Repositorio Institucional de Documentos

2012 59 Margarita Roka Elobo Caracterización de parásitos intestinales asociados a la infección por VIH en Guinea Ecuatorial Departamento Director/es Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública Goñi Cepero, María Pilar Clavel Parrilla, Antonio Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Margarita Roka Elobo CARACTERIZACIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES ASOCIADOS A LA INFECCIÓN POR VIH EN GUINEA ECUATORIAL Director/es Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública Goñi Cepero, María Pilar Clavel Parrilla, Antonio Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento de Microbiología, Medicina Preventiva y Salud P úblic a Caracterización d e parásitos i n t e s t i n a l e s asociados a la i n f e cc i ó n por VIH en Guinea E c u a t o r i a l Memoria presentada por M a r g a ri t a Roka E l o b o Para optar al grado de D o c t o r por la Universidad de Zaragoza Dirigida p o r Dra. M.ª Pilar Goñi C e p e r o Dr. A n t o n i o Clavel P a rrill a El Dr. Antonio Clavel Parrilla, Catedrático de Parasitología, del Departamento de Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza, Certifica: Que el trabajo titulado “Caracterización de parásitos intestinales asociados a la infección por VIH en Guinea Ecuatorial”, que corresponde al proyecto de tesis de igual título aprobado el 9 de julio de 2012, realizado por Dña. Margarita Roka Elobo en el Departamento de Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública bajo mi dirección, reúne a mi juicio méritos suficientes para poder optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, por lo que doy la oportuna autorización para su presentación. Y para que conste, firmo el presente en Zaragoza a 29 de junio de 2012. Fdo. Antonio Clavel Parrilla La Dra. Mª Pilar Goñi Cepero, Profesora Ayudante-Doctor de Parasitología, del Departamento de Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza, Certifica: Que el trabajo titulado “Caracterización de parásitos intestinales asociados a la infección por VIH en Guinea Ecuatorial”, que corresponde al proyecto de tesis de igual título aprobado el 9 de julio de 2012, realizado por Dña. Margarita Roka Elobo en el Departamento de Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública bajo mi dirección, reúne a mi juicio méritos suficientes para poder optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, por lo que doy la oportuna autorización para su presentación. Y para que conste, firmo el presente en Zaragoza a 29 de junio de 2012. Fdo. Mª Pilar Goñi Cepero ABREVIATURAS ______________________________________________________________________ ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico. ARN: Ácido ribonucleico. ARV: Antirretrovirales. AZT: Zidovudina. BLAST: Basic local alignment search tool. BrEt: Bromuro de etidio. CTA: Centro de Tratamiento Ambulatorio. D4T: Estavudina. DDI: Didanosina. dNTP: Desoxinucleótido trifosfato. EFV: Efavirenz. ELISA: Ensayo inmunoenzimático. ESBA: Enseñanza Secundaria Básica. FASTA: Buscador de secuencias similares. FP: Formación Profesional. IC: Intervalo de confianza. ICR: Inmunocromatografía rápida. IDH: Indicadores de desarrollo humano. INC: inmunocompetente. IO: Infecciones oportunistas. ISA: Inmunosupresión avanzada. ISM: Inmunosupresión moderada. ISS: Inmunosupresión severa. KDa: Kilodaltons. LPV: Lopinavir. Mg.: Miligramos. MINSABS: Ministerio de Sanidad y Bienestar Social de Guinea Ecuatorial. ml.: Mililitros. mM: Milimolar. NVP: Nevirapina. OMS: Organización Mundial de la Salud. pb: pares de bases. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. PTMH: Prevención de la transmisión de la madre al hijo del VIH. PVVIH: Persona que vive con el VIH. PVVS: Persona que vive con el virus del SIDA. RFLP: Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción. rpm: Revoluciones por minuto. S/V: sin valor. SAF: Formalina-ácido-acético-acetato de sodio. SIDA: Síndrome de inmunodeficiencia adquirida. SNP: Sustitución nucleotídica puntual. SSUrRNA: Subunidad pequeña del ARN ribosomal. TARGA: Tratamiento antirretroviral de gran actividad. TARV: Tratamiento antirretroviral. TBE: Tampón Tris-borato-EDTA. 3TC: Lamivudina. tpi: Triosafosfatoisomerasa. UREI: Unidad de Referencia de las Enfermedades Infecciosas. µg: Microgramos. µl: Microlitros. VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana. VPN: Valor predictivo negativo. VPP: Valor predictivo positivo. ZNm: Ziehl-Neelsen modificado. INDICE DE CONTENIDO ______________________________________________________________________ i ÍNDICE DE CONTENIDO CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1 1.1 DATOS GEOGRÁFICOS E INDICADORES DE DESARROLLO HUMANO DE LA REPÚBLICA DE GUINEA ECUATORIAL .................................................. 1 1.2 RELACIÓN VIH/SIDA E INFECCIONES PARASITARIAS INTESTINALES 6 1.2.1 Helmintos patógenos ....................................................................................... 7 1.2.1.1 Trichuris trichiura .................................................................................... 8 1.2.1.2 Ascaris lumbricoides .............................................................................. 10 1.2.1.3 Uncinarias ............................................................................................... 11 1.2.1.4 Strongyloides stercoralis ........................................................................ 13 1.2.1.5 Schistosoma spp. ..................................................................................... 14 1.2.2 Protozoos patógenos ...................................................................................... 16 1.2.2.1 Entamoeba spp. ...................................................................................... 16 1.2.2.2 Giardia spp. ............................................................................................ 19 1.2.2.3 Cryptosporidium spp. ............................................................................. 21 CAPÍTULO 2: OBJETIVOS 2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 31 2.1 Objetivo general ................................................................................................... 32 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 32 CAPÍTULO 3: MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 37 3.1 Pacientes y muestras ............................................................................................. 37 3.1.1 Muestreo y tamaño muestral.......................................................................... 37 3.1.2 Recogida de la muestra y conservación ......................................................... 37 3.1.3 Definición de variables y recogida de datos .................................................. 38 3.1.4 Muestras de la población objeto del estudio .................................................. 44 3.2 Identificación de parásitos por observación microscópica ................................... 45 3.2.1 Técnica microscópica con suero fisiológico y lugol ..................................... 45 3.2.2 Técnica de concentración de heces ................................................................ 46 3.2.3 Tinción ácido alcohol resistente de Ziehl-Neelsen modificado (ZNm) ........ 47 3.3 Técnica de detección de antígenos por inmunocromatografía rápida (ICR) ........ 48 3.4 Técnicas de biología molecular ............................................................................ 49 3.4.1 Extracción de ADN ....................................................................................... 49 3.4.2 Técnicas moleculares para la detección de Entamoeba spp. ......................... 52 3.4.3 Técnicas moleculares para la detección de Cryptosporidium spp. ................ 54 3.4.4 Técnicas moleculares para la detección y genotipado de Giardia spp. ......... 56 3.4.5 Electroforesis en gel de agarosa .................................................................... 60 3.4.6 Purificación del DNA a partir de la segunda PCR ........................................ 62 3.4.7 Secuenciación ................................................................................................ 63 3.5 Análisis estadísticos de los datos .......................................................................... 64 3.6 Consideraciones éticas .......................................................................................... 65 CAPÍTULO 4: TÉCNICAS MICROSCÓPICAS 4. RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES ................................................... 71 4.1 Descripción de la muestra..................................................................................... 71 4.1.1 Participantes VIH positivos ........................................................................... 71 4.1.2 Participantes VIH negativos .......................................................................... 77 4.2 Resultados de la aplicación de las técnicas microscópicas para la detección de parásitos intestinales ................................................................................................... 79 4.2.1 Concordancia entre las técnicas microscópicas con y sin concentración ...... 79 4.2.2 Resultados de los participantes del estudio ................................................... 82 4.2.2.1 Participantes VIH positivos .................................................................... 82 4.2.2.2 Participantes VIH negativos ................................................................... 91 4.2.3 Comparación entre los participantes VIH positivos y VIH negativos .......... 97 5. DISCUSIÓN SOBRE LOS RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES ...................................................................................................................................... 105 5.1 Concentración de la muestra vs visión en fresco ................................................ 105 iii 5.2 Identificación de parásitos por observación microscópica y técnica de detección de antígenos por inmunocromatografía rápida ......................................................... 106 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES SOBRE LOS RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES ......................................................................................................... 123 6.1 Conclusiones ....................................................................................................... 123 6.2 Recomendaciones ............................................................................................... 124 CAPÍTULO 5: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Entamoeba histolytica, dispar y moshkovskii 7. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Entamoeba histolytica, dispar y moshkovskii EN PACIENTES VIH POSITIVOS DE GUINEA ECUATORIAL 131 7.1 Malabo –Isla de Bioko- ...................................................................................... 131 7.1.1 Descripción de los pacientes infectados por E. histolytica/dispar/moshkovskii .............................................................................................................................. 131 7.1.2 Identificación de especies de Entamoeba por PCR en muestras procedentes de participantes VIH positivos ............................................................................. 132 7.1.3 Identificación de especies de Entamoeba por PCR en muestras procedentes de participantes VIH negativos............................................................................. 137 7.1.4 Comparación entre los participantes VIH positivos y VIH negativos......... 137 7.1.5 Identificación de especies de Entamoeba por PCR en muestras procedentes de participantes seleccionados al azar .................................................................. 138 7.2 Bata –Región Continental- ................................................................................. 140 7.2.1 Descripción de los pacientes infectados por E. histolytica/dispar/moshkovskii .............................................................................................................................. 140 7.2.2 Identificación de especies de Entamoeba por PCR en muestras procedentes de participantes VIH positivos ............................................................................. 141 7.2.3 Identificación de especies por PCR en muestras procedentes de participantes VIH negativos ....................................................................................................... 144 7.2.4 Comparación entre los participantes VIH positivos y VIH negativos......... 145 7.2.5 Identificación de especies por PCR en muestras procedentes de participantes seleccionados al azar ............................................................................................ 145 7.3 Comparación de los resultados encontrados en las dos regiones ....................... 148 7.4 Secuenciación de los productos de amplificación de Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii .................................................................................. 148 7.5 Concordancia entre las técnicas utilizadas para el diagnóstico de Entamoeba spp. .................................................................................................................................. 149 7.5.1 Las frecuencias positivas encontradas en cada caso fueron las siguientes: . 