Repositorio Institucional de Documentos

http://zaguan.unizar.es TDR-UZ [Tesis Doctorales en Red Universidad de Zaragoza] María Isabel Vázquez Efectos de la melatonina exógena sobre la viabilidad embrionaria en situaciones de subnutrición en la oveja Tesis Doctoral Universidad de Zaragoza Tesis Doctoral EFECTOS DE LA MELATONINA EXÓGENA SOBRE LA VIABILIDAD EMBRIONARIA EN SITUACIONES DE SUBNUTRICIÓN EN LA OVEJA MARÍA ISABEL VÁZQUEZ Dpto. Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza 2009 Zaragoza, 22 de octubre de 2009 Fernando Forcada Miranda y José Alfonso Abecia Martinez, directores del trabajo de Tesis Doctoral de María Isabel Vázquez que lleva por título “EFECTOS DE LA MELATONINA EXÓGENA SOBRE LA VIABILIDAD EMBRIONARIA EN SITUACIONES DE SUBNUTRICIÓN EN LA OVEJA”, consideran que dicho trabajo cumple los requisitos necesarios para poder ser presentado con el objetivo de optar al Grado de Doctor en Veterinaria. En este sentido, el presente trabajo se corresponde con el Proyecto de Tesis que fue aprobado el 16 de febrero de 2009. Fdo: Dr. FERNANDO FORCADA MIRANDA Director de la Tesis Dr. J. ALFONSO ABECIA MARTINEZ Director de la Tesis Producción Animal Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos FACULTAD DE VETERINARIA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA El presente trabajo de tesis se presenta como requisito para la obtención del título de Doctor en Veterinaria. Los experimentos aquí presentados han recibido financiación de la C.Y.C.I.T. a través de los Proyectos de Investigación AGL2004-00432 y AGL2007-63822/GAN y de la D.G.A. a través del Proyecto A26. La autora ha disfrutado de una beca doctoral del programa de cooperación internacional “Estancias cofinancidas para realizar estudios de doctorados dirigidas a Profesores universitarios latinoamericanos” otorgada por la Fundación Carolina en colaboración con la Universidad de Zaragoza y el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de la República Argentina. Período 2006-2009. 1 RESUMEN A partir de los antecedentes que por un lado evidencian que la subnutrición afecta la eficiencia reproductiva en las ovejas, disminuyendo las tasas de gestación y/o causando un retraso en el desarrollo embrionario y que, por otra parte, se conoce que la melatonina es la hormona mediadora de los efectos entre la estacionalidad y el eje reproductivo, actuando con efectos benéficos tanto a nivel embrionario como del tracto reproductivo, nuestra hipótesis de partida planteó que el tratamiento con melatonina exógena podría ser una herramienta útil para paliar o revertir los efectos adversos que causa la subnutrición sobre la supervivencia embrionaria en las explotaciones ovinas. Por todo ello, la presente Tesis Doctoral investigó los efectos de la melatonina exógena tanto in vivo como in vitro sobre la competencia oocitaria y la viabilidad embrionaria en situaciones de subnutrición en la especie ovina, evaluando también dicho efecto sobre la población de receptores esteroideos en el endometrio, todo ello durante la estación reproductiva y el anoestro estacional y en hembras en diferentes estados fisiológicos (vacías y a los 45 días post-parto). Por tal motivo se realizaron un total de cuatro experimentos utilizando ovejas adultas de raza Rasa Aragonesa. Cada uno de los experimentos se basó en un diseño factorial 2 x 2, considerando el tratamiento o no con melatonina exógena y el tratamiento nutricional (subnutrición o no) como factores fijos. De esta manera, los 4 grupos experimentales en cada uno de los experimentos realizados fueron: ovejas alimentadas con dieta control y que no recibieron implantes de melatonina (C-MEL), ovejas alimentadas con dieta control y que recibieron implantes de melatonina (C+MEL), ovejas subnutridas y que no recibieron implantes de melatonina (B-MEL) y 2 ovejas subnutridas y que recibieron implantes de melatonina (B+MEL). Las dietas control cubrían 1,5 veces las necesidades de mantenimiento, mientras que las dietas de subnutrición cubrían 0,5 veces dichas necesidades, en ambos casos durante un periodo de 21 días, desde el inicio de la sincronización de celos hasta el momento de la recuperación de los embriones u oocitos (Día 5 tras el celo). Los experimentos 1 y 2 se realizaron con ovejas vacías durante la estación reproductiva y durante el anoestro estacional, respectivamente. Los experimentos 3 y 4 se realizaron con ovejas que se encontraban con más de 45 días post-parto, de nuevo durante la estación reproductiva y el anoestro estacional, respectivamente. Debido a las diferentes respuestas encontradas en los parámetros estudiados en cada estación, se introdujo al modelo original la época del año (estación reproductiva y/o anoestro estacional) como factor fijo, obteniéndose un diseño factorial final de 2x2x2. En cada uno de los experimentos se estudió el efecto de la melatonina exógena sobre la viabilidad de los embriones recuperados in vivo, de los embriones producidos in vitro a partir de los oocitos procedentes de los ovarios recuperados al momento del sacrificio (Día 5 tras el celo), así como también los efectos sobre la expresión de los receptores esteroideos de progesterona (RP) y de estrógenos (REα) en el endometrio. En todos los experimentos se observó que, en respuesta al tratamiento nutricional, todas las ovejas subnutridas (implantadas o no) presentaron pérdidas significativas de PV y CC en el momento del sacrifico respecto a las ovejas control (P<0,01). En el Experimento 1 se observó que la melatonina exógena perjudicó la viabilidad de los embriones recuperados in vivo de las ovejas subnutridas (P<0,05). No hubo efectos de los tratamientos nutricionales sobre la competencia oocitaria ni en el posterior desarrollo in vitro de los embriones, aunque hubo una interacción significativa melatonina x nutrición, de manera que la hormona pineal disminuyó el número de 9 experiments 1 and 2, in both seasons, are described in Article I. During the anoestrous season, melatonin tended to improve embryo viability (P=0,1), although it had the opposite effect during the breeding season, especially on embryos collected from undernourished ewes (P<0,05). It was suggested that the mechanisms determining the interaction between melatonin and nutrition are seasonality regulated. In Article II, we have evaluated the effects of melatonin and undernutrition on oocyte competence and in vitro production and early development during breeding and anestrous seasons from experiments 1 and 2. We found an important season effect: during the breeding season the number of recovered oocytes per ewe was higher, and so, the number and rate of healthy oocytes for IVF in comparison with anoestrus (P<0,01). On the other hand, during anoestrus division rate presented a trend towards being higher than during the breeding season. It was concluded that there was a negative effect of anoestrus and undernutrition on oocyte competence, although exogenous melatonin improved such competence in undernourished ewes during anoestrus. In Experiment 3, some positive effect of melatonin on embryo viability (P<0.05) and pregnancy rate (P<0.05) on day 5 was observed in undernourished ewes. Nutrition only affected in vitro parameters, so undernourished ewes presented a lower number of cleaved embryos and blastoysts in comparison with control ewes (P=0.09), although only in undernourished ewes melatonin improved the number of cleaved embryos (P<0.05). In general, there were no effects of nutrition or melatonin on the expression of PR and ERα, with an increment of the expression of PR in the deep glandular epithelium in melatonin implanted undernourished ewes (P<0.05). In Experiment 4, there was an evident positive effect of melatonin on the studied parameters in the recovered embryos in vivo. Thus, regardless of nutritional level, melatonin improved the number of recovered embryos per corpus luteum (CL) 10 (P=0.08), the number of viable embryos per CL (P<0.01) and, particularly in undernourished ewes, viability (P<0.05) and pregnancy (P<0.05) rates. On the opposite, there were no effects of treatments and interactions on oocyte competence and in vitro development. There was only an interaction between treatments on PR and REα expression (P<0.01). Thus, melatonin reduced the expression of PR in the glandular epithelium and in the stroma (deep and superficial) of undernourished ewes, in opposite than in control ewes, where melatonin increased the expression of RP (P<0.01). Regarding REα, melatonin reduced its expression in the deep glandular epithelium of undernourished ewes, increasing in control ewes (P<0.01). Results obtained in experiment 4 were described in Article III, considering the effects of melatonin on oocyte competence and in vitro embryo development, and on viability of recovered embryos in vivo collected from ewes in the postpartum period (more than 45 days) during seasonal anoestrus. It was concluded that melatonin improved embryo viability during anoestrus, particularly in postpartum ewes, althought the effect seems not to be mediated by an action of melatonin on oocyte competence. In conclusion, results of this Thesis confirm our original hypothesis, although the effects of melatonin on the reproductive parameters under study in a situation of undernutrition were dependent both of physiological state and season. Thus, exogenous melatonin was able to improve embryo viability in vivo and oocyte competence and development in vitro, but only during seasonal anoestrus in dry non pregnant undernourished ewes. This fact was accompanied by a lack of effects of melatonin on endometrial steroid receptors population (PR and ER). On the other hand, in postpartum undernourished ewes, the beneficial effects of melatonin were observed only on in vivo embryo viability, together with changes in the expression of PR and ERα, both during the breeding and the anoestrous seasons. 11 TABLA DE CONTENIDOS RESUMEN .................................................................................................................................... 1 SUMMARY .................................................................................................................................. 7 APÉNDICE ................................................................................................................................. 15 ANEXOS..................................................................................................................................... 15 ABREVIATURAS Y TERMINOLOGÍA UTILIZADA ............................................................ 17 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 19 1. Breve descripción de la fisiología y la endocrinología del ciclo sexual ovino ................... 19 2. Desarrollo embrionario temprano y reconocimiento materno de la gestación ................... 24 3. Efectos del fotoperiodo sobre el eje reproductivo .............................................................. 26 3.1. Efectos de la melatonina sobre el establecimiento de la gestación.............................. 27 3.1.1. A nivel ovárico ..................................................................................................... 27 3.1.2. A nivel oviductal y uterino ................................................................................... 28 3.1.3. A nivel del embrión .............................................................................................. 28 4. Efectos de la nutrición sobre el eje reproductivo ................................................................ 30 4.1. Efecto de la subnutrición sobre el establecimiento de la gestación ............................. 31 4.1.1. A nivel ovárico ..................................................................................................... 31 4.1.2. A nivel oviductal y uterino ................................................................................... 33 4.1.3. A nivel del embrión .............................................................................................. 33 5. Efectos de la interacción melatonina-nutrición sobre la reproducción ............................... 35 6. Efecto del anoestro post-parto sobre la reproducción ......................................................... 35 6.1. Breve descripción de la fisiología y de la endocrinología del anoestro post-parto ..... 35 6.2. Influencia de la nutrición sobre el anoestro post-parto ................................................ 39 HIPÓTESIS DE TRABAJO........................................................................................................ 41 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 45 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 47 1. Aspectos generales .............................................................................................................. 47 1.1. Instalaciones ................................................................................................................ 47 1.2. Alimentación ............................................................................................................... 47 1.3. Tratamientos hormonales ............................................................................................ 48 2. Diseño experimental ........................................................................................................... 49 3. Animales ............................................................................................................................. 49 3.1. Experimento 1 (Artículos I y II-Ovejas vacías, Estación reproductiva) ...................... 49 3.2. Experimento 2 (Artículos I y II-Ovejas vacías, Anoestro) .......................................... 50 3.3. Experimento 3 (Ovejas post-parto, Estación reproductiva) ......................................... 50 3.4. Experimento 4 (Artículo III-Ovejas post-parto, Anoestro) ......................................... 52 12 4. Obtención de embriones producidos in vivo ...................................................................... 52 5. Obtención de ovarios y maduración in vitro (MIV) de oocitos .......................................... 54 6. Fecundación in vitro (FIV) y cultivo embrionario .............................................................. 55 7. Determinación de receptores de hormonas esteroideas en el endometrio ........................... 56 7.1. Abundancia y localización tisular de PR y REα .......................................................... 56 7.2. Análisis de imagen ...................................................................................................... 57 8. Determinación de niveles plasmáticos de hormonas y metabolitos .................................... 58 8.1. Progesterona ................................................................................................................ 58 8.2. Melatonina ................................................................................................................... 59 8.3. Metabolitos .................................................................................................................. 59 9. Análisis estadísticos ............................................................................................................ 60 RESULTADOS ........................................................................................................................... 63 EXPERIMENTO 1. Ovejas vacías, Estación reproductiva .................................................... 63 1.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal ............................ 63 1.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales ............................................ 63 1.2.1. Melatonina............................................................................................................ 63 1.2.2. Progesterona ......................................................................................................... 65 1.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles de metabolitos plasmáticos ................... 66 1.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo .... 68 1.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos para FIV ............................. 68 1.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores endometriales .......... 71 EXPERIMENTO 2. Ovejas vacías, Anoestro estacional ........................................................ 73 2.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal ............................ 73 2.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales ............................................ 73 2.2.1. Melatonina............................................................................................................ 73 2.2.2. Progesterona ......................................................................................................... 