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TRABAJO FIN DE GRADO “FACTORES QUE AFECTAN A LA MORFOMETRÍA DEL NÚCLEO ESPERMÁTICO EN Bos taurus” AUTOR: LEYRE VILLANOVA SEBASTIÁN DIRECTORES: JESÚS YÁNIZ PÉREZ DE ALBÉNIZ SANDRA VICENTE FIEL ENSEÑANZA: GRADO EN INGENIERÍA AGROALIMENTARIA Y DEL MEDIO RURAL FECHA: NOVIEMBRE 2014 AGRADECIMIENTOS Agradecimientos AGRADECIMIENTOS En este apartado quisiera agradecer a todas las personas que me han ayudado en la realización de este Trabajo Fin de Grado. En primer lugar a mis dos directores: Jesús Yániz y Sandra Vicente por su continua dedicación, dirección, ayuda y por todo lo que me han enseñado durante el desarrollo de este trabajo. Agradecerles que me hayan apoyado y animado en todo momento. A mi familia: en especial a mis padres, Manolo y Arantxa, por darme su cariño y animarme durante toda mi formación, sin su esfuerzo nada de esto hubiera sido posible. A mi abuela: Aurelia, se que esté donde esté estará muy orgullosa de mí. A mi novio: Chema, por confiar en mí, apoyarme y darme su cariño durante todo este tiempo. Por último a mis amigos y amigas: tanto a mis compañeros de carrera como a los de siempre. En especial a Andrea, María y Miguel, por todos los momentos vividos. ÍNDICE Índice ÍNDICE GENERAL Nº DE PÁGINA 1.-RESUMEN ................................................................................................................................. 1 2.-ABSTRACT ................................................................................................................................. 2 3.-INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3 4.-OBJETIVOS ................................................................................................................................ 5 5.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 6 5.1.-El espermatozoide en mamíferos .................................................................................... 6 5.1.1. Morfología del espermatozoide ................................................................................. 6 5.1.1.1.-La cabeza del espermatozoide ............................................................................. 7 5.1.1.2.- El flagelo del espermatozoide.............................................................................. 9 5.1.1.3.-Membrana plasmática .......................................................................................... 9 5.2.-Espermiograma ............................................................................................................... 10 5.2.1.- Estudio del volumen y concentración espermática ................................................. 11 5.2.2.-Estudio de la movilidad ............................................................................................. 12 5.2.3.- Estudio de la viabilidad espermática ........................................................................ 12 5.3.-Estudio de la morfología espermática ............................................................................ 13 5.4.-Estudio de la morfometría espermática ......................................................................... 14 5.4.1.-Factores que afectan a la morfometría ..................................................................... 16 5.4.1.1.-Citometría de flujo ............................................................................................... 18 5.4.1.2.-Hibridación fluorescente in situ (FISH) ................................................................ 19 6.-MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................................... 21 6.1.-Reactivos ......................................................................................................................... 21 6.2.-Recogida y obtención del semen .................................................................................... 21 6.3.- Manipulación del semen ................................................................................................ 21 6.3.1.-Movilidad espermática .............................................................................................. 22 6.4.- Preparación de las muestras para su evaluación morfométrica ................................... 23 6.4.1.-Fresco ........................................................................................................................ 23 Índice 6.4.1.1.- Tratamiento Fresco-1: Marcaje con H342 + IP ................................................... 23 6.4.1.2.- Tratamiento Fresco-2: Marcaje solamente con H342 ........................................ 23 6.4.1.3.- Tratamiento Fresco-3: Marcaje con IP ............................................................... 23 6.4.2.- Frotis ......................................................................................................................... 23 6.4.2.1.- Tratamiento Frotis-1: Marcaje con H342 ........................................................... 24 6.4.2.2.-Tratamiento Frotis-2: Marcaje con IP .................................................................. 24 6.5.- Imagen de fluorescencia y CASMA ................................................................................ 24 6.6.- Hibridación fluorescente in situ (FISH) .......................................................................... 25 6.6.1.-Preparación de muestras espermáticas .................................................................... 26 6.6.2.- Hibridación ............................................................................................................... 26 6.6.3.- Marcaje fluorescente ............................................................................................... 27 6.7.-Diseño experimental ....................................................................................................... 28 6.7.1-Estudio 1: Efecto de la viabilidad del espermatozoide en la morfometría del núcleo espermático ......................................................................................................................... 28 6.7.2.-Estudio 2: Efecto de la centrifugación sobre la morfometría del núcleo espermático espermático ......................................................................................................................... 28 6.7.3.-Estudio 3: Diferencias morfométricas entre espermatozoides portadores del cromosoma X y del cromosoma Y ....................................................................................... 28 6.8.-Análisis estadístico .......................................................................................................... 29 7.-RESULTADOS ........................................................................................................................... 30 7.1.- Estudio 1: Efecto de la viabilidad del espermatozoide en la morfometría del núcleo espermático ........................................................................................................................... 30 7.2.-Estudio 2: Efecto de la centrifugación sobre la morfometría del núcleo espermático .. 33 7.3.-Estudio 3: Diferencias morfométricas entre espermatozoides portadores del cromosomas X y del cromosoma Y ........................................................................................ 35 8.-DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 39 9.-CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 42 10.-BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 43 Índice ÍNDICE DE TABLAS Nº DE PÁGINA Tabla 1. Diferencias existentes entre espermatozoides X e Y, utilizadas por diferentes autores como base para la separación espermática (Adaptación de Parrilla, 2003) ............................... 17 Tabla 2. Diferencias morfométricas de los parámetros primarios entre espermatozoides vivos y muertos ....................................................................................................................................... 34 Tabla 3. Diferencias morfométricas de los parámetros secundarios entre espermatozoides vivos y muertos ........................................................................................................................... 34 Tabla 4. Diferencias morfométricas intra-macho entre muestras sin centrifugar y centrifugadas ..................................................................................................................................................... 