149 8. DISCUSION DE LA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Entamoeba histolytica, dispar y moshkovskii ................................................................................. 157 9. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES DE LA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Entamoeba histolytica, dispar y moshkovskii ........................... 167 9.1 Conclusiones ....................................................................................................... 167 9.2 Recomendaciones ............................................................................................... 168 CAPÍTULO 6: TÉCNICAS MOLECULARES DE Cryptosporidium spp 10. EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE Cryptosporidium spp. EN GUINEA ECUATORIAL ........................................................................................................... 173 10.1 Determinación de especies de Cryptosporidium .............................................. 174 10.1.1 Asociaciones encontradas en las dos regiones .......................................... 176 10.1.2 Secuenciación de los productos de amplificación de Cryptosporidium .... 176 11. DISCUSIÓN DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE Cryptosporidium spp. ............................................................................................................................... 181 12. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE Cryptosporidium spp. ................................................................ 187 12.1 Conclusiones ..................................................................................................... 187 12.2 Recomendaciones ............................................................................................. 187 CAPÍTULO 7: GENOTIPIFICACIÓN DE Giardia duodenalis 13. GENOTIPIFICACIÓN DE Giardia duodenalis POR TÉCNICAS MOLECULARES ....................................................................................................... 193 13.1 Identificación de genotipos de Giardia duodenalis .......................................... 195 13.2 Determinación de asociaciones entre los genotipo de Giardia duodenalis y las variables del estudio ................................................................................................. 196 13.2.1 Resultados de los participantes VIH positivos .......................................... 196 13.2.2 Resultados de los participantes VIH negativos ......................................... 197 13.2.3 Resultado de las muestras recogidas al azar .............................................. 197 13.2.4 Comparación entre los participantes VIH positivos y VIH negativos ...... 198 13.3 Concordancia entre las técnicas de ICR con o sin Visión directa .................... 198 CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN INTRODUCCION ______________________________________________________________________ Introducción 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1 DATOS GEOGRÁFICOS E INDICADORES DE DESARROLLO HUMANO DE LA REPÚBLICA DE GUINEA ECUATORIAL Datos geográficos Figura I-1: Mapa de la República de Guinea Ecuatorial. La República de Guinea Ecuatorial está situada en el África Subsahariana, al oeste del África Central, concretamente en el Golfo de Guinea, en el Océano Atlántico. Ocupa el 0,09% de la superficie del continente africano. Tiene una frontera marítima con la República Federal de Nigeria y Sao Tomé y Príncipe y tiene una extensión superficial de 28.051 km2 que se distribuye en dos regiones (Figura I-1): La Región Continental, limita al norte con Camerún, al sur y al este con Gabón, tiene una superficie de 26.000 km2. La región continental está formada por altiplanos accidentados por algunos macizos que van descendiendo hasta la costa, que por lo general es baja y arenosa. Pertenecen a esta región las Islas de Corisco de 15 km2, Elobey Grande 2,27 km2 y Elobey Chico de 0,19 km2. Estas dos últimas islas inhabitables. La Región Insular formada por varias islas: Bioko, Annobón y los islotes adyacentes. La Isla de Bioko es de origen volcánico, con una fertilidad excepcional, tiene una superficie de 2.017 km2, en ella se encuentra la capital de la nación, Malabo, y está separada 270 millas marinas de la Región Continental. La Isla de Annobón, con sus 17 km2 se encuentra al Sur de la República de Sao Tomé y Príncipe, a 600 millas de Malabo. Presenta un relieve abrupto, poco favorable a la producción agrícola. El país tiene un clima ecuatorial, muy lluvioso, con una temperatura media anual de 25º C y precipitaciones de hasta 2.000 mm/año. Algunos indicadores de desarrollo humano de Guinea Ecuatorial Población: Según los datos del III Censo General de Población y Viviendas de 2001, la estimación para el 2010 era de una población total de Guinea Ecuatorial de 1.622.000 habitantes. Según datos del Informe sobre Desarrollo Humano del año 2010, la población total, considerando ambos sexos, es de 720.200 habitantes, con una población urbana del 39,9%. La tasa de crecimiento anual es del 2,6%, con una edad media de la población de 19,1 años, y una tasa de fecundidad global de 5,36 hijos por mujer (World population prospects, 2008). Introducción 3 Esto significa que la distribución de la población presenta características de una estructura joven, cuya pirámide de edades tiene una base ensanchada y una cúspide fina (Figura I-2), confirmando así su elevada fecundidad y natalidad, así como una mortalidad bastante elevada que implica la existencia de mucha población en las primeras edades de vida y pocos ancianos. Figura I-2: Pirámide poblacional de Guinea Ecuatorial. Fuente: United Nations Department of Economic and Social Affairs/Population Division. World Population Prospects: The 2010, Volume II: Demographic Profiles Economía Guinea Ecuatorial está situado entre los países de desarrollo medio, ocupando el número 117, con un PIB per cápita de 28.857 (PPA en US$ de 2005), un ingreso nacional bruto (INB) de 17.608 $ (IDH, 2010). La economía está basada fundamentalmente en la explotación forestal (madera) y petrolera. Educación La tasa de alfabetización de adultos (mayores de 15 años) es del 93,3%, 7,7 años esperados de instrucción y un promedio de 5,4 años de educación por habitante y con un gasto público en educación del 0,7% del PIB (IDH, 2010). Varones Mujeres Salud La esperanza de vida al nacer es de 53 años para varones y 54 años para mujeres. La tasa de mortalidad de niños menores de cinco años es de 145 por 1.000 nacidos vivos y entre 15 a 60 años es de 373 en varones y 355 en mujeres por 1000 habitantes y la mortalidad materna es de 280 por 100.000 nacidos vivos (Observatorio Mundial de la Salud, 2009). El gasto público en salud es del 1,7% del PIB (IDH, 2010). Las principales causas de carga de enfermedad en el país son, por orden prevalencia: malaria, infecciones respiratorias bajas, enfermedades diarreicas y VIH/SIDA (Observatorio africano de salud, 2010), como se muestran en la Figura I-3. Figura I-3: Causas de carga de enfermedad. % total años de vida ajustados por discapacidad. G. E. Fuente: African Health Obsevatory at www.afro.who.int La mayoría de estas enfermedades también constituyen las principales causas de muerte: infecciones respiratorias de vías bajas, malaria, enfermedades diarreicas, VIH/SIDA y tuberculosis (Figura I-4; WHO. World Health Statistics, 2010). Introducción 5 Figura I-4: Causas de muertes en todas las edades. Guinea Ecuatorial. El programa conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/SIDA, ONUSIDA, estimó que en 2009, 33,3 millones de personas vivían con el VIH, de las cuales el 22,5 millones correspondían a África Subsahariana. De los 2,6 millones de nuevas infecciones por el VIH en el mundo, las que aparecen en esta Región representaban el 69%. Finalmente, hubo 1,8 millones de fallecimientos por causas relacionadas con el SIDA, de ellos 1,3 millones correspondía al África Subsahariana (UNAIDS, 2009). Tanto en la escala como en el alcance, las epidemias varían en forma significativa de un país a otro de África Subsahariana. La prevalencia del VIH en Camerún es del 5,3%, República Centroafricana el 4,7% y Gabón 5,2% (UNAIDS, 2010). En Guinea Ecuatorial, la seroprevalencia de VIH en población adulta es del 5,2%, catalogado por ONUSIDA como país de epidemia generalizada, teniendo como vía principal de transmisión la sexual (UNAIDS, 2010). Con estas cifras, el número estimado de personas que necesitan ARV es de 6.600 (WHO guidance, 2010) y el número estimado de personas que reciben ARV alcanza el 2.900 (Global Fund, 2011). 1.2 RELACIÓN VIH/SIDA E INFECCIONES PARASITARIAS INTESTINALES Las enfermedades diarreicas son una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en los países tropicales en desarrollo, siendo prioritario su control y prevención (Fuentes et al., 2007). Guinea Ecuatorial es zona endémica en numerosas parasitosis que vienen a agravar el estado de salud de las personas que viven con el virus de la inmunodeficiencia humana (PVVIH) (Sun, 1988; Hunter & Nichols, 2002). Las infecciones por parásitos son una causa frecuente de diarrea crónica en los pacientes con inmunosupresión (Scowden et al., 1978; Heyworth, 1996). Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis o Strongyloides stercoralis son los parásitos intestinales más importantes que se subrayan como principales causas de la diarrea en pacientes con VIH, aunque también, lo pueden ser Trichuris trichiura, Uncinarias y Ascaris lumbricoides (Nissapatorn & Sawangjaroen, 2011). Además de estas, hay múltiples infecciones parasitarias intestinales oportunistas que podrían dar lugar a enteritis graves y a diarrea crónica, con aumento de la morbimortalidad (Siddiqui et al., 2007). También se ha relacionado el aumento de la carga viral del VIH con la alteración inmunológica asociada a parasitosis intestinal crónica por helmintos en las personas seropositivas (Harms & Feldmeier, 2002). Guinea Ecuatorial es un país tropical, debido a su ubicación y clima. Dentro del país, la Región Continental presenta unas características similares a las del resto de los países del área Subsahariana, mientras que la Isla de Bioko constituye un ecosistema único. El auge económico basado en la extracción del petróleo aumenta cada día la inmigración en la capital, Malabo, situada en Bioko, provocando el hacinamiento de la población, sobre todo, en la zona del cinturón urbano, lo que favorece la diseminación de parásitos intestinales y la llegada de especies parasitarias no autóctonas a la isla, como es el caso de la schistosomiasis. Introducción 13 1.2.1.4 Strongyloides stercoralis Ciclo biológico de Strongyloides stercoralis Figura I-8: Ciclo biológico de Strongyloides stercoralis. Fuente: CDC El ciclo de vida de Strongyloides es más complejo que el de la mayoría de los nematodos, con su alternancia de ciclo de vida libre y ciclo parasitario, y su potencial de autoinfección y multiplicación dentro del huésped (Figura I-8). La hembra deposita los huevos parcialmente embrionados, de cubierta delgada, en la mucosa. Las larvas rabditoides eclosionan en el epitelio mucoso del intestino delgado, penetran en la luz intestinal, se eliminan en las heces y continúan su desarrollo en el suelo. En éste puede pasar al tercer estadio filariforme infectante (ciclo directo) o dar lugar a una generación de vida libre de gusanos adultos hembras y machos (ciclo indirecto). La hembra de vida libre produce huevos que se embrionan, eclosionan y desarrollan larvas filariformes. La infección humana se produce cuando la larva filariforme de tercer estadio atraviesa la piel. La hembra es partenogenética y madura en el epitelio mucoso del intestino delgado en un mes aproximadamente; después comienza a producir huevos. La larva de primer estadio puede pasar al tercer estadio dentro del intestino en pacientes inmunodeprimidos o tratados con corticoides e iniciar una autoinfección interna por invasión del íleon inferior y el colon. En estos casos, la estrongiloidiosis puede ser fulminante y mortal (Ash & Orihel, 2010). Epidemiología de Strongyloides stercoralis La distribución de la infección por Strongyloides se da en áreas tropicales y subtropicales, pero también se puede producir en las zonas templadas, siendo más frecuente en las zonas rurales y en los grupos de población con niveles socioeconómicos más bajos. En los estudios realizados en Guinea Ecuatorial, la proporción fue del 0,2% en el área rural y el 0,8 en la urbana (Roche & Benito, 1999) y en el otro alcanzó el 7,8% en los pacientes VIH positivos (Fuentes et al., 2007). 