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Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es Proyecto Fin de Carrera Producción de doblehaploides en cebada. Estudios moleculares asociados al albinismo. Autor/es Sandra Allué Durango Director/es y/o ponente Mª Pilar Vallés Brau (EEAD-CSIC) Celia Montaner Otín (Unizar) Título a defender: Ingeniería técnica Agrícola. Trabajo realizado en Aula Dei (EEAA-CSIC). Escuela Politécnica Superior de Huesca Septiembre 2014 RESUMEN Las plantas doblehaploides (DHs) en programas de mejora tiene como ventaja fundamental el permitir acortar el tiempo necesario para la obtención de nuevas variedades. En la actualidad, el método embriogénesis de la microspora mediante el cultivo de anteras o microsporas aisladas es la técnica de producción de DHs con mayor potencialidad. Aunque la cebada se considera una especie modelo en este método, los altos porcentajes de albinismo entre las plantas regeneradas es una limitación para el desarrollo de la técnica. Este Proyecto Fin de Carrera tiene como objetivo general, determinar los mecanismos moleculares asociados al albinismo en las fases iniciales de la embriogénesis de la microspora en cebada, a través del análisis de la expresión de genes asociados funcionalmente con los plástidos. Los estudios se realizaron en la Estación Experimental de Aula Dei (EEAD) (CSIC). Inicialmente se comparó la expresión génica de 67 genes asociados a los plástidos, en hojas albinas y verdes de plantas regeneradas por cultivo de anteras, de tres variedades de cebada que presentaban porcentajes de albinismo muy altos. De este análisis se seleccionaron 12 genes por presentar diferencias consistentes entre las hojas albinas y verdes y 3 genes que permitían diferenciar entre variedades. Se estudiaron los perfiles de expresión de los genes seleccionados en las primeras fases del cultivo de anteras, en dos líneas DHs de una población especialmente diseñada para el estudio genético del albinismo en cebada y en tres variedades con distinto porcentaje de regeneración de plantas albinas. Los resultados obtenidos parecen indicar que, al inicio de la embriogénesis de la microspora, las estructuras que regeneran plantas albinas expresan más tarde los genes asociados con el desarrollo de plástidos y la síntesis de almidón. Sin embargo, expresan antes, genes relacionados con la edición de RNA y traducción. Estos resultados parecen indicar que en los materiales albinos se produce una descoordinación entre distintos mecanismos moleculares relacionados con los plástidos y que esta descoordinación podría ser la causante del albinismo en el cultivo de anteras de cebada. SUMMARY The doubled haploid (DHs) plants in breeding programs has the great advantage that shortens the time required to develop new varieties. Currently, microspore embryogenesis through anther or isolated microspore culture is the most promising method for DHs production. Although barley is considered a model species in this method, the high level of albinism among the regenerated plants is a constraint to the full development of the technique. The general objective of this Final Year Project is to define the molecular mechanisms associated with albinism in early stages of barley microspore embryogenesis, by expression analysis of genes functionally associated with plastids. The studies were conducted at the Experimental Station of Aula Dei (EEAD) (CSIC). Initially, gene expression of 67 genes was compared in albino and green leaves of plants obtained by anther culture in three barley varieties exhibiting high rates of albinism. From this analysis, 12 genes that showed consistent differences between albino and green leaves and 3 genes that could differentiate varieties were selected. Expression profiles of selected genes in early stages of anther culture in two DHs lines specially designed for a genetic study of albinism and three varieties with different percentage of albinism were studied. The results suggest that in the earliest stages of microspore embryogenesis, albino structures begin later the expression of genes associated with plastid development and starch synthesis. However they expressed genes associated with RNA editing and translation earlier than green structures These results also suggest that in the albino structures an uncoordinated among different molecular mechanisms associated with plastids occurs, and that this lack of coordination may be the cause of albinism in barley anther culture. ÍNDICES Índices II ÍNDICE 1.- INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1 1.1.- Aspectos generales de la cebada (Hordeum vulgare L.). ................................. 2 1.2.- Importancia de las plantas doblehaploides (DHs) en mejora. ........................... 4 1.2.1.- Métodos de producción de plantas DHs. .................................................. 5 1.3.- Producción de plantas DHs mediante embriogénesis de la microspora. ........... 7 1.4.- Factores que afectan a la embriogénesis de la microspora. ............................. 8 1.4.1.- Genotipo. .................................................................................................. 8 1.4.2.- Estado fisiológico de las plantas donantes. ............................................... 9 1.4.3.- Estado de desarrollo de las microsporas. ................................................. 9 1.4.4.- Pretratamiento de estrés. .......................................................................... 9 1.4.5.- Composición de los medios de cultivo. ................................................... 10 1.5.- Albinismo. ...................................................................................................... 10 1.5.1.- Aspectos generales de los cloroplastos. ................................................. 10 1.5.2.- Cambios morfológicos en los plástidos de las plantas albinas. ............... 11 1.5.3.- Genoma del plástido. .............................................................................. 12 1.5.4.- Genoma nuclear. .................................................................................... 13 1.5.5.- Factores fisiológicos. .............................................................................. 14 2.- OBJETIVOS .......................................................................................................... 15 3.- MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 17 3.1.- Material vegetal. ............................................................................................. 18 3.1.1.- Genotipos utilizados. .............................................................................. 18 3.2.- Genes analizados. ......................................................................................... 19 3.3.- Estudios de expresión génica. ........................................................................ 21 3.3.1.- Recogida de muestras. ........................................................................... 21 3.3.2.- Aislamiento de RNA. ............................................................................... 22 3.3.2.1.- Homogeneización de las muestras. ................................................. 22 3.3.2.2.- Extracción de RNA mediante Trizol. ................................................ 23 3.3.3.- Síntesis de cDNA. ................................................................................... 27 3.3.3.1.- Tratamiento con DNAsa I. ............................................................... 27 3.3.3.2.- Limpieza del RNARNeasy MinElute Cleanup Kit. .......................... 27 3.3.3.3.- Síntesis de la cadena de cDNA. ...................................................... 28 Índices III 3.3.4.- Amplificación de genes mediante PCR-Semicuantitativa. ....................... 29 3.3.4.1.- Diseños de cebadores. .................................................................... 29 3.3.4.2.- PCR-Semicuantitativa. .................................................................... 33 3.3.5.- Amplificación de genes mediante PCR-Cuantitativa o en tiempo real. .... 37 3.3.5.1.- Diseño de Cebadores. ..................................................................... 37 3.3.5.2.- PCR-Cuantitativa. ........................................................................... 38 4.- RESULTADOS ...................................................................................................... 43 4.1.- Caracterización de los genes seleccionados para este estudio. ..................... 44 4.2.- Comparación de la expresión génica entre hojas albinas y verdes de plantas obtenidas en cultivo de anteras. ............................................................................. 48 4.2.1.- Comparación de los perfiles de expresión génica en cultivo de anteras de las líneas DH6148 y DH6183. ............................................................................ 51 4.2.2.- Comparación de los perfiles de expresión génica en cultivo de anteras de las variedades Orelie, Volley y Riviera. .............................................................. 56 4.3.- Análisis de la expresión de los genes candidatos mediante PCRCuantitativa. ............................................................................................................................... 61 4.3.1.- Establecimiento de las condiciones para PCRCuantitativa. .................. 62 4.3.2.- Determinación de los niveles de expresión de los genes RHB1A y HvALB5 en las primeras fases de cultivo de anteras. ............................................. 65 5.- DISCUSIÓN ........................................................................................................... 70 6.- CONCLUSIONES .................................................................................................. 83 7.- BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 86 8.- ANEXO I ................................................................................................................ 98 9.- ANEXO II ............................................................................................................. 103 Índices IV ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.- Distribución de la superficie (Mha) y de la producción (Mt) de cereales por cultivos en España. Campaña 2012/2013. Fuente: Secretaría General Técnica del MAGRAMA (Avances de superficies y producciones de cultivos). ................................ 2 Figura 2.- Morfología de una espiguilla (imagen de la izquierda) y de una flor de cebada. Adaptada de http://www.uc.cl/. ........................................................................ 4 Figura 3.- Métodos de producción de plantas haploides (adaptada de Forster y col. 2007): embriogénesis de la microspora o androgénesis a partir de anteras o microsporas cultivadas in vitro; ginogénesis a partir de óvulos u ovarios cultivados in vitro; cruzamiento interespecífico o intergenético por fertilización de un óvulo con el polen de otras especies o por partenogénesis mediante la fertización con polen irradiado. ....................................................................................................................... 6 Figura 4.- Estructura de un cloroplasto. Adaptada de http://www.uc.cl/. ..................... 11 Figura 5.- Pasos seguidos para los análisis de expresión génica. .............................. 21 Figura 6.- Recogida de muestras: a) Recogida de anteras en cultivo; b) Congelación de las muestras con N2 líquido y c) Muestra congelada en N2 líquido en un tubo Eppendorf de 1,5ml. ................................................................................................... 22 Figura 7.- Homogeneización de muestras mediante el Molino Mezclador MM 301 RETSCH: a) Kit criogénico con bloques criogénicos y unas pinzas para manipular los bloques en N2 líquido; b) Tubos Eppendorf de 1,5ml con las muestras y bolitas de acero para facilitar la homogeneización; c) Tubos con las muestras dentro de los bloques criogénicos en N2 líquido; d) Acoplado de los bloques criogénicos al molino y e) Agitación de los bloques en el molino a 1800rpm durante 2min. ............................. 23 Figura 8.- Extracción de RNA mediante Trizol®: a) Tratamiento de las muestras con Trizol® en la campana de extracción de gases; b) Incubación de las muestras en bloque seco durante 5min a 60ºC y c) Separación de la fase superior hidrosoluble que contiene el RNA. ......................................................................................................... 24 Índices V Figura 9.- Resultado de la separación de fases en la extracción de RNA mediante Trizol® (Hernández y col. 1994) ................................................................................. 25 Figura 10.- El equipo Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) se empleó para cuantificar el RNA en cada muestra. ................................................................................................ 26 Figura 11.- Comprobación del estado de RNA mediante electroforesis en gel de agarosa. Visualización mediante bromuro de etidio y luz ultravioleta. ......................... 27 Figura 12.