36 Tabla 5. Diferencias morfométricas intra-macho entre espermatozoides con cromosoma X y cromosoma Y ............................................................................................................................... 39 Tabla 6. Diferencias de los parámetros morfométricos primarios y secundarios intra-macho entre muestras sexadas y no sexadas ......................................................................................... 40 Índice ÍNDICE DE FIGURAS Nº DE PÁGINA Figura 1: Estructura del espermatozoide (Audesirk et al, 2003) ................................................... 6 Figura 2: ADivisión estrcutural del espermatozoide. BCorte sagital de la célula espermática: 1. Membrana espermática, 2. Membrana acrosomal externa, 3. Contenido acrosomal, 4. Membrana acrosomal interna, 5. Núcleo celular, 6. Contenido de ADN altamente condensado, 7. Anillo posterior, 8. Pieza media, 9. Mitocondria, 10. Anillo anular, 11. Flagelo, C y DReacción acrosomal (Flesch y Gadella, 2000). .............................................................................. 7 Figura 3: Representación gráfica de las principales anomalías espermáticas ............................ 14 Figura 4: Parámetros morfométricos medidos en este estudio ................................................. 15 Figura 5: Esquema general del citómetro de flujo ..................................................................... 19 Figura 6: Esquema de la hibridación fluorescente in situ ........................................................... 20 Figura 7: Cámara Makler en posición para su visionado al microscopio. ................................... 23 Figura 8: Sistema CASA – microscopio óptico conectado a un software de análisis de imágenes en el ordenador. .......................................................................................................................... 23 Figura 9: Microscopio de epifluorescencia (DM4500B, Leica, Alemania), al que va acoplado una cámara Canon Eos 400D digital que se controlaba mediante un ordenador con el programa DSLR Remote Pro software (Sistemas de Breeze). ...................................................................... 26 Figura 10: Núcleos espermáticos capturados automáticamente con el software Image J ........ 32 Figura 11: A) Núcleos espermáticos teñidos en fresco con H342 e IP (FRESCO-1). B) Núcleos espermáticos teñidos en fresco con H342 (FRESCO-2). C) Núcleos espermáticos teñidos en fresco con IP (FRESCO-3). D) Núcleos espermáticos de frotis teñidos con H342 (FROTIS-1). E) Núcleos espermáticos de frotis teñidos con IP (FROTIS-2).. ....................................................... 32 Figura 12: Fotografías, realizadas con distintos filtros, de núcleos espermáticos portadores de cromosomas X o Y marcados con fluorescencia. ........................................................................ 35 Índice Figura 13: A) Núcleos espermáticos portadores del cromosoma Y. B) Núcleos espermáticos portadores del cromosoma X. C) Fotografía utilizada para el análisis morfométrico, en la cual los núcleos espermáticos estaban fijados con glutaraldehído y teñidos con H342.................... 38 OBJETIVOS Objetivos 5 4.-OBJETIVOS El objetivo general de este Trabajo Fin de Grado es estudiar los factores que influyen en la morfometría del núcleo espermático utilizando el método CASMA-F. Los objetivos específicos son los siguientes: 1. Estudiar el efecto de la viabilidad del espermatozoide en la morfometría del núcleo espermático. 2. Comprobar si el proceso de centrifugación de la muestra de semen puede afectar a la morfometría del núcleo del espermatozoide. 3. Analizar las diferencias morfométricas entre espermatozoides portadores del cromosoma X y del cromosoma Y utilizando el método CASMA_F. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión bibliográfica 6 5.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5.1.-El espermatozoide en mamíferos El espermatozoide (del griego esperma-semilla y zoon-animal) es una célula altamente especializada que ha evolucionado para cumplir una función biológica compleja, fecundar al oocito. Se trata de una célula haploide, producto final del proceso de la gametogénesis en el macho, portadora de la información genética paterna. Las células germinales masculinas reducen el número diploide de cromosomas al comenzar la pubertad, manteniendo los procesos de división y diferenciación de forma cíclica durante toda la vida. La reducción del número de cromosomas a la mitad es necesaria para que tras la fecundación se origine un zigoto diploide, pero además, durante la meiosis se produce el proceso de entrecruzamiento cromosómico y en consecuencia el intercambio genético, lo que supone un incremento en la diversidad genética (Benito, 2010). Los espermatozoides constituyen aproximadamente el 25% del volumen del eyaculado (semen normal) y lo restante es secreción de tubos y glándulas. Físico-químicamente están integrados por un 86% de agua, sustancias inorgánicas (sodio, potasio, calcio, magnesio, fósforo, etc.), sustancias orgánicas (proteínas, hidratos de carbono, ácido láctico y cítrico, vitaminas, etc.) y otros componentes en menor cuantía. 5.1.1. Morfología del espermatozoide Los espermatozoides son células altamente diferencias de 50 a 80 µm de longitud. Podemos dividir la célula espermática en 2 regiones principales y diferenciadas: la cabeza y el flagelo o cola. Dentro de ellas podemos distinguir varias estructuras, en orden cefálico-caudal serían: en la cabeza, el acrosoma y el núcleo, el cuello, y la cola, con la pieza intermedia, la pieza principal y la pieza terminal (Fig 1). A continuación describiremos cada una de sus partes. Figura 1: Estructura del espermatozoide (Audesirk et al, 2003) Revisión bibliográfica 7 5.1.1.1.-La cabeza del espermatozoide Presenta variaciones morfológicas importantes entre las distintas especies. En el caso del toro es ovoide y plana. En cuanto al tamaño también existen considerables diferencias (Bhattacharyya et al., 1982; Eddy et al., 1988). Por ejemplo, la cabeza del espermatozoide de morueco mide 8,7 μm de longitud y 4,6 μm de ancho (Sancho et al., 1998), el de toro mide 8,79,7 µm de longitud y 4,6-4,8 µm de ancho (Cummins y Woodwall, 1985), mientras que el espermatozoide humano presenta 5-6 μm de longitud y 2,5-3,5 μm de ancho (WHO, 1999). Podemos distinguir dos estructuras fundamentales: el acrosoma y el núcleo, además de una pequeña cantidad de estructuras citoesqueléticas, un reducido citoplasma y la membrana plasmática. Estructuralmente podemos dividir la cabeza en 4 segmentos: apical, pre-ecuatorial, ecuatorial y post-ecuatorial (Fig 2-A). Figura 2: ADivisión estructural del espermatozoide. BCorte sagital de la célula espermática: 1. Membrana espermática, 2. Membrana acrosomal externa, 3. Contenido acrosomal, 4. Membrana acrosomal interna, 5. Núcleo celular, 6. Contenido de ADN altamente condensado, 7. Anillo posterior, 8. Pieza media, 9. Mitocondria, 10. Anillo anular, 11. Flagelo, C y DReacción acrosomal (Flesch y Gadella, 2000). El acrosoma cubre aproximadamente los dos primeros tercios de la cabeza del espermatozoide. Se pueden diferenciar tres regiones: la porción más proximal denominada segmento apical, situada por encima del núcleo; la porción principal, conocida como segmento principal; y la región caudal, llamada segmento ecuatorial en la que se produce un abrupto Revisión bibliográfica 8 estrechamiento con una ligera condensación de su contenido. Tiene una membrana interna y una membrana externa que delimitan su contenido (Fig 2-B). Posee diversas enzimas hidrolíticas incluyendo, entre otras, proacrosina, hialuronidasas, esterasas e hidrolasas. Estas encimas son esenciales para la lisis de la zona pelúcida y la penetración de las células que rodean al ovocito. La liberación de estas enzimas al exterior como consecuencia de la fusión de ambas membranas es un proceso conocido como reacción acrosomal (Fig. 2-C, D) (Avilés López, 2011). El núcleo contiene un número haploide de cromosomas y nucleoproteínas, principalmente protaminas, y en menor cantidad estructuras del citoesqueleto. Todo ello rodeado por la membrana nuclear. Estas proteínas tienen funciones estructurales y enzimáticas. La cromatina espermática se encuentra altamente compactada, ocupando menos espacio que en las células somáticas, de forma que el empaquetamiento del ADN con las proteínas nucleares es tan estrecho que la transcripción resulta casi imposible. Durante la espermiogénesis ocurre una remodelación que conlleva a la producción de una célula altamente especializada pero con un núcleo transcripcionalmente inactivo y