1.2.1.5 Schistosoma spp. Ciclo biológico de Schistosoma spp. Figura I-9: Ciclo biológico de Schistosoma spp. Fuente: CDC Introducción 15 Los huevos embrionados se eliminan con las heces en el agua donde eclosionan y liberan los miracidios que invaden al caracol que actúa como hospedador intermediario. En el caracol pasa por dos etapas de desarrollo hasta convertirse en cercarias. Las cercarias son liberadas en el agua, se mueven libremente en ésta e invaden la piel de los seres humanos. Cuando la cola de la cercaria se pierde durante la invasión de la piel, pasa al estadio larvario conocido como esquistosómulo. El esquistosómulo migra a través de los pulmones y el hígado y por último, los parásitos alcanzan la madurez en las venas mesentéricas superior e inferior, se aparean, y las hembras comienzan la producción de huevos (Figura I-9). Epidemiología de Schistosoma spp. Las diferentes especies de Schistosoma se encuentran distribuidas en determinadas áreas. Schistosoma mansoni se encuentra en algunas partes de Sudamérica y el Caribe, África y el Oriente Medio; S. haematobium en África y el Medio Oriente, y S. japonicum en el Lejano Oriente. Schistosoma mekongi y S. intercalatum se encuentran focalmente en el Sudeste de Asia central y África occidental, respectivamente. La carga mundial que tiene la esquistosomosis se ha expresado con el número de personas infectadas (200-209 millones) y con el número de personas que viven en países endémicos en riesgo de adquirir la infección (600-779 millones) (Chitsulo et al., 2000; Steinmann et al., 2006). En cuanto al impacto de esta enfermedad, está considerada como la segunda enfermedad parasitaria más devastadora después de la malaria. La esquistosomosis es considerada como una infección incluida en las Enfermedades Tropicales Desatendidas (ETD) (OMS). Debido a la participación de caracoles que se encuentran en aguas dulces como hospedadores intermediarios, la infección se adquiere en aguas dulces contaminadas. En los estudios realizados en Guinea Ecuatorial, se encuentra descrita una proporción de esquistosomosis del 0,2 en el área urbana (Roche & Benito, 1999) en la Isla de Bioko y ausencia en el área rural (en este estudio, los casos positivos procedían todos de la Región Continental); 21,2% en Bata (Simarro et al., 1990) y en el Fuentes et al., en el 2007 no se detectó en los pacientes VIH positivos de Malabo y Bata infección por Schistosoma. 1.2.2 Protozoos patógenos Las infecciones intestinales por protozoos son comunes en los seres humanos y en todo el mundo, aunque más frecuentes y de mayor importancia en la infancia, el embarazo y en coinfección con el SIDA. La morbimortalidad que producen es elevada, con más de 58 millones de casos al año de diarrea infantil por protozoos (WHO /CDS /IPI, 1991). En septiembre de 2004, Giardia y Cryptosporidium se incluyeron en la "Iniciativa de Enfermedades Olvidadas”. Con la esperanza de que los métodos moleculares generarían ideas significativas sobre la biología, la epidemiología y la interacción huésped-parásito sobre Giardia y Cryptosporidium. 1.2.2.1 Entamoeba spp. Ciclo biológico de Entamoeba spp. Las diferentes especies de Entamoeba se transmiten de forma directa por ingestión de los quistes, pero también puede transmitirse por vía feco-oral. El hombre se infecta por la ingestión de los quistes maduros que atraviesan el estómago, donde sufren la acción de los jugos gástricos. La ruptura del quiste tiene lugar en la región del íleon terminal o en el colon, dando origen a los trofozoítos. Introducción 17 Figura I-10: Ciclo biológico de Entamoeba spp. Fuente: CDC En muchos casos, los trofozoítos permanecen confinados en la luz intestinal (infección invasiva) de personas portadoras asintomáticas, emitiendo quistes en las heces (Figura I-10). En algunos pacientes, los trofozoítos invaden la mucosa intestinal (enfermedad intestinal), o a través del torrente sanguíneo alcanzan zonas extra intestinales como el hígado, pulmones y mucho menos frecuente otras localizaciones (enfermedad extra intestinal), con las consiguientes manifestaciones clínicas. Epidemiología de Entamoeba spp. Entamoeba ha sido descrita como la tercera causa de mortalidad en el mundo debida a infección por parásitos protozoarios, después de la malaria y la esquistosomosis (Walsh, 1986; Anonymous, 1997). Su distribución es mundial, aunque es especialmente prevalente en zonas tropicales y subtropicales con condiciones higiénico-sanitarias deficientes. El género Entamoeba está compuesto por numerosas especies diferentes, 6 de las cuales son las más frecuentemente descritas por su localización intestinal: E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii, E. polecki, E. coli y E. hartmanni. La especie E. polecki se encuentra fundamentalmente en el intestino de ganado porcino y en monos. Las tres primeras resultan morfológicamente indistinguibles, pero presentan diferencias genéticas y bioquímicas. E. histolytica está descrita como claramente patógena, mientras que E. dispar se considera no patógena y E. moshkovskii, la menos estudiada, también es no patógena aunque en algunos estudios se comenta que podría producir algún trastorno intestinal (Fotedar et al., 2007). Se demostraron diferencias genéticas de estas especies con las técnicas de biología molecular (Tannich & Burchard, 1991; Diamond & Clark, 1993). Su diagnóstico se realiza, por lo general, por visualización microscópica del parásito, mediante una preparación que resulta simple y de bajo coste, esto hace que sea difícil conocer la prevalencia de E. histolytica, dispar y moshkovskii a nivel mundial y local, dado que la diferenciación de las tres especies E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii morfológicamente idénticas, no se puede realizar por microscopia. En este sentido, la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Anonymous, 1997), en 1997, recomienda utilizar técnicas que permitan distinguir entre al menos E. histolytica y E. dispar, ya que E. histolytica es responsable de todos los casos de enfermedad invasora, colitis y absceso hepático, pero también, en muchas ocasiones, de colonización asintomática, mientras que E. dispar sólo coloniza el tracto digestivo y no causa enfermedad. Aunque se ha descrito algún caso en que E. dispar resulta responsable de síntomas o de infección oportunista (Fotedar et al., 2007). La Entamoeba histolytica es el agente causal de la disentería amebiana y de los abscesos hepáticos y responsable de hasta 100.000 muertes cada año en todo el mundo (Ali et al., 2008), mientras que la E. dispar está considerada como no patógena, por lo que no precisa de tratamiento (Singh et al., 2009), aunque se ha observado su mayor prevalencia respecto a E. histolytica (Chacin-Bonilla, 2010). E. moshkovskii conocida como ameba de vida libre en aguas residuales (Tshalaia, 1941; Scaglia et al., 1983; Clark & Diamond, 1991), ha sido recientemente encontrada infectando a humanos (Clark & Diamond, 1991; Haque et al., 1998; Ali et al., 2003; Parija & Khairnar, 2005; Fotedar et al., 2007; Tanyuksel et al., 2007; Ayed, 2008; Beck et al., 2008) y frecuentemente asociada a E. dispar (Chacín-Bonilla, 2010). En la mayoría de los países no hay estudios de la prevalencia de E. moshkovskii. Introducción 19 Pero, para llevar a cabo la diferenciación, es preciso aplicar técnicas de PCR (Tannich & Burchard, 1991; Diamond & Clark, 1993) no disponibles en muchos países en vías de desarrollo. Por otra parte, el control de la diseminación de la amebiasis requiere su detección e identificación en personas infectadas asintomáticas e identificar igualmente las fuentes de infección. La prevalencia de Entamoeba spp. en Guinea Ecuatorial, en los pocos estudios realizados en el país ha sido: en la Isla de Bioko 14,9% en las zonas rurales y el 32,7% en las urbanas (Roche & Benito, 1999) con técnicas microscópicas; Fuentes et al. (2007) aportan el dato de 9,2% para las dos regiones Bioko y Continente, siendo el porcentaje de E. histolytica el 26,0% por ELISA en personas VIH positivas. En cuanto al mecanismo de transmisión, tanto E. histolytica como dispar y moshkovskii son parásitos intestinales, por lo que, su principal vía de transmisión es feco-oral (Ali et al., 2008), si bien E. moshkovskii podría transmitirse también por vía hídrica. La forma más frecuente de transmisión es a través de los alimentos, o del agua contaminada con los quistes, o la transmisión de persona a persona. Se han descrito casos de contagios dentro de la misma familia (Gatti et al. 1995; Vreden et al. 2000) y por prácticas de sexo oral (Thompson et al. 1983). Por otro lado, los quistes pueden ser diseminados por artrópodos, lo que podría indicar que estos insectos pueden jugar un papel en la transmisión del parásito (Tanyuksel & Petri 2003). 1.2.2.2 Giardia spp. Los quistes son la forma resistente del parásito y responsables de la transmisión de la giardiosis. Tanto los quistes como los trofozoítos se pueden encontrar en las heces (etapa de diagnóstico). Los quistes son resistentes y pueden sobrevivir varios meses en agua fría. Ciclo biológico de Giardia spp. La infección se transmite de forma directa por la ingestión de quistes en el agua y alimentos contaminados, o por la vía feco-oral (manos o formites) (Figura I-11), debido a la baja dosis infectiva, la transmisión puede ocurrir con tan solo 10 quistes infectantes (Rendtorff, 1954). Figura I-11: Ciclo biológico de Giardia spp. Fuente: CDC Epidemiología de Giardia spp. Giardia puede ser transmitida a seres humanos a través de cualquier mecanismo que suponga la ingestión de quistes por un huésped susceptible (Smith, 2004). La transmisión a través del agua contaminada, agua de consumo y las aguas recreativas, ha sido documentada (Smith & Grimason, 2003; Savioli et al., 2006; Karanis et al., 2007), también se han originado brotes de giardiosis de origen alimentario, como resultado de la contaminación de los alimentos (Osterholm et al., 1981; Islam, 1990). Además es posible su transmisión por las moscas (Rendtorff & Holt, 1954; Doiz et al., 2000; Graczyk et al., 2003), que contaminan los alimentos después de que hayan estado en contacto con heces humanas o de animales. La actividad sexual oro-anal es otro mecanismo de transmisión de la giardiosis (Meyer et al., 1979). Se ha sugerido que los animales podrían ser fuentes de la transmisión de la infección por giardiosis en humanos (Traub et al, 2004; Savioli et al., 2006), pero han de realizarse más investigaciones para determinar su mecanismo. Introducción 21 La giardiosis es una infección endémica en todo el mundo. Su prevalencia varía entre menos del 1,0% y más del 50,0%, guardando relación con las condiciones de infraestructura sanitaria y hábitos higiénicos de la población (Ortiz et al., 2001). Las infecciones por Giardia son muy comunes en los niños en los países en desarrollo (Farthing, 1994; Rabbani & Islam, 1994). En los países desarrollados, la prevalencia tiene picos en los grupos de edad entre 1-4 años (Flannagan, 1992) y de nuevo entre la franja de 20 a 40 años que en parte corresponde al grupo de personas que están al cuidado de los niños y de los que realizan viajes turísticos a países endémicos de la infección. En los países en desarrollo, la prevalencia de giardiosis en pacientes con diarrea es de aproximadamente el 20% (Islam, 1990). La cifra para los países desarrollados oscila del 3% (Adán, 1991; Farthing, 1994) al 7% (WHO). En Guinea Ecuatorial la prevalencia, según los estudios llevados a cabo es de 7,2% en la zona rural y del 8,6% en la urbana de la Isla de Bioko (Roche & Benito, 1999) y el 9,2% en los pacientes VIH positivos (Fuentes et al., 2007). Debido a la gran propagación y difusión del parásito, la giardiosis es una de las posibles causas de diarrea del viajero, diarreas en los inmigrantes o en las adopciones internacionales, especialmente en personas provenientes de países con altos niveles de endemicidad, como África (Ekdahl & Andersson, 2005). Las técnicas de biología molecular han permitido poner de manifiesto la amplia diversidad genética de Giardia duodenalis. Las cepas que afectan a los seres humanos se pueden agrupar en dos principales genotipos genéticos o asociaciones, que han sido nombrados como genotipos A y B (Thompson RC et al., 2000); en los últimos años, se ha descrito el hallazgo de otros genotipos como el E, C y el D, cuyos hospedadores habituales son ganado, perros y gatos, y seres humanos (Sulaiman et al., 2001; Foronda et al., 2008). En Guinea Ecuatorial no se han llevado a cabo estudios que pongan de manifiesto los genotipos existentes de la infección por Giardia en la población. 