Repositorio Institucional de Documentos

2012 6 Esther Lapuente Brun Organización modular de la cadena respitatoria de mamíferos y optogenética mitocondrial Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular José Antonio Enríquez Erika Mª Fernández-Vizarra Bailey Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Esther Lapuente Brun ORGANIZACIÓN MODULAR DE LA CADENA RESPITATORIA DE MAMÍFEROS Y OPTOGENÉTICA MITOCONDRIAL Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular José Antonio Enríquez Erika Mª Fernández-Vizarra Bailey Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular ORGANIZACIÓN MODULAR DE LA CADENA RESPIRATORIA DE MAMÍFEROS Y OPTOGENÉTICA MITOCONDRIAL Memoria presentada por Esther Lapuente Brun Licenciada en Biología y Licenciada en Bioquímica para optar al Grado de Doctor Dirigida por los Doctores José Antonio Enríquez y Erika Mª Fernández-Vizarra Bailey Zaragoza, Febrero 2012 D. JOSÉ ANTONIO ENRIQUEZ DOMINGUEZ, Catedrático del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza Y Dª. ERIKA Mª FERNÁNDEZ-VIZARRA BAILEY, Investigadora “Miguel Servet” del Sistema Nacional de Salud en el Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón, CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral “Organización modular de la cadena respiratoria de mamíferos y Optogenética mitocondrial” ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, bajo su dirección y tutela y que reúne, a su juicio, las condiciones para optar al grado de Doctor. Zaragoza, Febrero 2012 Fdo: José Antonio Enríquez Erika Mª Fernández-Vizarra Este trabajo ha sido realizado con una beca de Formación del Profesorado Universitario del Ministerio de Educación (AP2007-03834) y con las subvenciones de Ministerio de Ciencia y Tecnología (CONSOLIDER CSD200700020), el Instituto de Salud Carlos III (PI09/00946), el Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (PIPAMER0905) y la Diputación General de Aragón (PI090/08; Grupo de Excelencia B55). Ha pasado ya algún tiempo desde el comienzo de este proyecto. Un proyecto con el que pretendía asomarme a este mundo de generación de conocimiento, de búsqueda de los procesos que se esconden en nuestro interior y que hacen posible la vida. Ha sido un camino lleno de retos que me han motivado en lo profesional y también en lo humano, pero no desligados de algunas dificultades que me han permitido crecer, pero que no hubiera podido salvar si en cada paso de este camino no hubierais estado alguno de vosotros dándome el apoyo necesario para afrontarlas. Por fin ha llegado el momento de compartir con vosotros los logros alcanzados, de los que sin duda sois partícipes. A todos vosotros, ¡Gracias! Gracias a Toño, por acogerme en este equipo de investigación, y en este grupo humano, por los medios que has dedicado para sacar adelante este trabajo. Y gracias, en especial, por tu ayuda y tu compromiso conmigo para permitirme realizar este trabajo en Zaragoza. Gracias muy especialmente a Erika. Por tomar las riendas de este trabajo a mitad de camino, por prestarte a ser mi codirectora. Gracias a eso estamos hoy aquí. Gracias por confiar en mí, haberme apoyado tanto, y ser tan buena maestra. Por haberme enseñado tantas cosas: desde el trabajo en la poyata, hasta la actitud crítica y rigurosa de interpretación de los resultados, por ser imparcial y estar abierta a la verdad. Por creer en lo que parecía imposible y llegar hasta el final. ¡La Ciencia necesita gente como tú! Aparte de todo eso, gracias por tu amistad, por mantenerte a mi lado en la dificultad y tener siempre palabras de aliento. Gracias a Patricio, por tu ayuda, tu orientación, y la atenta lectura y corrección de esta tesis, ¡y de todos los manuscritos previos! Gracias a Acisclo, por tu compañía siempre tan alegre, por transmitirme desde la experiencia que, con esfuerzo, al final las cosas acaban saliendo, por mal que pinten. Gracias a Nieves, por tramitarnos tantas cosas y facilitarnos tanto el trabajo. Gracias por ser siempre tan cercana, por todo tu cariño, por tus ánimos, tus consejos, y por hacerme sentir tan querida. ¡Espero no perderte de vista, y que la nueva etapa que se abre te depare mucha felicidad! Mil gracias a Raquel. Eres para mí una tercera directora. Gracias por la acogida tan calurosa que me diste y por haberte hecho responsable de mí durante ese primer año de manera tan desinteresada, por confiar en mí para ayudarte en tus experimentos y cuidar tus células desde el primer día. Gracias por haberme enseñado todo lo que sabes. Por ser tan buena compañera y ser la primera en echar una mano a todos. Por esa entrega a tu trabajo, que has sabido transmitirme. Gracias por tu amistad, por ser tan alegre y contagiarme esa risa maravillosa. Gracias a Ester Perales, por todos los momentos que hemos compartido a lo largo de estos años en Zaragoza o en Madrid, a través del Skype, a veces tan cerca, ¡y otras tan lejos! Desde el primer día me recibiste con una enorme sonrisa y he visto en ti una amiga. Gracias por enseñarme tus trucos: en cada uno de mis geles de Blue Native siempre has estado presente. Gracias, por animarme siempre tanto y por guardarme los secretos como nadie. Has sido para mí una referencia. Seguro que seguirás sumando muchos éxitos, y que llegarás muy lejos. Gracias a Ricardo, por aquellas tardes en las que los dos nos quedábamos a cerrar el chiringuito. Poco importaba la hora si aún quedaba trabajo y tan buena compañía. Gracias por ser tan buena gente, por ofrecerte siempre a ayudar en cualquier técnica o problema, por tu interés por entender mis resultados y por tu gran empatía. Has trabajado mucho y te mereces un final feliz. ¡Ánimo, ya te queda muy poco! Gracias a Ana y Elena, porque empezamos juntas este camino. A Ana, por tu compañía, en especial durante mi estancia en Madrid, por hacerme sentir que no estaba tan lejos de casa. A Elena por los cuatro años que hemos compartido, muchas veces enfrentándonos a las mismas dificultades. Os deseo mucha suerte ahora que acabamos esta etapa. Muchas gracias a Pilar, que desde el primer día mostraste interés por mi trabajo. Siempre has estado abierta a discutir los resultados y a pensar alternativas. Gracias por tus buenas ideas y por esos artículos de los que me advertías. Ha sido una suerte tenerte cerca y poder compartir contigo, además, muchas otras cosas personales. Gracias a Nuria, siempre tan positiva y tan alegre, dándole vidilla al laboratorio, y dispuesta a escuchar. Por el interés que has mostrado y todos tus ánimos, en especial en los últimos momentos de esta tesis, gracias. Gracias a Patricia, por ser tan práctica, porque en los momentos especialmente difíciles me regalaste tus consejos, animándome a dejar a un lado las dificultades y apostar por aquello que es mejor a largo plazo. Gracias a la gente que ha ido pasando alguna época por el laboratorio, a Guillermo, Cristina y María, por vuestra simpatía y hacerme más ameno el trabajo. Gracias a los miembros del grupo en Madrid, especialmente a Carmen y a Conchi, con las que he tenido más contacto. Gracias a Pili, Reyes, Mariví e Ismael, por su gran implicación siempre que los he necesitado. Gracias a Marta, que ha sido siempre tan cercana y solvente respondiendo a mis dudas. También quiero agradecer su amabilidad a los compañeros y profesores del Departamento, que he tenido el gusto de conocer en Veterinaria y en Ciencias. En especial a la gente del grupo de Julio y Eduardo (David, Marora, Malena, Iñigo, Ester…) cuya cercanía hace que parezcan parte del propio grupo. A mis amigas (Erena, Andrea, Patricia, Cristina…), aunque apenas podemos vernos, os tengo presentes mucho más de lo que pensáis. Gracias por vuestros ánimos y por arrancarme tantas sonrisas. En último lugar, quiero agradecer todo su apoyo a aquellos a quienes dedico este trabajo, a mi familia. A mis padres, que siempre han luchado tanto por nosotras, mil GRACIAS por estar siempre a mi lado, por enseñarme a asumir el reto de irme mejorando día a día, por escuchar con tanta atención las cosas que os contaba del trabajo, a pesar de no entenderlas siempre, por creer que es una labor importante y por creer en mí. Muchas gracias, Nuria y Cristina, por vuestro cariño, por vuestro interés en este trabajo, y las veces que me habéis acompañado a “ver las células”, y porque con vosotras consigo olvidarme de las preocupaciones. Siempre me tendréis cerca. Gracias al resto de mi familia, a mis tíos (Marcos, Fina y Ángel) y a mi prima Beatriz, por vuestro cariño y por tener esa fe ciega en mí; y a los Sánchez, que siempre habéis mostrado interés por mi trabajo, gracias por vuestra compañía y vuestros ánimos. Y por supuesto, GRACIAS a ti, Armando, por tu infinita comprensión, paciencia y apoyo durante tantos años. Por dar prioridad a mis sueños, y por darme el empujón necesario cuando parece que me rindo. Ahora quién sabe lo que nos espera, pero sea lo que sea, estaremos juntos. Gracias por estar a mi lado. Te quiero mucho. A todos de corazón, ¡gracias! Esther Abreviaturas A Absorbancia Aa Aminoácidos AAV Virus adenoasociados acetil-CoA Acetil-coenzima A ADP Adenosín difosfato AICAR Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide, AMP Adenosín monofosfato AMPK Kinasa de AMP ANT Translocasa de nucleótidos de adenina AOX Oxidasa alternativa APS Persulfato de amonio ATP Adenosín trifosfato ATPasa ATP sintasa BN Blue Native BPR Proteorrodopsina azul BR Bacteriorrodopsina BrEt Bromuro de etidio BSA Seroalbúmina bovina C8 Subunidad 8 de la citocromo c oxidasa Cer Ceramida CIAP Fosfatasa alcalina de intestino de ternera CI-CV Complejo I, al V CMV Citomegalovirus CoQ Coenzima Q o ubiquinona COX Citocromo c oxidasa CS Citrato sintasa Cyt c Citocromo c Chol Colesterol DCPIP Diclorofenol-indofenol DDM Dodecilmaltósido DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium, medio de Eagle modificado por Dulbecco DMSO Dimetilsulfóxido DNA Desoxyribonucleic Acid, Ácido Desoxirribonucleico (ADN) cDNA ADN codificante mtDNA ADN mitocondrial nDNA ADN nuclear DNP Dinitrofenol dNTP Desoxinucleótido trifosfato DT Tiempo de duplicación DTNB Ácido 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoico ε Coeficiente de extinción molar eElectrón EDTA Ácido etilen-diamino-tetra-acético EF Factor de elongación EGTA Ácido etilen-glicol-tetra-acético ETC,CTE Cadena transportadora de electrones ETF Flavoproteína Transferente de electrones FAD Flavín adenín dinucleótido, oxidado FADH2 Flavín adenín dinucleótido, reducido Fe-S Grupo sulfoférrico FILA Acidosis láctica severa neonatal Filtros SFCA Filtros de acetato de celulosa libres de surfactante FMN Flavín mononucleótido Ft Feet, pies GA3PDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GPR Proteorrodopsina verde Grp75 Proteína regulada por glucosa 75 HEPES 4 (2-hydroxyethyl) - ácido 1piperazineethanesulfónico HPLC Cromatografía líquida de alta resolución HSP Promotor de cadena pesada Hsp Proteína de choque térmico IMP Peptidasa de membrana interna IP3 Inositol trifosfato IP3R Receptor de Inositol trifosfato IRF Factor de regulación de interferón Kb kilobase kDa kiloDalton KP Tampón fosfato LHON Neuropatía óptica hereditaria de Leber LSP Promotor de cadena ligera M9 Subunidad 9 de la ATP sintasa MAM Membrana de retículo Asociado a Mitocondria MAVS Proteína mitocondrial de señalización antiviral MELAS Encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica MERRF Síndrome de epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas rasgada MILS Síndrome de Leigh heredado maternalmente MIM Membrana interna mitocondrial MISS Señal de espacio intermembrana mitocondrial MnSOD Superóxido dismutasa de manganeso MOPS 3-(N-morpholino)-propanosulfónico MPP Peptidasa de procesamiento mitocondrial MRP Proteína del ribosoma mitocondrial mt Mitocondria MTIF2 Factor de iniciación mitocondrial 2 mtSSB Proteína de unión a cadena sencilla mitocondrial NAD+ Nicotinamida adenina dinucleótido, oxidado NADH Nicotinamida adenina dinucleótido, reducido NARP Neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa NDI1 NADH deshidrogenasa alternativa de levadura NF-κB Factor nuclear κB nm nanómetros NRF1,2 Factor respiratorio nuclear 1 y 2 nt Nucleótidos OAA Oxalacetato Oligo Fw Cebador directo Oligo Rv Cebador reverso OXPHOS Sistema de fosforilación oxidativa PAM Motor asociado a la traslocasa de presecuencia PBS Tampón fosfato salino PBS-T PBS-Tween PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEG Polietilenglicol PGC-1α,-1β Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivators, coactivador del receptor gamma activado por proliferadores peroxisomales Pi Fosfato inorgánico PLA2 Fosfolipasa A2 PMSF Fluoruro de fenil-metil-sulfonilo PNA Peptide nucleic acid, péptido ácido nucleico, POLRMT ARN polimerasa mitocondrial PRC Coactivador relacionado a PGC PtdEtn Fosfatidiletanolamina PtdSer Fosfatidilserina PVDF Fluoruro de polivinilideno R-6-G Rodamina-6-G RE Retículo endoplásmico RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RNA Ribonucleic Acid, Ácido Ribonucleico (ARN) mRNA ARN mensajero rRNA ARN ribosómico tRNA ARN de transferencia ROS Especies reactivas de oxígeno rpm Revoluciones por minuto SAM Maquinaria de ensamblaje y distribución SC Supercomplejos SCAFI Factor de ensamblaje de supercomplejos I SDH Succinato deshidrogenasa SDS Dodecilsulfato sódico SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (d)SFB Suero fetal bovino (dializado) Sig-1R Receptor de Sigma-1 T Temperatura TAE Tampón Tris, Acético y EDTA TBE Tampón Tris, Borato y EDTA TEMED N, N, N‟, N‟-tetrametiletilendiamina TFAM Factor de transcripción mitochondrial A TFB1M Factor de transcripción B1 mitocondrial TFB2M Factor de transcripción B2 mitocondrial TIM Traslocasa de membrana interna Tm Temperatura de hibridación TMP Trimethyl-psoralen TMPD N,N,N‟,N‟-tetrametil-p-fenilendiamina TOM Traslocasa de membrana externa UQ2 Ubiquinona UQ2H2 Ubiquinol UV Ultravioleta VDAC Canal aniónico dependiente de voltaje, porina mitocondrial X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido λ Longitud de onda ρ0 Célula carente de ADN mitocondrial 2.2.8 Curvas de crecimiento……………………………………………………………….…185 2.2.9 Transfección celular………………………………………………………………….…185 2.2.9.1 Transfección química………………………..……………………….……………………...185 2.2.9.2 Transfección mediada por lentivirus.………………………………………………….186 2.2.10 Análisis de contaminación por micoplasma y tratamiento………………187 2.2.11 Congelación y descongelación celular…………………………………………..188 2.3 Purificación y permeabilización de mitocondrias……………………………188 2.3.1 Purificación de mitocondrias para medidas espectrofotométricas de los complejos respiratorios……………………………………………………………………….. 188 2.3.2 Extracción y purificación de mitocondrias de células en cultivo para el análisis por Blue Native ………………………………………………………………….…… 189 2.3.3 Purificación de mitocondrias de hígado o corazón de ratón…....…….… 190 2.3.4 Permeabilización de mitocondrias para Blue Native………………..………191 2.4 Medida de funcionalidad de la cadena de transporte electrónico 191 2.4.1 Medida de consumo de oxígeno………………………………………………….. 191 2.4.1.1 Medida de respiración endógena y desacoplada en células intactas….192 2.4.1.2 Medida de la actividad de los complejos por polarografía en células permeabilizadas con digitonina.……………………………………..……………………………..193 2.4.2 Medida de la actividad enzimática por espectrofotometría…….…….. 195 2.4.2.1 Actividad NADH-Deshidrogenasa sensible a rotenona (CI)………………….195 2.4.2.2 Actividad Succinato-Deshidrogenasa (CII).……………………………………….…196 2.4.2.3 Actividad Glicerol-3-P-Deshidrogenasa (G3P-DH)……………………….………197 2.4.2.4 Actividad Citocromo c Reductasa (CIII)….………………………………….……….197 2.4.2.5 Actividad Citocromo c Oxidasa (COX, CIV)….………………………………………198 2.4.2.6. Actividad CI+III……………………………………………………………………………….…198 2.4.2.7. Actividad CII+III…..………………………………………………………………………….…199 2.4.2.8 Citrato sintasa (CS)…………………………………………………………………………..…200 2.5 Extracción, manipulación y análisis de ácidos nucleicos…………….… 201 2.5.1 Diseño de los genes de interés……………………………………..……………. 201 2.5.2 Extracción y purificación de DNA…………………………………….…………. 201 2.5.2.1 Extracción y purificación de DNA total de células en cultivo……………….201 2.5.2.2. Extracción de DNA plasmídico………………………………………………………… 201 2.5.2.3. Purificación de DNA a partir de geles de agarosa……………………………...202 2.5.2.4. Purificación de productos de PCR……………………………………………………….202 2.5.3 Extracción de RNA total a partir de células en cultivo …………………. 202 2.5.4 Cuantificación de ácidos nucleicos …………………………………………….. 202 2.5.4.1. Cuantificación de ácidos nucleicos por espectrofotometría………………..202 2.5.4.2. Cuantificación de DNA en geles de agarosa……………………………………….203 2.5.5 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)………………………………… 203 2.5.5.1. Obtención de cDNA monocatenario para su uso como molde de PCR………………………………………………………………………………………..…………………...203 2.5.5.2 Reacción de PCR utilizando DNA genómico como molde………………..…..204 2.5.5.3. Reacción de PCR usando cDNA como molde……………………………………...205 2.5.5.4 Reacción de PCR utilizando DNA plasmídico como molde……………………205 2.5.6 Clonación de fragmentos de DNA en vectores plasmídicos…….……….205 2.5.6.1 Clonación de productos de PCR en el vector pCR2.1………………………......205 2.5.6.2 Clonación de los productos de digestión en un vector plasmídico……....206 2.5.6.2.A Digestión de vectores plasmídicos…………………………………………….207 2.5.6.2.B Purificación producto de digestión……………………………………………207 2.5.6.2.C Ligación de un determinado inserto en el vector de elección….…207 2.5.7 Electroforesis de ácidos nucleicos…………………………………………..…...207 2.5.7.1. Electroforesis de DNA en geles horizontales de agarosa…………………….207 2.5.7.2 Electroforesis vertical de DNA en geles de poliacrilamida………………….207 2.5.8 Análisis de mutaciones y polimorfismos en el mtDNA por RFLP……..208 2.5.8.1. Análisis de la mutación G15263A en mt-Cytb…………………………………….208 2.5.9 Secuenciación automática del DNA…………………………………………….208 2.6 Extracción, manipulación y análisis de proteínas………………………….209 2.6.1 Extracción de proteínas totales de células en cultivo……………………..209 2.6.2 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford……………..….210 2.6.3 Síntesis “in vitro” de proteínas ………………………………………………..…210 2.6.4 Electroforesis de proteínas………………………………………………….………211 2.6.4.1. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE………………..………………………….211 2.6.4.2. Electroforesis en geles nativos Blue Native: Primera dimensión………...212 2.6.4.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizante: Segunda dimensión………………………………………………………………………………………………………214 2.6.5. Inmunodetección de proteínas por Western Blot………………………..215 2.6.5.1 Transferencia y fijación de proteínas a membranas de PVDF……….……..215 2.6.5.2. Incubación de los anticuerpos primarios y secundarios………………………216 2.6.5.3 Detección de proteínas……………………………………………………………………….216 2.6.5.4 Reutilización de las membranas…………………………………………………..…….217 2.6.6. Inmunofluorescencia……………………………………………………………….217 Apéndice …………………………..……………………………………….…………….……219 Bibliografía ……………………………………….……………….…………………………231 Introducción y Objetivos Introducción y Objetivos 3 El sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) representa la principal fuente de energía del organismo, en forma de la molécula de ATP. Gracias a la actividad de una ATP sintasa ubicada en la membrana interna mitocondrial, el gradiente protónico generado por la cadena transportadora de electrones a través de dicha membrana permite la síntesis de esta molécula. Una de las características más relevantes de este sistema, es el doble origen genético de sus componentes. El sistema OXPHOS está constituido por dos transportadores electrónicos y cinco complejos enzimáticos, cuatro de los cuales están formados por subunidades codificadas tanto en el DNA mitocondrial (mtDNA) como en el nuclear. El DNA mitocondrial de mamíferos presenta una gran variabilidad como consecuencia de mutaciones puntuales debidas, entre otros, a factores ambientales. El catálogo de mutaciones puntuales y deleciones del DNA mitocondrial que causan enfermedades humanas es muy amplio y continúa creciendo a un ritmo acelerado (MITOMAP, http://www.mitomap.org). Estas mutaciones están asociadas a un variado espectro de manifestaciones clínicas, mayoritariamente síndromes neurológicos degenerativos, que hasta la fecha no tienen tratamiento efectivo. Por otra parte, los defectos en el mtDNA también afectan a otros órganos provocando debilidad muscular, fallo cardiaco, diabetes, disfunciones renales, enfermedad hepática, etc. Desde el punto de vista bioquímico, las mutaciones del mtDNA pueden afectar a la función de uno o más complejos respiratorios, aunque a menudo su determinación precisa resulta difícil. Además de las mutaciones en el mtDNA, existen bastantes casos de enfermedades del sistema OXPHOS causadas por fallos en algunos genes nucleares que codifican proteínas esenciales para la correcta biogénesis del sistema. La participación de dos genomas en la biogénesis del sistema OXPHOS, implica la necesidad de un exhaustivo control de los procesos de importe y ensamblaje de las subunidades para formar los complejos respiratorios, así como repercute en la complejidad de la etiología y manifestaciones de las enfermedades mitocondriales. Además, la producción de energía es sólo una de las muchas funciones desempeñadas por las mitocondrias. La homeostasis del calcio, la biosíntesis de pirimidinas o de los grupos hemo y centros Fe-S, la regulación del proceso apoptótico o la producción de especies reactivas son algunos de los otros procesos metabólicos en los que este orgánulo interviene de manera crucial, algunos de los cuales están íntimamente ligados al sistema OXPHOS a través de alguno de sus componentes. Por todo ello, el estudio de la mitocondria y en especial del sistema OXPHOS resulta de suma importancia para el entendimiento de la bioquímica y biología celular, así como para la comprensión de las patologías relacionadas. Desde su descubrimiento, este sistema se ha convertido en uno de los procesos bioquímicos mejor conocidos. Sin embargo, todavía quedan muchos aspectos por esclarecer, tanto estructurales, (cristalización de CI, sitios de unión de transportadores, etc.), como funcionales (papel de algunas subunidades, mecanismos de bombeo protónico, etc.). Por otro lado, algunas de las cuestiones del sistema OXPHOS que parecían estar bien definidas se están revisando en la actualidad. Es el caso por ejemplo de la organización del sistema. Recientemente se ha propuesto una distribución diferencial de sus componentes en compartimentos mitocondriales distintos, y también se han descrito interacciones entre los diferentes elementos de la cadena que llevarían a la formación de supercomplejos respiratorios. Esta nueva organización del sistema plantea interrogantes en cuanto a la participación de nuevas proteínas, factores o elementos regulatorios, y también en cuanto a las Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 4 consecuencias funcionales derivadas de la nueva estructuración del mismo, así como el papel que pasarían a jugar sus componentes en esta nueva situación. En este marco general, la presente tesis pretende abordar dos problemas relacionados con el estudio estructural y funcional de este sistema: Parte I: Organización modular de la cadena respiratoria. Se centra en el estudio de la organización del sistema OXPHOS, en concreto en aspectos relacionados con la formación de los supercomplejos respiratorios y en su relación con los transportadores móviles, concretamente con el Coenzima Q (CoQ). Los objetivos correspondientes a este apartado se enumeran a continuación: 1.- Determinar el papel del CoQ en el paso de electrones al Complejo III, y su vinculación a la formación de los supercomplejos CI+CIII en la cadena respiratoria. 2.- Regulación de la formación de los supercomplejos: identificación y caracterización de proteínas implicadas en estos procesos. Parte II: Optogenética mitocondrial. Cuando existen defectos en la cadena respiratoria mitocondrial, se produce un déficit de síntesis de ATP con las consiguientes consecuencias para la funcionalidad celular. El objetivo de esta parte del trabajo es: 1.