con la totalidad del citoplasma encapsulado en forma de cuerpo residual. Durante este proceso se produce una condensación progresiva de la cromatina que está asociada a modificaciones químicas en el ADN y proteínas nucleares, con una sustitución de las histonas por protaminas, proteínas pequeñas ricas en cisteína. Durante el tránsito epididimario se estabiliza este mecanismo de condensación con el incremento de puentes disulfuro a partir de los grupos tiol de los residuos de cisteína. La condensación de la cromatina disminuye el volumen del núcleo facilitando así la movilidad del espermatozoide y es fundamental para proteger el material genético del gameto masculino durante su exposición a ambientes agresivos como pueda ser la elevada acidez del tracto reproductor femenino. Cuando se ha producido la penetración del ovocito, el espermatozoide debe descondensar su cromatina para formar el pronúcleo masculino, reduciendo, como requisito, las uniones disulfuro del núcleo espermático. La capacidad fecundante del espermatozoide dependerá, entre otros factores, de la adecuada sucesión de estos tres eventos: condensación de la cromatina durante la espermatogénesis, estabilización durante la maduración espermática y descondensación dentro del ovocito para su fecundación. Cualquier daño del núcleo, dada su inercia metabólica sería imposible de reparar, lo que llevaría a una caída de la fertilidad (Sakkas et al., 1995). Revisión bibliográfica 9 5.1.1.2.- El flagelo del espermatozoide El flagelo o cola comprende cuatro regiones principales: el cuello, la pieza intermedia, y los segmentos principal y terminal (Fig 2). El cuello es la región del espermatozoide que une la cabeza con el flagelo. Es una zona frágil y estructuralmente compleja en la que se diferencia la pieza de conexión, los centriolos y algunas mitocondrias. La pieza intermedia se encuentra a continuación del cuello. Está caracterizada por la presencia de una gran cantidad de mitocondrias concentradas en una vaina helicoidal que rodea al complejo axonema y las fibras densas. El axonema consiste en un par de microtúbulos únicos que están rodeados por un paquete cilíndrico de dobles microtúbulos dispuestos uniformemente. Dicha estructura se conoce ordinariamente con la fórmula 9 + 2 y se prolonga distalmente a lo largo de toda la cola hasta casi la punta de la pieza terminal. Se considera que el componente motor del flagelo es el axonema y las fibras densas, debido a su composición de proteínas ricas en cisteína, que presentan grupos sulfhidrilo (-SH) lo que da lugar a la formación de puentes disulfuro (-S-S-) durante la maduración espermática y que podrían conferir propiedades elásticas y facilitar así la propagación del movimiento ondulatorio a través del flagelo (Soler et al., 1994). La pieza intermedia se caracteriza por presentar bajo la membrana plasmática, una vaina de mitocondrias orientadas circularmente y dispuestas helicoidalmente. Las mitocondrias son las encargadas de producir la energía necesaria que requiere el movimiento espermático. La parte caudal de la vaina mitocondrial es denominada anillo de Jensen, e indica la barrera entre pieza media y la pieza principal. La pieza principal está constituida por vainas fibrosas, el citoesqueleto que rodea el axonema y las fibras densas del exterior. Su función principal es la de proporcionar movilidad al espermatozoide (Pesch y Bergmann, 2006). Por último, la pieza terminal es la parte distal de la vaina fibrosa. Esta contiene únicamente el axonema central cubierto por la membrana plasmática. 5.1.1.3.-Membrana plasmática La membrana plasmática, o plasmalema, es esencial para la función de los espermatozoides. Esta delicada e inestable capa proporciona protección física a la célula, actúa como una barrera selectiva para el paso de sustancias, y desempeña un papel fundamental en Revisión bibliográfica 10 las interacciones con otras células, como las células epiteliales en el tracto genital de la hembra y los oocitos. Está situada externamente a la cabeza y flagelo del espermatozoide y responde al modelo de mosaico fluido (Singer y Nicholson, 1972), compuesta por proteínas integradas en una bicapa de fosfolípidos. En su composición química, además presenta moléculas de colesterol, que juegan un papel determinante como sustancias moduladoras de la fluidez de membrana. Los ácidos grasos y los glicolípidos son poco abundantes. En las membranas espermáticas de mamíferos, la cantidad de proteínas es casi la misma que la de lípidos totales. Una característica única de la membrana plasmática del espermatozoide es la presencia de dominios, regiones perfectamente definidas en las que varía su composición y función. En los mamíferos los principales dominios se encuentran en la cabeza, en la región acrosomal y en la región postacrosomal (parte posterior de la cabeza y pieza conectiva). La región acrosomal (parte anterior de la cabeza), a su vez se subdivide en tres dominios para los segmentos apical, principal y ecuatorial. Los segmentos apical y principal juntos suelen referirse como “capuchón acrosomal”. 5.2.-Espermiograma Durante mucho tiempo se ha realizado un análisis rutinario del semen como única herramienta para valorar los eyaculados (Chan et al., 1985). En este examen rutinario se incluye la valoración del número de células presentes en el eyaculado, el estudio de la motilidad y su morfología. Se caracteriza por la utilización de una serie de técnicas de simple ejecución, con un coste relativamente bajo y basado en una evaluación subjetiva, que ha permitido su amplia difusión en los centros de inseminación artificial. Por contra, presenta unas tasas de correlación con la fertilidad generalmente bajas (McClure y Tom, 1991) y dificulta la reproducibilidad satisfactoria tanto intracomo entretécnicos. Por ello se han desarrollado los sistemas de análisis de semen asistido por ordenador (CASA, computer assisted sperm analysis); (Davis et al., 1992; Kruger et al., 1993). Los sistemas CASA proporcionan una serie de parámetros de movilidad y morfométricos objetivos que facilitan la estandarización de la evaluación del espermatozoide. Los principales limitantes de esta técnica son que requiere mucho tiempo en lo referente a la evaluación morfométrica y que el coste es mayor. Estos sistemas constan de varias unidades interdependientes: un microscopio conectado a una cámara de vídeo, que envía la imagen desde el microscopio a un ordenador, donde un analizador digital de imagen captura varias fotografías seriadas de cada campo microscópico seleccionado, normalmente en menos de 1 segundo. Revisión bibliográfica 11 5.2.1.- Estudio del volumen y concentración espermática La determinación del volumen se realiza inmediatamente después de su recogida, valorándolo directamente en el tubo colector (graduado en escala de 0,1 ml), evitando el error producido al pasar el eyaculado de un recipiente a otro para su valoración (Maxwell y Evans, 1990). La determinación precisa del volumen de un eyaculado es imprescindible para determinar el número total de espermatozoides contenido en el mismo. El volumen de un eyaculado de toro es de 4-8 ml y tiene una concentración espermática de entre 1500-2500 millones de espermatozoides/ml. La posibilidad de estudiar adecuadamente la concentración espermática es un importante factor en el campo de la inseminación artificial. Podemos encontrar grandes diferencias de concentración entre un eyaculado y otro, siendo importante conocer el número de espermatozoides que existe en cada uno de ellos. Las técnicas más utilizadas son el recuento en cámaras hemocitométricas y la utilización de espectrofotómetros (Quintero, 2003) ya que los contadores de partículas, los métodos fluorométricos y los sistemas de análisis de semen asistidos por ordenador son más complejos. El recuento en cámara es el más utilizado por su bajo coste y su alta precisión, ya que se realiza una medición directa del número de espermatozoides presentes en una cámara de volumen conocido. Tradicionalmente, la cámara de Neubauer ha sido la más utilizada ya que está recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), aunque se producen variaciones debido a distribuciones no homogéneas de las células dentro de la cámara y a imprecisiones en el proceso de dilución (Woelders, 1991). Para aumentar la precisión del procedimiento y la reproducibilidad de los resultados se han creado nuevas cámaras que utilizan la muestra sin diluir (Cardona Maya et al., 2008), como la cámara Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel), Microcell (Concepcion Technologies, Natick, MA, EE.UU.), Horwell® (Horwell Ltd, Londres, Reino Unido), Blaubrand®, Bürker®, ISAS® y Cámara de recuento Leja®, para determinar la concentración de espermatozoides. La determinación de la concentración espermática mediante espectrofotometría es un método rápido y de fácil uso que se ha extendido en centros de inseminación artificial donde procesan un gran número de muestras. También podemos encontrar otros métodos como el contador de partículas y las técnicas de análisis automatizados de imagen que permiten medir muy rápidamente un gran número de partículas por unidad de volumen (Gadea, 1997). Revisión bibliográfica 12 5.2.2.