1.2.2.3 Cryptosporidium spp. Hay muchas especies de Cryptosporidium que infectan a los seres humanos y a una amplia gama de animales. A pesar de que las especies de C. parvum y C. hominis sean las que más comúnmente producen enfermedad en los seres humanos, también se han reportado infecciones humanas por C. felis, C. meleagridis, C. canis, C.muris, C. ubiquitum y C. suis (Cacciò, 2005; Llorente et al., 2005; Chalmers et al., 2009, Cieloszyk et al., 2012). Ciclo biológico de Cryptosporidium spp. El ciclo de vida de Cryptosporidium spp., se caracteriza por fases de reproducción asexuada y sexuada dentro de la célula del hospedador (Figura I-12). El ciclo se inicia tras la ingesta del ooquiste infectante, el cual se desenquista liberando 4 esporozoitos móviles a través de una sutura localizada en la pared del ooquiste. Estos esporozoitos atacan e invaden la membrana apical de los enterocitos (u otras células del hospedador), transformándose en el primer estadio intracelular denominado trofozoíto. Mediante merogonia, los trofozoítos se transforman en merontes tipo I que contienen de 6 a 8 merozoitos en su interior. Los merozoitos tipo I, localizados en la luz del intestino tras la ruptura del meronte, invaden nuevas células del hospedador iniciando un ciclo de autoinfección en el hospedador mediante la producción de nuevos merontes tipo I, o bien, iniciar el ciclo sexual mediante su transformación a merontes tipo II que contienen en su interior 4 merozoitos. Tras la lisis de la célula hospedadora, los merozoitos tipo II liberados invaden nuevas células transformándose en macro-gametocito (gameto femenino) y micro-gametocito (gameto masculino). Este último, libera varios microgametos que fertilizarán los macro-gametocitos hasta la formación de cigotos que, mediante esporogonia, se transformarán en ooquistes de pared fina y de pared gruesa, responsables de la autoinfección y transmisión respectivamente (Barta & Thompson, 2006; Borowski et al., 2008). Cerca del 20% de los ooquistes, denominados ooquistes de pared fina, carecen de la doble membrana que conforma la pared del ooquiste y, al parecer, son los responsables de reiniciar la infección dentro del hospedador mediante la invasión de nuevos enterocitos. Por el contrario, el resto de los ooquistes (80%), denominados ooquistes de pared gruesa, presentan la doble membrana lo que confiere un mecanismo de defensa y resistencia a los esporozoitos ante las condiciones adversas medioambientales y por tanto serán las formas infectantes para los hospedadores (Current & Reese, 1986). OBJETIVOS ______________________________________________________________________ Objetivos 31 2. OBJETIVOS Las enfermedades diarreicas son una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en los países tropicales en desarrollo, siendo prioritario su control y prevención. Entre los países tropicales, Guinea Ecuatorial es zona endémica en numerosas parasitosis que vienen a agravar el estado de salud de las Personas que viven con el VIH (PVVIH), ya que las infecciones por parásitos son una causa frecuente de diarrea crónica en los pacientes más inmunodeprimidos. La importancia de este estudio se justifica por los factores antes expuestos: la alta prevalencia de la infección por VIH, la falta de estudios de investigación sobre parásitos intestinales en pacientes infectados por el VIH en Guinea Ecuatorial, así como por tratarse de una zona endémica para otras enfermedades como son las enfermedades parasitarias que, en el caso de pacientes inmunodeprimidos, son difíciles de erradicar y contribuyen a empeorar la calidad de vida de quienes las padecen. Por otra parte, en el contexto del estudio – Guinea Ecuatorial – las investigaciones realizadas son escasas y los tratamientos para muchas parasitosis intestinales se dispensan indiscriminadamente, sin poder diferenciar las especies patógenas de las que no lo son. Esto es debido a que los diagnósticos se llevan a cabo por técnicas microscópicas que en ocasiones no son capaces de diferenciar unas especies parasitarias de otras, siendo estas las únicas técnicas disponibles. Nuestro estudio constituye la investigación más extensa que se ha realizado en el país y profundiza además en la epidemiología molecular de algunas parasitosis intestinales como la amebiasis, criptosporidiosis y giardiosis. Para su realización, se han planteado los siguientes objetivos: 2.1 Objetivo general Determinar la proporción de parásitos intestinales que se encuentran en la población VIH positiva de Guinea Ecuatorial, considerando las Regiones Continental e Insular (Isla de Bioko) del país y caracterizando genéticamente las especies y genotipos de Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, Cryptosporidium y Giardia que se están diseminando actualmente entre estos pacientes. También se analiza la influencia de los factores sociodemográficos y clínicos de la población en la adquisición de las parasitosis intestinales, incluyendo como elemento de comparación una pequeña proporción de habitantes VIH negativos que convivan con los VIH positivos. Este objetivo general, se concreta en los siguientes objetivos específicos: 2.2 Objetivos específicos - Determinar la proporción de las parasitosis intestinales que afectan a pacientes infectados por el VIH con o sin SIDA en Guinea Ecuatorial. - Definir las especies, genotipos y/o sub-genotipos de Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, Cryptosporidium y Giardia que se diseminan entre los pacientes VIH positivos en Guinea Ecuatorial. - Analizar las posibles asociaciones entre las especies y/o genotipos detectados con los datos sociodemográficos y clínicos de las personas participantes en el estudio; determinando a su vez la posible presencia de portadores sanos. - Comparar los riesgos de adquisición de las infecciones parasitarias intestinales entre las personas VIH positivas y VIH negativas. CAPÍTULO 3: MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y METODOS ______________________________________________________________________ Material y Métodos 37 3. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL 3.1 Pacientes y muestras 3.1.1 Muestreo y tamaño muestral La dimensión de la muestra se calculó teniendo en cuenta las personas infectadas con VIH/SIDA y controladas en las Unidades de Referencia de Enfermedades Infecciosas (UREIs) de Malabo y Bata y en el Centro de Tratamiento Ambulatorio (CTA) del Centro de Salud Mª Rafols de Bata. En total, según los datos del Fondo Global 2009 para Guinea Ecuatorial, sumaban 1.219 pacientes. Conociendo el tamaño poblacional, el cálculo del tamaño de la muestra fue realizado con la ayuda del logístico Epidat v3.0, con una proporción esperada del 0,5, precisión absoluta del 0,04 y un nivel de confianza del 95,5%. De esta manera se estableció una muestra total de 415 personas VIH positivas. Teniendo en cuenta las posibles pérdidas o presencia de sesgos que supusieran la salida de pacientes del estudio, se añadió un 20,0% de la muestra seleccionada, resultando 498. Finalmente el número de personas VIH positivas estudiadas fue de 533 por lo que la precisión final resultó ser de 0,03256. Conforme transcurría el proyecto y para poder determinar la influencia de factores ambientales en la prevalencia de enfermedades parasitarias intestinales, se seleccionó un pequeño grupo de 110 personas VIH negativas que vivían con personas VIH positivas, que además presentaran parásitos de transmisión de persona a persona. 3.1.2 Recogida de la muestra y conservación De cada paciente se tomó una muestra de heces fecales. La recogida de muestras se realizó por muestreo consecutivo hasta alcanzar el tamaño muestral calculado. Las muestras de los pacientes procedentes de la Isla de Bioko se recogieron entre los meses de marzo y abril de 2010 y las de los pacientes de la Región Continental durante el mes de agosto de ese mismo año. Las muestras fueron recogidas en frascos de heces de boca ancha, en el mismo momento y lugar en que se realizó la entrevista para obtener el resto de la información que requerían las variables del estudio. Se dieron las siguientes instrucciones para la recogida de la muestra: que fuera hecha directamente en el frasco, evitando que se mezclara con orina o cayera a la tierra o al suelo del inodoro. De esta manera se evitaba la contaminación de las heces con la orina, la tierra, etc. Las muestras fueron trasladadas inmediatamente desde su lugar de recogida hasta el laboratorio en neveras portátiles y conservadas a 4º C – 8º C hasta el momento de su envasado y realización de las técnicas que requerían realizarse en las primeras 24 horas. De cada muestra se hicieron cuatro partes alícuotas, una para la inmunocromatografía rápida (ICR) y para la visión directa de las heces con solución salina y yodo. La segunda alícuota se introdujo en una solución comercial SAF formol-acético (REAL SAF, Valencia, España) para el posterior análisis microscópico de la concentración de las mismas. La tercera alícuota se almacenó en nevera a 4º C - 8º C y la cuarta se congeló a -20º C. La segunda, tercera y cuarta alícuotas fueron enviadas al Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza, España, para su posterior análisis, con las respectivas autorizaciones sanitarias para el envío de muestras biológicas (Anexos 1-3). 3.1.3 Definición de variables y recogida de datos Información socio-demográfica y clínica De cada participante en el estudio, se recogieron los siguientes datos: edad, sexo, embarazo, niveles de formación académica, información higiénica y socioeconómica y lugar de residencia. También se les preguntó por su sintomatología intestinal (diarrea, estreñimiento y otros síntomas intestinales). En el caso de personas VIH positivas se añadió el valor de las células T-CD4+ del mismo día de la recogida de variables, tratamiento antirretroviral (TARV) y línea de tratamiento (Anexo 4). Material y Métodos 45 - Dolores de cuerpo crónicos o debilidad y fatiga (sentirse muy cansado incluso cuando la persona no ha hecho un ejercicio duro). - Ganglios linfáticos persistentes y generalizados. Los pacientes fueron incorporados al estudio cuando acudían a la cita de seguimiento habitual tras su conformidad informada y firmada, hasta alcanzar el número total de participantes para el estudio. MÉTODOS 3.2 Identificación de parásitos por observación microscópica Se realizó un diagnóstico coproparasitológico inicial in situ, con muestras de heces recién emitidas, por observación microscópica de una suspensión de las mismas en suero fisiológico y otra en lugol. Además, las alícuotas conservadas en SAF se concentraron por el método de formol-acetato de etilo para detectar la presencia de parásitos. Después de la concentración se hicieron frotis de todas las muestras y se realizó una tinción Zielh Neelsen modificada para detectar ooquistes de coccidios (Henriksen y Pohlenz, 1981). 3.2.1 Técnica microscópica con suero fisiológico y lugol Se deposita en un portaobjetos una gota de suero fisiológico y en otro una gota de lugol. En ambos casos, las dos gotas se mezclan con una pequeña porción de muestra de heces y se cubren con un cubreobjetos, se observan al microscopio con objetivos de 10x, 40x y 100x. A las muestras procedentes de la concentración no se las añade solución de lugol. Las concentraciones del suero fisiológico y del lugol son las siguientes: - Solución salina: NaCl 7,5 g H20 destilada 100 ml - Solución de lugol: Yodo en cristales 10 g Yoduro de potasio 20 g H20 destilada 100 ml 3.2.2 Técnica de concentración de heces Se realizó para la detección de formas parasitarias en todas las muestras. Esta técnica se realiza en el Laboratorio de Parasitología de Zaragoza, ya que en Guinea Ecuatorial no disponemos de los medios necesarios. Esta técnica nos ha permitido comparar el resultado que hemos obtenido de las muestras concentradas y sin concentrar, sirviendo en parte para valorar los diagnósticos que se realizan habitualmente en el país. Se procedió a la concentración de las muestras de heces mediante la técnica físicoquímica de formol-acetato de etilo, que aprovecha la mayor solubilidad de los restos fecales en acetato de etilo, menos denso que la solución de formalina-ácido acético, de manera que se eliminan las grasas y se depositan los parásitos junto con otros elementos no lipídicos. La técnica consiste en: La muestra se resuspende en medio SAF, se homogeniza bien, agitando enérgicamente y se deja actuar durante media hora como mínimo. Con la ayuda de un vortex se agita el tubo de SAF que contiene la muestra, después, se filtra para eliminar las partículas más groseras, pasando la suspensión a un tubo cónico de 18 ml. Se añaden a la muestra 2 ml de acetato de etilo al 99,5% (88,10 Molar) y tras agitar el tubo bien, hasta que la mezcla parezca homogénea, se centrifuga a 500 x g durante 10 minutos. Con la centrifugación se separan dos fases: una superior que contiene los elementos grasos, otra, formada por una solución acuosa de formalina-ácido acético con partículas ligeras en suspensión. Se aprecian también una interfase con elementos ligeros y desnaturalizados y un sedimento, en el que se encuentran las formas parasitarias. Se decanta el sobrenadante y se coloca una gota del sedimento en un portaobjetos para observarlo al microscopio. Con otra gota se realiza un frotis en un portaobjetos para su posterior tinción, que nos permita la observación de ooquistes de coccidios. Material y Métodos 47 Composición de la formalina –ácido acético– acetato de sodio (SAF): Formaldehído 1,6% Alcohol Isopropílico Anhidro 7,45% Ácido Acético 2,14% Acetato Sódico 1,53% H20 destilada 1 litro 3.2.3 Tinción ácido alcohol resistente de Ziehl-Neelsen modificado (ZNm) Una gota de muestra procedente de la concentración con formol-acetato de etilo fue depositada en un portaobjeto describiendo un círculo no muy grande. Se dejó secar durante un día. Para su fijación, la preparación fue cubierta con metanol que se dejó secar completamente. Tras la fijación, la muestra se cubrió con un trozo de papel de filtro, luego se cubrió con el colorante carbol fucsina durante 20 minutos y tras retirar con cuidado el papel, se lavó con agua. Luego, la muestra fue decolorada con ácido sulfúrico al 7% durante 1 minuto y se lavó con agua. Después del lavado, la muestra se cubrió con azul de metileno durante 1 minuto, se lavó y se dejó secar al aire en posición vertical. La identificación de los ooquistes en las muestras teñidas se realizó en el microscopio con los objetivo de 40x y 100x. 3.3 Técnica de detección de antígenos por inmunocromatografía rápida (ICR) Se realizó la técnica de ensayo cualitativa de inmunocromatografía rápida para la detección rápida y simultánea de Cryptosporidium spp., Giardia spp. y Entamoeba histolytica (Operon® SA, Zaragoza, España) en muestras de heces frescas, siguiendo las instrucciones del fabricante, dentro de las primeras 24 horas después de la recogida de la muestra. El test Triple o Stick Crypto/Giardia/Entamoeba utiliza anticuerpos monoclonales específicos frente a Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis y Entamoeba histolytica que detectan todas las formas del ciclo vital de los parásitos. Realización de la técnica: 50 mg. de muestras sólidas y/o 100 µl de muestras líquidas o semisólidas fueron depositadas en un tubo de ensayo de 1,5 ml. que contenía 1 