- Limpieza del RNA con el RNeasy MinElute Cleanup Kit: a) RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) de Quiagen; b) Columna que contiene una membrana de sílice para retener el RNA; c) Aplicación de las muestras a las columnas y d) Centrifugación de las muestras para que pasen a través de la membrana de la columna. ..................................................................................................................... 28 Figura 13.- Condiciones y equipamiento para la técnica PCR Semicuantitativa; a) Cabina de flujo laminar vertical para evitar contaminaciones de DNA externo; b) Material estéril utilizado; c) Tiras de 8 tubos de 0,2ml donde se desarrollan las reacciones y d) El termociclador utilizado para la amplificación de DNA. .................... 35 Figura 14.- Representación de las 3 etapas de un ciclo de amplificación. Fuente: www.aulavirtual-exactas.dyndns.org/ .......................................................................... 36 Figura 15.- Visualización de los productos de amplificación en geles de agarosa: a) Mezcla de la muestra con el buffer SB en un trozo de papel Parafilm; b) Introducción de 15µl de la mezcla, en los pocillos del gel de agarosa; c) La electroforesis se efectúa a 80V durante 1h y 20min y d) Gel-Doc de Bio-Rad con luz ultravioleta, para la visualización del producto amplificado. ....................................................................... 37 Figura 16.- Gráfica de amplificación en PCR-Cuantitativa. El eje vertical representa la cantidad de fluorescencia normalizada y el eje horizontal el número de ciclos. La Baseline o linea base se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios detectables en la cantidad de fluorescencia y solo se detecta la fluorescencia basal. Threshold es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia y el corte entre el Threshold y la curva de amplificacion determina el CT o Índices VI ciclo umbral que se emplea para la cuantificación de la expresión génica. Fuente: Applied Biosystems..................................................................................................... 39 Figura 17.- Procedimiento de la técnica PCR-Cuantitativa: a) Placas específicas para PCR-Cuantitativa y b) Termociclador de PCR-Cuantitativa. ........................................ 40 Figura 18.- Análisis de expresión de los 15 genes seleccionados, mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa, en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Se empleó como gen constitutivo Hv-Actin2. ................................................................................................ 50 Figura 19.- Perfiles de expresión de los 5 genes relacionados con la fotosíntesis, analizados mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo Hv-Actin2. ........................................................................... 52 Figura 20.- Perfiles de expresión de los genes relacionados con la respuesta al estrés, analizados mediante PCR-Semicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo Hv-Actin2. ........................................................................... 53 Figura 21.- Perfiles de expresión de los 7 genes relacionados con la expresión génica en plástidos, analizados mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos Índices XIII ÍNDICE DE ABREVIATURAS bp: pares de bases BrEt: Bromuro de etidio ºC: grado centígrado cDNA: DNA copia cm: centímetros CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas dc: días de cultivo DEPC: dietilpirocarbonato. DH: doblehaploide DNA: ácido desoxirribonucleico DNAsa: desoxirribonucleasa dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato dp: días de pretratamiento e-value: “Expectation value” EEAA: Estación Experimental de Aula Dei FAO: Food and Agriculture Organization FAOSTAT: FAO Statistical database FHGI: medio de inducción de embriogénesis de cebada FHGR: medio de regeneración de cebada. h: horas ha: hectáreas H2O: agua Kg: Kilogramo Kpb: kilopares de bases M: molar mg: miligramo Mha: miles de hectareas min: minutos ml: mililitros mM: milimolar mRNA: ácido ribonucleico mensajero MSU: “Rice Genome Annotation Project Database and Resource” Mt: miles de toneladas N2: nitrógeno líquido PCR: reacción en cadena de la polimerasa QTLs: Quantitative Trait Loci RNA: ácido ribonucleico rpm: revoluciones por minuto RT: transcriptasa reversa RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real s: segundo t: tonelada Tª: temperatura TAIR: “Arabidopsis Information Resource TAQ: “Themus aquaticus polymerase” Índices XIV TET: medio de tratamiento de cebada Tm: temperatura fusión V: voltios W: waltios µE: microEinstein µg: microgramo µl: microlitro µM: micromolar µm: micra Ø: diámetro 1.- INTRODUCCIÓN Introducción 2 1.1.- Aspectos generales de la cebada (Hordeum vulgare L.). La cebada (Hordeum vulgare L.) es un cereal que tiene gran importancia ya que ocupa el cuarto lugar a escala mundial en cuanto a superficie cultivada y a producción después del trigo, arroz y maíz. Su cultivo, como ocurre con otros cereales, se distribuye por prácticamente todo el mundo, siendo Rusia el país con mayor superficie seguido de Ucrania, Australia, Turquía y España (FAOSTATS 2012). En España, la cebada es el cereal más cultivado y el de mayor producción (Figura 1), seguido del trigo y del maíz. Figura 1.- Distribución de la superficie (Mha) y de la producción (Mt) de cereales por cultivos en España. Campaña 2012/2013. Fuente: Secretaría General Técnica del MAGRAMA (Avances de superficies y producciones de cultivos). La cebada se produce en prácticamente toda la geografía nacional, destacando por su importancia las comunidades de Castilla y León, Castilla-La Mancha y Aragón (Tabla 1). Introducción 3 Tabla 1.- Análisis por comunidades autónomas en 2011 de superficie (ha) y producción (t) según los tipos de cebada. Fuente: MAGRAMA. Anuario de estadística agraria de España 2012. Comunidades Autónomas Cebada de 2 carreras Cebada de 6 carreras Superficie (hectáreas) Producción (toneladas) Superficie (hectáreas) Producción (toneladas) Galicia 238 467 – – Cantabria – – 281 368 País Vasco 14.407 82.840 – – Navarra 87.968 – – 327.248 La Rioja 13.762 52.409 – – Aragón 376.452 1.038.759 40.624 133.667 Cataluña 150.417 482.304 14.835 42.912 Baleares 7.073 18.426 10.610 27.639 Castilla y León 851.547 2.850.592 88.812 270.601 Madrid 38.954 133.587 451 1.108 Castilla– La Mancha 630.781 1.881.566 172.645 501.541 Comunidad Valenciana 12.566 30.589 3.242 9.994 Región de Murcia 7.377 9.150 19.885 22.185 Extremadura 52.711 100.967 1.852 2.746 Andalucía 45.723 105.402 57.384 159.924 Canarias – – 82 82 La cebada es una planta monocotiledónea, fundamentalmente autógama, que pertenece a la familia de las Poaceae (Gramineae). La mayoría de las especies de Hordeum son diploides (2n=2x=14), aunque algunas son tetraploides (2n=4x=28) y hexaploides (2n=6x=42). Los cromosomas de cada genomio se clasifican en 7 grupos de homeología. La parte aérea de este cereal está compuesta por tallos que parten del nudo de ahijamiento. Cada tallo está formado por una serie de nudos, separados por entrenudos, de donde nacen las hojas. Las hojas constan de dos partes: el limbo y la vaina que envuelven al tallo. La inflorescencia de la cebada es una espiga compuesta por un eje o raquis, donde se insertan las espiguillas en posición alterna. Cada espiguilla está envuelta en dos brácteas o glumas (Figura 2). Dentro de ella, hay una flor cubierta por dos glumillas, inferior y superior, denominadas lema y pálea. Cada flor tiene tres estambres, un pistilo compuesto por un ovario y un estigma bífido (Figura 2). Introducción 4 Figura 2.- Morfología de una espiguilla (imagen de la izquierda) y de una flor de cebada. Adaptada de http://www.uc.cl/. Si todas las espiguillas son fértiles, la cebada se denomina de seis carreras (6C), si solo las espiguillas centrales son fértiles, la cebada se denomina de dos carreras (2C). Esta gramínea se cultiva en una gran variedad de ambientes, más que ningún otro cereal, porque se adapta bien a las condiciones marginales de clima y suelo. La mayoría de la cebada que se produce se emplea para alimentación de ganado bovino, porcino y aves de corral. También se utiliza para el malteado en la elaboración de cerveza y otras bebidas alcohólicas. Recientemente ha aumentado su uso en alimentación humana. Además del grano como producto principal, se aprovecha también la paja como fuente de celulosa en ración para los rumiantes y para cama del ganado. 1.2.- Importancia de las plantas doblehaploides (DHs) en mejora. La producción y calidad del grano en cebada ha ido mejorando en las últimas décadas por el desarrollo de programas de mejora que han aplicado métodos de mejora tradicional, como el método masal, genealógico o por retrocruzamientos (Sánchez-Monge 1974). La introducción de las técnicas biotecnológicas y los avances en biología molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas en la mejora vegetal, entre éstas, la producción de doblehaploides (DHs). Introducción 5 Las plantas haploides se definen como esporofitos cuya dotación cromosómica es la gamética (Kasha 2005). Estas plantas haploides son estériles y para conseguir la fertilidad es necesaria una duplicación cromosómica. Así, las plantas DHs son aquellas que se obtienen mediante la duplicación cromosómica, espontánea o mediante inducción química, de las plantas haploides. Por lo tanto, son plantas totalmente homocigóticas en todos los loci y completamente fértiles. Mientras que mediante los métodos tradicionales de mejora se consigue la homocigósis tras sucesivas generaciones de autofecundación, en la producción de plantas DHs se alcanza la homocigósis en solo una generación (Kasha 2005). Por tanto, este método permite acortar el tiempo necesario para la obtención de nuevas variedades en unos 4 a 6 años (Snape y col. 1986, Thomas y col. 2003). La combinación de la producción de DHs con la selección asistida por marcadores moleculares constituye una herramienta muy poderosa para la obtención de nuevas variedades. Una población DH a partir de una F1 de un cruzamiento es también un material ideal para el mapado genético, ya que ha sufrido solo una ronda de recombinación y por lo tanto muestra una expresión máxima de las relaciones de ligamento (Forster y Powell 1997). Los DHs son también especialmente útiles para estudios genéticos, análisis de QTLs (“Quantitative Trait Loci”) y en combinación con mutagénesis y transformación (Szarejko 2003, Forster y Thomas 2003, Devaux y Pickering 2005, Forster y Thomas 2005). 1.2.1.- Métodos de producción de plantas DHs. Aunque hay más de cien especies vegetales que son capaces de producir haploides de forma espontánea, estos se producen en una frecuencia muy baja (0,001 -0,01%) (Palmer y Keller 2005) como para que puedan usarse en los programas de mejora. Por ello, se han puesto a punto diversos métodos para la producción de forma más eficiente de haploides y tras una duplicación cromosómica se obtengan plantas DHs. En la figura 3 se muestra los métodos para la producción de haploides más efectivos en la actualidad. Introducción 6 Figura 3.- Métodos de producción de plantas haploides (adaptada de Forster y col. 2007): embriogénesis de la microspora o androgénesis a partir de anteras o microsporas cultivadas in vitro; ginogénesis a partir de óvulos u ovarios cultivados in vitro; cruzamiento interespecífico o intergenético por fertilización de un óvulo con el polen de otras especies o por partenogénesis mediante la fertización con polen irradiado. El método de embriogénesis de la microspora o androgénesis se basa en la capacidad que tienen las microsporas (espora masculina que se divide por mitosis para producir un grano de polen, gameto masculino), de cambiar su patrón de desarrollo de la vía gametofítica a la vía esporofítica, para dar lugar a un embrión. Esto se logra mediante el cultivo de anteras o de microsporas aisladas (Maluszynski y col. 2003a). La ginogénesis in vitro se lleva a cabo mediante el cultivo de ovarios o flores completas. Los embriones se forman a partir de alguna de las células haploides del saco embrionario. En la actualidad es la técnica menos empleada debido a su baja eficiencia, aunque se pueden obtener plantas DHs en especies que no responden a tratamientos más eficientes, como en Allium cepa L. En el método cruzamiento interespecífico o intergenético, tras la fertilización y durante la embriogénesis temprana, una dotación cromosómica de un parental es eliminada, generalmente del polinizador (Jensen 1977, MujeebKazi y RieraLizarazu 1996). En el caso de la cebada, el cruzamiento interespecífico se realiza con Hordeum bulbusum L., un pariente silvestre (Maluszynski y col. 2003a). La partenogénesis fue uno de los primeros métodos utilizados y está basado en la formación de un embrión a partir de la ovocélula sin la intervención del gameto Introducción 7 masculino. Este método puede ser inducido artificialmente, mediante polen irradiado o inactivo, por tratamientos físicos o químicos. Actualmente se utiliza en especies como Cucumis melo L. y Cucumis sativus L. (Claveria y col. 2005). En cebada los métodos de producción más utilizados son el cruzamiento interespecífico o intergenético y la embriogénesis de la microspora. Ambos han dado lugar al registro de un elevado número de nuevas variedades (Thomas y col. 2003). 