-Estudio de la movilidad El estudio de la movilidad de los espermatozoides es un importante indicador de la viabilidad celular, de la integridad de la membrana y de la funcionalidad del metabolismo intracelular. Para Shanis et al., (1989) es uno de los parámetros que mejor se correlaciona con la fertilidad. Tradicionalmente se viene haciendo una observación microscópica de una muestra y se cuenta el porcentaje del número de células que están en movimiento, en función del tipo de movimiento que presente cada una de ellas. Dado que se trata de una estimación subjetiva se han desarrollado otras técnicas, siendo hoy en día los analizadores de imágenes por ordenador los más utilizados. El software discrimina a los espermatozoides de otras partículas que puedan aparecer en la imagen por su tamaño, y analiza la trayectoria recorrida por cada espermatozoide individual durante esa fracción de segundo (Muiño, 2007). Se basan en numerosos parámetros para clasificar el movimiento de los espermatozoides en 4 categorías: a) movilidad progresiva rápida, b) movilidad progresiva lenta o lineal, c) movilidad no progresiva y d) espermatozoides inmóviles (Padrón et al., 1998). 5.2.3.- Estudio de la viabilidad espermática El estudio de la viabilidad espermática normalmente se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides, mediante el uso de dos fluorocromos combinados: uno de ellos sólo es capaz de atravesar las membranas plasmáticas dañadas o degeneradas, y por tanto permite identificar a las células muertas o en proceso de degeneración, mientras que el otro es capaz de atravesar membranas celulares intactas y por tanto permite identificar la población de células viables (Garner et al., 1997). Para identificar las células muertas se utiliza una sustancia que es impermeable a la membrana plasmática y que tiene afinidad por el ADN presente en el núcleo del espermatozoide, por lo que únicamente se verán teñidos aquellos espermatozoides con la membrana estructuralmente dañada. Uno de los fluorocromos más utilizados es el Ioduro de propidio (IP), pero también podemos encontrar otros marcadores fluorescentes con acción similar como por ejemplo, el Hoeschst 33258 (Pintado et al., 2000) o el bromuro de etidio (Evenson et al., 1982), que tiñen el núcleo de las células alteradas. En el caso de identificar células vivas será necesaria la utilización de sustancias permeables. Entre los fluorocromos más utilizados encontramos: el diacetato de carboxifluoresceína (CFDA); compuesto no fluorescente capaz de atravesar membranas Revisión bibliográfica 19 Figura 5: Esquema general del citómetro de flujo 5.4.1.2.-Hibridación fluorescente in situ (FISH) En los últimos años esta técnica se ha convertido en la herramienta más importante para los análisis citogenéticos de las regiones cromosómicas (anomalías estructurales, mapeo de genes, evolución cromosómica), el sexaje de espermatozoides o embriones, la investigación de la expresión génica en tejidos morfológicamente conservados, etc. La hibridación in situ permite la localización de una secuencia de ADN (o ARN) mediante la hibridación de una sonda complementaria previamente marcada con fluorescencia (Rèvay, 2003). Se puede utilizar para la identificación y caracterización de los cromosomas o segmentos de cromosomas. También podemos examinar la organización del genoma. Además la hibridación in situ muestra reordenamientos cromosómicos y cambios en las secuencias ocurridos a lo largo de la evolución, del desarrollo del organismo o de una enfermedad. La técnica FISH ha sido utilizada para la detección de defectos genéticos, tales como enfermedades. Pero una de las mayores ventajas que ofrece este método es la posibilidad de cuantificar el número concreto de espermatozoides X o Y que hay en una muestra (Welch y Revisión bibliográfica 20 Johnson, 1999), por tanto puede ser un método interesante para posteriormente estudiar las diferencias entre ambos tipos de espermatozoide. En esta técnica aprovecha la capacidad de los ácidos nucleicos del ADN para desy renaturalizarse. El proceso se basa en realizar las preparaciones sobre portaobjetos tratados con fijadores para preservar las características morfológicas del cromosoma aunque también pueden ser células, núcleos o ADN puro, todos ellos reciben el nombre de ADN diana. Se marca la sonda de ADN por ejemplo con un fluorocromo. Será necesario desnaturalizar el ADN para permitir la hibridación con la sonda por lo que el siguiente paso será la desnaturalización de ambas. Posteriormente se produce la hibridación de la sonda de ADN diana y de ADN marcada. Se realizarán lavados y se observará al microscopio de fluorescencia (Fig 6). Figura 6: Esquema de la hibridación fluorescente in situ. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 21 6.-MATERIAL Y MÉTODOS 6.1.-Reactivos A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Sigma-aldrich Chemical Company (Alcobendas, Madrid, España) y los diluyentes se prepararon con agua Mili-Q (Milipore Ibérica SA, Barcelona, España). 6.2.-Recogida y obtención del semen Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el reglamento de Protección Animal Español RD223/1988, cumpliendo con el Reglamento de la Unión Europea 86/609. Se trabajó con la especie bovina. Para el primer ensayo se analizaron 10 toros, para el ensayo 2 se analizaron 5, mientras que para el tercer ensayo, en el primer apartado se analizaron 8 machos y en el segundo apartado 4 machos. Las dosis seminales utilizadas se enviaron al laboratorio de la Escuela Politécnica Superior de Huesca fraccionadas en forma de pajuelas de 0,25ml o 0,5ml procedentes de diferentes centros de inseminación. En todos ellos la extracción se realizó mediante vagina artificial en machos de la raza Frisona, que se alimentaron con una dieta estándar y siguieron un manejo regular de extracciones seminales. 6.3.- Manipulación del semen Anterior al análisis de la morfometría se procedía a comprobar el estado de las muestras para homogeneizarlas mediante la medición de la concentración y la movilidad. Las pajuelas se sumergían 30 segundos en agua a 37ºC para su descongelación para posteriormente realizar una centrifugación (solo en los casos en los que era necesario como explicaremos más adelante) a 1500g, durante 7 minutos y a 20ºC, obteniendo el pellet. Se incubaron en la estufa a 37ºC 995 μl de un diluyente basado en TRIS a los que se añadió 5 μl de formaldehido y 5 μl de semen. Se vertió una gota de 10 μl en una cámara Makler (Fig 7) y se observó al microscopio x100 (Olympus BX40, Olympus Optical Co., Ltd., Japón). Se tomaron 8 imágenes de campos diferentes utilizando un analizador de esperma asistido por ordenador (CASA, ISAS ®, Versión 1.0, PROISER, Valencia, España) (Fig 8), con el módulo de concentración utilizando el objetivo de fases negativo (10/x0,30), anotando el valor de la concentración resultante. En todos los casos la concentración medida era la adecuada para los posteriores análisis que se iban a realizar. Material y métodos 22 Figura 7: Cámara Makler en posición para su visionado al microscopio. Figura 8: Sistema CASA, microscopio óptico conectado a una cámara que a su vez se controla por un software de análisis de imágenes en el ordenador. 6.3.1.-Movilidad espermática De la muestra de semen se colocaron dos gotas de 5 μl en un portaobjetos y se cubrieron con dos cubreobjetos, siempre con la máxima rapidez y se observaron al microscopio óptico (Olympus BX40) con una pletina térmica. Utilizamos un objetivo de fases negativas a 100x. Mediante el programa ISAS (ISAS ®, Versión 1.0, PROISER, Valencia, España) con el módulo de movilidad, se realizaron 10 capturas de diferentes campos y se anotaron los siguientes resultados: espermatozoides móviles, progresivos, lentos, medios y rápidos. Como criterio mínimo de aceptación se consideró una movilidad mínima del 60%. Material y métodos 23 Después de seleccionar las muestras válidas se procedió a la preparación de las muestras para su posterior análisis morfométrico. 