBmtC57 y posterior inmortalización por transfección con el plásmido lentiviral pLOX-Ttag-iresTK (Tronolab). Las células se crecieron en DMEM con alto contenido en glucosa (4.5 g/l) y piruvato (0.11 g/l) (GIBCO™) suplementado con un 5% de suero fetal bovino (SFB), como aporte de proteínas y factores de crecimiento y un 1% de una mezcla de antibióticos (AB), para prevenir contaminaciones por bacterias, compuesta por 10000 unidades/ml de penicilina G sódica y 10000 µg/ml de sulfato de estreptomicina, de Invitrogen. 4.4.2. Cultivo y siembra celular Para las medidas de respiración, las células se sembraron en placas de cultivo con una densidad de 10000-100000 cél/ml de medio de cultivo, en placas petri de 150 mm de diámetro, a las que se añadió un volumen aproximado de 0.2 ml de medio de cultivo/cm2 de superficie de la placa. Los cultivos se mantuvieron durante su crecimiento en estufa a 37ºC en atmósfera húmeda y con 5% de CO2 cambiando el medio de forma periódica (cada dos o tres días). Cuando las células alcanzaron la confluencia deseada se eliminó el medio por succión y las células se lavaron con PBS (GIBCO™) para eliminar las proteínas del suero que inhiben el efecto de la tripsina. Una vez eliminado el PBS se añadió 1 ml de tripsina de origen pancreático (0.033 ml/cm2 de una mezcla 0.05% tripsina (SIGMA) y 0.02% EDTA preparada en PBS y esterilizada por filtración) y se incubó durante 2-3 minutos a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se comprobó que las células se habían despegado de la placa, observándolas a través de un microscopio invertido. La acción de la tripsina se inhibió mediante adición de PBS suplementado con un 10% de SFB y las células, ya en suspensión, se trasvasaron a un tubo falcon de 15 ml y se centrifugaron 5 minutos a 1300-1500 rpm, lo que permitió su sedimentación. 4.5. Medidas de respiración endógena y desacoplada en fibroblastos inmortalizados 4.5.1. Electrodo de oxígeno El consumo de oxígeno se midió en un electrodo tipo Clark termostatizado (Oxytherm, Hansatech Instruments) que permite mantener la temperatura a 37ºC, que es 16 la adecuada para que la reacción sea favorable. Los datos obtenidos se registraron en un PC con el programa Oxygraph Plus V1.00 de Hansatech Instruments. Antes de empezar cada sesión se fijó la temperatura del Oxytherm a 37ºC y se calibró el aparato estableciendo el cero mediante adición de un agente oxidante como el ditionito de sodio. La adición de sustratos e inhibidores de la cadena de transporte electrónico se realizó usando jeringas Hamilton de 10 o 25 µl. 4.5.2. Medida de respiración endógena y desacoplada 1. Preparación de reactivos: El dinitrofenol (DNP) usado como desacoplante se preparó a una concentración de 6.5 mM. Para preparar 10 ml, se pesaron 12 mg de DNP (184.1 g/mol) y se disolvieron en 4 ml de NaOH 1M. La mezcla se calentó durante 20 minutos a 50ºC y se ajustó su pH a 7.0 añadiendo HCl 1M (aprox. 3 ml). El volumen final se ajustó a 10 ml con H2O, se alicuotó y se congeló a -20ºC. El KCN usado como inhibidor se preparó a una concentración de 400 mM en agua. 2. Procedimiento experimental: Para las medidas de respiración endógena, las células se recogieron por tripsinización de una placa de cultivo de 150 mm de diámetro, se contaron utilizando una cámara de Neubauer y 5x106 células se separaron para cada medida. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo completo (5x106 cél/ml) y se introdujeron en la cámara del electrodo para registrar su tasa de respiración endógena, es decir, cuando la respiración está acoplada a la síntesis de ATP. Transcurridos 2-3 minutos, se añadieron 10 l de una solución de DNP 6.5 mM, para desacoplar la cadena respiratoria y detectar la máxima capacidad OXPHOS de las células. Transcurridos otros 2-3 minutos, se añadieron 10 l de KCN 400 mM para inhibir el consumo de oxígeno asociado a la cadena de transporte electrónico. Un ejemplo de gráfica obtenida se recoge en la figura S1 en el anexo 1. 4.6. Análisis estadístico Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Para encontrar diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05) se utilizó el Posthoc Fisher’s PLSD test. Todos los cálculos fueron realizados con el programa estadístico StatView 5.0. 