75 2.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles de metabolitos plasmáticos ................... 76 2.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo .... 78 2.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos para FIV ............................. 78 2.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores endometriales .......... 81 Efecto de la época del año. Experimentos 1 y 2. .................................................................... 82 EXPERIMENTO 3. Ovejas post-parto, Estación reproductiva .............................................. 85 3.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal ............................ 85 3.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales ............................................ 87 3.2.1. Melatonina............................................................................................................ 87 3.2.2. Progesterona ......................................................................................................... 87 3.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles de metabolitos plasmáticos ................... 88 13 3.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo .... 91 3.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos para FIV ............................. 92 3.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores endometriales .......... 93 EXPERIMENTO 4. Ovejas post-parto, Anoestro estacional (Artículo III). ........................... 96 4.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal ............................ 96 4.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales ............................................ 96 4.2.1. Melatonina............................................................................................................ 96 4.2.2. Progesterona ......................................................................................................... 98 4.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles de metabolitos plasmáticos ................... 99 4.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo .. 101 4.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos para FIV ........................... 101 4.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores endometriales ........ 104 Efecto de la época del año. Experimentos 3 y 4. .................................................................. 104 DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 107 Efectos sobre el PV, la CC y la secreción de metabolitos .................................................... 107 Efectos sobre la ovulación y la secreción de P4 .................................................................. 109 Efectos sobre los embriones recuperados in vivo ................................................................. 110 Efectos sobre la producción in vitro de embriones ............................................................... 112 Efectos sobre los receptores esteroideos en el endometrio ................................................... 114 Efectos de la nutrición sobre la funcionalidad ovárica y el desarrollo embrionario temprano .............................................................................................................................................. 117 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 119 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 121 APÉNDICE ............................................................................................................................... 131 14 15 APÉNDICE El presente trabajo se ha basado en los siguientes artículos científicos originales, los cuales adjuntamos al final: Artículo I. Effects of melatonin and undernutrition on the viability of ovine embryos during anestrus and the breeding season. Animal Reproduction Science, 2008, 112: 83-94. doi:10.1016/j.anireprosci.2008.04.004 Artículo II. Undernutrition and exogenous melatonin can affect the developmental competence of ovine oocytes. Reproduction in Domestic Animals, 2008. doi: 10.1111/j.1439-0531.2008.01329. Artículo III. Effects of exogenous melatonin on in vivo embryo viability and oocyte competence of undernourished ewes after weaning during the seasonal anoestrus. Theriogenology (En revision desde 5/9/2009). ANEXOS Otros trabajos derivados del periodo de Tesis Doctoral - Artículos científicos originales Vázquez, M.I., Blanch, M.S., Alanis, G.A., Chaves, M.A., Gonzalez-Bulnes, A. Effects of treatment with a prostaglandin analogue on developmental dynamics and functionality of induced corpora lutea in goats. Animal Reproduction Science, 2009. doi:10.1016/j.anireprosci.2009.05.016 Sosa, C., Abecia, J.A., Carriquiry, M., Vázquez, M.I., Fernández-Foren, A., Talmon, M., Forcada, F., Meikle, A. Effect of undernutrition on the uterine environment during maternal recognition of pregnancy in sheep. Reproduction, Fertility and Development 2009, 21, 869-881. Casao, A., Abecia, J.A., Cebrian-Perez, J.A., Muino-Blanco, T., Vázquez, M.I., Forcada, F. The effects of melatonin on in vitro oocyte competence and embryo development in sheep. Spanish Journal of Agricultural Research 2009. Aceptado (ref. SJAR 170/09). 16 - Trabajos a Congresos Vázquez, M.I., Sartore, I., Abecia, J.A., Forcada, F., Sosa, C., Palacín, I., Casao, A. y Meikle, A. 2008. Melatonin treatment and undernutrition affect expression of uterine estrogen and progesterone receptors in ewes during the reproductive and the anestrous seasons. Reprod Dom Anim, vol 43 (3), 152. Vázquez, M.I., Forcada, F., Casao, A., Sosa, C., Palacín, I., Abecia, J. A. 2008. Undernutrition and exogenous melatonin affect ovine embryo viability on a seasonal basis. Reprod Dom Anim, vol 43 (3), 188. Vázquez, M.I., Gonzalez-Bulnes, A., Alanis, G.A., Blanch, M.S., Chaves, M.A. 2008. Morphological and functional features of corpora lutea induced by administration of cloprostenol in goats. Animal Reproduction (ISSN 1806-9614), vol 6 (1), 254. Vázquez, M.I., Abecia, J.A., Forcada, F., Casao, A. 2008. Influence of body condition previous to a short undernutrition period on embryo survival in ewes. Animal Reproduction (ISSN 18069614), vol 6 (1), 285. Vázquez, M.I.; Forcada, F.; Casao, A.; Abecia, J.A. 2008. Efecto de la condición corporal previa a un corto período de subnutrición sobre la supervivencia embrionaria en ovejas Rasa Aragonesa durante la estación reproductiva. XXXIII Jornadas Científicas y XII Jornadas Internacionales de Ovinotecnia y Caprinotecnia (SEOC), 24-27 de setiembre, Almería, España. Vázquez, M.I., Forcada, F., Casao, A., Abecia, J.A., Sosa, C. and Palacín, I. 2008. Undernutrition and Exogenous Melatonin can affect the Developmental Competence of Ovine Oocytes. 6th International Congress on Farm Animal Endocrinology (ICFAE), 14-16 de noviembre, Roanoke, Virginia, USA. Vázquez, M.I., Abecia, J.A, Forcada, F., Casão, A. 2009. El uso de melatonina exógena tras el parto en ovejas rasa aragonesa subnutridas mejora la viabilidad embrionaria durante la estación reproductiva. XII Jornadas sobre Producción Animal, AIDA, 12-13 de mayo, Zaragoza, España. Vázquez, M.I., Forcada, F., Abecia, J.A, Casão, A. 2009. Exogenous melatonin improves embryo viability of undernourished ewes during seasonal anoestrus. 60th EAAP Annual Meeting, 24-27 de agosto, Barcelona, España. PREMIO Best Poster of Sheep and goat reproduction 17 ABREVIATURAS Y TERMINOLOGÍA UTILIZADA Oveja Vacía, se definió de esta manera a aquella oveja que en el momento de iniciar el experimento presentaba al menos 60 días de post-parto, no lactante y por supuesto no gestante, pudiendo estar cíclica durante la estación reproductiva (experimento 1) o nocíclica durante el anoestro estacional (experimento 2). Oveja Post-parto, aquella oveja que en el momento de recibir las dietas experimentales llevaba al menos 45 días de lactancia con un solo cordero, pudiendo estar cíclica durante la estación reproductiva (experimento 3) o no-cíclica durante el anoestro estacional (experimento 4). Estructuras recuperadas tras el lavado uterino, se definió de esta manera al conjunto de estructuras recuperadas que incluían tanto a los oocitos como así también a los embriones. AGNE, ácidos grasos no esterificados BHB, beta-hidroxibutirato CC, condición corporal CL, cuerpo lúteo E, estrógenos eCG, gonadotrofina coriónica equica E2, 17β-estradiol EGp, epitelio glandular profundo EGs, epitelio glandular superficial EL, epitelio luminal Ep, estroma profundo Es, estroma superficial FIV, fecundación in vitro 18 GnRH, hormona liberadora de gonadotrofinas IFN-τ, interferon tau MIV, maduración in vitro P4, progesterona PG, prostaglandina PV, peso vivo RE, receptor de estrógenos RP, receptor de progesterona 25 producción de IFN-τ son eventos críticos para inhibir los mecanismos de la luteolisis, y por ende, favorecer la producción de P4 por el CL, asegurándose la continuidad del desarrollo embrionario (Spencer et al., 2007). Figura 2. Esquema del desarrollo embrionario temprano ocurrido tras la fecundación en relación a la ubicación del blastocisto en el tracto reproductivo de la oveja y a los niveles circulantes de hormonas esteroideas ováricas (adaptado de Spencer et al., 2007). Es sabido que varios factores extrínsecos e intrínsecos influyen sobre la actividad reproductiva del ganado ovino. De los primeros, los dos más importantes parecen ser el fotoperiodo (duración de las horas de luz diarias y su evolución con el tiempo) y la nutrición. Ambos factores afectan directamente a la viabilidad embrionaria y en consecuencia influyen también sobre la eficiencia de la reproducción en los sistemas de explotación ovina. D í as despu é s del celo Blastocisto Macizo celular interno Trofoectodermo Blastocisto elongado Producci ó n INF - tau Oviducto Cuerno uterino Entrada al ú tero Elongaci ó n Posici ó n en el Oviducto/ Ú tero Desarrollo y crecimiento embrionario D í as despu é s del celo Blastocisto Macizo celular interno Trofoectodermo Blastocisto elongado Producci ó n INF - tau Oviducto Cuerno uterino Entrada al ú tero Elongaci ó n Posici ó n en el Oviducto/ Ú tero Desarrollo y crecimiento embrionario D í as despu é s del celo Blastocisto Macizo celular interno Trofoectodermo Blastocisto elongado Producci ó n INF - tau Oviducto Cuerno uterino Entrada al ú tero Elongaci ó n Posici ó n en el Oviducto/ Ú tero Desarrollo y crecimiento embrionario 26 3. Efectos del fotoperiodo sobre el eje reproductivo El fotoperiodo es el principal factor regulador de la estacionalidad reproductiva en las ovejas, siendo sus efectos más intensos a medida que nos alejamos del ecuador hacia latitudes más altas, ya sea norte o sur (Karsch et al., 1984). El traductor endógeno de la información fotoperiódica es la melatonina, hormona que es liberada por la glándula pineal como respuesta a la percepción de horas de oscuridad y que actúa a nivel de hipotálamo para modular la secreción pulsátil de GnRH (Karsch et al., 1984; Robinson et al., 1985). El conocimiento de los efectos de la melatonina sobre el hipotálamo y su función principal como mediadora endocrina de la regulación de la estacionalidad en las ovejas (Chemineau et al., 1996), ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas para mejorar el control de la reproducción, como por ejemplo el uso de implantes subcutáneos de melatonina exógena a fin de lograr adelantar la estación reproductiva y mejorar la eficiencia reproductiva durante el anoestro tanto en ovejas de estacionalidad muy marcada (Haresign et al., 1990) como en ovejas de razas Mediterráneas (Chemineau et al., 1996; Zuñiga et al., 2002; Abecia et al., 2007). Los implantes subcutáneos de melatonina inducen altos niveles plasmáticos de la hormona durante las 24 horas del día pero sin suprimir la secreción endógena nocturna de la hormona pineal (O’Callaghan et al., 1991; Malpaux et al., 1997). La liberación de melatonina es eficaz más allá de los 70 días tras la colocación del implante (Forcada et al., 2002). Como se ha comentado anteriormente, los primeros días de vida del embrión tras la fecundación son críticos para la supervivencia embrionaria, por lo que es muy importante conocer cuáles son los efectos de este tratamiento hormonal sobre el embrión y su ambiente. 27 3.1. Efectos de la melatonina sobre el establecimiento de la gestación En general, los tratamientos con melatonina exógena aumentan la fertilidad y prolificidad en las ovejas (Forcada et al., 1995; Chemineau et al., 1996; Zuñiga et al., 2002; Abecia et al., 2007). Asimismo, se ha comprobado que es un método efectivo para inducir ciclicidad y para aumentar la tasa de ovulación (Forcada et al., 1995; Zúñiga et al., 2002; Luther et al., 2005). 3.1.1. A nivel ovárico El efecto de la melatonina sobre el desarrollo folicular y en consecuencia sobre la tasa de ovulación, se basa en que dicha hormona aumenta el número de folículos ovulatorios debido a una disminución en el proceso de atresia de los folículos pequeños y medianos presentes en la onda folicular previa a la ovulación (Bister et al., 1999; Noël et al., 1999). Parece que la melatonina es capaz de modular el crecimiento folicular sin influir en la secreción de hormona FSH (Noël et al., 1999), tal vez debido a la capacidad de estimular la esteroidogénesis a través de una acción directa sobre el ovario (Fiske et al., 1984). Por otra parte, distintas referencias destacan el efecto luteotrófico de la melatonina, que ha sido evidenciado tanto in vivo (Wallace et al., 1988; Durotoye et al., 1997) como in vitro (Abecia et al., 2002). De este modo, Abecia et al. (2006) observaron que el tratamiento con melatonina se asocia con una disminución significativa de la proporción de ovejas no cíclicas que responden al efecto macho con la presentación de un ciclo corto (en base a la formación de un cuerpo lúteo con la funcionalidad alterada), y por tanto con un aumento del número de hembras que presentan un ciclo de duración normal (cuerpo lúteo funcional) tras la introducción de los moruecos. Estos resultados refuerzan las propiedades luteotróficas de la melatonina 28 y podrían reflejar un efecto positivo de la melatonina en el establecimiento de la gestación, ya que los niveles de progesterona (P4) durante los primeros días siguientes a la fecundación son esenciales para la supervivencia e implantación del embrión (Watson et al., 1999) (Figura 3). 3.1.2. A nivel oviductal y uterino No se conoce hasta el momento que la melatonina ejerza efectos tanto directos como indirectos a nivel oviductal. Sin embargo, a nivel uterino se ha observado que la hormona pineal es capaz de reducir la producción in vitro de PGF2α en ovejas subnutridas durante el anoestro (Abecia et al., 1999). A su vez, la demostración de la presencia de receptores uterinos específicos para melatonina en ratas (Zhao et al., 2000) y su regulación a través de las hormonas esteroideas (Clemmens et al., 2001), permite pensar en una posible acción directa de la hormona a nivel uterino, aunque tampoco existe en la literatura ninguna referencia que demuestre estos hechos en ovinos. 3.1.3. A nivel del embrión Los resultados a este nivel son contradictorios. Si bien algunos autores, trabajando con ovulación normal o con superovulación, no encontraron diferencias en la viabilidad de los embriones recuperados en anoestro o en la estación reproductiva (LópezSebastián et al., 1990; Mitchell et al., 1999; González-Bulnes et al., 2003), Mitchell et al. (2002) observaron que la viabilidad y las características morfológicas de los embriones fueron mejores cuando éstos se recuperaban al inicio de la estación reproductiva que al final de la misma. Además, Abecia et al. (2002) demostraron que la melatonina añadida al medio de cultivo favoreció la viabilidad in vitro de embriones 29 EFECTOS DE LA MELATONINA Efecto sobre el desarrollo folicular Mejora tasa de ovulación Mejora funcionalidad del cuerpo lúteo En el EMBRIÓN En OVIDUCTOS Y ÚTERO En OVARIOS Reduce la producción in vitro de PGF2α No se conocen efectos en oviductos Hallazgo receptores uterinos de MEL en ratas. Ninguna información en ovejas Similar o mejor viabilidad embrionaria Melatonina en medio de cultivo mejora la viabilidad de embriones descongelados + +/= + ? ? + descongelados. Es posible que los efectos beneficiosos de la melatonina sobre el desarrollo embrionario temprano pudieran deberse, al menos en parte, a las propiedades antioxidantes de la hormona sobre las células embrionarias (Chetsawang et al., 2006), protegiendo a las mismas del daño que causa el estrés oxidativo durante los procesos de fecundación y de desarrollo in vitro. Sin embargo y hasta el presente, los mecanismos específicos por los cuales la melatonina podría actuar sobre la viabilidad embrionaria no han sido totalmente dilucidados. Figura 3. Esquema de los principales efectos de la melatonina exógena sobre el establecimiento de la gestación en la especie ovina. 