6.4.- Preparación de las muestras para su evaluación morfométrica Se prepararon 5 tratamientos diferentes siendo 3 de ellos en fresco y 2 en frotis. 6.4.1.-Fresco Para el análisis en fresco, se descongelaron las pajuelas como se ha indicado anteriormente y se realizaron 3 tratamientos. 6.4.1.1.- Tratamiento Fresco-1: Marcaje con H342 + IP Se tomaron en un eppendorf, 25 µl de semen, diluidos en 25 µl de diluyente TRIS, 5 µl de H342 (Hoechts 33342, marcador fluorescente con afinidad específica por el ADN que permite marcar todos los espermatozoides de cualquier especie de manera semejante, de un color azul) y 5 µl de IP (Ioduro de Propidio, marcador fluorescente que marca solo los espermatozoides dañados de un color rojo). Se incubaron a 37ºC durante 20 minutos. 6.4.1.2.- Tratamiento Fresco-2: Marcaje con H342 En este caso, se añadieron a un eppendorf, 25 µl de semen, diluidos en 25 µl de diluyente TRIS, y 5 µl de H342 y se incubaron también 20 minutos en estufa a 37ºC. 6.4.1.3.- Tratamiento Fresco-3: Marcaje con IP Las muestras de semen se dejaron a temperatura ambiente durante dos días como mínimo para producir la muerte de los espermatozoides, posteriormente se tomaron 25 µl de estas muestras y se diluyeron en 25 µl de diluyente TRIS con 5 µ de I.P. Se depositaron 2 gotas de 5 µl en un porta, se tapó con cubres y se observó al microscopio. 6.4.2.- Frotis Se prepararon 2 frotis de cada macho. En un portaobjetos se extendía una gota de 5 µl de semen dejando secar como mínimo 24 horas y resguardado de la luz solar. Posteriormente se realizaron dos tratamientos distintos. Material y métodos 24 6.4.2.1.- Tratamiento Frotis-1: Marcaje con H342 Se sumergió el frotis ya secado en un recipiente que contenía 2% de glutaraldehído en PBS durante 3 minutos. Se preparó una solución que contenía 20 µl de H342 diluidos en 480 µl de diluyente TRIS. Una vez secados los frotis, se añadieron 2 gotas de esta solución y se dejaron incubar 20 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. 6.4.2.2.-Tratamiento Frotis-2: Marcaje con IP El frotis se sumergió en un recipiente que contenía 2% de glutaraldehído en PBS durante 15 minutos. Se prepararon 5 µl de IP en 100 µl de diluyente TRIS. Tras secar los frotis se añadieron 2 gotas de esta solución dejando incubar 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Las muestras preparadas tanto en fresco como en frotis fueron evaluadas al microscopio de fluorescencia. 6.5.- Imagen de fluorescencia y CASMA Las imágenes digitalizadas de los espermatozoides marcados con fluorescencia se registraron en una instalación compuesta por un microscopio de epifluorescencia (DM4500B, Leica, Alemania), con un objetivo de 63x plan de apocromáticos y los juegos de filtros apropiados, y se fotografiaron con una cámara Canon Eos 400D digital. La cámara se controlaba mediante un ordenador con el programa DSLR Remote Pro software (Breeze Systems) (Fig 9). Se observó que el tamaño de los núcleos de los espermatozoides obtenidos por microscopía de epifluorescencia puede ser alterado mediante la modificación de la intensidad de fluorescencia. Para evitar esta variación, antes de iniciar la captura de las imágenes para cada muestra, algunas fotografías fueron tomadas y procesadas mediante el software Image J libre (versión 1.44h, disponibles en línea en http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html) para determinar la intensidad de fluorescencia en la cabeza del espermatozoide. Esta intensidad se ajustó, cuando fue necesario, modificando el tiempo de exposición de la cámara o la intensidad de la lámpara, a 80-120% del estándar de fluorescencia. Material y métodos 25 Figura 9: Microscopio de epifluorescencia (DM4500B, Leica, Alemania), al que va acoplado una cámara Canon Eos 400D digital que se controlaba mediante un ordenador con el programa DSLR Remote Pro software (Sistemas de Breeze). De cada imagen, las cabezas de los espermatozoides se capturaron automáticamente y se analizaron con el programa Image J, con un macro creado para este fin. En cada macro queda definido el método de valor umbral (Thersholding Methods), los pixeles y valores máximos y mínimos a los que se va a trabajar. Los espermatozoides se mostraron en el monitor con un brillo equivalente para todas las mediciones. Las cabezas de los espermatozoides que no se superponen y los espermatozoides que no presentaban anomalías fueron los que se consideraron para el análisis. De cada tratamiento se capturaron y analizaron 200 cabezas. 6.6.- Hibridación fluorescente in situ (FISH) La Hibridación Fluorescente In situ (FISH) consiste en la unión específica de una sonda de ADN marcada con fluorescencia y cuya secuencia es complementaria con una región diana Material y métodos 26 del ADN de una célula. En este caso se marcaron los cromosomas X e Y de los espermatozoides para posteriormente realizar un análisis morfométrico. 6.6.1.-Preparación de muestras espermáticas Las pajuelas se descongelaron sumergiéndolas al baño maría a 37ºC durante 30 segundos para las de 0,25 ml y durante 60 segundos para las de 0,5 ml. Posteriormente se realizaron tres lavados en tubos de 15 ml que contenían 10 ml de PBS (solución tampón o buffer, sin Ca-Mg) y EDTA (agente quelante) y se centrifugaron durante 10 minutos a 2000g. En cada uno de los lavados se eliminó rápidamente el sobrenadante mediante volcado. En el último lavado se retiró el sobrenadante con pipeta dejando sólo el pellet con algo de sobrenadante. Se fijaron las muestras resuspendiéndolas en 1 ml de fijador de Carnoy (3:1 metanol:ácido acético a 20ºC) en tubos de 1,5 ml. Se centrifugaron durante un minuto a 13200g y 0ºC. Se tiró el sobrenadante. Este lavado permitió eliminar restos de PBS. Se repitió el proceso dejando 100 µl y resuspendiendo el sedimento. La acción del fijador es muy importante ya que permite quitar los lípidos y desnaturalizar las proteínas lo que conlleva que la membrana plasmática se vuelva muy frágil. Esto ayuda a la extensión de los cromosomas. Posteriormente se ajustó la concentración a 20-40 x 106 Spz/ml. Una vez ajustada la concentración se añadió una gota de 10-15 µl de muestra sobre un portaobjetos Marenfield y se dejo secar durante toda la noche a temperatura ambiente. 6.6.2.- Hibridación Las sondas se desnaturalizaron sumergiéndolas en baño maría a 75ºC durante 10 minutos. Para detener la desnaturalización las incubamos en hielo durante 3 minutos. Se incubaron a 37ºC durante una hora para asegurarnos el preannealing con el competidor. Una vez secos, los portas Marenfield se sumergieron en NaOH 3M durante 3 minutos para desnaturalizar las muestras. Para eliminar los restos de NaOH se lavó la muestra en agua destilada 2 veces. Para detener la desnaturalización las muestras se sumergieron en concentraciones ascendentes de etanol (70-90-100%) a -20ºC durante 2 minutos en cada una de ellas. Se secaron las muestras con la ayuda de un secador para evitar la re-naturalización de las muestras. Material y métodos 27 Los cubreobjetos y portaobjetos que se utilizaron fueron lavados, secados, etc., anteriormente para asegurarse su máxima limpieza. . Se colocaron 15 µl de la sonda mix en cada cubreobjetos y se unieron al portaobjetos. Se sellaron con rubber cement (pegamento especial de sellado) y se colocaron en una caja de portas con agua debajo (para propiciar un ambiente de humedad) y se dejaron incubando a 37ºC durante toda la noche. 6.6.3.