- Restaurar la función de bombeo protónico propia de la cadena transportadora de electrones, cuando existen defectos en ella. Se plantea la xenoexpresión, en células de mamífero, de bombas de protones fotoinducibles bacterianas, de manera análoga a las utilizadas en la “optogenética”. De esta manera se pretende: AAumentar el conocimiento básico de la interacción de los distintos elementos del sistema OXPHOS (cadena respiratoria y ATPsintasa) con otras vías metabólicas, BPlantear una posibilidad de terapia para restaurar una cierta tasa de síntesis de ATP en casos de una cadena respiratoria defectuosa. Revisión Bibliográfica 13 información para los dos rRNAs, 14 tRNAs y 12 polipéptidos, mientras que la cadena L sólo contiene 9 genes: 8 tRNAs y la subunidad ND6 del complejo I. Figura 4. Mapa genético del mtDNA humano y sistema OXPHOS. A) Mapa genético del mtDNA humano. Representación de las dos cadenas que lo componen y los genes que codifican: siete subunidades de complejo I (NDs), una subunidad de complejo III (CYTB), tres subunidades de complejo IV (COX), y dos subunidades de complejo V (A6 y A8), se muestran en distintos colores. Los RNAs ribosómicos 12S y 16S se muestran en verde y los 22 tRNAs en azul oscuro. B) Representación esquemática del sistema OXPHOS embebido en la membrana interna mitocondrial (IMM). Muestra las subunidades codificadas por el nDNA en azul y las codificadas por el mtDNA en distintos colores. Los electrones (e-) fluyen a través de los complejos de la cadena de transporte electrónico (mtCTE) y los protones son bombeados desde la matriz (MAT) al espacio intermembrana (IMS), a través de los complejos I, III y IV, volviendo a la matriz mediante el complejo V para producir ATP. Los transportadores móviles son el coenzima Q10 (CoQ) y el citocromo c (Cyt c). Figura adaptada de (Schon, DiMauro et al. 2010). El genoma mitocondrial de mamíferos reúne una serie de características particulares: I) su código genético difiere ligeramente del código genético universal (Barrell, Bankier et al. 1979); II) presenta una alta tasa de mutación, 10 veces superior a la del DNA nuclear (Brown, George et al. 1979), debido a la exposición del mtDNA a las especies reactivas de oxígeno generadas en el interior de la mitocondria, a su menor protección por asociación de proteínas que el nuclear, y a la ausencia de sistemas eficientes para su reparación (Fernandez-Silva, Enriquez et al. 2003); III) se transmite por herencia materna, no mendeliana (Giles, Blanc et al. 1980); IV) es muy compacto ya que carece de intrones, A B Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 14 de regiones no traducidas en los extremos del gen y de espaciadores entre genes. Otra característica de los genes codificados en el mtDNA es que la mayor parte de ellos carecen de codon de parada. En estos casos, se ha visto que presentan una T o TA justo después del último triplete y que estas bases van seguidas por el extremo 5‟ del gen adyacente por lo que el codon de terminación se genera mediante la poliadenilación del extremo 3‟ del mRNA correspondiente (Ojala, Montoya et al. 1981). Otro aspecto interesante del mtDNA es la posibilidad de que existan varias formas alélicas en un mismo individuo, pudiendo diferir su proporción relativa dependiendo del tejido (Holt, Harding et al. 1988). La presencia de más de un tipo de mtDNA en una célula o tejido se denomina heteroplasmia, frente al término homoplasmia que se utiliza cuando todas las moléculas de mtDNA de una célula u organismo son idénticas. Dentro de un mismo individuo pueden encontrarse distintos grados de heteroplasmia en los diferentes tejidos y suele darse la necesidad de alcanzar un umbral de porcentaje de DNA mutante para que empiecen a manifestarse los efectos patológicos de la mutación (Mazat, Rossignol et al. 2001). Otro fenómeno destacable es que mientras algunas moléculas de mtDNA pueden sufrir varias rondas de replicación a lo largo del ciclo celular, otras pueden no replicarse. Este hecho, junto a la distribución al azar de mitocondrias entre las células hijas en el proceso de división celular, permite la segregación de variantes alélicas. El mtDNA es además altamente polimórfico: esto significa que hay numerosas diferencias en su secuencia, no patológicas, entre individuos del mismo grupo étnico y que se ven incrementadas entre individuos de grupos distintos. Estas variantes se denominan haplogrupos del mtDNA y se basan en patrones específicos de polimorfismos. Algunos haplogrupos parecen estar relacionados con diversos procesos como la motilidad espermática (Ruiz-Pesini, Lapena et al. 2000), el envejecimiento (Castri, MelendezObando et al. 2009), la susceptibilidad a diversas enfermedades (Hendrickson, Hutcheson et al. 2008; Khusnutdinova, Gilyazova et al. 2008) o la sensibilidad a fármacos (PacheuGrau, Gomez-Duran et al. 2010; Pacheu-Grau, Gomez-Duran et al. 2010). Además, se han utilizado para seguir el rastro de los movimientos poblacionales mundiales, la antigüedad de la especie humana y proporcionan un medio para evaluar la descendencia étnica (Horai 1995; Disotell 1999; Rhouda, Martinez-Redondo et al. 2009; Catelli, Alvarez-Iglesias et al. 2011). Durante mucho tiempo se pensó que las moléculas de mtDNA están desnudas y sin protección, es decir, que no se encuentran asociadas a proteínas, como las histonas al DNA nuclear. Sin embargo, ahora se sabe que el mtDNA está asociado a varias proteínas dentro de una estructura denominada nucleoide. Los nucleoides tiene forma oval y están formados por un número variable de copias de mtDNA, entre 1-10. Recientemente se ha descrito que tienen un tamaño de ~70 nm y la mayor parte de ellos contienen una sola copia de mtDNA (Kukat, Wurm et al. 2011). Este tamaño implica un alto grado de compactación del DNA, ya que dicho diámetro corresponde a 300 pb lineales (Bogenhagen 2011). La principal proteína estructural en el nucleoide es el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM ó mtTFA), de la que se calcula que existen 1,4 x 103 moléculas por nucleoide. Además de compactar el mtDNA, TFAM funciona como factor de transcripción (ver más abajo) y recientemente se ha determinado el cambio estructural que provoca su unión en la molécula de mtDNA (Ngo, Kaiser et al. 2011; Rubio-Cosials, Sidow et al. 2011). Revisión Bibliográfica 15 Se ha descrito que la organización del mtDNA en los nucleoides es importante durante la segregación y afecta al grado de heteroplasmia (Jacobs, Lehtinen et al. 2000; Poe, Duffy et al. 2010). También se ha propuesto un modelo de la estructura del nucleoide en capa. En este modelo, la replicación y la transcripción tienen lugar en el interior del nucleoide, mientras que la traducción tiene lugar en la zona periférica, estando el nucleoide unido a la membrana interna mitocondrial (Bogenhagen, Rousseau et al. 2008). 1.4 Biogénesis mitocondrial 1.4.1 Replicación, transcripción y traducción mitocondrial Como se ha mencionado anteriormente, la replicación del mtDNA tiene lugar en la matriz mitocondrial independientemente de la fase del ciclo celular (Bogenhagen y Clayton 1977). La única DNA polimerasa presente en la mitocondria y responsable de la síntesis, reparación y recombinación del mtDNA es la DNA polimerasa γ (Bolden, Fry et al. 1972; Fridlender, Fry et al. 1972; Bolden, Noy et al. 1977; Kaguni 2004) compuesta por dos subunidades: la subunidad catalítica α (Gray y Wong 1992), y la subunidad accesoria β, que le confiere capacidad de procesamiento y reconocimiento de los cebadores (Olson, Wang et al. 1995; Carrodeguas, Kobayashi et al. 1999; Lim, Longley et al. 1999). Otras proteínas implicadas en la síntesis de DNA son la proteína de unión a cadena sencilla (mtSSB: Single-Stranded Binding Protein) (Tiranti, Rocchi et al. 1993), la DNA helicasa Twinkle (Spelbrink, Li et al. 2001) y, probablemente la mtDNA topoisomerasa I (Zhang, Barcelo et al. 2001; Wang 2002). Existen varios modelos sobre la replicación del mtDNA. El modelo propuesto por Vinograd-Clayton (Kasamatsu y Vinograd 1974; Clayton 1982), sugiere un mecanismo de replicación asimétrico y unidireccional de las dos cadenas a partir de orígenes de replicación diferentes y específicos de cada una de ellas, en un proceso íntimamente unido a la transcripción del mtDNA. Por otro lado, el modelo llamado de Holt-Jacobs propone la replicación simultánea de ambas cadenas a partir de una horquilla de replicación única, bien de manera unidireccional (Holt, Lorimer et al. 2000), o bidireccional (Bowmaker, Yang et al. 2003). En cuanto a la transcripción del mtDNA, la iniciación tiene lugar a partir de tres promotores, un promotor de cadena ligera (LSP) y dos promotores en la cadena pesada (HSP1 y HSP2). En el proceso de transcripción desde LSP Y HSP2 se originan largos transcritos policistrónicos, mientras que el iniciado en HSP1 produce un transcrito corto que contiene tan sólo tRNAPhe y los dos rRNAs (Shadel 2008). Las principales proteínas implicadas en la transcripción mitocondrial son la RNA polimerasa POLRMT,y los factores de transcripción TFAM yTFB2M (Shutt y Shadel 2010). TFB1M ha sido considerado durante algún tiempo otro factor de transcripción mitocondrial debido a experimentos in vitro, donde se demostraba su unión a TFAM y su actividad, aunque considerablemente inferior a la de TFB2M (Falkenberg, Gaspari et al. 2002; McCulloch, Seidel-Rogol et al. 2002). Sin embargo, recientemente se ha visto que no ejerce esta función, sino la de metilación del rRNA 12S (Cotney, McKay et al. 2009; Litonin, Sologub et al. 2010). Otras proteínas posiblemente implicadas en el proceso de transcripción mitocondrial son MRPL12, capaz de asociarse a POLRMT (Wang, Cotney et al. 2007), o proteínas de la familia de mTERF (Shutt y Shadel 2010). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 16 Debido a la generación de transcritos policistrónicos, un proceso de edición del RNA mediado por las RNasa P y RNasa Z posibilita la liberación de los tRNAs, que se sigue de la adición del CCA al extremo 3´ (Nagaike, Suzuki et al. 2001), y de los rRNAs y mRNAs que serán poliadenilados (Ojala, Montoya et al. 1981; Tomecki, Dmochowska et al. 2004). El reconocimiento de los mRNAs mitocondriales por los ribosomas es un proceso poco conocido en mamíferos al carecer de regiones no traducidas en el extremo 5´(Montoya, Ojala et al. 1981). La falta de estructura secundaria en esa región del mRNA o la existencia de señales internas podrían participar en la iniciación de la traducción (Jones, Wilkinson et al. 2008). Los mitorribosomas o ribosomas mitocondriales son, junto al sistema OXPHOS, los únicos componentes de la mitocondria con doble origen genético. Alrededor de 80 proteínas del mitorribosoma estan codificados en el núcleo, y se ensamblan, una vez importadas a la matriz, a los dos rRNAs codificados en el mtDNA (rRNAs 12S y 16S) para originar el ribosoma (Attardi, Chomyn et al. 1990). El ensamblaje del ribosoma y el inicio de la traducción precisa solamente de dos factores de iniciación, MTIF2 (mitochondrial initiation factor 2), que realiza las funciones de IF1 y IF2 de bacterias (Gaur, Grasso et al. 2008), y MTIF3 que se une directamente al tRNA iniciador (Christian y Spremulli 2009). Se han identificado tres factores de elongación de las proteínas mitocondriales (mtEF-Tu, mtEF-Ts y mtEF-G) en hígado bovino (Schwartzbach y Spremulli 1989; Chung y Spremulli 1990). En humanos se conocen los factores de elongación EF-Ts, EF-Tu, EF-G1 y EF-G2 (Xin, Woriax et al. 1995; Hammarsund, Wilson et al. 2001; Bhargava, Templeton et al. 2004; Tsuboi, Morita et al. 2009). Para la terminación de la traducción se han descrito también factores implicados: mtRRF (ribosome release factor), mtRF1 (translation release factor) y su homólogo mtRF1a (Zhang y Spremulli 1998; Soleimanpour-Lichaei, Kuhl et al. 2007; Nozaki, Matsunaga et al. 2008). 1.4.2 Expresión coordinada de dos genomas El mtDNA contiene tan sólo una pequeña proporción de los genes que necesita el orgánulo para desempeñar sus funciones biológicas. La mayor parte de las proteínas mitocondriales se encuentran codificadas en el núcleo celular. Por ello, se dice que la mitocondria es un orgánulo semiautónomo. Figura 5. Doble origen genético de las proteínas mitocondriales. Imagen tomada de (Smits, Smeitink et al. 2010). Revisión Bibliográfica 17 La coordinación de la transcripción de los genes del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) en los dos compartimentos celulares está mediada, en parte, a través de ciertas hormonas, especialmente hormonas esteroideas (Scheller y Sekeris 2003) y tiroideas (Enriquez, Fernandez-Silva et al. 1999). La unión de la hormona a su receptor nuclear induce la transcripción de genes del sistema OXPHOS y la de factores de transcripción de estos genes (Nelson, Luciakova et al. 1995; Wrutniak-Cabello, Casas et al. 2001; Scarpulla 2002; Weitzel, Iwen et al. 2003). También se induce la expresión de los factores de transcripción mitocondrial (Weitzel, Iwen et al. 2003; Gleyzer, Vercauteren et al. 2005; Scarpulla 2006), que son traslocados a la mitocondria, coordinando la transcripción de los genes OXPHOS en ambos compartimentos. Por otro lado, la presencia de receptores de hormonas tiroideas y esteroideas en la mitocondria, así como de secuencias de unión a éstas en el genoma mitocondrial han sugerido el efecto directo de la hormona en la transcripción mitocondrial, sin mediación de factores nucleares (Sekeris 1990; Chen, Delannoy et al. 2004). Esta acción directa de las hormonas tiroideas sobre la transcripción mitocondrial ha sido demostrada experimentalmente (Casas, Rochard et al. 1999; Enriquez, Fernandez-Silva et al. 1999). Sin embargo, se han observado diferencias en la acción de estas hormonas en función del tipo celular, en cuanto al mecanismo a través del cual ejercen su acción, y destacando que la acción directa de la hormona sobre la mitocondria, sin implicación de proteínas nucleares, es específica de tejido (Fernandez-Vizarra, Enriquez et al. 2008). Entre los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes respiratorios codificados en el núcleo se encuentran NRF-1 (Cyt c, ATPase-γ) y NRF-2 (subunidades del CIV). NRF-1 también induce la expresión de dos enzimas de la ruta de biosíntesis del grupo hemo (Braidotti, Borthwick et al. 1993; Aizencang, Bishop et al. 2000), de la proteína Tom20 perteneciente al sistema de importe de proteínas en la mitocondria (Blesa, Prieto-Ruiz et al. 2007), y también actúa sobre los factores de transcripción mitocondrial TFAM y TFB2M, y sobre TFB1M, de manera que coordina la expresión simultánea de los dos genomas (Virbasius y Scarpulla 1994; Gleyzer, Vercauteren et al. 2005). En esta misma dirección, NRF-2 también se ha descrito que activa la expresión tanto de subunidades del complejo respiratorio IV (Virbasius, Virbasius et al. 1993; Ongwijitwat y Wong-Riley 2005), como de TFAM, TFB1M y TFB2M (Larsson, Wang et al. 1998; Falkenberg, Gaspari et al. 2002; McCulloch, Seidel-Rogol et al. 2002). Por otro lado, independientemente de los mecanismos anteriores, para lograr la expresión coordinada de los componentes de la cadena respiratoria sintetizados en el citoplasma y en la matriz mitocondrial, los factores de transcripción mitocondrial, y los factores de transcripción de genes nucleares codificantes de proteínas mitocondriales están sujetos al control de coactivadores de la transcripción (PGC-1α, PGC-1β y PRC), cuya expresión se induce bajo determinadas condiciones ambientales y también en respuesta a señales intracelulares (Scarpulla 2006; Scarpulla 2008). 1.4.2 Importe de proteínas Además de la expresión coordinada de sus genes en dos compartimentos celulares diferentes, la mitocondria debe solventar el problema del importe de aquellos productos génicos sintetizados en el exterior del orgánulo. En mamíferos, de aproximadamente 1.500 proteínas mitocondriales diferentes (Pagliarini, Calvo et al. 2008), tan sólo el 1% se sintetizan en la matriz, y las demás han de ser importadas a través de diferentes mecanismos. Para ello, existe gran diversidad de señales contenidas en la proteína mitocondrial necesarias para importarse en el orgánulo y alcanzar allí su posición final, con la topología y disposición adecuadas. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 18 Figura 6. Señales descritas en precursores de proteínas mitocondriales para el direccionamiento y la distribución en el orgánulo. Imagen obtenida de (Chacinska, Koehler et al. 2009). Una gran parte de las proteínas mitocondriales se sintetizan como precursores que poseen en su extremo amino una presecuencia. Esta consiste en una secuencia de 1550 aminoácidos, que se elimina proteolíticamente una vez que la proteína se encuentra en la matriz gracias a la peptidasa mitocondrial MPP (mitochondrial processing peptidase). Esta secuencia de aminoácidos adopta una estructura secundaria en hélice α, anfipática y positivamente cargada. Su conformación se modifica al atravesar los complejos de importe proporcionando diferente información. En algunos casos, esta presecuencia no se escinde y forma parte de la proteína madura. Un grupo de proteínas precursoras poseen además de la presecuencia, una secuencia hidrofóbica que permite su anclaje en la membrana interna mitocondrial. Cuando esta es la ubicación final de la proteína, la presecuencia no se escinde sino que forma parte de la proteína madura y permanece anclada a la membrana; sin embargo en el caso de las proteínas del espacio intermembrana, se produce la ruptura de la misma por una peptidasa de membrana interna (IMP, inner membrane peptidase) u otra proteasa (AAA-proteasas), de manera que la proteína madura queda soluble (Chacinska, Koehler et al. 2009). Otro tipo de señal de importe a mitocondria consiste en varias secuencias no contiguas a lo largo de la proteína. Este es el caso de los transportadores de metabolitos, localizados en la membrana interna mitocondrial. Entre las proteínas de membrana externa, las de tipo barril β poseen una señal interna que permite el reconocimiento de la mitocondria, y a través de la última lámina beta se une a la maquinaria de ensamblaje SAM (sorting and assembly machinery), mientras que las proteínas de tipo hélice α presentan una hélice transmembrana flanqueada por residuos cargados positivamente. Algunos precursores de proteínas mitocondriales poseen una señal mitocondrial de espacio intermembrana (MISS) que incluye un residuo hidrófobico y un residuo cisteína que permite la formación de un puente disulfuro con el receptor del espacio intermembrana Mia40 (Chacinska, Koehler et al. 2009). Revisión Bibliográfica 19 Todas estas señales permiten la inserción de proteínas en la mitocondria a través de diferentes rutas de importe: Ruta de la presecuencia Los precursores proteicos que disponen de presecuencia se importan parcialmente plegados. El punto de entrada a la mitocondria es el complejo TOM (traslocasa de membrana externa), un complejo proteico construido entorno a Tom40, una proteína integral de membrana con estructura de barril beta que actúa de canal (Ahting, Thieffry et al. 2001). La preproteína se une al receptor Tom20 (Saitoh, Igura et al. 2007), que la transfiere a Tom22, y atraviesa Tom40 con la ayuda de Tom5. A continuación la proteína se libera del complejo TOM tras la interacción con Tim21 y se une a Tim50, el receptor de la traslocasa de membrana interna TIM23, con la que el complejo TOM establece una interacción transitoria (Chacinska, Lind et al. 2005; Tamura, Harada et al. 2009). A través de Tim50, la preproteína atraviesa Tim23 en un proceso que requiere del correcto potencial de membrana mitocondrial (Shariff, Ghosal et al. 2004; Krayl, Lim et al. 2007). Desde el Tim23, la proteína puede salir hacia la bicapa lipídica y anclarse en la membrana interna mitocondrial gracias a Tim17 (Martinez-Caballero, Grigoriev et al. 2007), o bien se une a la chaperona mtHsp70 perteneciente al motor de importe expuesto a matriz, PAM, y se trasloca a la matriz, en un proceso en el que participan Tim44, Pam16, Pam17 y Pam18 (Kozany, Mokranjac et al. 2004; Li, Dudek et al. 2004; Hutu, Guiard et al. 2008). Este proceso requiere gasto energético, esto es hidrólisis de ATP. Figura 7. Ruta de la presecuencia. Los precursores proteicos con señales amino-terminales atraviesan los complejos de importe parcialmente plegados. Atraviesan la membrana externa a través de la traslocasa de membrana externa, el complejo TOM. Distintas formas de complejo TIM23 median la traslocación completa del precursor hacia la matriz mitocondrial o bien su salida e inserción en la bicapa de la membrana interna, ambos procesos dependientes de potencial de membrana. Finalmente en ambos casos, la peptidasa procesadora de matriz (MPP) elimina la presecuencia. Imagen tomada de (van der Laan, Hutu et al. 2010). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 20 Ruta de los transportadores de metabolitos Estos precursores son altamente hidrofóbicos. Con el fín de evitar su agregación, se unen en el lado citoplásmico a chaperonas Hsp70 y Hsp90 formando complejos reconocibles por el receptor Tom70 (Wiedemann, Pfanner et al. 2001), el cual oligomeriza y permite la traslocación de los precursores a la subunidad Tom22 y de allí al interior del canal Tom40. Posteriormente, se unirán al complejo Tim9-Tim10 del espacio intermembrana (Curran, Leuenberger et al. 2002). Este complejo asocia la subunidad Tim12 en la superficie externa del complejo TIM22, que le permite interaccionar con Tim54, el receptor de la traslocasa TIM22 (Wagner, Gebert et al. 2008). Finalmente, TIM22 permite la inserción en la membrana de los precursores proteicos gracias al potencial de membrana. Figura 8. Ruta de los transportadores de metabolitos. (Chacinska, Koehler et al. 2009) Ruta de proteínas de espacio intermembrana Muchas de las proteínas del espacio intermembrana poseen motivos cisteína. Estos precursores utilizan el complejo TOM para su internalización en la mitocondria, vía Tom5, en estado reducido (Kurz, Martin et al. 1999). Una vez en el espacio intermembrana, se unen a Mia40 (mitocondrial intermembrane space assembly machinery) a través de un residuo hidrofóbico de su superficie y estableciendo un puente disulfuro con el motivo CPC de esta. La sulfidril oxidasa Erv1 se encarga del reciclaje por reoxidación de la proteína Mia40 reducida, transfiriendo los electrones al Cyt c (Muller, Milenkovic et al. 2008). Figura 9. Ruta de las proteínas del espacio intermembrana. (Chacinska, Koehler et al. 2009) Revisión Bibliográfica 21 Ruta de proteínas de membrana externa con estructura de barril β Inicialmente, los precursores de proteínas de tipo barril β, se dirigen al complejo TOM y a través de Tom40 pasan al espacio intermembrana. Allí se unen a los complejos Tim9Tim10 y Tim8-Tim13 (Hoppins y Nargang 2004) que los guían hasta el complejo SAM (Sorting and assembly machinery). SAM permite la liberación de los precursores en la membrana externa (Wiedemann, Kozjak et al. 2003). Se han descrito varias subunidades del complejo SAM y proteínas adicionales que modulan su actividad (Kozjak, Wiedemann et al. 2003; Gentle, Gabriel et al. 2004; Chan y Lithgow 2008). Figura 10. Importe y ensamblaje de las proteínas de membrana externa con estructura de barril β. Imagen tomada de (Chacinska, Koehler et al. 2009). Ruta de proteínas de membrana externa con estructura de hélice α Presentan diversos mecanismos de importe. Algunas no requieren de complejo TOM y su internalización esta mediada por Mim1, ya que contienen un segmento transmembrana que actúa de señal y al mismo tiempo permite su anclaje en la bicapa lipídica (Becker, Pfannschmidt et al. 2008; Hulett, Lueder et al. 2008). Otro grupo de precursores esta formado por aquellos que poseen en su extremo carboxilo una estructura en hélice. Esta cola hidrófoba permite su anclaje en membrana, aunque no se han descrito las insertasas involucradas (Setoguchi, Otera et al. 2006; Kemper, Habib et al. 2008). Otras, en cambio, requieren de la acción combinada de complejo TOM y del complejo SAM para su inserción (Stojanovski, Guiard et al. 2007). Un último grupo se inserta en la membrana gracias a Tom70, aunque no precisan de la acción de ningún otro componente del sistema de importe descrito hasta la fecha (Otera, Taira et al. 2007). Figura 11. Importe y ensamblaje de las proteínas de membrana externa con estructura de hélice α. Imagen tomada de (Chacinska, Koehler et al. 2009). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 22 1.4.3 Importe de RNAs Los RNAs sintetizados en el citoplasma translocados a la mitocondria son muy pocos comparados con el elevado número de proteínas que se importan y que son necesarias para la viabilidad celular. El importe mitocondrial de tRNAs ocurre en distintos microorganismos eucarióticos (protozoos, hongos y algas), en algunas plantas y en unos pocos animales pertenecientes a los filos Cnidaria y Mollusca (Schneider y MarechalDrouard 2000). En la mayor parte de los casos, el importe mitocondrial de los tRNAs se basa en la falta de dichos genes en los correspondientes genomas mitocondriales. En mamíferos, tradicionalmente se había considerado que no se produce importe de tRNAs codificados en el núcleo, sin embargo, intentos de compensar algunos defectos mitocondriales causados por la mutación en genes del tRNA, han demostrado la posibilidad de importar tRNA citoplasmáticos en mitocondrias humanas (Kolesnikova, Entelis et al. 2004; Mahata, Mukherjee et al. 2006; Karicheva, Kolesnikova et al. 2011). Este importe de tRNAs a la mitocondria parece que ocurre de manera fisiológica, pues se ha detectado la presencia del tRNAGln codificado en el núcleo en mitocondrias murinas y humanas (Rubio, Rinehart et al. 2008). Clásicamente se ha postulado que la síntesis del ribosoma mitocondrial precisaba tan sólo de los rRNAs codificados en la mitocondria (Attardi y Ojala 1971). Sin embargo se ha demostrado que existe de manera natural importe del rRNA 5S codificado en el núcleo a la mitocondria, pero a pesar de la existencia de evidencias en relación a su implicación en la síntesis proteica (Entelis, Kolesnikova et al. 2001), inicialmente no se detectó en los mitorribosomas (Yoshionari, Koike et al. 1994; Magalhaes, Andreu et al. 1998; Smirnov, Tarassov et al. 2008). Recientemente, gracias a modificaciones en el protocolo de purificación, se ha conseguido detectar su presencia en mitorribosomas murinos y humanos, y se ha dilucidado el mecanismo de traslocación a la mitocondria mediado por el precursor de la proteina ribosomal MRP-L18 (preMRPL-18) y la rodanasa (Smirnov, Entelis et al. 2011). Otros dos RNAs codificados en el núcleo, el componente RNA de la nucleasa MRP (mitochondrial RNA processing) y el componente de RNA de la Rnasa P, se importan a la mitocondria en humanos, pero su presencia dentro de la mitocondria es un tema controvertido (Puranam y Attardi 2001; Kamenski, Kolesnikova et al. 2007). 1.5 Control de calidad El doble origen genético del sistema de fosforilación oxidativa, exige la existencia de un sistema que ejerza un fuerte control y permita eliminar aquellos productos proteicos que se hallen en exceso. Este sistema de control de calidad, es también capaz de reconocer aquellas proteínas defectuosas incapaces de alcanzar su estado nativo, y de eliminarlas del orgánulo (Tatsuta y Langer 2008; Baker 2011). Se trata de un sistema proteolítico presente en la membrana interna mitocondrial, que se encuentra distribuido ubicuamente en eucariotas. Hay dos complejos proteolíticos dependientes de ATP embebidos en la membrana: las i-AAA proteasas son activas en el lado del espacio intermembrana, mientras que las mAAA proteasas exponen su centro catalítico hacia la matriz mitocondrial (Koppen y Langer 2007). Las m-AAA proteasas son diferentes isoenzimas formadas en humanos por subunidades de AFG3L2 que forman homo-oligómeros o hetero-oligómeros con paraplegina (SPG7). En ratones existe una subunidad adicional, llamada Afg3l1, que Revisión Bibliográfica 29 nucleares NDUFV2, NDUFV1 y NDUFS1, al menos), el módulo de la hidrogenasa (transfiere electrones a la ubiquinona e incluye las subunidades NDUFS2, NDUFS3, NDUFS7 y NDUFS8, al menos), y el módulo de transporte de protones, dispuesto en el brazo de membrana, compuesto al menos por todas las subunidades mitocondriales (Pagniez-Mammeri, Loublier et al. 2012). El proceso de ensamblaje de las diferentes subunidades que tiene lugar mediante módulos (Vogel, Smeitink et al. 2007; Perales-Clemente, Fernandez-Vizarra et al. 2010) precisa de diversos factores de ensamblaje que se han ido describiendo en los últimos años. En humanos, algunas de estas proteínas son NDUFAF1/CIA30, Ecsit, NDUFA12L/B17.2L/NDUFAF2, C20orf7, NDUFAF3, NDUFAF4 (McKenzie y Ryan 2010). 