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La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales Máster en Biología Molecular y Celular Julia Marquina Reglero Directores: Patricia Meade Huerta Patricio Fernández Silva Curso 2013-2014 La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 1 Índice 1. Presentación .............................................................................................................. 4 2. Introducción .............................................................................................................. 4 2.1. Sistema genético de las mitocondrias. .............................................................. 5 2.2. Origen endosimbiótico de las mitocondrias. ..................................................... 7 2.3. Proteínas mitocondriales. .................................................................................. 8 2.4. Rutas metabólicas en la mitocondria. ............................................................... 9 2.5. Sistema de fosforilación oxidativa. .................................................................. 10 2.6. Vías alternativas de transporte de electrones. ................................................ 14 2.6.1. La oxidasa alternativa AOX. ...................................................................... 14 2.7. Patología mitocondrial. .................................................................................... 16 2.8. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales. ..................................... 18 3. Hipótesis y objetivos ............................................................................................... 21 4. Materiales y métodos: ............................................................................................ 22 4.1. Muestras biológicas: ........................................................................................ 22 4.2. Cultivos celulares: ............................................................................................ 24 4.2.1. Medios de cultivo. .................................................................................... 24 4.2.2. Descongelación, siembra y mantenimiento de las líneas celulares. ........ 24 4.2.3. Congelación de las líneas celulares. ......................................................... 25 4.2.4. Recuento celular. ...................................................................................... 26 4.2.5. Ensayos de resistencia a rotenona. .......................................................... 27 4.3. Ácidos nucleicos: .............................................................................................. 28 4.3.1. Extracción de DNA a partir de cultivos celulares. .................................... 28 4.3.2. Extracción de DNA a partir de cola o dedo de ratón. ............................... 29 La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 2 4.3.3. Cuantificación de los ácidos nucleicos. .................................................... 29 4.3.4. Amplificación del DNA. ............................................................................. 30 4.3.5. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. ............................................. 34 4.4. Proteínas: ......................................................................................................... 34 4.4.1. Electroforesis de proteínas. ...................................................................... 34 4.4.2. Electrotransferencia. ................................................................................ 35 4.4.3. Inmunodetección de proteínas. ............................................................... 36 4.4.4. Cuantificación de proteínas. ..................................................................... 37 4.5. Purificación de mitocondrias. .......................................................................... 38 4.5.1. Purificación de mitocondrias de células en cultivo. ................................. 38 4.5.2. Purificación de mitocondrias procedentes de tejidos. ............................. 39 4.6. Análisis estadístico de los resultados. ............................................................. 40 5. Resultados ............................................................................................................... 41 5.1. Ensayos de resistencia a rotenona. ................................................................. 41 5.2. Genotipado de las líneas celulares. ................................................................. 43 5.3. Genotipado de los ratones. ............................................................................. 43 5.4. Expresión de la proteína AOX en pulmón, testículo, timo, bazo, hígado y páncreas en ratones knock-in AOX. ............................................................................ 45 5.5. Diferencias en la expresión de AOX entre machos y hembras knock-in AOX. 46 5.6. Degradación de la proteína AOX. ..................................................................... 47 6. Discusión ................................................................................................................. 51 7. Conclusiones............................................................................................................ 56 8. Bibliografía .............................................................................................................. 57 La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 3 La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Las enfermedades mitocondriales constituyen un amplio grupo de patologías que se caracterizan por presentar alteraciones en la cadena de transporte de electrones, con la consiguiente disminución de la producción de energía en forma de ATP. El tratamiento de las enfermedades mitocondriales presenta una serie de dificultades y, de hecho, no existe una terapia efectiva para tratarlas. Actualmente, las medidas terapéuticas se limitan a ser de soporte en la gran mayoría de los pacientes. Una de las terapias que se está investigando en la actualidad consiste en la xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX, enzima procedente del hongo Emericella nidulans. En concreto, en el presente trabajo de fin de máster se ha continuado con la caracterización de dicha proteína, realizando ensayos de inmunodetección de AOX en distintos tejidos de ratón knock-in, y ensayos de viabilidad para estudiar la funcionalidad de la proteína. Los ensayos de inmunodetección revelaron que AOX se expresa en todos los tejidos de ratón analizados y que su expresión es mayor en ratones machos. Sin embargo, no se pudo concluir el origen de las tres bandas correspondientes a AOX. Además, los ensayos de viabilidad demostraron que no ejerce ningún efecto cuando se produce un fallo en la cadena a nivel del complejo I, al contrario de lo que sucedía con los complejos III y IV, validando la relevancia funcional de dicha proteína. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 4 1. Presentación Las mitocondrias son orgánulos celulares que se encargan de la producción de energía para la célula en forma de ATP, a través del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Las enfermedades causadas por defectos en los genes del sistema OXPHOS, tanto nucleares como mitocondriales, se presentan principalmente como disfunciones neurológicas, musculares, cardíacas o endocrinas. Están catalogadas como enfermedades raras, debido a su baja prevalencia en la población (1/5000). En la actualidad no hay terapias eficaces para el tratamiento de estas enfermedades, lo que ha impulsado la investigación para poder ofrecer una alternativa terapéutica a las personas afectadas por estos síndromes. Una posible solución, a largo plazo, podría ser la terapia génica. El grupo GENOXPHOS, en el cual he realizado el proyecto Máster, está ensayando la terapia génica mediante la xenoexpresión en células de mamíferos de la oxidasa alternativa AOX. Con este fin, han desarrollado un modelo de ratón knock-in para dicha proteína. En trabajos anteriores se ha comprobado que AOX se expresa en distintos tejidos de los ratones knock-in y que se localiza en la mitocondria. En el presente trabajo de fin de máster se ha continuado la caracterización de dicha proteína en el ratón knock-in para AOX. 2. Introducción Las mitocondrias son orgánulos membranosos que forman parte de las células eucariotas y se localizan en el citosol. Desempeñan un papel crucial en la generación de energía metabólica dentro de la célula, ya que son responsables de la mayor parte de la energía útil derivada de la degradación de los carbohidratos y los ácidos grasos, que es convertida en ATP en el proceso de fosforilación oxidativa. Debido a esto, las mitocondrias se localizan en áreas de gran consumo de energía y su concentración varía según el tejido. En cuanto a su estructura, las