- Marcaje fluorescente Se eliminó el rubbert cement con una hoja de bisturí. Para eliminar los cubreobjetos se colocaron los portas en una gradilla de cerámica con SSC 2X (tampón salino de citrato sódico) sobre la plataforma de balanceo durante 30 minutos. Los portas se lavaron en una solución de formamida 50% en SSC 2X a 42ºC durante 4 minutos. Se repitió 3 veces la operación. Después se lavaron tres veces más en SSC 2X a 42ºC durante 4 minutos. Se colocaron en PBS-Tween 20 durante 5 minutos a temperatura ambiente. A su vez, se preparó una solución PBT (solución salina amortiguadora) para diluir los anticuerpos: 10 ml de PBS-T (solución tampón) y 10 mg de BSA (albúmina de suero bovino). Todos los procesos que se explican a continuación se realizaron en oscuridad. Se añadieron 1 µl de AntiDIG y 1 µl de Avidina a 248 µL de la solución de PBT. Tras realizar los lavados se eliminó el exceso de líquido y se aplicaron 50 µl de esta solución a cada porta, cubriendo con un cubre. Se colocaron en caja de cubres con agua debajo y se incubaron con 100% de humedad a 37ºC durante una hora. Se retiraron los cubres y se lavaron 3 veces sumergiendo en gradilla con PBS-T durante 5 minutos en plataforma de balanceo y tapado. Se retiró el exceso de líquido y se añadió 12 µl de antifade con DAPI (el DAPI es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones enriquecidas en Adenina y Timina en secuencias de ADN) el cubre de 24 x 24 mm. Se colocó el porta sobre el cubre con la gota y se incubo en la oscuridad durante 5 minutos. Se observaron en un microscopio de epifluorescencia DM4500B (Leica, Alemania), con un objetivo de 63x plan apocromático y los conjuntos de filtros apropiados. Las imágenes se capturaron con una cámara Canon EOS 400D digital controlada mediante un ordenador con DSLR Remote Pro software (Breeze Systems). Al igual que en anterior caso las fotos fueron analizadas con el software Image J y analizaron 400 espermatozoides de cada macho. Resultados 33 7.2.-Estudio 2: Efecto de la centrifugación sobre la morfometría del núcleo espermático Se analizaron un total de 1000 núcleos espermáticos sin centrifugar y de 1000 núcleos espermáticos tras ser centrifugados, procedentes de 4 toros (Fig 12). Figura 12: A: Núcleos espermáticos de toro fijados con glutaraldehído y teñidos con H342 antes de centrifugar (A) y después de centrifugar (B). En general, se obtuvieron diferencias significativas en todos los parámetros estudiados tanto en los primarios como en los secundarios entre las muestras antes de centrifugar y después. En promedio, las muestras centrifugadas presentaron mayores valores morfométricos que las muestras sin centrifugar (Tabla 4). B A A Resultados 34 Tabla 4. Diferencias morfométricas intra-macho entre muestras sin centrifugar y centrifugadas. MACHO CENTRIFUGACIÓN AREA (µm2) INT. FLUO PERIMETRO (µm) LONGITUD (µm) ANCHURA (µm) ELIPTICIDAD (%) RUGOSIDAD ELONGACIÓN REGULARIDAD 1 0 29,16±0,17a 110,37±0,83a 22,41±0,063a 8,43±0,027a 4,35±0,015a 1,94±0,007a 0,73±0,002a 0,32±0,002a 0,99±0,001a 2000g 10min 32,84±0,16b 88,82±0,37b 23,53±0,055b 8,80±0,022b 4,68±0,015b 1,88±0,006b 0,74±0,001b 0,31±0,001b 0,99±0,001b 2 0 32,38±0,13a 105,82±0,62a 23,44±0,048a 8,78±0,020a 4,63±0,013a 1,90±0,006a 0,74±0,001a 0,31±0,001a 0,99±0,001a 2000g 10min 31,73±0,12b 104,89±0,53a 23,21±0,043b 8,74±0,019a 4,54±0,012b 1,93±0,005b 0,74±0,001a 0,32±0,001b 0,98±0,001b 3 0 30,93±0,15a 88,43±0,63a 23,32±0,049a 8,89±0,022a 4,44±0,013a 2,00±0,006a 0,71±0,001a 0,33±0,001a 1,00±0,001a 2000g 10min 30,72±0,13a 86,71±1,24a 23,23±0,050a 8,86±0,024a 4,42±0,016a 2,01±0,008a 0,72±0,002a 0,33±0,002a 1,00±0,001a 4 0 30,84±0,18a 96,93±1,10a 23,31±0,057a 8,89±0,026a 4,38±0,015a 2,03±0,009a 0,71±0,002a 0,34±0,002a 0,99±0,002a 2000g 10min 31,03±0,18a 96,80±0,88a 23,30±0,062a 8,89±0,027a 4,40±0,016a 2,02±0,008a 0,72±0,002a 0,34±0,002a 0,99±0,002a 5 0 29,51±0,18a 82,15±0,88a 22,91±0,066a 8,65±0,025a 4,29±0,017a 2,02±0,008a 0,71±0,002a 0,34±0,002a 0,99±0,001a 2000g 10min 30,45±0,21b 77,88±0,77b 22,97±0,078a 8,72±0,029a 4,39±0,018b 1,99±0,007b 0,72±0,001b 0,33±0,002b 0,99±0,001a MEDIAS 0 30,56±0,08a 96,74±0,50a 23,08±0,028a 8,73±0,012a 4,42±0,008a 1,98±0,004a 0,72±0,001a 0,33±0,001a 0,99±0,001a 2000g 10min 31,35±0,08b 91,02±0,47b 23,25±0,027b 8,80±0,011b 4,49±0,008b 1,97±0,008b 0,73±0,001b 0,32±0,001b 0,99±0,001b - ab:Letras distintas en cada macho indican diferencias significativas entre ambos tipos de centrifugación (P<0,05) Resultados 35 7.3.-Estudio 3: Diferencias morfométricas entre espermatozoides portadores del cromosomas X y del cromosoma Y En la primera parte de este estudio se realizó un ensayo en el que se analizaron 8 machos distintos de la especie bovina tras realizar la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH), que permite distinguir claramente los espermatozoides de ambos sexos. Se midieron los valores de los parámetros primarios, de los parámetros secundarios y la intensidad fluorescente. Esto permitió estudiar las posibles diferencias entre las dimensiones del núcleo espermático en espermatozoides portadores del cromosoma X y del cromosoma Y (Fig 13). Se obtuvieron diferencias significativas en todos los parámetros primarios estudiados. En todos los casos, área, perímetro, anchura, y longitud así como para la intensidad fluorescente se obtuvieron mayores valores morfométricos en los espermatozoides con cromosoma X que en los portadores del cromosoma Y (Tabla 5). En el caso de los parámetros secundarios se obtuvieron diferencias significativas en la rugosidad y la regularidad, siendo los valores algo mayores para los espermatozoides con cromosoma Y (Tabla 5). En el segundo ensayo dentro de este estudio se comparó la morfometría de muestras sexadas y sin sexar perteneciente al mismo macho como método de confirmación. Para ello se analizaron 4 machos distintos de los que se tenían dosis sexadas y sin sexar. Se obtuvieron diferencias significativas en área, perímetro, longitud, anchura, elipticidad, rugosidad y elongación. La regularidad fue el único parámetro en el que no se obtuvieron diferencias significativas. Las muestras sexadas presentaban mayores valores para todos los parámetros morfométricos que las muestras no sexadas excepto para la elipticidad (Tabla 6). Resultados 36 Figura 13: A) Núcleos espermáticos portadores del cromosoma Y. B) Núcleos espermáticos portadores del cromosoma X. C) Fotografía utilizada para el análisis morfométrico, en la cual los núcleos espermáticos estaban fijados con glutaraldehído y teñidos con H342. A B C Resultados 37 Tabla 5. Diferencias morfométricas intra-macho entre espermatozoides con cromosoma X y cromosoma Y. - ab: Comparando intra-macho, letras distintas indican diferencias significativas entre ambos cromosomas (P<0,05) MACHO CROMOSOMA AREA (µm2) INT. FLUO PERIMETRO (µm) LONGITUD (µm) ANCHURA (µm) ELIPTICIDAD (%) RUGOSIDAD ELONGACIÓN REGULARIDAD 1 X 30,59±0,17a 95,12±1,10a 23,61±0,072a 8,72±0,027a 4,54±0,018a 1,92±0,008a 0,69±0,002a 0,31±0,002a 1,02±0,002a Y 30,05±0,15b 93,66±1,12a 23,39±0,066b 8,70±0,024a 4,49±0,017b 1,94±0,008a 0,69±0,002a 0,32±0,002a 1,02±0,002a 2 X 36,46±0,17a 92,51±0,63a 25,21±0,056a 9,07±0,021a 5,02±0,016a 1,81±0,006a 0,72±0,002a 0,29±0,002a 0,98±0,001a Y 36,14±0,15a 92,57±0,49a 25,00±0,059b 9,00±0,019b 5,02±0,017a 1,80±0,006a 0,73±0,002a 0,28±0,002a 0,98±0,001a 3 X 39,07±0,18a 89,41±0,66a 25,83±0,059a 9,31±0,023a 5,24±0,015a 1,78±0,005a 0,74±0,002a 0,28±0,001a 0,98±0,001a Y 38,94±0,17a 88,93±0,65a 25,87±0,062a 9,31±0,024a 5,23±0,016a 1,78±0,006a 0,73±0,003a 0,28±0,002a 0,98±0,001b 4 X 32,87±0,18a 85,95±0,72a 24,47±0,068a 9,08±0,029a 4,66±0,016a 1,95±0,008a 0,69±0,003a 0,32±0,002a 1,01±0,002a Y 32,64±0,15a 84,87±0,72a 24,43±0,065a 9,05±0,025a 4,64±0,015a 1,96±0,008a 0,69±0,002a 0,32±0,002a 1,01±0,001a 5 X 33,70±0,19a 84,90±0,51a 24,92±0,071a 9,31±0,027a 4,61±0,018a 2,02±0,008a 0,68±0,003a 0,34±0,002a 1,00±0,002a Y 33,35±0,15a 83,02±0,48b 24,84±0,059a 9,26±0,023a 4,59±0,017a 2,03±0,008a 0,68±0,002a 0,34±0,002a 1,00±0,002b 6 X 34,25±0,14a 87,70±0,53a 24,03±0,048a 8,80±0,021a 4,89±0,013a 1,80±0,005a 0,74±0,002a 0,29±0,001a 0,99±0,001a Y 33,42±0,11b 86,50±0,49a 23,85±0,038b 8,73±0,016b 4,82±0,013b 1,81±0,006a 0,74±0,002b 0,29±0,001a 0,99±0,001a 7 X 38,37±0,16a 95,58±0,24a 26,07±0,059a 9,45±0,023a 5,08±0,015a 1,86±0,006a 0,71±0,002a 0,30±0,002a 0,98±0,002a Y 37,67±0,37b 93,74±0,54b 25,93±0,200b 9,38±0,068b 5,04±0,023b 1,86±0,008a 0,71±0,003a 0,30±0,002a 0,99±0,003a 8 X 31,45±0,17a 99,46±1,02a 23,25±0,058a 8,60±0,021a 4,60±0,017a 1,87±0,006a 0,73±0,002a 0,30±0,002a 0,99±0,001a Y 30,60±0,17b 97,14±1,13a 23,03±0,057b 8,51±0,020b 4,53±0,017b 1,88±0,006a 0,72±0,002a 0,31±0,001a 0,99±0,001b MEDIA X 34,57±0,10a 91,55±0,29a 24,65±0,033a 9,03±0,011a 4,83±0,008a 1,88±0,003a 0,71±0,001a 0,30±0,001a 0,99±0,001a Y 34,13±0,10b 89,87±0,28b 24,57±0,039b 9,00±0,013b 4,80±0,009b 1,88±0,003a 0,71±0,001b 0,31±0,001a 1,00±0,001b Resultados 38 Tabla 6. Diferencias de los parámetros morfométricos primarios y secundarios intra-macho entre muestras sexadas y no sexadas. MACHOS MUESTRA AREA (µm2) INT. FLUO PERIMETRO (µm) LONGITUD (µm) ANCHURA (µm) ELIPTICIDAD (%) RUGOSIDAD ELONGACIÓN REGULARIDAD ALTAOLIN No-Sexada 29,16±0,17a 110,37±0,57a 22,41±0,063a 8,43±0,027a 4,35±0,015a 1,94±0,007a 0,73±0,002a 0,32±0,002a 0,99±0,001a Sexada 32,38±0,13b 105,82±0,62b 23,44±0,048b 8,78±0,021b 4,63±0,013b 1,90±0,006a 0,74±0,001b 0,31±0,001b 0,99±0,001a AUGUSTA No-Sexada 36,02±0,15a 132,09±0,57a 24,60±0,063a 9,05±0,02a 4,99±0,014a 1,82±0,005a 0,75±0,003a 0,29±0,001a 0,99±0,001a Sexada 36,14±0,15a 120,14±1,50b 24,70±0,057a 9,20±0,023b 4,92±0,013b 1,87±0,006b 0,74±0,002a 0,30±0,002b 0,98±0,001a SUPERJET No-Sexada 34,88±0,15a 122,59±0,97a 24,27±0,049a 9,04±0,019a 4,80±0,014a 1,89±0,005a 0,74±0,001a 0,31±0,001a 0,98±0,001a Sexada 35,33±0,17b 119,63±0,79b 24,36±0,059a 9,06±0,021a 4,84±0,017a 1,88±0,005a 0,75±0,002a 0,30±0,001a 0,98±0,001a TRIANGLE No-Sexada 30,36±0,18a 82,08±0,98a 23,22±0,066a 8,75±0,026a 4,35±0,017a 2,01±0,008a 0,71±0,002a 0,34±0,002a 0,99±0,001a Sexada 33,74±0,13b 104,37±0,61b 23,86±0,059b 8,93±0,023b 4,74±0,013b 1,88±0,006b 0,75±0,002b 0,31±0,001b 0,99±0,001b MEDIA No-Sexada 32,61±0,13a 111,79±0,79a 23,62±0,043a 8,82±0,015a 4,62±0,012a 1,91±0,004a 0,73±0,001a 0,31±0,001a 0,98±0,015a Sexada 34,40±0,09b 112,49±0,54a 24,09±0,033b 8,99±0,012b 4,78±0,008b 1,88±0,003b 0,74±0,001b 0,31±0,001b 0,98±0,001a - ab: Comparando intra-macho, letras distintas indican diferencias significativas entre ambos tipos de muestras (P<0,05) DISCUSIÓN Discusión 39 8.