30 4. Efectos de la nutrición sobre el eje reproductivo Como ha sido mencionado previamente, la nutrición es uno de los principales factores que afectan la supervivencia embrionaria en los rumiantes. La compleja relación existente entre la nutrición y sus efectos sobre la reproducción ha sido objeto de numerosos estudios (Schillo, 1992; Rhind, 1992; Chilliard et al., 1998; O’Callaghan y Boland, 1999; Scaramuzzi et al., 2006). Aunque uno de los aspectos más estudiados de esa relación ha sido el efecto de la sobrealimentación o suplementación (flushing), como herramienta para incrementar la tasa de ovulación (Rhind, 1992), también existe documentación que avala el efecto de la subnutrición sobre el eje hipotálamo-hipofisogonadal en los rumiantes (Robinson, 1996; Boland et al., 2001; Forcada y Abecia, 2006). Al respecto, se ha observado que ovejas subnutridas, a largo y a corto plazo, presentaron una disminución de las concentraciones de FSH y LH, así como también una disminución en la frecuencia de pulsos de LH (Thomas et al., 1990; O’Callaghan et al., 2000). Dado que Foster et al. (1989) lograron revertir la baja frecuencia de descargas de FSH y LH con la administración de GnRH a corderas subnutridas, se sugiere que la deficiencia de gonadotropinas durante el período de subnutrición estaría causada por una deficiencia en la liberación endógena de GnRH, teniendo por tanto su origen a nivel hipotalámico. Algunos trabajos han encontrado una menor tasa de ovulación en ovejas subnutridas (McNeilly et al., 1987; Rhind et al., 1989a), mientras que otros autores no han encontrado diferencias (Lozano et al., 2003; Kakar et al., 2005). La subnutrición es uno de los problemas que se presenta con mayor frecuencia en los rebaños ovinos, debido a que el esquema nutricional de los sistemas extensivos está 31 basado en el pastoreo, con lo cual la disponibilidad de alimento es muy fluctuante a lo largo del año (Lindsay et al., 1993). 4.1. Efecto de la subnutrición sobre el establecimiento de la gestación Los mecanismos que deben llevarse a cabo para el establecimiento de la gestación son esenciales para la supervivencia del embrión (Robinson, 1996) (Figura 2), y la subnutrición afecta estos mecanismos aumentando la mortalidad embrionaria y disminuyendo las tasas de gestación (Rhind et al. 1989b, Abecia et al., 1995, 1999; Lozano et al., 2003), principalmente debido a una inadecuada calidad del ovocito o del desarrollo temprano del embrión; así como también afectando el ambiente uterino y el sistema de reconocimiento materno de la gestación (Abecia et al., 2006) (Figura 4). 4.1.1. A nivel ovárico McNeilly et al. (1987) observaron en ovejas subnutridas un menor número de folículos grandes (≥ 3 mm) que en las controles. Además Viñoles et al. (2002) observaron que el patrón de la dinámica folicular era diferente según la condición corporal (CC) de los animales, donde ovejas con una CC más alta mostraron un número mayor de ondas durante el período inter-ovulatorio, y mayor cantidad de folículos antrales pequeños que en las ovejas con una CC baja. Cuando se estudió el efecto de la subnutrición sobre el número de folículos estrogénicos (aquellos que secretan cantidades > 500 pg de estrógeno/hora), no se encontraron diferencias entre animales subnutridos y controles (Abecia et al., 1995, 1999). En cuanto a la calidad de los oocitos, los resultados encontrados en la bibliografía son contradictorios. Algunos autores han encontrado una calidad similar, respecto a la morfología de los oocitos, 32 entre subnutridas y controles (O’ Callaghan et al., 2000; Boland et al., 2001), mientras que otros han mostrado una alteración de la misma en animales subnutridos (Lozano et al., 2003). Además, se ha observado que, la tasa de fecundación de los oocitos en las ovejas subnutridas podía ser menor (O’Callaghan et al., 2000; Lozano et al., 2003) que las alimentadas según sus requerimientos de mantenimiento, probablemente como consecuencia de una alteración de la competencia oocitaria en el primer caso. Otro importante aspecto a evaluar en el ovario es la función luteal. Al respecto, la literatura ha mostrado repetidamente que en los ovinos existe una relación inversa entre el nivel nutricional y las concentraciones plasmáticas de P4 (Parr et al., 1987; Rhind et al., 1992; Lozano et al., 1998; O’Callaghan et al., 2000). Sin embargo, la producción in vitro de P4 por el cuerpo lúteo (CL) no parece estar afectada por la subnutrición (Abecia et al., 1995, 1997, 1999), lo que indicaría que los mayores niveles de P4 no se deben a un aumento en su síntesis. Parr (1992) propuso que este fenómeno podría deberse a una menor metabolización hepática de la hormona en animales subnutridos. De esta manera, Rhind et al. (1989a) sugirieron que la medición de la hormona a nivel local (vena ovárica) daría un mejor reflejo de la situación que al tomar muestras de sangre de la vena yugular, y que además podría ayudar a explicar el hecho de que animales subnutridos, con mayores niveles plasmáticos de P4, presentaban una mayor tasa de mortalidad embrionaria. En este sentido, se ha podido comprobar que las ovejas subnutridas tienen similares niveles de P4 en la vena ovárica y en la arteria uterina que ovejas controles (Abecia et al., 1997; Lozano et al., 1998), aunque Lozano et al. (1998) observaron el día 5 del ciclo estral unas menores concentraciones de P4 en el tejido endometrial de ovejas subnutridas respecto a las controles, lo que podría explicar el desarrollo embrionario inadecuado que presentaron las primeras. 33 4.1.2. A nivel oviductal y uterino Es conocido que un ambiente adecuado para el embrión, principalmente durante sus primeros estadios de formación, es esencial para alcanzar un desarrollo adecuado, y por ende, para asegurar su supervivencia (Watson et al., 1999). Los trabajos publicados recientemente por nuestro grupo de investigación muestran algunos de los efectos de la subnutrición sobre el ambiente en el cual podría desarrollarse un embrión ovino. Se observó que la subnutrición producía alteraciones en la expresión génica así como una disminución de la sensibilidad a las hormonas esteroideas ováricas (e.g. menor expresión de RP y REα) tanto en los oviductos como en el endometrio durante el día 5 después del estro (Sosa et al., 2004, 2006, 2008). En el útero en concreto observaron una menor expresión de los RP y una menor capacidad de unión de la hormona a los mismos durante el día 5 posterior al estro, aunque no encontraron diferencias los días 10 o 14 del ciclo estral para los parámetros mencionados. 4.1.3. A nivel del embrión Los estudios que investigan los efectos directos de la subnutrición sobre el desarrollo embrionario son relativamente escasos. En ovinos, se ha demostrado que 25 días de subnutrición aumentan la mortalidad de los embriones con 11 días de gestación (Rhind et al., 1989c). Otros trabajos, con condiciones nutricionales comparables, han reportado un porcentaje de embriones recuperados similar en ovejas subnutridas y controles los días 4, 8 y 9, aunque los embriones de las ovejas subnutridas presentaban un retraso en su desarrollo (Abecia et al., 1997, 1999; Lozano et al., 2003). Además, se encontraron diferencias en las tasas de gestación debidas a la subnutrición durante los días 14 y 15, pero no en los días 8 y 9 de gestación (Abecia et al., 1995,1997, 1999). 34 EFECTOS DE LA SUBNUTRICIÓN Menor Nº blastocistos/CL Similar % embriones recuperados pero retrasados en su desarrollo Menor contenido endometrial de P4 Menor expresión de RP en útero y en oviducto Menor capacidad de unión de los RP y RE Desde Día 15 tras el celo En el EMBRIÓN Menor tasa de gestación Menor producción de INFτ En OVIDUCTOS Y ÚTERO Mayor secreción de PGF2α Similar contenido endometrial de P4 Similar número de RP En OVIDUCTOS Y ÚTERO En el EMBRIÓN Período elongación y reconocimiento materno del embrión Desde Día 5 tras el celo Llegada del embrión al útero Figura 4. Esquema de los principales efectos de la subnutrición sobre el establecimiento de la gestación en la especie ovina 41 HIPÓTESIS DE TRABAJO Bajo la premisa de aumentar la eficiencia reproductiva en la especia ovina y teniendo en cuenta que tanto la nutrición como la estación del año son factores muy importantes que influyen en la reproducción de esta especie, nuestro equipo de investigación viene desarrollando, desde 1988, una línea de investigación con el objeto de profundizar en el conocimiento de los mecanismos que intervienen en las relaciones entre nutrición y reproducción en la oveja. Además, y a partir de 1991, se incorporó una línea paralela con el objeto de determinar los mecanismos de acción de la melatonina sobre el eje reproductivo en la especie ovina. Uno de los aspectos de mayor interés en los que han confluido ambas líneas de trabajo ha sido el conocimiento de los mecanismos que determinan la viabilidad embrionaria y el reconocimiento materno de la gestación en la especie ovina, poniendo al descubierto el papel que la subnutrición y la estacionalidad juegan en los mismos. Hemos comentado anteriormente que la oveja es una especie con estacionalidad reproductiva y que la melatonina es la hormona que interviene como mediadora entre el medio ambiente externo y el eje reproductivo, actuando tanto a nivel del embrión como del tracto reproductivo, con efectos benéficos para la eficiencia reproductiva. Nuestra hipótesis de trabajo es que el tratamiento con melatonina exógena podría ser una herramienta útil para paliar o revertir los efectos adversos que causa la subnutrición sobre la supervivencia embrionaria en las explotaciones ovinas. Además, debido a que un inadecuado ambiente uterino podría determinar un retraso en el desarrollo e incluso la muerte del embrión, consideramos un punto clave y esencial para el entendimiento de los mecanismos involucrados en la supervivencia embrionaria, evaluar los efectos sobre 42 la competencia oocitaria y el embrión tanto in vivo como in vitro, así como también los efectos sobre el endometrio. En las condiciones de los sistemas de producción ovinos en el área mediterránea, el manejo nutricional del rebaño es un punto fundamental a considerar al determinar la rentabilidad de las explotaciones. Debido a las variaciones en la disponibilidad de alimentos, estacionales o coyunturales, es muy frecuente observar la presentación de periodos más o menos prolongados de subnutrición. Esta situación puede agravarse en los momentos en que las hembras presentan requerimientos máximos para cubrir sus necesidades fisiológicas, como por ejemplo durante la lactación. De esta manera, nos pareció importante comprobar nuestra hipótesis de trabajo en hembras que estuvieran en diferentes estados fisiológicos (vacías secas o recién paridas), lo que podría influir en la respuesta al efecto de la melatonina exógena sobre la viabilidad embrionaria y en la posible mejora de la eficiencia de producción en las explotaciones ovinas. En la actualidad existen pocos trabajos en los que se evalúen de manera conjunta los efectos de la estación del año y de la subnutrición sobre el establecimiento de la gestación en una especie con una notable estacionalidad reproductiva como la ovina. Por lo que profundizar sobre el tema nos permitiría comprender de manera global los mecanismos implicados en la viabilidad embrionaria y por tanto en la mejora de la productividad en dicha especie. En resumen, el presente trabajo pretende aportar información precisa sobre los efectos del tratamiento exógeno con melatonina a ovejas mediterráneas subnutridas sobre la viabilidad de oocitos y de embriones, así como también del ambiente uterino, tanto durante la estación reproductiva como durante el anoestro estacional. 43 MELATONINA Mejora tasa de ovulación Efecto Luteotrófico Reduce secreción de PGF2αin vitro SUBNUTRICIÓN Menor nº de receptores uterinos de P4 Mayor secreción de PGF2α Menor secreción de INF-tau por el embrión ¿MELATONINA + SUBNUTRICIÓN? ¿Mejora la competencia oocitaria y/o la viabilidad embrionaria? ¿Sobre el ambiente uterino? (in vivo) ¿Sobre los oocitos? (in vivo e in vitro) ¿Sobre los embriones? (in vivo e in vitro) ¿Son similares los efectos en la estación reproductiva y en el anoestro? ¿Porque causa efectos a qué nivel? ¿Los efectos dependen del estado fisiológico de la oveja (vacía vs. post-parto)? ESQUEMA DE LA HIPOTESIS DE TRABAJO PLANTEADA 44 45 OBJETIVOS ESPECÍFICOS IEvaluar los efectos de la melatonina exógena sobre la viabilidad embrionaria en ovejas subnutridas de Rasa Aragonesa, en dos diferentes estados fisiológicos (vacías y con al menos 45 días tras el parto) y durante dos épocas diferentes del año (estación reproductiva y anoestro estacional). IIEvaluar los efectos de la melatonina exógena sobre la competencia de los oocitos recuperados de ovejas subnutridas, vacías y con 45 días tras el parto, durante la estación reproductiva y el anoestro estacional. IIIEvaluar los efectos de la melatonina exógena sobre la localización y abundancia de los receptores esteroideos de progesterona (RP) y estrógenos (REα) en el endometrio de ovejas subnutridas, vacías y con 45 días tras el parto, durante la estación reproductiva y el anoestro estacional. 46 47 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Aspectos generales 1.1. Instalaciones Todos los experimentos se realizaron en la granja experimental del Servicio de Experimentación Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, España (latitud 41º 41’N), cumpliendo con los requerimientos del Comité Ético para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza. Se utilizaron ovejas adultas de la raza Rasa Aragonesa, durante la estación reproductiva y durante el anoestro estacional (definido para dicha raza por Forcada et al., 1992). 1.2. Alimentación Los animales se alimentaron una vez al día, por la mañana, en base a una dieta compuesta por paja de cebada y concentrado, con libre acceso al agua. El concentrado de la dieta consistió en una mezcla de cebada (73%), soja (22%) y suplemento mineral (5%). Desde la colocación de los implantes de melatonina hasta el inicio de las dietas experimentales, todos los animales recibieron una dieta que cubría 1,0 veces los requerimientos diarios de mantenimiento (M) (Agricultural and Food Research Council, 1993) (experimentos 1 y 2) o los requerimientos de lactancia para un solo cordero (experimentos 3 y 4). En todos los experimentos y desde el momento de la colocación de las esponjas intravaginales hasta el sacrificio (día 5 tras el celo), las ovejas fueron asignadas para ser 48 alimentadas en grupo con una de dos dietas con diferentes niveles energéticos: dieta control y dieta baja, que aportaron 1,5 o 0,5 veces los requerimientos diarios de M, respectivamente. La dieta control (C) estuvo compuesta por 0,60 kg de concentrado y 1,0 kg de paja de cebada por oveja y por día, aportando 12,4 MJ de energía metabolizable (EM) y 9,3% de proteína bruta (PB). La dieta baja (B) consistió en 0,20 kg de concentrado y 0,35 kg de paja de cebada por oveja y por día (4,1 MJ de EM y 9,1% PB). Durante el periodo de oferta de los tratamientos nutricionales (20 días), la dieta 1,5 M aseguró el mantenimiento del PV y la CC, mientras que la dieta 0,5 M provocó una disminución de aproximadamente un 12% tanto en el PV como en la CC (Abecia et al., 1995, 1997; Lozano et al., 1998; Sosa et al., 2004, 2006). El PV y la CC fueron determinados al momento de colocación y de retirada de las esponjas intravaginales, y al sacrificio de los animales. Adicionalmente en los experimentos 3 y 4, también se determinaron al momento del parto y del destete. 1.3. Tratamientos hormonales En cada uno de los experimentos, la mitad de las ovejas fueron seleccionadas para recibir un implante subcutáneo de melatonina (18 mg melatonina, Melovine®, CEVA Salud Animal, Barcelona, España) en la base de la oreja, 42 d antes de realizar la sincronización de los celos. La sincronización de los celos se realizó utilizando un tratamiento intravaginal con esponjas impregnadas con progestágenos (30 mg de acetato de fluorogestona, Sincropart®, CEVA Salud Animal, Barcelona, España) durante 14 días, al cabo de los cuales se administraron 400 UI (Experimentos 1 y 3, durante la estación reproductiva) y 480 UI (Experimentos 2 y 4, durante el anoestro) de gonadotropina coriónica equina (eCG) (Sincropart® PMSG, CEVA Salud Animal, Barcelona, España) por vía 49 intramuscular. Desde las 24 h posteriores a la retirada de las esponjas intravaginales, y cada 8 h, se realizó la detección del celo (día 0) con machos enteros dotados de arneses con pintura marcadora. 