1.3.- Producción de plantas DHs mediante embriogénesis de la microspora. La embriogénesis de la microspora o androgénesis es el proceso mediante el cual una microspora, tras un tratamiento de estrés, es capaz de cambiar su patrón de desarrollo de la vía gametofítica a la vía esporofítica, formando un embrión haploide que da lugar, después de la duplicación, a una planta completa homocigótica y fértil. La embriogénesis de la microspora se puede conseguir mediante el cultivo de anteras o mediante el cultivo de microsporas aisladas. Desde que Guha y Maheshwari (1964 y 1966) consiguieron la inducción de este proceso in vitro en la planta solanácea Datura innoxia P.Mill, se han realizado enormes esfuerzos para inducir la androgénesis en un buen número de especies. Nicotiana tabacum L. y Brassica napus L. son las especies que se usan como modelo para el estudio de la embriogénesis de la microspora, debido a la facilidad con la que se produce en ellas y al alto rendimiento que se obtiene. Aunque en general los cereales responden mal a los sistemas de producción de DHs in vitro, en la actualidad, gracias a los avances metodológicos, se han obtenido en algunas especies frecuencias de producción equivalentes a las de algunas dicotiledóneas (Kasha y col. 1990). En cebada se ha incrementado considerablemente la eficiencia del proceso mediante cambios en la composición de los medios y en las condiciones de cultivo (Cistué y col. 1994, 1995 y 1999, Castillo y col. 2000), siendo considerada una especie modelo para el estudio de la embriogénesis de la microspora en monocotiledóneas. En el Departamento de Genética y Producción Vegetal de la EEAD-CSIC se ha desarrollado un método eficiente de producción de plantas DHs de cebada mediante la embriogénesis de la microspora, utilizando el cultivo de anteras (Cistué y col. 2003) (Anexo I). En este método, las anteras con las microsporas en estado uninucleado se Introducción 8 someten a un tratamiento de estrés al incubarlas en un medio con manitol. A continuación, las anteras tratadas se inoculan en un medio de cultivo donde las microsporas empiezan a dividirse por la vía esporofítica. Las microsporas pueden dar lugar a formaciones de tipo callo o embriones. Los embriones bien diferenciados son transferidos a un medio de regeneración para conseguir plántulas. Aunque las plantas resultantes deberían ser haploides y por tanto estériles, en cebada se dan unos porcentajes muy altos de duplicación espontánea y por tanto se obtienen plantas fértiles completamente homocigotas. 1.4.- Factores que afectan a la embriogénesis de la microspora. La eficiencia del proceso de producción de plantas DHs mediante androgénesis depende: del número de microsporas que se dividen (inducción); del número de embriones formados (embriogénesis); de su capacidad de regeneración (regeneración); de los porcentajes de plantas albinas (albinismo) y de la capacidad de duplicación cromosómica. Estas variables se ven afectadas por un gran número de factores. 1.4.1.- Genotipo. El genotipo es el factor con mayor influencia sobre la frecuencia de embriogénesis, de regeneración y sobre el porcentaje de plantas verdes (Moieni y col. 1997, Holme y col. 1999, Forster y Thomas 2005). Se ha observado que el efecto recíproco para estos caracteres es muy pequeño o inexistente, por lo que se concluye que son caracteres que se transmiten mediante genes nucleares (Tuvesson y col. 1989). Se han identificado QTLs asociados a distintos caracteres en la producción de DHs, como el porcentaje de embriogénesis y producción de plantas verdes. En un trabajo realizado por el Departamento de Genética y Producción Vegetal (EEADCSIC) identificaron QTLs para el porcentaje de embriogénesis en la región del locus vrs1 del cromosoma 2H y en el cromosoma 6H para número de embriones. Para el número de plantas verdes se identificaron QTLs en los cromosomas 3H, 5H y 6H, y para el porcentaje de plantas albinas en 3H y 5H (Chen y col. 2007, MuñozAmatriaín y col. 2008). 2.- OBJETIVOS Objetivos 16 El objetivo principal de este trabajo es determinar los mecanismos moleculares asociados al albinismo en las fases iniciales de la embriogénesis de la microspora en cebada. Se han utilizado tres colecciones diferentes de genes y de muestras para lograr los siguientes objetivos específicos: 1. Identificación de genes asociados al albinismo en hoja de plantas regeneradas de cultivo de anteras de variedades con alto porcentaje de albinismo. 2. Identificación de genes asociados al albinismo en las primeras fases de cultivo de anteras de las líneas DHs de cebada DH6148 y DH6183 con distinto porcentaje de albinismo. 3. Identificación de genes asociados al albinismo en las primeras fases de cultivo de anteras en variedades con alto y bajo porcentaje de albinismo. 3.- MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 18 3.1.- Material vegetal. 3.1.1.- Genotipos utilizados. Se seleccionaron las líneas doblehaploides DH6148 y DH6183 de una población obtenida previamente en el grupo de trabajo, a partir del cruzamiento Igri x DH46. El cultivar de invierno Igri presenta muy buena respuesta al cultivo de anteras y un porcentaje de albinismo bajo, por ello se considera una variedad modelo para la embriogénesis de la microspora en cebada. La línea DH46 se obtuvo del cruzamiento Igri x Dobla (Chen y col. 2007) y presenta una buena respuesta al cultivo de anteras, pero un porcentaje muy alto de albinismo (MuñozAmatriaín y col. 2008). Las líneas DH6148 y DH6183 son por tanto líneas casi isogénicas que se diferencian, en el alto porcentaje de embriogénesis (%EMB) y bajo porcentaje de albinismo (%ALB) de la línea DH6148 frente al bajo porcentaje de embriogénesis (%EMB) y alto porcentaje de albinismo (%ALB) de la línea DH6183 (Tabla 3). Tabla 3.- Características de la respuesta del cultivo de anteras de las líneas DH6148 y DH6183. En la tabla se representa: (nAR) número de anteras que responden a la inducción/100 anteras inoculadas; (nDIV) número de divisiones/100 anteras inoculadas; (nEMB) número de embriones/100 anteras inoculadas; (%EMB) (nEMB/ nDIV)x100; (nPV) número de plantas verdes/100 anteras inoculadas; (nPA) número de plantas albinas/100 anteras inoculadas y (%REG) (nPV+nPA/ nEMB)x100 y (%ALB) (nPA/ (nPV+ nPA))x100. Genotipo nAR nDIV nEMB %EMB nPV nPA %REG %ALB DH6148 87,50 2165,83 465,83 21,50 363,33 15,83 81,39 4,17 DH6183 81,67 2646,67 171,67 6,49 6,67 46,67 31,07 87,49 También se utilizaron para este estudio, distintas variedades comerciales de cebada con alto valor agronómico. Las variedades seleccionadas fueron Vanessa, Orelie y Volley como variedades de 2C y de invierno; Static y Riviera como variedades de 2C y de primavera y Siberia como variedad de 6C y de invierno. La mejor respuesta al cultivo de anteras la presentaba la variedad Orelie con 220,92 plantas verdes por 100 anteras sembradas (nPV) (Tabla 4). En las otras variedades, el número de plantas verdes estaba condicionado por una parte por la baja respuesta, como en Volley con 85,97 embriones y 31,82 plantas verdes por 100 anteras sembradas, o bien por el albinismo como en las variedades Vanessa, Siberia, Static y Riviera, que siendo buenas en sus respuestas generales al cultivo de anteras presentaban altos Material y métodos 19 porcentajes de albinismo (100%, 93,01%, 90,26% y 92,59% respectivamente) (Tabla 4). Tabla 4.- Características de la respuesta del cultivo de anteras de las variedades de importancia agronómica: Vanessa, Siberia, Static, Orelie, Volley y Riviera. En la tabla se representa: (nAR) número de anteras que responden a la inducción/100 anteras inoculadas; (nDIV) número de divisiones/100 anteras inoculadas; (nEMB) número de embriones/100 anteras inoculadas; (%EMB) (nEMB/ nDIV)x100; (nPV) número de plantas verdes/100 anteras inoculadas; (nPA) número de plantas albinas/100 anteras inoculadas; (%REG) (nPV+nPA/ nEMB)x100 y (%ALB) (nPA / (nPV+ nPA))x100. Variedad nAR nDIV nEMB %EMB nPV nPA %REG %ALB Vanessa 49,72 2098,47 232,22 11,07 0 66,52 28,65 100,00 Siberia 65,77 2614,72 182,61 6,98 6,45 85,77 50,50 93,01 Static 79,54 1578,83 219,44 13,90 11,13 103,09 52,05 90,26 Orelie 98,12 3869,21 393,66 10,17 220,92 6,53 57,78 2,87 Volley 47,53 984,41 85,97 8,73 31,82 0 37,01 0 Riviera 78,75 2936,25 305,00 10,39 7,50 93,75 33,20 92,59 3.2.- Genes analizados. Para este trabajo se han utilizado tres colecciones de genes (Tabla 5). Dos de ellas derivan de trabajos previos del grupo: (EM) Colección de genes inducidos en las primeras fases de la embriogénesis de la microspora, y que mediante la categorización funcional en TAIR (The Arabidopsis Information Resource), utilizando las homologías de secuencia en Arabidopsis, se asociaron al componente celular plastídico (Vallés y col., resultados no publicados) y (QTL-Alb) colección de genes asociados a plástidos que han sido mapados en regiones cromosómicas, donde se había localizado algún QTLs de albinismo en cultivo de anteras (QTL-Alb) (Muñoz-Amatriain y col. 2008). La tercera colección se seleccionó del trabajo publicado por Svensson y col. (2006), en el que se estudiaba la relación entre los cloroplastos y la respuesta al estrés por frío. Los genes seleccionados permitían diferenciar entre distintos tipos de mutantes albinos de cebada (M-Alb). Material y métodos 20 Tabla 5.- Colecciones de genes seleccionadas para el estudio de los mecanismos moleculares asociados a albinismo: (EM) seleccionados en embriogénesis de la microspora; (QTL-Alb) mapados en regiones cromosómicas asociadas a albinismo y (M-Alb) asociados a mutantes albinos de cebada. El código para nombrar los genes es el correspondiente al “Barley1 GeneChip” (Affymetrix). EM QTLAlb M-Alb Contig11738_at Contig4499_s_at HV_CEb0002J23r2_s_at Contig1314_s_at Contig2515_at Contig2742_at Contig13277_at Contig7192_at Contig7944_at Contig14691_at Contig7090_s_at Contig12692_s_at Contig14780_at Contig2278_at Contig10615_at Contig16148_at Contig6276_s_at Contig9813_at Contig16389_at Contig12110_s_at Contig1800_at Contig16595_at Contig4021_at Contig4811_s_at Contig17155_at Contig9559_at Contig2721_at Contig17319_at Contig4586_at Contig418_at Contig19088_at Contig4470_s_at Contig5059_s_at Contig2243_s_at Contig6695_at Contig14378_at Contig23344_at Contig11071_at HV09F14u_at Contig23926_at Contig8361_at Contig3221_at Contig24791_at SNP 6170-304 Contig828_s_at Contig24914_at Contig6598_at Contig19438_at Contig25153_at Contig9219_at Contig13481_at Contig26034_at Contig2992_s_at Contig4380_s_at Contig9152_at Contig5004_at Contig12724_at Contig5708_at Contig6640_at Contig6817_at Contig7509_at Contig8790_at Contig9121_at Contig938_s_at Contig9412_s_at HVSMEb0007O01f_at HVSMEm0013I03r2_at Para asignar una funcionalidad a los distintos genes seleccionados se determinó las homologías de secuencia de estos genes utilizando la información Material y métodos 21 recogida en distintas bases de datos, como UniProt de carácter general, MSU de arroz y TAIR de Arabidopsis, mediante el programa HarvEST Barley v.1.74. El criterio de similitud de secuencia fue de 9, en una escala de 1 a 11. 3.3.- Estudios de expresión génica. Para los estudios de expresión génica fue necesario realizar distintos pasos, desde la recogida del material vegetal hasta la amplificación de genes concretos. Estos pasos se resumen en la siguiente figura (Figura 5). Figura 5.- Pasos seguidos para los análisis de expresión génica. 3.3.1.- Recogida de muestras. Para este trabajo se tomaron tres colecciones de muestras. La primera estaba compuesta de muestras de hoja albina (A) y hoja verde (V) de plántulas obtenidas mediante cultivo de anteras de las variedades Vanessa, Siberia y Static. Las otras colecciones se tomaron durante las primeras fases de la embriogénesis de la microspora en dos materiales distintos: una colección comprendía muestras de anteras de las líneas DH6148 y DH6183 antes del tratamiento de estrés (0dp), después de 4 días de inducción por estrés (4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc, 16dc), y la otra comprendía muestras de anteras de las variedades Orelie, Volley y Riviera antes del tratamiento de estrés (0dp), después de 4 días de inducción por estrés (4dp) y a los 4 y 10 días de cultivo de anteras (4dc, 10dc). Material y métodos 22 Para cada una de las muestras de los distintos estadios de cultivo de anteras se tomaron 400500 anteras. Para las muestras de hoja se tomaron 100mg de tejido. Todas las muestras se congelaron en N2 líquido en tubos Eppendorf de 1,5ml y se conservaron a -80ºC (Figura 6.a, b y c). Figura 6.- Recogida de muestras: a) Recogida de anteras en cultivo; b) Congelación de las muestras con N2 líquido y c) Muestra congelada en N2 líquido en un tubo Eppendorf de 1,5ml. 3.3.2.- Aislamiento de RNA. Para evitar la degradación del RNA por las Ribonucleasas (RNasas) es necesario seguir una serie de recomendaciones generales como la utilización de guantes, la esterilización del material mediante autoclave (40min a 120ºC y 1Kg/cm2) y utilizar soluciones libres de RNasas mediante el tratamiento del H2O con DEPC (dietilpirocarbonato 97% NMR) al 1‰ (v/v) durante 2h. 3.3.2.1.