-DISCUSIÓN La inseminación artificial (IA), además de ser la biotecnología reproductiva más utilizada en todo el mundo, está adquiriendo un nuevo interés con la incorporación de nuevas tecnologías como el sexaje espermático. La evaluación seminal es un aspecto clave en la clasificación de las muestras de toro destinadas a la IA, ya sean sexadas o no sexadas. En esta evaluación seminal, o espermiograma, también han aparecido nuevas tecnologías que se han incorporado masivamente en los centros de IA. Entre ellas destacan la evaluación espermática asistida por ordenador (CASA). Estos sistemas cuentan normalmente con varios módulos, que entre otros suelen incluir los de concentración, movilidad y morfometría. El módulo de morfometría es quizá el menos utilizado en la práctica, porque el tiempo necesario para el análisis morfométrico es muy elevado. Para disminuir estos requerimientos y hacer la técnica más factible en la práctica, nuestro grupo desarrollo una técnica que permitió la automatización del proceso CASMA-F (Yániz et al., 2012; Vicente-Fiel et al., 2013a, 2013b, 2014; Yániz et al., 2014). En un intento de estandarizar esta técnica, en los trabajos citados ya se describieron algunos factores que condicionan el análisis morfométrico, tales como el secado y fijación de las muestras, entre otros. En este Trabajo Fin de Grado se profundiza en otros factores que pueden influir en los resultados morfométricos, tales como la viabilidad espermática, los procesos de centrifugación durante los lavados y el sexo del espermatozoide. En el primer estudio se evaluó el efecto de la viabilidad sobre la morfometría del núcleo espermático. Para ello nos basamos en el análisis de la integridad de la membrana plasmática, mediante la utilización de dos fluorocromos combinados (Garner et al., 1997): el I.P capaz de atravesar solo las membranas plasmáticas degeneradas o dañas, y el H342, para la tinción de células viables. En general, los espermatozoides vivos presentaron unas mayores dimensiones que los muertos para la mayoría de los parámetros primarios. Esta relación entre la viabilidad espermática y la morfometría nuclear no se explica por el diferente fluorocromo utilizado para marcar los espermatozoides vivos y muertos. Cuando se han comparado los dos fluorocromos en frotis sobre portas hemos observado que el IP, de tener efecto, es inverso al descrito en la viabilidad para la mayoría de los parámetros. A diferencia del presente estudio, en un trabajo previo en ovino no observamos diferencias morfométricas entre los núcleos espermáticos de frotis teñidos con IP y con H342. Discusión 40 A pesar del elevado número de trabajos publicados sobre la morfometría espermática en toro, solo unos pocos han estudiado las diferencias debidas a la viabilidad (Revay et al., 2004). La mayor parte de los trabajos han estudiado estas diferencias utilizando tinciones vitales tales como la eosina-nigrosina (Lütke-Holz, 1958), la tinción Feulgen (Baker y Salisbury, 1963) o el azul tripán (Rèvay et al., 2004). A diferencia de nuestros resultados, en estos tres trabajos los espermatozoides muertos presentaron mayor área de la cabeza que los vivos, oscilando entre el 0,8% (Lütke-Holz, 1958) y alrededor de un 10% (Baker y Salisbury, 1963; Rèvay et al., 2004). Sin embargo, dado que el método de tinción tiene un efecto claro sobre la morfometría del núcleo espermático es difícil determinar si tales diferencias se deben al espermatozoide o al propio método de tinción (teñidos vs no teñidos o teñidos con diferentes colorantes en los casos nombrados). En contraposición a estos trabajos, en un estudio previo utilizando técnicas de contraste de fases en espermatozoides de conejo, Marco-Jiménez et al. (2006) observaron que las cabezas de los espermatozoides muertos tenían un área menor que las de los vivos, lo que coincide con los resultados obtenidos en nuestro estudio. Este resultado lo atribuyen a que los espermatozoides muertos pierden la membrana plasmática, aunque debemos indicar que los sistemas ópticos convencionales no tienen poder de resolución suficiente para distinguir la membrana. La mayor frecuencia de acrosomas dañados/perdidos en los espermatozoides muertos sí podría explicar tales diferencias, aunque no en nuestro caso por haber teñido solamente el núcleo espermático. En coincidencia con los trabajos previos del grupo (Yániz et al., 2012; Vicente-Fiel et al.2013), el secado y la fijación disminuyó las dimensiones del núcleo espermático en el presente trabajo. Ball y Mohammed también comprobaron que el secado y fijación provocan una reducción del 20% de longitud y de un 13% de anchura del espermatozoide en caballo. En el segundo estudio se demostró que el proceso de centrifugación influye notablemente en todos los parámetros morfométricos, con un aumento de las dimensiones en los espermatozoides centrifugados. Las causas de este aumento no son claras, aunque podría deberse a una sedimentación más eficiente de los espermatozoides de mayores dimensiones. En otros estudios se ha demostrado que tras someter la muestra a un proceso de centrifugación de larga duración se produce un efecto deletéreo sobre el ADN incluso en los casos de tratamientos más agresivos, una degradación de la membrana plasmática (Urrego, 2008. y Oliva, 2010), aunque no está claro que esto se relacione con un aumento de tamaño del núcleo espermático. En un estudio reciente en bovino García-Herreros y Leal (2014) han Discusión 41 demostrado que el lavado-centrifugación de las muestras tiene un importante efecto en la distribución de las subpoblaciones morfométricas. En el último estudio se estudiaron las posibles diferencias entre las dimensiones del núcleo espermático en espermatozoides portadores del cromosoma X y del cromosoma Y, obteniéndose diferencias significativas en la mayoría de los parámetros. Los espermatozoides portadores del cromosoma X presentaron, en general, mayores dimensiones del núcleo que los portadores del cromosoma Y. En algunos estudios previos se ha observado que el tamaño de la cabeza de los X es mayor (Cui y Mathew, 1993; van Munster et al., 1999a; van Munster et al., 1999b; van Munster, 2002), aunque en un trabajo reciente utilizando FISH no se observaron diferencias (Rèvay, 2004). Posiblemente, el método de descondensación de los núcleos espermáticos utilizado en este trabajo, basado en DTT, ha podido camuflar las diferencias existentes entre los espermatozoides X e Y. También hemos encontrado diferencias morfométricas entre dosis sexadas (para obtener hembras) y no-sexadas de un mismo macho, evitando así el efecto del tratamiento de descondensación necesario para hacer FISH. De nuevo, el área nuclear de los espermatozoides sexados fue mayor que la de los no sexados, lo que confirma los resultados obtenidos utilizando FISH en el primer ensayo. Se ha descrito que, en el caso del toro, el espermatozoide X contiene en torno al 4% más ADN que el Y (Garner, 2006), por lo que parece lógico que esto se refleje en diferencias del área nuclear utilizando la técnica CASMA-F. Bibliografía 46 Hendricksen, P.J.M., Tieman, M., van Der Lende, T., Johnson, L.A. (1993). Binding of anti H-Y monoclonal antibodies to separated X and Y chromosome bearing porcine spermatozoa. Mol. Reprod. Dev.: 35: 189-196. Hendrikcsen, P.J.M., Welch, G.R., Grootegoed, J.A., vander Lende, T., Johnson, L.A. (1996). Comparison of detergent-solubilized membrane and soluble proteins from flow cytometrically sorted Xand Ychromosome bearing porcine spermatozoa by high resolution 2-D electrophoresis. Mol. Reprod. Dev.: 45: 342-450. Hoppe, P.C., Koo, G.C. (1984). Reacting mouse sperm with monoclonal H-Y antibodies does not influence sex ratio of eggs fertilized in vitro. J.Reprod. Immun.: 6: 1-9. Howes, E.A., Miller, N.G.A., Dolby, C., Hutchings, A., Butcher, G.W., Jones, R. (1997). A search for sex-specific antigens on bovine spermatozoa using immunological and biochemical techniques to compare the protein profiles of X and Y chromosomebearing sperm populations separated by fluorescence-activated cell sorting. J. Repro. Fertil.: 110: 195-204. Johnson, L.A. (1988). Flow cytometric determination of sperm sex ratio in semen purportedly enriched for Xor Ybearing sperm. Theriogenology. 