mitocondrias tienen un sistema de doble membrana que delimita dos compartimentos: el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. La membrana externa es fácilmente permeable a moléculas pequeñas e iones, debido a La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 5 que contiene una gran cantidad de porinas, una familia de proteínas integrales de membrana que forman canales que permiten la difusión libre de moléculas menores de 1 kDa. Por tanto, la composición del espacio intermembrana es similar a la del citosol en cuanto a los iones y a las moléculas pequeñas. La membrana interna forma unos pliegues llamados crestas mitocondriales que se extienden hacia el interior del orgánulo y es impermeable a la mayor parte de moléculas e iones, incluido el protón, lo que permite el mantenimiento del gradiente de protones, necesario para la fosforilación oxidativa. En la membrana interna mitocondrial se encuentran los componentes de la cadena respiratoria: complejos I, II, III y IV y la ATP sintasa. La matriz contiene el sistema genético mitocondrial, que se encuentra formando los nucleoides asociado a la cara interna de la membrana interna, y las enzimas responsables de las reacciones centrales del metabolismo oxidativo; excepto las de la glucólisis, que tiene lugar en el citosol. [1] Figura 1: Representación esquemática de la estructura de una mitocondria. 2.1. Sistema genético de las mitocondrias. Las mitocondrias contienen su propio genoma, que es distinto del genoma nuclear y se encuentra en la matriz mitocondrial. El genoma mitocondrial humano consiste en una molécula de DNA circular de cadena doble, sin intrones, que tiene 16569 pb y su secuencia se conoce en tu totalidad [3]. Hay 37 genes: 2 rRNA, 22 tRNA y 13 secuencias codificadoras de subunidades de proteínas de la cadena respiratoria: 7 subunidades del complejo I o NADH ubiquinona:oxidorreductasa; la subunidad apocitocromo b del La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 6 complejo III o ubiquinona:citocromo c oxidorreductasa; las subunidades 1, 2 y 3 del complejo IV o citocromo c oxidasa; y las subunidades 6 y 8 del complejo V o F0 – ATP sintasa [4]. No obstante, la mayoría de proteínas mitocondriales están codificadas en el genoma nuclear [3]. Las 2 hebras del DNA mitocondrial (mtDNA) tienen diferente densidad, debido a que contienen una composición distinta en bases nitrogenadas y así se puede distinguir la hebra pesada, rica en guaninas, que codifica los 2 rRNA, 14 tRNA y 12 polipéptidos; y la hebra ligera, rica en citosinas, que contiene la información para 8 tRNA y el polipéptido ND6 del complejo I [5]. Figura 2: DNA mitocondrial. Debido al ambiente oxidativo que existe en el interior de la mitocondria, por la producción de especies reactivas de oxígeno en la cadena respiratoria, y a la carencia de histonas, la tasa de mutaciones en el mtDNA es elevada. Además, el sistema de replicación mitocondrial es menos efectivo en la corrección de errores que el nuclear. Como consecuencia de estos dos factores, los defectos en el mtDNA se acumulan a lo largo del tiempo. La herencia del mtDNA es exclusivamente por vía materna, debido a que las mitocondrias del espermatozoide están marcadas con ubiquitina y durante la fecundación el mtDNA del espermatozoide es selectivamente degradado por endonucleasas, por lo que el cigoto solo poseerá mitocondrias de la madre. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 7 Cada célula contiene cientos de mitocondrias, por lo que existirán miles de copias de mtDNA y de los genes que codifica (poliplasmia). Durante la mitosis, las mitocondrias segregan al azar a las células hijas, fenómeno que se denomina segregación mitótica. Por tanto, a partir de un cigoto que es portador de mtDNA normal y mutado, en sucesivas divisiones pueden obtenerse tres tipos de poblaciones celulares: células que solo contienen mtDNA mutado (homoplasmia mutante), células que solo tienen mtDNA normal (homoplasmia normal), y células portadoras de ambos tipos de mtDNA (heteroplasmia). Según este hecho, en un paciente que hereda una mutación mitocondrial la proporción de moléculas mutadas puede variar de un tejido a otro. El porcentaje mínimo de mtDNA mutado necesario para que se exprese la patología se denomina umbral de expresión fenotípica. Este umbral es diferente para cada tejido, siendo menor para aquéllos con un mayor requerimiento energético (cerebro, músculo esquelético y cardíaco, por ejemplo) [6]. Figura 3: Selección genética mitocondrial. 2.2. Origen endosimbiótico de las mitocondrias. La existencia dentro de las mitocondrias del mtDNA, ribosomas y tRNA apoya la hipótesis sobre su origen endosimbiótico, que supone que los primeros organismos capaces de metabolismo aeróbico, incluida la producción de ATP ligada a la La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 8 respiración, eran bacterias [7]. Los eucariotas primitivos que vivían anaeróbicamente adquirieron la capacidad de llevar a cabo la fosforilación oxidativa cuando establecieron una relación simbiótica con bacterias que vivían en su citosol. Tras mucha evolución y traslado de muchos genes bacterianos al núcleo del eucariota huésped, las bacterias endosimbióticas se transformaron finalmente en mitocondrias. La hipótesis del origen endosimbiótico de las mitocondrias supone que las bacterias primitivas que vivían libremente tenían la maquinaria enzimática para la fosforilación oxidativa y predice que sus descendientes bacterianos modernos han de tener cadenas respiratorias muy similares a las de los eucariotas modernos. [1] 2.3. Proteínas mitocondriales. Las mitocondrias contienen cientos de proteínas diferentes, de las que sólo alrededor de un 1% están codificadas por el mtDNA [3, 4]. El resto están codificadas por genes nucleares, son sintetizadas por ribosomas citosólicos libres e importadas en las mitocondrias como cadenas polipeptídicas completadas, mediante un sistema de proteínas transportadoras de membrana. Debido a la estructura de doble membrana de la mitocondria, el importe de proteínas es más complejo que la transferencia de un polipéptido a través de las bicapas fosfolipídicas sencillas. El destino de las proteínas mitocondriales puede ser la membrana externa o interna, la matriz o el espacio intermembrana. Las proteínas atraviesan la membrana externa a través del sistema de translocadores mitocondriales externo e interno (TOM y TIM) que reconocen señales de importe de proteínas específicas para cada espacio del orgánulo. En el caso de ser proteínas del espacio intermembrana solo tendrán señales de importe a través de TOM, mientras que si tienen señales de importe a la matriz atravesarán TOM y TIM [2]. Las proteínas codificadas por el mtDNA interaccionan con proteínas codificadas en el DNA nuclear (nDNA) que son importadas de forma selectiva a la mitocondria [8, 9]. Así, se forman los complejos de la cadena de transporte electrónico mitocondrial I, III y IV, siendo el complejo II codificado exclusivamente por el núcleo. La cadena de transporte de electrones junto con la ATP sintasa (complejo V) se encargan de realizar una de las funciones mitocondriales más importantes, el sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) [10], a través del cual la célula obtiene el 90% de su energía en forma de ATP. Existen otros procesos metabólicos que tienen lugar en la mitocondria como son La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 15 electrones sin pasar por la parte de la cadena respiratoria mitocondrial dependiente de citocromos (complejos III y IV) (Figura 10). La proteína AOX se había encontrado en plantas, la mayoría de hongos y protistas, aunque recientemente se ha ampliado esta lista gracias al análisis bioinformático de genomas, lo que ha permitido detectar la presencia de AOX en 28 especies animales de nueve phyla diferentes: Porifera, Placozoa, Cnidaria, Mollusca, Annelida, Nematoda, Echinodermata, Hemichordata y Chordata [17]. Sin embardo, AOX no está presente en vertebrados. En plantas AOX es un homodímero, mientras que en hongos y animales parece ser un monómero. En los animales el extremo carboxilo de AOX posee una secuencia común y carece de una cisteína importante para la regulación en plantas, lo que ha facilitado su identificación por análisis bioinformáticos. En las plantas, AOX parece tener un papel protector frente al estrés oxidativo, ya que reduce la acumulación de ubiquinol que favorece la formación de radicales libres [18]. La proteína AOX también es capaz de orientar la respiración hacia una menor generación de energía, pues al sortear los dos pasos dependientes de citocromo, también se evitan dos translocaciones de protones que contribuyen a la generación del gradiente electroquímico. Debido a la incapacidad de AOX de bombear protones al espacio intermembrana, la energía que se produce en la transferencia de electrones se disipa en forma de calor y esta característica le permite realizar una de sus funciones principales en plantas, la regulación de la termogénesis [19]. Figura 10: Cadena de transporte de electrones con la oxidasa alternativa (AOX). AOX transfiere los electrones del ubiquinol al oxígeno molecular, reduciéndolo a agua. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 16 2.7. Patología mitocondrial. Las enfermedades mitocondriales constituyen un amplio grupo de enfermedades que se caracterizan por presentar alteraciones en la cadena de transporte de electrones, con la consiguiente disminución de producción de energía en forma de ATP. Los defectos en el sistema OXPHOS pueden ser debidos a mutaciones en el mtDNA o en el nDNA y manifiestan una gran cantidad de fenotipos, que pueden aparecer en la infancia o en la edad adulta. Una de las características de la patología mitocondrial es su complejidad. Pueden ser multisistémicas y afectar a una gran cantidad de tejidos y órganos. Además, una misma mutación puede dar lugar a distintos fenotipos y distintas mutaciones pueden producir un mismo fenotipo. Los síntomas son variados y se pueden solapar entre distintos síndromes, de ahí que se realice una clasificación de estas enfermedades en función de las características genético-moleculares de las mutaciones, más que con respecto a los síntomas clínicos [6]. Fue en 1988 cuando se describió, por primera vez, una mutación en el mtDNA que estaba asociada a una patología en el ser humano [20, 21] y desde entonces el número de mutaciones y el espectro de enfermedades producidas por ellas ha aumentado enormemente. Las enfermedades mitocondriales son consideradas raras, debido a su baja prevalencia en la población (1/5000); y su diagnóstico es complejo, como consecuencia de la gran variedad de síntomas que presentan los enfermos, como se ha comentado anteriormente [6]. En el caso de mutaciones en el mtDNA, esta heterogeneidad de los desórdenes mitocondriales es consecuencia de la herencia materna, la heteroplasmia, la segregación replicativa y el efecto umbral. Debido a la transmisión materna del mtDNA, cuando se produce una mutación en heteroplasmia, dicha mutación es segregada aleatoriamente entre las células hijas debido a un fenómeno denominado segregación replicativa [22] que puede dar lugar a todos los grados de heteroplasmia posibles, desde la homoplasmia para la mutación hasta la homoplasmia para el mtDNA silvestre. Como el porcentaje de mtDNA mutado que las células pueden soportar sin observarse efectos fenotípicos es variable, se puede definir un factor umbral de La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 17 heteroplasmia que dependerá de las demandas energéticas de cada tejido, de manera que la mutación será mucho más grave cuando se manifieste en tejidos que precisen de un alto consumo energético e inapreciable en tejidos con un bajo consumo energético. Por lo tanto, la segregación replicativa junto con el factor umbral, podrían explicar las diferencias fenotípicas observadas en familias de pacientes con una mutación en el mtDNA, así como la manifestación de una misma mutación que puede afectar a distintos órganos o tejidos dependiendo del individuo. Desde hace varias décadas se están estudiando las características estructurales e histoquímicas de tejidos afectados por patologías mitocondriales y su relación con la alteración del mtDNA. Las mutaciones descritas en el mtDNA están recogidas en MITOMAP (http://www.mitomap.org) [23]. Las mutaciones responsables de la patología mitocondrial pueden dividirse en los siguientes grupos: Grandes reorganizaciones del mtDNA Principalmente son deleciones o duplicaciones espontáneas en el mtDNA, presentándose en heteroplasmia aunque la proporción de mtDNA mutado varía dependiendo del tejido. Estas mutaciones están asociadas a diferentes patologías como el Síndrome de oftalmoplejia externa progresiva crónica (CPEO), el Síndrome de Kearns-Sayre y el Síndrome de Pearson. Todas estas patologías tienen en común grandes deleciones de entre 1 y 9 kb que se localizan en el arco comprendido entre los dos orígenes de replicación pero sin incluirlos, aunque implican la eliminación completa de algún tRNA. Las deleciones no suelen heredarse pero las duplicaciones pueden transmitirse genéticamente vía materna. Las duplicaciones forman dímeros de mtDNA normal y delecionado, que son menos frecuentes pero heredables [24, 25]. Mutaciones puntuales en tRNA o rRNA Aproximadamente la mitad de las mutaciones descritas en el mtDNA se localizan en los genes codificantes de tRNA. Se ha observado que mutaciones en los genes de tRNA La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 18 producen gran variedad de defectos [26] que se asocian con síndromes como el MERRF (síndrome de epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas rasgadas) o el MELAS (encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y accidente cerebrovascular), mientras que las mutaciones en los genes de rRNA se han asociado principalmente a fenotipos de sordera, sobre todo tras el tratamiento con aminoglicósidos. También se han descrito mutaciones responsables de la intolerancia al ejercicio y de la aparición de CPEO [25]. Mutaciones en genes que codifican proteínas mitocondriales Suelen ser pequeñas deleciones o mutaciones puntuales en las proteínas que codifican las subunidades que forman los complejos de la cadena respiratoria, provocando una deficiencia del complejo del que forman parte. Algunas patologías causadas por estas mutaciones son la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), el Síndrome de Leigh y la retinitis pigmentosa (NARP). Estos desórdenes clínicos tienen como fenotipos característicos la neuropatía óptica (LHON), encefalopatía y acidosis láctica (Leigh), neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP) [24, 25]. Mutaciones en genes nucleares Se caracterizan por tener un patrón de herencia mendeliano y dan lugar a patologías análogas a las producidas por los genes mitocondriales. Muchos genes pueden verse afectados, desde subunidades estructurales de los complejos de la cadena respiratoria, factores de ensamblaje, chaperonas, hasta genes implicados en el mantenimiento, replicación y traducción del material genético mitocondrial. 2.8. Terapia génica de las enfermedades mitocondriales. El tratamiento de las enfermedades mitocondriales presenta una serie de dificultades debido a que, como ya se ha comentado anteriormente, éstas pueden ser causadas tanto por mutaciones en el nDNA como en el mtDNA que, junto con las características genéticas de heteroplasmia y efecto umbral, producen una heterogeneidad tanto clínica como bioquímica en estos pacientes. No existen muchos pacientes con el mismo defecto molecular y la misma manifestación clínica que permitan realizar La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 19 estudios concluyentes sobre el efecto de los fármacos aplicados en el tratamiento. En la gran mayoría de los pacientes las medidas terapéuticas se limitan a ser de soporte [6]. En los últimos años, se han llevado a cabo estudios acerca de nuevas terapias como el aumento de la biogénesis mitocondrial [27], la suplementación con coenzima Q, o el aumento de la fusión y la fisión de las mitocondrias [28]. Otro grupo de aproximaciones terapéuticas proponen el uso de distintas estrategias de terapia génica como posible alternativa para el tratamiento de las enfermedades mitocondriales. Entre ellas encontramos la eliminación del gen mutante (mediante el uso de enzimas de restricción dirigidas a la mitocondria y que cortan específicamente las copias mutadas), la introducción del gen sano para su expresión en el citoplasma e importe a la mitocondria (expresión alotópica) y la xenoexpresión de enzimas alternativas (procedentes de otros organismos). Este último método se ha estudiado en el grupo de investigación GENOXPHOS como terapia para las enfermedades mitocondriales basada en el uso de vías alternativas al transporte electrónico en la cadena respiratoria y es el objeto de la presente memoria. En investigaciones recientes se han desarrollado líneas de ratón portadoras de mutaciones en el nDNA para dar lugar a fenotipos equivalentes a los de las enfermedades humanas, para poder estudiarlas en un modelo animal, con el fin de obtener tratamientos más efectivos. Hasta ahora, los modelos más usados han estado basados en cultivos celulares derivados de tejidos de pacientes y algunos organismos recombinantes, los cuales están alejados filogenéticamente de los mamíferos, y por lo tanto, también del ser humano. Entre los modelos animales que se están estudiando actualmente están ratones portadores de mutaciones, creados por recombinación homóloga, para genes que codifican proteínas estructurales de la cadena respiratoria, entre ellos el gen COX10, presente en este estudio, que se ha visto que está mutado en enfermedades mitocondriales