- Homogeneización de las muestras. Para homogeneizar los tejidos se utilizó el Molino Mezclador MM 301 RETSCH con el Kit criogénico (Figura 7.a). A cada tubo que contenía las muestras congeladas a -80ºC, se añadieron tres bolitas de acero inoxidable para facilitar la rotura de los tejidos (Figura 7.b). Los tubos se colocaron en un bloque criogénico que se mantuvo sumergido en N2 líquido (Figura 7.c) para mantener la integridad de las muestras a baja temperatura (–196°C) y evitar la acción de las RNasas. Material y métodos 23 Los bloques se acoplaron al molino (Figura 7.d) y las muestras se trituraron durante 2min a 1.800rpm (Figura 7.e). Al finalizar el proceso, los bloques criogénicos se mantuvieron de nuevo en N2 líquido. Figura 7.- Homogeneización de muestras mediante el Molino Mezclador MM 301 RETSCH: a) Kit criogénico con bloques criogénicos y unas pinzas para manipular los bloques en N2 líquido; b) Tubos Eppendorf de 1,5ml con las muestras y bolitas de acero para facilitar la homogeneización; c) Tubos con las muestras dentro de los bloques criogénicos en N2 líquido; d) Acoplado de los bloques criogénicos al molino y e) Agitación de los bloques en el molino a 1800rpm durante 2min. 3.3.2.2.- Extracción de RNA mediante Trizol. Para la extracción de RNA se siguió el procedimiento que utiliza como reactivo básico el Trizol® (Invitrogen). Esta técnica permite la disociación de proteínas y la eliminación de los componentes no hidrosolubles mediante una separación de fases con distinta solubilidad. Se siguieron las indicaciones de la casa comercial. En una campana de extracción de gases, a cada tubo Eppendorf con muestra molida se agregaron 500µl de Trizol® y se agitó suavemente por inversión (Figura 8.a). Las muestras se incubaron en un bloque seco (AccuBlock Digital Dry Bath de Labnet) durante 5min a 60ºC, para permitir la completa disolución de los complejos nucleoproteicos (Figura 8.b). Material y métodos 24 Figura 8.- Extracción de RNA mediante Trizol®: a) Tratamiento de las muestras con Trizol® en la campana de extracción de gases; b) Incubación de las muestras en bloque seco durante 5min a 60ºC y c) Separación de la fase superior hidrosoluble que contiene el RNA. A continuación, se realizaron los siguientes pasos: - Separación de fases: De nuevo en la campana de extracción de gases se añadieron 100µl de cloroformo y se agitaron fuertemente los tubos durante 15s. Se incubaron 3min a temperatura ambiente y posteriormente se centrifugaron a 12.000rpm en la centrífuga Biofuge Primo R de Heraeus a 4ºC durante 15min. Después de la centrifugación se distinguieron dos fases (Figura 8.c y 9): una fase inferior que contiene lípidos y proteínas solubles en disoluciones orgánicas y restos celulares, y una fase superior acuosa, menos densa, la cual contiene el RNA junto a polisacáridos, otros ácidos nucleicos y pequeñas moléculas hidrosolubles. La mayor parte de las proteínas son retenidas en la interfase debido a sus características hidrofóbicas e hidrofílicas. Material y métodos 31 Tabla 8.- Secuencias de los pares de cebadores diseñados para PCR-Semicuantitativa correspondientes a los genes de la colección EM. Probe Forward primer (5´ 3´) Reverse primer (5´ 3´) Contig11738_at GATCACGGCGAGACAGATAGAA TTTACTGGCCGCTATGGAGA Contig1314_s_at AAGTCCGACATCGTCATCGAG ACACCTCAGCCATCAGGATT Contig13277_at ACGGTTGAAGCATCTGCGTGAT AGTGGTGGCATCGTCTCTTTGA Contig14691_at TTGACACGGAGACGAGCAAT ATCATCTTCGGCATCGTCCT Contig14780_at TCGTGCAGACCAATCACCAA TTAGGGTCGAACAGCGACTT Contig16148_at ACACACATACTGCCCACTCA TTGGCATCAGGAGGAAGCAA Contig16389_at ACAGAAGAGCTGATGGCTGT TTCATTGAGCTTGTCGCCCT Contig16595_at AGCTCGATGAAACCACGCTAGT TCGGAGTTCAGGTTCTCTTGGA Contig17155_at TCACCGGCAACACAGTTGAGAA TTGCCCAGGATCAGTTTCGGTT Contig17319_at AAACATGATGCGGGCAGACGAT AACGCAACCCAAGGCTGCTAAT Contig19088_at ATCCGCAAGACCAGCTACAAGA AGCCGCTACTCAACAATCTCCA Contig2243_s_at ATCGGCAGCCATGAAGAGCA TGAAGCCCTGAAGCGATCAGT Contig23344_at TGCAGCCAAACAAATCGGGAAC AGCACACGGTGACTAGACTGAA Contig23926_at TTCTGAGGACGAGGGATGCAAT TCTGTGTCAAATCCTCCGGCAA Contig24791_at AACGGAGAAATCGTCCAGCGATCA TACAATGCAGCAAAGACGCCGA Contig24914_at CCCACCACAGAAGCAGATGAAT AAGACCTCGACTGGTTTGGGTA Contig25153_at AGATCAAGCAGATCCGTGGTGA AACGATGACGAACAGCGCAT Contig26034_at GCAGTCGAACCTGAGACCATAA ACAAGGGCATGTCGCAAAGA Contig4380_s_at TCCATGATGTGCTCCTACTCCT GCTGCTTCTTGGTCTTGTGGTT Contig5004_at ATACGAGTCACTGTCCCACCAT AACCTTGCTCAGCTCCTGTT Contig5708_at GCCTCCAAGGAAGGATCAGTTT AGCCAACATAGGTGCCAGTT Contig6640_at AAACCGCCATTGAGGACAGTGA TCTTCTAGCCGGTCCCTTTATGGT Contig6817_at TCAGCCATGTTTCTCGTGCCAA TCATGTGCCGGTCAGACGTT Contig7509_at TGCCTTCAGCACAACCACTT TGTTGTTTCGGTCTCCTGCT Contig8790_at AGATGGCTGACCCAATGCTT AATGATGGTTTGGCGAGCGT Contig9121_at TATGCGTGAAAGCGGCCATT TGCAGCCTTTGCCTTTGGTT Contig938_s_at TGGATCATCTCCGGCTTCTGCTAT TTCGAGGCAGATTGGGCAAACA Contig9412_s_at ACCTGGGAATTGGGAAGATGGT ACTGCCGTGTTCTTCAGCGA HVSMEb0007O01f_at TAAATTCCGTGGGTGGCGTA AGGAATGAATGGCTCGGCTA HVSMEm0013I03r2_at TCCTCGTTCCTGAGCTTCGACAT AACGCCAAGTTTGTGGACGTGA Material y métodos 32 Tabla 9.- Secuencias de los pares de cebadores diseñados para PCR-Semicuantitativa correspondientes a los genes de la colección QTL-Alb. Probe Forward primer (5´ 3´) Reverse primer (5´ 3´) Contig4499_s_at TCCAACCTCGGCAATCATGT TGTGCATTAGGCTCCACCTT Contig2515_at ACATTGCATCTGCGTCCAAGTG ATTCATCCCTTCATCTCCGCCT Contig7192_at TTGCACTCTGTAGCGGCAGTTT ACTTTGGCGGCAGAATCCAGAA Contig7090_s_at TTGGAAATGCCGCCAAGGTTGT TGTTGCATTCAGCGCGTCTTCA Contig2278_at TTAAGGGCATGGAGAAGGGCAT TTGATGATCGCGGTGCTACACA Contig6276_s_at AAAGCGACTGCCTCGTGAAA AACTCCAGGGCTTGTTGCAT Contig12110_s_at TGGGCATGTCTATGCGTGTT ACCCGAAGCAGCAATTCACT Contig4021_at TGTCTGCGACCAATGCTATCCA TTCCTTTCGGTTACTGGGCCTT Contig9559_at ATTAGCTGAGCGGTTGGGTT AGCAGTTGCCTTGCTGAAGA Contig4586_at ATGCTGGGCACTACATTCCT AGGCAGCAAGGCAAGATACA Contig4470_s_at TTAGGATTCGGGAGCTGGGTTT AAACTGATGCCAACGCCCAT Contig6695_at TTCTCCAGGTGCCAACAACA TCCTTCCATGCGTTCCTTCT Contig11071_at ACGATGTCCAAGTCGTGCAA GTGACAATTCGGCTGCAAGT Contig8361_at TGGCAAAGGCAGTTGGCTACA AGGCTGGCAGTTGCTTCACTT SNP 6170-304 TTTGTTTGAGCGGGAGGCAT ACGCCGTTGAACTTGACCTT Contig6598_at TGATCTCACGGGCTTCATCA TGTCGTAGTTGCCAAACCCA Contig9219_at ACGGCAGGCTTTGATTTGACGA TCGTCTGTTTCCGCTAACTGGACT Material y métodos 33 Tabla 10.- Secuencias de los pares de cebadores diseñados para PCR-Semicuantitativa correspondientes a los genes de la colección M-Alb. Probe Forward primer (5´ 3´) Reverse primer (5´ 3´) HV_CEb0002J23r2_s_at AACCCTTAAACTCCGGCAACGA ACGAGGCCAAATCCTGCTGTT Contig2742_at ACCCTCGTCCTCAAATGCAA ACCGCAACATGGAAACACCA Contig7944_at AAGGACATCTTCACGGCGAT AAGAAGAAGGTGAGCGCGTA Contig12692_s_at ACATGGTGATGGACTACTGCGA TACTACCATTGCTACGCCTACACG Contig10615_at CGCCATCCTCTTCGAGCACATA TTCATCTCACTGTCGTGGCTTGT Contig9813_at TTCGGCAACGGCTTCTTCCA AGTAACAACGCCACCGCAACTA Contig1800_at ACTTGACCCACAAGCTGAAGCA TTGCCACGAGAAACGTCGATGA Contig4811_s_at TCAAGGAGGTTGGCGACATT GTTGAACATTTCGGCGGTGA Contig2721_at ACAAGCTGAGCAAGCTGGAAGA ACGACATGACACGGAAGCAGAA Contig418_at AAGACTGCGGCAAAGGCAAA CCTCACCAAACTTGACGCCATT Contig5059_s_at ACAAGCTGGAGCCAATCGAGAA TGGTTCACCGCCCATTTGATGT Contig14378_at TGTGGGAAAGGATGGACGAGTT ACGTTGCTGTGCCTGTTGTT HV09F14u_at CCTGTGATACTTTCATGCCATCCG CAACAAATCGGCTCAGTTGGGT Contig3221_at ACCTCGCCAAGCAGAAGAAA TGTTTGCGTGCTGGATGTGA Contig828_s_at TCAAAGCATCCTCGCCATCT TTGTTGACAGGGTCGGCAAT Contig19438_at AGCTCATCCGTCTGTGACAAGT ACCAGGCGTACACGTTGAAG Contig13481_at CATTGCCACGCTGATGATGTTC TCAATGGTGTAATGCCCTCTGC Contig2992_s_at ACGGCCATTTGGTTCTGGAT AAGTTTCGCTGGGTGTAGCA Contig9152_at GTCCAGGATGCCACGGACAA GCAGGTTCAATGTTCAGACGGCAA Contig12724_at ATGTCCATTGCCTCGTTCCT TGAACCTGACGAGTGGCTTA Como gen control se empleó el gen constitutivo ACTINA de cebada (Hv-Actin2) mediante el uso de los siguientes cebadores (tabla 11): Tabla 11.- Secuencias de los pares de cebadores diseñados para PCR-Semicuantitativa correspondientes al gen constitutivo ACTINA de cebada (Hv-Actin2). Forward primer (5´ 3´) Reverse primer (5´ 3´) Hv-Actin2 GGCTGACGGTGAGGACATCCAG GCTCATTGTAGAAAGTGTGATGCCAG 3.3.4.2.- PCR-Semicuantitativa. La PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica que permite amplificar secuencias de DNA in vitro, por repetición de la reacción de síntesis de un fragmento de DNA, comprendido entre cebadores específicos mediante una DNA polimerasa. Material y métodos 34 Esta técnica permite estimar la cantidad de DNA de la muestra al compararla con un patrón. En este estudio se empleó el gen constitutivo Hv-Actin2 para ajustar las concentraciones de los cDNA originales y para comparar las diferencias de expresión de los genes analizados, relacionadas con la cantidad de DNA total de las muestras. Para la amplificación se realizó la mezcla de la reacción en un volumen final de 18µl, en una cabina de flujo vertical (Figura 13.a), para impedir posibles contaminaciones, y con material específico y estéril (Figura 13.b). La reacción se preparó tal como se detalla en la tabla 12, utilizando los siguientes reactivos: - Cebadores de cadena sencilla sintéticos. - dNTPs (DNA Polymerization Mix 20mM) de Amersham Bioscience. - Buffer Taq (10x), MgCl2 50mM y Taq polimerasa (5u/µl) del kit “DNA polymerase” de Biotools. Tabla 12.- Composición de la mezcla de la reacción para PCRSemicuantitativa. H2O DEPC 13,66µl x Nº de reacciones = µl H2O DEPC Buffer 2µl x Nº de reacciones = µl buffer MgCl2 (50mM) 0,34µl x Nº de reacciones = µl MgCl2 dNTPs (20mM) 0,2µl x Nº de reacciones = µl dNTPs De cada Cebador 0,8µl x Nº de reacciones = µl cada Cebador TAQ (5u/µl) 0,2µl x Nº de reacciones = µl TAQ Para preparar la mix se tuvo en cuenta el número de reacciones, no obstante sumamos una reacción más, ya que al pipetear constantemente se tienen pérdidas. Se añadieron 18µl a cada tubo que contenía 2µl de cDNA (tiras de 8 tubos de 0,2ml de Thermo-Stripe de ABgene) (Figura 13.c) y a continuación se agregó una gota de aceite (Mineral Oil de Sigma). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador de DNA Engine Peltier Thermal Cycler 4.0 (Bio Rad) (Figura 13.d). Material y métodos 35 Figura 13.- Condiciones y equipamiento para la técnica PCR Semicuantitativa; a) Cabina de flujo laminar vertical para evitar contaminaciones de DNA externo; b) Material estéril utilizado; c) Tiras de 8 tubos de 0,2ml donde se desarrollan las reacciones y d) El termociclador utilizado para la amplificación de DNA. El programa utilizado para las amplificaciones se compone de las siguientes fases y se resume en la tabla 13: Tabla 13.- Programa de amplificación para PCR-Semicuantitativa. Fase 1 1 ciclo 94ºC 2 min 94ºC 1 min Fase 2 33 ciclos xºC 1 min 72ºC 1 min Fase 3 1 ciclo 72ºC 10 min Fase 4 1 ciclo 4ºC ------ - Fase 1: Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 2 min para la separación de las hebras de DNA. - Fase 2: La reacción en cadena de la DNA-Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo de amplificación (Figura 14) que se repite 33 veces consecutivas. El ciclo consta: o Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 1min. Material y métodos 36 o Hibridación de las hebras simples de DNA de interés, con los cebadores durante 1min, a una temperatura que va a depender de la composición de bases, tamaño y concentración de los cebadores. o Etapa de elongación a 72ºC durante 1min, donde la DNA polimerasa sintetiza las nuevas cadenas empleando como sustrato los dNTPs. - Fase 3: Elongación de las hebras sintetizadas a 72ºC durante 10min. - Fase 4: Mantenimiento de las muestras a 4ºC. Figura 14.- Representación de las 3 etapas de un ciclo de amplificación. Fuente: www.aulavirtualexactas.dyndns.org/ Para visualizar los fragmentos de cDNA amplificados, se realiza una electroforesis en gel de agarosa (MS-12 Conda) en 1,5% tampón TBE 0,5x. Para la tinción de DNA se añadió el producto SYBR® DNA gel stain al 0,1% (Invitrogen). La mezcla de las muestras (15µl) y el tampón de muestra (2,5µl SB) se realizó en un papel Parafilm (Figura 15.a). La composición del SB es: glycerol (50%), bromophenol blue (0,25%) y Xylene cyanol (0,25%). En los pocillos del gel se introdujeron las mezclas (Figura 15.b). Como marcador de peso molecular se utilizó el “100pb DNA Ladder” de Invitrogen. Material y métodos 37 La electroforesis se efectuó a 80V en el equipo E300 de Pharmacia Biotech durante 1h y 20min (Figura 15.c). Para la visualización del producto de amplificación se utilizó el programa Quantity One 4.6.7 con el trasiluminador con luz ultravioleta del Gel Doc 2.000 de Bio Rad (Figura 15.d). Figura 15.- Visualización de los productos de amplificación en geles de agarosa: a) Mezcla de la muestra con el buffer SB en un trozo de papel Parafilm; b) Introducción de 15µl de la mezcla, en los pocillos del gel de agarosa; c) La electroforesis se efectúa a 80V durante 1h y 20min y d) Gel-Doc de Bio-Rad con luz ultravioleta, para la visualización del producto amplificado. 3.3.5.- Amplificación de genes mediante PCR-Cuantitativa o en tiempo real. 3.3.5.1.