2.2.2 Complejo II El complejo II o succinato deshidrogenasa (EC 1.3.5.1) se localiza en la membrana interna mitocondrial expuesto hacia la matriz, y conecta la cadena transportadora de electrones con el ciclo de Krebs (Cecchini 2003). Oxida el succinato a fumarato con la consiguiente reducción del cofactor FAD. A continuación transfiere los electrones del FADH2 a la ubiquinona. Está formado por cuatro subunidades (SDHA-D) codificadas todas ellas en el núcleo (Hagerhall 1997). Las subunidades SDHA y SDHB forman el centro catalítico. SDHA contiene el cofactor FAD unido covalentemente y el sitio de unión del succinato. SDHB posee tres centros Fe-S que permiten la transferencia de electrones a la ubiquinona (Sun, Huo et al. 2005). SDHC y SDHD permiten el anclaje a la membrana interna. Sin embargo, la superficie de contacto de SDHB con SDHA y SDHC es similar, y el núcleo catalítico no existe como una entidad libre funcional en ausencia de las subunidades de anclaje a membrana, lo que sugiere que las subunidades de membrana participan de algún modo en la reacción enzimática (Rutter, Winge et al. 2010). Figura 16. Estructura cristalina del CII y representación del flujo de electrones. Las subunidades SDHA y SDHB se orientan hacia la matriz mitocondrial y llevan a cabo la reacción catalítica. SDHC y SDHD están embebidas en la membrana interna. Además de ser el único complejo de la cadena respiratoria con todas sus subunidades codificadas en el núcleo, es el único que no ejerce bombeo de protones. Se han descrito dos proteínas principales en el ensamblaje de CII, SDHAF1 y SDHAF2 (Ghezzi, Goffrini et al. 2009; Hao, Khalimonchuk et al. 2009). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 30 2.2.3 Complejo III El complejo III, también llamado complejo citocromo bc1 o ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa (EC 1.10.2.2), transfiere electrones desde el CoQ reducido al Cyt c en un proceso acoplado a la traslocación de cuatro protones hacia el espacio intermembrana. Tiene una estructura de homodímero simétrico y se localiza en la membrana interna. En mamíferos, cada “monómero” consta de 11 subunidades. De todas ellas sólo MTCYB se codifica en el mtDNA. Tres subunidades forman el centro catalítico de la enzima y contienen centros metálicos que permiten la transferencia electrónica: citocromo b (MTCYB), citocromo c1 (CYC1), y la proteína de Rieske Fe-S (UQCRFS1 ó RISP). Citocromo b posee 8 hélices transmembrana, mientras que Cyc1 y la proteína de Rieske se anclan a la membrana a través de un solo dominio transmembrana y exponen sus dominios globulares, conteniendo el hemo c y 2 grupos Fe-S respectivamente, hacia el espacio intermembrana. Figura 17. Estructura de CIII dimérico de mitocondrias bovinas. El código de color de cada subunidad se detalla a la izquierda, y los grupos prostéticos aparecen según el modelo de bolas y palos. Las dos líneas horizontales representan los límites de la membrana interna mitocondrial. Figura tomada de (Xia, Esser et al. 2007). Se desconoce el papel de las subunidades UQCRC1 (core1), UQCRC2 (core2) y UQCRH (subunidad 6) en el complejo enzimático. UQCRB (subunidad 7) y UQCRQ (subunidad 8) intervienen en la unión de la ubiquinona. UQCR10 (subunidad 9) interacciona con el citocromo c1 y la subunidad 10 podría unir la proteína de Rieske (Diaz, Kotarsky et al. 2011). Respecto al proceso de ensamblaje de CIII, el factor de ensamblaje BCS1L, tal y como su homólogo en S. cerevisiae, Bcs1p, interviene en los estadios finales al promover la inserción de RISP en el precomplejo citocromo bc1 (Cruciat, Hell et al. 1999; FernandezVizarra, Bugiani et al. 2007). TTC19 es la otra proteína que actúa como factor de ensamblaje del CIII en mamíferos descrita hasta la fecha (Ghezzi, Arzuffi et al. 2011). Revisión Bibliográfica 31 2.2.4 Complejo IV El complejo IV o Citocromo c oxidasa (COX, EC 1.9.3.1) es el complejo final de la cadena transportadora de electrones. Cataliza la transferencia electrónica desde el Cyt c reducido al oxígeno molecular. El complejo IV está formado por 13 subunidades. El centro catalítico del complejo está formado por las subunidades mitocondriales MTCO1 y MTCO2 que contienen los motivos hemo a y hemo a3 y los centros CuA y CuB necesarios en la transferencia de electrones. MTCO3, la subunidad mitocondrial restante, forma parte del núcleo estructural de la enzima y podría promover la traslocación de protones. Las 10 subunidades codificadas en el núcleo podrían tener un papel de regulación o estabilización (Arnold y Kadenbach 1997). También se han descrito isoformas específicas de tejido para varias de las subunidades nucleares de COX (Ewart, Lightowlers et al. 1990; Kennaway, Carrero-Valenzuela et al. 1990), entre ellas, COX6A y COX7A presentan isoformas específicas de corazón e hígado (Grossman y Lomax 1997), COX6B2 es una isoforma específica de testículo y también existe una isoforma específica de pulmón en el caso de COX4 (Fernandez-Vizarra, Tiranti et al. 2009). Figura 18. Estructura de complejo IV de mitocondria bovina y mecanismo de bombeo protónico acoplado al flujo electrónico. Figura tomada de (Popovic y Stuchebrukhov 2011). En S. cerevisiae, se han descrito en torno a 20 proteínas necesarias para el ensamblaje del CIV, de las cuales más de la mitad tienen descritas proteínas ortólogas en humanos. SURF1, COX10, COX15, SCO1 y SCO2 son algunos de los factores de ensamblaje de CIV (Diaz, Kotarsky et al. 2011). 2.2.5 Complejo V La ATP sintasa mitocondrial o complejo V (EC 3.6.3.14) aprovecha la energía generada por la cadena transportadora de electrones en la creación de un gradiente de protones en el espacio intermembrana para llevar a cabo la fosforilación del ADP. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 32 Figura 19. Estructura de complejo V o ATP sintasa. A) Estructura de PDB. B) Representación esquemática de las subunidades de CV, tomada de (Kucharczyk, Zick et al. 2009). Se pueden distinguir dos módulos funcionales conectados por un tallo (Futai, Noumi et al. 1989; Boyer 1993; Lutter, Saraste et al. 1993). La región F1 se localiza en la matriz mitocondrial constituyendo la fracción soluble de la enzima y se compone de cinco subunidades distintas ensambladas en una estequiometría de 3α:3β:1δ:1γ:1ε (Abrahams, Leslie et al. 1994). Esta región forma el dominio catalítico de la ATP sintasa. La región FO se encuentra anclada en la membrana interna mitocondrial, está compuesta por ocho tipos de proteínas (a, b, c, d, e, f, g y A6L). El tallo central contiene alguna de las proteínas de la región F1 (δ, γ, ε) y el periférico se compone de las subunidades OSCP, F6, b y d (Collinson, Runswick et al. 1994; Stock, Leslie et al. 1999). Las subunidades a y A6L se encuentran codificadas en el mtDNA, en los genes mt-Atp6 y mt-Atp8 respectivamente (Anderson, Bankier et al. 1981) y el resto, en el genoma nuclear. La región FO funciona como un poro de protones y dirige la energía liberada en la disipación del gradiente electroquímico a la parte F1 que es donde se forma el ATP. La energía se transfiere de una parte a otra mediante un mecanismo de motor rotatorio (Stock, Leslie et al. 1999). Cuando disminuye el gradiente de protones, la ATP sintasa puede funcionar de modo inverso, es decir, es capaz de hidrolizar ATP para bombear protones al espacio intermembrana y así contribuir a mantener el potencial de membrana. La actividad hidrolítica del complejo V se regula mediante la unión de la proteína inhibitoria natural IF1 (Cabezon, Montgomery et al. 2003). En mamíferos, se han descrito otras dos subunidades asociadas tanto al complejo V monomérico como dimérico, llamadas DAPIT (diabetes-associated protein in insulinsensitive tissue) y el proteolípido mitocondrial de 6,8 kDa (Meyer, Wittig et al. 2007). Estas subunidades no parecen vincularse a la actividad hidrolítica del complejo. Recientemente se ha demostrado que la ausencia de DAPIT conlleva la disminución en la actividad de CV (Ohsakaya, Fujikawa et al. 2011). Revisión Bibliográfica 33 2.2.6 Transportadores móviles La transferencia electrónica entre los complejos respiratorios tiene lugar gracias a la acción de dos transportadores móviles de electrones, moléculas capaces de adoptar diferentes formas redox y de trasladarse de un lugar a otro en la bicapa lipídica conectando así los complejos entre sí. Estos transportadores móviles son la ubiquinona o coenzima Q (CoQ), que permite conectar los complejos I o II con el CIII, y el Cyt c que conecta CIII y CIV. El CoQ presenta tres estados redox: totalmente oxidado (ubiquinona), radical semiquinona (ubisemiquinona) y totalmente reducido (ubiquinol). Es una molécula muy hidrofóbica que puede presentarse unida a proteínas o disuelta en bicapas lipídicas. Los sitios de unión a CoQ en proteínas no siguen unos patrones comunes, aunque sí se observan características análogas: la interacción del CoQ con la proteína tiene lugar en un sitio hidrófobo a través de puentes de H entre motivos carbonilo/hidroxilo y el anillo quinona/quinol queda flanqueado por residuos alifáticos o aromáticos. Se requieren también interacciones con la cadena lateral del CoQ para evitar competición. Se observa la conservación de un residuo histidina para el enlace de puentes de H, inserto en una secuencia de aminoácidos con la estructura alifático-[X]3-H-[X]2/3-[L/T/S] (Lenaz y Genova 2009). En cuanto a la difusión lateral en bicapas lipídicas artificiales y naturales, los coeficientes de difusión varían en función de la técnica empleada, pero los resultados más fidedignos apuntan a un coeficiente >10-6 cm2/s (Fato, Battino et al. 1986). Además de actuar en la transferencia electrónica entre complejos repiratorios, se le ha descrito una función antioxidante en su forma reducida, interrumpiendo la iniciación del proceso de peroxidación lípidica (Ernster y Dallner 1995), y también un papel protector frente a la apoptosis, inhibiendo la apertura del poro de transición PTP (Yamamura, Otani et al. 2001; Papucci, Schiavone et al. 2003; Naderi, Somayajulu-Nitu et al. 2006). Figura 20. Estructuras del Coenzima Q y Citocromo c. A) Estructura química del coenzima Q, en su forma oxidada o ubiquinona. B) Estructura tridimensional del citocromo c. Imagen adaptada de Protein Data Bank. El citocromo c (Cyt c) es una proteína de 104 aminoácidos, que actúa como transportador de electrones hidrosoluble y se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria. Cumple al menos cinco funciones conocidas: la transferencia de electrones desde CIII al CIV, la iniciación de la apoptosis formando un complejo con Apaf-1 para activar la caspasa-9 (Liu, Kim et al. 1996), actúa como cardiolipina oxigenasa en las etapas iniciales de la apoptosis (Kagan, Tyurin et al. 2005; Belikova, Jiang et al. 2007), actúa como dador de electrones para p66Shc, como scavenger de superóxido (Skulachev 1998; Trinei, Berniakovich et al. 2009), y como aceptor de electrones en la traslocación de proteínas del espacio intermembrana con puentes disulfuro (Chacinska, Koehler et al. 2009). A B Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 34 2.3 Organización del sistema OXPHOS La organización del sistema de fosforilación oxidativa dentro de la membrana interna mitocondrial ha resultado ser mucho más complicada de lo que se suponía inicialmente. Tradicionalmente, se han propuesto dos modelos contrapuestos. El “modelo fluido” postula que los complejos de la cadena difunden libremente por la membrana y la transferencia de electrones tiene lugar en función de las colisiones arbitrarias entre los complejos y los transportadores móviles (Hackenbrock, Chazotte et al. 1986). Frente a este, el “modelo sólido” propone la asociación entre los complejos I-IV siguiendo una secuencia ordenada (Chance y Williams 1955). El aislamiento o reconstitución de ensamblados estequiométricos de dos o más complejos y algunos estudios cinéticos apoyaron este último modelo (Garfinkel 1957; Fowler y Richardson 1963), sin embargo el que se impuso fue el modelo fluido debido al hecho experimental de que todos los complejos del sistema OXPHOS pueden ser purificados individualmente, manteniendo su actividad enzimática, y a demostraciones cinéticas (Kroger y Klingenberg 1973; Hackenbrock, Chazotte et al. 1986). En la última década, sin embargo, se han publicado numerosos trabajos que han avivado de nuevo el debate entre los dos modelos. Diversas observaciones experimentales apoyan la existencia de interacciones estables entre los complejos del sistema OXPHOS, formando los denominados supercomplejos: 1) En levaduras, usando inhibidores específicos de la cadena, se ha encontrado que la cadena respiratoria se encuentra organizada en una unidad funcional (Boumans, Grivell et al. 1998). También en mamíferos hay datos cinéticos en este sentido (Bianchi, Genova et al. 2004; Genova, Bianchi et al. 2005; Lenaz y Genova 2009). 2) Los supercomplejos pueden ser separados mediante técnicas electroforéticas cuasi-nativas (Blue-Native) y gradientes de densidad (Schagger y Pfeiffer 2000; Eubel, Jansch et al. 2003). 3) El consumo de oxígeno en mitocondrias aisladas de patata se encuentra relacionado con la abundancia de supercomplejos (Eubel, Heinemeyer et al. 2004). También se ha visto asociación entre la tasa respiratoria y la cantidad de supercomplejos ensamblados (D'Aurelio, Gajewski et al. 2006), así como cambios en la abundancia de supercomplejos y en la tasa respiratoria asociados a envejecimiento y fallo cardiaco en mamíferos (Rosca, Vazquez et al. 2008; Gomez, Monette et al. 2009). 4) Las estructuras obtenidas por diversas técnicas basadas en la microscopía electrónica, correlacionan con la superposición de las estructuras cristalinas de los diferentes complejos OXPHOS y permiten vislumbrar las interacciones entre ellos dentro de los supercomplejos (Dudkina, Eubel et al. 2005; Minauro-Sanmiguel, Wilkens et al. 2005; Schafer, Seelert et al. 2006; Heinemeyer, Braun et al. 2007; Dudkina, Kudryashev et al. 2011). 5) Los supercomplejos aislados presentan capacidad para transferir electrones desde el NADH hasta el oxígeno (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Desde un punto de vista funcional, se ha propuesto que la existencia de supercomplejos teóricamente conferiría varias ventajas, entre ellas la canalización más eficiente de los electrones a través de las moléculas transportadoras (Genova, Bianchi et al. 2005; D'Aurelio, Gajewski et al. 2006), la disminución en la producción de ROS, o la estabilización de los complejos para su correcto ensamblaje. En este sentido, estudios con Revisión Bibliográfica 35 pacientes y modelos celulares de ratón portadores de mutaciones en distintos complejos han revelado que los complejos III y IV son esenciales para la estabilización del complejo I (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004; Schagger, de Coo et al. 2004; Diaz, Fukui et al. 2006). Por otra parte, la ausencia de citocromo c repercute en el ensamblaje del complejo IV, afectando secundariamente al ensamblaje de CI y de supercomplejos (Vempati, Han et al. 2009). Tanto el modelo fluido como el de ensamblaje en supercomplejos se asientan solamente sobre algunas de las observaciones experimentales realizadas en relación a la naturaleza del sistema OXPHOS, permitiendo una explicación parcial del mismo. Por ello, se ha sugerido que la integración de las observaciones realizadas debe ocurrir a través de la coexistencia de ambas formas de organización del sistema OXPHOS, en una manera dinámica (Boekema y Braun 2007). Conforme a estos principios y en base a las observaciones realizadas en nuestro laboratorio, nuestro grupo ha propuesto un tercer modelo para la organización del sistema de fosforilación oxidativa. Este modelo se ha denominado “modelo de plasticidad” y propone que los complejos pueden aparecer individualmente o bien establecer diversas asociaciones entre ellos formando diferentes tipos de supercomplejos. Este modelo ofrece una visión más dinámica que permitiría adaptar la disposición de los elementos del sistema OXPHOS a las necesidades energéticas y fisiológicas de la célula (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Figura 20. Modelos organizativos del sistema OXPHOS. A) Modelo fluido. B) Modelo sólido. C) Modelo de plasticidad. El código con el que se representan los complejos individuales se describe en A), las estrellas rojas representan el CoQ y los triángulos morados el Cyt c. Sólo se representa una unidad de cada complejo aunque la estequiometría puede variar. Figura tomada de (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 36 Todavía se ha propuesto un nivel superior de organización del sistema OXPHOS, en estructuras macromoleculares superiores a los SC. Estas consistirían en el ensamblaje de SC sucesivos formando una estructura lineal, a la que se ha denominado cordones respiratorios (Wittig, Braun et al. 2006). La composición de los mismos podría variar en función del organismo. En plantas se han sugerido diversos modelos constructivos de cordón. El más reciente, en mitocondria de patata, define el cordón como estructuras compuestas por unidades de I2+III2+IV2 repetitivas que se conectarían entre sí a través de CIV contiguos (Bultema, Braun et al. 2009). Nuevas técnicas electroforéticas están desarrollándose para permitir el análisis de estos cordones respiratorios (Strecker, Wumaier et al. 2010). 2.4 Supercomplejos respiratorios La asociación de los complejos respiratorios en supercomplejos (SC) es un fenómeno universalmente descrito en todos los eucariotas. Sin embargo, la composición de los mismos difiere en función de la especie y el tipo de tejido, variando la cantidad relativa de los mismos. El complejo I se ha visto asociado a CIII en muchos organismos, a través de una asociación estable formando SC I+III2 (Dudkina, Eubel et al. 2005; Peters, Dudkina et al. 2008). Esta asociación es la forma más abundante en plantas (Eubel, Heinemeyer et al. 2004). La asociación de complejos III+IV formando SC se ha descrito ampliamente en mitocondrias vegetales (Eubel, Jansch et al. 2003; Eubel, Heinemeyer et al. 2004; Krause, Reifschneider et al. 2004; Dudkina, Heinemeyer et al. 2006). El complejo III dímero se puede asociar hasta con cuatro copias de CIV. La más estudiada es la forma en que se asocia a una o dos copias de CIV. La estructura de este tipo de SC se estudió en primer lugar en S. cerevisiae (Heinemeyer, Braun et al. 2007), ya que este organismo carece de complejo I multimérico, y se observó que hasta dos CIV monoméricos se unen a ambos lados de CIII dímero a través de su cara convexa. Esta misma disposición se ha descrito para el SC III2+IV1 en mitocondria de patata (Bultema, Braun et al. 2009). Figura 21. Supercomplejos III2+IV2 (AC) y III2+IV1 (D) en mitocondrias de levadura. Se representa la proyección de la estructura pseudo-atómica de complejo bc1 de levadura (en rojo) y de complejo IV de mitocondria bovina (en verde), sobre la imagen obtenida mediante microscopía electrónica de los supercomplejos III2+IV2 y III2+IV1. En amarillo se representa la posición que ocuparía la membrana interna. Las figuras E y F representan mapas alternativos de la estructura de supercomplejos, que como indican las flechas rojas, se ajustan peor a la imagen de ME. (Heinemeyer, Braun et al. 2007). Revisión Bibliográfica 37 En mitocondrias de corazón bovino, la cantidad de CI que forma SC I+III2 es del 17% respecto del CI total, mientras que un 67% aparece en asociaciones I+III2+IVn. Estos datos sugieren que la cantidad de CI libre in vivo, en ausencia de detergentes, es casi nula (Schagger y Pfeiffer 2001). De acuerdo con la estequiometría de los complejos del sistema OXPHOS en que I:III es 1.1:3, es plausible que un tercio del CIII total permanezca libre en mitocondria bovina. La fracción de CIV libre, en cambio, representa un 85% del CIV total. A los SC formados por unidades de complejos I, III y IV se les denominó también respirasomas (Schagger y Pfeiffer 2000), ya que se consideraron capaces de reducir el oxígeno, como se ha demostrado posteriormente (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). El primer mapa 3D del respirasoma bovino, propone que los sitios de unión de la ubiquinona y el Cyt c se hallan próximos (Schafer, Dencher et al. 2007), aunque la estructura presentaba diferencias con respecto al modelo que Dudkina y colaboradores habían propuesto anteriormente para la unión entre CIII y CI en mitocondrias vegetales (Dudkina, Eubel et al. 2005). En Arabidopsis, el CIII2 se une al final del brazo de membrana del CI. En mamíferos en cambio interaccionaría con el brazo de membrana del CI en su parte media y es el CIV el que se uniría al final del brazo de membrana de CI. Más recientemente Dudkina et al corrigen resultados anteriores y concluyen que no existen diferencias en la unión de CIII al CI entre mamíferos y plantas. Así, el CIII se uniría al CI en la parte interna de su curvatura. En cambio, en esta aproximación no llegan a precisar la posición de CIV en el respirasoma bovino (Dudkina, Kouril et al. 2010). Para la determinación de esta posición, han presentado un nuevo mapa, coherente con los resultados del primer mapa 3D bovino, según el cual ambos complejos parecen conectar uno con otro en la parte de la membrana próxima a la matriz y la distancia propuesta para la difusión del citocromo c entre CIII y CIV sería de 10 nm, mientras que la distancia propuesta para el SC III+IV es inferior a 4 nm (Dudkina, Kudryashev et al. 2011). Figura 22. Estructura del respirasoma bovino. A) Mapa generado por (Schafer, Dencher et al. 2007). B) Mapa propuesto por (Dudkina, Kudryashev et al. 2011). También se ha descrito la formación de dímeros para el CV en levadura, Arabidopsis y también en mitocondrias bovinas (Arnold, Pfeiffer et al. 1998; Schagger y Pfeiffer 2000; Eubel, Jansch et al. 2003; Minauro-Sanmiguel, Wilkens et al. 2005; Couoh-Cardel, UribeCarvajal et al. 2010). En todos los organismos estudiados dos monómeros de CV se asocian a través de las partes de membrana de las FO, formando un ángulo fijo o variable de entre 35º y 90º. Sin embargo asociaciones mayores de complejos ATP sintasa se han descrito más recientemente. Así, largas cadenas constituidas por dímeros de CV se localizan en el límite donde se produce la curvatura en la membrana de las crestas laminares (Davies, Strauss et al. 2011). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 38 Figura 23. Reconstrucción 3D del dímero de ATPsintasa. A) y B) Representación en superficie de la reconstrucción para el dímero de ATPasa de levadura con mediciones de las distancias características, vista frontal y superior respectivamente. C) y D) Proyección del modelo atómico de referencia sobre la reconstrucción 3D, e identificación de las subunidades estructurales. Imagen tomada de (Couoh-Cardel, Uribe-Carvajal et al. 2010). 2.5 Ensamblaje de supercomplejos Así como para el ensamblaje de los complejos individuales se dispone de diversos modelos y se conoce la participación de proteínas accesorias o factores de ensamblaje, poco se sabe en relación al proceso constructivo de los supercomplejos. Experimentos de pulso-caza revelaron que la formación de los SC tiene lugar una vez que se ensamblan los complejos individuales, debido al lapso de tiempo entre la detección de los complejos individuales completamente ensamblados y la aparición de supercomplejos (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Sin embargo, en células humanas, la interferencia de Cox17 sugiere que la formación de supercomplejos no tiene lugar con posterioridad a la de los complejos individuales, sino que el ensamblaje y asociación entre complejos individuales es un proceso coordinado (Oswald, KrauseBuchholz et al. 2009). En esta misma dirección, otros estudios concluyen que la asociación de CI a otros complejos para formar SC tiene lugar antes del completo ensamblaje del CI individual (Lazarou, Smith et al. 2009; Moreno-Lastres 2012). Por otro lado es necesario esclarecer la participación de factores de ensamblaje en este proceso de construcción de los SC. Hasta la fecha no hay descrito ningún factor proteico implicado. Sí existen evidencias acerca del papel de moléculas de lípidos en la interacción entre complejos. En este sentido, se ha descrito que la cardiolipina tiene un papel estabilizador de la interacción de los supercomplejos III2+IV en levadura y humanos (Zhang, Mileykovskaya et al. 2005; McKenzie, Lazarou et al. 2006). Se ha propuesto que promueve una neutralización de carga de la hélice transmembrana del Cyt c1 que aparece en la interfaz entre ambos complejos. La deficiencia en cardiolipina descrita en el síndrome de Barth se asocia a la desestabilización de los SC, particularmente la asociación de CIV (McKenzie, Lazarou et al. 2006). Revisión Bibliográfica 45 MTATP6. En un estudio (Nijtmans, Henderson et al. 2001) muestran una reducción en el complejo ensamblado y una acumulación de varios subcomplejos de bajo peso molecular, mediante técnicas de BNGE. En otro encuentran que el complejo V en líneas celulares con las mutaciones T8993C o T8893G, mantiene su integridad estructural, aunque la actividad se ve seriamente afectada (Cortes-Hernandez, Vazquez-Memije et al. 2007). También se ha descrito una mutación en MTATP8 en un paciente con cardiomiopatía hipertrófica y neuropatía. Esta mutación se asocia con disminución de la actividad, del ensamblaje del complejo entero y con la acumulación de subcomplejos (Jonckheere, Hogeveen et al. 2008). En cuanto a los factores de ensamblaje, una mutación sin sentido en la proteína ATP12 se ha descrito en un paciente con defecto de CV que presentaba acidosis láctica severa, cardiomiopatía hipertrófica y aciduria metilglutagónica (De Meirleir, Seneca et al. 2004). Se han descrito mutaciones en TMEM70 asociadas a déficit de CV (Cizkova, Stranecky et al. 2008). 