humanas [29, 30]. Con las técnicas clásicas aún no ha sido posible la generación de ratones knock-out para genes codificados en el mtDNA. Sin embargo, lo que sí se ha conseguido ha sido la introducción de mutaciones presentes en el mtDNA con el uso de estrategias de fusión La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 20 entre células enucleadas (citoplastos) que presentan la mutación y células madre embrionarias [31] o cigotos [32]. Las mutaciones estudiadas afectan a las subunidades del complejo IV y son hereditarias [33, 34]. Defectos en el complejo IV han sido asociados con varias enfermedades mitocondriales y neurodegenerativas [35, 36]. La expresión de la oxidasa alternativa AOX podría proporcionar una opción en el caso de deficiencias que afecten a los complejos III y IV. Esta enzima ha sido expresada en células humanas sanas en cultivo, comprobando que su expresión no resulta tóxica y las hace parcialmente resistentes al cianuro y a la antimicina A, inhibidores de los complejos IV y III, respectivamente [37]. En Drosophila, dicha oxidasa alternativa permite la supervivencia de moscas que tienen disminuida parcialmente la expresión del factor de ensamblaje del complejo IV Surf1, así como compensar el fenotipo en una cepa que contiene una mutación en el gen homólogo al humano Park7 relacionado con la enfermedad del Parkinson [38]. La xenoexpresión simultánea de la proteína AOX y una NADH deshidrogenasa (NADI1) en una línea celular carente de mtDNA (rho cero o ro) permitió restablecer el transporte electrónico desde NADH hasta el oxígeno molecular [39]. Además de la función respiratoria, se restablecieron vías metabólicas adyacentes como la síntesis de pirimidinas. Sin embargo, no se recuperó el bombeo protónico, ya que ninguna de estas proteínas cumple esta función, por lo que la compensación funcional de la cadena respiratoria fue incompleta. Para restaurarla, y así establecer un potencial de membrana para la síntesis de ATP, se podría desarrollar una estrategia de xenoexpresión con proteínas con función de bombeo de protones. La expresión de AOX en el modelo de ratón permite el estudio del potencial terapéutico de dicha proteína como terapia génica en mamíferos con defectos del sistema OXPHOS. Por ello, en el presente proyecto Máster se abordó el estudio de un modelo de ratón knock-in para AOX y del modelo resultante de cruzar dicho knock-in con animales knock-out para factores de ensamblaje del complejo IV de la cadena respiratoria (COX10). La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 21 3. Hipótesis y objetivos 3.1. Hipótesis Nuestra hipótesis se basa en que, mediante la xenoexpresión de la proteína AOX de Emericella nidulans, se puede restaurar el paso de electrones del NADH al oxígeno en aquellos animales que tengan interrumpida la cadena respiratoria a nivel de los complejos III o IV. Esto disminuiría la producción de ROS, permitiría restablecer el funcionamiento del complejo I y de aquellas rutas metabólicas dependientes del funcionamiento de la cadena, con la consiguiente mejora de la sintomatología. 3.2. Objetivos 3.2.1. Completar la caracterización funcional de AOX en los ratones knock-in comparando con el fenotipo salvaje. 1.1. Expresión de AOX en pulmón, testículo, timo, bazo y páncreas en ratones knock-in AOX. 1.2. Diferencias en la expresión de AOX entre machos y hembras. 3.2.2. Definir las posibles opciones que expliquen la aparición de tres bandas en los análisis de western blot (procesamiento tras el importe a mitocondria o degradación de la proteína AOX). 3.2.3. Ensayos de resistencia a rotenona. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 22 4. Materiales y métodos: 4.1. Muestras biológicas: Con el fin de estudiar el papel de la proteína AOX in vivo se generó un ratón transgénico que expresara el gen AOX de forma ubicua. Esta parte del procedimiento fue llevada a cabo por la empresa genOway. El ratón fue generado por inserción del cDNA de AOX, bajo la influencia del promotor Rosa26, vía recombinación homóloga en células madre embrionarias. Figura 11: Representación esquemática del proceso de generación del ratón knock-in AOX. El procedimiento comenzó con la inserción del constructo AOX cDNA, procedente del hongo Emericella nidulans, en el vector Rosa26 “Quick Knock-inTM” de genOway. Se insertó un casete STOP flanqueado por sitios loxP (floxeado) en la zona upstream del constructo, para que la expresión del gen AOX dependiera de la acción de la enzima Cre-recombinasa, y un casete de resistencia a neomicina, flanqueado por sitios FRT, para facilitar la selección de las células recombinantes. Se introdujo el transgén en La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 23 células madre embrionarias por recombinación homóloga y éstas se inyectaron en blastocistos para generar las quimeras. Los ratones se cruzaron con otros que fueran portadores de Flp recombinasa, para escindir el casete de selección a neomicina mediante el sistema Flp-FRT, y posteriormente con ratones portadores de Cre recombinasa, para escindir el casete STOP y permitir la expresión del gen AOX (Figura 11). El ratón knock-out para COX10 se generó eliminando el exón 6 del gen COX10 usando el sistema Cre-loxP. Primero, los sitios loxP fueron introducidos en el gen en células madre embrionarias por recombinación homóloga. A continuación, se eliminó el casete de selección con la Cre recombinasa para obtener el gen floxeado. Las células madre embrionarias que contenían el gen floxeado fueron inyectadas en blastocistos para producir ratones quiméricos. Posteriormente, el exón 6 fue eliminado in vivo, cruzando ratones portadores del gen floxeado con ratones transgénicos que expresaban Cre recombinasa de forma específica en músculo esquelético (Figura 12) [30]. Figura 12: Esquema del exón 6 del gen COX 10 en los ratones knock-out para COX10. La línea de ratones knock-out COX10 se cruzó con los ratones knock-in AOX para obtener ratones knock-in-knock-out. Los ratones knock-in AOX utilizados a lo largo de este estudio fueron obtenidos a partir de cruces entre ratones knock-in heterocigotos para AOX (+/-). Las crías eran clasificadas como homocigotos AOX +/+, heterocigotos AOX +/- y homocigotos AOX -/-. Las líneas celulares utilizadas a lo largo de este estudio fueron fibroblastos inmortalizados AOX +/+, AOX +/- y AOX -/-, obtenidos a partir de ratones knock-in AOX; La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 24 C57-AOX línea celular C57 que sobreexpresa la proteína AOX [39]; y fibroblastos de ratón C57 silvestre. 4.2. Cultivos celulares: Todo el trabajo con cultivos celulares se llevó a cabo en campana de esterilización de flujo laminar. Todo el material se limpió con etanol al 70%, antes y después de cada sesión de trabajo, dejando conectado el UV al finalizar la misma. Los conductos empleados para la aspiración de los medios de cultivo, mediante bomba de vacío, se lavaron con lejía al 20% tras cada uso y al finalizar la sesión de trabajo, para evitar posibles contaminaciones con agentes patógenos. Los cultivos se crecieron en incubadores a 37 oC con una atmósfera de CO2 al 5%. Todos los medios usados para lavar, tripsinizar, centrifugar y cultivar las células, se precalentaron en un baño de agua a 37 oC. Para la eliminación del medio de cultivo y residuos líquidos que habían estado en contacto con las células, se utilizaron pipetas Pasteur estériles y se aspiraron con una bomba de vacío. Todo el material que estuvo en contacto directo con el cultivo celular se recogió en contenedores especiales para material biológico para su eliminación posterior por empresas especializadas. 4.2.1. Medios de cultivo. Para el crecimiento y mantenimiento de las distintas líneas de fibroblastos de ratón usadas en este trabajo, se utilizó un medio de cultivo preparado a partir del medio comercial DMEM (GIBCO) con alto contenido en glucosa (4,5 g/L), piruvato de sodio (0,11 g/L) y glutamina (584 mg/L), al que se le añadió un 5% de suero fetal bovino (SFB, GIBCO), el cual aporta proteínas y factores de crecimiento, y un 1% de una mezcla de antibióticos para prevenir contaminaciones por bacterias (10000 unidades/mL de penicilina G sódica y 10000 μg/mL de sulfato de estreptomicina, GIBCO). 4.2.2. Descongelación, siembra y mantenimiento de las líneas celulares. Las líneas celulares se almacenan en viales de congelación en un tanque de nitrógeno líquido para evitar la pérdida accidental de una línea celular por muerte o contaminación y minimizar la acumulación de cambios genéticos. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 31 Figura 17: Representación del programa de PCR en la que se indica las temperaturas de cada etapa, para las distintas PCR. En el proceso de genotipado de los ratones, para determinar los ratones que eran knock-in para AOX, los que eran knock-in y conservaban el casete STOP y los que eran AOX -/-, se llevaron a cabo dos protocolos distintos de PCR, con dos grupos distintos de cebadores. El primer protocolo incluye la PCR AOX y la PCR Cre-LoxP. La PCR AOX identifica los ratones knock-in sin STOP y en ella se usan los cebadores Rosa-F, Rosa-R y AOX-R (Figura 18). En los ratones homocigotos para AOX se obtiene una banda de 711 pares de bases (pb), en los ratones heterocigotos se obtienen 2 bandas, una de 711 pb y otra de 400 pb y en los ratones homocigotos AOX -/- se obtiene una banda de 400 pb. La PCR Cre-LoxP identifica los ratones que son knock-in para AOX y conservan el casete STOP, con los cebadores Rosa-F, Rosa-R2, AOX R y Cre-F (Figura 18). En los ratones AOX -/- se amplifica una banda de 400 pb, en los ratones heterocigotos se amplifican 2 bandas, una de 850 pb y otra de 400 pb y en los homocigotos (los 2 alelos son knockin+STOP) se amplifica una banda de 850 pb. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 32 Figura 18: Representación esquemática del lugar de unión de los cebadores en las reacciones PCR AOX y PCR Cre-LoxP que identifica los ratones AOX -/-, los que tienen el gen AOX y los que tienen el gen AOX con el casete STOP. En el segundo protocolo de PCR se usaron los cebadores: 027, 061, 15901, 028 (Figura 19). De tal manera que los cebadores 027/15901 permiten identificar los ratones knock-in AOX sin casete STOP (banda de 803 pb), los cebadores 061/15901 identifican los ratones knock-in AOX con STOP (banda 593 pb) y los cebadores 028/027 se unen a los alelos silvestres (banda de 293 pb). Figura 19: Representación esquemática del segundo protocolo con el lugar de unión de los cebadores en la reacción de PCR que identifica los ratones AOX -/-, los que tienen el gen AOX y los que tienen el gen AOX con el casete STOP. La PCR ACTA permite identificar aquellos ratones que tienen Cre recombinasa específica de músculo esquelético. Usando los cebadores ACTA-Cre Forward y ACTACre Reverse aquellos ratones que tengan Cre recombinasa en músculo esquelético dan una banda de 400 pb. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 33 Por último, con la PCR COX10 se identifican los ratones que tienen el gen COX10 floxeado. En aquellos ratones que posean los 2 alelos del gen de COX10 floxeados se amplifica una banda de 838 pb, en los ratones con un alelo floxeado y un alelo silvestre se obtienen 2 bandas, una de 838 pb y otra de 708 pb y en los ratones AOX -/- se amplificará una banda de 708 pb (Figura 20). Figura 20: Representación esquemática del exón 6 del gen COX10, con los lugares de unión de los cebadores. Los reactivos empleados para la reacción de PCR se detallan en la Tabla 1 y la secuencia de los cebadores usados, en la Tabla 2. Tabla 1: Reactivos empleados en las reacciones de PCR, con los volúmenes utilizados y la concentración de cada uno en los 25 µL de volumen final. Concentración inicial Volumen Concentración final Tampón SO4 10x 2,5 µL 1x MgCl2 100 mM 0,5 µL 2 mM dNTPs 10 mM 0,5 µL 0,2 mM Cebador directo 10 µM 1 µL 0,4 µM Cebador reverso 10 µM 1 µL 0,4 µM Taq polimerasa 5 U/µL 0,1 µL 0,02 U/µL DNA 1 µL 4 ng/µL H2O 18,4 µL El programa usado en el termociclador varía según la PCR que se lleva a cabo ya que las temperaturas de hibridación de los cebadores dependen de la longitud de éstos y de su contenido en bases nitrogenadas y el tiempo de extensión depende de la longitud del tamaño del producto de PCR (Figura 17). La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 34 Tabla 2: Cebadores empleados en las reacciones de PCR. Nombre del cebador Secuencia Rosa-F CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCT AOX-R CTCCACGATCTTTGGGGCGTCTG Rosa-R2 GCGGATCACAAGCAATAATAACCTG Cre-F GTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGT COX10-F ACCCATTAGAAACTGCTGATGGCT COX10-R CACTGACGCAGCGCCAGCATCTT ACTA-Cre-F CGCAGAACCTGAAGATGTTC ACTA-Cre-R GTTCGAACGCTAGAGCCTG 027 CAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGC 061 CATGGTAAGTAAGCTTGGGCTGCAGG 15901 GGAGGACATCAAGAAGTTCCAGATGACC 028 GGTAGTCATCTGGGGTTTTATGCAG 4.3.5. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. Los geles de agarosa empleados tenían una concentración del 1,8% de agarosa y se prepararon disolviendo 1,44 gramos de agarosa en 80 mL de TAE 1x (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM y EDTA 1 mM) y calentando la mezcla en un microondas hasta la completa disolución de la agarosa. Una vez templada la disolución se añadieron 4 µL de bromuro de etidio (10 mg/mL) para conseguir una concentración final de 0,5 µg/mL, se vertió en el molde del gel, se pusieron los peines y se dejó polimerizar. Una vez sólido se quitaron los peines y el gel se colocó en la cubeta de electroforesis y se llenó con TAE 1x. Para cargar las muestras se añadió a cada muestra 5 µL del tampón de carga (Ficoll400 al 30% y azul de bromofenol al 0,1% (p/v) en TAE) y se cargaron 20 µL en cada pocillo. Como marcador de pesos moleculares se usó Low Mass Ladder de Invitrogen. La corriente empleada fue 100 voltios y el tiempo de electroforesis varió entre 30 y 50 minutos, dependiendo de las muestras. Para visualizar los geles se empleó un transiluminador GelDoc de Bio-Rad. 4.4. Proteínas: 4.4.1. Electroforesis de proteínas. El primer paso en la inmunodetección de proteínas es la separación de las mismas mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Estos geles se La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 35 componen de gel concentrador en la parte superior, y gel separador en la inferior. Los reactivos usados para la preparación de los geles, que tenían 1 mm de espesor, se detallan en la Tabla 3. Tabla 3: Reactivos empleados en la preparación de los geles separador y concentrador. Gel separador (12,5%) Gel concentrador (5%) Acrilamida:bisacrilamida 30:0,8 2,125 mL 0,33 mL Tris HCl 1,5 M pH 8 4x 1,25 mL 0,5 mL Agua 2 mL 1,1 mL 10% persulfato amónico 30 µL 20 µL TEMED 5 µL 5 µL Primero se montaron los cristales sobre el soporte y se comprobó que no había fugas añadiendo agua destilada. Se eliminó el agua y se añadió el gel separador, hasta una altura de 5 centímetros, seguido de un pequeño volumen de isopropanol para eliminar las burbujas de la superficie y evitar la entrada de oxígeno, que inhibe la polimerización. Una vez polimerizado, se eliminó el isopropanol, se añadió el gel concentrador y se colocaron los peines, con cuidado de que no se formaran burbujas. Cuando el gel polimerizó se retiraron los peines y los pocillos se lavaron con agua destilada. Los cristales se colocaron en la cubeta de electroforesis, que se llenó con tampón de electroforesis 1x (preparado a partir de tampón de electroforesis 10x TrisHCl 250 mM, glicina 1,92 mM y SDS 1%). Para cargar las muestras se mezclaron con tampón de carga 4x (Tris-HCl pH 6,8 50 mM, SDS 2%, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 1% y azul de bromofenol 0,02%) y el marcador de pesos moleculares empleado fue Precision Plus Protein Dual Color de Bio-Rad. Se conectó a una corriente de 10 mA por gel durante 30 minutos, hasta que las muestras alcanzaban el gel separador y, a continuación, se aumentó la corriente a 20 mA por gel durante 2 horas. 4.4.2. Electrotransferencia. La transferencia de proteínas desde el gel a membranas de PVDF se realiza mediante electrotransferencia húmeda en un sistema Mini Trans-Blot Cell de Bio-Rad (Figura 21). Las membranas empleadas son Hybond-P de Amersham y necesitan activarse en metanol durante 10 segundos. El gel se incubó en BSN (Tris 48 mM, glicina 39 mM y La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 36 metanol 20%) durante 20 minutos y la membrana, una vez activada, se lavó en agua destilada 1 minuto y se incubó en BSN 15 minutos. La preparación de los sándwiches se realizó en una cubeta llena de BSN, para que todos los componentes estuvieran humedecidos con BSN. Se colocó, encima del casete transparente, la esponja, 3 papeles de filtro, la membrana, el gel, 3 papeles de filtro, la otra esponja y se cerró, con cuidado de que no quedaran burbujas entre la membrana y el gel. Los sándwiches se colocaron en la cubeta de transferencia y se añadió BSN hasta arriba. Se conectó a una corriente de 100 voltios, durante 1 hora a 4 oC. Una vez acabada la transferencia se sacó la membrana y se lavó con agua destilada y PBS-T (PBS con 0,05% Tween 20) y se utilizó inmediatamente. Figura 21: Sistema Mini Trans-Blot Cell de Bio-Rad. 4.4.3. Inmunodetección de proteínas. Para detectar las proteínas fijadas a la membrana el primer paso fue el bloqueo de sitios inespecíficos con solución de bloqueo (12% de leche desnatada en polvo y 4 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS-T). La membrana se incubó en la solución de bloqueo durante toda la noche a 4 oC, con agitación. Antes de poner el anticuerpo primario, se lavó brevemente con PBS-T. El anticuerpo primario fue anti HA-peroxidasa (Roche, no precisa de anticuerpo secundario) 1:5000, que se preparó en una disolución que contenía leche (1%) y BSA (2,4 mg/mL) en PBS-T, y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Al finalizar el tiempo de incubación se realizaron 3 lavados de 10 minutos con PBS-T y se procedió a la detección de la proteína. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 37 Para la detección de la proteína se bañó la membrana con el reactivo quimioluminiscente del kit comercial EZ-ECL de Biological Industries. La enzima peroxidasa de rábano, que está conjugada al anticuerpo, actúa sobre el luminol y produce una señal luminosa que se detectó exponiendo la membrana a una placa autorradiográfica (Amersham, Hyperfilm). Esta operación se realizó colocando la membrana y la placa en un casete de exposición y en oscuridad. Transcurrido el tiempo de exposición se sumerge la placa en líquido revelador (Kodak) durante unos segundos, después en agua y, por último, en líquido fijador (Kodak). Una vez terminado este proceso, se lavó la placa con agua destilada y se dejó secar al aire. La membrana se aclaró con agua destilada para eliminar el reactivo quimioluminiscente y se conservó a 4 oC hasta su posterior utilización. Para la inmunodetección de proteínas control se incubó la membrana en una solución de bloqueo al 5% de leche en PBS-T, durante toda la noche a 4 oC. Antes de poner el anticuerpo primario, se lavó brevemente con PBS-T. A continuación, se incubó la membrana con el anticuerpo primario (1:20000, complejo II 70 kDa Invitrogen), en una solución de 0,5% de leche en PBS-T durante 2 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo se lavó la membrana con PBS-T (3 lavados de 10 minutos) y se incubó con el anticuerpo secundario (1:30000, anti IgG de ratón GE Healthcare) en una solución de 0,5% de leche en PBS-T durante una hora. Finalizado el tiempo se lavó de nuevo con PBS-T (3 lavados de 10 minutos) y la proteína de 70 kDa del complejo II se detectó de la manera explicada anteriormente. 4.4.4. Cuantificación de proteínas. Para cuantificar las proteínas en los homogenados tisulares y en las mitocondrias aisladas se realizó un método espectrofotométrico, llamado método de Bradford, y se usó el espectrofotómetro UV-VIS (Unicam, UV 500 y software Vision32 versión 1.05). En primer lugar se obtuvo una recta de calibrado a partir de concentraciones conocidas de albúmina sérica bovina (BSA), para ello se prepararon distintas diluciones de una solución de concentración 1 mg/mL de BSA, con agua y reactivo de Bradford (Bio-Rad Protein Assay). Las cantidades añadidas de cada reactivo para la realización de la curva se detallan en la Tabla 4. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 38 Tabla 4: Reactivos empleados para la realización de la recta de calibrado. Reactivo Tubo 0 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 BSA 0 µL 1 µL 2 µL 3 µL 5 µL 10 µL 15 µL Agua 800 µL 799 µL 798 µL 797 µL 795 µL 790 µL 785 µL Bradford 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL µg/µL proteína 0 1 2 3 5 10 15 Para preparar las muestras se mezcló 1 µL de muestra, 200 µL de Bradford y 799 µL de agua, se agitaron con el vórtex y se incubaron 5 minutos. A continuación, se procedió a la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Una vez obtenidos los valores de absorbancia para cada muestra se extrapolaron en la recta de calibrado para conocer su concentración proteica. 4.5. Purificación de mitocondrias. 4.5.1. Purificación de mitocondrias de células en cultivo. La extracción y purificación de mitocondrias se realizó partiendo de 7-10 placas de 150 mm al 80% de confluencia, de cada línea celular. Las células se recogieron por tripsinización y se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos, el pellet celular resultante fue lavado 2 veces con PBS frío mediante resuspensión y posterior centrifugación. El pellet celular resultante se congeló a -80 oC para facilitar la ruptura de las células. Para la extracción de mitocondrias, se descongeló el pellet en un baño de hielo y la ruptura celular se realizó mediante choque hipotónico. Para ello, se resuspendió el pellet en tampón hipotónico (sacarosa 83mM, MOPS 10mM, pH 7,2) en una proporción tampón:pellet celular de 7:1 (volumen:volumen) aproximadamente. La suspensión de células se mantuvo en hielo durante al menos 2 minutos para permitir el aumento de volumen celular y así facilitar la ruptura por homogeneización mecánica. La suspensión celular se homogeneizó usando un tubo potter tipo Elvehjem con un émbolo de teflón rotando a una velocidad de 600 rpm. Se realizaron 8-10 pases, para romper las membranas celulares ya tensas debido al aumento de volumen La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 39 sufrido. En este punto se tomaron alícuotas de homogenado total. El resto de la muestra se diluyó a la mitad con tampón hipertónico (sacarosa 250 mM, MOPS 30 mM, pH 7,2) y se mezcló bien. A continuación se centrifugó a 1000 x g durante 5 minutos a 4 oC para eliminar núcleos y células no rotas. Se recogió el sobrenadante y se sedimentaron las mitocondrias mediante centrifugación a 10000 x g durante 2 minutos en frío. En este punto se tomaron alícuotas del sobrenadante. Las mitocondrias se resuspendieron en medio A (sacarosa 0,32 M, EDTA 1 mM, TrisHCl, 10 mM pH 7,4), se centrifugaron a 10000 x g durante 2 minutos en frío, y finalmente se resuspendieron en medio MAITE (sacarosa 25 mM, sorbitol 75 mM, KCl 100 mM, EDTA-Na 0,05 mM, MgCl2 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH=7,4 y H3PO4 10 mM, pH=7,4). Tras esto se procedió a la cuantificación de las proteínas (apartado 4.4.4.). Por último, las muestras se prepararon para realizar los geles de proteínas. A las fracciones de homogenado y sobrenadante se les añadió RIPA 10x (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4, NaCl 1,5 M, ácido deoxicólico 2,5%, NP-40 10%, EDTA 10 mM) a concentración final 1X o 2X y se dividieron en dos tubos eppendorf, a uno de ellos se le añadió inhibidores de proteasas (1x) (Protease Inhibitor Cocktail, SIGMA). La fracción de mitocondrias se dividió en 3 partes: a una se le añadió RIPA 1x más inhibidores de proteasas, a otra se le añadió RIPA 1x sin inhibidores de proteasas y a la tercera se le añadió TRIzol e inhibidores de proteasas. 4.5.2. Purificación de mitocondrias procedentes de tejidos. Para la inmunodetección de AOX se realizó la extracción de mitocondrias procedentes de hígado y corazón de ratón. Para preparar los homogenados tisulares, se procedió al sacrificio del animal por dislocación cervical, extrayéndose los distintos órganos a estudio: pulmón, testículo, timo, bazo, hígado, páncreas y corazón, que se colocaron en tubos tipo falcon de 50 mL que contenían medio A frío y se pesaron. Después se trocearon finamente con unas tijeras y se lavaron varias veces (2-3) con medio A frío para eliminar la mayor cantidad posible de sangre y pelos, filtrando con la ayuda de un colador estéril. A continuación las muestras de tejido fueron transferidas a un homogeneizador tipo Potter-Elvehjem de volumen adecuado con un émbolo de teflón rotando a 600 rpm, utilizando distintas La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 40 cantidades de medio A según el tejido y peso del mismo (10 mL de medio A/g de tejido para corazón, y para el resto de tejidos 4 mL/g). Cada muestra de tejido se homogeneizó realizando varios pases por muestra hasta que se observó un homogenado uniforme, el cual se transfirió a tubos vórtex (de plástico) y se centrifugaron a 1000 x g durante 5 minutos a 4 oC. El sobrenadante resultante fue transferido a tubos eppendorf, tomándolo de la parte central con ayuda de pipetas Pasteur estériles y procurando no apoyar la pipeta en las paredes del tubo para no tomar grasa que pudiera contaminar las mitocondrias. Los tubos eppendorf se centrifugaron en microcentrífuga a 10000 x g durante 2 minutos a 4 oC, se eliminó el sobrenadante, los pellets mitocondriales obtenidos se lavaron con medio A juntándolos de dos en dos. Este proceso se repitió hasta tener todas las mitocondrias en un mismo tubo. Posteriormente, la fracción mitocondrial obtenida se resuspendió en medio MAITE, centrifugando de nuevo a 10000 x g durante 2 minutos a 4 oC, el pellet final se resuspendió en tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 50 mM, Tritón X-100 1%, deoxicolato de sodio 0,5%, EDTA 5 mM, esterilizado mediante autoclave). Finalmente, a la fracción mitocondrial obtenida se añadió inhibidores de proteasas (Protease Inhibitor Cocktail, SIGMA) para su conservación, y se almacenaron a -80 oC. La concentración proteica total se cuantificó a través del método Bradford (apartado 4.4.4.). 