17 5. RESULTADOS 5.1. Evaluación de la actividad OXPHOS en homogenados de tejidos de ratones complásticos Con el fin de evaluar las diferencias en la función OXPHOS inducidas por variantes polimórficas del mtDNA, se determinó la actividad enzimática de la Citocromo c oxidasa (COX) en muestras de homogenados de cerebro e hígado de ratones complásticos en presencia y ausencia del antioxidante N-acetil cisteína (NAC). La Citocromo c oxidasa o complejo IV es el último de los complejos de la cadena de transporte electrónico y su función es la de catalizar la oxidación del citocromo c con la consiguiente reducción del oxígeno molecular para dar H2O por lo que es un buen indicador de la eficiencia de la respiración mitocondrial. Los datos de actividad COX obtenidos se normalizaron frente a la actividad CS, que es una enzima del ciclo de Krebs que nos indica la masa mitocondrial. Como se observa en la figura 4, el haplotipo del mtDNA influye en la actividad COX en homogenados de hígado pero no se observan diferencias estadísticamente significativas en muestras de homogenados de cerebro de ratones no tratados. El tratamiento con NAC pone de manifiesto diferencias en actividad entre las distintas líneas de ratón en muestras de cerebro. En el caso del hígado, el tratamiento induce un aumento en la actividad COX/CS de los ratones complásticos que los iguala a la de la línea parental que no se ve afectada por el tratamiento. Figura 4: Determinación de la actividad COX/CS en homogenados de cerebro (izquierda) e hígado (derecha) en ratones portadores del mtDNA de C57 (CN) y NZB. La actividad se determinó en muestras de ratones tratados con NAC (gris) y en situación control (negro). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Los valores de n y de p se recogen en el anexo 2. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) y su color ilustra los grupos que se comparan. 18 5.2. Inmunodetección de proteínas mediante Western blot Para determinar si las diferencias en función OXPHOS se debían a diferencias en los niveles de expresión de proteínas de los distintos complejos respiratorios, analizamos el contenido de dichas proteínas mediante SDS-PAGE seguida de WB utilizando anticuerpos específicos de proteínas de los distintos complejos respiratorios normalizados por el valor de actina que utilizamos como control de carga (figura 5). La cuantificación de las proteínas se realizó con el programa Quantity One de BioRad. Los datos se representan normalizados por el valor de intensidad de actina y el valor de una muestra que se cargó en todos los geles (N1). Una vez obtenidos estos datos se analizaron estadísticamente con el programa StatView como se representan en la figura 6. Las gráficas obtenidas representan la cantidad de proteínas de los diferentes complejos en las líneas CN y NZB en muestras obtenidas de ratones control y tratados con NAC. En este caso hay diferencias estadísticamente significativas para:  Proteína SDHA del complejo II: - Diferencias entre las muestras control CN y NZB - Diferencias entre las muestras CN control y tratadas con NAC  Proteína Co I del complejo IV: - Diferencias entre las muestras control CN y NZB - Diferencias entre las muestras CN control y tratadas con NAC Este experimento fue realizado en su totalidad con muestras de cerebro. Figura 5: Cuantificación de niveles relativos de proteínas del sistema OXPHOS mediante electroforesis desnaturalizante y western blot. La imagen de la izquierda corresponde a las muestras tratadas con NAC (numeración par) y la imagen de la derecha a las muestras control (números impares). En ambos casos se ha incluido una muestra control (N1) para normalizar los datos por ese valor. 19 5.3. Evaluación del ensamblaje de supercomplejos en geles nativos de PAA “Blue Native” Para determinar si las variantes polimórficas de mtDNA influyen en la capacidad de ensamblaje de supercomplejos respiratorios, llevamos a cabo experimentos de actividad enzimática del complejo I (CI) en geles nativos, utilizando muestras de mitocondrias aisladas de cerebro e hígado de los cuatro grupos de estudio permeabilizadas con digitonina. En el gel se puede observar que no existen diferencias en los patrones electroforéticos entre las distintas muestras, aunque sí parece que la presencia de NAC en cerebro afecta a la cantidad de supercomplejos ensamblados. Figura 7: Estudio del ensamblaje de complejos respiratorios mediante “Blue Native” seguida de actividad en gel del complejo I. Figura 6: Determinación de la cantidad de proteína/actina en homogenados de cerebro, para los complejos I, II, III y IV de la cadena respiratoria, en ratones portadores del mtDNA de C57 (CN) y NZB. Los niveles de proteínas de los complejos respiratorios se determinaron en muestras de cerebro de ratones tratados con NAC (gris) y en situación control (negro). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Los valores de n y de p se recogen en el anexo 2. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) y su color ilustra los grupos que se comparan. 20 5.4. Cuantificación del número de copias de mtDNA por Real Time PCR Con el fin de determinar si los haplotipos mitocondriales influyen en la biogénesis mitocondrial, evaluamos el número de copias de mtDNA en muestras de cerebro e hígado mediante PCR cuantitativa. Como se observa en la figura 8, el haplotipo del mtDNA influye en el número de copias de mtDNA en homogenados de hígado control, pero no ocurre lo mismo con las muestras de cerebro, que no presentan diferencias estadísticamente significativas. En cerebro, el tratamiento con NAC pone de manifiesto diferencias en la cantidad de mtDNA, en la línea parental NZB, que sufre una disminución del contenido en mtDNA cuando es tratada con el antioxidante. En el caso del hígado, el tratamiento con NAC también induce una disminución del número de copias de mtDNA, en este caso para ambas líneas. En resumen, ambas líneas (CN y NZB), tanto de cerebro como de hígado, ven reducido su número de copias de mtDNA al ser tratadas con un antioxidante. 5.5. Evaluación de la actividad OXPHOS en fibroblastos inmortalizados Estudios previos del grupo GENOXPHOS determinaron que existe diferencia en la actividad OXPHOS debidas a haplotipos mitocondriales en células de ratón en cultivo18,22. Con el fin de confirmar estos datos sin los problemas de aneuploidía que presentan las líneas celulares inmortalizadas tras años de cultivo, se llevó a cabo el establecimiento de fibroblastos primarios a partir de células epiteliales de las líneas de ratón NZB y CN y su posterior inmortalización. Para evaluar la actividad OXPHOS de estas líneas medimos la respiración endógena y desacoplada en células intactas, utilizando un electrodo de oxígeno tipo Clark. Como se observa en la gráfica (figura 9) en estas líneas celulares menos adaptadas al cultivo que las utilizadas en los estudios previos, observamos diferencias estadísticamente significativas tanto en la respiración endógena como en la desacoplada. Figura 8: Evaluación de la biogénesis mitocondrial en ratones portadores de distintas variantes de mtDNA. Determinación del número de copias de mtDNA en homogenados de cerebro (izquierda) e hígado (derecha) en ratones portadores del mtDNA de C57 (CN) y NZB, tratados con NAC (gris) y en situación control (negro), mediante PCR cuantitativa, Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Los valores de n y de p se recogen en el anexo 2. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) y su color ilustra los grupos que se comparan. 21 Así, la cadena respiratoria de la línea complástica que es portadora del mtDNA de C57, parece presentar una mayor eficiencia en el consumo de oxígeno. Figura 9: Medidas de la respiración endógena y desacoplada en fibroblastos inmortalizados. Se puede observar que la línea complástica CN presenta valores mayores de respiración, tanto endógena como desacoplada. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Los valores de n y de p se recogen en el anexo 2. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05) y su color ilustra los grupos que se comparan. 22 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS El objetivo principal de este trabajo consistía en evaluar las posibles diferencias fenotípicas inducidas por las variantes polimórficas del mtDNA. Los experimentos llevados a cabo confirman que la sustitución del mtDNA en un mismo fondo genético es suficiente para inducir diferencias medibles en la función mitocondrial. Estos efectos son moderados y no patológicos, pero son capaces de afectar el comportamiento celular y el metabolismo general del organismo. La combinación genética utilizada en este trabajo, mtDNA de C57 en el fondo nuclear de NZB, genera diversos efectos, como son: una disminución en la actividad de la enzima COX y en la biogénesis mitocondrial en hígado, un aumento en la síntesis de los complejos II y IV de la cadena respiratoria en cerebro y un aumento de la respiración, tanto endógena como desacoplada, en fibroblastos primarios de ratón. Trabajos previos del grupo habían demostrado