- Diseño de Cebadores. Para el diseño de cebadores correspondientes a los genes elegidos (Tabla 14), se partió de las secuencias de cDNA “consensus” contenidas en el programa HarvEST Barley V.1.74. Se diseñaron los cebadores mediante el programa Primers Express 3.0, siguiendo estos criterios: - La longitud de los cebadores debe ser entre 15 y 30pb. - La Tm debe estar entre 58-60ºC. La diferencia de Tm entre los dos cebadores no debe ser superior a 2ºC. - El contenido de GCs debe estar entre 30-80%. Lo ideal, es que esté entre 4060%. Material y métodos 38 - Se deben evitar las GCs en el extremo 3’, de manera que las últimas cinco bases no contengan más de dos GCs. - Es también importante evitar la complementariedad de bases en y entre los cebadores, para que no se formen bucles (“hairpins”) en el cebador, y para evitar la formación de dímeros. - El amplicón resultante debe ser pequeño, entre 50 y 150pb para aumentar la eficiencia de la PCR. Los cebadores diseñados fueron sintetizados por Invitrogen. Se preparó una solución stock de 200µM y una dilución final de 20µM en H2O mili Q. Tabla 14.- Secuencias de los pares de cebadores diseñados para PCR-Cuantitativa. Se incluye las secuencias correspondientes al gen constitutivo GAPDH, que se empleó como gen control. Probe Forward primer (5´3´) Reverse primer (5´3´) Contig16389_at CAATAGCAGAGGATGCAACGTATT AATCCGCCTTGGGTGGTT Contig16595_at GCACTTCCTGGCCATCCA GCCAGAAACCCACGCAACTA Contig24914_at ATCGCGGTTGAACCACTTG CCTTCTTCCTCAATGCTGCTATC Contig7509_at CCAGCAGGAGACCGAAACA GCCTCATGAAGATGCTGACTCA Contig938_s_at AGAGCGGAAGCGGACAGA ATGCTCTTCTTGATTTTGTTGATGA Contig9412_s_at GACCAGCGAGGAGCTCATTT AGCAGTGCAGACAGAACCATTG Contig11071_at GGCCTGCGGGAGACCTA GGGCTCGCATGTCAACCT GAPDH GTGAGGCTGGTGCTGATTACG TGGTGCAGCTAGCATTTGAGAC 3.3.5.2.- PCR-Cuantitativa. La PCR-Cuantitativa o a tiempo real (qRT-PCR) se basa en la detección y cuantificación de cDNA mediante fluorescencia (Livak y Schmittgen 2001). El análisis de qRT-PCR se llevó a cabo en un termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System de Applied Biosystems. Los reactivos utilizados fueron el kit “Fast SYBR® Green Master Mix de Applied Biosystems y el Rox (50x) Reference Dye de Invitrogen. Rox es un colorante que normaliza la señal de fluorescencia en qRT-PCR y permite reducir la desviación entre replicas debidas a la preparación de la reacción. Las condiciones de amplificación fueron básicamente: 10min a 95ºC para la desnaturalización, seguido de 40 ciclos de amplificación que constaban de 15s a 95ºC para la desnaturalización y 1min a 60ºC para la elongación, seguido de dos nuevos ciclos para la curva de melting o curva de la temperatura de fusión de 60-95ºC. Material y métodos 39 Un detector realiza la medida de la cantidad de fluorescencia emitida por el fluorocromo SYBR Green al amplificar el fragmento de cDNA en cada ciclo, concretamente durante la elongación a 60ºC y durante el programa de la curva de melting, y la representa gráficamente (Dorak 2008) (Figura 16). Esto permite determinar el valor CT, ciclo en el que la fluorescencia de la muestra supera el umbral que es inversamente proporcional a la cantidad inicial de producto (Dorak 2008). Figura 16.- Gráfica de amplificación en PCR-Cuantitativa. El eje vertical representa la cantidad de fluorescencia normalizada y el eje horizontal el número de ciclos. La Baseline o linea base se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios detectables en la cantidad de fluorescencia y solo se detecta la fluorescencia basal. Threshold es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia y el corte entre el Threshold y la curva de amplificacion determina el CT o ciclo umbral que se emplea para la cuantificación de la expresión génica. Fuente: Applied Biosystems. Antes de iniciar los análisis de qRT-PCR fue necesario comprobar la validez de los cebadores diseñados según dos parámetros: formación de dímeros entre cebadores y eficiencia en la amplificación. - Formación de dímeros entre cebadores. Se define como “Primer Dimer” o dímeros entre cebadores, a la existencia de complementariedad de bases entre las secuencias de los cebadores, dando como resultado amplificaciones inespecíficas y una incorrecta cuantificación del producto en la PCR. Para la detección del parámetro se realizaron amplificaciones para cada uno de los pares de cebadores sin cDNA. Material y métodos 40 En una cabina de flujo vertical, se preparó la mezcla de la reacción en un volumen final de 20µl, tal como se detalla a continuación en la tabla 15. Tabla 15.- Composición de la reacción para detectar dímeros entre cebadores. Cebador Forward 1µl x Nº reacciones = µl Cebador Forward Cebador Reverse 1µl x Nº reacciones = µl Cebador Reverse Mix: Fast SYBR® Green Master Mix 10µl x Nº reacciones = µl Master Mix Rox 0,4µl x Nº reacciones = µl Rox H2O MilliQ 7,6µl x Nº reacciones = µl H2O Milli Q Los componentes de la reacción se añadieron según el orden en la tabla. Se trabajó con dos réplicas técnicas con cada pareja de cebadores en placas de 96 pocillos (Figura 17.a) cubiertas por una lámina adhesiva (QPCR Adhesive Clear Seals 4titude). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de PCR-Cuantitativa (Figura 17.b). Figura 17.- Procedimiento de la técnica PCR-Cuantitativa: a) Placas específicas para PCR-Cuantitativa y b) Termociclador de PCR-Cuantitativa. - Eficiencia de los cebadores. Para estudiar la estabilidad en la amplificación por los cebadores independientemente de la concentración inicial de cDNA se analizó la eficiencia de los pares de cebadores. Se realizaron diluciones a 1:1, 1:2, 1:4 y 1:6 de las muestras control (anteras a los 8 días de cultivo (8dc) de la línea DH6148 y a los 16 días de cultivo (16dc) de la línea DH6183). Para la amplificación de las muestras se realizó la siguiente reacción Resultados 47 Tabla 19.- Homologías de secuencias de los genes de la colección M-Alb, mediante el programa HarvEST Barley v. 1.74. Se presenta la homología con mayor valor de similitud (“evalue”) de las tres analizadas (UniProt (general), MSU (arroz), TAIR (Arabidopsis)), así como el acrónimo correspondiente. Probe Nº de entrada evalue Acrónimo Descripción HV_CEb0002J23r2_s_at UniRef90_Q70DK2 2,00E-95 PcL Blue copper binding protein Contig2742_at LOC_Os01g69250.1 1,00E-88 TOM20 Mitochondrial import receptor subunit TOM20 Contig7944_at UniRef90_B8ZWH5 0.0 PHT6 Phosphate transporter Contig12692_s_at LOC_Os04g51520.1 1,00E-102 GH16 Protein glycosyl hydrolases family 16 Contig10615_at LOC_Os03g07400.1 5,00E-42 Hv-ALB6 Expressed protein Contig9813_at LOC_Os02g52040.1 1,00E-54 EXO Phosphate-induced protein 1 Contig1800_at UniRef90_Q43210 0.0 PAL Phenylalanine ammonia-lyase Contig4811_s_at LOC_Os04g48230.2 0.0 DYR Dehydration response related protein Contig2721_at LOC_Os02g28980.1 0.0 PPIA Peptidyl-prolylisomerase Contig418_at UniRef90_P04784 1,00E-143 WCAB-1 Chlorophyll a-b binding protein Contig5059_s_at UniRef90_Q8L827 1,00E-142 RNS RNase S-like protein Contig14378_at LOC_Os12g18650.7 1,00E-80 RCC Regulator of chromosome condensation HV09F14u_at LOC_Os12g14440.1 2,00E-07 JRL Jacalin-like lectin Contig3221_at UniRef90_P31093 8,00E-77 PSAN Photosystem I reaction center subunit N Contig828_s_at UniRef90_P04784 1,00E-145 WCAB-2 Chlorophyll a-b binding protein Contig19438_at LOC_Os04g36720.1 1,00E-115 FRO Ferric-chelate reductase Contig13481_at LOC_Os06g40500.1 1,00E-111 Hv-ALB7 Expressed protein Contig2992_s_at UniRef90_Q9LEH7 1,00E-141 CHIT Chitinase II Contig9152_at UniRef90_Q8H0Q4 2,00E-71 COR14b Cor14b protein Contig12724_at LOC_Os03g03034.4 1,00E-136 FLS Flavonol synthase/flavanone 3-hydroxylase Al estudiar los procesos en los que intervenían los genes seleccionados, se pudo determinar que la mayor parte de los genes de la colección EM estaban asociados a mecanismos ligados a la regulación de la expresión génica, mientras que en la colección QTL-Alb predominaban los genes asociados a la regulación celular, en particular por regulación proteica. Finalmente en la colección M-Alb predominan los genes asociados a la fotosíntesis y a la respuesta al estrés. Resultados 48 4.2.- Comparación de la expresión génica entre hojas albinas y verdes de plantas obtenidas en cultivo de anteras. La existencia de unos porcentajes altos de albinismo en el cultivo de anteras no se hace visible hasta que se regeneran las plántulas. Por ello, para determinar qué genes de las tres colecciones permitían diferenciar materiales albinos de verdes, se estudiaron los niveles de expresión de dichos genes en hojas albinas y verdes de plántulas regeneradas de cultivo de anteras. Para este estudio se seleccionaron tres variedades Vanessa, Siberia y Static, que aunque presentaban distintas características agronómicas y respuesta al cultivo de anteras (Apartado 3.1.1, tabla 4), coincidían en que menos del 12% de las plántulas regeneradas eran verdes. Para realizar los análisis de expresión génica se realizaron amplificaciones por PCRSemicuantitativa. Para ello, se extrajo el RNA de las muestras de hojas y se sintetizó el cDNA. Con el cDNA se realizaron las amplificaciones, utilizando los cebadores diseñados a partir de las secuencias de los genes seleccionados (Apartado 3.3.4.1, tabla 8, 9, 10 y 11). Se empleó como gen control el gen Hv-Actin2. Los fragmentos amplificados se visualizaron en geles de agarosa. Al caracterizar la expresión génica de los 67 genes de las tres colecciones (Anexo II) se observó que aunque muchos genes presentaban diferencias significativas en su nivel de expresión entre hoja verde y albina en alguna variedad, muchas veces estas diferencias no eran consistentes entre las variedades estudiadas. Únicamente 15 genes presentaban patrones de expresión que los hacían candidatos para posteriores estudios (WCAB-2, WCAB-1, PSAN, RHB1A, SBE, RNS, JRL, SIG, NOS1, RRF, RLUB, DAG, TAB, RPL28 y Hv-ALB5). Las homologías de secuencia de estos genes (Apartado 4.1, tabla 17,18 y 19) nos determinaron sus funciones (Tabla 20) que estaban relacionadas con fotosíntesis (WCAB-2, WCAB-1, PSAN, RHB1A y SBE), respuesta al estrés (RNS y JRL), expresión génica (SIG, NOS1, RRF, RLUB, DAG, TAB y RPL28) y el gen Hv-ALB5 de función desconocida. Resultados 49 Tabla 20.- Homologías de secuencias de los 15 genes seleccionados como genes candidatos para posteriores estudios, con sus acrónimos correspondientes y agrupados por su función general. Acrónimo Descripción Función general WCAB-2 Chlorophyll a-b binding protein Fotosíntesis WCAB-1 Chlorophyll a-b binding protein Fotosíntesis PSAN Photosystem I reaction center subunit N Fotosíntesis RHB1A Zinc finger, C3HC4 type domain containing protein Fotosíntesis SBE Putative starch branching enzyme Fotosíntesis RNS RNase S-like protein Respuesta al estrés JRL Jacalin-like lectin Respuesta al estrés SIG RNA polymerase sigma factor Expresión génica NOS1 Protein nitric oxide synthase 1 Expresión génica RRF Ribosome recycling factor Expresión génica RLUB Ribosomal large subunit pseudouridine synthase B Expresión génica DAG DAG protein Expresión génica TAB psaB translation factor Expresión génica RPL28 50S ribosomal protein L28 Expresión génica Hv-ALB5 Expressed protein - Cuando estudiamos los patrones de expresión en hoja albina y verde de los 15 genes seleccionados (Figura 18), observamos que 12 genes (WCAB-2, WCAB-1, PSAN, RHB1A, SBE, RNS, JRL, SIG, NOS1, RRF, RLUB y Hv-ALB5) mostraban una diferencia de expresión clara entre hojas albinas y verdes en las variedades Vanessa, Siberia y Static. En los 3 genes restantes (DAG, TAB y RPL28) aunque se observaron diferencias entre hojas albinas y verdes, estas diferencias no eran consistentes. Sin embargo, estos tres genes determinaban diferencias claras de patrón de expresión entre variedades. Resultados 50 Figura 18.- Análisis de expresión de los 15 genes seleccionados, mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa, en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Se empleó como gen constitutivo Hv-Actin2. Entre los genes asociados a funciones fotosintéticas, WCAB-2 es el que presentó una mayor diferencia en el nivel de expresión entre hojas albinas y verdes. Los dos genes relacionados con la respuesta al estrés (RNS y JRL) así como de los genes asociados a expresión génica (SIG, NOS1, RRF y RLUB) también mostraban diferencias de expresión entre hojas verdes y albinas en las tres variedades. Como ya habíamos indicado, el resto de los genes asociados a expresión génica (DAG, TAB y RPL28) mostraron unas diferencias claras de patrón de expresión entre las variedades. Así, DAG en el genotipo Siberia mostró una mayor expresión en la hoja albina al contrario que en las otras dos variedades. TAB mostró una expresión distinta en cada variedad: en Vanessa se expresó en hoja verde, en Siberia de forma semejante en hoja albina y verde, y en Static se expresó en hoja albina. El gen RPL28 Resultados 51 sólo se expresó en Siberia, pero más en hoja albina que en hoja verde. Finalmente, el gen de función desconocida Hv-ALB5 se expresó más en hoja verde en los genotipos Vanessa y Siberia, mientras que en Static la expresión era baja en los dos tipos de hojas. 4.2.1.