ml de solución de tampón de carga. Una vez homogeneizada la mezcla, agitándola vigorosamente con la ayuda de un vortex, se centrifugó durante un minuto a 3.000 rpm para clarificar la muestra y así el sobrenadante estuviera libre de partículas sólidas en suspensión. Tras la centrifugación, 150 µl del sobrenadante fueron transferidos a un tubo de ensayo y se procedió a introducir una tira de inmunocromatografía que tras 10 minutos de inmersión, fue retirada y leída: a) muestra negativa: línea morada (banda de control del test); b) muestra positiva a Cryptosporidium parvum: línea morada + línea azul; c) muestra positiva a Giardia duodenalis: línea morada + línea roja/rosa; d) muestra positiva a Entamoeba histolytica: línea morada + línea verde. Material y Métodos 49 3.4 Técnicas de biología molecular Se llevaron a cabo técnicas de biología molecular para la diferenciación de especies y genotipado de algunos parásitos: Entamoeba spp., Giardia spp. y Cryptosporidium spp. La técnica utilizada fue la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) consistente en una amplificación específica de ácidos nucleicos. La reacción en cadena de la polimerasa es un método enzimático que permite amplificar in vitro, de forma exponencial, un fragmento específico de ADN localizado entre dos regiones de secuencia conocida, pudiéndose obtener numerosas copias del mismo. Para llevar a cabo la reacción de PCR se necesita un ADN diana de doble cadena, dos oligonucleótidos o iniciadores específicos (cebadores o “primers”) para el fragmento que se quiere amplificar, la enzima de polimerización (Taq polimerasa), la mezcla de los cuatro deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para producir nuevo ADN y un medio tamponado con Mg2+ como ión fundamental, que proporcione las condiciones adecuadas de pH y fuerza iónica. Es un proceso que se lleva a cabo cíclicamente en un termociclador, estando cada ciclo dividido temporalmente en tres fases térmicas: desnaturalización (separación de las dos cadenas de ADN), acoplamiento (unión de los cebadores con las secuencias diana) y polimerización (síntesis de la cadena complementaria a partir de los cebadores). 3.4.1 Extracción de ADN Se procesaron muestras de heces congeladas a -22º C sin conservantes para Cryptosporidium spp. y Entamoeba spp. En el caso de Giardia spp., es preciso un pre-tratamiento, por lo que antes de iniciar la extracción de ADN de las muestras positivas por inmunocromatografía rápida y por microscopía fueron sometidas a la técnica de concentración de quistes con sacarosa y/o la lisis de quistes con choques térmicos a partir de muestras conservadas a 4º C. Concentración de quistes de Giardia spp. con gradiente de sacarosa: Se resuspende una pequeña porción de heces en 5 ml de agua esterilizada. Para cada muestra se toman dos tubos falcón y se ponen 10 ml de sacarosa 1M, se añade la suspensión anterior sobre la sacarosa hasta un volumen total de 15 ml, con cuidado de no mezclarlas, deslizando la muestra por la pared del tubo. Se centrifuga a 1.500 rpm durante 6 minutos. Se recoge el sobrenadante junto con el menisco con una pipeta pasteur y se pasa a otro tubo falcón, añadiendo agua esterilizada hasta un volumen total de 40 ml. Se agita bien y se centrifuga a 1.500 rpm durante 6 minutos. Se desecha el sobrenadante. Se añaden al sedimento 2,5ml de agua esterilizada y se resuspende. En otros dos tubos se ponen 10 ml de sacarosa 0,5 M, añadiendo la muestra igual que en el caso anterior. Se centrifuga a 1.500 rpm durante 6 minutos. Con la ayuda de una pipeta pasteur se recoge el sedimento, alrededor de 1 ml, y se pasa a un tubo limpio. Se añade agua esterilizada hasta un volumen total de 40 ml, agitando bien. Se centrifuga a 5.300 rpm durante 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y el sedimento se resuspende en 1 ml de agua destilada estéril. Se pasa a un eppendorf y se conserva a -20º C hasta que se realice la extracción de ADN. Tomamos una pequeña gota para observarlo al microscopio con objetivo de 40x para comprobar la presencia de quistes de Giardia spp. Lisis de quistes de Giardia duodenalis por choques térmicos: 200 mg de heces o 200 ml de concentrado de quistes de Giardia se sometieron a cuatro ciclos de choques térmicos, consistentes en introducir la muestra de heces al baño maría a 100º C durante 10 minutos y posteriormente en el congelador a -20º C durante 30 minutos. Material y Métodos 51 Extracción de ADN con el kit comercial IBIAN® DNA Stool Kit El protocolo de trabajo fue realizado según la pauta indicada por la casa comercial IBIAN®. En un tubo eppendorf se colocaron 200 mg de heces sólidas o 200 µl de heces líquidas, se les añadió 1,2 ml de IBIAN lysis Buffer. Tras homogeneizar la muestra con vortex durante 1 minuto, se incubó 10 minutos a 95º C, agitando seguidamente durante unos segundos con vortex y centrifugando a 13.300 rpm durante 1 minuto. El sobrenadante fue transferido al tubo de IBIAN Inhibitor Remove para el proceso de absorción de sustancias inhibidoras presentes en la muestra. La muestra fue homogeneizada con vortex durante 15 segundos, incubada a temperatura ambiente 1 minuto y centrifugada a 13.300 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó a 13.300 rpm durante 3 minutos. Una alícuota de 400 µl se añadió a un tubo de eppendorf de 1,5 ml que contenía 25 µl de Proteinasa K, se homogeneizó utilizando vortex y se incubó a 70º C durante 10 minutos. Posteriormente se le añadieron 400 µl de IBIAN Binding Buffer, se homogeneizó y el lisado fue transferido a una columna de filtrado dispuesta sobre un tubo recolector de 2,0 ml. La columna se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 minuto, el líquido recogido en el tubo fue desechado y se procedió a dos lavados con 500 µl y 800 µl de IBIAN Wash Buffer I y II, respectivamente, mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 1 minuto. Para asegurar la eliminación de todo el etanol de los lavados se centrifugó la columna a 13.300 rpm durante 3 minutos. Para la recuperación del ADN, la columna fue depositada en un tubo eppendorf de 1,5 ml y se le añadieron 200 µl de IBIAN Elution Buffer. Después de incubar a 70º C durante 3 minutos, se centrifugó a 8.000 rpm durante 1 minuto y el ADN se conservó a - 20º C hasta su uso. 3.4.2 Técnicas moleculares para la detección de Entamoeba spp. La diferenciación entre E. dispar y E. histolytica se realizó siguiendo el protocolo descrito por Gutiérrez-Cisneros et al. en 2009 y para E. moshkovskii el descrito por Ali et al. en 2003, con pequeñas modificaciones. El ADN control para E. moshkovskii fue cedido por el Dr. Graham Clark (The London School of Hygiene & Tropical Medicine, Londres, Inglaterra). Se desarrolló una nested-PCR, ya que este tipo de reacción permite un incremento de la sensibilidad al contar con dos pasos de amplificación, y de la especificidad al utilizar dos parejas de cebadores distintos en cada paso de amplificación. Técnica molecular para la detección de E. histolytica y E. dispar Para la PCR, se utilizaron cebadores diseñados por Evangelopoulos et al. (2000) y por Paglia &Visca (2004). En la primera PCR se utilizaron los cebadores E1 y E2 que permiten amplificar un fragmento genérico para E. histolytica y E. dispar de 1076 pb (Tabla MM-2). En un segundo paso, con este producto se llevó a cabo la segunda reacción de PCR con los cebadores Eh-l y Eh-r específicos para E. histolytica obteniendo un producto de amplificación final de 427 pb y los cebadores Ed-1 y Ed-r específicos para E. dispar, obteniendo un producto final amplificado de 195 pb (Tabla MM-2). La reacción para la primera PCR se desarrolló en un volumen final de 50 µl empleando 5 μl de ADN, 5 μl de buffer 10X ([100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl] (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain); 1,5 μl de MgCl2 50 mM (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain); 0,4 μl de desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) 25 μM (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) (Promega Corporation, USA); 1 μl de cada cebador de 12,5 μM (Isogen Life Science, De Meern, Netherlands ), 0,3 μl de Taq polimerasa de 5 U/µl (BIOTOOLS B&M Labs, S.A) y 36,1 μl de agua destilada estéril. Las condiciones de amplificación consistieron en un paso previo de desnaturalización a 95 º C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 º C durante 50 segundos, 50 º C durante 90 segundos y 72 º C durante 120 segundos, seguido de una extensión final a 72 º C durante 7 minutos. Material y Métodos 53 La reacción para la segunda PCR se desarrolló en dos tubos eppendorf diferentes, uno para E. histolytica y otro para E. dispar; con un volumen final en cada uno de 50 µl, empleando las mismas cantidades y concentración de reactivos, así como de los diferentes cebadores para preparar el Master-Mix, utilizadas en el procedimiento de la primera PCR. Como ADN se utiliza el producto de la primera PCR. También las condiciones de amplificación de la segunda reacción de PCR fueron las mismas de la primera reacción, excepto en la temperatura de alineación que fue de 58º C. Técnica molecular para la detección de E. moshkovskii Para la detección de E. moshkovskii, se utilizaron cebadores diseñados por Ali et al. (2003). En la primera PCR, los cebadores R-R5 y R-R3 permiten amplificar un fragmento de ADN de 323 pb (Tabla MM-2). Posteriormente, con este producto se llevó a cabo la segunda reacción de PCR con los cebadores EmR-1 y EmR-2 específicos para E. moshkovskii obteniendo un producto de amplificación final de 260 pb (Tabla MM-2). La reacción para la primera PCR se desarrolló en un volumen final de 25 µl empleando 2,5 μl de ADN, 2,5 μl de buffer 10X ([100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl] (BIOTOOLS B&M Labs, S.A); 0,75 μl de MgCl2 50 mM (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain); 0,25 μl dNTPs 25 μM (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) (Promega Corporation, USA); 2,5 μl de cada cebador 10 μM (Isogen Life Science, De Meern, Netherlands), 0,3 μl de Taq polimerasa de 5 U/µl (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain) y 14 μl de agua destilada estéril. Las condiciones de amplificación consistieron en: un paso previo de desnaturalización a 94 º C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 º C durante 60 segundos, 55 º C durante 90 segundos y 72 º C durante 120 segundos, seguido de una extensión final a 72 º C durante 5 minutos. La reacción para la segunda PCR se desarrolló en un volumen final de 50 µl empleando 5 μl de ADN de la primera PCR, 5 μl de buffer 10X, 1,5 μl de MgCl2 50 mM; 0,5 μl de dNTPs 25 μM; 5 μl de cada cebador 10 μM, 0,3 μl de Taq polimerasa y 32 μl de agua destilada estéril. Las condiciones de amplificación de la segunda reacción de PCR fueron las mismas que se describen para la primera reacción de PCR. Tabla MM-2. Cebadores utilizados en la amplificación del gen SSUrDNA Gen Cebadores Secuencia de 5' a 3' Pares de base Referencia SSUrDNA E1 TGCTGTGATTAAAACGCT 1076 Evangelopoulos et al., 2000. Paglia &Visca, 2004 E2 TTAACTATTTCAATCTCGG Eh-1 ACATTTTGAAGACTTTATGTAAGT A 427 Eh-r CAGATCTGAAAACAATGCTTCTCT Ed-1 GTTAGTTATCTAATTTCGATTAGAA 195 Ed-r ACACCACTTACTATCCCTACC R-R5 AGCATCAGCCTTCTAAGCTG 323 Ali et al., 2003 R-R3 CTTCCGACTGAGCTAACAAG EmR-1 GGCGCCTTTTTTACTTTATGG 260 EmR-2 GCTAACAAGGCCAATCGATAA A 3.4.3 Técnicas moleculares para la detección de Cryptosporidium spp. PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) La técnica se utiliza con el fin de identificar las especies y genotipos de Cryptosporidium presentes en Guinea Ecuatorial (Xiao et al., 1999; Feng et al., 2007). Para todas las muestras positivas por ICR y/o por tinción de ZNm se procedió a realizar la técnica de PCR anidada que amplifica el gen de la subunidad 18S del rRNA (SSUrRNA) del ARN ribosomal. En la primera PCR se obtuvo un producto de 1325 pb utilizando los cebadores Ssu1 y Ssu2, y en la segunda reacción de PCR, con los cebadores Ssu3 y Ssu4, se obtuvo un amplificado de 826-864 pb, dependiendo de la especie (Tabla MM-3). La reacción para la primera PCR se desarrolló en un volumen final de 25 µl utilizando 2 μl de ADN, 2,5 μl de buffer 10X ([100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl] (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain); 1 μl de MgCl2 50 mM (BIOTOOLS B&M Labs, S.A); 0,2 μl de dNTPs 25 μM (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) (Promega Corporation, USA); 0,25 μl de cada cebador 10 μM (Isogen Life Science, De Meern, Netherlands), 0,3 μl de Taq polimerasa de 5 U/µl (BIOTOOLS B&M Labs, S.A, Madrid, Spain) y 18,8 μl de agua destilada estéril. Las condiciones de amplificación consistieron en un paso previo de desnaturalización a 94 º C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 º C durante 45 segundos, 55 º C durante 45 segundos y 72 º C durante 60 segundos, y de una extensión final a 72 ºC durante 7 minutos. Material y Métodos 61 cadenas de ADN. Este reactivo revela la presencia de una banda de ADN al ser iluminado con luz ultravioleta. Procedimiento de preparación del gel de agarosa La concentración de agarosa que se utiliza está condicionada por el tamaño de los fragmentos de ADN a separar. En nuestro caso se han utilizado geles de agarosa del 1,5% para las segundas PCR de pesos moleculares de aproximadamente 800 pb y del 2% en las que son menores de 400 pb y para bandas que se desea purificar para conseguir una mayor garantía de pureza. Los geles se han preparado según se describe a continuación: - Se mezclan 1,5 o 2 gramos de agarosa (Agarosa tipo I estándar PB, Panreac) en 100 ml de TBE x 0,5 (Tris 0.045 mM, ácido bórico 0,045 mM, EDTA 0,001 mM, pH 8,0) llevándolo a ebullición hasta su total disolución. - Se deja enfriar hasta unos 50-60º C aproximadamente y se añade 3 µl de una solución acuosa de bromuro de etidio (BrEt) 0,5 µg/ml por cada 50 ml de gel. - Se vierte la solución en una bandeja de electroforesis previamente sellada y con el correspondiente molde para formar los pocillos, y se deja solidificar. - Se retira el molde, con cuidado para no dañar los pocillos, y se coloca la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis llena de tampón TBE x0,5 hasta la medida señalizada. Se utilizaron cubetas de electroforesis horizontal (BIOCOM DIRECT.COM. Serial Nº. BCMS 1509101219 y VARI-GEL. Serial Nº. 502) y se desarrolló la electroforesis a 97100V. El marcador utilizado fue DNA del Fago λ (Promega 502 µg/ml) digerido con Pst I (Advanced Biotecnologies 10 U/µl). Preparación del marcador DNA del Fago λ para un volumen final de 400 µl: Se realiza la siguiente mezcla: - 100 µl fago λ. - 40 µl tampón multi-core 10x. - 20 µl Pst I. - 240 µl de H20 MQ (doble destilada, estéril). Se incuba a 37º C durante 24 horas. El marcador y las muestras del producto de la segunda PCR fueron mezclados cada uno con una solución de carga (1% SDS, 50% glicerol, 0,05%, azul de bromofenol): 3 µl de solución de carga y 5 µl del marcador; para las muestras 3 µl de solución de carga y 10 µl de muestra. Se dispensa cada una en uno de los pocillos formados por el molde en el gel. La visualización de los fragmentos de ADN se consiguió iluminando con luz UV de 340 nm mediante un trans-iluminador Viber Lourmet y la captura de las fotos con un capturador de imágenes de la misma casa comercial. 