que estas diferencias fenotípicas van acompañadas por una producción ligeramente superior de ROS, que alteran la célula activando la biogénesis mitocondrial, como un mecanismo de compensación. Los niveles basales de ROS continuamente elevados no promueven el daño oxidativo, sino que constituyen una forma de combatirlo, activando los genes implicados en la biogénesis mitocondrial. Este efecto compensatorio se puede eliminar al tratar los ratones con un antioxidante (NAC), que nos permite observar el comportamiento de la célula en ausencia de dicha compensación. En muestras de homogenado de cerebro, la actividad COX no presenta diferencias significativas entre ambas líneas de ratón. Sin embargo, al evaluar el número de copias de mtDNA, observamos que la línea parental, NZB, presenta un incremento en los niveles de mtDNA lo que confirmaría que posee un sistema OXPHOS menos eficiente pues se necesitan más mitocondrias para alcanzar la misma actividad. Si reducimos el número de copias de mtDNA mediante tratamiento con NAC, ya se observan diferencias estadísticamente significativas entre ratones portadores de ambas variantes. En el caso de muestras de hígado, el comportamiento es diferente pero, al igual que en cerebro, la actividad COX correlaciona con el número de copias de mtDNA. 23 7. CONCLUSIONES Una vez analizados los resultados obtenidos en los distintos experimentos realizados se puede concluir que: 1. El haplotipo de mtDNA influye en el fenotipo OXPHOS de los ratones. 2. Las variantes polimórficas del mtDNA inducen cambios en la biogénesis mitocondrial en hígado y cerebro de ratón. 3. El haplotipo de mtDNA no parece afectar de modo notable al ensamblaje de supercomplejos en las variantes y tejidos analizados. 4. El antioxidante NAC desenmascara el efecto compensatorio de las ROS poniendo en evidencia la actividad real del sistema OXPHOS. Al tratar con NAC y disminuir ROS se elimina el efecto biogénico sobre las mitocondrias. 5. La línea de fibroblastos inmortalizados portadora del mtDNA de C57 presenta mayor tasa de respiración endógena y desacoplada que su línea parental correspondiente (NZB). 7. CONCLUSIONS Once the results obtained in the diverse experiments have been analyzed, it can be concluded that: 1. mtDNA haplotypes influence the OXPHOS phenotype in mice. 2. mtDNA polymorphic variants induce changes in mitochondrial biogenesis in mouse brain and liver. 3. The mtDNA haplotype doesn’t seem to affect the assembly of supercomplex in the analyzed variants and tissues. 4. NAC antioxidant unmasks the compensatory effect of ROS highlighting the actual activity of the OXPHOS system. Treating with NAC and decreasing ROS eliminates the biogenic effect on mitochondria. 5. Immortalized fibroblasts carrying the C57 mtDNA present higher rate of endogenous and uncoupled respiration than their corresponding parental cells (NZB). 30 -5,382 14,124 ,4457 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, CN 6,933 12,775 ,2793 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB -14,839 11,111 ,0115 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, CN -1,204 11,250 ,8252 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB -5,382 14,124 ,4457 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, CN 6,933 12,775 ,2793 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB -14,839 11,111 ,0115 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, CN -1,204 11,250 ,8252 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for COX/CS normalizado Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB Hígado CN Hígado NZB B. Estadística del análisis de proteínas OXPHOS por Western Blot (Figura 6) B.1) Valores de n, medias y desviaciones estándar Ndufb6 vs actina Core 2 vs actina SDHA vs actina Co1 vs actina B.2) Análisis estadístico t de Student B.2.1. Efecto del haplotipo mitocondrial sobre los niveles de proteínas OXPHOS Ndufb6 control Ndufb6 NAC 4 122,810 12,800 6,400 4 84,385 22,013 11,007 6 97,168 10,039 4,098 4 89,975 20,004 10,002 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Co1/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 114,565 16,701 8,351 4 76,500 20,622 10,311 6 93,812 8,858 3,616 4 86,968 19,118 9,559 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for SDHA/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 76,513 24,151 12,075 4 94,635 19,018 9,509 6 92,122 13,451 5,491 4 89,067 19,124 9,562 