4.6. Análisis estadístico de los resultados. En los ensayos de resistencia a rotenona, se realizaron 5 experimentos independientes, por lo que fue necesario realizar un análisis estadístico de los resultados obtenidos para comprobar si existían diferencias significativas. En estos ensayos se incluyeron 2 muestras correspondientes con los genotipos de las líneas celulares (el homocigoto para AOX +/+ y el silvestre -/-) y la significancia estadística se determinó usando el test t-student. Los datos mostrados en los resultados (Figura 22 B) representan el promedio de los 5 experimentos realizados, con sus desviaciones estándar. El intervalo de confianza se estableció en el 95%, por lo que el valor de significancia necesario para descartar que el efecto era debido al azar fue p < 0,05. El valor de p se obtuvo mediante el programa GraphPad Software. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 47 Como se observa en la Figura 30 existe una expresión mayor de la proteína AOX en las muestras de machos en comparación con las hembras knock-in AOX. 5.6. Degradación de la proteína AOX. Al realizar los western blot de las distintas muestras de tejidos y células se observó que casi siempre aparecían tres bandas para la proteína AOX. La banda de arriba se sabe que es la proteína intacta ya que corresponde con el peso molecular de la misma, sin embargo, se desconoce a qué formas de la proteína pertenecen las otras 2 bandas. En una primera hipótesis se pensó que una de estas dos bandas podría corresponder a la forma de la proteína que se encuentra en la mitocondria, después de perder el péptido señal que permitiría su importe. La otra podría corresponder a una forma de la proteína degradada por proteasas de la mitocondria. Para intentar averiguarlo se realizaron varios experimentos. En el primer ensayo se intentó comprobar si los inhibidores de proteasas tenían algún efecto sobre la degradación. Para ello se emplearon las muestras de homogenado (Hom), sobrenadante (Sn) y mitocondrias (Mit) extraídas durante el proceso de purificación de mitocondrias (apartado 4.5.1.) obtenidas a partir de fibroblastos de ratón AOX +/+. También se utilizaron muestras de proteína total de células C57-AOX, extraídas con RIPA. Figura 31: Western blot de las muestras de homogenado, sobrenadante y mitocondrias procedentes de fibroblastos AOX +/+ y proteína total de células C57-AOX extraídas con RIPA. Los signos + y – hacen referencia a la presencia o ausencia de inhibidores de proteasas. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 48 Como se puede observar en la Figura 31 no hay un efecto notable con el uso de inhibidores de proteasas. Excepto en la muestra C57-AOX, la segunda banda es menos intensa en la muestra tratada con inhibidores, lo que sugiere que puede ser resultado de degradación por proteasas. Con el fin de encontrar un método alternativo de extracción que pueda ser más eficiente a la hora de inhibir posibles proteasas se cargaron muestras de proteína total de células C57-AOX lisadas utilizando RIPA o TRIzol. A las muestras se les añadió o no inhibidores de proteasas para estudiar si pueden detener la acción de estas enzimas. Figura 32: Western blot de las muestras de mitocondrias extraídas de células C57AOX con RIPA o con TRIzol. Los signos + y – hacen referencia a la presencia o ausencia de inhibidores de proteasas. En el control del complejo II no se observan bandas probablemente porque la cantidad de proteína cargada es muy pequeña. Como se puede observar en la Figura 32, las bandas de las muestras que no llevan inhibidores de proteasas son más intensas. La segunda banda, al igual que en la Figura 31, es más intensa en la muestra que no está tratada con inhibidores de proteasas. Además, no se observan grandes diferencias entre ambos procesos de extracción. Para tratar de esclarecer los resultados obtenidos en el western blot de la Figura 31 se extrajeron nuevas muestras de homogenado, sobrenadante y mitocondrias de células C57-AOX y AOX +/+, en este caso, la fracción de sobrenadante se centrifugó 2 veces con el fin de obtener una segunda fracción mitocondrial correspondiente a mitocondrias con menor densidad (fracción Mit 2). La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 49 Figura 33: Western blot de las muestras de homogenado, sobrenadante y mitocondrias extraídas de células AOX +/+ y C57-AOX. La muestra llamada Mit 2 corresponde a una muestra más ligera de mitocondrias obtenida de una segunda centrifugación. Como se puede observar en la Figura 33, la banda de menor tamaño de las muestras de C57-AOX es proporcionalmente más intensa en ambas fracciones mitocondriales. Este resultado sugiere que la hipótesis del procesamiento podría ser válida. El siguiente ensayo se diseñó para comprobar si las proteasas degradaban la proteína AOX. Se utilizaron las muestras de sobrenadante que debería contener solo la proteína AOX de la fracción citosólica ya que las mitocondrias han sido sedimentadas y no están en esta fracción. Las muestras de sobrenadante se incubaron con mitocondrias extraídas de células C57 control (sin AOX), a 37 oC a diferentes tiempos, temperatura a la que actúan las proteasas. Con este ensayo se pretendía comprobar si las proteasas mitocondriales y lisosomales que copurifican en la misma fracción, degradan la proteína AOX de la muestra de sobrenadante (mayoritariamente la banda superior) para formar parte de las 2 bandas inferiores. Figura 34: Western blot de las muestras de sobrenadante de células C57-AOX y AOX +/+, incubadas junto con mitocondrias -/- e incubadas en hielo y a 37 oC a diferentes tiempos. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 50 El resultado obtenido se muestra en la Figura 34, no se observa ningún efecto al incubar muestras de sobrenadante con mitocondrias -/- procedentes de células C57, quizá porque la cantidad usada de mitocondrias era baja en proporción con la fracción de sobrenadante, y porque además las muestras se lisaron con RIPA concentrado 2X, lo que ayudaría a inhibir a las posibles proteasas. Se decidió repetir el ensayo anterior, esta vez con mitocondrias obtenidas de hígado procedente de ratón AOX +/+, en una mayor proporción con respecto al sobrenadante. Figura 35: En las 5 primeras calles se cargó una mezcla de sobrenadante de células C57 y mitocondrias +/+ de hígado, incubadas a 37 oC a diferentes tiempos. En las 4 últimas calles se hizo lo mismo pero con sobrenadante de células AOX +/+. El resultado se muestra en la Figura 35, en las cinco primeras calles (sobrenadante C57-AOX) se observa una degradación de todas las bandas y en mayor medida de la banda intermedia a 37 oC, temperatura a la que actúan las proteasas, al incubar las muestras de sobrenadante con mitocondrias +/+ de hígado. En las calles de la derecha que corresponden a sobrenadante de células AOX +/+ no se detecta ningún efecto de la incubación, quizás porque la fracción mitocondrial de hígado de ratón AOX +/+ estaba aún diluida, y por tanto, las posibles proteasas presentes también. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 51 6. Discusión Ensayos de resistencia a rotenona en células en cultivo. En trabajos anteriores, se había descrito que la xenoexpresión de AOX confiere, a las células en cultivo y a los organismos, resistencia a la toxicidad del cianuro. Asimismo, se ha demostrado que AOX permite transferir electrones de la ubiquinona al oxígeno, rescatando parcialmente mutantes del complejo III y IV, y regulando la producción de ROS en células con defectos mitocondriales [40]. En estudios más recientes, se probó la resistencia de fibroblastos embrionarios de ratón frente a inhibidores de los complejos III y IV. En presencia de antimicina, un inhibidor del complejo III, se vio que las células AOX +/+ conseguían sobrevivir en concentraciones más altas de esta droga que las AOX -/-. Lo mismo se observó en el caso de un inhibidor del complejo IV, en este caso, azida de sodio. En ambos experimentos se obtuvo una LD50 superior para las células que tenían AOX que para las que no lo tenían. Como AOX recibe los electrones del ubiquinol, que se forma por la transferencia de electrones desde los complejos I y II, un inhibidor del complejo I va a afectar por igual a células que tengan AOX, como a las que no lo tengan. En este ensayo se observó que, como se esperaba, la rotenona afectaba por igual a las células +/+ que a las -/-, confirmando que la función de AOX es efectiva para subsanar fallos en los complejos III y IV, pero no para aquellos que afecten a los complejos I y II (Figura 22). Expresión de AOX en distintos tejidos del ratón knock-in para AOX. Con el fin de continuar analizando la expresión de la proteína AOX en los ratones knock-in para AOX, se realizaron experimentos de inmunodetección de dicha proteína en distintos tejidos obtenidos de ratones que expresaban AOX. AOX se expresa en todos los tejidos de ratón analizados, con una mayor expresión en aquellos que requieren un mayor requerimiento energético. Esto se puede deber a que estos tejidos tienen una mayor masa mitocondrial. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 52 Expresión de AOX en machos y hembras del ratón knock-in para AOX. En ensayos anteriores se había estudiado la expresión de AOX en ratones adultos en distintos tejidos, y se había comparado la expresión entre adultos y crías, viendo que en crías la proteína AOX tenía un mayor nivel de expresión. Para seguir con la caracterización del ratón knock-in para AOX se decidió comprobar si existía alguna diferencia en la expresión de la proteína entre ratones machos y hembras. Para comparar la expresión de AOX en ratones machos y hembras se usaron mitocondrias extraídas de hígado y corazón, y se observó que la proteína se expresaba en ambos, dando las tres bandas típicas de AOX. Sin embargo, en hígado se observan más bandas lo que se puede ser debido probablemente a la degradación de la proteína llevada a cabo por las enzimas presentes en este tejido. En ambos casos, vemos una mayor expresión de AOX en machos que en hembras. Una de las hipótesis que se barajaban para explicar este hecho era una posible regulación hormonal del promotor Rosa26, aunque no se han encontrado referencias bibliográficas al respecto. Estos resultados pueden tener relevancia a la hora de ver un posible efecto terapéutico de AOX ya que quizás cabría esperar que fuera más notable en los machos. Degradación de la proteína AOX. En los ensayos de inmunodetección de la proteína AOX realizados en el grupo Genoxphos se observan en todos ellos 3 bandas. La banda de arriba se sabe que corresponde a la proteína sintetizada por los ribosomas en el citosol. Para explicar la naturaleza de las bandas de menor peso molecular se pensó que podían ser resultado del procesamiento de la proteína para ser importada a la mitocondria o de la degradación por enzimas inespecíficas. Pero se observó que la proporción de las bandas inferiores no era siempre la misma en los distintos tejidos, ni en las muestras de un mismo tejido procedentes de distintos ratones y extraídas en diferentes días, ni en una misma muestra de mitocondrias después de estar un tiempo almacenada a -80 oC y ser congelada y descongelada más de una vez. Además, otros grupos obtenían una única banda (la superior) en ensayos de inmunodetección de AOX [41]. Todo esto sugería una degradación por enzimas liberadas durante el proceso de extracción. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 53 Para tratar de averiguar a qué formas de la proteína correspondían las bandas inferiores se realizaron diferentes ensayos de inmunodetección de AOX, de muestras de células C57-AOX y de fibroblastos de ratón AOX +/+. En el primer ensayo (Figura 31) se probó el efecto de inhibidores de proteasas en las distintas fracciones obtenidas durante el proceso de extracción de las mitocondrias de fibroblastos de ratón AOX (apartado 4.5.1.). La fracción de homogenado contiene todas las formas en que AOX se encuentra en la célula: la citosólica y la mitocondrial. La banda superior, como ya se ha dicho, corresponde a la forma citosólica y las dos inferiores podrían corresponder a productos de degradación o a la forma procesada y un producto de proteólisis. También se barajó la hipótesis de que AOX sufriera un doble procesamiento para entrar a la mitocondria. Sin embargo, no se observa un efecto claro en el uso de los inhibidores de proteasas, lo que podría significar que ambas bandas no son producto de la degradación o que son substrato de proteasas no inhibibles por los cócteles comerciales. La fracción de sobrenadante solo contiene la forma de AOX citosólica que, al ser la banda más intensa, concuerda con la teoría de que en el citosol se encuentra la forma de la proteína sin procesar. La presencia de la banda de peso intermedio, aunque sea muy tenue, podría indicar que ésta banda corresponde a un producto de degradación de AOX y la banda de menor tamaño, a la forma procesada. Sin embargo, no se puede concluir del todo esta afirmación, ya que en esta fracción las proteasas son mucho menos abundantes. En la fracción mitocondrial esperaríamos ver solo la forma de la proteína AOX procesada, pero observamos las tres bandas, en un patrón muy similar al obtenido para la muestra de homogenado, aunque la banda de peso inferior parece ser más intensa en la fracción mitocondrial que en la de homogenado. En esta fracción se concentran la mayor cantidad de proteasas, ya que junto con las mitocondrias copurifican los lisosomas, que tienen una gran actividad enzimática. A la vista de estos resultados no se puede descartar ninguna hipótesis. En las dos calles de células C57-AOX, que corresponden a proteína total, sí se observa un efecto en la acción de los inhibidores de proteasas en la banda intermedia, lo que podría sugerir que ésta es resultado de proteólisis. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 54 Para tratar de encontrar un proceso de extracción que minimizara la acción de proteasas se lisaron células C57-AOX con RIPA y con TRIzol y se observó que la segunda banda era mucho más tenue si se usaban inhibidores de proteasas (Figura 32), llegando casi a desaparecer en el caso de las células lisadas con RIPA. Esto, de nuevo, parece indicar el origen proteolítico de la segunda banda. También se observó que no había diferencias significativas en el uso de RIPA o TRIzol. Para tratar de esclarecer los resultados de la Figura 31, se extrajeron mitocondrias de células C57-AOX y fibroblastos AOX +/+ y se guardaron fracciones de homogenado y sobrenadante, como en el caso anterior. En el caso de las células C57-AOX (Figura 33) se observa que la banda inferior es mucho más intensa en las fracciones mitocondriales, lo que refuerza la hipótesis de que sea resultado del procesamiento para su importe a la mitocondria. Además, en las muestras de fibroblastos, esta banda también se observa en ambas fracciones mitocondriales y no en el sobrenadante. Hay que destacar que todas las bandas son más intensas en el caso de las células C57-AOX, ya que éstas sobreexpresan AOX. Aunque la hipótesis del procesamiento había cobrado fuerza en el último ensayo no se podía descartar la hipótesis de la degradación de la proteína por proteasas inespecíficas. Para comprobar si las bandas inferiores eran resultado de la degradación de la proteína por las enzimas presentes en la fracción mitocondrial durante el proceso de extracción, se planteó la realización de un ensayo que consistía en mezclar sobrenadante de células C57-AOX o fibroblastos AOX +/+ con mitocondrias extraídas de células C57 silvestres (Figura 34). Sin embargo, las cantidades usadas para la realización de los ensayos no fueron las adecuadas y no se observó ningún efecto. En este punto la cantidad de muestra era insuficiente para realizar otro western blot. Debido a la falta de tiempo, ya que el proceso de extracción de mitocondrias de células en cultivo requiere de varios días, se decidió realizar el mismo ensayo con mitocondrias de hígado de ratón AOX +/+ (Figura 35), muestra que se encontraba disponible en el laboratorio. Aunque en esta fracción se espera encontrar la forma AOX mitocondrial, la cantidad de mitocondrias era muy pequeña con respecto a la de sobrenadante y se decidió probar así. En las muestras de sobrenadante de C57-AOX se La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 55 observa que, a 37 oC, temperatura a la que las proteasas se encuentran activas, la banda superior desaparece y también en menor medida las de inferior tamaño, reforzando en este caso la hipótesis de la degradación. A la vista de los resultados no podemos descartar ninguna hipótesis y se debe seguir trabajando en esta línea para tratar de encontrar un proceso de extracción y fraccionamiento que disminuya la proteólisis y clarifique esta cuestión. La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Julia Marquina Reglero. Máster en Biología Molecular y Celular. 56 7. Conclusiones. Como resultado de los ensayos de inmunodetección de AOX se puede concluir que:  En el ratón knock-in AOX, la proteína AOX se expresa en todos los tejidos analizados en este estudio, con una mayor presencia en aquellos que requieren de un mayor aporte energético.  En el ratón knock-in AOX, la expresión de AOX es mayor en ratones machos que en hembras, diferencia que no podemos explicar con los datos que contamos hasta ahora.  No hay evidencias claras que demuestren que en el ratón knock-in AOX la proteína AOX sufre el procesamiento del péptido señal en su importe a la mitocondria.  Las bandas de menor tamaño observadas en los ensayos de inmunodetección podrían ser consecuencia de la degradación no específica de la proteína por parte de proteasas, durante el proceso de extracción. Los ensayos de viabilidad con rotenona demostraron que:  Cuando la cadena de transporte de electrones se encuentra bloqueada en el complejo I, AOX no ejerce ningún efecto sobre el transporte de electrones; al contrario de lo que sucedía con los complejos III y IV, validando por tanto la relevancia funcional de esta proteína.