3.4.6 Purificación del DNA a partir de la segunda PCR Para la purificación de los productos de la segunda reacción de las diferentes PCR se empleó el “Quick Referente Protocol Card. Illustra™ GFX™ PCR DNA and band purification Kit”, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello, tras la electroforesis se procedió a cortar la banda esperada y/o recoger directamente el producto de la segunda PCR y depositarla en un eppendorf de 1,5 ml. Primer paso: para la captura de la muestra, se añade a lo anterior 500 µl del buffer de captura a la muestra para desnaturalizar las proteínas y/o disolver la agarosa, se agita por inversión. Si la muestra procede de un gel de agarosa se incubará a 60º C hasta su disolución total, observando que el color final sea amarillo o naranja pálido. Segundo paso: unión de la muestra. Se transfiere la mezcla del primer paso a la columna de illustration GFX Microspin para unir el ADN a la membrana de la misma. Se incuba a temperatura ambiente 1 minuto. Se centrifuga a 13.000 rpm durante 30 segundos. Material y Métodos 63 Tercer paso: lavado y secado con el buffer de lavado tipo 1 para eliminar sales y otros contaminantes de la membrana ligada al DNA. Se añade 500 µl del buffer de lavado tipo 1 y se centrifuga a 13.000 rpm durante 30 segundos. Cuarto paso: tras eliminar cualquier exceso de buffer por centrifugación, se procedió a añadir 20 µl del buffer de elución tipo 6 (agua esterilizada, libre de nucleasas) a la columna, se incuba 1 minuto a temperatura ambiente, se centrifuga a 13.000 rpm durante 1 minuto, se guarda la muestra a -20º C hasta el momento de su electroforesis y/o envío para su secuenciación. Electroforesis del gen purificado. Para valorara los productos de la segunda PCR purificados de Giardia spp., Entamoeba spp., y Cryptosporidium spp. se utilizó la electroforesis en un gel de agarosa al 2%. El gel fue preparado con agarosa (Agarosa tipo I estándar PB, Panreac); en tampón TBE 0,5x (Tris-borato 0,045 mM, EDTA 0,001 mM pH 8,0) y tinción con bromuro de etidio (BrEt) 3 µl de solución (0,5 µg/ml) por cada 50 ml de gel. En una cubeta de electroforesis horizontal (BIOCOM DIRECT.COM. Serial Nº BCMS 1509101219 y VARI-GEL. Serial Nº 502) se desarrolló la electroforesis a 97-100 V. Se utilizó un buffer 5x (BIOLINE) con un marcador que permita la posterior cuantificación (EasyladderI 100 lanes de BIOLINE): 2 µl de buffer y 3 µl de marcador; y para las muestras la solución de carga: 3 µl de solución de carga y 3 µl de muestra. La visualización de los fragmentos de ADN se consiguió con un trans-iluminador Viber Lourmet y la captura de las fotos con un capturador de imágenes de la misma casa comercial. 3.4.7 Secuenciación Los productos de la segunda PCR de Cryptosporidium spp. del gen de la subunidad 18S rRNA (SSUrRNA) y del gen gp60; Entamoeba spp. del gen rRNA de las subunidades pequeñas (SSUrDNA) y Giardia spp. (gen tpi, gen tpi-Sulaiman y β-giardina) fueron purificados con Quick Referente Protocol Card. Illustra™ GFX™ PCR DNA and band purification Kit y llevados al Centro de Análisis Genético de Zaragoza para su secuenciación. Análisis de secuencias El análisis de las secuencias se llevó a cabo utilizando los programas Chromas Lite, Blast tool y BioEdit v7.0.5.3. 3.5 Análisis estadísticos de los datos Las variables de las entrevistas y los resultados analíticos de las heces se analizaron mediante el paquete estadístico SPSS 19.0 (licencia de la Universidad de Zaragoza) y Epidat v3.0. En primer lugar se realizó una descripción de todas las variables de la muestra mediante los estadísticos media y desviación estándar si las variables seguían distribuciones normales y mediana y recorrido intercuartílico si las variables no seguían distribución gausiana. En el caso de variables cualitativas se valoró la proporción de las diferentes variables con su intervalo de confianza al 95% (IC95%). El análisis bivariante y en caso de variables cualitativas se realizó mediante el test de χ2 de Pearson y la prueba exacta de Fisher. El análisis post hoc para conocer entre qué valores de las variables existía asociación importante se basó en la valoración de los residuos ajustados de Haberman, realizando la corrección de Bonferroni, en caso de tablas de más de 2x2. La medida de los riesgos asociados a cada factor se realizó mediante el cálculo de la Odds Ratio con su intervalo de confianza al 95%. El nivel de significación fue p<0,05. Para las distintas pruebas diagnósticas se evaluó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) tomando como “gold standard” la PCR. La concordancia de los resultados entre los distintos métodos diagnósticos se evaluó mediante el nivel de concordancia y el coeficiente Kappa. Estos datos han sido representados mediante la curva ROC (características operativas del receptor). Nota: por comodidad los resultados se han dado en porcentajes a pesar del escaso número de muestras presentadas en algunos casos, para subsanar este “error pactado” se ha puesto al lado de cada porcentaje el número de muestra sobre el que se estaba trabajando. Material y Métodos 65 Depuración Se llevó a cabo una revisión general y exhaustiva de todos los registros, fichas, muestras, resultados encontrados y tratamientos ofrecidos. Verificación y control de calidad de los datos Se procedió a la verificación de la coherencia de las bases de datos-fichas (una por una). Para el control de calidad, se escogieron de manera aleatoria el 10% de muestras negativas de las especies caracterizadas para someterlas al mismo procedimiento diagnóstico. Para las técnicas microscópicas, cada muestra fue observada por al menos tres microscopistas diferentes. Estratificación de variables Apareamiento y/o cruzamiento de variables según su importancia y su nivel de asociación con otras. 3.6 Consideraciones éticas La participación fue voluntaria, y de cada sujeto se obtuvo el consentimiento informado y firmado por escrito (Anexo 5 y 6). Se mantuvieron encuentros informativos con cada paciente para explicar en qué consistía el estudio, comentar los resultados de su muestra y ofrecerle tratamiento según necesidad (Tabla MM-8). Los tratamientos fueron verificados y controlados a los quince días. Así mismo, se ofrecieron charlas de educación para la salud en cuanto a normas de higiene medioambiental y alimenticia. Cada muestra de heces fue codificada, de tal manera que se garantizara la confidencialidad de los datos correspondientes a las personas que han participado en el estudio. Este estudio fue aprobado y validado por el Ministerio de Sanidad y Bienestar Social de Guinea Ecuatorial (Anexos 7-9) y por la OMS (oficina de la representación de la Organización Mundial de la Salud en Guinea Ecuatorial) (Anexos 10 y 11) y el Comité Ético de Aragón (CEICA, Zaragoza, España). Tabla MM-8: Protocolo de tratamientos antiparasitarios intestinales. PARÁSITO MEDICACIÓN CANTIDAD POR DOSIS DOSIS DIARIA DURACIÓN Entamoeba spp.** Metronidazol 500 mg. 3 7 días Blastocystis hominis Metronidazol 250 mg. 3 10 días A. lumbricoides Mebendazol 500 mg. 1 1 día Albendazol 400 mg. 1 1 día T. trichiura Mebendazol 500 mg. 1 1 día Albendazol 400 mg. 1 1 día S. stercoralis Mebendazol 300 mg. 2 3 días Albendazol 400 mg. 1 1 día Uncinarias spp. Albendazol 400 mg. 1 1 día. Repetir a los 15 días Giardia spp. Metronidazol 250 mg. 3 7 días Albendazol 400 mg. 2 5 días Schistosoma spp. Prazicuantel  600 mg. 2 1 día * Son en total 4 comprimidos de 600 mg. cada uno, se toman 2 y se repite la toma a las 6 horas. ** Si presenta síntomas intestinales. CAPÍTULO 4: TÉCNICAS MICROSCÓPICAS RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS ______________________________________________________________________ Resultados Técnicas Microscópicas 77 4.1.2 Participantes VIH negativos Se seleccionaron 110 pacientes, con el criterio de convivir en el hogar con una persona infectada del VIH/SIDA que participe en el estudio y que presente algún parásito de transmisión persona a persona como Cryptosporidium spp., Giardia spp. y/o Entamoeba spp. Para estos pacientes, se recogió una muestra de heces y se les pasó el mismo cuestionario que a los pacientes VIH positivos objeto del estudio. En relación al origen geográfico: Malabo -Isla de BiokoEl 45,5% (50/110) del total de los participantes VIH negativos procedían de la Isla de Bioko (Región Insular del país), la edad media fue de 27,0 ± 17,9 (rango 3-57 años). Con una proporción de adultos del 66,0% (33/50), de ellos el 42,2% (14/33) eran varones y el 57,6% (19/33) mujeres, de éstas, dos embarazadas. Para los menores de 15 años la proporción fue de 34,0% (17/50), de los cuales el 64,7% (11/17) fueron niñas y el 35,3% (6/17) niños. En cuanto al lugar de residencia, el 6,0% (3/50) de los participantes vivían en zonas rurales, el 44,0% (22/50) en el área urbana y el 50,0% (25/50) en el cinturón urbano. Variables socio-económicas: para el nivel de formación, el 30,0% (15/50) tenían formación profesional, el 24,0% (12/50) secundaria y el 46,0% (23/50) primaria o nula. En cuanto a la información higiénica, el 28,0% (14/50) la tenían alta, el 24,0% (12/50) media y el 48,0% (24/50) baja. La proporción para el nivel socioeconómico fue: el 10,0% (5/50) alto, el 78,0% (39/50) medio y el 12,0% (6/50) bajo. En relación a la sintomatología presentaban diarrea el 4,0% (2/50), estreñimiento el 4,0% (2/50) y 8,0% (4/50) otros síntomas como dolor abdominal, aerofagia, retortijones, etc. Bata - Región Continental El 54,5% (60/110) de los participantes del grupo VIH negativos procedían de Bata – Región Continental-, con una edad media de 27,68 ± 17,6 (rango 3-76 años), el 73,3% (44/60) de los participantes eran mayores de 15 años, 25,0% (11/44) varones y 75,0% (33/44) mujeres, de éstas, 4 embarazadas. El 26,6 % (16/60) fueron menores de 15 años, 8 niños y 8 niñas. En cuanto al lugar de residencia, el 8,3% (5/60) de los participantes vivían en las zonas rurales, el 53,3% (32/60) en las áreas urbanas y el 38,3% (23/60) en el cinturón urbano. Variables sociológicas: nivel de formación académica: el 11,6% (7/60) tenían formación profesional, el 38,3% (23/60) tenía educación secundaria y el 50,0% (30/60) primaria o nula; información higiénica, el 10,0% (6/60) alta, el 40,0% (24/60) media y el 50,0% (30/60) baja; nivel socioeconómico: el 8,3% (5/60) lo tenía alto, el 73,3% (44/60) medio y el 18,3% (11/60) bajo. Sintomatología el 54,0% (3/60) presentaban diarrea, el 15,0% (9/60) estreñimiento y el 28,3% (17/60) otros síntomas como dolor, aerofagia, retortijones, etc. Tabla VD-9: Variables sociológicas. Valor absoluto y relativo. VIH negativo. I. Bioko y R. Continental. VARIABLE ALTO/PROFESIONAL MEDIO/SECUNDARIA BAJO/PRIMARIA-NULA ISLA CONTIN. ISLA CONTIN. ISLA CONTIN. Formación académica 30,0 (15/50) 11,6 (7/60) 24,0 (12/50) 38,3 (23/60) 46,0 (23/50) 50,0 (30/60) Información higiénica 28,0 (14/50) 10,0 (6/60) 24,0 (12/50) 40,0 (24/60) 48,0 (24/50) 50,0 (30/60) Nivel socioeconómico 10,0 (5/50) 8,3 (5/60) 78,0 (39/50) 73,3 (44/60) 12,0 (6/50) 18,3 (11/60) Tabla VD-10: Variables demográficas. Valor absoluto y relativo. VIH negativo. Bioko y Continente. ZONA R. INSULAR R. CONTINENTAL TOTAL RURAL 6,0 (3/50) 8,3 (5/60) 7,3 (8/110) URBANO 44,0 (22/50) 53,3 (32/60) 49,1 (54/110) CINTURÓN 50,0 (25/50) 38,3 (23/60) 43,6 (48/110) Resultados Técnicas Microscópicas 79 4.2 Resultados de la aplicación de las técnicas microscópicas para la detección de parásitos intestinales 4.2.1 Concordancia entre las técnicas microscópicas con y sin concentración Malabo –Isla de BiokoEl 80,3% (249/310) de las muestras de los participantes de la Isla de Bioko fueron positivas para al menos un parásito intestinal, sin asociación estadísticamente significativa entre la coinfección por parásitos intestinales y la infección por VIH. En 178 participantes se detectó poliparasitismo. Figura VD-3: Muestras positivas para al menos un parásito en los participantes de la Isla de Bioko. 