- Comparación de los perfiles de expresión génica en cultivo de anteras de las líneas DH6148 y DH6183. En el grupo de trabajo se disponía de una población de líneas casí isogénicas, diseñadas para la identificación de QTLs asociados al albinismo en cultivo de anteras de cebada. Entre estas líneas se habían intentado minimizar las diferencias en la respuesta a cultivo de anteras excepto las asociadas al albinismo. El análisis de los perfiles de expresión de los 15 genes seleccionados en dos de las líneas de esta población con porcentajes de albinismo muy distintos, nos permitirá identificar diferencias de expresión ligadas al albinismo en fases iniciales del cultivo de anteras en las que no es posible distinguir entre los materiales que darán lugar a plantas verdes o albinas. Así, las diferencias en los perfiles de expresión nos permitirán determinar que mecanismos están implicados en el albinismo en las primeras fases del cultivo de anteras. Las líneas seleccionadas fueron; la línea DH6148 con un solo un 4,17% de albinismo y la línea DH6183 con un 87,49% (Apartado 3.1.1, tabla 3). De estas líneas se tomaron anteras correspondientes a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp), fase en la que se produce el cambio en el patrón de desarrollo de las microsporas, y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc), que corresponden a las fases iniciales del desarrollo embriogénico hasta que las estructuras embrionarias están ya diferenciadas. Se extrajo el RNA y se sintetizó el cDNA de cada una de las muestras. Con el cDNA se realizaron las amplificaciones por PCRSemicuantitativa y visualización en geles de agarosa, utilizando los cebadores de los 15 genes seleccionados. Se empleó como control el gen constitutivo Hv-Actin2. En la figura 19 se muestran los resultados de la PCRSemicuantitativa de los genes relacionados con la fotosíntesis. Resultados 52 Figura 19.- Perfiles de expresión de los 5 genes relacionados con la fotosíntesis, analizados mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo Hv-Actin2. De los 5 genes analizados WCAB-2, WCAB-1 y SBE no se expresaron a lo largo del cultivo de anteras. El gen PSAN, en las dos líneas únicamente se expresó en las anteras antes de iniciar el tratamiento de estrés (0dp). Solo el gen RHB1A se expresaba a lo largo del cultivo y mostraba diferencias significativas entre las líneas. Así, el gen RHB1A que se expresaba en 0dp, baja su expresión después del tratamiento de estrés (4dc) y se induce de nuevo en 4dc en ambas líneas. En la línea menos albina (DH6148) su expresión decaía de nuevo a los 12dc, mientras que en la línea albina (DH6183) se mantenía hasta los 16dc. Al estudiar el perfil de expresión de los genes asociados con la respuesta al estrés (Figura 20), se observó que el gen RNS no se expresaba a lo largo del proceso, Resultados 53 mientras que el gen JRL lo hacía en cada una de las fases con variaciones en el nivel de expresión, siendo más intenso a los 8-12dc. Figura 20.- Perfiles de expresión de los genes relacionados con la respuesta al estrés, analizados mediante PCR-Semicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo HvActin2. En los resultados de la PCRSemicuantitativa de los genes vinculados a la expresión génica relacionada con plástidos (Figura 21) se observan diferencias significativas entre líneas en los perfiles de expresión de algunos de los genes. Resultados 54 Figura 21.- Perfiles de expresión de los 7 genes relacionados con la expresión génica en plástidos, analizados mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo Hv-Actin2. De los cuatro genes que habían mostrado una diferencia clara de expresión entre las hojas albinas y verdes en las tres variedades estudiadas, los genes SIG y RRF mostraban un perfil de expresión semejante. Este perfil se caracterizaba por su expresión a los 0dp únicamente en la línea más albina (DH6183) y por su disminución de la expresión después del tratamiento, inducción a los 4dc y expresión hasta los 16dc en ambas líneas. Resultados 55 Los otros dos genes (NOS1 y RLUG) presentan diferencias marcadas entre los perfiles de expresión en las líneas. El gen NOS1 se expresa de los 4dp a los 12dc en la línea menos albina, mientras que en la línea DH6183 se induce fuertemente a los 4dc y luego decae su expresión. El gen RLUB se inducía a los 4dc en la línea más albina pero lo hacía a los 8dc en la línea DH6148. Entre los genes que mostraban diferencias de expresión entre las variedades en hojas verdes y albinas, los genes DAG y TAB presentaban un perfil de expresión semejante y con diferencias entre líneas. Así, DAG y TAB en la línea DH6148 se inducían a los 4dc-8dc aunque con mayor nivel de expresión a los 8dc, mientras que en la línea DH6183 no se inducían hasta los 16dc. Por último, el gen RPL28 no mostró diferencias entre líneas, activándose a los 4dc y decayendo a lo largo del cultivo con más rapidez en la línea DH6148. Finalmente, el gen Hv-ALB5 de función desconocida es el gen que presentó una mayor diferencia de expresión entre líneas (Figura 22), ya que en la línea menos albina (DH6148) únicamente se detectó una expresión muy débil a los 4dp y 8dc, mientras que en la línea albina DH6183 se observó una inducción fuerte a los 4dc y 16dc. Figura 22.- Perfil de expresión del gen Hv-ALB5 de función desconocida, analizada mediante PCRSemicuantitativa y gel de agarosa. A la izquierda de la imagen, los patrones de expresión en las fases iniciales del cultivo de anteras. Las muestras corresponden a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. A la derecha se muestran los patrones obtenidos anteriormente en muestras de hojas albinas (A) y hojas verdes (V) de las variedades de cebada Vanessa, Siberia y Static. Gen constitutivo Hv-Actin2. Resultados 56 4.2.2.- Comparación de los perfiles de expresión génica en cultivo de anteras de las variedades Orelie, Volley y Riviera. Una vez caracterizado el perfil de expresión de los genes candidatos en las fases iniciales del cultivo de anteras en dos líneas casí isogénicas con diferencias extremas en el porcentaje de albinismo, se planteó la validación de las diferencias en los perfiles de expresión asociados al albinismo en variedades de cebada con distinta respuesta en el cultivo de anteras y distinto porcentaje de albinismo. Así para este estudio se seleccionaron tres variedades de cebada Orelie, Volley y Riviera (Apartado 3.1.1, tabla 4). Orelie es la variedad más eficiente en cultivo de anteras y presenta un porcentaje muy bajo de albinismo (2,87%), Volley aunque es la peor en cuanto a respuesta general, destaca por la ausencia de albinismo (0%), finalmente, Riviera se comporta de manera intermedia en cuanto a su respuesta al cultivo, pero se caracteriza por su alto porcentaje de albinismo (92,59%). Para la caracterización del perfil de expresión de los 15 genes seleccionados, se tomaron anteras correspondientes a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp), fase en la que se produce el cambio en el patrón de desarrollo de las microsporas, y a los 4 y 10 días de cultivo de anteras (4dc y 10dc), que corresponden a las fases iniciales del desarrollo embriogénico de la microspora. Se extrajo el RNA y se sintetizó el cDNA de las anteras. Con el cDNA se realizaron las amplificaciones por PCRSemicuantitativa y visualización en geles de agarosa, utilizando los cebadores diseñados a partir de las secuencias de los genes (Apartado 3.3.4.1, tabla 8, 9, 10 y 11). Se empleó como gen control Hv-Actin2. Cuando se estudió el perfil de expresión de los genes asociados con la fotosíntesis (Figura 23), se observó que los genes WCAB-2, WCAB-1 y PSAN no se expresaban a lo largo del cultivo de anteras o solo lo hacían en anteras antes del tratamiento de estrés (0dc), tal como se había observado en el estudio de las líneas DHs. Resultados 63 En la tabla 22 se muestran los valores CT obtenidos para cada pareja de cebadores. A partir de estos valores, se calculan las rectas de regresión (Figura 27) para obtener el valor de m y calcular la eficiencia (Tabla 23). Tabla 22.- Valores de CT obtenidos en las amplificaciones mediante PCRCuantitativa, con los cebadores diseñados para los genes seleccionados. Se utilizó diluciones de cDNA de 1, 1:2, 1:4 y 1:6 de anteras a los 16 días de cultivo (16dc) de la línea DH6183 para el gen Hv-ALB5. Se hicieron las mismas diluciones de anteras a los 8 días de cultivo (8dc) de la línea DH 6148 para el resto de genes. Gen Muestra cDNA Dilución cDNA CTm RHB1A 8dc, DH6148 1:1 31,938 1:2 33,906 1:4 34,879 1:6 35,454 SBE 8dc, DH6148 1:1 35,136 1:2 34,556 1:4 36,396 1:6 36,957 NOS1 8dc, DH6148 1:1 29,274 1:2 30,941 1:4 31,973 1:6 32,383 RLUB 8dc, DH6148 1:1 32,466 1:2 34,113 1:4 33,916 1:6 36,951 DAG 8dc, DH6148 1:1 26,943 1:2 28,882 1:4 29,944 1:6 30,093 TAB 8dc, DH6148 1:1 28,886 1:2 30,662 1:4 31,675 1:6 31,953 Hv-ALB5 16dc, DH6183 1:1 29,786 1:2 31,182 1:4 31,951 1:6 32,412 Resultados 64 Figura 27.- Rectas de regresión de los pares de cebadores calculadas a partir de los valores de CT obtenidos en las amplificaciones de las diluciones de cDNA (1, 1:2, 1:4, 1:6). Se consideraron válidas aquellas parejas de cebadores con una eficiencia entre el 90 y el 100%. De los genes estudiados únicamente los genes RHB1A y Hv-ALB5 cumplían este requisito y por lo tanto se seleccionaron para continuar con el análisis. Resultados 65 Tabla 23.- Cálculo de las eficiencias de los cebadores, tras hallar la recta de regresión. Gen Recta de regresión Eficiencia RHB1A y=-3,4009x + 39,165 96,8% SBE y=-2,6949x + 40,017 135% NOS1 y=-3,9816x + 37,431 78,3% RLUB y=-4,7464x + 41,857 62,4% DAG y=-4,0861x + 35,419 75,7% TAB y=-3,9482x + 37,029 79,2% Hv-ALB5 y=-3,3083x + 36,557 100,5% - Gen control y ajuste de muestras. Para evaluar el nivel de expresión de los genes estudiados en cada una de las muestras se empleó el método del CT comparativo. Los valores CT obtenidos para cada gen en cada punto se corrigieron respecto a los valores obtenidos para el gen de expresión constitutiva GLICERALDEHIDO-3-FOSFATO-DESHIDROGENASA (GAPDH) y así eliminar la variación experimental (∆CT). A partir de una dilución inicial de 1:5 de los cDNA, se realizaron nuevas diluciones hasta aproximar las CT de las muestras a la escogida como referencia del gen control, CT=30. 4.3.2.- Determinación de los niveles de expresión de los genes RHB1A y Hv-ALB5 en las primeras fases de cultivo de anteras. Para cuantificar la expresión de los genes a lo largo de la fase inicial del cultivo de anteras, se utilizaron dos réplicas biológicas de las muestras correspondientes a las anteras a los 0 y 4 días después del tratamiento de estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. De cada una de las réplicas biológicas se analizaron dos replicas técnicas. Se realizaron simultáneamente las amplificaciones del gen analizado y el gen control para cada una de las muestras y replicas. Los valores CT obtenidos para cada gen analizado se corrigieron respecto a los valores obtenidos para gen control GAPDH, utilizando el método de cuantificación relativa 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen 2001) según se especifica en el apartado 3.3.5.2 (Análisis de qRT-PCR) y se determinaron los valores de expresión de los genes (Tabla 24 y 25). Resultados 66 Tabla 24.- Cuantificación de la expresión del gen RHB1A mediante PCRCuantitativa utilizando como control el gen GAPDH, en muestras de anteras a los 0 y 4 días después del tratamiento de estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo (4dc, 8dc, 12dc y 16dc), de dos replicas biológicas (A y B) y dos replicas técnicas (1 y 2) de las líneas DH6148 y DH6183. Genotipo Muestra CT gen CT media gen CT control CT media control ∆CTm Po ∆∆CT 2(-∆∆CT) 2(-∆∆CT)m DH6148-A1 0dc 34,406 33,929 29,211 29,339 4,591 7,004 -2,414 5,328 3,437 DH6148-A2 0dc 33,452 29,466 DH6148-B1 0dc 36,046 35,406 28,742 29,031 6,375 7,004 -0,629 1,546 DH6148-B2 0dc 34,765 29,319 DH6148-A1 4dp 36,517 36,281 27,881 27,826 8,456 7,004 1,452 0,366 0,715 DH6148-A2 4dp 36,045 27,770 DH6148-B1 4dp 36,156 36,545 29,724 29,630 6,915 7,004 -0,089 1,064 DH6148-B2 4dp 36,933 29,535 DH6148-A1 4dc 36,984 37,164 28,006 27,948 9,216 7,004 2,212 0,216 0,899 DH6148-A2 4dc 37,343 27,889 DH6148-B1 4dc 37,429 36,293 29,638 29,951 6,342 7,004 -0,662 1,582 DH6148-B2 4dc 35,156 30,263 DH6148-A1 8dc 35,962 35,666 28,668 28,662 7,004 7,004 0,000 1,000 1,789 DH6148-A2 8dc 35,369 28,656 DH6148-B1 8dc 33,966 33,836 28,269 28,198 5,638 7,004 -1,366 2,578 DH6148-B2 8dc 33,706 28,127 DH6148-A1 12dc 35,769 36,641 28,187 28,231 8,410 7,004 1,406 0,377 0,377 DH6148-A2 12dc 37,513 28,275 DH6148-B1 12dc 36,076 36,076 27,851 27,868 --- 7,004 --- --- DH6148-B2 12dc --- 27,884 DH6148-A1 16dc 35,726 35,627 28,068 28,119 7,508 7,004 0,504 0,705 1,388 DH6148-A2 16dc 35,528 28,169 DH6148-B1 16dc 34,769 35,173 29,069 29,219 5,954 7,004 -1,050 2,071 DH6148-B2 16dc 35,576 29,368 DH6183-A1 0dc 32,152 32,365 28,805 28,866 3,500 7,004 -3,504 11,349 10,236 DH6183-A2 0dc 32,578 28,926 DH6183-B1 0dc 32,206 32,253 28,384 28,439 3,815 7,004 -3,190 9,123 DH6183-B2 0dc 32,300 28,493 DH6183-A1 4dp --- --- 27,732 27,780 --- 7,004 --- --- 0,545 DH6183-A2 4dp --- 27,828 DH6183-B1 4dp 36,312 36,443 28,461 28,563 7,880 7,004 0,875 0,545 DH6183-B2 4dp 36,573 28,665 DH6183-A1 4dc 36,084 35,027 27,924 28,130 6,897 7,004 -0,108 1,077 0,702 DH6183-A2 4dc 33,969 28,336 DH6183-B1 4dc 36,282 37,070 28,540 28,456 8,614 7,004 1,610 0,328 DH6183-B2 4dc 37,857 28,371 DH6183-A1 8dc 35,774 36,008 28,600 28,720 7,289 7,004 0,284 0,821 0,821 DH6183-A2 8dc 36,242 28,839 DH6183-B1 8dc --- --- 28,734 28,640 --- 7,004 --- --- DH6183-B2 8dc --- 28,546 DH6183-A1 12dc 35,452 36,118 30,898 29,668 6,450 7,004 -0,554 1,469 1,363 DH6183-A2 12dc 36,783 28,438 DH6183-B1 12dc 35,714 35,593 28,672 28,918 6,675 7,004 -0,329 1,257 DH6183-B2 12dc 35,471 29,164 DH6183-A1 16dc 36,790 37,144 30,930 29,632 7,512 7,004 0,508 0,703 0,703 DH6183-A2 16dc 37,497 28,334 Resultados 67 Tabla 25.