3.6 Consecuencias metabólicas de los defectos en OXPHOS Consecuencias sistémicas Generalmente, los pacientes con defectos en el sistema OXPHOS presentan niveles altos de ácido láctico e intermediarios del ciclo de Krebs en sangre, orina y líquido cefalorraquídeo, además de a nivel tisular. El aumento en la producción de ácido láctico se debe a la fermentación mediante la NADH lactato deshidrogenasa del piruvato acumulado debido a la inhibición del sistema OXPHOS y el ciclo de Krebs. El exceso de ácido láctico puede provocar acidosis láctica. Además el desequilibrio NADH/NAD+ puede conducir a un aumento en la proporción de cuerpos cetónicos (Munnich, Rustin et al. 1992) La concentración sanguínea de alanina está elevada en la mayor parte de los pacientes, ya que su síntesis a partir de piruvato por la enzima alanina aminotransferasa es dependiente de los niveles de este sustrato. En algunos casos, los pacientes pueden presentar aumento de prolina o disminución de citrulina (Rabier, Diry et al. 1998). También se ha asociado diabetes a pacientes con defectos OXPHOS, debido a una secreción inapropiada de insulina por las células beta pancreáticas producida por la defectuosa señalización mediada por glucosa (Walker, Taylor et al. 2005). Consecuencias a nivel celular y tisular La insuficiente producción de ATP para hacer frente a las demandas energéticas de la célula, es una de las consecuencias inmediatas del defecto en OXPHOS, pero no tiene por qué ser la consecuencia más relevante. Este defecto repercutirá mayoritariamente en aquellos tejidos como cerebro, corazón o músculo, que requieren un aporte elevado. En cambio, procesos vitales para todas las células como el transporte de metabolitos y de iones (fosfato, sodio, calcio o potasio), dependen de un gradiente protónico y potencial de membrana generado por un sistema OXPHOS funcional. Un ejemplo es la internalización de calcio en la mitocondria tras el aumento de sus niveles citoplásmicos en algunas cascadas de señalización intracelular. Pacientes con sistema OXPHOS defectuosos han mostrado defectos en la homeostasis de calcio (Kawamata y Manfredi 2010). Por otro lado la inhibición del sistema OXPHOS provoca desequilibrios redox, acumulándose aquellos intermediarios o transportadores previos al defecto de complejo Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 46 en estado reducido y en estado oxidado los transportadores posteriores. Esto puede tener efectos en aquellas rutas metabólicas dependientes de estas moléculas con capacidad de ceder o donar electrones. Un ejemplo es la inhibición de la síntesis de las pirimidinas, debido a la inhibición de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa como consecuencia de la acumulación de CoQ reducido debido al defecto en CIII o CIV (Hirano, Nishigaki et al. 2004). El defecto en el sistema OXPHOS también repercute en la generación de especies reactivas de oxígeno. Los complejos respiratorios I y III son la principal fuente de ROS (superóxido y H2O2, que pueden dar lugar al radical hidroxilo). En condiciones normales se producen bajas cantidades de ROS que pueden actuar como señalizadores intracelulares y se pueden detoxificar por varias enzimas, entre ellas la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa. Con la cadena bloqueada, la producción de ROS se incrementa y se puede producir daño oxidativo (Balaban, Nemoto et al. 2005; Koopman, Verkaart et al. 2005). Debido al papel de la mitocondria en el inicio del proceso apoptótico, el defecto en el sistema OXPHOS puede desencadenar la desrregulación de este proceso (Smeitink, Zeviani et al. 2006). Revisión Bibliográfica 47 4. TERAPIA MITOCONDRIAL Actualmente no existe una terapia efectiva para las enfermedades mitocondriales, aunque se han desarrollado numerosas estrategias que, por el momento, son sólo terapias paliativas. Entre ellas, la suplementación de la dieta con carnitina, CoQ, tiamina, succinato o ácido fólico; la eliminación de metabolitos nocivos como el lactato; la administración de antioxidantes; el tratamiento de los síntomas mediante ejercicio, cirugía (implantes cocleares, transplante hepático o cardiaco, corrección de ptosis) y también el consejo genético. Algunas de las estrategias actuales que se están investigando se revisan a continuación. Una de las perspectivas terapéuticas actuales es el aumento de la biogénesis mitocondrial, y por consiguiente el número de mitocondrias, mediante la estimulación de coactivadores de la transcripción mitocondrial (PGC-1, PGC-1 y PRC) (Schon, DiMauro et al. 2010). Estudios en ratón deficiente en Cox10 han mostrado una recuperación completa del fenotipo normal tras la sobreexpresión de PGC-1α mediante terapia génica, y de un 85 % tras la administración de bezafibrato, un agonista de PGC-1α (Wenz, Diaz et al. 2008). Aunque en otro estudio con el bezafibrato no se logró la recuperación de la actividad en otros tres modelos animales de déficit de COX, sí que se consiguió parcialmente activando el eje AMPK/PGC-1 mediante la administración de AICAR (Viscomi, Bottani et al. 2011). Otra estrategia prometedora es la manipulación de la dinámica mitocondrial, mediante agentes farmacológicos. Las mitocondrias son orgánulos con gran capacidad para fusionarse y dividirse, y redistribuir los nucleoides, logrando incluso la complementación entre diferentes moléculas de mtDNA. Se ha propuesto que aumentando los procesos de fusión, podría alcanzarse una complementación funcional entre diferentes moléculas de DNA mitocondrial y al mismo tiempo, debido a la estrecha relación de este proceso de fusión con la autofagia, eliminar las mitocondrias que contienen elevados niveles de mtDNA mutante (Schon, DiMauro et al. 2010). Otro grupo de aproximaciones terapéuticas proponen el uso de distintas estrategias de terapia génica como posible alternativa para el tratamiento de las enfermedades mitocondriales. Éstas aproximaciones son: 1) Eliminar el gen mutante. Para las enfermedades que tienen su origen en fallos en el mtDNA, las aproximaciones más prometedoras se basan en reducir la proporción de genomas mutados respecto al genoma sano, es decir, en reducir la heteroplasmia. Se han propuesto distintas estrategias: 1.a) Inhibir la replicación de las moléculas de mtDNA mutantes. Para ello se necesita una molécula que se una selectivamente al mtDNA mutado e inhiba su replicación, permitiendo así la propagación del mtDNA sano, eliminando de este modo el defecto OXPHOS. Dicha estrategia se basa en el uso de ácidos peptidonucléicos o PNAs (peptide nucleic acids) moléculas sintéticas análogas a ácidos nucleicos (Egholm, Buchardt et al. 1993; Muratovska, Lightowlers et al. 2001; Muratovska, Lightowlers et al. 2001). 1.b) Eliminación de las moléculas de mtDNA mutante mediante corte con enzimas de restricción dirigidas a la mitocondria. Estrategia utilizada con éxito tanto en células en cultivo (Srivastava y Moraes 2001) como en ratones heteroplásmicos (Bayona-Bafaluy, Blits et al. 2005; Bacman, Williams et al. 2007). Dicha estrategia ve limitada su aplicación a secuencias generadas por una mutación patológica que Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 48 reconoce una determinada enzima de restricción, por ello se ha propuesto el uso de nucleasas con dominios de dedos de Zn, que se pueden unir a secuencias de DNA predeterminadas y cortar la doble hebra (Minczuk, Papworth et al. 2008). 1.c) Una estrategia recientemente llevada a cabo en modelos animales y en humanos es la manipulación de los oocitos maduros o de los zigotos para eliminar las moléculas de mtDNA maternas, en aquellos casos en que la madre presenta una mutación en genes mitocondriales. En el estudio realizado en Macaca mulata con oocitos maduros parados en segunda metafase, se realizó una transferencia de los complejos cromosoma-huso acromático de la madre a oocitos enucleados de una hembra sin parentesco. Una vez realizada la transferencia y fusión utilizando un extracto de virus Sendai, los complejos cromosoma-huso acromático se mantuvieron intactos. Posteriormente se realizó la fecundación del oocito y se prosiguió el desarrollo embrionario con normalidad. Los monos nacidos fueron todos sanos. Esta técnica ha requerido la optimización de las técnicas de visualización de DNA para evitar su daño (Tachibana, Sparman et al. 2009). Figura 25. Transferencia de complejo cromosómico-huso acromático. A) Distribución de DNA nuclear (azul, tinción con DAPI) y de las mitocondrias (rojo, Mitotracker red) en el oocito arrestado en fase MII.B) Observación de oocito MII bajo microscopio de luz polarizada. C) Extracción de complejo cromosómico-huso acromático. D) Comparativa de los tamaños de carioplasto y citoplasto. E y F) Oocitos regenerados. Tinción DNA nuclear con DAPI (azul), y anticuerpo αtubulina (verde). (Tachibana, Sparman et al. 2009) En el estudio en humanos, a partir de oocitos fecundados artificialmente con el objetivo de producir zigotos portando uno o tres pronúcleos, se produjo una transferencia de los pronúcleos a un zigoto receptor previamente enucleado (Craven, Tuppen et al. 2010). El desarrollo embrionario se permitió hasta la etapa de blastocisto. Los análisis revelaron que en esta técnica se produce un arrastre de mtDNA junto al pronúcleo variable entre blastómeros de un mismo individuo. Los aspectos éticos de esta transferencia de citoplasmas todavía deben ser discutidos. En cualquier caso, este mismo grupo señala haber realizado la técnica de transferencia Revisión Bibliográfica 49 cromosómica desarrollada en monos y no encontraron diferencias significativas en cuanto al resultado y arrastre de mtDNA entre las dos técnicas. Figura 25. Esquema de la técnica de transferencia de pronúcleos. A partir de zigotos producidos artificialmente portadores de una mutación en el mtDNA, se produce una transferencia de pronúcleos a un zigoto receptor previamente enucleado, que es donante de un mtDNA sano. (Craven, Tuppen et al. 2010) 2) Introducir el gen sano. Actualmente no existe ninguna técnica que permita introducir un gen exógeno dentro de la mitocondria, con la excepción de las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae y Chlamydomonas reinhardtii mediante biolística (Bonnefoy y Fox 2007; Bonnefoy, Remacle et al. 2007). Por tanto, se ha propuesto la expresión funcional del mismo gen mitocondrial que el que presentaba la mutación, mediante su inserción en el núcleo (Expresión Alotópica). Esta estrategia se basa en la síntesis de la proteína por los ribosomas citoplasmáticos y su importe a la mitocondria, donde reemplazaría a la proteína mutada. Durante muchos años se ha considerado una técnica de terapia génica mitocondrial prometedora, aunque existen numerosos trabajos con resultados contradictorios en mitocondrias de mamíferos (Guy, Qi et al. 2002; Manfredi, Fu et al. 2002; Oca-Cossio, Kenyon et al. 2003; Bokori-Brown y Holt 2006; Bonnet, Augustin et al. 2008) En un trabajo reciente de nuestro grupo se cuestiona la viabilidad de esta aproximación y explica los motivos de las discrepancias existentes entre los diferentes trabajos publicados (Perales-Clemente, Fernandez-Silva et al. 2011). 3) Xenoexpresión de enzimas alternativas. Esta estrategia se basa en el uso de vías alternativas al transporte electrónico en la cadena respiratoria. Se ha demostrado que la expresión de la NADH deshidrogenasa de levadura NDI1 en células de ratón deficientes en complejo I restablece la capacidad de crecer en medios no fermentables (Seo, Kitajima-Ihara et al. 1998; Bai, Hajek et al. 2001). Además, la generación de virus asociados a adenovirus expresando NDI1, (rAAVNDI1), ha permitido obtener altas tasas de transfección en células de roedores (incluidas las neuronales), y demostrar que éstas pueden sobrevivir en presencia de inhibidores de complejo I, que in vivo producen parkinsonismo en roedores, (rotenona y 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPTP) (Seo, Nakamaru-Ogiso et al. 2006). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 50 Posteriormente, se ha demostrado el efecto neuroprotector de la enzima NDI1 en un modelo de la enfermedad de Parkinson en ratas, mediante tratamiento con rotenona (Marella, Seo et al. 2008). El efecto protector propuesto se basa en la restauración de la parte de la cadena dañada y en la reducción de la producción de radicales libres. La expresión de la oxidasa alternativa AOX podría proporcionar una opción en el caso de deficiencias en la vía del citocromo. Esta enzima ha sido expresada en células humanas sanas en cultivo, comprobando que su expresión no resulta tóxica y las hace parcialmente resistentes al cianuro y a la antimicina A, inhibidores de los complejos IV y III respectivamente (Hakkaart, Dassa et al. 2006). Dicha oxidasa alternativa es capaz de permitir la supervivencia de moscas que tienen disminuida parcialmente la expresión del factor de ensamblaje del complejo IV Surf1, así como compensar el fenotipo de una cepa de Drosophila que contiene una mutación en el gen homólogo al humano Park7 relacionado con la enfermedad del Parkinson (Fernandez-Ayala, Sanz et al. 2009). La xenoexpresión simultánea de ambas proteínas en una línea celular carente de mtDNA (línea rho cero) permitió restablecer el transporte electrónico desde NADH hasta oxígeno molecular en un trabajo llevado a cabo en nuestro grupo (PeralesClemente, Bayona-Bafaluy et al. 2008). Esta recuperación funcional permitió asimismo restablecer vías metabólicas adyacentes, como la biosíntesis de pirimidinas. Sin embargo no se recupera el bombeo protónico, ya que ninguna de estas proteínas cumple esta función. En este sentido, la recuperación de las funciones de la cadena respiratoria fue incompleta. Para restaurar esta función, necesaria para el establecimiento del potencial de membrana requerido en la síntesis de ATP, entre otros procesos, se podría desarrollar una estrategia de xenoexpresión que emplease proteínas con función de bombeo de protones. Figura 26. Reconstrucción de la cadena transportadora de electrones (CTE) mediante una estrategia de xenoexpresión. A) Funcionamiento de CTE en líneas carentes de mtDNA. B) Xenoexpresión de AOX y recuperación de la oxidación del CoQ y vías metabólicas dependientes. C) Xenoexpresión conjunta de AOX y NDI1 y recuperación de flujo electrónico desde NADH hasta O2. (Perales-Clemente, BayonaBafaluy et al. 2008). A B C Revisión Bibliográfica 51 5. BOMBAS DE PROTONES 5.1 Bacteriorrodopsina La bacteriorrodopsina es una proteína integral de membrana con función de bomba protónica fotoinducible presente en arqueobacterias con halofilismo extremo, siendo el género Halobium el más representativo. Estos organismos pueden obtener el ATP mediante dos vías alternativas: mediante respiración a través de una cadena respiratoria funcional en condiciones aeróbicas, o a través de un proceso de fotofosforilación inducible en condiciones de hipoxia (Danon y Stoeckenius 1974; Lanyi 1978). En estas condiciones, se estimula la transcripción de una serie de genes que conllevan cambios fenotípicos en el organismo, como la formación de vesículas gaseosas en el citoplasma que le confieren flotabilidad, y la aparición de parches a nivel de la membrana plasmática, llamados membrana púrpura, en los que se expresa la proteína bacteriorrodopsina. En condiciones de luminosidad, esta proteína es capaz de traslocar protones desde el lado citoplásmico hacia el extracelular, lo cual genera un gradiente protónico que será ulteriormente utilizado por una ATP sintasa presente en la membrana plasmática para la fosforilación del ADP (revisiones de (Haupts, Tittor et al. 1999; Lanyi y Luecke 2001). Este proceso de conversión de la energía lumínica recibida en la traslocación de protones se ha llamado fotociclo (1 fotón-1 protón), y se inicia gracias al cambio conformacional mediado por el cofactor todo-trans-retinal, tras la recepción de un fotón (λmáx 568nm) (Goldschmidt, Ottolenghi et al. 1976; Luecke 2000; Pebay-Peyroula, Neutze et al. 2000). Figura 27. Bacteriorrodopsina. A) Esquema de la estructura secundaria y disposición en la membrana púrpura de Halobacterium. Imagen tomada de (Allen, Kim et al. 2001). B) Estructura terciaria de la bacteriorrodopsina. Tomada de Protein Data Bank. C) Fotociclo. Se inicia tras la recepción de un fotón, y a lo largo del mismo se producen cambios conformacionales y en los estados de protonación de diferentes residuos. En la figura se muestran los sucesivos intermediarios K, L, M, N y O, y las flechas hacen referencia a los cambios en el espectro de absorción (color de la flecha), la duración de cada una de las etapas, y la liberación y reposición del protón. Imagen tomada de (Cartailler y Luecke 2003). La bacteriorrodopsina es una proteína de 26 kDa constituida por una sola cadena polipeptídica de 248 aminoácidos unida a través del grupo ε-amino de K216 a un cofactor, todo-trans-retinal, formando una base de Schiff. La estructura terciaria de la A B C A Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 52 proteína consiste en siete hélices α, denominadas A-G, unidas entre sí por lazos cortos extramembranosos. Las hélices E, F y G son casi perpendiculares al plano de la membrana, mientras que las hélices A, B, C y D atraviesan la membrana formando pequeños ángulos respecto a la perpendicular. Las siete hélices encierran una cavidad interna donde se ubica el cromóforo y por donde transcurre el protón. La base de Schiff divide la cavidad en dos secciones: el semicanal citoplásmico y el semicanal extracelular. La región extracelular contiene residuos polares cargados, entre los que destaca Asp-85 que actúa como aceptor del protón cuando la base de Schiff se desprotona. Otros residuos destacables son Asp-212, Arg-82, Glu-204, y Glu-194, que permiten la traslocación y liberación de un protón hacia el lado extracelular. La región citoplasmica contiene residuos hidrófobos a excepción de Asp-96, encargado de reponer el protón perdido a la base de Schiff (Lanyi y Luecke 2001). Esta es una de las proteínas de membrana mejor conocidas a nivel estructural y funcional, gracias a su simplicidad y la disponibilidad de cientos de mutantes puntuales. 5.2 Proteorrodopsinas Las proteorrodopsinas son bombas protónicas fotoinducibles, al igual que la bacteriorrodopsina, descubiertas muy recientemente a partir de muestras marinas (Beja, Aravind et al. 2000; Beja, Spudich et al. 2001; Friedrich, Geibel et al. 2002; de la Torre, Christianson et al. 2003; Giovannoni, Bibbs et al. 2005). Se encuentran en α, β y γproteobacterias, organismos altamente representados en el bioplankton. De manera que, considerando el porcentaje de biomasa que representan, el fototrofismo mediado por las proteorrodopsinas contribuiría de manera fundamental en el flujo de carbono y energía en los océanos. Se distinguen dos subgrupos de proteorrodopsinas principales atendiendo a su diferente espectro de absorción: λmáx 525 nm (verde) y λmáx 490 nm (azul). Su diferente distribución en capas en función de la profundidad a la que se encuentra el organismo, proteorrodopsinas verde (GPR) para los organismos más superficiales, y azul (BPR) en los de aguas más profundas, demuestra el proceso adaptativo en función de la disponibilidad lumínica a esas profundidades. Esta divergencia en cuanto al espectro de absorción no se manifiesta en cuanto a la secuencia aminoacídica, ya que ambos tipos comparten más del 78% de sus residuos (Kelemen, Du et al. 2003; Man, Wang et al. 2003). De hecho el cambio en el espectro de absorción puede conseguirse mediante mutación puntual en un único residuo: Leu-105 determina espectro de absorción con máxima en el verde, mientras que Gln-105 determina la absorción de luz azul (Man, Wang et al. 2003). A parte de diferencias en el espectro de absorción, las GPR muestran un fotociclo más rápido y un bombeo protónico superior (Wang, Sineshchekov et al. 2003). Debido a su similitud con la bacteriorrodopsina, se ha propuesto su reemplazo en aquellas aplicaciones tecnológicas en las que se emplea la bacteriorrodopsina (Pandey 2006; Anton, Walczak et al. 2010; Chu, Yen et al. 2010), debido a que resulta más ventajosa la producción in vitro de proteorrodopsinas de manera funcional que la de la bacteriorrodopsina (Gourdon, Alfredsson et al. 2008; Ranaghan, Shima et al. 2010). Revisión Bibliográfica 53 Figura 28. Modelo de estructura de proteorrodopsinas. A) Variante eBAC31A08, proteorrodopsina de absorción de luz verde (G-PR). B) Variante PalE6, proteorrodopsina de absorción de luz azul (B-PR). Imagen obtenida de (Man, Wang et al. 2003). 5.3 Optogenética La optogenética es una combinación de métodos genéticos y ópticos para llevar a cabo una ganancia o pérdida de función específica en células, tejidos o animales. En realidad, pretende controlar la activación o desactivación de un proceso o mecanismo celular mediante una señal luminosa. En 1979 Francis Crick, estudiando en el ámbito de la neurociencia, sugirió que la luz podría actuar como método de control y reemplazar el uso de electrodos y drogas en la estimulación neurológica, actuando sobre un tipo celular específico y a gran velocidad. Pero convertir esta idea en realidad llevó cerca de 30 años. Fue en el año 2005, cuando se describe la sensibilización de neuronas a la luz tras la expresión en su membrana plasmática de una proteína fotoinducible natural de algas llamada canalrodopsina-2 (Boyden, Zhang et al. 2005). No es necesario la adición del cofactor todo-trans retinal, el cofactor de todas las opsinas microbianas, debido a que existe de manera natural en vertebrados. Esto ha permitido ampliar estos estudios realizados en modelos celulares a otros modelos más complejos, modelos tisulares y modelos animales (Adamantidis, Zhang et al. 2007; Aravanis, Wang et al. 2007; Zhao, Ting et al. 2011). El uso de diferentes tipos de canales fotoinducibles también ha contribuido a la extensión de esta técnica. Así por ejemplo se han utilizado diferentes proteínas que permiten el paso de protones: mientras que la bacteriorrodopsina realiza una función de transporte de protones en una sola dirección, determinada por la conformación de la proteína, las canalrodopsina-1 y canalrodopsina-2, son canales que permiten su paso a favor de gradiente (Nagel, Ollig et al. 2002; Nagel, Szellas et al. 2003). Otro tipo de moléculas empleadas en optogenética para modular la polarización neuronal ha sido la halorrodopsina, una bomba de iones cloruro (Lanyi 1986; Zhao, Cunha et al. 2008; Kaneda, Kasahara et al. 2011). No obstante, para el empleo de algunas de estas proteínas procedentes de microorganismos ha sido necesario resolver algunas dificultades en cuanto a la toxicidad y niveles de expresión o localización intracelular (Gradinaru, Thompson et Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 54 al. 2008; Zhao, Cunha et al. 2008; Gradinaru, Zhang et al. 2010; Kaneda, Kasahara et al. 2011). Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 61 Preferential Super-assembly Between Mitochondrial Respiratory Complexes I and III defines a dedicated CoQ pool Raquel Moreno-Loshuertos2, Esther Lapuente-Brun2, Carmen Colás1, M. A. RodríguezHernández3, Plácido Navas3, Acisclo Pérez-Martos2, Patricio Fernández-Silva2 and José Antonio Enríquez1, 2 * 1 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III. Melchor Fernández Almagro, 3. 28029 Madrid. SPAIN 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza. Pedro Cerbuna, 12. Zaragoza 50009. SPAIN. 3 Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide-CSIC and Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, ISCIII, Sevilla, SPAIN. * To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected] Tel. +34 914531200. Fax: +34 914531240. Experimental Procedures word count: 1,443 Introduction, Results & Discussion word count: 2,549 Running title: Specific Quinone pool for complexes I and III Keywords: Mitochondrial Complex I/Quinone pool/Mitochondrial Electron transport chain Subject Category: Cellular Metabolism; Molecular Biology of Disease Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 62 SUMMARY Four multi-protein complexes (I to IV) compose the mitochondrial electron transport chain. The electrons are transferred between the respiratory complexes by two small electron carriers. Coenzyme Q (CoQ) transfers electrons from complexes I, II and other FAD dependent enzymes to complex III; and cytochrome c (cyt c) transfers electrons from complex III to IV. It was believed that a unique pool of CoQ exists, and, therefore, the origin of electrons that reduce CoQ cannot be traced back. We report here that the physical interaction between complexes I and III defines a specific CoQ pool and a subset of complex III molecules that are dedicated to transfer electrons between NADH and cyt c. Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 63 INTRODUCTION Coenzyme Q (CoQ, Ubiquinone) is required to transfer electrons from NADH or FAD dependent enzymes to respiratory complex III within the inner mitochondrial membrane. The reduction/oxidation of CoQ is critical for energy production, redox balance, pyrimidine synthesis, amino acid and lipid metabolism and indirectly for apoptosis control and calcium handling. For more than 40 years it was generally accepted that CoQ exerted its role by freely diffusing through the membrane and behaving as a homogenous pool available to enzymes that required it, according to the random collision model proposed to explain the organization of the mitochondrial electron transport chain (Lenaz, Fato et al. 2007). In the last 10 years this view has been modified substantially with strong experimental support for a model in which the electron transport chain is organized, at least partially, into dynamic structures called respiratory supercomplexes. We recently demonstrated that such structures contain CoQ. Here, we show in mammalian cells that the physical interaction between complexes I and III defines a specific CoQ pool and a subset of complex III molecules that are dedicated to transferring electrons between NADH and cytochrome c. We also show that a different subset of complex III molecules oxidizes CoQ molecules that receive electrons from complex II or from enzymes other than complex I. By modulating the relative levels of complexes I and III we demonstrate competition between these two electron flux pathways. RESULTS We previously characterized a mouse mitochondrial DNA (mtDNA) mutant cell line (A22) harbouring a mutation in the mt-Cytb gene that prevents the assembly of mitochondrial complex III (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004). In the absence of complex III, complex I becomes very unstable and is degraded. Here, we randomly induced suppressor mutations in A22 cells (Bayona-Bafaluy, Movilla et al. 2008) by Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 64 chemical mutagenesis followed by selection for uridine autotrophy. After mutagenesis, cells were replicated and grown in selective medium (lacking uridine), in which the original cyt bKO cells (A22; referred to hereafter as mutant or M cells) are unable to grow. In this way, we isolated mA22, a cell line able to survive without uridine supplementation (hereafter suppressor or S cells). Interestingly, S cells were also able to grow in a medium in which glucose was replaced by galactose (Fig 1A). RFLP analysis revealed that the suppressor phenotype was not due to a reversion in the original mutation in mt-Cytb (Fig. 1B). Furthermore, full sequencing of the S cell mtDNA discarded the possible role of a secondary mutation in either mt-Cytb or any other mtDNA-encoded gene. To directly demonstrate the nuclear origin of the suppressor mutation, we performed two cybridization assays (Moraes, Dey et al. 2001; Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2003). First, the nucleus of the suppressor cells (puromycin resistant) was transferred to enucleated mutant cells (geneticin resistant): proper nucleus replacement was confirmed by geneticin sensitivity and puromycin resistance. In the second assay, mtDNA of mutant cells was replaced with that of suppressor cells by mitochondrial substitution. The cybrids were tested for geneticin resistance and puromycin sensitivity to ensure that only mitochondria were transferred (Fig 1C). Finally, in both cases the trans-mitochondrial cell lines were cultured in galactose-containing medium. While none of 45 independent clones with the M nucleus were able to survive in galactose, all clones harbouring mutant mtDNA and the S nucleus survived, indicating that the suppressor genetic alteration was transferred with the nucleus and not with the mtDNA. Furthermore, sequencing of the entire set of cDNAs for the structural complex III subunits (Uqcrc1, Uqcrc2, Cyc1, Risp, Uqcrcb, Uqcrcq, Uqcrh, Uqcr10, Uqcr), as well as the chaperones BCS1L and OXA1, did not detect any mutation that would explain the suppressor phenotype (See Table S1 for primer sequences). Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 65 The fact that S cells become both uridine independent and able to grow in galactose indicates that, despite being mutant for mt-Cytb, they have recovered OXPHOS competence. Indeed, suppressor cells have recovered respiration ability (Fig 1D), implying that complexes III and I are once again assembled. To understand the effect of the suppressor mutation on the steady state assembly of mtDNA-dependent respiratory complexes, we performed Blue-Native Gel Electrophoresis (BNGE) of dodecyl-maltoside (DDM) solubilized mitochondria followed by western blot. We found that ≈11% of assembled complex III dimers is enough to stabilize ≈50% of fully-assembled complex I. We also found that the amount of complex IV in the suppressor cell line is only ≈15% lower than that found in controls (Fig 1E). S cells have thus recovered the ability to reduce oxygen and, despite the modest recovery in the amount of complexes I and III, their respiration capacity was even higher than that of control cells grown under the same conditions (Fig 1D). Polarographic measurement performed in digitonized cells showed that in suppressor cells, oxygen consumption dependent on complexes I+III+IV is similar to that in isogenic control cells. But to our surprise, complex II+III+IV-dependent oxygen consumption in S cells, though restored, remained significantly lower than in controls (p=0.0024). Finally, complex IVdependent oxygen consumption in S cells was similar to that of M cells and significantly higher than in controls (p=0.0063) (Fig. 1F). We previously described an influence of the level of assembled complex III on complex I stability and function, but complex II activity was believed to be independent of complex III levels (Acin-Perez, BayonaBafaluy et al. 2004). To better understand this phenomenon, we measured, by spectrophotometry, the activity of the individual OXPHOS complexes in isolated mitochondria from S cells. We found a significant reduction, compared with controls, in the activities of complexes I, III and IV (CI/CS=46.9% of control, p<0.0001; Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 66 CIII/CS=37.9% of control, p=0.020; CIV/CS=83.0%, p=0.0271, see figure S1 for IU activity values), while complex II activity was normal or slightly increased (Fig. 2A). Note that the relative amount of assembled complexes I, II, III and IV (Fig. 1F) correlated with the enzymatic activity of individual complexes (Fig. 2A). This observation appears to contradict the respiration rates measured above: on one hand, maximal complex I amount and activity were less than half of the control, while complex-I–dependent respiration was normal; on the other hand, maximal complex II activity and amount were normal, while complex-II–dependent respiration was significantly lower than in control cells (Fig.1F and 2A). To investigate electron flow through complex III we used linked spectrophotometric assays to measure the activities of complexes I+III, II+III or glycerol-3-phosphate dehydrogenase+III (G3PDH+III). Interestingly, we observed a significant increase in the activity linking complexes I and III in S cells (p=0.0252) and a reduction in the activities of both succinateand glycerol-3-P-cytochrome c reductase (p=0.0003 and p=0.0006, respectively) (Fig. 2A, left pannel). This observation reconciles the discrepancy between the spectrophotometric and polarographic measurements, and strongly suggests that electron transfer to complex III through the CoQ pool is much more efficient from NADH dehydrogenase than from succinate dehydrogenase. In other words, the small amount of complex III was more available to electrons coming from complex I than from other sources. Next we measured the amount of CoQ available for electron transfer in control, mutant and suppressor cells. As expected, since they are rodent cells, the major form of CoQ detected was CoQ9, being CoQ10 (the human major form) levels much lower. In addition, we found that while mutant cells showed a small but significant reduction CoQ9, suppressor cells do not show any depletion in CoQ levels that could influence the availability of the carrier (Fig. 2B) Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 67 Evidence accumulated in recent years indicates that respiratory complexes associate in superstructures called supercomplexes (Schagger and Pfeiffer 2000). We recently demonstrated that some supercomplexes containing associations of complexes I, III and IV also contain CoQ and cyt c, and are able to respire (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). The formation of supercomplexes is suggested to provide greater efficiency for electron transfer (Schagger and Pfeiffer 2000). We wondered if our present observations might reveal the nature of the formation of these supercomplexes. Our findings indicate that complexes I and III in S cells are assembled into the same supramolecular structure, and whereas a small amount of independent complex I can be detected in S mitochondria, no free complex III dimer is detected in this cell line within the detection limit of this assay (Fig. 2C). This observation suggests a potential explanation for the apparently contradictory results described above: the existence of at least two discrete CoQ pools in the inner mitochondrial membrane. One of these pools would be sequestered with complexes I and III in supercomplexes to facilitate the transfer of electrons from complex I to complex III, with the other free in the inner membrane, allowing the transfer of electrons from complex II and other FAD dependent enzymes to complex III. If this hypothesis is correct, and the complex II vs. complex I competition phenomenon is also happening with normal levels of complex III, specific depletion of complex I in cells, maintaining normal complex III levels would result in an increase of complex II plus III activity. To evaluate this prediction we took advantage of another cell line isolated in our laboratory that harboured an insertion of a C in a stretch of 6Cs at positions 13887 to 13892 within the mt-Nd6 coding sequence, in heteroplasmic form (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2003). This is a frameshift mutation (13887iC) that creates a stop codon 51-53 base pairs downstream of the C stretch, resulting in a 79 amino acid truncated polypeptide, instead of the 172 amino acids of the full ND6 protein. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 68 In particular we used a clone with an stable 60% of mutation that leads to a partial depletion of complex I (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2003). Complex I activity was reduced while complex III and complex II showed normal or slightly increased activity (Fig. 2D). On the contrary, complex I+III combined activity was still normal while, as predicted, complex II+III was significantly increased (Fig. 2D). In view of these results we hypothesized that specific depletion of complex I in the suppressor cell line should release complex III to reactivate the transfer of electrons from complex II. To test this possibility, we had to grow the cells in permissive (glucose-containing) medium, in which oxidative phosphorylation is down regulated in favour of glycolysis. We therefore observed lower overall respiratory activity in the S cells (Fig. 3B). We reduced the relative amount of complex I by siRNA targeting of NDUFS3 protein (Fig. 3A). The reduction in complex I had three linked consequences: 1) reduced activity of complex I+III (Fig. 3B); 2) a parallel increase in complex II+III activity (Fig. 3B); and 3) release of complex III from its physical association with complex I (Fig. 3C). We thus demonstrate that competition also takes place between complexes I and II for the transfer electrons to complex III in cells with abnormally low levels of complex III. This occurs because complex III associates preferentially with complex I in CoQ-containing supercomplexes (I+III or I+III+IV), establishing a preferential flux of electrons from complex I to III. These results demonstrate the existence of a specific CoQ pool for the transfer of electrons from complex I to complex III in mammalian mitochondria (Fig. 3D), and have major implications for our understanding of the function and regulation of the mitochondrial electron transport chain. In particular, they indicate that the regulation of the relative abundance of complexes I and III defines the metabolic potential of mitochondria by determining the use of CoQ. Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 69 The suppression mechanism is still elusive. However, we do not believe that this would handicap seriously the interpretation of this study. Nevertheless, to discard any potential doubt, we have performed an additional experiment to clarify it. We have down regulated complex III levels in control cells by interfering core 1 protein expression (Fig 4A) and we have found that this reduction in complex III induces, in agreement with the suppressor phenotype, a specific loss of the III+IV complex (Fig 4B). Also as predicted, a decrease in complex I levels and activity takes place. But more interestingly, a decrease in complex II+III activity, significantly higher than that of complex I+III activity, was observed with a controlled CIII reduction (Fig. 4C). This observation confirms our interpretation of the results obtained in S cells regardless the mechanism of suppression. DISCUSSION In this report we have provide compelling evidence showing that the physical assembly between complexes I and III determine an exclusive pathway for electrons mediated by a dedicated CoQ subset of molecules that we name CoQNADH. In this way NADH oxidation and FAD oxidation do not inter-talk at least until the electrons reach cytochrome c. In addition, we have shown that complex I affinity for complex III is very high, to the point that this association is preferred despite the possibility that dragging too much complex III could compromise the oxidation of CoQH2 reduced by FAD dependent enzymes (using CoQFAD). These observations provide the experimental support to resolve a long lasting controversy on the existence of a single or multiple CoQ pools within inner membrane mitochondria (for review see (Genova and Lenaz 2011)). Some reports studying the reduction of CoQ in isolated mitochondria determined that succinate and NADH can reduce a limited and specific fraction of the total CoQ pool (Jorgensen, Rasmussen et al. 1985; Lass and Sohal 1998). In addition, it was also estimated that a portion of CoQ (15% to 30% of the total) seemed to be bound to proteins (although the Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 70 nature of the proteins was not determined) while the rest seemed to be free in the membrane (Lass and Sohal 1999). More recently, Rossignol and co-workers, clearly demonstrated that CoQ content in mitochondrial inner membrane is not homogenous. Thus, when they measured the reduction levels of CoQ and cytochrome c in state 3 isolated mitochondria, they found that one fraction of CoQ was utilized during steadystate respiration, another mobilizable, i.e. a reserve that is used in case of a perturbation to maintain the energy fluxes at normal values (e.g. as a consequence of inhibition of the respiratory complexes or in case of mitochondrial diseases), and a third one which is not utilizable and is unable to participate in succinate-dependent respiration. They estimated that the non-utilizable pool by succinate was 79% of the total CoQ in muscle mitochondria and 21% in liver mitochondria. Unfortunately they did not perform similar assays analysing NADH dependent respiration. In any case, these results are incompatible with a single CoQ pool (Benard, Faustin et al. 2008). In a review published recently by Genova and Lenaz they collect, in an impressive tour the force, chemical, biochemical, metabolic, structural and biophysical data from 1955 up to date, to address the function and role of CoQ in mitochondria. With respect to the existence of a single CoQ pool in mitochondria they state that the concept of CoQ pool has been universally accepted to the point that “has gained place in all biochemistry textbooks”(sic) despite the existence of experimentally demonstrated deviations from this concept (Genova and Lenaz 2011). More impressive, they, in fact, predicted our results: “The non-homogeneity of the ubiquinone pool with respect to succinate and NADH oxidation may be interpreted today in terms of compartmentalization of CoQ in the I–III supercomplex in contrast with the free pool used for connecting complexes II and III.” (Genova and Lenaz 2011).In particular, they indicate that the regulation of the relative abundance of complexes I and Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 77 Staden, R., Beal, K.F., and Bonfield, J.K. (2000). The Staden package, 1998. Methods Mol Biol 132, 115-130. FIGURE LEGENDS Figure 1.- Genetic and biochemical characterization of suppressor cells. A) Growth ratios for each cell line in medium containing galactose as the energy source versus medium containing glucose. Mutant cells (M) are unable to grow in galactose-containing medium while isogenic control cells (C) or suppressor cells (S) do grow. B) Chromatogram showing the G15263A transition in the mt-Cytb gene of suppressor cells (left) and RFLP analysis of the mutation in homoplasmy (right). C) Scheme of cybridization experiments showing the nuclear origin of the suppressor mutation. D) Endogenous (left) and maximal (right) rates of oxygen consumption in intact cells. Mutant cells do not respire. E) Western blot of the different assembled complexes after Blue Native Gel Electrophoresis (BNGE), probed with monoclonal antibodies specific for complexes I (anti NDUFA9), III (anti Core2), IV (anti COI) and II (anti SDHA, Fp70). F) Oxygen consumption by permeabilized cells in the presence of electron donors for complex I (glutamate + malate), complex III (succinate + G3P) and complex IV (TMPD). Note that mutant cells only consume oxygen when complex IV substrates are added. Figure 2.- A) Spectroscopic measurement of the activities of isolated mitochondrial complexes (left) and mitochondrial complexes combined with complex III (right) in control and suppressor cell lines. Activities are normalized to citrate synthase activity. B) CoQ content evaluation in C, M and S cells. C) Western blot of the different assembled supercomplexes in digitonin-permeabilized mitochondria after BNGE, probed with monoclonal antibodies specific for complexes I (anti NDUFB6), III (anti Core2), IV (anti COI) and II (anti SDHB (I30)). In the mitochondria of S cells, supercomplexes can be Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 78 observed containing complex III and lacking dimeric complex III, while other supercomplexes contain either complex IV or complex II. D) Spectroscopic measurement of the specific activities of isolated mitochondrial complexes (left) and mitochondrial complexes combined with complex III (right) in control, suppressor and heteroplasmic ND6 mutant cells lines. Data are means ± SD. Asterisks indicate significant differences with respect to control cells, tested by ANOVA and post-hoc Fisher PLSD (p<0.05). See supplementary material for detailed statistic analysis. Figure 3.- Characterization of cells knocked down for complex I (NDUFS3-interfered cells). A) Western blot of NDUFS3 protein after SDS-PAGE. Actin was detected as a loading control. B) Spectroscopic measurement of the activities of isolated complex I and of complex I or II combined with complex III in non-interfered and NDUFS3-interfered suppressor cells. Note that the respiration capacity of suppressor cells in these experiments was lower than in the previous figure because here they were grown in glucose medium. Data are means ± SD. Asterisks indicate significant differences with respect to control cells, tested by ANOVA and post-hoc Fisher PLSD (p<0.05). See supplementary material for statistics details. C) Characterization of complex IIIcontaining supercomplexes in non-interfered and NDUFS3-interfered suppressor cells. The presence of complex III+IV and dimeric complex III can be observed in interfered clones. The small amounts of these two forms present in suppressor cells disappear when the cells are grown in galactose medium. D) Scheme representing the existence of two ubiquinone pools. Figure 4.- Characterization of complex III knocked down cells (Core1-interfered cells). A) Western blot of Core 1 protein after SDS-PAGE. Actin was used to normalize. For control purposes, control cells were transduced with an empty vector (mock). Quantification of interference levels was made using Odyssey CLx. B) Characterization Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 79 of complex III-containing supercomplexes in non-interfered and Core1-interfered cells. The decrease of complex III+IV and dimeric complex III can be observed when Core1 is knocked down. C) Spectroscopic measurement of the activities of isolated complex I and of complex I or II combined with complex III in non-interfered and Core1-interfered suppressor cells (71.6% of interference). Complex IV activity was measured for control purposes. Data were normalized by CS activity and are represented as means ± SD. Asterisks indicate significant differences with respect to control cells, tested by ANOVA and post-hoc Fisher PLSD (p<0.05). See supplementary material for statistics details. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 80 Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 81 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 82 Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 83 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 84 SUPPLEMENTARY MATERIAL Statistical analysis. Differences between cell lines were assessed by analysis of variance (ANOVA). Paired differences were assessed by the post hoc Fisher‟s protected least significant difference test (PLSD). All tests and calculations were done with the statistical package StatView 5.0 for Macintosh (SAS Institute, Inc.). For figure 1: (A) n=4, 2 and 4 for control, mutant and suppressor respectively; differences between control and suppressor doubling times ratio (DTGal/DTGlu) are significant according to Fisher‟s PLSD post-hoc test: p=0.0006. (D) n=4, 3 and 6 for control, mutant and suppressor cells respectively; paired differences between all the cell lines are significant for both endogenous and maximal respiratory rates according to Fisher‟s PLSD post-hoc test: Endogenous respiration: p=0.0001 between control and suppressor cells and p<0.0001 between mutant and any other cell line. Maximal respiration: p=0.0003 between control and suppressor cells and p<0.0001 between mutant and any other cell line. (F) n=6, 3 and 6 for control, mutant and suppressor cells respectively. Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences among cell lines is significant for different substrates: Glutamate+Malate: p<0.0001 between mutant and any other cell line but it is not significant between control and suppressor cells. Succinate+G3P: There are significant differences among all cell lines: p<0.0001 between control and mutant cells, p=0.0024 between control and suppressor cells and p=0.0002 between mutant and suppressor cells. TMPD: p=0.0063 between control and suppressor cells. For figure 2: (A) Left panel: n≥3 in all the measurements; Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences between control -Cand suppressor -Scells is significant for some complexes: Complex I: n=6 and 7 for C and S respectively; p<0.0001. Complex III: n=4 and 3 for C and S respectively; p=0.0020. Complex IV: n=4 for both cell lines; p=0.0271. Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 85 Right panel: n=3 for both cell lines in all cases but G3PDH+Complex III where n=4. Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences between control and suppressor cells is significant for all complex III-linked measurements: p=0.0252 for complex I+III, p=0.0004 for complex II+III and p=0.0048 for G3PDH+complex III. (D) Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences between control -Csuppressor - Sand ND6 mutants cells is significant for some complexes: Complex I: n=14, 9 and 3 for C, S and ND6-M cells respectively; p<0.0001 between C and S, p=0.0082 between C and ND6-M and p=0.0014 between S and ND6-M. Complex II: n=6; 3 and 3 for C, S and ND6-M cells; p=0.0090 between mutant and control cells. Complex III: n=7, 3 and 2 for C, S and ND6-M cells; p=0.0001 between S and the others. Complex I+III: n=8, 4 and 3 for C, S and ND6-M; p>0.05. Complex II+III: n=11, 6 and 3 for M, S and ND6-M and p<0.0001 in all the paired tests. For figure 3: (B) Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences among cell lines is significant for all measured activities: Complex I: n=3 for all cell lines; p<0.0001 between control (C) and any other cell line and p=0.0218 between suppressor (S) and Complex I-Kd5 (CI-Kd5) cells. Complex I+III: n=10, 6, 3 and 3 for C, S and CI-Kd2 and CI-Kd5 respectively; p<0.0001 between C and Complex I Kd cells; p=0.0006 between suppressor and CI-Kd2 and p=0.0022 between S and CI-Kd5. Complex II+III: n=9, 6, 3 and 3 for C, S and Complex I-Kd2 and 5 respectively; p=0.0447 between C and CI-Kd5, p=0.0002 between C and S and p<0.0001 between S and CI-Kd cells. For figure 4: (C) n≥3 in all the measurements. Fisher‟s PLSD post-hoc test of paired differences among cell lines is significant for all but complex IV analysis. Complex I: p=0.0333; Complex I+III: p=0.0298; and Complex II+III: p<0.0001. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 86 Table 1. Primers Collection used for cDNAs sequencing Function Gene Accesion number Primer name Primer sequence Mitochondrial Complex III Subunits Uqcrc1 NM_025407.2 Uqcrc1-F GACGGAAGTTAGAAGATGGC Uqcrc1-R CTGTGCAGACTTCCTGCCTA Uqcrc2 NM_025899.2 Uqcrc2-F AGGGCAACTGCTAGAGCCAT Uqcrc2-R GAGCTTTAAATACACGCATGTG Cyc1 NM_025567.2 Cyc1-F GCACTAAAGGGGGCCGACAT Cyc1-R CAAGCAGATACTGAACAGGG Uqcrfs1 NM_025710.1 RISP-F TGGTTTGAGCAGCTGTCGCC RISP-R TAGGCCCTGAGTCCACGTGT Uqcrb NM_026219.1 VI-F CGCTTCACTCTCAGGTCAAA VI-R CCCACAGATCTTAACTAAAAG Uqcrq NM_025352.2 Ucrq-F GGTGTTAGGCCGTGGGAGG Ucrq-R CAAGACTACAGTGTGGATTCC Uqcrh NM_025641.3 VIII-F ATCCCAAACCGGCTCCCGAC VIII-R TGAGGAGGACGAATCTGCACAT Uqcr10 NM_197979.1 X-F ATGTCGTCGCCGACGATCC X-R TTACTCCTTGTTCTCATACTTG Uqcr11 NM_025650.2 XI-F AGTATTGAGACCCTGCAGCG XI-R TGAGGCCTCGGCACATGGTA Mitochondrial Complexes Chaperones Bcs1l NM_025784 BCS1-F CATCTGTGCTGCTTCTTTTCAAG BCS1-R GCAGATCATGGCCTGGTGGGTCA Oxa1l NM_026936 Oxa1-F TTCCCGGCAAGATGGCGAG Oxa1-R CAGAGTGAGCACAGAACACGTCA Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 93 INTRODUCTION Formation of supercomplexes through the interaction of complexes III and IV has been postulated in all types of eukaryotic cells, from yeast and fungi to plants and animals (Schagger and Pfeiffer 2000; Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004; Eubel, Heinemeyer et al. 2004; Lenaz and Genova 2010). In all studies to date, the putative occurrence of these supercomplexes has been determined by electrophoretic co-migration and stable purification through density gradients (Schagger and Pfeiffer 2000; Acin-Perez, BayonaBafaluy et al. 2004; Eubel, Heinemeyer et al. 2004; Dudkina, Eubel et al. 2005). In addition, 3D maps of respiratory supercomplexes have been generated by single-particle electron microscopy analysis (Dudkina, Eubel et al. 2005; Schafer, Seelert et al. 2006; Schafer, Dencher et al. 2007) or single particle cryoelectron tomography (Dudkina, Kudryashev et al. 2011). Two potential roles have been attributed to the supercomplex organization of the respiratory chain. First, this supraorganization has been proposed to stabilize the respiratory complexes, and there is evidence indicating that complex I is stabilized by interaction with complex III or IV (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004; Diaz, Fukui et al. 2006; Vempati, Han et al. 2009). Second, supercomplexes have been suggested to allow substrate channelling in order to increase electron flux, but the evidence for this role is controversial since it conflicts with the predicted pool behaviour of CoQ and cytochrome c (Genova, Bianchi et al. 2005; Lenaz and Genova 2007). The lack of functional and genetic evidence has fed continued controversy regarding the in vivo significance of supercomplexes, and two models, the classic random collision or fluid model (Hackenbrock, Chazotte et al. 1986) and the solid model(Schagger and Pfeiffer 2000), have been in dispute. We previously demonstrated that the respirasome is functional, being able to transfer electrons from NADH to oxygen (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). We have also proposed the plasticity model, which can Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 94 resolve the apparent contradiction between the fluid and solid models by incorporating them as extreme forms of a variety of structural associations that can be adopted by the respiratory complexes and in which electron flux and proton pumping can be operative (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Here we have identified Cox7a2l, for which we propose the new name “supercomplex assembly factor 1” (SCAFI), as a protein required for super-assembly of complexes III and IV, providing the first genetic evidence for the regulation of respiratory supercomplexes assembly. Our data also show that SCAFI is not required for cell survival in culture or in vivo, since C57Bl/6 mice lacking functional SCAFI are healthy and fertile. RESULTS Cox7a2l is only detected in supercomplexes.