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Core2/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 86,722 10,947 5,473 4 86,655 23,877 11,939 6 119,893 31,762 12,967 4 80,898 30,969 15,484 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for NDUFB6/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 122,810 12,800 6,400 4 84,385 22,013 11,007 6 97,168 10,039 4,098 4 89,975 20,004 10,002 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Co1/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 114,565 16,701 8,351 4 76,500 20,622 10,311 6 93,812 8,858 3,616 4 86,968 19,118 9,559 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for SDHA/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 76,513 24,151 12,075 4 94,635 19,018 9,509 6 92,122 13,451 5,491 4 89,067 19,124 9,562 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Core2/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 86,722 10,947 5,473 4 86,655 23,877 11,939 6 119,893 31,762 12,967 4 80,898 30,969 15,484 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for NDUFB6/actina Effect: Línea * Tratamiento -15,609 27,114 ,2210 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,568 32,997 ,6941 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -33,171 38,686 ,0834 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,757 47,843 ,7783 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -15,609 27,114 ,2210 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,568 32,997 ,6941 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -33,171 38,686 ,0834 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,757 47,843 ,7783 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 4 122,810 12,800 6,400 4 84,385 22,013 11,007 6 97,168 10,039 4,098 4 89,975 20,004 10,002 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Co1/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 114,565 16,701 8,351 4 76,500 20,622 10,311 6 93,812 8,858 3,616 4 86,968 19,118 9,559 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for SDHA/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 76,513 24,151 12,075 4 94,635 19,018 9,509 6 92,122 13,451 5,491 4 89,067 19,124 9,562 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Core2/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 86,722 10,947 5,473 4 86,655 23,877 11,939 6 119,893 31,762 12,967 4 80,898 30,969 15,484 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for NDUFB6/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 122,810 12,800 6,400 4 84,385 22,013 11,007 6 97,168 10,039 4,098 4 89,975 20,004 10,002 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Co1/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 114,565 16,701 8,351 4 76,500 20,622 10,311 6 93,812 8,858 3,616 4 86,968 19,118 9,559 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for SDHA/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 76,513 24,151 12,075 4 94,635 19,018 9,509 6 92,122 13,451 5,491 4 89,067 19,124 9,562 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for Core2/actina Effect: Línea * Tratamiento 4 86,722 10,947 5,473 4 86,655 23,877 11,939 6 119,893 31,762 12,967 4 80,898 30,969 15,484 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN, control CN, NAC NZB, control NZB, NAC Means Table for NDUFB6/actina Effect: Línea * Tratamiento 31 Core 2 control Core 2 NAC SDHA control SDHA NAC Co1 control Co1 NAC B.2.2. Efecto del NAC sobre los niveles de proteínas OXPHOS Ndufb6 CN Ndufb6 NZB Core 2 CN Core 2 NZB -15,609 27,114 ,2210 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,568 32,997 ,6941 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -33,171 38,686 ,0834 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,757 47,843 ,7783 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -15,609 27,114 ,2210 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,568 32,997 ,6941 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -33,171 38,686 ,0834 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control 5,757 47,843 ,7783 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 25,642 16,604 ,0074 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -5,590 36,391 ,7199 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 20,753 18,450 ,0319 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -10,468 34,404 ,4847 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 25,642 16,604 ,0074 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -5,590 