2. Diseño experimental Cada uno de los experimentos se basó en un diseño factorial 2 x 2; considerando el tratamiento con melatonina exógena (con o sin implantes de melatonina) y el tratamiento nutricional (dietas control y baja) como factores fijos. De esta manera, los 4 grupos experimentales en cada uno de los experimentos realizados fueron: ovejas alimentadas con dieta control y que no recibieron implantes de melatonina (C-MEL), ovejas alimentadas con dieta control y que recibieron implantes de melatonina (C+MEL), ovejas alimentadas con dieta baja y que no recibieron implantes de melatonina (B-MEL) y ovejas alimentadas con dieta baja y que recibieron implantes de melatonina (B+MEL). La Figura 5 muestra un esquema del diseño experimental en los 4 experimentos realizados. 3. Animales 3.1. Experimento 1 (Artículos I y II-Ovejas vacías, Estación reproductiva) Se utilizaron 42 ovejas adultas, cíclicas y vacías de la raza Rasa Aragonesa, que al comienzo del experimento tuvieron un peso vivo (PV) medio (± ES) de 64,1±1,7 kg y una condición corporal (CC) media (± S.E.) de 3,1±0,1. A principios de diciembre, las ovejas fueron distribuidas en 2 grupos: el primer grupo (n=21) incluyó ovejas que recibieron un implante subcutáneo de melatonina el segundo grupo (n=21) quedó sin 50 implantar. A mediados de enero, 42 días después de la colocación de los implantes de melatonina, los celos de las hembras fueron sincronizados, y cada hembra fue distribuída en uno de los 4 grupos experimentales, iniciándose el mismo día los tratamientos nutricionales correspondientes. 3.2. Experimento 2 (Artículos I y II-Ovejas vacías, Anoestro) Se utilizaron 31 hembras no-cíclicas, vacías de raza Rasa Aragonesa que tuvieron un PV (± S.E.) medio de 57,2±1,2 kg y una CC media (± S.E.) de 2,9±0,04. El 26 de marzo, 16 de esas ovejas recibieron un implante subcutáneo de melatonina y el resto de las ovejas (n=15) no fueron implantadas. Todas las hembras fueron sincronizadas en mayo, 42 días después de la colocación de los implantes de melatonina, iniciándose el mismo día con el suministro de las dietas experimentales. 3.3. Experimento 3 (Ovejas post-parto, Estación reproductiva) Se utilizaron 24 ovejas adultas, de la raza Rasa Aragonesa, con un peso vivo (PV) medio (± S.E.) de 65,9±1,8 kg y una condición corporal (CC) media (± S.E.) de 2,80±0,06, durante los meses de noviembre a febrero. En el momento del parto (noviembre), las ovejas fueron distribuidas en 2 grupos: el primer grupo recibió un implante subcutáneo de melatonina, el segundo grupo incluyó las ovejas sin implantar. Tras un periodo de amamantamiento de 45 días, con un solo cordero, se realizaron los destetes y los celos de las ovejas fueron sincronizados Desde el momento de la colocación de las esponjas hasta el sacrificio (día 5 post estro), las ovejas fueron alimentadas con una de las dos dietas experimentales. 57 antigénica. Tras un lavado en solución tampón (PBS 0,01 M, pH 7,5), se bloqueó la actividad inespecífica de las peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de un lavado de 10 minutos en PBS, los preparados se incubaron con suero de caballo (Vectastain; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) durante 60 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Luego, se los incubó durante 1 hora con el anticuerpo primario correspondiente para la detección de cada receptor, diluido en PBS: anti-RP (Zymed, South San Francisco, CA, USA) y anti-REα (Santa Cruz, California, USA). Los controles negativos se obtuvieron reemplazando el anticuerpo primario por un suero inespecífico a una concentración equivalente. Tras la unión al anticuerpo primario, los tejidos se incubaron durante 60 minutos con un anticuerpo secundario biotinilado (Vectastain, Vector) diluido en suero de caballo, y luego 60 minutos más con el complejo avidinabiotina-peroxidasa (Vectastain Elite; Vector). El sitio de unión del complejo enzimático al tejido se visualizó por medio de 3,3’-diaminobencidina (DAB, Vector), un cromógeno que produce un precipitado marrón insoluble cuando se incuba junto con la enzima. Las secciones de tejido se colorearon con hematoxilina y se deshidrataron en etanol antes de ser montadas con cemento sintético. 7.2. Análisis de imagen Para estimar la expresión de los receptores de interés en el endometrio, se realizó un análisis de imagen subjetivo llevado a cabo por dos observadores independientes que desconocían la conformación de los grupos. Sólo se evaluaron las regiones intercarunculares del endometrio. La expresión de RP y REα se estudió en 5 compartimientos histológicos. El primero de ellos fue el epitelio luminal. Tanto el epitelio glandular como el estroma, se dividieron según su ubicación en: superficial y 58 profundo. Se analizaron 10 campos por compartimiento histológico por animal a un aumento de 1000X. La intensidad de tinción se clasificó en negativa, leve, moderada o intensa y cada categoría se expresó como porcentaje de la cantidad total de células (Thatcher et al., 2003). A partir de esta evaluación se estudiaron dos variables: la proporción de células positivas y la intensidad de tinción. La intensidad de tinción se calculó mediante la siguiente fórmula: 1 x n1 +2 x n2 + 3 x n3, donde n es igual a la proporción de células con intensidad leve (1), moderada (2) o intensa (3) (Boos et al., 1996). 8. Determinación de niveles plasmáticos de hormonas y metabolitos En todos los experimentos se obtuvieron muestras de sangre de la vena yugular en tubos heparinizados (BD Vacutainer®, Franklin Lakes, NJ, USA). Todas las muestras fueron centrifugadas dentro de los 15 minutos desde su obtención (1000 g, 10 minutos) y el plasma obtenido fue almacenado a -20ºC hasta su posterior procesamiento. 8.1. Progesterona Previo al inicio de los experimentos y para confirmar la ciclicidad ovárica (experimentos 1 y 3) o el anoestro (experimentos 2 y 4), se procedió a la determinación de los niveles de progesterona (P4) plasmática los días 7 y 14 antes de la colocación de los implantes de melatonina. Todas las ovejas que presentaron niveles de P4 mayores a 1 ng/ml en al menos una de las muestras, se consideraron cíclicas. Estos niveles han sido demostrados como propios de una fase luteal del ciclo estral en esta especie y con la analítica empleada. En todos los experimentos se obtuvieron muestras de sangre en tubos heparinizados los días 0, 3 y 5 (sacrificio) para determinar los niveles plasmáticos 59 de P4. Las concentraciones plasmáticas de P4 fueron determinadas utilizando un kit comercial de RIA en fase sólida y directo (Count-A-Count TKPG;DPC) (Meikle et al., 1997). La sensibilidad de la prueba fue de 0,02 ng/ml. El coeficiente de variación (CV) intra-ensayo para los controles de concentraciones bajas (3ng/ml), medias (15 ng/ml) y altas (30 ng/ml) fue 14%, 8,5% y 7,5%, respectivamente. El CV inter-ensayo fue menor al 15% para todos los controles de las concentraciones utilizados. 8.2. Melatonina A fin de comprobar la efectividad de los implantes de melatonina, se obtuvo una muestra diurna de sangre. Las concentraciones plasmáticas de melatonina fueron analizadas en un único ensayo de radioinmunoanálisis (RIA) directo y en fase sólida, utilizando un kit comercial (Bühlmann RK-MDI; Bühlmann Lab; Switzerland). La sensibilidad del ensayo fue de 1,3 pg/ml. Los CV intra-ensayo fueron de 10,9 % y 7,5 % para los controles de concentraciones bajas (3,3 pg/ml) y altas (20,6 pg/ml), respectivamente. 8.3. Metabolitos Desde el inicio de las dietas experimentales hasta el día del sacrificio (día 5 post celo) de los animales, se obtuvieron muestras de sangre cada 2 días. Posteriormente se realizó la determinación de los niveles plasmáticos de glucosa, ácidos grasos no esterificados (AGNE) y de β-hidroxibutirato (BHB) en un autoanalizador (Gernonstar, Transasia, Bombay, India). La glucosa se analizó utilizando un kit enzimático (Gernon®, RAL for Laboratories Techniques, Barcelona, Spain). También se utilizaron 60 kits comerciales para analizar AGNE (NEFA®, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, United Kingdom) y para BHB (RANBUT®, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, United Kingdom). Los CV intra e inter-análisis para glucosa y BHB fueron 2,2 % y 3,1%, respectivamente (siendo los CV similares para ambos metabolitos). En cambio los CV intra e inter-análisis para AGNE fueron 11,7% y 13%, respectivamente. 9. Análisis estadísticos Cada experimento se basó en un diseño factorial 2x2, con el nivel nutricional y el tratamiento con melatonina como efectos fijos. En un análisis posterior y complementario, los experimentos se agruparon con un diseño factorial 2x2x2, con el nivel nutricional, el tratamiento con melatonina y la época del año (estación reproductiva o anoestro estacional) como efectos fijos. En los artículos I y II, los efectos de los tratamientos en el desarrollo y calidad de los oocitos y de los embriones (obtenidos in vivo e in vitro) fueron evaluados usando el PROC GEN MOD (Statistical Analysis System, SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA) con una distribución Poisson especificada en un modelo que incluyó la estación del año (reproductiva o anoestro), el nivel nutricional (dieta control o dieta baja), el tratamiento con melatonina (tratadas o no con implantes de melatonina) y sus interacciones. Las concentraciones de metabolitos y hormonas plasmáticas, la expresión de receptores en el endometrio, el PV y la CC, se analizaron por análisis de varianza utilizando un modelo mixto (Statistical Analysis System, SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA), que incluyó los efectos del tratamiento nutricional, del tratamiento con melatonina, del día del ciclo y de sus interacciones. Para el caso concreto de la expresión de receptores, se incluyó además, el efecto del compartimiento histológico estudiado. Estas variables se estudiaron por análisis de medidas repetidas, y las observaciones previas al inicio del tratamiento se 61 incluyeron en el análisis como covariables. Los valores expresados como porcentajes fueron comparados con la prueba de Chi cuadrado. El nivel de significación se estableció en P<0,05 y los valores de P comprendidos entre 0,05 y 0,1 se consideraron como tendencia. Todos los resultados se expresaron como medias ± S.E. 62 63 RESULTADOS EXPERIMENTO 1. Ovejas vacías, Estación reproductiva (Artículos I y II). 1.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal Los PV en las ovejas de los grupos C-MEL y C+MEL no experimentaron cambios durante el periodo experimental de las dietas (20 días), pero las ovejas B-MEL y B+MEL mostraron una pérdida media de peso significativa (P<0,001), de 7,5 y 9.3 kg, respectivamente (Figura 6a). Así mismo, las ovejas B-MEL y B+MEL disminuyeron significativamente la CC media (0,3 y 0,5 puntos, respectivamente); mientras que en los grupos C-MEL y C+MEL la CC de las ovejas permaneció sin variaciones (Figura 6b). 1.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales 1.2.1. Melatonina El día 45 posterior a la colocación de los implantes, todos los implantes de melatonina indujeron altos niveles plasmáticos de melatonina durante las horas diurnas (enero: 53,6±4,2 pg/ml), lo cual indicó que la hormona fue liberada por los implantes de manera apropiada. Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C-MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B-MEL) -47 -15 0 5 Días desde el momento del celo Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C-MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B-MEL) -47 -15 0 5 Dieta MANTENIMIENTO Dieta ExperimentalDieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL)1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C-MEL)1,5 M sin MEL (C-MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL)0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B-MEL)0,5 M sin MEL (B-MEL) -47 -15 0 5-47 -15 0 5 Días desde el momento del celo 64 Figura 6. Medias (± S.E.) de peso vivo (a) y de CC (b) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con implantes de melatonina, desde el inicio (barras negras) hasta el final (barras blancas) de los 20 d de periodo experimental de las dietas, durante la estación reproductiva. Barras con diferentes letras (a, b) entre grupos indican P<0,01. Asteriscos dentro de cada grupo indican P<0,001 (**). 45 50 55 60 65 70 C C+MEL L L+MEL Peso vivo (kg) 2 2.4 2.8 3.2 3.6 C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL Condición corporal (CC) a a b b ** ** ** ** a a b b (b) (a) 65 0 0.6 1.2 1.8 2.4 3 3.6 4.2 4.8 5.4 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Dias desde el momento del celo P4 (ng/ml) C-MEL C+MEL L-MEL L+MEL 1.2.2. Progesterona En todas las ovejas, los niveles de P4 incrementaron gradualmente desde el momento del celo hasta el día del sacrificio. Las concentraciones plasmáticas de P4 el día del sacrificio (día 5), aunque no presentaron diferencias significativas entre grupos, indicaron que todas las ovejas exhibieron un CL funcional. De esta manera, los niveles medios de P4 en plasma el día 5 tras el celo fueron: 3,7±0,5 ng/ml (C-MEL); 3,8±0,5 ng/ml (C+MEL), 4,7±0,7 ng/ml (B-MEL) y 4,0±0,8 ng/ml (B+MEL) (Figura 7). Figura 7. Concentraciones plasmáticas medias (± S.E.) de progesterona (P4) desde el día del retiro de la esponja con progestágenos hasta el día del sacrificio (día 5 tras el celo) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con implantes de melatonina durante la estación reproductiva. (Día 0=celo). 66 1.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles plasmáticos de glucosa, ácidos grasos no esterificados y β-hidroxibutirato La melatonina exógena no tuvo efectos sobre la concentración media de glucosa, aunque se observó que el tipo de dieta influyó sobre el perfil de secreción de este metabolito. Así, de manera global y a lo largo de la experiencia, los animales que consumieron la dieta C presentaron una mayor concentración media de glucosa que las ovejas con la dieta B (C: 3,6±0,03 vs. B: 3,4±0,03 mmol/L; P<0,01). Es de destacar que, a excepción del grupo C-MEL, los demás grupos presentaron la aparición de un pico pronunciado en la secreción de glucosa el día previo a la aparición del estro (Figura 8a). Con respecto a la secreción de AGNE y coincidiendo con las pérdidas de peso vivo observadas, las ovejas de los grupos B-MEL y B+MEL presentaron concentraciones entre 5 a 6 veces mayores que las observadas en los grupos C-MEL y C+MEL. Un hallazgo interesante en este experimento fue que hubo un efecto significativo de la melatonina sobre las concentraciones de AGNE en las ovejas subnutridas, siendo el grupo B+MEL el que presentó menores niveles de este metabolito durante los 21 d de tratamiento nutricional (B+MEL: 0,30±0,01 vs. B-MEL: 0,38±0,01 mmol/L, P<0,01) (Figura 8b). Al evaluar el perfil de secreción de BHB, se observó que las ovejas que consumieron la dieta C presentaron una menor concentración de este metabolito respecto a las ovejas subnutridas (C: 0,24±0,006 vs. B: 0,29±0,006 mmol/L; P<0,001). Se puede observar en la Figura 8c que fue el grupo B-MEL el que presentó los mayores niveles de BHB a lo largo de todo el experimento. 73 EXPERIMENTO 2. Ovejas vacías, Anoestro estacional (Artículos I y II). 2.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal Las ovejas de los grupos C-MEL y C+MEL mantuvieron el PV y la CC, pero las ovejas de B-MEL y B+MEL disminuyeron significativamente el PV (pérdidas medias de 2,5 y 3,8 kg, respectivamente) y la CC (pérdidas medias de 0,2 y 0,3 puntos, respectivamente) durante los 20 d de periodo experimental de las dietas (P<0,05) (Figura 10). 2.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales 2.2.1. Melatonina El día 45 posterior a la colocación de los implantes, todos los implantes de melatonina indujeron altos niveles plasmáticos de melatonina durante las horas del día (mayo: 62,4±4,9 pg/ml), lo cual indicó que la hormona fue liberada por los implantes de manera apropiada. Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 47 - 15 0 5 D í as desde el momento del celo Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 47 - 15 0 5 Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental Dieta MANTENIMIENTO Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 47 - 15 0 5 - 47 - 15 0 5 D í as desde el momento del celo 74 Figura 10. Medias (± S.E.) de peso vivo (a) y de CC (b) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con implantes de melatonina, desde el inicio (barras negras) hasta el final (barras blancas) de los 20 d de periodo experimental de las dietas, durante el anoestro. Barras con diferentes letras (a, b) entre grupos indican P<0,01. Asteriscos dentro de cada grupo indican P<0,001 (**) o P<0,05 (*). 