- We previously characterized several mouse cell lines harbouring mitochondrial DNA (mtDNA) mutations that render them deficient for a given respiratory complex (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004; Moreno-Loshuertos, Acin-Perez et al. 2006; Bayona-Bafaluy, Movilla et al. 2008; Perales-Clemente, Fernandez-Vizarra et al. 2011). In our laboratory, we are conducting a high-throughput proteomic analysis of these cell lines to identify candidates for participation in the formation of respiratory (oxidative phosphorylation: OXPHOS) supercomplexes. Digitonin-treated mitochondrial samples from respiratory-deficient cell lines and mtDNA isogenic controls were separated by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Bands corresponding to supercomplexes were identified in lanes from control cells, and the corresponding positions excised from the lanes from the respiratory-deficient cells, in which supercomplexes do not assemble due to the lack of a particular complex. We also excised the gel areas corresponding to the migration positions of free complexes. The protein components in each band were then analyzed by Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 95 liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. We first compared isogenic controls with a cell line with a mutation in mt-Nd4, which prevents the assembly of complex I (Fig. 1a and 1b). Comparison of supercomplexes and free complexes identified the presence of Cox7a21 exclusively in supercomplexes of isogenic control cells. Cox7a21 is a protein of unknown function that is very similar in sequence to the structural complex IV subunit Cox7a2 (Fig. 1c and 1d). Cox7a2l was present in the associations between complexes I+III2+IVn (respirasome) and III2+IV, but was not detected at the migration positions of free complex III2 or complex IV (Fig. 1a). This was the case despite the fact that most complex IV migrates in the free form on BN-PAGE, confirmed by the fact that other structural complex IV proteins such as Cox7a2 and Cox6a1 were detectable only in the free complex IV band (Fig. 1a). Lack of Cox7a2l abolishes the formation of supercomplexes containing complex IV.- While studying the assembly of respiratory complexes in immortalized mouse fibroblast lines derived from different littermate animals (mixed C57BL/6 and 129Sv nuclear background), we observed two patterns for the incorporation of complex III into supercomplexes (SC), despite the fact that all the cell lines express all individual respiratory complexes (Fig. 2a). The expected pattern (hereafter SC+ cells) included, from lower to higher molecular weight, free complex III dimer, complex III co-migrating with complex IV (III2+IV), complex III co-migrating with complex I (I+III2), the respirasome (I+III2+IVn) and complex III again co-migrating with complex I (likely I2+III2). However, three cell lines (hereafter SCcells) showed an unexpected pattern, lacking all putative co-migrations involving interaction between complexes III and IV (III2+IV and the respirasome) (Fig. 2a). This was confirmed by 2D BN-PAGE plus SDSPAGE electrophoresis followed by immunodetection of respiratory complexes (Fig. 2b). To identify the genomic region responsible for the heterogeneous SC phenotype, we Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 96 performed genome-wide analyses with the Affymetrix® Mouse Diversity Genotyping Array, which can interrogate more than 623,000 single nucleotide polymorphisms (SNPs). DNA samples from three SC+ cell lines and the three SCcell lines were compared. Most SNPs differentiating SC+ and SCcells were located in chromosome 17 (274 discriminant SNPs), and very few discriminant SNPs were detected in other chromosomes (mean: 4.7, range 0-17). Mapping of chromosome 17 discriminant SNPs revealed a well-defined grouping (Fig. 2c). Most discriminant SNPs concentrated in two neighbouring groups located between positions 81296164 and 86203330. Detailed examination of this zone revealed a near complete absence of non-discriminant SNPs (coded as -1 in the figure). For all discriminant SNPs, SCcell lines were homozygous and SC+ cells were opposed allele carriers (most of them heterozygous). Among the small number of genes located in this region, we identified Cox7a21 (Fig. 2c, lower panel). Sequencing of the coding region of the Cox7a2l gene revealed that the three SCcell lines were homozygous for a Cox7a2l version 6 bp shorter than the one found in heterozygosis in the three SC+ cell lines (Fig. 3a). The short and long forms of the gene respectively encode proteins of 111 and 113 amino acids. Western blot analysis of the fibroblast lines with a polyclonal antibody against Cox7a2l detected two protein bands. The larger band was detected in all preparations and showed a molecular mass much higher than that expected for Cox7a2l, indicating that it was non-specific. The second immunoreactive band, corresponding to the expected size of Cox7a2l, was detected only in SC+ cell lines (Fig. 3b). Immunoprecipitation of in vitro-synthesized haemagglutinin epitope (HA)-tagged Cox7a21 proteins followed by western blot confirmed that the anti-Cox7a2l antibody detects both isoforms (Fig. 3b). We therefore conclude that the 111 amino-acid isoform is unstable and degraded in cells. Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 97 We next investigated the evolutionary conservation of Cox7a2l (Fig. 3c). Surprisingly, we found that the reference sequence for the mouse Cox7a2l gene (corresponding to the C57Bl/6 genetic background) is that encoding the unstable, 111 amino-acid isoform (Fig. 2c), which does not support interaction between complexes III and IV. The Cox7a21 proteins of all vertebrates studied contain a conserved triplet in the region that differs between the 111 and 113 amino acid-long mouse proteins (Fig. 3c). The N-and Cterminal amino acids of this triplet vary (VPI, VPV, LPV or IPV), but the central residue is always proline. Since proline residues often confer a specific secondary structure, it is likely that the absence of this motif in the 111 amino-acid isoform results in a misfolded, non-functional protein that is then degraded. Notice that in our proteomic study we could detect unambiguously the 113 isoform (Fig. 1d). Since the analysed cell lines were derived from animals on a mixed genetic background (129sv:C57BL/6), we examined the SC phenotype in tissues derived from these strain-mixed mice. The heterogeneity in SC phenotype shown in the cell lines was also apparent in littermate source animals, with mitochondria isolated from liver and heart showing either normal formation of supercomplexes or no association between complexes III and IV (Fig. 3e). Moreover, mitochondria isolated from the inbred strain C57BL/6 exclusively showed the SCphenotype, whereas mitochondria from the inbred NZB/BlNJ strain are SC+ (Fig. 3e). Consistent with the findings in the cell lines, the SC+ animals exclusively expressed the long form of the Cox7a2l protein, while SCanimals, including the purebred C57Bl/6 mice, expressed the short form (Fig. 3D). Re-expression of wild type Cox7a2l restores the incorporation of complex IV in supercomplexes.- There is thus an exact correlation in cells and animals between the absence of the 113 amino acid Cox7a2l protein and the lack of interaction between complexes III and IV. To test whether this correlation signifies a causal relationship, we Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 98 cloned and overexpressed the long and short Cox7a2l proteins in SCcells (Fig. 4). Overexpression of the short form (111 amino acids) had no effect on the phenotype of SCcells, whereas the long isoform (113 amino acids) restored the assembly of supercomplexes containing III2+IV and I+III2+IV1-4 (Fig. 4a and 4b). Collectively, these results demonstrate that the functional form of Cox7a2l is required for the assembly of complexes III and IV into supercomplexes in the mammalian respiratory chain. To our knowledge, these observations provide the first genetic evidence for the existence of respiratory supercomplexes in mammalian mitochondria and indicate that mitochondrial supercomplexes are physiologically regulated entities. DISCUSSION The debate on the organization of the mitochondrial electron transport chain (mtETC) between the fluid model, with individual ETC complexes connected by single pools of “mobile carriers” CoQ and cythocrome c (Fig. 5a), and the solid model, where the respiratory complexes are assembled in superstructures called respirasomes, was maintained because the absence of genetic evidences of the existence of supercomplexes in vivo. We recently propose that the two opposed views may be reconciled in an unified model, that we called Plasticity model (Acin-Perez, Bayona-Bafaluy et al. 2004). Thus, we proposed that a variety of superstructures could co-exist (Fig. 5b): complex I associations (the respirasome (CI+III+IV) and CI+III) containing a dedicated CoQ pool (author‟s manuscript submitted) coexisting with complex III+IV associations and free complexes II, III and IV. Then complex I would be virtually always in association with other complexes while complex IV super-assembly would be under tide regulation. Intrinsic to this model would be that any arrangement of complex IV, from 100% free to 100% interacting with other complexes would be functional (Fig 5c). Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 99 The discovery of SCAFI as a modulator of the proportion of CIV-containing and the observation of the in vivo viability of the extreme situation where SCAFI is absent and no complex IV-containing supercomplexes can be formed, strongly validate the Plasticity model. Moreover, the demonstration of a dedicated CoQ pool for the transfer of electrons between complexes I and III complete the picture of the functional consequences of the Plasticity model (Fig 5c) The mechanism that we describe here reformulates the picture of the function, regulation and homeostasis of bioenergetics metabolism in eukaryotic cells. The finding that the mitochondrial electron transport chain has a variable and complex structural organization adds a new level of regulation to the system that, when fully characterized and understood, will allow a better understanding of its implication in human disease. EXPERIMENTAL PROCEDURES Cell Culture. All cell lines were grown in DMEM (GIBCO-Invitrogen) supplemented with 5% FBS (fetal bovine serum, GIBCO-Invitrogen). Cell culture studies were conducted with immortalized fibroblast cell lines derived from six animals (77-82) on a mixed C57BL/6 and 129Sv nuclear background (129sv/B6). Animal studies were conducted with 129sv/B6 mice and purebred C57BL/6J mice and NZB/B1NJ. DNA isolation and mutation analysis. For total DNA isolation from cells, cells were digested with proteinase K in TE buffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5) containing 0.5% SDS and ribonuclease A, and DNA was extracted with phenol-chloroform-isoamyl alcohol and precipitated with ethanol. DNA was isolated from liver or heart homogenates with using TRIzol®Reagent (Invitrogen). For microdeletion analysis the Cox7a2l genomic region was amplified with the following primers: Fw 5´-3´: CTTTCTTGCTTTGCAGAAGGC and Rev: 5´-3´: GAAGGCCTCGTTTCAGGTGG. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 100 Amplification products (56 bp and 50 bp-long) were analysed by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel. Genotyping. Cell lines were genotyped using de Affymetrix Mouse Diversity Genotyping array. Total genomic DNA (500 ng) was processed according to the Affymetrix Genome-Wide Human SNP Nsp/Sty assay protocol. Image files were automatically processed for allele calling and quality control with a modified version of the BRLMM-P algorithm, available through the Affymetrix Power Tools (APT); for details, see http://www.affymetrix.com. The Affymetrix Mouse Diversity Genotyping array contains more than 623,000 SNPs, with a mean separation of 4.3 kb. Of these SNPs, 80% (498929) were monomorphic in the sample (all six cell lines showed the same genotype) and another 38457 SNPs were missing. Thus 85738 SNPs showed genetic variability in our sample and were analysed. To try to identify genomic regions which best discriminate between supercomplex competent and non-competent cell lines, each SNP was classified as discriminant or not-discriminant. An SNP was classified as discriminant when it showed a coherent genotype within one group opposite to that shown in the other group (frequent homozygous allele versus rare allele carrier; rare homozygous allele versus frequent allele carrier). This difference was only evaluated for those SNPs genotyped in a minimum of two lines per group, to check the coherence within each phenotypic group. Data were managed and figures generated with IBM SPSS Statistics v18. Cox7a2l constructs. Total RNA was isolated from SC+ cell line 78 with TRIzol®Reagent (Invitrogen). Total cDNA was synthesized using the Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit (Roche). Cox7a2l cDNA was amplifiedand cloned into the pCR2.1 plasmid using the TA Cloning kit (Invitrogen) and sequenced. A second construct Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 101 was performed with the haemagglutinin epitope added for immunoprecipitation to the Cterminus. The short and long Cox7a2l variants (Cox7a2l-111 and Cox7a2l-113) were subcloned into the pWPXLd lentiviral vector (Tronolab) for cell transfection, using BamHI and SpeI restriction sites (NEB), and into the pTNTTM vector (Promega) for in vitro protein synthesis, using NotI and XhoI restriction sites (NEB). Lentiviral vector production and cell infection. Human 293T cells (2.5x106) were plated 24 h before cotransfection with 10 µg of transfer vector (pWPXLd COX7A2L111p or pWPXLd COX7A2L-113p), 7.5 µg of second-generation packaging plasmid (psPAX2) and 3 µg of envelope plasmid (pMD2.G). FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche) was used. Infectious particles were collected 24 h after transfection (Naldini, Blomer et al. 1996). Lentiviral particles were used to transduce SCcell lines. Protein extraction. Cells were collected from 100 mm-diameter culture plates, washed twice with PBS, pelleted and resuspended in 200 µl RIPA buffer with protease inhibitors. In vitro reticulocyte protein expression. Cox7a2l-111 and Cox7a2l-113 cloned into pTNTTM vector (Promega) were in-vitro synthesized using the TNT T7/SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega). Blue native polyacrylamide electrophoresis. Mitochondria were isolated from mouse liver and heart samples as described (Fernandez-Vizarra, Lopez-Perez et al. 2002). Mitochondria were isolated from cultured cell lines according to Schägger (Schagger 1995), with some modifications (Acin-Perez, Fernandez-Silva et al. 2008). Digitoninsolubilized mitochondrial proteins (100 µg) were separated on blue native gradient gels (3-13% acrylamide). After electrophoresis, the gels were further processed for Western blotting or a second dimension of SDS-PAGE (Wittig, Braun et al. 2006). For proteomic analysis, the gel was submerged for 2 h in staining solution (0.25% Coomasie Blue R- Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 102 250, 40% methanol, 10% acetic acid) at room temperature. After several washes in 40% methanol, 10% acetic acid, the gel was soaked in water overnight and the protein bands of interest were excised. Immunological techniques. Synthetic proteins were immunoprecipitated using the HA epitope (Anti HA Immunoprecipitation Kit, SIGMA) and run on a 16% SDS– polyacrylamide gel. Total cell protein extracts (15 µg) were separated by 16% acrylamide/bisacrylamide SDS-PAGE. After electrophoresis, SDS-PAGE, BN-PAGE or BN-SDS-PAGE gels were electroblotted onto Hybond–P PVDF membranes (GE Lifesciences). Antibodies used were anti-cox7a2l (polyclonal, Protein Tech Group), or specific antibodies against complex I (anti-NDUFA9, MitoSciences), complex II (anti-70 kDa subunit, SDHA, Invitrogen), complex III (anti-Core2, MitoSciences) and complex IV (anti-COXIV, MitoSciences). Secondary antibodies used were peroxidase-conjugated anti-mouse or anti-rabbit (Invitrogen). Signal was generated using the EZ-ECL Chemiluminiscence Detection Kit for HRP (Biological Industries). Protein identification by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Gel pieces from blue native gels containing the protein bands of interest were excised. After reduction with DTT (10mM) and alkylation of Cys groups with iodoacetamide (50mM), modified porcine trypsin (Promega) was added at a final mass ratio of 1:50 (trypsin-protein). Digestion proceeded overnight at 37ºC, after which samples were vacuum-dried and dissolved in 1% acetic acid. To identify proteins, the resulting tryptic peptide mixtures were analysed by nanoliquid chromatography coupled to mass spectrometry. Peptides were injected onto a C-18 reversed phase (RP) nano-column (100 µm I.D. and 15 cm, Mediterranea sea, Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 109 phylogenetic analysis of Cox7a2l proteins reveals high conservation of a proline residue absent in the C57BL/6 background (Image generated with the Clustawl 2.1 multiple sequence alignment package). d) Cox7a2l allele analysis in C57BL/6 (C57) and NZB/BlNJ (NZB) backgrounds. C57 is homozygous for Short 111, whereas NZB is homozygous for the Long 113 allele. e) Western blot analysis of complex III (anti Core2) after BN-PAGE showing complex assembly status in mitochondrial samples from C57 and NZB mice. Figure 4.- Restoration of the superassembly between complexes III and IV in SCcell lines by overexpression of 113 amino-acid Cox7a2l. a) Western blot after BN-PAGE, probed with antibody specific for complex III (anti Core2). Supercomplex formation in SCcells is rescued only when cells are transfected with the 113 amino acid-long version of the Cox7a2l protein (+113p). Results obtained with fibroblasts derived from purebred NZB and C57 mice are shown for reference. b) Western blot, after second dimension separation of proteins on blue native gels by denaturing SDS-PAGE, probed with antibodies specific for complexes I (Nduaf9), II (anti SDHA), III (anti Core2) and IV (CoxIV). Figure 5.- Electron transport chain (ETC) organization alternatives and role of SCAFI. a) fluid model with individual ETC complexes connected by single pools of the “mobile carriers” CoQ and cytochrome c. b) Plasticity model showing complex I associations, the respirasome (CI+III+IV) and CI+III supercomplex, containing a dedicated CoQ pool and coexisting with complex III+IV associations and free complexes II, III and IV. The role of SCAFI as modulator of CIV-containing supercomplexes and free complex III and complex IV proportions is highlighted. c) Extreme situation reported in this article where SCAFI is absent and no complex IV-containing supercomplexes can be formed. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 110 Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 111 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 112 Resultados: Organización modular de la cadena respiratoria 113 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 114 Figura 5 Parte II: Optogenética Mitocondrial Manuscrito3 Strategies for optogenetical control of membrane potential generation. Apéndice 221 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 222 Apéndice 223 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 224 Apéndice 225 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 226 Apéndice 227 Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 228 Apéndice 229 pC8 pM9 PmeI BamH ATPase9 PRESEQUENCE NdeI SpeI PmeI BamH Cox8a PRESEQUENCE NdeI SpeI Bibliografía 237 Bogenhagen, D. and D. A. Clayton (1977). "Mouse L cell mitochondrial DNA molecules are selected randomly for replication throughout the cell cycle." Cell 11(4): 719727. Bogenhagen, D. F. (2011). "Mitochondrial DNA nucleoid structure." Biochim Biophys Acta. Bogenhagen, D. F., D. Rousseau and S. Burke (2008). "The layered structure of human mitochondrial DNA nucleoids." J Biol Chem 283(6): 3665-3675. Bokori-Brown, M. and I. J. Holt (2006). "Expression of algal nuclear ATP synthase subunit 6 in human cells results in protein targeting to mitochondria but no assembly into ATP synthase." Rejuvenation Res 9(4): 455-469. Bolden, A., M. Fry, R. Muller, R. Citarella and A. Weissbach (1972). "The presence of a polyriboadenylic acid-dependent DNA polymerase in eukaryotic cells." Arch Biochem Biophys 153(1): 26-33. Bolden, A., G. P. Noy and A. Weissbach (1977). "DNA polymerase of mitochondria is a gamma-polymerase." J Biol Chem 252(10): 3351-3356. Boldogh, I. R. and L. A. Pon (2007). "Mitochondria on the move." Trends Cell Biol 17(10): 502-510. Bonnefoy, N. and T. D. Fox (2007). "Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination." Methods Mol Biol 372: 153-166. Bonnefoy, N., C. Remacle and T. D. Fox (2007). "Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria." Methods Cell Biol 80: 525-548. Bonnet, C., S. Augustin, S. Ellouze, P. Benit, A. Bouaita, P. Rustin, J. A. Sahel and M. Corral-Debrinski (2008). "The optimized allotopic expression of ND1 or ND4 genes restores respiratory chain complex I activity in fibroblasts harboring mutations in these genes." Biochim Biophys Acta 1783(10): 1707-1717. Boumans, H., L. A. Grivell and J. A. Berden (1998). "The respiratory chain in yeast behaves as a single functional unit." J Biol Chem 273(9): 4872-4877. Bourgeron, T., P. Rustin, D. Chretien, M. Birch-Machin, M. Bourgeois, E. ViegasPequignot, A. Munnich and A. Rotig (1995). "Mutation of a nuclear succinate dehydrogenase gene results in mitochondrial respiratory chain deficiency." Nat Genet 11(2): 144-149. Bowmaker, M., M. Y. Yang, T. Yasukawa, A. Reyes, H. T. Jacobs, J. A. Huberman and I. J. Holt (2003). "Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone." J Biol Chem 278(51): 50961-50969. Boyden, E. S., F. Zhang, E. Bamberg, G. Nagel and K. Deisseroth (2005). "Millisecondtimescale, genetically targeted optical control of neural activity." Nat Neurosci 8(9): 1263-1268. Boyer, P. D. (1993). "The binding change mechanism for ATP synthase--some probabilities and possibilities." Biochim Biophys Acta 1140(3): 215-250. Bradford, M. M. (1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding." Anal Biochem 72: 248-254. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 238 Braidotti, G., I. A. Borthwick and B. K. May (1993). "Identification of regulatory sequences in the gene for 5-aminolevulinate synthase from rat." J Biol Chem 268(2): 1109-1117. Brea-Calvo, G., A. Rodriguez-Hernandez, D. J. Fernandez-Ayala, P. Navas and J. A. Sanchez-Alcazar (2006). "Chemotherapy induces an increase in coenzyme Q10 levels in cancer cell lines." Free Radic Biol Med 40(8): 1293-1302. Brown, W. M., M. George, Jr. and A. C. Wilson (1979). "Rapid evolution of animal mitochondrial DNA." Proc Natl Acad Sci U S A 76(4): 1967-1971. Bruno, C., A. Martinuzzi, Y. Tang, A. L. Andreu, F. Pallotti, E. Bonilla, S. Shanske, J. Fu, C. M. Sue, C. Angelini, S. DiMauro and G. Manfredi (1999). "A stop-codon mutation in the human mtDNA cytochrome c oxidase I gene disrupts the functional structure of complex IV." Am J Hum Genet 65(3): 611-620. Bruno, C., F. M. Santorelli, S. Assereto, E. Tonoli, A. Tessa, M. Traverso, S. Scapolan, M. Bado, S. Tedeschi and C. Minetti (2003). "Progressive exercise intolerance associated with a new muscle-restricted nonsense mutation (G142X) in the mitochondrial cytochrome b gene." Muscle Nerve 28(4): 508-511. Bueler, H. (2009). "Impaired mitochondrial dynamics and function in the pathogenesis of Parkinson's disease." Exp Neurol 218(2): 235-246. Bugiani, M., V. Tiranti, L. Farina, G. Uziel and M. Zeviani (2005). "Novel mutations in COX15 in a long surviving Leigh syndrome patient with cytochrome c oxidase deficiency." J Med Genet 42(5): e28. Bultema, J. B., H. P. Braun, E. J. Boekema and R. Kouril (2009). "Megacomplex organization of the oxidative phosphorylation system by structural analysis of respiratory supercomplexes from potato." Biochim Biophys Acta 1787(1): 60-67. Cabezon, E., M. G. Montgomery, A. G. Leslie and J. E. Walker (2003). "The structure of bovine F1-ATPase in complex with its regulatory protein IF1." Nat Struct Biol 10(9): 744-750. Campos, Y., A. Garcia-Redondo, M. A. Fernandez-Moreno, M. Martinez-Pardo, G. Goda, J. C. Rubio, M. A. Martin, P. del Hoyo, A. Cabello, B. Bornstein, R. Garesse and J. Arenas (2001). "Early-onset multisystem mitochondrial disorder caused by a nonsense mutation in the mitochondrial DNA cytochrome C oxidase II gene." Ann Neurol 50(3): 409-413. Carrodeguas, J. A., R. Kobayashi, S. E. Lim, W. C. Copeland and D. F. Bogenhagen (1999). "The accessory subunit of Xenopus laevis mitochondrial DNA polymerase gamma increases processivity of the catalytic subunit of human DNA polymerase gamma and is related to class II aminoacyl-tRNA synthetases." Mol Cell Biol 19(6): 4039-4046. Carroll, J., I. M. Fearnley, R. J. Shannon, J. Hirst and J. E. Walker (2003). "Analysis of the subunit composition of complex I from bovine heart mitochondria." Mol Cell Proteomics 2(2): 117-126. Cartailler, J. P. and H. Luecke (2003). "X-ray crystallographic analysis of lipid-protein interactions in the bacteriorhodopsin purple membrane." Annu Rev Biophys Biomol Struct 32: 285-310. Bibliografía 239 Cartoni, R. and J. C. Martinou (2009). "Role of mitofusin 2 mutations in the physiopathology of Charcot-Marie-Tooth disease type 2A." Exp Neurol 218(2): 268-273. Casas, F., P. Rochard, A. Rodier, I. Cassar-Malek, S. Marchal-Victorion, R. J. Wiesner, G. Cabello and C. Wrutniak (1999). "A variant form of the nuclear triiodothyronine receptor c-ErbAalpha1 plays a direct role in regulation of mitochondrial RNA synthesis." Mol Cell Biol 19(12): 7913-7924. Castri, L., M. Melendez-Obando, R. Villegas-Palma, R. Barrantes, H. Raventos, R. Pereira, D. Luiselli, D. Pettener and L. Madrigal (2009). "Mitochondrial polymorphisms are associated both with increased and decreased longevity." Hum Hered 67(3): 147-153. Catelli, M. L., V. Alvarez-Iglesias, A. Gomez-Carballa, A. Mosquera-Miguel, C. Romanini, A. Borosky, J. Amigo, A. Carracedo, C. Vullo and A. Salas (2011). "The impact of modern migrations on present-day multi-ethnic Argentina as recorded on the mitochondrial DNA genome." BMC Genet 12: 77. Catucci, L., V. M. Lattanzio, S. Lobasso, A. Agostiano and A. Corcelli (2004). "Role of endogenous lipids in the chromophore regeneration of bacteriorhodopsin." Bioelectrochemistry 63(1-2): 111-115. Cavalier-Smith, T. (1987). "Eukaryotes with no mitochondria." Nature 326(6111): 332333. Cavalier-Smith, T. (2006). "Origin of mitochondria by intracellular enslavement of a photosynthetic purple bacterium." Proc Biol Sci 273(1596): 1943-1952. Cecchini, G. (2003). "Function and structure of complex II of the respiratory chain." Annu Rev Biochem 72: 77-109. Cizkova, A., V. Stranecky, J. A. Mayr, M. Tesarova, V. Havlickova, J. Paul, R. Ivanek, A. W. Kuss, H. Hansikova, V. Kaplanova, M. Vrbacky, H. Hartmannova, L. Noskova, T. Honzik, Z. Drahota, M. Magner, K. Hejzlarova, W. Sperl, J. Zeman, J. Houstek and S. Kmoch (2008). "TMEM70 mutations cause isolated ATP synthase deficiency and neonatal mitochondrial encephalocardiomyopathy." Nat Genet 40(11): 1288-1290. Clayton, D. A. (1982). "Replication of animal mitochondrial DNA." Cell 28(4): 693-705. Clayton, D. A. (1991). "Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA." Annu Rev Cell Biol 7: 453-478. Coenen, M. J., L. P. van den Heuvel, C. Ugalde, M. Ten Brinke, L. G. Nijtmans, F. J. Trijbels, S. Beblo, E. M. Maier, A. C. Muntau and J. A. Smeitink (2004). "Cytochrome c oxidase biogenesis in a patient with a mutation in COX10 gene." Ann Neurol 56(4): 560-564. Collinson, I. R., M. J. Runswick, S. K. Buchanan, I. M. Fearnley, J. M. Skehel, M. J. van Raaij, D. E. Griffiths and J. E. Walker (1994). "Fo membrane domain of ATP synthase from bovine heart mitochondria: purification, subunit composition, and reconstitution with F1-ATPase." Biochemistry 33(25): 7971-7978. Cortes-Hernandez, P., M. E. Vazquez-Memije and J. J. Garcia (2007). "ATP6 homoplasmic mutations inhibit and destabilize the human F1F0-ATP synthase Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 240 without preventing enzyme assembly and oligomerization." J Biol Chem 282(2): 1051-1058. Cotney, J., S. E. McKay and G. S. Shadel (2009). "Elucidation of separate, but collaborative functions of the rRNA methyltransferase-related human mitochondrial transcription factors B1 and B2 in mitochondrial biogenesis reveals new insight into maternally inherited deafness." Hum Mol Genet 18(14): 26702682. Couoh-Cardel, S. J., S. Uribe-Carvajal, S. Wilkens and J. J. Garcia-Trejo (2010). "Structure of dimeric F1F0-ATP synthase." J Biol Chem 285(47): 36447-36455. Craven, L., H. A. Tuppen, G. D. Greggains, S. J. Harbottle, J. L. Murphy, L. M. Cree, A. P. Murdoch, P. F. Chinnery, R. W. Taylor, R. N. Lightowlers, M. Herbert and D. M. Turnbull (2010). "Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of mitochondrial DNA disease." Nature 465(7294): 82-85. Crimi, M., S. Galbiati, I. Moroni, A. Bordoni, M. P. Perini, E. Lamantea, M. Sciacco, M. Zeviani, I. Biunno, M. Moggio, G. Scarlato and G. P. Comi (2003). "A missense mutation in the mitochondrial ND5 gene associated with a Leigh-MELAS overlap syndrome." Neurology 60(11): 1857-1861. Cruciat, C. M., K. Hell, H. Folsch, W. Neupert and R. A. Stuart (1999). "Bcs1p, an AAAfamily member, is a chaperone for the assembly of the cytochrome bc(1) complex." EMBO J 18(19): 5226-5233. Curran, S. P., D. Leuenberger, W. Oppliger and C. M. Koehler (2002). "The Tim9pTim10p complex binds to the transmembrane domains of the ADP/ATP carrier." EMBO J 21(5): 942-953. Chacinska, A., C. M. Koehler, D. Milenkovic, T. Lithgow and N. Pfanner (2009). "Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms." Cell 138(4): 628-644. Chacinska, A., M. Lind, A. E. Frazier, J. Dudek, C. Meisinger, A. Geissler, A. Sickmann, H. E. Meyer, K. N. Truscott, B. Guiard, N. Pfanner and P. Rehling (2005). "Mitochondrial presequence translocase: switching between TOM tethering and motor recruitment involves Tim21 and Tim17." Cell 120(6): 817-829. Chan, N. C. and T. Lithgow (2008). "The peripheral membrane subunits of the SAM complex function codependently in mitochondrial outer membrane biogenesis." Mol Biol Cell 19(1): 126-136. Chance, B. and G. R. Williams (1955). "A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation." Nature 176(4475): 250-254. Chen, H. and D. C. Chan (2009). "Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases." Hum Mol Genet 18(R2): R169176. Chen, J. Q., M. Delannoy, C. Cooke and J. D. Yager (2004). "Mitochondrial localization of ERalpha and ERbeta in human MCF7 cells." Am J Physiol Endocrinol Metab 286(6): E1011-1022. Chow, B. Y., X. Han, A. S. Dobry, X. Qian, A. S. Chuong, M. Li, M. A. Henninger, G. M. Belfort, Y. Lin, P. E. Monahan and E. S. Boyden (2010). "High-performance Bibliografía 241 genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps." Nature 463(7277): 98-102. Christian, B. E. and L. L. Spremulli (2009). "Evidence for an active role of IF3mt in the initiation of translation in mammalian mitochondria." Biochemistry 48(15): 32693278. Chu, L. K., C. W. Yen and M. A. El-Sayed (2010). "Bacteriorhodopsin-based photoelectrochemical cell." Biosens Bioelectron 26(2): 620-626. Chung, H. K. and L. L. Spremulli (1990). "Purification and characterization of elongation factor G from bovine liver mitochondria." J Biol Chem 265(34): 21000-21004. D'Aurelio, M., C. D. Gajewski, G. Lenaz and G. Manfredi (2006). "Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids." Hum Mol Genet 15(13): 2157-2169. Danon, A. and W. Stoeckenius (1974). "Photophosphorylation in Halobacterium halobium." Proc Natl Acad Sci U S A 71(4): 1234-1238. Davies, K. M., M. Strauss, B. Daum, J. H. Kief, H. D. Osiewacz, A. Rycovska, V. Zickermann and W. Kuhlbrandt (2011). "Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria." Proc Natl Acad Sci U S A 108(34): 14121-14126. Davis, A. J., N. N. Alder, R. E. Jensen and A. E. Johnson (2007). "The Tim9p/10p and Tim8p/13p complexes bind to specific sites on Tim23p during mitochondrial protein import." Mol Biol Cell 18(2): 475-486. De Coo, I. F., W. O. Renier, W. Ruitenbeek, H. J. Ter Laak, M. Bakker, H. Schagger, B. A. Van Oost and H. J. Smeets (1999). "A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome b gene associated with parkinsonism/MELAS overlap syndrome." Ann Neurol 45(1): 130-133. de la Torre, J. R., L. M. Christianson, O. Beja, M. T. Suzuki, D. M. Karl, J. Heidelberg and E. F. DeLong (2003). "Proteorhodopsin genes are distributed among divergent marine bacterial taxa." Proc Natl Acad Sci U S A 100(22): 12830-12835. de Lonlay, P., I. Valnot, A. Barrientos, M. Gorbatyuk, A. Tzagoloff, J. W. Taanman, E. Benayoun, D. Chretien, N. Kadhom, A. Lombes, H. O. de Baulny, P. Niaudet, A. Munnich, P. Rustin and A. Rotig (2001). "A mutant mitochondrial respiratory chain assembly protein causes complex III deficiency in patients with tubulopathy, encephalopathy and liver failure." Nat Genet 29(1): 57-60. De Meirleir, L., S. Seneca, E. Damis, B. Sepulchre, A. Hoorens, E. Gerlo, M. T. Garcia Silva, E. M. Hernandez, W. Lissens and R. Van Coster (2003). "Clinical and diagnostic characteristics of complex III deficiency due to mutations in the BCS1L gene." Am J Med Genet A 121A(2): 126-131. De Meirleir, L., S. Seneca, W. Lissens, I. De Clercq, F. Eyskens, E. Gerlo, J. Smet and R. Van Coster (2004). "Respiratory chain complex V deficiency due to a mutation in the assembly gene ATP12." J Med Genet 41(2): 120-124. Deisseroth, K. (2011). "Optogenetics." Nat Methods 8(1): 26-29. Diaz, F., H. Fukui, S. Garcia and C. T. Moraes (2006). "Cytochrome c oxidase is required for the assembly/stability of respiratory complex I in mouse fibroblasts." Mol Cell Biol 26(13): 4872-4881. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 242 Diaz, F., H. Kotarsky, V. Fellman and C. T. Moraes (2011). "Mitochondrial disorders caused by mutations in respiratory chain assembly factors." Semin Fetal Neonatal Med 16(4): 197-204. Disotell, T. R. (1999). "Human evolution: the southern route to Asia." Curr Biol 9(24): R925-928. Dudkina, N. V., H. Eubel, W. Keegstra, E. J. Boekema and H. P. Braun (2005). "Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III." Proc Natl Acad Sci U S A 102(9): 3225-3229. Dudkina, N. V., J. Heinemeyer, S. Sunderhaus, E. J. Boekema and H. P. Braun (2006). "Respiratory chain supercomplexes in the plant mitochondrial membrane." Trends Plant Sci 11(5): 232-240. Dudkina, N. V., R. Kouril, K. Peters, H. P. Braun and E. J. Boekema (2010). "Structure and function of mitochondrial supercomplexes." Biochim Biophys Acta 1797(67): 664-670. Dudkina, N. V., M. Kudryashev, H. Stahlberg and E. J. Boekema (2011). "Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography." Proc Natl Acad Sci U S A 108(37): 15196-15200. Dunn, R. J., N. R. Hackett, J. M. McCoy, B. H. Chao, K. Kimura and H. G. Khorana (1987). "Structure-function studies on bacteriorhodopsin. I. Expression of the bacterio-opsin gene in Escherichia coli." J Biol Chem 262(19): 9246-9254. Duvezin-Caubet, S., M. Koppen, J. Wagener, M. Zick, L. Israel, A. Bernacchia, R. Jagasia, E. I. Rugarli, A. Imhof, W. Neupert, T. Langer and A. S. Reichert (2007). "OPA1 processing reconstituted in yeast depends on the subunit composition of the m-AAA protease in mitochondria." Mol Biol Cell 18(9): 3582-3590. Echtay, K. S., E. Winkler and M. Klingenberg (2000). "Coenzyme Q is an obligatory cofactor for uncoupling protein function." Nature 408(6812): 609-613. Egholm, M., O. Buchardt, L. Christensen, C. Behrens, S. M. Freier, D. A. Driver, R. H. Berg, S. K. Kim, B. Norden and P. E. Nielsen (1993). "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules." Nature 365(6446): 566-568. Ehses, S., I. Raschke, G. Mancuso, A. Bernacchia, S. Geimer, D. Tondera, J. C. Martinou, B. Westermann, E. I. Rugarli and T. Langer (2009). "Regulation of OPA1 processing and mitochondrial fusion by m-AAA protease isoenzymes and OMA1." J Cell Biol 187(7): 1023-1036. Endo, T., H. Yamamoto and M. Esaki (2003). "Functional cooperation and separation of translocators in protein import into mitochondria, the double-membrane bounded organelles." J Cell Sci 116(Pt 16): 3259-3267. Enriquez, J. A., P. Fernandez-Silva, N. Garrido-Perez, M. J. Lopez-Perez, A. PerezMartos and J. Montoya (1999). "Direct regulation of mitochondrial RNA synthesis by thyroid hormone." Mol Cell Biol 19(1): 657-670. Enriquez, J. A., P. Fernandez-Silva and J. Montoya (1999). "Autonomous regulation in mammalian mitochondrial DNA transcription." Biol Chem 380(7-8): 737-747. Bibliografía 243 Entelis, N. S., O. A. Kolesnikova, S. Dogan, R. P. Martin and I. A. Tarassov (2001). "5 S rRNA and tRNA import into human mitochondria. Comparison of in vitro requirements." J Biol Chem 276(49): 45642-45653. Ernster, L. and G. Dallner (1995). "Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function." Biochim Biophys Acta 1271(1): 195-204. Estornell, E., R. Fato, C. Castelluccio, M. Cavazzoni, G. Parenti Castelli and G. Lenaz (1992). "Saturation kinetics of coenzyme Q in NADH and succinate oxidation in beef heart mitochondria." FEBS Lett 311(2): 107-109. Eubel, H., J. Heinemeyer and H. P. Braun (2004). "Identification and characterization of respirasomes in potato mitochondria." Plant Physiol 134(4): 1450-1459. Eubel, H., J. Heinemeyer, S. Sunderhaus and H. P. Braun (2004). "Respiratory chain supercomplexes in plant mitochondria." Plant Physiol Biochem 42(12): 937-942. Eubel, H., L. Jansch and H. P. Braun (2003). "New insights into the respiratory chain of plant mitochondria. Supercomplexes and a unique composition of complex II." Plant Physiol 133(1): 274-286. Ewart, G., R. Lightowlers, Y. Z. Zhang, V. J. Balan, N. Kennaway and R. A. Capaldi (1990). "Tissue specificity and defects in human cytochrome c oxidase." Biochim Biophys Acta 1018(2-3): 223-224. Falkenberg, M., M. Gaspari, A. Rantanen, A. Trifunovic, N. G. Larsson and C. M. Gustafsson (2002). "Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA." Nat Genet 31(3): 289-294. Fato, R., M. Battino, M. Degli Esposti, G. Parenti Castelli and G. Lenaz (1986). "Determination of partition and lateral diffusion coefficients of ubiquinones by fluorescence quenching of n-(9-anthroyloxy)stearic acids in phospholipid vesicles and mitochondrial membranes." Biochemistry 25(11): 3378-3390. Feagin, J. E. (2000). "Mitochondrial genome diversity in parasites." Int J Parasitol 30(4): 371-390. Fernandez-Ayala, D. J., A. Sanz, S. Vartiainen, K. K. Kemppainen, M. Babusiak, E. Mustalahti, R. Costa, T. Tuomela, M. Zeviani, J. Chung, K. M. O'Dell, P. Rustin and H. T. Jacobs (2009). "Expression of the Ciona intestinalis alternative oxidase (AOX) in Drosophila complements defects in mitochondrial oxidative phosphorylation." Cell Metab 9(5): 449-460. Fernandez-Silva, P., J. A. Enriquez and J. Montoya (2003). "Replication and transcription of mammalian mitochondrial DNA." Exp Physiol 88(1): 41-56. Fernandez-Vizarra, E., M. Bugiani, P. Goffrini, F. Carrara, L. Farina, E. Procopio, A. Donati, G. Uziel, I. Ferrero and M. Zeviani (2007). "Impaired complex III assembly associated with BCS1L gene mutations in isolated mitochondrial encephalopathy." Hum Mol Genet 16(10): 1241-1252. Fernandez-Vizarra, E., J. A. Enriquez, A. Perez-Martos, J. Montoya and P. FernandezSilva (2008). "Mitochondrial gene expression is regulated at multiple levels and differentially in the heart and liver by thyroid hormones." Curr Genet 54(1): 1322. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 244 Fernandez-Vizarra, E., Fernandez-Silva, P. (2006). "Isolation of Mitochondria from Mammalian Tissues and Cultured Cells." Cell Biology: A Laboratory Handbook. J. E. Celis, Elsevier-Academic Press 3rd: : 69-77. Fernandez-Vizarra, E., M. J. Lopez-Perez and J. A. Enriquez (2002). "Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells." Methods 26(4): 292-297. Fernandez-Vizarra, E., V. Tiranti and M. Zeviani (2009). "Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects." Biochim Biophys Acta 1793(1): 200-211. Fiumera, H. L., M. J. Dunham, S. A. Saracco, C. A. Butler, J. A. Kelly and T. D. Fox (2009). "Translocation and assembly of mitochondrially coded Saccharomyces cerevisiae cytochrome c oxidase subunit Cox2 by Oxa1 and Yme1 in the absence of Cox18." Genetics 182(2): 519-528. Fowler, L. R. and S. H. Richardson (1963). "Studies on the electron transfer system. L. On the mechanism of reconstitution of the mitochondrial electron transfer system." J Biol Chem 238: 456-463. Frey, T. G. and M. G. Sun (2008). "Correlated light and electron microscopy illuminates the role of mitochondrial inner membrane remodeling during apoptosis." Biochim Biophys Acta 1777(7-8): 847-852. Fridlender, B., M. Fry, A. Bolden and A. Weissbach (1972). "A new synthetic RNAdependent DNA polymerase from human tissue culture cells (HeLa-fibroblastsynthetic oligonucleotides-template-purified enzymes)." Proc Natl Acad Sci U S A 69(2): 452-455. Friedrich, T. and B. Bottcher (2004). "The gross structure of the respiratory complex I: a Lego System." Biochim Biophys Acta 1608(1): 1-9. Friedrich, T., S. Geibel, R. Kalmbach, I. Chizhov, K. Ataka, J. Heberle, M. Engelhard and E. Bamberg (2002). "Proteorhodopsin is a light-driven proton pump with variable vectoriality." J Mol Biol 321(5): 821-838. Futai, M., T. Noumi and M. Maeda (1989). "ATP synthase (H+-ATPase): results by combined biochemical and molecular biological approaches." Annu Rev Biochem 58: 111-136. Gallardo, M. E., R. Moreno-Loshuertos, C. Lopez, M. Casqueiro, J. Silva, F. Bonilla, S. Rodriguez de Cordoba and J. A. Enriquez (2006). "m.6267G>A: a recurrent mutation in the human mitochondrial DNA that reduces cytochrome c oxidase activity and is associated with tumors." Hum Mutat 27(6): 575-582. Garfinkel, D. (1957). "Preparation and properties of a microsomal DPNH-cytochrome c reductase." Arch Biochem Biophys 71(1): 100-110. Gaur, R., D. Grasso, P. P. Datta, P. D. Krishna, G. Das, A. Spencer, R. K. Agrawal, L. Spremulli and U. Varshney (2008). "A single mammalian mitochondrial translation initiation factor functionally replaces two bacterial factors." Mol Cell 29(2): 180-190. Genova, M. L., A. Baracca, A. Biondi, G. Casalena, M. Faccioli, A. I. Falasca, G. Formiggini, G. Sgarbi, G. Solaini and G. Lenaz (2008). "Is supercomplex Bibliografía 245 organization of the respiratory chain required for optimal electron transfer activity?" Biochim Biophys Acta 1777(7-8): 740-746. Genova, M. L., C. Bianchi and G. Lenaz (2005). "Supercomplex organization of the mitochondrial respiratory chain and the role of the Coenzyme Q pool: pathophysiological implications." Biofactors 25(1-4): 5-20. Genova, M. L. and G. Lenaz (2011). "New developments on the functions of coenzyme Q in mitochondria." Biofactors 37(5): 330-354. Gentle, I., K. Gabriel, P. Beech, R. Waller and T. Lithgow (2004). "The Omp85 family of proteins is essential for outer membrane biogenesis in mitochondria and bacteria." J Cell Biol 164(1): 19-24. Ghezzi, D., P. Arzuffi, M. Zordan, C. Da Re, C. Lamperti, C. Benna, P. D'Adamo, D. Diodato, R. Costa, C. Mariotti, G. Uziel, C. Smiderle and M. Zeviani (2011). "Mutations in TTC19 cause mitochondrial complex III deficiency and neurological impairment in humans and flies." Nat Genet 43(3): 259-263. Ghezzi, D., P. Goffrini, G. Uziel, R. Horvath, T. Klopstock, H. Lochmuller, P. D'Adamo, P. Gasparini, T. M. Strom, H. Prokisch, F. Invernizzi, I. Ferrero and M. Zeviani (2009). "SDHAF1, encoding a LYR complex-II specific assembly factor, is mutated in SDH-defective infantile leukoencephalopathy." Nat Genet 41(6): 654656. Giles, R. E., H. Blanc, H. M. Cann and D. C. Wallace (1980). "Maternal inheritance of human mitochondrial DNA." Proc Natl Acad Sci U S A 77(11): 6715-6719. Gilkerson, R. W., J. M. Selker and R. A. Capaldi (2003). "The cristal membrane of mitochondria is the principal site of oxidative phosphorylation." FEBS Lett 546(23): 355-358. Gilles-Gonzalez, M. A., D. M. Engelman and H. G. Khorana (1991). "Structure-function studies of bacteriorhodopsin XV. Effects of deletions in loops B-C and E-F on bacteriorhodopsin chromophore and structure." J Biol Chem 266(13): 8545-8550. Giorgi, C., D. De Stefani, A. Bononi, R. Rizzuto and P. Pinton (2009). "Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum." Int J Biochem Cell Biol 41(10): 1817-1827. Giovannoni, S. J., L. Bibbs, J. C. Cho, M. D. Stapels, R. Desiderio, K. L. Vergin, M. S. Rappe, S. Laney, L. J. Wilhelm, H. J. Tripp, E. J. Mathur and D. F. Barofsky (2005). "Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11." Nature 438(7064): 82-85. Gleyzer, N., K. Vercauteren and R. C. Scarpulla (2005). "Control of mitochondrial transcription specificity factors (TFB1M and TFB2M) by nuclear respiratory factors (NRF-1 and NRF-2) and PGC-1 family coactivators." Mol Cell Biol 25(4): 1354-1366. Glick, B. S., A. Brandt, K. Cunningham, S. Muller, R. L. Hallberg and G. Schatz (1992). "Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism." Cell 69(5): 809-822. Goldschmidt, C. R., M. Ottolenghi and R. Korenstein (1976). "On the primary quantum yields in the bacteriorhodopsin photocycle." Biophys J 16(7): 839-843. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 246 Gomez, L. A., J. S. Monette, J. D. Chavez, C. S. Maier and T. M. Hagen (2009). "Supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain decline in the aging rat heart." Arch Biochem Biophys 490(1): 30-35. Gourdon, P., A. Alfredsson, A. Pedersen, E. Malmerberg, M. Nyblom, M. Widell, R. Berntsson, J. Pinhassi, M. Braiman, O. Hansson, N. Bonander, G. Karlsson and R. Neutze (2008). "Optimized in vitro and in vivo expression of proteorhodopsin: a seven-transmembrane proton pump." Protein Expr Purif 58(1): 103-113. Gradinaru, V., K. R. Thompson and K. Deisseroth (2008). "eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications." Brain Cell Biol 36(1-4): 129-139. Gradinaru, V., F. Zhang, C. Ramakrishnan, J. Mattis, R. Prakash, I. Diester, I. Goshen, K. R. Thompson and K. Deisseroth (2010). "Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics." Cell 141(1): 154-165. Gray, H. and T. W. Wong (1992). "Purification and identification of subunit structure of the human mitochondrial DNA polymerase." J Biol Chem 267(9): 5835-5841. Gray, M. W., G. Burger and B. F. Lang (1999). "Mitochondrial evolution." Science 283(5407): 1476-1481. Grigorieff, N. (1998). "Three-dimensional structure of bovine NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) at 22 A in ice." J Mol Biol 277(5): 1033-1046. Grossman, L. I. and M. I. Lomax (1997). "Nuclear genes for cytochrome c oxidase." Biochim Biophys Acta 1352(2): 174-192. Guy, J., X. Qi, F. Pallotti, E. A. Schon, G. Manfredi, V. Carelli, A. Martinuzzi, W. W. Hauswirth and A. S. Lewin (2002). "Rescue of a mitochondrial deficiency causing Leber Hereditary Optic Neuropathy." Ann Neurol 52(5): 534-542. Haack, T. B., K. Danhauser, B. Haberberger, J. Hoser, V. Strecker, D. Boehm, G. Uziel, E. Lamantea, F. Invernizzi, J. Poulton, B. Rolinski, A. Iuso, S. Biskup, T. Schmidt, H. W. Mewes, I. Wittig, T. Meitinger, M. Zeviani and H. Prokisch (2010). "Exome sequencing identifies ACAD9 mutations as a cause of complex I deficiency." Nat Genet 42(12): 1131-1134. Hackenbrock, C. R. (1966). "Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria." J Cell Biol 30(2): 269-297. Hackenbrock, C. R. (1968). "Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. II. Electron transport-linked ultrastructural transformations in mitochondria." J Cell Biol 37(2): 345-369. Hackenbrock, C. R., B. Chazotte and S. S. Gupte (1986). "The random collision model and a critical assessment of diffusion and collision in mitochondrial electron transport." J Bioenerg Biomembr 18(5): 331-368. Hagerhall, C. (1997). "Succinate: quinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme." Biochim Biophys Acta 1320(2): 107-141. Hakkaart, G. A., E. P. Dassa, H. T. Jacobs and P. Rustin (2006). "Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration." EMBO Rep 7(3): 341-345. Bibliografía 253 Lenaz, G. and M. L. Genova (2009). "Mobility and function of coenzyme Q (ubiquinone) in the mitochondrial respiratory chain." Biochim Biophys Acta 1787(6): 563-573. Lenaz, G. and M. L. Genova (2010). "Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject." Antioxid Redox Signal 12(8): 961-1008. Li, Y., J. Dudek, B. Guiard, N. Pfanner, P. Rehling and W. Voos (2004). "The presequence translocase-associated protein import motor of mitochondria. Pam16 functions in an antagonistic manner to Pam18." J Biol Chem 279(36): 3804738054. Liao, M. J., K. S. Huang and H. G. Khorana (1984). "Regeneration of native bacteriorhodopsin structure from fragments." J Biol Chem 259(7): 4200-4204. Lim, S. E., M. J. Longley and W. C. Copeland (1999). "The mitochondrial p55 accessory subunit of human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance." J Biol Chem 274(53): 38197-38203. Lithgow, T. and A. Schneider (2010). "Evolution of macromolecular import pathways in mitochondria, hydrogenosomes and mitosomes." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 365(1541): 799-817. Litonin, D., M. Sologub, Y. Shi, M. Savkina, M. Anikin, M. Falkenberg, C. M. Gustafsson and D. Temiakov (2010). "Human mitochondrial transcription revisited: only TFAM and TFB2M are required for transcription of the mitochondrial genes in vitro." J Biol Chem 285(24): 18129-18133. Liu, X., C. N. Kim, J. Yang, R. Jemmerson and X. Wang (1996). "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c." Cell 86(1): 147-157. Loeffen, J. L., J. A. Smeitink, J. M. Trijbels, A. J. Janssen, R. H. Triepels, R. C. Sengers and L. P. van den Heuvel (2000). "Isolated complex I deficiency in children: clinical, biochemical and genetic aspects." Hum Mutat 15(2): 123-134. Logan, D. C. (2006). "The mitochondrial compartment." J Exp Bot 57(6): 1225-1243. Luecke, H. (2000). "Atomic resolution structures of bacteriorhodopsin photocycle intermediates: the role of discrete water molecules in the function of this lightdriven ion pump." Biochim Biophys Acta 1460(1): 133-156. Lutter, R., M. Saraste, H. S. van Walraven, M. J. Runswick, M. Finel, J. F. Deatherage and J. E. Walker (1993). "F1F0-ATP synthase from bovine heart mitochondria: development of the purification of a monodisperse oligomycin-sensitive ATPase." Biochem J 295 ( Pt 3): 799-806. Magalhaes, P. J., A. L. Andreu and E. A. Schon (1998). "Evidence for the presence of 5S rRNA in mammalian mitochondria." Mol Biol Cell 9(9): 2375-2382. Mahata, B., S. Mukherjee, S. Mishra, A. Bandyopadhyay and S. Adhya (2006). "Functional delivery of a cytosolic tRNA into mutant mitochondria of human cells." Science 314(5798): 471-474. Mai, Z., S. Ghosh, M. Frisardi, B. Rosenthal, R. Rogers and J. Samuelson (1999). "Hsp60 is targeted to a cryptic mitochondrion-derived organelle ("crypton") in the Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 254 microaerophilic protozoan parasite Entamoeba histolytica." Mol Cell Biol 19(3): 2198-2205. Man, D., W. Wang, G. Sabehi, L. Aravind, A. F. Post, R. Massana, E. N. Spudich, J. L. Spudich and O. Beja (2003). "Diversification and spectral tuning in marine proteorhodopsins." EMBO J 22(8): 1725-1731. Manfredi, G., J. Fu, J. Ojaimi, J. E. Sadlock, J. Q. Kwong, J. Guy and E. A. Schon (2002). "Rescue of a deficiency in ATP synthesis by transfer of MTATP6, a mitochondrial DNA-encoded gene, to the nucleus." Nat Genet 30(4): 394-399. Marella, M., B. B. Seo, E. Nakamaru-Ogiso, J. T. Greenamyre, A. Matsuno-Yagi and T. Yagi (2008). "Protection by the NDI1 gene against neurodegeneration in a rotenone rat model of Parkinson's disease." PLoS One 3(1): e1433. Marti, T. (1998). "Refolding of bacteriorhodopsin from expressed polypeptide fragments." J Biol Chem 273(15): 9312-9322. Martinelli, P. and E. I. Rugarli (2010). "Emerging roles of mitochondrial proteases in neurodegeneration." Biochim Biophys Acta 1797(1): 1-10. Martinez-Caballero, S., S. M. Grigoriev, J. M. Herrmann, M. L. Campo and K. W. Kinnally (2007). "Tim17p regulates the twin pore structure and voltage gating of the mitochondrial protein import complex TIM23." J Biol Chem 282(6): 35843593. Massa, V., E. Fernandez-Vizarra, S. Alshahwan, E. Bakhsh, P. Goffrini, I. Ferrero, P. Mereghetti, P. D'Adamo, P. Gasparini and M. Zeviani (2008). "Severe infantile encephalomyopathy caused by a mutation in COX6B1, a nucleus-encoded subunit of cytochrome c oxidase." Am J Hum Genet 82(6): 1281-1289. Mazat, J. P., R. Rossignol, M. Malgat, C. Rocher, B. Faustin and T. Letellier (2001). "What do mitochondrial diseases teach us about normal mitochondrial functions...that we already knew: threshold expression of mitochondrial defects." Biochim Biophys Acta 1504(1): 20-30. McCulloch, V., B. L. Seidel-Rogol and G. S. Shadel (2002). "A human mitochondrial transcription factor is related to RNA adenine methyltransferases and binds Sadenosylmethionine." Mol Cell Biol 22(4): 1116-1125. McKenzie, M., M. Lazarou, D. R. Thorburn and M. T. Ryan (2006). "Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients." J Mol Biol 361(3): 462-469. McKenzie, M. and M. T. Ryan (2010). "Assembly factors of human mitochondrial complex I and their defects in disease." IUBMB Life 62(7): 497-502. McKenzie, M., E. J. Tucker, A. G. Compton, M. Lazarou, C. George, D. R. Thorburn and M. T. Ryan (2011). "Mutations in the gene encoding C8orf38 block complex I assembly by inhibiting production of the mitochondria-encoded subunit ND1." J Mol Biol 414(3): 413-426. Meyer, B., I. Wittig, E. Trifilieff, M. Karas and H. Schagger (2007). "Identification of two proteins associated with mammalian ATP synthase." Mol Cell Proteomics 6(10): 1690-1699. Minauro-Sanmiguel, F., S. Wilkens and J. J. Garcia (2005). "Structure of dimeric mitochondrial ATP synthase: novel F0 bridging features and the structural basis of Bibliografía 255 mitochondrial cristae biogenesis." Proc Natl Acad Sci U S A 102(35): 1235612358. Minczuk, M., M. A. Papworth, J. C. Miller, M. P. Murphy and A. Klug (2008). "Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA." Nucleic Acids Res 36(12): 3926-3938. Minenko, A. N., L. A. Novikova, V. N. Luzikov and I. E. Kovaleva (2008). "Import of hybrid forms of CYP11A1 into yeast mitochondria." Biochim Biophys Acta 1780(10): 1121-1130. Mitchell, P. (1961). "Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism." Nature 191: 144-148. Mitchell, P. and J. Moyle (1967). "Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation." Nature 213(5072): 137-139. Montoya, J., D. Ojala and G. Attardi (1981). "Distinctive features of the 5'-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs." Nature 290(5806): 465-470. Mootha, V. K., P. Lepage, K. Miller, J. Bunkenborg, M. Reich, M. Hjerrild, T. Delmonte, A. Villeneuve, R. Sladek, F. Xu, G. A. Mitchell, C. Morin, M. Mann, T. J. Hudson, B. Robinson, J. D. Rioux and E. S. Lander (2003). "Identification of a gene causing human cytochrome c oxidase deficiency by integrative genomics." Proc Natl Acad Sci U S A 100(2): 605-610. Moraes, C. T., R. Dey and A. Barrientos (2001). "Transmitochondrial technology in animal cells." Methods Cell Biol 65: 397-412. Moreno-Lastres (2012). "Mitochondrial Complex I plays an essential role in human respirasome assembly." Cell Metabolism. Moreno-Loshuertos, R., R. Acin-Perez, P. Fernandez-Silva, N. Movilla, A. Perez-Martos, S. R. de Cordoba, M. E. Gallardo and J. A. Enriquez (2006). "Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants." Nat Genet 38(11): 1261-1268. Moreno-Loshuertos, R., R. Acin-Perez, P. Fernandez-Silva, N. Movilla, A. Perez-Martos, S. Rodriguez de Cordoba, M. E. Gallardo and J. A. Enriquez (2006). "Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants." Nat Genet 38(11): 1261-1268. Morris, R. M., M. S. Rappe, S. A. Connon, K. L. Vergin, W. A. Siebold, C. A. Carlson and S. J. Giovannoni (2002). "SAR11 clade dominates ocean surface bacterioplankton communities." Nature 420(6917): 806-810. Muller, J. M., D. Milenkovic, B. Guiard, N. Pfanner and A. Chacinska (2008). "Precursor oxidation by Mia40 and Erv1 promotes vectorial transport of proteins into the mitochondrial intermembrane space." Mol Biol Cell 19(1): 226-236. Munnich, A., P. Rustin, A. Rotig, D. Chretien, J. P. Bonnefont, C. Nuttin, V. Cormier, A. Vassault, P. Parvy, J. Bardet and et al. (1992). "Clinical aspects of mitochondrial disorders." J Inherit Metab Dis 15(4): 448-455. Muratovska, A., R. N. Lightowlers, R. W. Taylor, D. M. Turnbull, R. A. Smith, J. A. Wilce, S. W. Martin and M. P. Murphy (2001). "Targeting peptide nucleic acid (PNA) oligomers to mitochondria within cells by conjugation to lipophilic cations: Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 256 implications for mitochondrial DNA replication, expression and disease." Nucleic Acids Res 29(9): 1852-1863. Muratovska, A., R. N. Lightowlers, R. W. Taylor, J. A. Wilce and M. P. Murphy (2001). "Targeting large molecules to mitochondria." Adv Drug Deliv Rev 49(1-2): 189198. Naderi, J., M. Somayajulu-Nitu, A. Mukerji, P. Sharda, M. Sikorska, H. BorowyBorowski, B. Antonsson and S. Pandey (2006). "Water-soluble formulation of Coenzyme Q10 inhibits Bax-induced destabilization of mitochondria in mammalian cells." Apoptosis 11(8): 1359-1369. Nagaike, T., T. Suzuki, Y. Tomari, C. Takemoto-Hori, F. Negayama, K. Watanabe and T. Ueda (2001). "Identification and characterization of mammalian mitochondrial tRNA nucleotidyltransferases." J Biol Chem 276(43): 40041-40049. Nagel, G., D. Ollig, M. Fuhrmann, S. Kateriya, A. M. Musti, E. Bamberg and P. Hegemann (2002). "Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae." Science 296(5577): 2395-2398. Nagel, G., T. Szellas, W. Huhn, S. Kateriya, N. Adeishvili, P. Berthold, D. Ollig, P. Hegemann and E. Bamberg (2003). "Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel." Proc Natl Acad Sci U S A 100(24): 1394013945. Nagel, G., T. Szellas, S. Kateriya, N. Adeishvili, P. Hegemann and E. Bamberg (2005). "Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels." Biochem Soc Trans 33(Pt 4): 863-866. Naini, A. B., J. Lu, P. Kaufmann, R. A. Bernstein, M. Mancuso, E. Bonilla, M. Hirano and S. DiMauro (2005). "Novel mitochondrial DNA ND5 mutation in a patient with clinical features of MELAS and MERRF." Arch Neurol 62(3): 473-476. Naldini, L., U. Blomer, F. H. Gage, D. Trono and I. M. Verma (1996). "Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11382-11388. Nelson, B. D., K. Luciakova, R. Li and S. Betina (1995). "The role of thyroid hormone and promoter diversity in the regulation of nuclear encoded mitochondrial proteins." Biochim Biophys Acta 1271(1): 85-91. Ngo, H. B., J. T. Kaiser and D. C. Chan (2011). "The mitochondrial transcription and packaging factor Tfam imposes a U-turn on mitochondrial DNA." Nat Struct Mol Biol 18(11): 1290-1296. Niemann, S. and U. Muller (2000). "Mutations in SDHC cause autosomal dominant paraganglioma, type 3." Nat Genet 26(3): 268-270. Nijtmans, L. G., N. S. Henderson, G. Attardi and I. J. Holt (2001). "Impaired ATP synthase assembly associated with a mutation in the human ATP synthase subunit 6 gene." J Biol Chem 276(9): 6755-6762. Nolden, M., S. Ehses, M. Koppen, A. Bernacchia, E. I. Rugarli and T. Langer (2005). "The m-AAA protease defective in hereditary spastic paraplegia controls ribosome assembly in mitochondria." Cell 123(2): 277-289. Nouws, J., L. Nijtmans, S. M. Houten, M. van den Brand, M. Huynen, H. Venselaar, S. Hoefs, J. Gloerich, J. Kronick, T. Hutchin, P. Willems, R. Rodenburg, R. Bibliografía 257 Wanders, L. van den Heuvel, J. Smeitink and R. O. Vogel (2010). "Acyl-CoA dehydrogenase 9 is required for the biogenesis of oxidative phosphorylation complex I." Cell Metab 12(3): 283-294. Nozaki, Y., N. Matsunaga, T. Ishizawa, T. Ueda and N. Takeuchi (2008). "HMRF1L is a human mitochondrial translation release factor involved in the decoding of the termination codons UAA and UAG." Genes Cells 13(5): 429-438. Oca-Cossio, J., L. Kenyon, H. Hao and C. T. Moraes (2003). "Limitations of allotopic expression of mitochondrial genes in mammalian cells." Genetics 165(2): 707720. Ohsakaya, S., M. Fujikawa, T. Hisabori and M. Yoshida (2011). "Knockdown of DAPIT (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue) results in loss of ATP synthase in mitochondria." J Biol Chem 286(23): 20292-20296. Ojala, D., J. Montoya and G. Attardi (1981). "tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria." Nature 290(5806): 470-474. Olson, M. W., Y. Wang, R. H. Elder and L. S. Kaguni (1995). "Subunit structure of mitochondrial DNA polymerase from Drosophila embryos. Physical and immunological studies." J Biol Chem 270(48): 28932-28937. Ongwijitwat, S. and M. T. Wong-Riley (2005). "Is nuclear respiratory factor 2 a master transcriptional coordinator for all ten nuclear-encoded cytochrome c oxidase subunits in neurons?" Gene 360(1): 65-77. Oquendo, C. E., H. Antonicka, E. A. Shoubridge, W. Reardon and G. K. Brown (2004). "Functional and genetic studies demonstrate that mutation in the COX15 gene can cause Leigh syndrome." J Med Genet 41(7): 540-544. Oswald, C., U. Krause-Buchholz and G. Rodel (2009). "Knockdown of human COX17 affects assembly and supramolecular organization of cytochrome c oxidase." J Mol Biol 389(3): 470-479. Otera, H., Y. Taira, C. Horie, Y. Suzuki, H. Suzuki, K. Setoguchi, H. Kato, T. Oka and K. Mihara (2007). "A novel insertion pathway of mitochondrial outer membrane proteins with multiple transmembrane segments." J Cell Biol 179(7): 1355-1363. Pacheu-Grau, D., A. Gomez-Duran, M. J. Lopez-Perez, J. Montoya and E. Ruiz-Pesini (2010). "Mitochondrial pharmacogenomics: barcode for antibiotic therapy." Drug Discov Today 15(1-2): 33-39. Pacheu-Grau, D., A. Gomez-Duran, J. Montoya and E. Ruiz-Pesini (2010). "Influence of mtDNA genetic variation on antibiotic therapy." Pharmacogenomics 11(9): 11851187. Pagliarini, D. J., S. E. Calvo, B. Chang, S. A. Sheth, S. B. Vafai, S. E. Ong, G. A. Walford, C. Sugiana, A. Boneh, W. K. Chen, D. E. Hill, M. Vidal, J. G. Evans, D. R. Thorburn, S. A. Carr and V. K. Mootha (2008). "A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology." Cell 134(1): 112-123. Pagniez-Mammeri, H., S. Loublier, A. Legrand, P. Benit, P. Rustin and A. Slama (2012). "Mitochondrial complex I deficiency of nuclear origin I. Structural genes." Mol Genet Metab 105(2): 163-172. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 258 Pagniez-Mammeri, H., M. Rak, A. Legrand, P. Benit, P. Rustin and A. Slama (2012). "Mitochondrial complex I deficiency of nuclear origin II. Non-structural genes." Mol Genet Metab 105(2): 173-179. Palade, G. E. (1953). "An electron microscope study of the mitochondrial structure." J Histochem Cytochem 1(4): 188-211. Palmer, C. S., L. D. Osellame, D. Stojanovski and M. T. Ryan (2011). "The regulation of mitochondrial morphology: intricate mechanisms and dynamic machinery." Cell Signal 23(10): 1534-1545. Pandey, P. C. (2006). "Bacteriorhodopsin--novel biomolecule for nano devices." Anal Chim Acta 568(1-2): 47-56. Papadopoulou, L. C., C. M. Sue, M. M. Davidson, K. Tanji, I. Nishino, J. E. Sadlock, S. Krishna, W. Walker, J. Selby, D. M. Glerum, R. V. Coster, G. Lyon, E. Scalais, R. Lebel, P. Kaplan, S. Shanske, D. C. De Vivo, E. Bonilla, M. Hirano, S. DiMauro and E. A. Schon (1999). "Fatal infantile cardioencephalomyopathy with COX deficiency and mutations in SCO2, a COX assembly gene." Nat Genet 23(3): 333337. Papucci, L., N. Schiavone, E. Witort, M. Donnini, A. Lapucci, A. Tempestini, L. Formigli, S. Zecchi-Orlandini, G. Orlandini, G. Carella, R. Brancato and S. Capaccioli (2003). "Coenzyme q10 prevents apoptosis by inhibiting mitochondrial depolarization independently of its free radical scavenging property." J Biol Chem 278(30): 28220-28228. Parfait, B., D. Chretien, A. Rotig, C. Marsac, A. Munnich and P. Rustin (2000). "Compound heterozygous mutations in the flavoprotein gene of the respiratory chain complex II in a patient with Leigh syndrome." Hum Genet 106(2): 236-243. Pebay-Peyroula, E., R. Neutze and E. M. Landau (2000). "Lipidic cubic phase crystallization of bacteriorhodopsin and cryotrapping of intermediates: towards resolving a revolving photocycle." Biochim Biophys Acta 1460(1): 119-132. Perales-Clemente, E., M. P. Bayona-Bafaluy, A. Perez-Martos, A. Barrientos, P. Fernandez-Silva and J. A. Enriquez (2008). "Restoration of electron transport without proton pumping in mammalian mitochondria." Proc Natl Acad Sci U S A 105(48): 18735-18739. Perales-Clemente, E., P. Fernandez-Silva, R. Acin-Perez, A. Perez-Martos and J. A. Enriquez (2011). "Allotopic expression of mitochondrial-encoded genes in mammals: achieved goal, undemonstrated mechanism or impossible task?" Nucleic Acids Res 39(1): 225-234. Perales-Clemente, E., E. Fernandez-Vizarra, R. Acin-Perez, N. Movilla, M. P. BayonaBafaluy, R. Moreno-Loshuertos, A. Perez-Martos, P. Fernandez-Silva and J. A. Enriquez (2010). "Five entry points of the mitochondrially encoded subunits in mammalian complex I assembly." Mol Cell Biol 30(12): 3038-3047. Perales-Clemente, E., E. Fernandez-Vizarra, R. Acin-Perez, N. Movilla, M. P. BayonaBafaluy, R. Moreno-Loshuertos, A. Perez-Martos, P. Fernandez-Silva and J. A. Enriquez (2011). "Five entry points of the mitochondrially encoded subunits in mammalian complex I assembly." Mol Cell Biol 30(12): 3038-3047. Peters, K., N. V. Dudkina, L. Jansch, H. P. Braun and E. J. Boekema (2008). "A structural investigation of complex I and I+III2 supercomplex from Zea mays at 11-13 A Bibliografía 259 resolution: assignment of the carbonic anhydrase domain and evidence for structural heterogeneity within complex I." Biochim Biophys Acta 1777(1): 8493. Poe, B. G., 3rd, C. F. Duffy, M. A. Greminger, B. J. Nelson and E. A. Arriaga (2010). "Detection of heteroplasmy in individual mitochondrial particles." Anal Bioanal Chem 397(8): 3397-3407. Popovic, D. M. and A. A. Stuchebrukhov (2011). "Coupled electron and proton transfer reactions during the O-->E transition in bovine cytochrome c oxidase." Biochim Biophys Acta. Pulkes, T., L. Eunson, V. Patterson, A. Siddiqui, N. W. Wood, I. P. Nelson, J. A. Morgan-Hughes and M. G. Hanna (1999). "The mitochondrial DNA G13513A transition in ND5 is associated with a LHON/MELAS overlap syndrome and may be a frequent cause of MELAS." Ann Neurol 46(6): 916-919. Puranam, R. S. and G. Attardi (2001). "The RNase P associated with HeLa cell mitochondria contains an essential RNA component identical in sequence to that of the nuclear RNase P." Mol Cell Biol 21(2): 548-561. Rabier, D., C. Diry, A. Rotig, P. Rustin, B. Heron, J. Bardet, P. Parvy, G. Ponsot, C. Marsac, J. M. Saudubray, A. Munnich and P. Kamoun (1998). "Persistent hypocitrullinaemia as a marker for mtDNA NARP T 8993 G mutation?" J Inherit Metab Dis 21(3): 216-219. Rahman, S., R. B. Blok, H. H. Dahl, D. M. Danks, D. M. Kirby, C. W. Chow, J. Christodoulou and D. R. Thorburn (1996). "Leigh syndrome: clinical features and biochemical and DNA abnormalities." Ann Neurol 39(3): 343-351. Ranaghan, M. J., S. Shima, L. Ramos, D. S. Poulin, G. Whited, S. Rajasekaran, J. A. Stuart, A. D. Albert and R. R. Birge (2010). "Photochemical and thermal stability of green and blue proteorhodopsins: implications for protein-based bioelectronic devices." J Phys Chem B 114(44): 14064-14070. Reddy, P. H. and U. P. Shirendeb (2011). "Mutant huntingtin, abnormal mitochondrial dynamics, defective axonal transport of mitochondria, and selective synaptic degeneration in Huntington's disease." Biochim Biophys Acta. Reddy, P. H., R. Tripathi, Q. Troung, K. Tirumala, T. P. Reddy, V. Anekonda, U. P. Shirendeb, M. J. Calkins, A. P. Reddy, P. Mao and M. Manczak (2011). "Abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration as early events in Alzheimer's disease: Implications to mitochondria-targeted antioxidant therapeutics." Biochim Biophys Acta. Rhouda, T., D. Martinez-Redondo, A. Gomez-Duran, N. Elmtili, M. Idaomar, C. DiezSanchez, J. Montoya, M. J. Lopez-Perez and E. Ruiz-Pesini (2009). "Moroccan mitochondrial genetic background suggests prehistoric human migrations across the Gibraltar Strait." Mitochondrion 9(6): 402-407. Richardson, D. R., D. J. Lane, E. M. Becker, M. L. Huang, M. Whitnall, Y. Suryo Rahmanto, A. D. Sheftel and P. Ponka (2010). "Mitochondrial iron trafficking and the integration of iron metabolism between the mitochondrion and cytosol." Proc Natl Acad Sci U S A 107(24): 10775-10782. Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 260 Rosca, M. G., E. J. Vazquez, J. Kerner, W. Parland, M. P. Chandler, W. Stanley, H. N. Sabbah and C. L. Hoppel (2008). "Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation." Cardiovasc Res 80(1): 30-39. Rubio-Cosials, A., J. F. Sidow, N. Jimenez-Menendez, P. Fernandez-Millan, J. Montoya, H. T. Jacobs, M. Coll, P. Bernado and M. Sola (2011). "Human mitochondrial transcription factor A induces a U-turn structure in the light strand promoter." Nat Struct Mol Biol 18(11): 1281-1289. Rubio, M. A., J. J. Rinehart, B. Krett, S. Duvezin-Caubet, A. S. Reichert, D. Soll and J. D. Alfonzo (2008). "Mammalian mitochondria have the innate ability to import tRNAs by a mechanism distinct from protein import." Proc Natl Acad Sci U S A 105(27): 9186-9191. Ruiz-Pesini, E., A. C. Lapena, C. Diez-Sanchez, A. Perez-Martos, J. Montoya, E. Alvarez, M. Diaz, A. Urries, L. Montoro, M. J. Lopez-Perez and J. A. Enriquez (2000). "Human mtDNA haplogroups associated with high or reduced spermatozoa motility." Am J Hum Genet 67(3): 682-696. Rutter, J., D. R. Winge and J. D. Schiffman (2010). "Succinate dehydrogenase - Assembly, regulation and role in human disease." Mitochondrion 10(4): 393-401. Sabehi, G., R. Massana, J. P. Bielawski, M. Rosenberg, E. F. Delong and O. Beja (2003). "Novel Proteorhodopsin variants from the Mediterranean and Red Seas." Environ Microbiol 5(10): 842-849. Sagan, L. (1967). "On the origin of mitosing cells." J Theor Biol 14(3): 255-274. Saitoh, T., M. Igura, T. Obita, T. Ose, R. Kojima, K. Maenaka, T. Endo and D. Kohda (2007). "Tom20 recognizes mitochondrial presequences through dynamic equilibrium among multiple bound states." EMBO J 26(22): 4777-4787. Santos-Ocana, C., T. Q. Do, S. Padilla, P. Navas and C. F. Clarke (2002). "Uptake of exogenous coenzyme Q and transport to mitochondria is required for bc1 complex stability in yeast coq mutants." J Biol Chem 277(13): 10973-10981. Satoh, M. and T. Kuroiwa (1991). "Organization of multiple nucleoids and DNA molecules in mitochondria of a human cell." Exp Cell Res 196(1): 137-140. Sazanov, L. A., S. Y. Peak-Chew, I. M. Fearnley and J. E. Walker (2000). "Resolution of the membrane domain of bovine complex I into subcomplexes: implications for the structural organization of the enzyme." Biochemistry 39(24): 7229-7235. Scaglia, F., J. A. Towbin, W. J. Craigen, J. W. Belmont, E. O. Smith, S. R. Neish, S. M. Ware, J. V. Hunter, S. D. Fernbach, G. D. Vladutiu, L. J. Wong and H. Vogel (2004). "Clinical spectrum, morbidity, and mortality in 113 pediatric patients with mitochondrial disease." Pediatrics 114(4): 925-931. Scarpulla, R. C. (2002). "Nuclear activators and coactivators in mammalian mitochondrial biogenesis." Biochim Biophys Acta 1576(1-2): 1-14. Scarpulla, R. C. (2006). "Nuclear control of respiratory gene expression in mammalian cells." J Cell Biochem 97(4): 673-683. Scarpulla, R. C. (2008). "Transcriptional paradigms in mammalian mitochondrial biogenesis and function." Physiol Rev 88(2): 611-638. Scott, I. (2010). "The role of mitochondria in the mammalian antiviral defense system." Mitochondrion 10(4): 316-320. Bibliografía 261 Schafer, E., N. A. Dencher, J. Vonck and D. N. Parcej (2007). "Three-dimensional structure of the respiratory chain supercomplex I1III2IV1 from bovine heart mitochondria." Biochemistry 46(44): 12579-12585. Schafer, E., H. Seelert, N. H. Reifschneider, F. Krause, N. A. Dencher and J. Vonck (2006). "Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes." J Biol Chem 281(22): 15370-15375. Schagger, H. (1995). "Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes." Methods Enzymol 260: 190-202. Schagger, H. (1996). "Electrophoretic techniques for isolation and quantification of oxidative phosphorylation complexes from human tissues." Methods Enzymol 264: 555-566. Schagger, H., R. de Coo, M. F. Bauer, S. Hofmann, C. Godinot and U. Brandt (2004). "Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I." J Biol Chem 279(35): 36349-36353. Schagger, H. and K. Pfeiffer (2000). "Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria." Embo J 19(8): 1777-1783. Schagger, H. and K. Pfeiffer (2001). "The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes." J Biol Chem 276(41): 37861-37867. Scheller, K. and C. E. Sekeris (2003). "The effects of steroid hormones on the transcription of genes encoding enzymes of oxidative phosphorylation." Exp Physiol 88(1): 129-140. Schneider, A. and L. Marechal-Drouard (2000). "Mitochondrial tRNA import: are there distinct mechanisms?" Trends Cell Biol 10(12): 509-513. Schneider, H., J. J. Lemasters and C. R. Hackenbrock (1982). "Lateral diffusion of ubiquinone during electron transfer in phospholipidand ubiquinone-enriched mitochondrial membranes." J Biol Chem 257(18): 10789-10793. Schon, E. A., S. DiMauro, M. Hirano and R. W. Gilkerson (2010). "Therapeutic prospects for mitochondrial disease." Trends Mol Med 16(6): 268-276. Schuelke, M., H. Krude, B. Finckh, E. Mayatepek, A. Janssen, M. Schmelz, F. Trefz, F. Trijbels and J. Smeitink (2002). "Septo-optic dysplasia associated with a new mitochondrial cytochrome b mutation." Ann Neurol 51(3): 388-392. Schulte, U., V. Haupt, A. Abelmann, W. Fecke, B. Brors, T. Rasmussen, T. Friedrich and H. Weiss (1999). "A reductase/isomerase subunit of mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) carries an NADPH and is involved in the biogenesis of the complex." J Mol Biol 292(3): 569-580. Schwartzbach, C. J. and L. L. Spremulli (1989). "Bovine mitochondrial protein synthesis elongation factors. Identification and initial characterization of an elongation factor Tu-elongation factor Ts complex." J Biol Chem 264(32): 19125-19131. Sekeris, C. E. (1990). "The mitochondrial genome: a possible primary site of action of steroid hormones." In Vivo 4(5): 317-320. Selak, M. A., S. M. Armour, E. D. MacKenzie, H. Boulahbel, D. G. Watson, K. D. Mansfield, Y. Pan, M. C. Simon, C. B. Thompson and E. Gottlieb (2005). Organización modular de la cadena respiratoria y Optogenética mitocondrial 262 "Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-alpha prolyl hydroxylase." Cancer Cell 7(1): 77-85. Seneca, S., M. Abramowicz, W. Lissens, M. F. Muller, E. Vamos and L. de Meirleir (1996). "A mitochondrial DNA microdeletion in a newborn girl with transient lactic acidosis." J Inherit Metab Dis 19(2): 115-118. Seo, B. B., T. Kitajima-Ihara, E. K. Chan, I. E. Scheffler, A. Matsuno-Yagi and T. Yagi (1998). "Molecular remedy of complex I defects: rotenone-insensitive internal NADH-quinone oxidoreductase of Saccharomyces cerevisiae mitochondria restores the NADH oxidase activity of complex I-deficient mammalian cells." Proc Natl Acad Sci U S A 95(16): 9167-9171. Seo, B. B., E. Nakamaru-Ogiso, T. R. Flotte, A. Matsuno-Yagi and T. Yagi (2006). "In vivo complementation of complex I by the yeast Ndi1 enzyme. Possible application for treatment of Parkinson disease." J Biol Chem 281(20): 1425014255. Setoguchi, K., H. Otera and K. Mihara (2006). "Cytosolic factorand TOM-independent import of C-tail-anchored mitochondrial outer membrane proteins." EMBO J 25(24): 5635-5647. Shadel, G. S. (2008). "Expression and maintenance of mitochondrial DNA: new insights into human disease pathology." Am J Pathol 172(6): 1445-1456. Shariff, K., S. Ghosal and A. Matouschek (2004). "The force exerted by the membrane potential during protein import into the mitochondrial matrix." Biophys J 86(6): 3647-3652. Shutt, T. E. and G. S. Shadel (2010). "A compendium of human mitochondrial gene expression machinery with links to disease." Environ Mol Mutagen 51(5): 360379. Sirrenberg, C., M. Endres, H. Folsch, R. A. Stuart, W. Neupert and M. Brunner (1998). "Carrier protein import into mitochondria mediated by the intermembrane proteins Tim10/Mrs11 and Tim12/Mrs5." Nature 391(6670): 912-915. Skulachev, V. P. (1998). "Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades." FEBS Lett 423(3): 275-280. Smeitink, J. A., M. Zeviani, D. M. Turnbull and H. T. Jacobs (2006). "Mitochondrial medicine: a metabolic perspective on the pathology of oxidative phosphorylation disorders." Cell Metab 3(1): 9-13. Smirnov, A., N. Entelis, R. P. Martin and I. Tarassov (2011). "Biological significance of 5S rRNA import into human mitochondria: role of ribosomal protein MRP-L18." Genes Dev 25(12): 1289-1305. Smirnov, A., I. Tarassov, A. M. Mager-Heckel, M. Letzelter, R. P. Martin, I. A. Krasheninnikov and N. Entelis (2008). "Two distinct structural elements of 5S rRNA are needed for its import into human mitochondria." RNA 14(4): 749-759. Smits, P., J. Smeitink and L. van den Heuvel (2010). "Mitochondrial translation and beyond: processes implicated in combined oxidative phosphorylation deficiencies." J Biomed Biotechnol 2010: 737385. Soleimanpour-Lichaei, H. R., I. Kuhl, M. Gaisne, J. F. Passos, M. Wydro, J. Rorbach, R. Temperley, N. Bonnefoy, W. Tate, R. Lightowlers and Z. Chrzanowska-