29; 265. Johnson L.A., Flook J.P., Hawk H.W. (1989). Sex preselection in rabbits: live births from Xand Ysperm separated by DNA and cell sorting. Biol. Reprod.: 41: 199-203. Johnson, L.A. (1991). Sex preselection in swine: altered sex ratios in offspring following surgical insemination of flow sorted Xor Ybearing sperm. Reprod. Dom. Anim.: 26 309-314. Johnson, L.A. (2000). Sexing mammalian sperm for production of offspring: the state of the art. Anim Reprod Sci: 60-61: 93-107. Kiddy, C.A., Hafs, H.D. (Eds). (1971). Sex ratio at birth – Prospects for control. American Society of Animal Science, Savoy, IL. Kaneko, O., Oshiro, S., Kobayashi, T., Itzuka, R., Mohri, H. (1984). Human Xand Y Bearing sperm differ incell surface sialic acid content. Biochem. Biophys. Res. Commun.: 124: 950-955. Kruger, T.F., Du Toit, T.C., Franken, D.R., Acosta, A.A., Oehninger, S.C., Menkveld,R., Lombard, C.J. (1993). A new computerized method of reading sperm morphology (strict criteria) is as efficient as technician reading. Fertil. Steril, 59: 202–209. Bibliografía 47 Lütke-Holz, F.J. (1958) Vergleichende Messungen von Spermienköpfen an ungefärbtem und vitalgefärbtem Bullensamen unter besonderer Berücksichtigung des Spermatiefkühlverfahrens. [Thesis].Hannover, Germany: Tierärztliche Hochschule. Marco-Jiménez, F., Viudes de Castro M.P., Balasch, S., Mocé, E., Silvestre, M.A., Gomez, E.A., Vicente, J.S. (2006). Morphometric changes in goat sperm heads induced by cryopreservation. Cryobiology 52 (2006) 295–304 Maxwell, W.M.C., Evans, G. (1990). Inseminación Artificial de ovejas y cabra. McClure, R.D., Tom, R. (1991). Human sperm hypo-osmotic swelling test: Relationship to sperm fertilizing ability. Int. J. Fertil. 36:360-366. Mohri, H., Oshio, S., Kaneko, S., Kobayashi, T., Lizuka, R. (1987). Separation and characterization of mammalian Xand Ybearing sperm. New Horizons in Cell Research. pp: 469-481. Ed. H. Mohri. Japan Scientific Society Press, Tokyo/Gordon and Breach Scientific Publishers, New York. Moruzzi, J.F. (1979). Selecting a mammalian species for the separation of Xand Ychromosomebearing spermatozoa. J. Reprod. Fertil.: 57: 319. Muiño, R. (2007). Evaluación de la motilidad y vialidad del semen bovino mediante el uso de sistemas CASA y citometría de flujo: identificación de subpoblaciones espermáticas. [Tesis doctoral] Universidad Santiago de Compostela, Facultad de Veterinaria. Oliva-Hernández, J., Marcos-González, M. (2010). Efectos de la descongelación-lavado sobre la motilidad, vitalidad y morfología de espermatozoides de baja calidad. Andrology 2010;8(1):1420. Ollero, M., Pérez-Pe, R.; Gargallo, I., Morlanes, S., Osada, J., Muiño-Blanco, T., Cebrian-Perez J. (2000). Separation of ram spermatozoa bearing X and Y chromosome. Padrón-Durán, R.S., Fernández-López, G. M., Gallardo-Ríos, M. (1998). Interpretación del análisis seminal. Rev Cubana Endocrinol 1998; 9(1):81-90 Pesch, S., Bergmann, M. (2006). Structure of mammalian spermatozoa in respect to viability, fertility and cryopreservation. Micron 37, 597-612. Bibliografía 48 Pinkel, D., Lake, S., Gledhill, B.L., Van Dilla, M.A., Stephenson, D., Watchmaker, G. (1982). High resolution DNA content measurements of mammalian sperm. Cytometry, 3: 1-9. Pintado, B., De la Fuente, J., Roldan, E.R.S. (2000). Permeability of boar and bull spermatozoa to the nucleic acid stains propidium iodide or Hoechst 33258 or to eosin: accuracy in the assessment of cell viability. J. Reprod. Fertil. 118, 145-152. Quintero, R.A. (2003). Treatment of previable premature ruptured membranes. Clinics in perinatology, 30(3):573-589. Rèvay, T. (2003). Detection of the Xand Y-chromosomes of different bovines species by fluorescence in situ hybridization, studied in the context of their evolution and separation of Xand Y-bearing spermatozoa. [Tesis Doctoral]. Budapest University of Technology and Economics. Rèvay, T., Nagy, S., Kovacs, A., Edvi, M.E., Hidas, A., Rens, W., Gustavvson, I. (2004). Head area measurements of dead, live, Xand Y-bearing bovine spermatozoa. Reproduction Fertility and Development 16, 681-687. Sakkas, D., Manicardi, G., Bianchi, P.G., Bizarro D., Bianchi, U. (1995). Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa. Biol. Reprod, 52:1149-1155. Schrader, S.M., Platek, S.F.,Zaneveld, L.J.D.,PérezPelaez, M., Jeyendran, R.S. (1986). Sperm viability: A comparison of analytical methods. Andrologia, 18:530-538. Seidel, G.E. Jr., Allen, C.H., Johnson, L.A., Holland, M.D., Brink, Z., Welch, G.R., Graham, J.K., Cattell, M.B. (1997). Uterine horn insemination of heifers with very low numbers of non frozen and sexed spermatozoa. Theriogenology: 48: 1255-64. Shanis, B.S., Check, J.H., Bollendorf, A. (1989). Interpretation and misinterpretation of semen parameters. Arch. Androl, 23: 213-217. Shapiro, H.M. (2003). Practical flow cytometry. 4th edition. Eds. John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. Singer, S.J., Nicholson, G.L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175:720-731. Bibliografía 49 Soler, C., Yeung, C.H., Cooper, T.G. (1994). Development of sperm motility patterns in the murine epididymis. Int. J. Androl, 17:271-278. Thundathil, J., Palasz, A.T., Barth, A.D., Mapletoft, R.J., (1999). An investigation of the fertilizing characteristics of pyriform shaped bovine spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 57 (1-2), 35-50. Urrego, R., Ríos, A., Olivera Ángel, M., Camargo, O. (2008). Efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática y el ADN de espermatozoidesbovinos. Rev. Colombiana Ciencias Pecuarias 2008; 21:19-26. Van Munster E.B., Stap, J., Hoebe, R., te Meerman, G.J., Aten, J.A. (1999a). Difference in volume of Xand Ychromosome bearing bovine sperm heads matches difference in DNA content. Cytometry: 35: 125-128. Van Munster, E.B., Stap, J., Hoebe, R.A., te Meerman G.J., Aten, J.A. (1999b). Difference in sperm head volume as a theoretical basis for sorting Xand Ybearing spermatozoa: Potentials and limitations. Theriogenology: 52: 1281-1293. Van Munster, E.B. (2002). Interferometry in flow to sort unstained Xand Ychromosome bearing bull spermatozoa. Cytometry: 47: 192-199. Vázquez, J.M., Martínez, E.M., Roca, J., Lucas, X., Parrilla, I. (2001). Sex-sorting boar sperm: problems and possibilities. Arch Animal Breeding Dummerstorf 44: 141-144 Vicente-Fiel, S., Palacín, I., Santolaria, P., Hidalgo C.O., Silvestre, M.A., Arrebola, F., Yániz J.L. (2013a). A comparative study of the sperm nuclear morphometry in cattle, goat, sheep, and pigs using a new computer-assisted method (CASMA-F). Theriogenology 79, 436-442. Vicente-Fiel, S., Palacin, I., Santolaria, P., Yaniz, J.L. (2013b). A comparative study of sperm morphometric subpopulations in cattle, goat, sheep and pigs using a computer-assisted fluorescence method (CASMA-F). Anim. Reprod. Sci. 139, 182-189. Welch, G.R., Johnson, L.A. (1999). Sex preselection: laboratory validation of the sperm sex ratio of flow sorted Xand Y-sperm by sort reanalysis for DNA. Theriogenology 52: 1343-1352. WHO. World Health Organization. (1999).WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University Press. Nex York. Cambridge. Bibliografía 50 Woelders, H. (1991) Overview of in vitro methods for evaluation of semen quality. En: Boar semen preservation II. Eds.: Johnson, L.A. y Rath, D. Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg. 145-164. Yániz J.L., Vicente-Fiel. S., Capistros, S., Palacín, I., Santolaria, P. (2012). Automatic evaluation of ram sperm morphometry. Theriogenology 77: 1341-50 Yaniz, J.L., Capistros, S., Vicente-Fiel, S., Soler, C., Nunez de Murga, J., Santolaria, P. (2014). Study of nuclear and acrosomal sperm morphometry in ram using a computer-assisted sperm morphometry analysis fluorescence (CASMA-F) method. Theriogenology 82, 921-924.