45 50 55 60 65 70 C C+MEL L L+MEL Peso vivo (kg) 2 2.4 2.8 3.2 3.6 C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL Condición corporal (CC) a a b b ** ** * * a a b b (b) (a) 75 0 0.6 1.2 1.8 2.4 3 3.6 4.2 4.8 5.4 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Dias desde el momento del celo P4 (ng/ml) C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL 2.2.2. Progesterona En todas las ovejas, los niveles de P4 incrementaron gradualmente desde el momento del estro hasta el día del sacrificio (día 5), indicando que todas las ovejas exhibían un CL funcional al momento del sacrificio. Las concentraciones plasmáticas de P4 el día 5 post-estro en los diferentes grupos fueron: 3,6±0,6 ng/ml (C-MEL); 3,8±0,6 ng/ml (C+MEL), 2,6±0,7 ng/ml (B-MEL) y 3,4±0,7 ng/ml (B+MEL), sin diferencias significativas entre grupos (Figura 11). Figura 11. Concentraciones plasmáticas medias (± S.E.) de progesterona (P4) desde el día del retiro de la esponja con progestágenos hasta el día del sacrificio (día 5 tras el celo) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con implantes de melatonina durante el anoestro estacional. (Día 0=celo). 76 2.3. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles plasmáticos de glucosa, ácidos grasos no esterificados y β-hidroxibutirato Las ovejas alimentadas con la dieta C presentaron mayores niveles de glucosa que las ovejas de los grupos B, expresado como media general del periodo experimental (C: 3,8±0,03 vs. B: 3,5±0,03 mmol/L; P<0,001) (Figura 12a). Se observó un efecto de la melatonina sobre las concentraciones de este metabolito, siendo las ovejas implantadas las que presentaron mayores niveles de glucosa durante los 21 días de periodo experimental (+MEL: 3,74±0,04 vs. –MEL: 3,4±0,03 mmol/L; P<0,05). En la Figura 12a también se puede observar que todos los grupos, excepto las ovejas B+MEL presentaron un pico de secreción alrededor de la aparición del estro. Un hallazgo inesperado se observó en la secreción de AGNE, ya que a pesar de las pérdidas significativas de peso vivo observadas en ambos grupos de ovejas subnutridas, solo en el grupo L+MEL se observó un incremento de los niveles plasmáticos de este metabolito, de manera que las ovejas del grupo L-MEL tuvieron un perfil de secreción semejante a las ovejas de los grupos C. Además, en la Figura 12b se puede observar que todas las ovejas presentaron una elevada concentración de este metabolito el día del inicio del tratamiento nutricional, el cual fue seguido por un descenso del nivel, leve en el caso de los grupos C-MEL y L-MEL y pronunciado en el grupo C+MEL. No hubo efecto de la nutrición ni de la melatonina exógena sobre la concentración plasmática de BHB durante todo el periodo experimental (Figura 12c). 77 Figura 12. Concentraciones plasmáticas medias (± S.E.) de glucosa (a), ácidos grasos no esterificados (b) y β-hidroxibutirato (c) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con implantes de melatonina, durante los 20 d de periodo experimental de las dietas en el anoestro estacional. Letras diferentes en glucosa (a, b) indican P<0,01entre grupos C y B. La flecha señala el día previo al celo. Los asteriscos indican P<0,001 entre L+MEL y los demás grupos. 3 3.5 4 4.5 GLU (mmol/L) (a) a b a b a b a b a b a b 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 AGNE (mmol/L) (b) ** ** ** ** ** ** ** 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 3 6 9 12 15 18 21 Días desde el inicio del tratamiento nutricional BHB (mmol/L) C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL (c) 78 2.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo No hubo diferencias entre grupos en la tasa de ovulación (Tabla 3). Sólo una oveja, en el grupo B+MEL, no presentó comportamiento de celo después de retirada la esponja. Además, dos ovejas del grupo B-MEL (n=5) y dos ovejas del grupo B+MEL (n=6) fueron excluidas del experimento debido a que no presentaron CL de apariencia normal en el momento del sacrificio. No se observaron diferencias significativas en el número de embriones fertilizados ni viables el día 5 tras el celo, lo que indica que durante el anoestro ni la subnutrición ni el tratamiento con melatonina exógena tuvieron efecto sobre estos parámetros (Tabla 3). No hubo efecto significativo de la subnutrición ni de la melatonina exógena en la viabilidad in vitro de los embriones recuperados; de esta manera, los porcentajes de embriones que fueron capaces de alcanzar el estadio de blastocisto expandido o eclosionado fueron los siguientes: 87,5% (C-MEL), 83,3% (C+MEL), 83,3% (B-MEL) y 88,9% (B+MEL). 2.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos como fuente de embriones in vitro Se observó una tendencia a que la subnutrición redujera el número de oocitos recuperados por oveja (C: 15,6±1,4 vs. B: 13,3±1,8; P<0,1) (Tabla 4). En los grupos que no recibieron implantes de melatonina, la subnutrición provocó una significativa disminución en el número de embriones divididos observados por oveja (C: 7,2±0,8 vs. B: 4,1±0,9; P<0,05). Por contra, ninguno de los parámetros evaluados estuvieron afectados por el tratamiento de melatonina exógena ni por la interacción entre el nivel nutricional y el tratamiento con melatonina; sin embargo, en los grupos de ovejas 79 subnutridas, la melatonina exógena pareció incrementar el número de oocitos aptos para IVM (B+MEL: 9,4±1,0; B-MEL: 7,6±1,4; P<0,1), aumentando el número de oocitos divididos (B+MEL: 7,0±0,7; B-MEL: 4,1±0,9; P<0,05) así como también la tasa de blastocistos (B+MEL: 37,2%, B-MEL: 21,9%; P<0,05), Además, el tratamiento con melatonina mejoró la tasa de blastocistos en las ovejas de los grupos C (C+MEL 26,4%; C-MEL: 11,3%; P<0,05). Tabla 3. Respuesta ovárica y producción de embriones en el anoestro de ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas con 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena 62 d antes de la recuperación de los embriones (medias ± S.E.) GRUPO C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL No. de ovejas 8 7 5 6 No. de ovejas en estro 8/8 7/7 5/5 5/6 Tasa de ovulación 2,4±0,4 2,1±0,3 2,0±0,6 1,8±0,2 No. estructuras recuperadas 1,0±0,3 1,6±0,3 1,2±0,4 1,4±0,4 No. de embriones recuperados 0,6±0,3 c 1,3±0,3 d 0,8±0,4 c 1,2±0,4 d Tasa de fecundación (%) 66,7±18 83,3±18 75,0±22 87,5±22 No. de embriones viables 0,6±0,3 c 1,1±0,3 d 0,8±0,4 c 1,2±0,4 d Tasa de viabilidad (%) 66,7±18,1 75,0±18,1 75,0±22,2 87,5±22,2 Tasa de gestación (%)* 50 (4/8) 71,4 (5/7) 60 (3/5) 80 (4/5) Diferentes superíndices (c, d) en la misma fila indican P<0,1. Estructuras recuperadas = oocitos + embriones. *Porcentaje de ovejas con embriones viables el día 5. 80 Tabla 4. Resultados de la fecundación in vitro (FIV) de los oocitos recogidos de ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas con una dieta 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena durante el anoestro estacional (medias ± S.E.) Todos los valores han sido expresados por oveja. Diferentes superíndices (a, b) o (c, d) en la misma fila indican diferencias significativas (P<0,05) o (P<0,1), respectivamente. C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL No. de ovejas con CL funcional 11 9 8 8 Tasa de ovulación 2,3 ± 0,4 2,4 ± 0,4 2,5 ± 0,5 1,9 ± 0,5 No. de oocitos recuperados 16,1 ± 1,8 15,2 ± 1,9 12,0 ± 2,1 14,6 ± 2,1 No. de oocitos aptos para MIV 9,6 ± 0,4 d 9,4 ± 0,8 7,6 ± 1,4 e 9,4 ± 1,0 d Tasa de oocitos aptos (%) 59,6 61,8 63,3 64,4 No. de oocitos no-aptos para MIV 6,5 ± 0,9 5,8 ± 1,0 4,4 ± 1,1 5,2 ± 1,1 No. de embriones divididos 7,2 ± 0,8 a 5,3 ± 0,9 4,1 ± 0,9 b 7,0 ± 0,7 a Tasa de división (%) 75,0 56,4 53,9 d 74,5 e No. de blastocistos 0,8 ± 0,4 1,4 ± 0,5 0,9 ± 0,6 2,6 ± 0,8 Tasa de blastocistos (%) 11,3 a 26,4 b, d 21,9 b 37,2 c, e 81 2.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores esteroideos (RP y REα) en el endometrio El porcentaje de células positivas para RP y REα no estuvo afectado por el tratamiento nutricional ni por la melatonina exógena ni tampoco por la interacción entre ambos. Tampoco hubo efectos de los tratamientos ni de su interacción sobre la intensidad de tinción de RP y REα en ninguno de los tipos celulares evaluados (Figura 13). Hubo un efecto muy claro de la ubicación (superficial vs. profundo) en EG para REα (P<0,01). Figura 13. Intensidad de tinción de RP (arriba) y REα (abajo) en el endometrio de ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas con una dieta 1,5x (C) o 0,5x (B) veces los requerimientos de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena durante el anoestro estacional (medias ± S.E.) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL b 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad b b 82 Efecto de la época del año. Experimentos 1 y 2 Efecto de la época del año sobre los parámetros estudiados Tal como se comentó en la sección de Metodología, una vez estudiados los parámetros en cada estación y dadas las diferentes respuestas encontradas en función de la estación del año en algunos de ellos, se introdujo en el modelo estadístico original la estación del año (estación reproductiva y/o anoestro estacional) como factor fijo. De esta manera, el diseño factorial final fue 2x2x2, con la estación del año, el nivel nutricional y el tratamiento con melatonina como factores fijos. Los principales efectos observados se resumen en la Tabla 5. 89 consumida sobre la concentración global de la glucosa, siendo las dietas C las que presentaron mayores niveles de este metabolito (C: 4,0±0,04 vs. B: 3,7±0,04 mmol/L, P<0,001). Con respecto a la secreción de AGNE, y coincidiendo con las pérdidas de peso vivo observadas, las ovejas de los grupos B-MEL y B+MEL presentaron concentraciones de entre 7 y 8 veces superiores que las observadas en los grupos CMEL y C+MEL durante todo el periodo del tratamiento nutricional (Figura 16b), lo cual demostró un marcado efecto del tipo de dieta sobre la secreción de este metabolito (P<0,001). Por el contrario, no se observó ningún efecto de la melatonina exógena. Al evaluar el perfil de secreción de BHB, se observó que las ovejas que consumieron la dieta C presentaron una menor concentración de este metabolito respecto a las ovejas subnutridas (C: 0,33±0,009 vs. B: 0,37±0,008; P<0,005). Por el contrario, no hubo efecto alguno de la melatonina exógena sobre la secreción de BHB. Es de destacar que, en todos los grupos se observó la aparición de un pico leve de secreción el día previo a la aparición del celo (día 15 del tratamiento nutricional), seguido de un descenso de las concentraciones hacia el día 5 tras el celo (Figura 16c). 90 Figura 16. Concentraciones plasmáticas medias (± S.E.) de glucosa (a), ácidos grasos no esterificados (b) y β-hidroxibutirato (c) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas durante 45 días de periodo post-parto con una dieta lactancia para un solo cordero, y tras el destete alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto, durante la estación reproductiva. La flecha señala el día previo al celo. Letras diferentes (a, b) en glucosa indican P<0,001 entre grupos C+MEL y B+MEL. Asteriscos indican P<0,01 entre grupos C y B. 3 3.5 4 4.5 5 5.5 GLU (mmol/L) (a) a a a a a a a a b b b b b b b b 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 AGNE (mmol/L) (b) ** ** ** ** ** ** ** ** 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 3 6 9 12 15 18 21 Días desde el inicio del tratamiento nutricional BHB (mmol/L) C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL (c) 91 3.4. Efectos de los tratamientos sobre la recuperación de embriones obtenidos in vivo No hubo efecto de la dieta ni de la melatonina sobre la tasa de ovulación o sobre el número de embriones recuperados por CL (Tabla 1), pero se observó que la presencia de melatonina exógena tendió a mejorar el número de estructuras recuperadas por oveja (-MEL: 0,75±0,3 vs. +MEL: 1,50±0,3; P=0,09). Además, se observó que las ovejas subnutridas implantadas con melatonina presentaron un mayor número de embriones viables/CL y mayores tasas de viabilidad y de gestación a día 5 tras el celo que aquellas ovejas no implantadas (Tabla 6, P<0,05). Tabla 6. Respuesta ovárica y producción de embriones en la estación reproductiva de ovejas raza Rasa Aragonesa con 45 días de periodo post-parto, alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto (70 d antes de la recuperación de los embriones), durante la estación reproductiva (medias ± S.E.) GRUPOS C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL No. de ovejas 6 6 6 6 No. de ovejas en celo 6/6 6/6/ 6/6 6/6 Tasa de ovulación 2,17±0,3 2,17±0,3 1,50±0,3 2,0±0,3 No. de estructuras recuperadas/CL 0,30±0,2 0,60±0,3 0,50±0,2 0,83±0,2 No. de embriones totales/CL 0,30±0,2 0,30±0,2 c 0,50±0,2 0,75±0,2 d Tasa de fecundación (%) 100 c 50 d 100 90 No. de embriones viables/CL 0,30±0,2 0,20±0,2 0,12±0,1 a 0,50±0,2 b Tasa de viabilidad (%) 100 a, c 37,5 d 25 b 65 a Tasa de desarrollo in vitro (%) 80 100 75 87,5 Tasa de gestación (%)* 50,0 (3/6) 33,3 (2/6) 16,6 (1/6) a 66,6 (4/6) b Diferentes superíndices (a, b) en la misma fila indican diferencias significativas (P<0.05). Diferentes superíndices (c, d) en la misma fila indican diferencias significativas (P<0.1). *Porcentaje de ovejas con embriones viables en el Día 5 tras el celo. 92 3.5. Efecto de los tratamientos sobre la población de oocitos como fuente de embriones in vitro No hubo efecto del nivel nutricional ni del tratamiento con melatonina sobre el número de oocitos recuperados; tampoco se observaron diferencias sobre la tasa de oocitos aptos para MIV ni sobre la tasa de blastocistos (Tabla 6). Sin embargo, en las ovejas que consumieron la dieta control hubo una tendencia a aumentar el número de embriones divididos (C: 8,1±0,9 vs. B: 5,4±0,9; P=0,09) y, en consecuencia, también se observó una tendencia a un mayor número de blastocistos obtenidos tras el cultivo in vitro (C: 3,5±0,7 vs. B: 1,1±0,7; P=0,09). En las ovejas subnutridas, se observó un efecto positivo de los implantes de melatonina sobre el número de embriones divididos (Tabla 7, P<0,05). Tabla 7. Producción in vitro de embriones con ovarios recogidos de ovejas raza Rasa Aragonesa con 45 días de periodo post-parto, alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto (70 d antes de la recuperación de los embriones) durante la estación reproductiva (medias ± S.E.) Todos los valores están expresados por oveja, CL=cuerpo lúteo. Superíndices (a, b) en la misma fila indican diferencias significativas de P<0,05 y superíndices (c, d) indican P<0,1. C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL No. de ovejas con CL funcional 6 6 6 6 Tasa de ovulación 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,3 1,50 ± 0,3 2,0 ± 0,3 No. de oocitos recuperados 25,3 ± 5,5 25,5 ± 5,5 21,2 ± 5,4 27,3 ± 5,4 No. de oocitos aptos para MIV 15,8 ± 3,4 13,5 ± 3,4 14,3 ± 3,4 15,0 ± 3,4 Tasa de oocitos aptos (%) 62,5 52,9 67,5 54,9 No. de oocitos no-aptos para MIV 9,5 ± 2,8 12,0 ± 2,8 6,8 ± 2,8 12,3 ± 2,8 No. de embriones divididos 8,2 ± 1,3 c 8,0 ± 1,3 c 3,9 ± 1,3 d 6,8 ± 1,3 c Tasa de división (%) 51,9 59,3 27,3 45,3 No. de blastocistos 3,6 ± 1,0 3,3 ± 1,0 1,5 ± 1,0 1,1 ± 1,0 Tasa de blastocistos (%) 43,9 41,3 38,5 16,2 93 3.6. Efecto de los tratamientos sobre la expresión de los receptores esteroideos (RP y REα) en el endometrio No se observaron efectos de los tratamientos de nutrición y de melatonina, así como tampoco de la interacción entre ellos sobre el porcentaje de células positivas para REα. Tampoco hubo efecto de la nutrición sobre el porcentaje de células positivas a RP. Sin embargo, el tratamiento con melatonina aumentó el porcentaje de células positivas a RP en el epitelio glandular profundo, independientemente del nivel nutricional (P=0,1). No se observaron efectos de la nutrición o de la melatonina sobre la intensidad de tinción de RP o REα. Para RP, se observó una interacción entre la nutrición y la melatonina mostró efectos solamente en el epitelio glandular profundo (P<0,05). Así las ovejas subnutridas implantadas con melatonina experimentaron una mayor intensidad de PR en EGp que las ovejas subnutridas sin implantar, mientras que no se observaron cambios en los grupos control (Figura 17). En cambio, se observó que la melatonina aumentó la expresión de REα en el estroma superficial del grupo control (P<0,01), mientras que las ovejas subnutridas implantadas tendieron a disminuir la expresión del mismo en el estroma profundo respecto a las subnutridas sin implantar (P<0,01). 94 Figura 17. Intensidad de tinción de RP (arriba) y REα (abajo) en el endometrio de ovejas raza Rasa Aragonesa con 45 días de periodo post-parto, alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto, durante la estación reproductiva. Dentro de cada tipo celular, letras diferentes indican P<0,01 (a, b) y P=0.1 (r, s). 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL (RP) r s 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad (REα) a b b a b 95 96 EXPERIMENTO 4. Ovejas post-parto, Anoestro estacional (Artículo III). 