80,3% (249) 19,7 % (61) No parasitados Parasitados Figura VD-4: Parasitismo en la Isla de Bioko. La concordancia entre las técnicas microscópicas con y sin concentración, medida con el índice de concordancia Kappa fue de 0,185. El método de concentración con formaldehído permitió la detección de parásitos intestinales que no habían sido visualizados mediante examen en fresco con suero fisiológico y lugol en 103 muestras. En 11 (10,7%) de ellas, anteriormente no se había observado ningún parásito. Estas desigualdades se traducen en diferencias en el diagnóstico del 34,6% (90/260) de las muestras de pacientes VIH positivos y un 26,0% (13/50) en las de los VIH negativos. Bata - Región ContinentalEl 78,7% (262/333) de las muestras de la Región Continental fueron positivas para al menos un parásito intestinal, no habiendo asociación estadísticamente significativa entre la coinfección del participante por parásitos intestinales y por el VIH. Se observó poliparasitismo en 178 muestras. 61 (19,7%) 71 (22,9%) 178 (57,4%) No Parasitados Monoparasitismo Poliparasitismo Resultados Técnicas Microscópicas 81 Figura VD-5: Muestras positivas para al menos un parásito en los participantes de la R. Continental. Figura VD-6: Parasitismo en la Región Continental. La evaluación de la concordancia entre ambas técnicas microscópicas, con y sin concentración, medida con el índice de concordancia Kappa fue de 0,163. El método de concentración con formaldehído-acetato de etilo, permitió la detección de parásitos intestinales que no habían sido detectados mediante examen en fresco de una suspensión en suero fisiológico y lugol, en 82 muestras. Siete (8,5%) de ellas, pertenecían a pacientes en los que no se había observado previamente ningún parásito. 78,7% (262) 21,3% (71) No parasitados Parasitados 84 (25,2%) 71 (21,3%) 178 (53,5%) No Parasitados Monoparasitismo Poliparasitismo La diferencia entre los dos métodos afectó al diagnóstico de un 22,3% (61/273) de las muestras de pacientes VIH positivos y de un 35,0% (21/60) de las de los VIH negativos. Figura VD-7: Diferencias entre microscopia con y sin concentración. Isla/Continente. En toda la población estudiada y considerando los grupos VIH positivos y VIH negativos de forma independiente, no se encontró asociación entre la infección parasitaria y la edad, el género, el nivel socioeconómico, la formación académica, la información higiénica, los síntomas o el embarazo. La única asociación hallada fue respecto a la zona de residencia (p=0,041) que refleja que las zonas con mayor proporción son las urbanas y el cinturón urbano, respecto a la zona rural. 4.2.2 Resultados de los participantes del estudio 4.2.2.1 Participantes VIH positivos Malabo -Isla de BiokoEl 81,5% (212/260) de los participantes VIH positivos estaban infectados por uno o más parásitos intestinales, siendo la asociación estadísticamente significativa (p=0,048). Los pacientes que vivían en el cinturón urbano fueron los que presentaron el mayor 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 Participantes VIH+ Participantes VIH34,6% (90) 26,0% (13) 22,3% (61) (35,0% (21) Isla Continente Resultados Técnicas Microscópicas 83 porcentaje de parasitosis intestinal (Tabla VD-11). Además, se observó poliparasitismo en el 58,5% (152/260) de los participantes, con un rango de 0 a 7 parásitos encontrados simultáneamente en la misma persona, una moda de 2 parásitos y una media de 2,0 ± 1,5 parásitos por paciente. El lugar de residencia con menor rango de poliparasitismo correspondió a la zona rural con un máximo de tres parásitos en la misma persona. La Tabla VD-12 muestra la intensidad de parasitismo en esta población. Solamente se encontró poliparasitismo en adultos [60,0% (152/253)], no encontrándose asociación significativa entre el número de parásitos y el estado inmunológico o estar bajo TARV. Tabla VD-11: Distribución de la infección por parásitos intestinales según el lugar de residencia. Isla/Continente. ZONA DE RESIDENCIA HIV+ ISLA % (*) HIV+ CONTINENTE % (*) Rural 6,1 (13/212) 24,3 (51/210) Urbano 29,7 (63/212) 30,5 (64/210) Cinturón urbano 64,2 (136/212) 45,2 (95/210) TOTAL 100 (212) 100 (210) p-valor 0,048 0,098 (*) = Número de participantes infectados por parásitos intestinales en cada zona/total de infectados VIH+. Tabla VD-12: Número de parásitos que se encuentran simultáneamente en los pacientes VIH+ Isla/Continente. Nº de parásitos HIV+ Isla n=260 % IC HIV+ Continente n=273 % IC 7 2 0,8 (0,09-2,7) 1 0,4 (0,009-2,0) 6 7 2,7 (0,5-4,8) 8 2,9 (0,7-5,1) 5 7 2,7 (0,5-4,8) 13 4,8 (2,0-7,5) 4 29 11,2 (7,1-15,2) 17 6,2 (3,1-9,2) 3 35 13,5 (9,1-17,8) 41 15,0 (10,6-19,4) 2 72 27,7 (22,0-33,3) 62 22,7 (17,5-27,8) 1 60 23,1 (17,7-28,4) 68 24,9 (19,6-30,2) 0 48 18,5 (13,5-23,4) 63 23,1 (17,9-28,2) Los pacientes con una combinación de 7 parásitos simultáneos fueron dos mujeres adultas. Una de ellas con una inmunosupresión avanzada y estaba bajo TARV, albergaba los siguientes parásitos: E. histolytica/dispar/moshkovskii, Giardia duodenalis, Entamoeba coli, Pentatrichomonas hominis, Blastocystis hominis, Ascaris lumbricoides y T. trichiura. La otra paciente estaba embarazada, era inmunocompetente y se encontraba bajo TARV. Esta última albergaba los siguientes parásitos: E. histolytica/dispar/moshkovskii, Giardia duodenalis, Entamoeba coli, I. bütschlii, Chilomastix mesnili, Schistosoma intercalatum/guineensis y T. trichiura. Ambas vivían en el cinturón urbano de Malabo. La infección con al menos un parásito intestinal se asoció con la edad (p=0,003), dado que el 83,0% (210/253) de los participantes adultos estaban parasitados frente al 28,6% (2/7) de los niños y a la información higiénica, siendo, los participantes con nivel bajo de información higiénica los que presentaban un mayor porcentaje [85,3% (163/191) p=0,004]. Sin embargo, no hubo asociación estadísticamente significativa, entre infección parasitaria intestinal y el género, el nivel socioeconómico, los síntomas o el estado inmunológico. Respecto al nivel académico, se observa que la infección parasitaria fue mayor en pacientes con formación secundaria [84,0% (84/100)] y primaria o nula [83,3% (100/120)] que en aquellos que tenían formación profesional [70,0% (28/40)], aunque sin alcanzar la significación estadística. Cuando los síntomas se estudiaron por separado, se encontró asociación significativa entre el estado inmunológico y diarrea, destacando que el 36,4% (12/33) de los participantes que tenían diarrea, también tenían inmunosupresión severa (p= 0,003). Se encontraron quince parásitos diferentes, como se muestra en la Tabla VD-13, con una proporción del 62,3% (162/260) de participantes infectados por algún helminto patógeno, considerando como tales: Trichuris, Ascaris, Strongyloides, Schistosoma spp. y Uncinarias (Figura VD-8 y VD-9) y del 47,7% (124/260) infectados por protozoos patógenos, considerando como tales: Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii y Giardia duodenalis. Resultados Técnicas Microscópicas 85 1: Larva de S. stercoralis; 2: Huevos de Schistosoma spp.; 3: Huevo de Uncinaria Figura VD-8: Helmintos patógenos: Strongyloides, Schistosoma y Uncinaria. La proporción de protozoos oportunistas encontrada en este grupo fue del 35,0% (91/260), considerando como tales: Cryptosporidium spp., Entamoeba coli, E. hartmanni, I. bütschlii, Pentatrichomonas hominis, Blastocystis hominis, E. nana y Chilomastix mesnili; aunque la patogenicidad de Blastocystis hominis se encuentra en entredicho. Considerando el total de parásitos intestinales identificados en el grupo VIH positivos de la Isla de Bioko, el 46,9% (242/516) correspondían a helmintos patógenos, el 27,9% (144/516) a protozoos patógenos y el 25,2% (130/516) protozoos oportunistas. 1: Huevos de Ascaris y Trichuris; 2: Huevo embrionado de Ascaris Figura VD-9: Helmintos patógenos: Trichuris trichiura y Ascaris lumbricoides. 1 2 3 1 2 En este estudio no se han encontrado cestodos, ni otros protozoos como Isospora o Cyclospora. Tabla VD13: Proporción de parásitos intestinales en pacientes VIH positivos en la Isla/Continente. PARASITO HIV+ Isla (n= 260) %IC HIV+ Continente (n= 273) %IC T. trichiura 134 51,5 (45,3-57,8) 124 45,4 (39,3-51,5) A. lumbricoides 50 19,2 (14,2– 24,2) 63 23,1 (17,9– 28,2) S. stercoralis 23 8,8 (5,2 – 12,5) 28 10,3 (6.5 – 14,0) Uncinarias 11 4,2 (1,6 – 6,9) 11 4,0 (1,5 – 6,5) S. intercalatum/guineensis 24 9,2 (5,5– 12,9) 19 7,0 (3,7– 10,2) Schistosoma mansoni 0 0 1 0,4 (0,01 – 2,0) Entamoeba spp. 112 43,1 (36,99,3) 101 37,0 (31,142,9) Giardia duodenalis 32 12,3 (8,1– 16,5) 14 5,1 (2,3– 7,9) Cryptosporidium spp. 24 9,2 (5,5 – 12,9) 8 2,9 (0,7 – 5,1) Entamoeba coli 41 15,8 (11,1– 20,4) 33 12,1 (8,0– 16,1) E. nana 13 5,0 (2,1 – 7,8) 58 21,2 (16,2 – 26,3) E. hartmanni 1 0,4 (0,01 – 2,1) 1 0,4 (0,01 – 2,0) Blastocystis hominis 28 10,8 (6,8 – 14,7) 16 5,9 (2,9 – 8,8) Pentatrichomonas hominis 11 4,2 (1,6 – 6,9) 7 2,6 (0,5 – 4,6) Chilomastix mesnili 11 4,2 (1,6 – 6,9) 3 1,1 (0,2 – 3,2) I. bütschlii 1 0,4 (0,01 – 2,1) 16 5,.9 (2,9 – 8,8) TOTAL PARASITOS 516 503 Todos los pacientes parasitados por S. stercoralis y por Chilomastix mesnili pertenecieron al grupo de participantes VIH positivos y todos eran adultos. Además, Chilomastix mesnili infectó solo a mujeres. También eran adultos todos los participantes infectados con Trichuris trichiura, con una proporción más alta en los que vivían en el cinturón urbano de Malabo que en los que vivían en áreas urbanas y rurales. Ascaris lumbricoides fue detectado solamente en participantes pertenecientes a un nivel socioeconómico bajo o medio, asociado estadísticamente con la variable género, siendo las mujeres el 90,0% (45/50) de los infectados por este helminto [p = 0,005, OR = 3,7, (1,4 – 9,7)]. En cuanto a la infección por Schistosoma intercalatum/guineensis en este grupo, la proporción de infectados fue mayor entre las mujeres, con el 91,7% (22/24), frente al 8,3% (2/24) en los varones [p = 0,044, OR = 4,1 (0,9-17,9)], aunque el análisis bivariante no haya confirmado la asociación significativa entre género y la infección. En el caso de Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, sólo se da asociación respecto al lugar de residencia [p=0,023, OR=4,7 (1,3-16,5)], siendo el 67,0% (75/112) de las Resultados Técnicas Microscópicas 93 proporción de pacientes infectados con algún protozoo patógeno fue del 48,0% (24/50), considerando como tales (Figura VD-11): Entamoeba spp. y Giardia duodenalis. 1: Quiste de Giardia; 2: Ooquistes de Cryptosporidium; 3: Quistes de Entamoeba spp. Figura VD-11: Protozoos patógenos: Giardia, Cryptosporidium y Entamoeba histolytica/dispar. La proporción de pacientes infectados con algún protozoo oportunista fue del 36,0% (18/50), incluyendo en este grupo: Cryptosporidium spp., Entamoeba coli, E. hartmanni, I. bütschlii, Pentatrichomonas hominis, Blastocystis hominis, E. nana y Chilomastix mesnili. Considerando el total de parásitos intestinales identificados en el grupo VIH negativos de la Isla de Bioko, el 45,9% (50/109) correspondían a helmintos patógenos, el 30,3% (33/109) a protozoos patógenos y el 23,8% (26/109) protozoos oportunistas. Al igual que en el grupo de participantes VIH positivos de la Isla de Bioko, no se encontraron Isospora o Cyclospora, aunque fue más frecuente la infección por Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp., y Schistosoma intercalatum/guineensis. 