36,391 ,7199 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 20,753 18,450 ,0319 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -10,468 34,404 ,4847 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 25,642 16,604 ,0074 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -5,590 36,391 ,7199 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 20,753 18,450 ,0319 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -10,468 34,404 ,4847 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 25,642 16,604 ,0074 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -5,590 36,391 ,7199 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC 20,753 18,450 ,0319 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: control -10,468 34,404 ,4847 Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN, NZB Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tratamiento Cell: NAC -18,123 37,609 ,2830 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 3,054 23,546 ,7725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB ,067 32,137 ,9961 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 38,996 46,839 ,0911 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB -18,123 37,609 ,2830 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 3,054 23,546 ,7725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB ,067 32,137 ,9961 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 38,996 46,839 ,0911 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB -18,123 37,609 ,2830 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 3,054 23,546 ,7725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB ,067 32,137 ,9961 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 38,996 46,839 ,0911 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB -18,123 37,609 ,2830 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 3,054 23,546 ,7725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Core2/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB ,067 32,137 ,9961 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 38,996 46,839 ,0911 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for NDUFB6/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 32 SDHA CN SDHA NZB Co1 CN Co1 NZB C. Estadística del análisis del número de copias de mtDNA(Figura 6) C.1) Valores de n, medias y desviaciones estándar Cerebro Hígado C.2) Análisis estadístico t de Student C.2.1. Efecto del haplotipo mitocondrial sobre la el número de copias de mtDNA Cerebro control Hígado control 38,425 31,154 ,0235 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 7,193 21,727 ,4671 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,065 32,467 ,0285 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 6,844 20,306 ,4594 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,425 31,154 ,0235 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 7,193 21,727 ,4671 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,065 32,467 ,0285 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 6,844 20,306 ,4594 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,425 31,154 ,0235 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 7,193 21,727 ,4671 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,065 32,467 ,0285 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 6,844 20,306 ,4594 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,425 31,154 ,0235 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 7,193 21,727 ,4671 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for Co1/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 38,065 32,467 ,0285 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: CN 6,844 20,306 ,4594 Mean Diff. Crit. Diff P-Value control, NAC Fisher's PLSD for SDHA/actina Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Línea Cell: NZB 21 117,224 31,627 6,902 16 62,061 22,478 5,620 18 107,411 21,126 4,979 15 89,481 32,469 8,383 Count Mean Std. Dev. Std. Err. NZB, Control NZB, NAC NZBmtC57, Control NZBmtC57, NAC Means Table for Nº copias mtDNA Effect: Línea * Tratamiento Split By: Tejido Cell: Cerebro 24 117,798 32,474 6,629 16 76,276 37,766 9,441 19 100,000 22,107 5,072 10 76,750 25,444 8,046 Count Mean Std. Dev. Std. Err. NZB, Control NZB, NAC NZBmtC57, Control NZBmtC57, NAC Means Table for Nº copias mtDNA Effect: Línea * Tratamiento Split By: Tejido Cell: Hígado 21 117,224 31,627 6,902 16 62,061 22,478 5,620 18 107,411 21,126 4,979 15 89,481 