4.1. Efecto de los tratamientos sobre el peso vivo y condición corporal Todos los grupos presentaron una pérdida significativa de PV durante el intervalo parto-inicio del tratamiento nutricional (Figura 18a), aunque durante el período de consumo de las dietas experimentales (20 días después del destete) los grupos C-MEL y C+MEL mantuvieron los PV mientras que los grupos B-MEL y B+MEL experimentaron una pérdida significativa de 4,2 y 6,0 kg de PV, respectivamente (P<0,01). Las CC no presentaron diferencias significativas entre grupos durante todo el período experimental (Figura 18b). 4.2. Efecto de los tratamientos sobre los perfiles hormonales 4.2.1. Melatonina El día 45 posterior a la colocación de los implantes, todas las ovejas implantadas con melatonina presentaron altos niveles plasmáticos de la hormna pineal durante las horas del día (abril: 81,0 ± 14,9 pg/ml), lo cual indicó que los implantes liberaron la hormona de manera apropiada. Dieta Lactancia c/1 cordero Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 60 - 15 0 5 D í as desde el momento del celo Dieta Lactancia c/1 cordero Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 60 - 15 0 5 Dieta Lactancia c/1 cordero Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 60 - 15 0 5 Dieta Lactancia c/1 cordero Dieta Experimental Dieta Lactancia c/1 cordero Dieta Experimental 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M + MEL (C+MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 1,5 M sin MEL (C - MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M + MEL (C+MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) 0,5 M sin MEL (B - MEL) - 60 - 15 0 5 - 60 - 15 0 5 D í as desde el momento del celo 97 Figura 18. Medias (± S.E.) de peso vivo (a) y de CC (b) en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas durante 45 días de periodo post-parto con una dieta lactancia para un solo cordero, y tras el destete alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto, durante el anoestro. Letras diferentes (a, b) entre grupos que consumieron dietas C y B indican P<0,01. 40 45 50 55 60 65 70 -70 -63 -56 -49 -42 -35 -28 -21 -14 -7 0 7 14 21 Peso vivo (kg) Intervalo parto-destete a a b b * (a) 2 2.5 3 3.5 4 -70 -63 -56 -49 -42 -35 -28 -21 -14 -7 0 7 14 21 Días desde el inicio del tratamiento nutricional Condición corporal C-MEL C+MEL L-MEL L+MEL * (b) 98 0 1 2 3 4 5 6 -1 0 1 2 3 4 5 Dias desde el momento del celo P4 (ng/ml) C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL * 4.2.2. Progesterona Los niveles de P4 aumentaron gradualmente desde el momento del celo hasta el día del sacrificio en todas las ovejas, indicando que todas ellas exhibían un CL funcional. En la Figura 19 se observa que las concentraciones plasmáticas de P4 el día del sacrificio para cada grupo fueron de: 2,6±0,5 ng/ml (C-MEL); 2,8±0,3 ng/ml (C+MEL), 3,02±0,5 ng/ml (B-MEL) y 4,1±0,7 ng/ml (B+MEL). Aunque no hubo diferencias significativas entre grupos, se observó una tendencia a que las ovejas que consumieron la dieta B presentaran niveles mayores de P4 que aquéllas que consumieron la dieta C en el día 5 tras el celo (B: 3,6±0,3 vs. C: 2,7±0,4 ng/ml; P<0,1). Además también se observó que las ovejas implantadas con melatonina (+MEL) tuvieron mayores niveles de P4 que aquellas ovejas sin implantar (+MEL: 3,5±0,3 vs. – MEL: 2,8±0,4 ng/ml; P<0,1). Figura 19. Concentraciones plasmáticas medias (± S.E.) de progesterona (P4) desde el día del retiro del progestágeno hasta el día del sacrificio (día 5 tras el celo), en ovejas raza Rasa Aragonesa alimentadas durante 45 días de periodo post-parto con una dieta lactancia para un solo cordero, y tras el destete alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto, durante el anoestro. (Día 0=celo). El asterisco indica P<0,05 entre grupos BMEL y B+MEL, así como también entre C+MEL y B+MEL. 105 Figura 21. Intensidad de tinción de RP (arriba) y REα (abajo) en el endometrio de ovejas raza Rasa Aragonesa con 45 días de periodo post-parto, alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto, durante la estación reproductiva. Dentro de cada tipo celular, letras diferentes indican P<0,01 (a, b, c, d) y P=0.1 (r, s). 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad C-MEL C+MEL B-MEL B+MEL (RP) a b a a b r a,s b a b c d 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 EL Es Ep EG s EG p Intensidad (REα) r s a b b a 106 Tabla 10. Efectos de la estación del año sobre las principales variables estudiadas en los experimentos 3 y 4 con ovejas raza Rasa Aragonesa con 45 días de periodo post-parto, alimentadas con una dieta 1,5 M (C) o 0,5 M (B) veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con melatonina exógena en el momento del parto. ESTACIÓN NUTRICIÓN MELATONINA INTERACCIÓN (A) PESO VIVO ** ** ns ns CC ns * ns ns Metabolitos GLUCOSA ** ** * ** AGNE ** ** ns ns BHB ** P<0,1 ns ** PROGESTERONA * ns ns P<0,1 Parámetros de la recuperación de embriones in vivo TASA DE OVULACIÓN ns ns ns ns No. DE EMBRIONES TOTALES ns P=0,08 P=0,09 ns TASA DE FECUNDACIÓN ns P<0,1 ns P=0,09 (estac x mel) No. DE EMBRIONES VIABLES ns ns ** ns TASA DE VIABILIDAD ns ns ns ** (nut x mel) TASA DE PREÑEZ (a día 5 tras el celo) ns ns ** P<0,1 (nut x mel) Parámetros de la producción in vitro de embriones No. OOCITOS RECUPERADOS ns ns ns ns No. OOCITOS APTOS PARA MIV ns ns ns ns No. EMBRIONES DIVIDIDOS P=0,09 ns ns ns TASA DE DIVISIÓN * ns ns ns No. DE BLASTOCISTOS ns ns ns ns TASA DE BLASTOCISTOS P<0,1 ns ns ns Receptores de hormonas esteroideas Receptor de Progesterona (RP) ** ns ns (A) P<0,1 y (B) es ** Receptor de Estrógenos (REα) ** ns ns (A) ns y (B) es ** Referencias, (**) indica P< 0,01 y (*) indica P<0,05. (A)=Interacción se consideró como la intervención de los tres efecto fijos (estación, nutrición y melatonina), excepto en las aclaraciones que figuran en la tabla. (B)= Interacción entre los sgtes. efectos estación, nutrición, melatonina, tipo y ubicación celular. 107 DISCUSIÓN La presente tesis investigó los efectos de la melatonina exógena tanto sobre la competencia oocitaria y la viabilidad embrionaria en situaciones de subnutrición en la oveja, evaluando ambas in vivo e in vitro, como también el efecto sobre la población de receptores esteroideos en el endometrio, durante la estación reproductiva y el anoestro estacional y sobre hembras en diferentes estados fisiológicos (vacías y a los 45 días post-parto). Efectos sobre el PV, la CC y la secreción de metabolitos En los 4 experimentos realizados, las ovejas subnutridas mostraron una disminución significativa en el PV y la CC durante el periodo en el que se les ofrecieron las dietas experimentales. Aunque las pérdidas de PV y CC no fueron similares en los diferentes experimentos, se asumió que el tratamiento nutricional para los grupos subnutridos fue efectivo dado que en todos los ensayos el PV final fueron menor al inicial, observándose por lo tanto diferencias significativas en los PV de las ovejas de los grupos B y C en el momento del sacrificio. Además, se observó que las ovejas subnutridas, tanto las vacías como las post-parto, exhibieron un incremento en su actividad lipolítica durante ambas estaciones, evidenciado por un incremento de los niveles de AGNE paralelo al descenso de PV. Sin embargo, en las ovejas vacías del grupo B-MEL este incremento no se constató durante el anoestro. El perfil de secreción de BHB aunque estuvo influenciado por el nivel nutricional de la dieta en todos los experimentos, no mostró diferencias tan evidentes entre ovejas de los grupos B y C como lo hicieron los niveles de AGNE. Clarke (2001) observó una regulación estacional 108 del consumo de alimento en ovejas, describiendo un aumento del consumo voluntario de alimento durante condiciones de días largos, lo que podría explicar las diferencias en el comportamiento del PV encontradas en ambas estaciones. En estudios previos desarrollados en la misma raza, se observó que periodos de 3-4 semanas de subnutrición con niveles semejantes a los del presente trabajo indujeron una reducción significativa en el PV y la CC de las ovejas Rasa Aragonesa durante la estación reproductiva y durante el anoestro (Abecia et al., 1997, 1999; Sosa et al., 2008). En todos los experimentos se observó que las ovejas subnutridas presentaron una concentración plasmática de glucosa significativamente inferior respecto a las ovejas control. Sin embargo, se observó un pico en los niveles de glucosa que coincidió con el muestreo del día previo a la aparición del celo, siendo más pronunciado en las ovejas vacías que en las ovejas post-parto y a su vez en los grupos control respecto de los subnutridos. Resultados previos en nuestro laboratorio han evidenciado unos patrones de secreción de glucosa y AGNE similares a los del presente estudio, observándose además el mismo incremento puntual en los perfiles de insulina e IGF-I (Sosa et al., 2006). Parece probable que dichos incrementos puedan deberse a una respuesta frente al posible estrés inducido por las prácticas de manejo inherentes a la detección de los celos (retiro de esponjas, introducción de machos, aumento del número de personas en contacto con los animales), que podría provocar una liberación refleja de insulina y glucagón, así como también una resistencia periférica a la insulina, reduciendo la incorporación de glucosa a las células (Elsasser et al, 2000). Sin embargo, otra posible explicación fisiológica podría asociarse al incremento notable de las necesidades de glucosa a nivel hipofisiario durante la fase folicular del ciclo estral, siendo entonces necesaria para aumentar las concentraciones basales de LH en respuesta al aumento de 109 los niveles de estradiol producidos por el folículo dominante (retroacción positiva), a fin de lograr el pico preovulatorio de LH y en consecuencia, la ovulación (I’Anson et al., 1991). Efectos sobre la ovulación y la secreción de P4 Los resultados del presente estudio parecen avalar las observaciones de que tratamientos de subnutrición a corto plazo asociados a la utilización de progestágenos en los protocolos de inducción/sincronización de celos, no parecen influir en la tasa de ovulación durante la estación reproductiva o el anestro (Abecia et al., 1997, 1999; Borowczyk et al., 2006; Sosa et al., 2006). Además, tampoco se observaron diferencias significativas entre grupos sobre la tasa ovulatoria en los experimentos con ovejas paridas, lo que podría deberse a que las dietas suministradas durante el periodo de lactancia lograron mantener el peso vivo desde el momento del parto hasta el destete en casi todos los grupos experimentales, principalmente en las ovejas paridas en anoestro. Al respecto, Abecia et al. (1993) demostraron que en ovejas Rasa Aragonesa destetadas en primavera existe una alta correlación positiva y significativa entre el peso al momento del destete y la tasa de ovulación. Sin embargo, estos autores evidenciaron una correlación negativa entre las pérdidas de peso desde el parto hasta el destete y la tasa de ovulación, indicando que a menores pérdidas de peso vivo en dicho intervalo parto-destete, mayor era la tasa de ovulación observada tras el primer celo detectado una vez destetados los animales. Respecto a la secreción de P4, es consistente en la literatura el hallazgo de que las ovejas subnutridas presentan mayores concentraciones de dicha hormona que las ovejas controles entre los días 10 y 14 del ciclo sexual (Rhind et al., 1989c; Lozano et al., 1998; O’Callaghan et al., 2000; Sosa et al., 2006). No obstante, en nuestros 110 experimentos no encontramos diferencias en la secreción de P4 el día 5 tras el celo en función del tratamiento nutricional aplicado, exceptuando los resultados del experimento 4 (ovejas post-parto y en anoestro estacional), que mostraron una tendencia a que las ovejas subnutridas presentaran mayores niveles de P4 respecto a aquéllas con la dieta control. Es evidente que hasta el día 5 el CL está iniciando su secreción de P4, con lo que los factores que hacen que existan diferencias en sus niveles plasmáticos en momentos más avanzados de la fase luteal (a partir del día 10) todavía no han ejercido su influencia, sino mas bien se encuentran consolidando la secreción (y su metabolización) de P4. Efectos sobre los embriones recuperados in vivo Un hallazgo inesperado del presente estudio por sus diferencias estacionales en las ovejas vacías, ha sido la reducida viabilidad embrionaria encontrada el día 5 tras el celo en las ovejas subnutridas implantadas con melatonina durante la estación reproductiva, no sucediendo lo mismo durante el anoestro, donde dicha hormona pareció mejorar las tasas de fecundación y de viabilidad embrionaria en dichos animales. No hubo efecto de la estación sobre el número de embriones viables ni sobre la tasa de viabilidad en los diferentes grupos de ovejas vacías. Durante el anoestro e independientemente del nivel nutricional, se observaron menores tasas de fecundación y de viabilidad en las ovejas que no recibieron implantes de melatonina. Diferentes estudios han mostrado que la suplementación con melatonina durante el anoestro no mejora la tasa de fertilidad de los embriones recuperados en ovejas superovuladas (McEvoy et al., 1998; Forcada et al., 2006) o procedentes de oocitos recuperados en ovejas superovuladas y procesados por FIV (Luther et al., 2005). A su vez, resultados previos de nuestro equipo de trabajo han demostrado que la suplementación con 111 melatonina reduce significativamente el número y la tasa de embriones no viables (degenerados y retardados) en ovejas superovuladas durante el anoestro (Forcada et al., 2006). Aunque el tratamiento nutricional no tuvo un efecto significativo sobre la mayoría de los parámetros estudiados en las ovejas post-parto, la melatonina exógena mejoró significativamente la viabilidad in vivo de los embriones recuperados en las ovejas subnutridas el día 5 tras el celo, en ambas estaciones. Además, independientemente del nivel nutricional, las tasas de gestación fueron significativamente mayores en las ovejas implantadas con melatonina que en las no implantadas, si bien en la estación reproductiva este efecto benéfico de la melatonina sólo se observó en las ovejas subnutridas. Los mecanismos involucrados en la mejora de la viabilidad embrionaria por la melatonina no son totalmente conocidos, si bien podrían ser explicados en parte por el efecto luteotrófico de la hormona pineal, observado tanto in vivo (Durotoye et al., 1997) como in vitro (Abecia et al., 2002), así como por sus efectos a nivel del eje hipotálamohipofisiario ya descriptos hace años (Malpaux et al., 1997), y también por sus propiedades antioxidantes y de captación de radicales libres (Chetsawang et al., 2006). En nuestros resultados en las ovejas post-parto, hemos encontrado una evidencia adicional del efecto luteotrófico de la melatonina, ya que las hembras implantadas exhibieron niveles plasmáticos de P4 mayores a los de aquéllas no implantadas, tanto durante el anoestro como en la estación reproductiva. Este hecho podría por tanto haber influido en la mejora de las tasas de viabilidad y de gestación encontradas en los grupos implantados. Sin embargo, esta manifestación del efecto luteotrófico de la melatonina no pudo ser evidenciada en las ovejas vacías de nuestros experimentos 1 y 2, ya que no encontramos diferencias significativas entre grupos ni entre estaciones del año en los 112 niveles de P4 el día 5 tras el celo. En conjunto y teniendo en cuenta los resultados del presente estudio, se puede sugerir que los efectos de la melatonina exógena sobre la viabilidad embrionaria podrían ser debidos a diferentes mecanismos en función del estado fisiológico en que se encuentre la oveja. Efectos sobre la producción in vitro de embriones Aunque la melatonina exógena no tuvo efecto significativo en la mayoría de los parámetros in vitro evaluados en nuestros experimentos con ovejas vacías, el tratamiento con esta hormona durante el anoestro mejoró significativamente la tasa de fecundación de los oocitos procedentes de las ovejas subnutridas, así como la tasa de blastocistos obtenida, en este caso independientemente del nivel de nutrición. Por el contrario, en nuestros experimentos con ovejas post-parto se observó que la melatonina exógena tuvo un efecto positivo sobre la competencia de los oocitos de las ovejas subnutridas únicamente durante la estación reproductiva, mejorando la división y el desarrollo in vitro de los embriones; por el contrario, no se observó efecto alguno de la hormona pineal sobre los parámetros evaluados in vitro durante el anoestro estacional. Algunos estudios tampoco han encontrado efectos positivos de la melatonina sobre el número de folículos visibles o sobre el número de oocitos recuperados de ovejas (Luther et al., 2005) y cabras (Berlinguer et al., 2007) superovuladas con FSH durante el anoestro, lo cierto es que los tratamientos con melatonina exógena