- Cuantificación de la expresión del gen Hv-ALB5 mediante PCRCuantitativa utilizando como control el gen GAPDH, en muestras de anteras a los 0 y 4 días después del tratamiento de estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de dos replicas biológicas (A y B) y dos replicas técnicas (1 y 2) de las líneas DH6148 y DH6183. Genotipo Muestra CT gen CT media gen CT control CT media control ∆CTm Po ∆∆CT 2(-∆∆CT) 2(-∆∆CT)m DH6148-A1 0dc 31,295 31,588 31,225 31,296 0,293 1,820 -1,528 2,883 1,808 DH6148-A2 0dc 31,881 31,366 DH6148-B1 0dc 33,438 33,494 31,231 31,227 2,267 1,820 0,447 0,734 DH6148-B2 0dc 33,550 31,223 DH6148-A1 4dp 31,672 31,812 29,575 29,600 2,213 1,820 0,393 0,762 1,442 DH6148-A2 4dp 31,952 29,624 DH6148-B1 4dp 31,914 31,920 30,962 31,185 0,735 1,820 -1,085 2,121 DH6148-B2 4dp 31,926 31,408 DH6148-A1 4dc 32,824 33,221 29,846 29,869 3,352 1,820 1,532 0,346 4,913 DH6148-A2 4dc 33,618 29,892 DH6148-B1 4dc 31,275 31,201 33,232 32,626 -1,425 1,820 -3,245 9,481 DH6148-B2 4dc 31,126 32,019 DH6148-A1 8dc 32,571 32,639 30,816 30,819 1,820 1,820 0,000 1,000 2,533 DH6148-A2 8dc 32,707 30,822 DH6148-B1 8dc 32,418 32,396 30,262 32,599 -0,204 1,820 -2,024 4,066 DH6148-B2 8dc 32,373 34,936 DH6148-A1 12dc 32,605 32,781 30,580 30,506 2,275 1,820 0,455 0,730 0,559 DH6148-A2 12dc 32,957 30,432 DH6148-B1 12dc 33,590 33,492 30,322 30,305 3,187 1,820 1,367 0,388 DH6148-B2 12dc 33,394 30,288 DH6148-A1 16dc 32,614 32,803 30,017 30,235 2,568 1,820 0,748 0,595 0,873 DH6148-A2 16dc 32,991 30,452 DH6148-B1 16dc 32,860 32,595 30,877 30,977 1,619 1,820 -0,202 1,150 DH6148-B2 16dc 32,330 31,076 DH6183-A1 0dc 31,819 31,923 30,514 30,464 1,460 1,820 -0,360 1,284 1,993 DH6183-A2 0dc 32,027 30,413 DH6183-B1 0dc 30,858 30,903 30,660 30,517 0,386 1,820 -1,434 2,702 DH6183-B2 0dc 30,947 30,373 DH6183-A1 4dp 31,221 31,228 30,001 31,238 -0,010 1,820 -1,830 3,555 2,728 DH6183-A2 4dp 31,235 32,475 DH6183-B1 4dp 31,705 31,621 30,800 30,727 0,894 1,820 -0,927 1,901 DH6183-B2 4dp 31,536 30,654 DH6183-A1 4dc 32,152 32,106 30,286 30,364 1,742 1,820 -0,078 1,056 0,895 DH6183-A2 4dc 32,059 30,441 DH6183-B1 4dc 33,020 32,828 30,646 30,564 2,265 1,820 0,445 0,735 DH6183-B2 4dc 32,636 30,481 DH6183-A1 8dc 32,555 33,129 30,559 30,755 2,374 1,820 0,554 0,681 0,702 DH6183-A2 8dc 33,702 30,951 DH6183-B1 8dc 34,785 32,842 30,356 30,552 2,290 1,820 0,470 0,722 DH6183-B2 8dc 30,898 30,747 DH6183-A1 12dc 31,227 31,206 30,955 30,779 0,427 1,820 -1,393 2,625 1,796 DH6183-A2 12dc 31,185 30,602 DH6183-B1 12dc 32,515 32,905 30,835 31,036 1,869 1,820 0,048 0,967 DH6183-B2 12dc 33,294 31,237 DH6183-A1 16dc 31,649 31,540 30,229 30,333 1,207 1,820 -0,613 1,529 1,529 DH6183-A2 16dc 31,430 30,436 Resultados 68 La representación gráfica de los valores de expresión obtenidos (Figura 28 y 29), nos mostró que existía una gran variabilidad entre replicas biológicas, en especial en la línea DH6148. Sin embargo, se apreciaban diferencias en el perfil de expresión de los genes entre las líneas. El gen RHB1A se expresaba en las dos líneas a un nivel más alto en las anteras antes de iniciar el proceso, siendo mayor en DH6183 la línea más albina. Posteriormente, la expresión decaía después del tratamiento de estrés aumentado ligeramente hasta los 8dc en la línea DH6148 y a los 12dc en la línea DH6183. Figura 28.- Representación gráfica de los valores de expresión del gen RHB1A obtenidos mediante PCRCuantitativa, utilizando como control el gen GAPDH. Las muestras correspondían a anteras a los 0 y 4 días de tratamiento de estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de dos replicas biológicas de las líneas DH6148 y DH6183. Resultados 69 Figura 29.- Representación gráfica de los valores de expresión del gen Hv-ALB5 obtenidos mediante PCRCuantitativa utilizando como control el gen GAPDH. Las muestras correspondían a anteras a los 0 y 4 días de tratamiento de estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de dos replicas biológicas de las líneas DH6148 y DH6183. En el análisis de expresión del gen Hv-ALB5, las diferencias entre las réplicas biológicas de la línea DH6148 fueron muy grandes, haciendo difícil interpretar los resultados. En la línea DH6183 parecía existir una activación del gen durante el tratamiento de estrés y de nuevo a los 12-16 días de cultivo. 5.- DISCUSIÓN Discusión 71 Para satisfacer la cada vez mayor demanda de cereales, los programas de mejora disponen de herramientas biotecnológicas que permiten la creación, análisis y manipulación de la variabilidad genética, y entre éstas, la producción de doblehaploides (DHs). La introducción de las plantas DHs en programas de mejora, tiene como ventaja fundamental el permitir acortar el tiempo necesario para la obtención de nuevas variedades (Snape y col. 1986, Thomas y col. 2003), al alcanzar la homocigósis en una sola generación (Kasha 2005). Así, mientras que con los métodos tradicionales de mejora para la obtención de nuevas variedades se necesitan de 10 a 12 años con sucesivas generaciones de autofecundación hasta conseguir la homocigósis, utilizando plantas DHs estos métodos se acortan en unos 4 a 6 años. En la actualidad, el método embriogénesis de la microspora, mediante el cultivo de anteras o microsporas aisladas, es la técnica de producción de DHs con mayor potencialidad. Aunque la cebada se considera una especie modelo en la embriogénesis de la microspora, algunos cultivares de gran importancia agronómica presentan tasas de embriogénesis bajas y altos porcentajes de albinismo (MuñozAmatriaín y col. 2008). Se ha descrito que, en algunos casos, las plantas albinas regeneradas mediante cultivo de anteras o microsporas presentan alteraciones en el tamaño y la organización interna de los plástidos (Caredda y col. 1999, 2000), deficiencias en los ribosomas plastídicos y la presencia de un patrón de transcripción y traducción alterado en comparación con las plantas verdes (Hofinger y col. 2000). El porcentaje de albinismo en las plantas regeneradas presenta una fuerte dependencia del genotipo, pero también existen factores fisiológicos que pueden aumentar este porcentaje como: el estado de desarrollo de la microspora (He y Ouyang 1984), el pretratamiento de estrés (Touraev y col. 1996a, Kunz y col. 2000), el medio de cultivo (Liang y Hassawi 1990) y la duración del cultivo (Cistué y col. 1995, Puolimatka y Pauk 2000). Muchos estudios que se han centrado en determinar el origen y las causas del albinismo, lo han hecho a través del análisis de las plantas albinas regeneradas (para revisión ver en Makowska y Oleszczuk 2013). Sin embargo, no se tiene información de en que momento durante el cultivo de anteras o microsporas se producen las modificaciones observadas; si ya existían en las anteras antes de iniciar el proceso, si Discusión 72 se producen por el tratamiento de estrés, o a lo largo del proceso de embriogénesis, o durante la regeneración de plantas o de forma distinta en cada una de las fases. El objetivo final de este trabajo fue determinar los mecanismos moleculares que pueden estar asociados al albinismo en las fases iniciales de la embriogénesis de la microspora en cebada, a través del análisis de la expresión de genes asociados funcionalmente con los plástidos. Los materiales utilizados correspondían a líneas de una población especialmente diseñada para el estudio genético del albinismo en cebada, y a variedades de cebada con porcentajes de regeneración de plantas albinas muy distintos. Para este estudio se seleccionaron tres colecciones de genes que permitían abarcar distintos aspectos del albinismo en cultivo de anteras en cebada: 30 genes que se inducen en las primeras fases de la embriogénesis de la microspora (EM), 17 genes mapados en regiones cromosómicas donde se habían localizado QTLs asociados al albinismo en cultivo de anteras (QTL-Alb) (Muñoz-Amatriain y col. 2008) y 20 genes que mostraban diferencias de expresión en distintos mutantes albinos de cebada (M-Alb) (Svensson y col. 2006). Para todos los genes se establecieron las mejores homologías ente las secuencias de los genes y los genes registrados en las bases de datos generales de secuencias y en las específicas de arroz y de Arabidopsis, y así poder asociar una función a cada uno de los genes. Como las fases iniciales de la embriogénesis de la microspora se realizan en condiciones de oscuridad y en materiales no fotosintéticos, el primer análisis se realizó en hojas verdes y albinas de plantas regeneradas por cultivo de anteras. Esta estrategia nos permitiría seleccionar los genes que presentan una expresión alterada en los materiales albinos respecto a los verdes. Las hojas se tomaron de tres variedades de cebada (Vanessa, Siberia y Static) que en cultivo de anteras presentaban porcentajes de albinismo muy altos, superiores al 90% (Apartado 3.1.1, tabla 4) (Muñoz-Amatriaín y col. 2008). En la comparación de la expresión génica de los 67 genes entre hojas verdes y albinas de las tres variedades (Anexo II), se observó que la mayoría de los genes presentaban diferencias de expresión al menos en alguna de las variedades. Por lo Discusión 79 desplazamiento en el punto de inducción de los genes entre la línea verde y la línea albina, aunque en este caso de mayor proporción y de signo contrario, ya que en DH6148 se inducen alrededor de 8dc y en la línea albina DH6183 no lo hacen hasta los 16dc. En estudios que caracterizaban la estructura de los plástidos a lo largo del cultivo de anteras de cebada (Caredda y col.1999, 2000 y 2004) se observó que en una variedad que producía plantas verdes, ya al inicio del cultivo se aprecia un aumento en el número de membranas internas, sin embargo, en la variedad albina no se aprecia un aumento hasta los 12dc. Estas observaciones concuerdan con las diferencias en los perfiles de expresión en genes implicados en el desarrollo de plástidos de este estudio. Hay que remarcar que en los análisis realizados en las variedades no se apreciaron diferencias en los perfiles de expresión en ninguno de los genes, por lo que será necesario continuar los estudios en nuevas líneas y variedades para comprobar estas asociaciones. Finalmente, los resultados obtenidos con el gen de función desconocida HvALB5 (Figura 31) tampoco eran consistentes entre el análisis de las líneas y de las variedades, mientras en las líneas su función podría estar asociada a la línea albina, en las variedades únicamente se aprecian diferencias en el nivel de expresión siendo ligeramente superior en la variedad albina. Como en algunos de los genes las diferencias de expresión entre líneas o variedades eran débiles y de carácter cuantitativo, siendo difíciles de interpretar cuando se realizan los análisis de expresión mediante técnica de PCRSemicuantitva, se ensayó el uso de la técnica PCRCuantitativa en muestras de anteras de las líneas DHs. Sin embargo, la disponibilidad de sólo dos replicas biológicas de los materiales y la dificultad para obtener cebadores de alta calidad para los genes de interés, limitó esta aproximación. Así de los 7 genes seleccionados, solo se pudieron analizar dos genes RHB1A y Hv-ALB5. Este estudio se ha de considerar como una aproximación que nos ha permitido determinar los problemas existentes al aplicar esta técnica a estos materiales y la necesidad de una optimización de las distintas fases del proceso. Uno de los problemas asociados a las técnicas de embriogénesis de la microspora es la variabilidad existente en la respuesta a cultivo de los distintos lotes de plantas donadoras de anteras. En estudios de Jacquard y col. (2006) ya se Discusión 80 determinó que parámetros fisiológicos internos de las espigas, como los asociados al ciclo anual del cultivo y a la posición de la espiga donadora en la planta, podrían ser algunos de los factores determinantes de la variabilidad observada. Aunque normalmente, debido a la elevada sensibilidad de la PCRCuantitativa se deben emplear al menos tres replicas biológicas, se ha propuesto que al estudiar procesos de cultivo in vitro serían 5 el número de réplicas biológicas necesarias (Boutilier, K., comunicación personal). Al tratarse de muestras de difícil obtención, el número de muestra que se disponía de partida era reducido y limitaba la obtención de cDNA para el análisis. Otro de los problemas detectados al trabajar con las secuencias presentes en la base de datos del HarvEST Barley V.1.74 es que en muchos casos estas secuencias son cortas, con lo que el diseño de cebadores óptimos para PCRCuantitativa se queda muy limitado. Con la reciente secuenciación del genoma de cebada y el diseño de programas de búsqueda de secuencias asociados al trabajo de secuenciación, este problema podría solventarse (The International Barley Genome Sequencing Consortium, 2012). Este trabajo proporciona un punto de partida para el estudio de los mecanismos moleculares que intervienen en la determinación del albinismo en las primeras fases del cultivo de anteras de cebada. Se han podido identificar genes implicados en el control de la expresión génica ligada a procesos de trascripción, biogénesis de ribosomas, procesamiento de rRNA, traducción, que podrían estar implicados en la disfunción de los plástidios, en las estructuras embriogénicas que regeneraran las plantas albinas en cultivo de anteras. El mayor número de genes con perfiles de expresión alterados en materiales albinos, se dio en la comparación entre líneas DH especialmente diseñadas para el estudio del albinismo. En estas se pudo determinar que tanto los genes RLUB y NOS1 implicados en mecanismos de control de la traducción en plástidos como los genes DAG y TAB implicados en procesos de desarrollo funcional de los plástidos, presentaban un pico de expresión a los 8dc en la línea DH6148 con un porcentaje de albinismo del 4,17% (Figura 32). Discusión 81 Figura 32.