32,469 8,383 Count Mean Std. Dev. Std. Err. NZB, Control NZB, NAC NZBmtC57, Control NZBmtC57, NAC Means Table for Nº copias mtDNA Effect: Línea * Tratamiento Split By: Tejido Cell: Cerebro 24 117,798 32,474 6,629 16 76,276 37,766 9,441 19 100,000 22,107 5,072 10 76,750 25,444 8,046 Count Mean Std. Dev. Std. Err. NZB, Control NZB, NAC NZBmtC57, Control NZBmtC57, NAC Means Table for Nº copias mtDNA Effect: Línea * Tratamiento Split By: Tejido Cell: Hígado 9,813 17,773 ,2705 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, Control -27,420 20,401 ,0102 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, NAC 17,798 17,608 ,0477 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, Control -,474 28,019 ,9725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, NAC 9,813 17,773 ,2705 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, Control -27,420 20,401 ,0102 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, NAC 17,798 17,608 ,0477 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, Control -,474 28,019 ,9725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, NAC 33 Cerebro NAC Hígado NAC C.2.2. Efecto del NAC sobre el número de copias de mtDNA Cerebro CN Cerebro NZB Hígado CN Hígado NZB D. Estadística de la evaluación de la actividad OXPHOS en fibroblastos inmortalizados D.1) Valores de n, medias y desviaciones estándar Respiración endógena Respiración desacoplada 55,163 18,913 <,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB 17,929 19,143 ,0654 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZBmtC57 41,521 22,645 ,0007 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB 23,250 18,655 ,0165 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZBmtC57 55,163 18,913 <,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB 17,929 19,143 ,0654 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZBmtC57 41,521 22,645 ,0007 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB 23,250 18,655 ,0165 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZBmtC57 5 10,304 1,044 ,467 7 8,533 1,172 ,443 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN loxtag NZB loxtag Means Table for Maximal respiration Effect: Cell line Row exclusion: Respiracion total.ssd 9,813 17,773 ,2705 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, Control -27,420 20,401 ,0102 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, NAC 17,798 17,608 ,0477 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, Control -,474 28,019 ,9725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, NAC 9,813 17,773 ,2705 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, Control -27,420 20,401 ,0102 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Cerebro, NAC 17,798 17,608 ,0477 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, Control -,474 28,019 ,9725 Mean Diff. Crit. Diff P-Value NZB, NZBmtC57 Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Línea Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Tratamiento Cell: Hígado, NAC 55,163 18,913 <,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB 17,929 19,143 ,0654 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZBmtC57 41,521 22,645 ,0007 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB 23,250 18,655 ,0165 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZBmtC57 55,163 18,913 <,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZB 17,929 19,143 ,0654 Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Cerebro, NZBmtC57 41,521 22,645 ,0007 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZB 23,250 18,655 ,0165 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value Control, NAC Fisher's PLSD for Nº copias mtDNA Effect: Tratamiento Significance Level: 5 % Split By: Tejido, Línea Cell: Hígado, NZBmtC57 5 6,856 ,393 ,176 7 5,399 ,409 ,154 Count Mean Std. Dev. Std. Err. CN loxtag NZB loxtag Means Table for Endogenous Resp Effect: Cell line Row exclusion: Respiracion total.ssd 34 D.2) Análisis estadístico t de Student Respiración endógena Respiración desacoplada 1,772 1,465 ,0225 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN loxtag, NZB loxtag Fisher's PLSD for Maximal respiration Effect: Cell line Significance Level: 5 % Row exclusion: Respiracion total.ssd 1,456 ,525 ,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value CN loxtag, NZB loxtag Fisher's PLSD for Endogenous Resp Effect: Cell line Significance Level: 5 % Row exclusion: Respiracion total.ssd