durante el anoestro parecen mejorar la competencia para el desarrollo in vitro de oocitos obtenidos de ovejas sincronizadas con progestágenos y gonadotropina coriónica equina (Valasi et al., 2006), así como las tasas de divididos y de blastocistos obtenidas por FIV en cabras (Berlinguer et al., 2007). El anoestro es un periodo de presentación de pulsos de LH de baja frecuencia, 113 mientras que durante la estación reproductiva la frecuencia y amplitud de los pulsos de LH es la adecuada para controlar la presentación y sucesión de las fases luteal y folicular del ciclo estral (Goodman, 1988). Por su parte, Oussaid et al. (1999) demostró que una supresión temporal de la descarga de LH durante la fase folicular perjudicaba la competencia de los oocitos en ovejas cíclicas. Además, el anoestro post-parto es un periodo caracterizado por una baja frecuencia de los pulsos de la LH (Goodman, 1988). Por lo tanto y en conjunto, nuestros resultados in vitro principalmente en las ovejas vacías, son coherentes con lo anteriormente mencionado en el sentido de que el anoestro tuvo un efecto negativo sobre el número de oocitos recuperados por oveja, la competencia de los mismos y las tasas de fecundación. Del mismo modo, Stenback et al. (2001) señalaron que los oocitos procedentes de ovejas superovuladas tuvieron una mejor respuesta a la fecundación in vitro durante la estación reproductiva que durante el anoestro. No obstante, en el presente estudio estas diferencias estacionales no fueron tan evidentes en las ovejas post-parto como en las ovejas vacías. Además, se ha observado que la estación influye en la tasa de fecundación in vivo, y algunos autores han demostrado la existencia de una mayor proporción de oocitos no fecundados y/o degenerados en ovejas superovuladas e inseminadas durante el periodo de anoestro, así como también que un mayor número de folículos pequeños fueron inducidos a ovular en dicha estación, la mayoría de los cuales contenían oocitos inmaduros al momento de la ovulación (Mitchell et al., 2002; Gónzalez-Bulnes et al., 2003), comprometiendo por tanto la fecundación o el desarrollo posterior. Estas diferencias se podrían atribuir, al menos en parte, a cambios estacionales en la calidad del semen; sin embargo, se han observado pocos cambios en el volumen o calidad del semen procedente de eyaculados de machos Rasa Aragonesa a lo largo del año (Martí et al., 2007), lo que sugiere que la mayor tasa de fertilidad durante la estación reproductiva podría deberse principalmente 114 a una mayor competencia del oocito en el momento de la ovulación. Efectos sobre los receptores esteroideos en el endometrio En general, en nuestros experimentos tanto en las ovejas vacías como en las ovejas en post-parto, no se observaron diferencias en la expresión de ambos receptores esteroideos con respecto al tratamiento nutricional. Esto está en desacuerdo con el trabajo de Sosa et al. (2004) donde se encontró en el día 5 tras el celo una disminución en la expresión de RP y ningún cambio de REα en la mayoría de los tipos celulares evaluados en las ovejas subnutridas. Sin embargo, los mismos autores en un trabajo posterior (Sosa et al., 2006) tampoco encontraron diferencias en la expresión de RP y REα debidas al tratamiento nutricional, de manera similar a lo observado en nuestros experimentos. A pesar de que la subnutrición a la que se sometió a los animales es muy similar entre los diferentes experimentos, las diferencias encontradas entre estudios podrían explicarse en base a las diferentes CC alcanzadas por los animales. Por otro lado, no puede descartarse que en nuestros experimentos existan efectos que la subnutrición pudiera ejercer a otro nivel, como por ejemplo a nivel del mRNA o de su capacidad de unión. Según nuestro conocimiento y hasta el momento de la realización de la presente tesis, no existe en la literatura otro trabajo que haga referencia a los efectos de la melatonina exógena sobre la expresión de los receptores esteroideos en el endometrio ovino y mucho menos sobre los efectos de su interacción con la nutrición. Tampoco se han encontrado trabajos en otras especies con las que poder comparar nuestras observaciones. En general, observando sólo las ovejas controles, la melatonina no tuvo efecto sobre la expresión de RP o REα, excepto por un aumento en la expresión de ambos receptores en las glándulas profundas de las ovejas en post-parto durante el 121 BIBLIOGRAFÍA Abecia, J.A., Forcada, F., Zarazaga, L. (1993). Variación del peso vivo durante La lactación: efecto sobre la reactivación cíclica y ováricaen ovejas paridas en anoestro estacionario. ITEA 89A, 78-89. Abecia, J.A., Rhind, S.M., Bramley, T.A., McMillen, S.R. (1995). Steroid production and LH receptor concentrations of ovarian follicles and corpora lutea and associated rates of ova wastage in ewes given high and low levels of food intake before and after mating. Animal Science 61, 57-62. Abecia, J.A., Rhind, S.M., Goddard, P.J., Mcmillen, S.R., Ahmadi, S., Elston, D.A. (1996). 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For each ewe, the following variables were recorded: number of corpora lutea, number of recovered ova (oocytes + embryos), recovery rate (number of ova recovered/number of corpora lutea), number of fertilized embryos, number of viable embryos (as compacted morulae), and number of viable embryos after 48 h in culture (as expanded and hatched blastocysts). Fertilization rate was the number of embryos divided by the number of ova recovered. Viability rate was the number of viable embryos divided by the number of ova recovered. Ewes that did not provide recovered ova were excluded from the calculations of fertilization and viability rates. 2.4. Hormone assays Plasma melatonin concentrations were measured by a direct, solid-phase radioimmunoassay (RIA) using a commercially available kit (B¨ uhlmann RK-MDI; B¨ uhlmann Lab; Switzerland), within a single assay. The sensitivity of the assay was 1.3 pg/mL and the intra-assay CV was 10.9% for low control concentrations (3.3 pg/mL) and 4.9% for high control concentrations (20.6 pg/mL). Plasma progesterone concentrations were measured by a direct, solid-phase RIA using commercially available kits (Count-A-Count TKPG; DPC) (Meikle et al., 1997). The RIA had a sensitivity of 0.02 ng/mL. The intra-assay CV was 14% for low control concentrations (3 ng/mL), 8.5% for medium concentrations (15 ng/mL), and 7.5% for high concentrations (30 ng/mL). The interassay CV was <15% for all of the standard concentrations. 2.5. Statistical analyses The experimental was based on a 2 ×2×2 factorial design, with nutritional level, melatonin treatment, and season as fixed effects. The effects of the treatments on the development and quality of oocytes and embryos were evaluated using the PROC GEN MOD (Statistical Analysis System; SAS Institute, Cary, NC, USA) with the Poisson distribution specified in a model that included Season (reproductive or anestrus), Nutrition Level (low or control), and Melatonin Treatment (with or without melatonin implant) and their interactions. The values expressed as percentages were arcsine-transformed before being subjected to statistical analyses. The probability level for statistical significance was set to P< 0.05 and the results are expressed as mean ±S.E.M. 3. Results 3.1. Live weight and body condition In the RS, the LW of the ewes in the L and L+MEL groups dropped significantly (from 61.8 ±3.5 to 54.3 ±3.2 kg and 64.1 ±2.8 to 54.8 ±2.5 kg, respectively; P< 0.001), but not those in the C and C+MEL groups (from 63.8 ±3.7 to 64.6 ±3.6 kg and 64.7 ±3.7 to 64.4 ±3.5 kg, respectively). Ewes in the L and L+MEL groups experienced a significant reduction in BC (from 2.8 ±0.1 to 2.5 ±0.1 and from 3.0 ±0.1 to 2.5 ±0.1, respectively; P< 0.001), but ewes in the C and C+MEL groups did not (2.9 ±0.1 to 3.0 ±0.1 and 2.9 ±0.2 to 2.8 ±0.1, respectively). In the AS, ewes in the C and C+MEL groups maintained their LW (from 62.5 ±2.4 to 63.5 ±2.2 kg and 54.6 ±0.9 to 53.3 ±0.9 kg, respectively) and BC (from 3.0 ±0.6 to 3.0 ±0.7 88 M.I. V´azquez et al. / Animal Reproduction Science 112 (2009) 83–94 and from 2.9 ±0.1 to 2.9 ±0.1, respectively); but those in the L and L+MEL groups experienced a significant reduction in LW (from 54.6 ±3.2 to 52.8 ±3.2 kg and 56.6 ±2.2 to 51.8 ±1.9 kg, respectively; P< 0.001) and BC (from 2.9 ±0.1 to 3.0 ±0.1 and from 2.75 ±0.06 to 2.8 ±0.1, respectively). In the RS and AS, after pessary withdrawal (14 d after the onset of nutritional treatments), the LW and BC of ewes in the L group were significantly lower than were those of the control ewes (P< 0.01). 3.2. Circulating hormones In both seasons, when measured during daylight on Day 45, the concentrations of plasma melatonin in all of the ewes that received a melatonin implant were high, which confirmed that the implants functioned properly (mean ±S.E.M.): 53.6 ±4.2 and 62.6 ±4.9 pg/ml in January and May, respectively. In both seasons and all of the groups, progesterone concentrations increased gradually after estrus. In the RS, nutrition level and supplemental melatonin did not have a significant effect on plasma progesterone concentrations at estrus, at Day 3, and at slaughter (Day 5). Plasma progesterone concentrations on Day 5 were 3.7 ±0.5 ng/mL (C), 3.8 ±0.5 ng/mL (C+MEL), 4.7 ±0.7 ng/mL (L), and 4.0 ±0.8 ng/mL (L+MEL). In the AS, the interaction effect of melatonin ×nutrition on plasma progesterone concentrations at estrus presented a trend to significance (C: 0.30 ±0.09 ng/mL, C+MEL: 0.11 ±0.09 ng/mL, L: 0.19 ±0.11 ng/mL, L+MEL: 0.35 ±0.11 ng/mL; P< 0.09), but nutrition or melatonin treatments had no significant effects on plasma concentrations on Day 3 and at slaughter (Day 5). On Day 5, mean plasma progesterone concentrations were 3.6 ±0.5 ng/mL (C), 3.8 ±0.5 ng/mL (C+MEL), 2.6 ±0.6 ng/mL (L), and 3.4 ±0.6 ng/mL (L+MEL). 3.3. Ovulation rate Ovulation rates did not differ among groups or between seasons (Tables 1 and 2). 3.4. Embryo recovery 3.4.1. Reproductive season Nutrition level had a significant effect on the number of viable embryos (1.1 ±0.2 vs. 0.6 ±0.2 in C and L ewes, respectively; P< 0.05), and undernutrition reduced the number of viable embryos in ewes treated with melatonin (P< 0.05) (Table 1). Melatonin treatment had a detrimental effect on fertilization rate (P< 0.05) and, consequently, the numbers of fertilized and viable embryos were consistently lower in the undernourished, melatonin-implanted group ewes than they were in the other groups. Ewes in the L+MEL group exhibited the lowest in vitro viability (40.0%), and differed significantly from the ewes in the C and C+MEL groups (77.8% and 80.0%, respectively; P< 0.05) and, to a lesser extent, from the ewes in the L group (66.7%; P= 0.07). 3.4.2. Anestrous season Only one ewe in the L+MEL group did not exhibit estrous behaviour after pessary withdrawal. Two of the ewes in group L (n= 5) and two in group L+MEL (n= 6) were excluded from the analysis of the AS because they did not exhibit normal corpora lutea at slaughter. On Day 5 after estrus, the groups did not differ significantly in the number of fertilized and viable embryos, M.I. V´azquez et al. / Animal Reproduction Science 112 (2009) 83–94 89 Table 1 Ovarian response and embryo production in the reproductive season by Rasa Aragonesa ewes fed either 1.5 (C) or 0.5 (L) times the maintenance requirements and treated (MEL) or not treated with melatonin 62 d before embryo recovery GROUP C C+MEL L L+MEL No. of ewes 10 11 11 10 No. of ewes in estrus 8/10 9/11 9/11 9/10 Ovulation rate 1.9 ±0.4 2.2 ±0.3 2.2 ±0.4 1.8 ±0.4 No. of recovered ova 1.1 ±0.3 1.7 ±0.3 1.1 ±0.2 0.9 ±0.4 Recovery rate (%) 60 75 50 50 No. of fertilized embryos 1.1 ±0.3c1.3 ±0.3c1.1 ±0.3c0.5 ±0.3d Fertilization rate (%) 100a87.5 ±9.5b100a70 ±12b No. of viable embryos 1 ±0.3a1.2 ±0.3a0.9 ±0.3a0.2 ±0.3 b Viability rate (%) 83.3 ±17c81.3 ±15.6c75 ±15.6c40 ±19.8d Pregnancy rate (%)a75 (6/8) 77.7 (7/9) 88.8 (8/9) 44.4 (4/9) Different superscript letters (a, b) in the same row indicate significant differences (P< 0.05). Different superscript letters (c, d) in the same row indicate differences of P< 0.1. Ova = oocytes + embryos. aPercentage of ewes with viable embryos on Day 5. which indicates that undernutrition and supplemental melatonin did not have a significant effect on these parameters in the AS (Table 2). Supplemental melatonin and undernutrition did not have a significant effect on the in vitro viability of recovered embryos in the AS; thus, the percentages of embryos that were capable of developing into expanded or hatched blastocysts were 87.5% (C), 83.3% (C+MEL and L), and 88.9% (L+MEL). The interaction between season ×melatonin treatments had a significant effect on fertilization rate (P< 0.05), and tended to have an effect on embryo viability (P< 0.08). In general, unlike in the RS, melatonin had a positive effect on fertilization rate and embryo viability in the AS (Table 2). In the RS, the effect of this interaction was particularly pronounced among the undernourished ewes, in which supplemental melatonin significantly (P< 0.05) impaired the number of viable Table 2 Ovarian response and embryo production in the anestrous season by Rasa Aragonesa ewes fed either 1.5 (C) or 0.5 (L) times the maintenance requirements and treated (MEL) or not treated with melatonin 62 d before embryo recovery GROUP C C+MEL L L+MEL No. of ewes 8 7 5 6 No. of ewes in estrus 8/8 7/7 5/5 5/6 Ovulation rate 2.4 ±0.4 2.1 ±0.3 2.0 ±0.6 1.8 ±0.2 No. of recovered ova 1.0 ±0.3 1.6 ±0.3 1.2 ±0.4 1.4 ±0.4 Recovery rate (%) 42a73.3b60b78b No. of fertilized embryos 0.6 ±0.3c1.3 ±0.3d0.8 ±0.4c1.2 ±0.4d Fertilization rate (%) 66.7 ±18 83.3 ±18 75 ±22 87.5 ±22 No. of viable embryos 0.6 ±0.3c1.1 ±0.3d0.8 ±0.4c1.2 ±0.4d Viability rate (%) 66.7 ±18.1 75 ±18.1 75 ±22.2 87.5 ±22.2 Pregnancy rate (%)a50 (4/8) 71.4 (5/7) 60 (3/5) 80 (4/5) Different superscript letters (a, b) in the same row indicate significant differences (P< 0.05). Different superscripts letters (c, d) in the same row indicate differences of P< 0.1. Ova = oocytes + embryos. aPercentage of ewes with viable embryos on Day 5. 90 M.I. V´azquez et al. / Animal Reproduction Science 112 (2009) 83–94 Fig. 2. Number of viable embryos per corpus luteum (CL) in the reproductive season (left panel) and the anestrous season (right panel) in Rasa Aragonesa ewes fed either 1.5 (C) or 0.5 (L) times the LW maintenance requirements and treated (MEL) or not treated with melatonin 62 d before embryo recovery. Mean ±S.E.M. Within the same panel, bars that have different superscripts are significantly different (P≤0.05). embryos, whereas, in the AS, embryo viability tended (P< 0.1) to improve. The mean number of viable embryos per functional corpus luteum in each group is shown in Fig. 2. 