- Representación cronológica de la expresión de los genes NOS1, RLUB, DAG y TAB, en cultivo de anteras a los 0 y 4 días de inducción por estrés (0dp y 4dp) y a los 4, 8, 12 y 16 días de cultivo de anteras (4dc, 8dc, 12dc y 16dc) de las líneas DH6148 y DH6183. Sin embargo, en la línea DH6183 con un porcentaje de albinismo elevado (87,49%) no se aprecia esta coordinación (Figura 32) ya que los genes implicados en el control de la traducción “per se” (RLUB y NOS1) presentan picos de expresión a los 4dc y los genes DAG y TAB asociados al control del desarrollo funcional de los plástidos se expresan a los 16dc, cuando las estructuras embriogénicas ya están bien formadas. Estos resultados parecen indicar que al inicio de la embriogénesis de la microspora se puede producir una descoordinación entre los mecanismos básicos de control de la expresión génica y los destinados a alcanzar la funcionalidad de los plástidos, y que está descoordinación podría ser la causa del albinismo en algunos materiales. Discusión 82 Cabe destacar que algunos de estos genes como RLUB y NOS1 también presentaban diferencias en los perfiles de expresión cuando se analizaban las primeras fases del cultivo de anteras en variedades comerciales de cebada con distinto porcentaje de albinismo. Aunque para realizar una comparación más correcta sería necesario realizar el análisis en las mismas fases en todos los materiales. Por primera vez se han determinado mecanismos moleculares que podrían estar asociados al albinismo en las fases iniciales de la embriogénesis de la microspora en cebada. Las dificultades tanto del abordaje del trabajo en distintos materiales con las dificultades técnicas de puesta a punto de las condiciones de la PCRCuantitativa, demuestra la complejidad del estudio. Todavía existen muchas incógnitas para comprender la determinación del albinismo en las fases de cultivo estudiadas. La continuidad de este tipo de estudios se hace necesaria para conseguir el objetivo final de a través de, una modificación de las condiciones de cultivo, se elimine el fenómeno de albinismo y se amplie la producción de líneas DH en la mejora vegetal. 6.- CONCLUSIONES Conclusiones 84 1. La comparación de la expresión génica de los genes asociados funcionalmente con los plástidos entre hojas verdes y albinas de plantas obtenidas por cultivo de anteras de cebada, demostró que las hojas albinas presentaban grandes alteraciones en la expresión de genes. 2. De los 67 genes analizados, se seleccionaron 12 genes por su consistencia en el perfil de expresión entre las hojas verdes y albinas de las variedades Vanessa, Siberia y Static, y 3 genes que permitían diferenciar entre estas variedades. 3. Se caracterizaron los perfiles de expresión de los genes seleccionados en las primeras fases del cultivo de anteras en dos líneas DHs de una población especialmente diseñada para el estudio genético del albinismo en cebada, y en tres variedades con distinto porcentaje de regeneración de plantas albinas: Orelie, Volley y Riviera. 4. Se observó que los genes relacionados con la fase luminosa de la fotosíntesis (WCAB-1, WCAB-2 y PSAN,) no se expresaban, no pudiendo determinar si se debía a alteraciones asociadas al proceso o a su dependencia de la luz. 5. Entre los genes asociados a la fase oscura de lo fotosíntesis (RHB1A y SBE), destacó el gen SBE que codifica para una enzima de ramificación del almidón. Este gen presentaba una inducción más tardía en la variedad albina Riviera y coincide con los resultados de los niveles de almidón en cultivo de anteras obtenidos por otros autores. 6. El estudio de los genes asociados al estrés (RNS y JRL) indicó que la diferente respuesta al estrés de las plantas albinas se establecía en fases del cultivo de anteras más avanzadas de las estudiadas en este trabajo. 7. Los genes NOS1 y RLUB que intervienen en el control de la expresión génica asociados a procesos de edición de RNA y traducción, mostraban perfiles de expresión diferentes entre materiales verdes y albinos. Estos resultados, concuerdan con los descritos por otros autores, con presencia de defectos en la edición del RNA traducción en plantas albinas. Conclusiones 85 8. Los genes DAG y TAB, relacionados a procesos de desarrollo de los plástidos, se inducen más tarde en la línea albina DH6183. Esto coincide con estudios realizados por otros autores, que describían el desarrollo tardío de los plástidos en plantas albinas. 9. Al comparar los perfiles de expresión de los genes NOS1, RLUB, DAG y TAB en las primeras fases de cultivo de anteras, se aprecia que en los materiales albinos al inicio de la embriogénesis de la microspora se produce una descoordinación entre los mecanismos básicos de control de la expresión génica y los destinados a alcanzar la funcionalidad de los plástidos. Esta descoordinación podría ser causa del albinismo. 10. Para poder confirmar los resultados obtenidos mediante PCRCuantitativa es necesario optimizar la técnica tanto en el número de réplicas biológicas (más de tres réplicas) como en el origen de las secuencias de cebada para un diseño óptimo de cebadores para PCRCuantitativa. 7.- BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 87 Aghdasi, M., Fatahi, S. y Sadeghipour, H. R. (2012). Identification and Characterization of LHCB1 CoSuppressed Line in Arabidopsis. 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Posteriormente, las plántulas fueron trasplantadas a macetas con el mismo sustrato y trasladadas a una cámara de crecimiento a 12ºC, con un fotoperiodo de 12/12h luz/oscuridad, y 500µEm-2s-1 de intensidad luminosa proporcionada por lámparas de halogenuro metálico de alta presión (Philips Powertone HPI-T Plus 400 W). Después de 21 días, la temperatura se incrementó a 18-21ºC y el fotoperiodo a 16/8h luz/oscuridad, hasta que las espigas fueron cosechadas (Figura 33). La humedad relativa para ambos periodos fue del 70-80%. En el momento de la preparación del sustrato, éste se fertilizó con una combinación de N:P:K (15:15:15). Además, la fertilización foliar “Zelti foliage” (Zeneca-Agro S.A) que contiene N:P:K (20:20:20) y micronutrientes se aplicó una vez por semana durante la fase de crecimiento. Figura 33.- Plantas de cebada en cámara de crecimiento a 18-21ºC y fotoperiodo de16/8h luz/oscuridad. El estado óptimo de desarrollo de las microsporas para el cultivo de anteras es de uninucleado medio a tardío. Para seleccionar las espigas en dicho estado se utilizó Anexo I 100 el carácter morfológico: distancia entre las lígulas de la hoja bandera y la próxima hoja inferior. Todo el procedimiento que se describe a continuación, se realizó con material de laboratorio esterilizado y en condiciones asépticas en una cámara de flujo horizontal. Y durante todo el procedimiento las placas que contenían material vegetal se mantuvieron selladas con papel del tipo Parafilm, entre una fase y otra. Las espigas cosechadas envueltas en su vaina, se esterilizaron con etanol al 70%. Posteriormente se eliminó la vaina y se colocaron en placas Petri de 9cm Ø, que contenían una gota de agua. Las placas se almacenaron en una nevera a 4ºC durante 2-3 días hasta su posterior uso. Tratamiento de estrés Las anteras fueron extraídas de la flor utilizando un microscopio estereoscópico y se inocularon en el medio de tratamiento de estrés. Las placas se incubaron en oscuridad a 24ºC durante 4 días. El medio de tratamiento de estrés en cebada (TEC) estaba compuesto por 0,7M manitol, 40mM CaCl2 y 8g/l agarosa Sea Plaque (Lonza). El estrés aplicado a las anteras es de inanición y presión osmótica. Inducción de embriogénesis. Después de los 4 días de tratamiento de estrés, se seleccionaron las anteras que habían respondido y presentaban un aspecto hinchado y brillante (Figura 34.a). Estas se inocularon en placas Petri de 3cm Ø con el medio de inducción FGHI suplementado con 1mg/l de BA (6bencilaminopurina) y 200g/l de Ficoll tipo 400. Las placas se incubaron a 24ºC en oscuridad y después de 10 o 12 días de cultivo, se añadieron 2ml de medio FHGI con 400g/l de Ficoll tipo 400 (Kao y col. 1991) (Figura 34.b y c). Regeneración de embriones Después de 25 días de cultivo, los embriones de buena calidad (Figura 34.d) fueron transferidos a medio de regeneración FHGR en placas de Petri de 6cm Ø (Castillo y col. 2000, Maluszynski y col. 2003a). Las placas se incubaron a 24ºC, en oscuridad durante los primeros 2 días. Posteriormente se transfirieron a la luz con un Anexo I 101 fotoperiodo de 16/8h luz/oscuridad y una intensidad luminosa de 200µEm-2s-1, proporcionada por lámparas fluorescentesincandescentes (Mazdafluor TF 58W/LJ 54-Philips 25W) y 7080% de humedad relativa, hasta la obtención de plántulas verdes o albinas (Figura 34.e). Figura 34.- Producción de plantas doblehaploides en cebada mediante el cultivo de anteras: a) Anteras sometidas a un tratamiento de estrés en un medio con manitol; b) Anteras en la fase de inducción, donde las microsporas empiezan a dividirse; c) Formación de estructura embriogénicas; d) Embriones bien diferenciados; e) Plántulas verdes y albinas en el medio de regeneración; f) Plántulas verdes en una caja Magenta que contiene un medio para el desarrollo del sistema radicular; g) Trasplante a tierra y aclimatación de las plantas y h) Plantas en invernadero para obtención de semillas. Crecimiento y vernalización de las plantas. Todas las plántulas verdes regeneradas se transfirieron a unas cajas Magenta que contenían un medio pobre de sales, suplementado con 30g/l de sacarosa, 2mg/l de NAA, y 8g/l de agar, para el desarrollo de un buen sistema radicular (Figura 34.f). Para la vernalización de las plantas, estas cajas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 4ºC, 8/16h luz /oscuridad, y 100µEm-2s-1 durante un mes. Traspaso de las plantas al suelo Tras la vernalización, las plántulas se colocaron en una cámara de crecimiento a 16ºC, 12/12h luz/oscuridad de fotoperiodo, con 200µEm-2s-1 proporcionada por lámparas incandescentes, fluorescentes y 90-100% HR. Anexo I 102 Una semana más tarde, las plantas se traspasaron a macetas y se cubrieron con un vaso de plástico durante la primera semana para su aclimatación (Figura 34.g).Las plantas se mantienen en esta cámara durante otros 15 a 21 días más y se transfieren a invernaderos para su desarrollo y obtención de la semilla (Figura 34.h). 9.- ANEXO II Anexo II 104 Expresión génica en hojas albinas y verdes de plantas obtenidas por cultivo de anteras en las variedades Vanessa, Siberia y Static. Para realizar los análisis de expresión génica, se realizaron amplificaciones por PCRSemicuantitativa. Para ello, se extrajo el RNA de las muestras de hojas y se sintetizó el cDNA. Con el cDNA se realizaron las amplificaciones, utilizando los cebadores diseñados a partir de las secuencias de los genes seleccionados (Apartado 3.3.4.1, Tablas 8, 9, 10 y 11). Se empleó como gen control Hv-Actin2. Los fragmentos amplificados se visualizaron en geles de agarosa. Los genes estudiados corresponden a las colecciones siguientes: - (EM) Colección de genes inducidos en las primeras fases de la embriogénesis de la microspora y que estaban asociados al componente celular plastídico - (QTL-Alb) Colección de genes asociados a plastídios que han sido mapados en regiones cromosómicas donde se había localizado algún QTLs de albinismo en cultivo de anteras. - (M-Alb) Colección de genes que permitían diferenciar entre distintos tipos de mutantes albinos de cebada. - Análisis de la colección EM De los 30 genes que componían esta colección, los genes SRS, PK1B, CRS1 y Hv-ALB2 no amplificaron en las muestras de hojas. Según los resultados obtenidos mostrados en la figura 35, se seleccionaron los genes RRF, NOS1, RLUB, RHB1A, DAG, SBE, TAB, RPL28 y SIG para continuar con los estudios.