4. Discussion This study investigated the effects of exogenous melatonin and level of nutrition on embryo viability in Rasa Aragonesa ewes in the anestrous and the reproductive seasons in northern Spain. We hypothesized that the known beneficial effects of exogenous melatonin on embryo survival would override the negative effects of undernutrition at any time of year; however, in this study, the effects of melatonin implants on embryo development differed between the reproductive or anestrous seasons. In our experiments, nutritional restrictions reduced significantly the mean live weights and body condition of ewes. Although the rate of live weight decrease of undernourished ewes were not similar in both seasons, the effectiveness of the nutritional treatments can be assumed because of the significant differences observed between C and L live weight at slaughter time (P< 0.01). Several factors could explain this situation, such as nutritional status of the ewes before the onset of the experiment, metabolic and hormonal factors interacting with season, nutrition and reproduction, environment factors and others. In addition, Clarke (2001) observed a seasonal regulation of food intake in sheep, observing an increment of voluntary food intake under long-day conditions, which in turn, could provoke live weight differences. Our previous studies (Abecia et al., 1997, 1999; Sosa et al., 2006) demonstrated that mature ewes subjected to a degree of undernutrition similar to that of the present experiment for 3–4 weeks exhibited a significant reduction in LW and BC. In addition, underfed ewes exhibited an increase in lipolytic activity (Sosa et al., 2006). However, such short-term undernutrition associated with a progestagen-synchronized estrus does not appear to impair ovulation rate in the reproductive season (Abecia et al., 1997, 1999; Borowczyk et al., 2006) or the anestrous season (Sosa et al., 2006). It was unexpected that undernutrition impaired embryo viability on Day 5 after the onset of estrus in melatonin-implanted ewes in the reproductive season, but not in the anestrous season, when the melatonin treatment seemed to improve embryo fertilization and viability. Season did not have a significant effect on the number of viable embryos or viability rate. Regardless of the level of nutrition, seasonal anestrus seemed to reduce the fertilization rate and viability rate of the ewes that did not receive melatonin implants. Seasonal differences might be due in part to differences in semen quality; however, low seasonal variations in the volume and quality of M.I. V´azquez et al. / Animal Reproduction Science 112 (2009) 83–94 91 the ejaculates from Rasa Aragonesa rams (Mart´ ı et al., 2007) suggest that the higher fertilization rate in the reproductive season might be mainly due to higher oocyte quality at the time of ovulation. Mitchell et al. (2002) reported a higher proportion of unfertilized or degenerated ova in the anestrous period following superovulatory treatments and artificial insemination, and a larger number of small follicles were induced to ovulate in April than in October, and most of them contained immature oocytes at the time of ovulation. In vitro fertilization rates of oocytes recovered from superovulating ewes can be lower in the anestrous season than in the reproductive season (Stenbak et al., 2001). The presence of a corpus luteum before gonadotrophin treatment is beneficial to embryo development (Gonzalez-Bulnes et al., 2002; Gonz´ alez-Bulnes et al., 2003), which might be due to the inability of progestagen protocols to suppress LH to the level achieved in the luteal phase (Kojima et al., 1992), thereby inducing inadequate follicular development that can lead to abnormalities in fertilization and embryo development. In our experiment, all of the ewes that were induced to ovulate in anestrus were non-cyclic at the time of sponge insertion. In our study, four undernourished ewes failed to exhibit functional corpora lutea after ovulation in the anestrous season. Undernutrition is associated with a low uterine expression of progesterone receptors on Day 5 after estrus in ewes (Sosa et al., 2004; Sosa et al., 2006). In addition, progesterone can modulate the endometrial PGF2␣secretion by down-regulating the concentration of oxytocin receptor and delaying the time of luteolysis (McCracken et al., 1999). Given that undernutrition during early embryo development in sheep increases uterine in vitro production of PGF2␣after an induced estrus (Abecia et al., 1999) or following superovulation (Lozano et al., 2003), undernutrition might lead to a poor uterine environment that compromises the development of embryos. Furthermore, undernutrition can influence earlier embryo development, by reducing oviductal sensitivity to ovarian steroids (Sosa et al., 2008) or by altering oocyte quality (Borowczyk et al., 2006). In the present experiments, melatonin implants had a significant detrimental effect on fertilization rate in the reproductive season, but not in the anestrous season. Elsewhere, studies have shown that supplemental melatonin in anestrus does not improve fertilization rate in terms of embryos recovered from superovulated ewes (McEvoy et al., 1998; Forcada et al., 2006a) or after IVF of oocytes recovered from superovulatory treatment (Luther et al., 2005). Although McEvoy et al. (1998) found that melatonin implants did not have a significant effect on embryo production and survival after superovulation during anestrus. Our recent studies have shown that supplemental melatonin can reduce significantly the number and rate of non-viable (degenerated and retarded) embryos in superovulated ewes during anestrus (Forcada et al., 2006a). The luteotrophic effect of the pineal hormone observed in vivo or in vitro (Durotoye et al., 1997; Abecia et al., 2002) and the effects of melatonin at the hypothalamic–hypophyseal level (Malpaux et al., 1997) might be involved in the melatonin-induced improvement in embryo viability during anestrus. In our study, it is unclear why melatonin implants had a detrimental effect on fertilization and viability rates in Rasa Aragonesa ewes in the reproductive season. In humans and rats, granulosa cells express specific melatonin binding sites (Yie et al., 1995; Clemmens et al., 2001). In addition, in rats, chronic exposure to estrogen can down-regulate melatonin receptors in the ovaries and, therefore, reduce their expression (Clemmens et al., 2001). Thus, it is possible that over exposure to melatonin during the reproductive season in sheep might be detrimental at the ovarian level and associated with high concentrations of estradiol, particularly around the estrus. In conclusion, undernutrition impaired the viability of embryos in the RS, particularly in the ewes that were given melatonin implants. In the AS, supplemental melatonin appeared to improve embryo quality. Those results suggest that the mechanisms underlying the interaction between 92 M.I. V´azquez et al. / Animal Reproduction Science 112 (2009) 83–94 exogenous melatonin and level of nutrition on embryo development are seasonally regulated, but the nutrition–melatonin interactions and their mechanisms require further study. Acknowledgements This study was supported by grants AGL2004-00432 and AGL2007-63822 from CICYT and A-26 from DGA. M.I.V. was funded by Fundaci´ on Carolina-Universidad de Zaragoza. The authors thank the ovine staff of the Servicio de Experimentaci´ on Animal (Universidad de Zaragoza) for their assistance in maintaining the animals. References Abecia, J.A., Rhind, S.M., Bramley, T.A., McMillen, S.R., 1995. Steroid production and LH receptor concentrations of ovarian follicles and corpora lutea and associated rates of ova wastage in ewes given high and low levels of food intake before and after mating. Anim. Sci. 61, 57–62. Abecia, J.A., Lozano, J.M., Forcada, F., Zarazaga, L., 1997. 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Ewes were synchronized and mated at oestrus (Day = 0). On Day 5, ovaries were collected and oocytes were used for IVF. Season had a significant (p < 0.01) effect on the number of oocytes recovered (RS: 19.6 ± 1.0; SA: 14.5 ± 1.0) and the number of healthy oocytes (RS: 13.9 ± 0.7; SA: 9.0 ± 0.7). In the RS, neither nutrition nor melatonin had a significant effect on the evaluated oocytes quality parameters although melatonin implants appeared to reduce the number of unhealthy oocytes in the undernourished group (p < 0.05). During SA, in undernourished ewes exogenous melatonin tended to increase the number of healthy (L+MEL: 9.4 ± 1.0, L)MEL: 7.6 ± 1.4; p < 0.1), and significantly improved both cleaved oocytes (L+MEL: 7.0 ± 0.7, L)MEL: 4.1 ± 0.9; p < 0.05) and blastocyst rate (L+MEL: 37.2, L)MEL: 21.9%; p < 0.05). In conclusion, oocyte competence in ewes was affected by season, and melatonin implants appeared to improve developmental competence in the seasonal anoestrous period, particularly in experimentally undernourished ewes. Introduction Season and nutritional condition can have a significant effect on reproduction in sheep, particularly in the Mediterranean region, where the availability of nutritional resources are highly seasonally variable. Embryo production and viability are the main factors that reflect female reproductive success, and both are affected by follicular development and oocyte quality. Season appears to influence the fertilization and viability rates of sheep embryos (Va ´zquez et al. 2008), and can affect some of the characteristics of the embryos (Mitchell et al. 2002). Mitchell et al. (2002) observed that the numbers of fertilized ova and embryos that had <16 cells impacted embryo quality, which was lower during anoestrus than during the reproductive season (RS). In addition, Stenbak et al. (2001) found the in vitro fertilization (IVF) rates of oocytes recovered from superovulated ewes were higher in the RS than they were during anoestrus. Melatonin implants can be an effective method of inducing oestrous cycles, increasing lambing rates, and prolificacy during anoestrus (Haresign et al. 1990; Robinson et al. 1991; Haresign 1992; Abecia et al. 2007). Abecia et al. (2008) summarized the effects of exogenous melatonin on the ovary and early embryos in ewes. Although melatonin treatments during anoestrus did not improve fertilization rates in superovulated ewes (McEvoy et al. 1998; Forcada et al. 2006), this pineal hormone can improve the viability of embryos (Forcada et al. 2006). Although information about the effects of melatonin on oocyte quality and IVF during anoestrus is limited, Luther et al. (2005) did not observe a significant difference between melatonin-treated and untreated ewes in their fertilization rates after IVF of the oocytes recovered from superovulated ewes in the non-reproductive season. Nutrition can have a significant effect on numerous aspects of reproduction, including hormone release, fertilization, and early embryonic development (Boland et al. 2001). Nutritional condition can be correlated with embryo survival and is a key factor in the efficiency of assisted reproductive technologies (Webb et al. 2004). Borowczyk et al. (2006) found that the oocytes derived from underfed ewes yielded fewer blastocysts and had lower rates of cleavage and blastocyst formation than did control ewes. Lozano et al. (2003) observed lower cleavage rates in underfed ewes than in overfed ewes; in addition, undernutrition can impair embryo viability (Va ´zquez et al. 2008). To our knowledge, yet, there are no published studies on the competence of oocytes recovered from the ovaries of undernourished ewes. As melatonin can increase embryo survival and IVF rates (Valasi et al. 2006), we hypothesized that this hormone might override the effects of undernutrition and season on oocyte competence, which is the ability of an oocyte to be fertilized and develop to the blastocyst stage. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of melatonin and undernutrition on oocyte competence, IVF and early embryonic development during the anoestrus and the RS in ewes. Materials and Methods All procedures used in this study were approved by the Ethics Committee of the University of Zaragoza, Spain, performed at the Experimental Farm of the University of Zaragoza, Spain (4141¢N), and met the requirements of the European Union for Scientific Procedure Establishments. Reprod Dom Anim doi: 10.1111/j.1439-0531.2008.01329.x ISSN 0936-6768 2009 Blackwell Verlag GmbH Animals and experimental design The study included multiparous, non-pregnant Rasa Aragonesa ewes. In the RS, 42 cycling ewes with a mean (± SEM) live weight (LW) of 64.1 ± 1.7 kg and mean body condition (BC) (Russell et al. 1969) of 3.1 ± 0.1 were used. To confirm ovarian cyclicity, 7 days and 14 days before the insertion of melatonin implants, blood samples were collected and plasma progesterone concentrations were measured. All of the ewes had progesterone concentrations >1 ng ⁄ml in at least one of the samples, which indicated ovarian activity. On 8th December, 21 ewes received a subcutaneous melatonin implant (18 mg melatonin, Melovine  , CEVA Salud Animal S.A., Barcelona, Spain) at the base of the ear and 21 others did not. Forty-two days after implantation, all of the ewes were synchronized after a 14-day treatment with intravaginal progestagen (30 mg Flourogestone Acetate; Sincropart  , Ceva Salud Animal S.A.). When the pessaries were removed, the ewes were treated i.v. with 400 IU of equine chorionic gonadotrophin (eCG) (Sincropart  PMSG, Ceva Salud Animal S.A.). During the seasonal anoestrus (SA), at 7 and 14 days before the start of the experiment, blood samples were collected from 42 ewes and their plasma progesterone concentrations were measured. To create a group of anoestrous ewes, those that had progesterone levels >1 ng ⁄ml in at least one of their samples were considered cyclic, and were excluded from the study. Consequently, the experiment included 36 adult, non-cycling, non-pregnant Rasa Aragonesa ewes that had a mean (± SEM) LW of 59.2 ± 1.3 kg and BC of 3.2 ± 0.06. On 26 March, 17 ewes received a subcutaneous implant of melatonin, while another 19 did not. Synchronization with intravaginal progestagen pessaries occurred 42 days after implantation. When the pessaries were removed, the ewes were treated i.v. with 480 IU of equine chorionic gonadotrophin (eCG). In both seasons, from the date of insertion of the pessaries until slaughter (Day 5 post-oestrus), the ewes were fed with a diet that provided either 1.5·M(control, C groups) or 0.5·M(low, L groups) the daily maintenance requirements (Agricultural and Food Research Council 1993) and had unlimited access to water. Ewes fed the C diet received 0.60 kg of pellets and 1 kg of barley straw per day, which provided 12.4 MJ of metabolizable energy (ME) and 9.3% crude protein (CP). The L diet comprised 0.20 kg of pellets and 0.35 kg of barley straw per day, which provided 4.1 MJ of ME and 9.1% CP. The pellets consisted of barley (73%), soybean (22%), and a mineral supplement (5%). Live weight and BC were recorded at the time of pessary insertion, pessary withdrawal, and at slaughter. A 1.5·Mdiet ensures the maintenance of LW and BC, whereas a 0.5·Mdiet leads to a 12% reduction in LW and BC after 20 days. Thus, the four groups in the study were: group C)MEL, ewes that were offered the C diet and did not receive a melatonin implant; group C+MEL, ewes that were offered the C diet and received a melatonin implant; group L)MEL, ewes that were offered the L diet and did not receive a melatonin implant; and group L+MEL, ewes that were offered the L diet and received a melatonin implant. From 24 h after pessary withdrawal, every 8 h intact rams wearing harnesses with marking crayons were used to monitor oestrus (Day 0). To verify the functionality of the corpora lutea at Day 5 (slaughter), jugular blood samples were collected in evacuated heparinized tubes. To test the effectiveness of the melatonin implants, one diurnal blood sample was collected from each of the melatonin-implanted ewes 45 days after implantation. The samples were centrifuged within 15 min (1000 ·g for 10 min) and the plasma was stored at )20C. Collection and in vitro maturation of oocytes On Day 5, 20 days after the start of the experimental diets, ewes were anaesthetized using an i.m. injection of 0.4 ml 2% xylazine (Xilagesic 2%  , Calier, Barcelona, Spain), and 10 ml of sodium thiopental (20 mg ⁄ml) (Thiobarbital Braun Medical, Jae ´n, Spain) administered by i.v. injection 5 min later. Uterine horns were flushed with pre-warmed (36C) phosphate-buffered saline (PBS) and embryos were collected by mid-ventral laparotomy. The effects of exogenous melatonin and level of nutrition on the viability of embryos are described elsewhere (Va ´zquez et al. 2008). After embryo collection, ewes were euthanized using an i.v. injection of sodium thiopental (T-61  ; Intervet, Salamanca, Spain). Ovaries were collected and placed in PBS supplemented with 100 IU ⁄ml of penicillin-G and 100 lg⁄ml of streptomycin sulphate at 39C until they were processed. Except where indicated otherwise, all of the reagents were from Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA. A combination of puncture and slicing techniques (Wani et al. 1999) were used to collect oocytes in a Petri dish and partially covered with a handling medium (Hepes-buffered TCM-199 supplemented with 0.1% polyvinyl alcohol (PVA), 0.04% sodium bicarbonate, 25 IU ⁄ml of heparin, 100 IU ⁄ml of penicillin-G, and 100 lg⁄ml of streptomycin sulphate). Following Wani et al. (2000), oocytes were classified, based on their cumulus cells and cytoplasm morphology, as: Good, included all oocytes with a lot of complete layers of granulose cells and homogeneous cytoplasm; Fair, included all oocytes with few or incomplete layers of granulose cells and homogeneous cytoplasm; and Poor, included oocytes with few or absence of granulose cells and non-homogeneous cytoplasm. Only the oocytes that had several layers of cumulus cells and a uniform cytoplasm (called healthy oocytes) were selected for in vitro maturation (IVM). Healthy oocytes were transferred into a maturation medium that contained bicarbonate-buffered TCM-199 supplemented with 10% (v : v) oestrous sheep serum, 0.1 lg⁄ml each of FSH and LH, 100 lMof cysteamine, 0.3 lMof sodium pyruvate, 100 IU ⁄ml of penicillin G, and 100 lg⁄ml of streptomycin sulphate, which was covered with mineral oil and incubated at 39C under 5% CO 2 and saturated humidity for 24 h. In vitro fertilization (IVF) and embryo cultures At the end of IVM, oocytes were freed from the cumulus cells and transferred to the fertilization medium, which 2MIVa ´zquez, F Forcada, A Casao, JA Abecia, C Sosa and I Palacı´n 2009 Blackwell Verlag GmbH