1 2 3 Tabla VD-16: Proporción de parásitos intestinales en pacientes VIH negativos. Isla/ Continente. PARASITO HIVIsla (n= 50) %IC HIVContinente (n= 60) %IC T. trichiura 21 42,0 (27,3 – 56,7) 30 50,0 (36,5 – 63,5) A. lumbricoides 14 28,0 (14,5 – 41,4) 19 31,7 (19,0 – 44,3) S. stercoralis 0 0 8 13,3 (3,9 – 22,7) Uncinarias 5 10,0 (3,3 – 21,8) 4 6,7 (1,8 – 16,2) S. intercalatum/guineensis 10 20,0 (7,9 – 32,0) 8 13,3 (3,9 – 22,7) Entamoeba spp. 21 42,0 (27,3 – 56,7) 24 40,0 (26,8 – 53,2) Giardia duodenalis 12 24,0 (11,1 – 36,8) 10 16,7 (6,4 – 26,9) Cryptosporidium spp. 10 20,0 (7,9 – 32,0) 1 1,7 (0,04 – 8,9) Entamoeba coli 6 12,0 (2,0 – 22,0) 10 16,7 (6,4 – 26,9) E. nana 3 6,0 (1,2 – 16,5) 11 18,3 (7,7 – 28,9) Blastocystis hominis 2 4,0 (0,5 – 13,7) 1 1,7 (0,04 – 8,9) Pentatrichomonas hominis 4 8,0 (2,2 – 19,2) 3 5,0 (1,0 – 13,9) I. bütschlii 1 2,0 (0,05 – 10,.6) 2 3,3 (0,4 – 11,5) TOTAL PARASITOS 109 131 La infección por Trichuris estuvo asociada con la edad, con una proporción de la infección en niños del 76,5% (13/17) [p<0,001, OR = 10,1 (2,6-40,1)], frente a un 24,2% (8/33) de adultos. Así mismo, se encontró asociación entre Trichuris y el nivel de información higiénica [p=0,003, OR=8,4 (2,3-30,6)], y entre Trichuris y el nivel de formación académica (p=0,025), siendo la infección mayor en los participantes con un nivel bajo de información higiénica, con un 76,2% (16/21); y en el nivel académico de formación primaria/nula, con un 61,9% (13/21). Hay que destacar que todos los casos de uncinariosis se han dado en el cinturón urbano. Por otro lado, se encontró asociación entre la infección por Schistosoma y la edad [p=0,007 OR=7,0 (1,5-32,3)], ya que un 70,0% (7/10) de los participantes parasitados por Schistosoma spp. eran niños. En el caso de los protozoos patógenos, la infección por Giardia duodenalis, Entamoeba spp. y Entamoeba coli se relacionó con la edad [41,2% (7/17), p=0,041, OR=3,9 (1,015,2)], [64,7% (11/17), p=0,020, OR = 4,2 (1,214,6)] y [83,3% (5/6), p=0,007, OR=13,3 (1,4-126)] siendo más frecuente la infección en el grupo de los participantes menores de 15 años. La infección por Entamoeba spp. se relacionó con el género, siendo más frecuente la infección en los varones, con un 60,0% (12/20) de infectados [p = 0,035, OR = 3,5 (1,0-11,5)]. En el caso de Cryptosporidium spp., la infección se encuentra relacionada con el nivel de información higiénica y de formación académica, de modo que sólo se ha encontrado Resultados Técnicas Microscópicas 95 este parásito en participantes con niveles académicos de formación primaria/nula [90,0% (9/10)] o secundaria [10,0% (1/10)] y con niveles bajos o medios de información en normas de higiene, en las mismas proporciones. Además, igual que ocurría con los protozoos anteriores la infección por Cryptosporidium se asocia con la edad [p=0,007, OR = 7,0 (1,5-32,3)], con mayor frecuencia de infección en niños que representan el 70,0% (7/10) de los infectados por este protozoo. En lo que respecta a coinfecciones, se encontró asociación entre la infección por Trichuris y las siguientes especies de parásitos: Ascaris (p=0,001), Entamoeba spp. (p=0,003), Entamoeba coli (p=0,002) y con Cryptosporidium spp. (p=0,045). En este grupo, también se dio asociación entre Ascaris y las siguientes especies parasitarias: Entamoeba coli (p=0,025) y Entamoeba spp. (p=0,046). Entre la infección por Schistosoma intercalatum/guineensis y Uncinaria (p=0,018). Entre la infección por Giardia duodenalis y las especies: Uncinaria (p=0,047), Pentatrichomonas hominis (p<0,001). Así como entre Entamoeba spp. con: Pentatrichomonas hominis (p=0,014) y con Giardia (p=0,008). Bata - Región Continental - El 86,7% (52/60) de los participantes de este grupo fueron positivos para al menos un parásito intestinal e, igual que en el grupo de participantes VIH positivos de esta región continental, la infección parasitaria intestinal fue más frecuente en los participantes de la zona urbana (Tabla VD-14). La proporción total de participantes VIH negativos de la Región Continental parasitados (86,7%) ha sido mayor que en la Isla de Bioko (74,0%), así como la frecuencia de la misma en la zona rural y urbana; en cambio en la isla la zona de residencia donde se encuentran más pacientes parasitados es el cinturón urbano. Se observó poliparasitismo en el 60,0% (36/60) de los componentes del grupo, con un rango de 0-8 parásitos y una media de parásitos por participante de 2,18 ± 1,70 (Tabla VD-15). Sólo en un paciente se detectó la presencia simultánea de 8 parásitos, un varón adulto que residía en la zona urbana de Bata y que albergaba los siguientes parásitos: E. histolytica/dispar/moshkovskii, Entamoeba coli, I. bütschlii, Pentatrichomonas hominis, E. nana, Ascaris lumbricoides, T. trichiura y Uncinarias. La proporción de poliparasitismo, así como el número de especies de parásitos encontrados son mayores en la Región Continental, aunque este hecho no se haya asociado a ninguna de las variables de estudio. No se ha encontrado asociación estadísticamente significativa entre la infección y las distintas variables del estudio. En este grupo, 24 (40,0%) de los participantes presentaron síntomas intestinales y de ellos 21 (87,5%) estaban parasitados. Se encontraron trece parásitos diferentes en los participantes de este grupo (Tabla VD16). La proporción de pacientes infectados con algún helminto patógeno fue del 71,7% (43/60), habiendo detectado: Trichuris, Ascaris, S. stercoralis, Schistosoma spp. y Uncinaria. La proporción de pacientes infectados con algún protozoo patógeno fue del 46,7% (28/60), considerando como tales: Entamoeba spp. y Giardia duodenalis. El porcentaje de pacientes infectados con algún protozoo oportunista fue del 31,7% (19/60), incluyendo como oportunistas: Cryptosporidium spp., Entamoeba coli, I. bütschlii, Pentatrichomonas hominis, Blastocystis hominis, y E. nana. Por otra parte, considerando el total de parásitos intestinales identificados en el grupo VIH negativos de la Región Continental, el 52,7% (69/131) correspondían a helmintos patógenos, el 25,9% (34/131) a protozoos patógenos y el 21,4% (28/131) protozoos oportunistas. Al igual que en el grupo VIH positivos de la zona continental, no se encontraron ni Isospora ni Cyclospora. La infección por S. stercoralis, fue significativamente más frecuente en los participantes con nivel socioeconómico bajo o medio [75,0% (6/8)], respecto al alto [25,0% (2/8) (p=0,038)]. El porcentaje total de protozoos oportunistas ha sido mayor en la Isla de Bioko que en la región continental. Lo mismo ha ocurrido a nivel de especies, con mayor probabilidad de adquirir una infección por Cryptosporidium (p=0,0014) en los residentes de la Isla que en el continente. En relación a la infección por Giardia, el 31,6% (6/19) de varones la presentaba, frente al 9,8% (4/41) de mujeres, dando una asociación significativa de la infección con el género [p =0,035, OR=4,2 (1,0-17,5)]. Resultados Técnicas Microscópicas 97 4.2.3 Comparación entre los participantes VIH positivos y VIH negativos Teniendo en cuenta la alta proporción de infecciones parasitarias intestinales presente en personas VIH positivas y los factores que influyen en la adquisición de las mismas, así como la coinfección con el VIH y el estado inmunológico, se seleccionaron y se incluyeron en el estudio 110 personas VIH negativas (50 procedentes de la Isla de Bioko y 60 de la Región Continental). Todas ellas convivían con alguno de los participantes VIH positivos que estaban parasitados. Estos pacientes se estudiaron con el objetivo de eliminar la influencia de factores medioambientales. Los datos de los 110 participantes VIH negativos fueron comparados con los de los 110 participantes VIH positivos que vivían con ellos. Resultados de la Isla de Bioko La probabilidad de parasitismo por Ascaris, Uncinarias y Schistosoma disminuye en un 39,1%, 27,3% y 43,2% respectivamente para el grupo de personas VIH positivas, mientras que la probabilidad de parasitismo por Trichuris, Entamoeba coli, Blastocystis, Pentatrichomonas spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp. y Entamoeba spp. fueron de un 59,9%, el 67,4%, 76,6%, 56,1%, 63,2%, 71,3% y 79,7% respectivamente. La tabla VD-17 muestra la OR entre el VIH y la coinfección parasitaria intestinal. Se encontró asociación estadísticamente significativa entre la infección por Entamoeba spp. y Giardia spp. y la infección por VIH (p=0,001 y p=0,035 respectivamente). En este grupo, los participantes con diarrea fueron el 15,0% (15/100), apreciándose asociación entre infección parasitaria intestinal y diarrea en pacientes VIH positivos (p=0,002), con mayor proporción de infección en este grupo [13 (86,7)] que en el grupo de participantes VIH negativos [2 (13,3%)]. Como resumen general, se describen en la figura VD-11 todos los resultados de los diferentes grupos de parásitos intestinales identificados en los pacientes procedentes de la Isla de Bioko y se señalan las cuencas más importantes asociadas a los mismos. Figura VD-12: Mapa georeferenciado de los distintos grupos de parásitos intestinales. Isla de Bioko. Resultados Técnicas Microscópicas 99 Resultados de la Región Continental La probabilidad de parasitismo por Ascaris, Trichuris, Pentatrichomonas spp., Giardia y Schistosoma disminuye en un 46,0%, 48,3%, 39,6%, 46,8% y 31,7% respectivamente, para el grupo de participantes VIH positivos, mientras que la probabilidad de parasitismo por Blastocystis, Uncinarias, Cryptosporidium, E. nana y Entamoeba spp. aumenta en un 88,6%, 56,0%, 80,8%, 76,0% y 91,9% respectivamente. La tabla VD-17 muestra la OR para la coinfección entre VIH e infección parasitaria intestinal. Además, se encontró asociación estadísticamente significativa entre la infección por Entamoeba spp., Blastocystis y E. nana e infección por VIH (p< 0,001, p=0,028 y p=0,005 respectivamente). Como resumen general, se describen en la figura VD-12 todos los resultados de los diferentes grupos de parásitos intestinales identificados en los pacientes procedentes de la Región Continental y se señalan las cuencas más importantes asociadas a los mismos. Figura VD-13: Mapa georeferenciado de los distintos grupos de parásitos intestinales. R. Continente. Resultados Técnicas Microscópicas 101 Tabla VD-17: OR para VIH+ e infección parasitaria, tomando como referencia VIH negativo. Isla de Bioko/R. Continental. PARÁSITO ISLA BIOKO R. CONTINENTAL OR IC95% % OR IC 95% % Ascaris lumbricoides 0,643 0,254-1,626 39,1 0,853 0,390-1,864 46,0 Trichuris trichiura 1,496 0,679-3,294 59,9 0,935 0,457-1,914 48,3 Uncinarias 0,375 0,069-2,031 27,3 1,273 0,325-4,991 56,0 Schistosoma spp. 0,762 0,273-2,125 43,2 0,464 0,132-1,634 31,7 Entamoeba coli 2,068 0,700-6,116 67,4 Blastocystis hominis 3,273 0,627-17,071 76,6 7,792 0,928-65,433 88,6 Pentatrichomonas h. 1,278 0,322-5,066 56,1 0,655 0,106-4,069 39,6 Giardia duodenalis 2,488 1,0575,857 71,3 0,882 0,331-2,354 46,8 Entamoeba spp. 3,930 1,688-9,154 79,7 11,357 4,426-29,143 91,9 E. nana 3,182 1,386-7,306 76,0 Cryptosporidium spp. 1,714 0,683-4,301 63,2 4,214 0,457-38,865 80,8 Discusión Técnicas Microscópicas 109 significativa. Además, en esta última región se observa una considerable diferencia entre la proporción de parasitados VIH negativos (7,7%) y VIH positivos (24,3%) residentes en el medio rural, diferencia mucho mayor a la observada entre los dos grupos en la Isla de Bioko. Esta observación puede sugerir que en el continente se dé una menor influencia de factores medioambientales y una mayor influencia de la coinfección con el VIH a la hora de adquirir infecciones parasitarias intestinales, aunque también hay que tener en cuenta que en esta región, las personas VIH positivas tienden a volver a sus poblados natales -zona ruralen busca de una mejora de su estado de salud, cuando se diagnostica la seropositividad o entran en proceso de SIDA. Este hecho podría justificar igualmente la elevada proporción de participantes, así como de infección parasitaria intestinal, de los pacientes VIH positivos de la zona rural. Otro resultado que llama la atención es que en el medio urbano, la proporción de participantes parasitados es mayor en los participantes VIH negativos (55,8%) que en los VIH positivos (30,5%). Una posible explicación es que cada tres meses, sin análisis parasitológico previo, se administra albendazol y/o mebendazol así como metronidazol, a personas seropositivas en los controles rutinarios de seguimiento en la UREI y CTA de la Región Continental y cotrimoxazol en la Región Insular, lo que redundaría en la disminución de los parásitos en los pacientes VIH positivos. El que esto no ocurra en las otras zonas estudiadas podría estar relacionado con una accesibilidad menor de los participantes rurales y del cinturón urbano a las unidades de control, tanto por cuestiones de distancia como sociales. Como consecuencia de las altas tasas de parasitismo encontradas, apareció poliparasitismo, con combinación de hasta 7 especies de parásitos en la Isla de Bioko, más común en los niños del grupo VIH negativos, y de 8 en el continente, más frecuente en los adultos VIH positivos. No ha habido diferencias significativas en las proporciones de poliparasitación en las dos regiones del país. Sin embargo, la zona más afectada en la isla fue el cinturón urbano de Malabo y en Bata lo fue la zona urbana seguida del cinturón urbano. Cuando se analizan los factores que influyen en la infección parasitaria intestinal, se observa, como dato destacado, que para los participantes VIH positivos, en Bioko no se ha encontrado asociación entre estado inmunológico e infección parasitaria intestinal, pero sí en el continente, de acuerdo con algunos estudios que sugieren que el bajo recuento de células T-CD4 + se relaciona con una mayor incidencia de infecciones parasitarias oportunistas (Certad et al., 2003). En la región continental, la proporción de parasitación intestinal fue mayor en los participantes sin TARV que en los que estaban bajo TARV. El inicio del TARV por los pacientes es mucho más tardío en esta zona, por lo que es mayor el número de personas con necesidad de tratamiento antirretroviral de los que estaban recibiendo, aunque en el seguimiento sí recibieran tratamiento con antihelmínticos y antiprotozooarios lo que puede tener una gran influencia en la disminución de parásitos intestinales. Pocos participantes informaron de síntomas clínicos como diarrea, malestar abdominal, o vómitos. En la isla, la falta de asociación entre la infección parasitaria en los participantes VIH positivos y los síntomas se justifica debido a que sólo el 48,8% (127/260) de los participantes informaron de síntomas, y de ellos, 103 estaban parasitados. No se encontró asociación entre los diferentes parásitos, considerando cada especie de forma individual, y la presencia de síntomas. Por el contrario, en el continente el 61,9% (169/273) de participantes señaló síntomas, 133 de los cuales se encontraban parasitados. Sin embargo, en este caso sí se encontró asociación entre infección por E. histolytica/dispar/moshkovskii y Entamoeba coli con otros síntomas, que incluyen molestias abdominales, dolor epigástrico o vómitos. Estos resultados, junto con las altas tasas de parasitación sugieren que el contacto permanente con los parásitos podría dar lugar a infecciones asintomáticas. Esta observación estaría de acuerdo con la opinión expresada por diversos autores de que la mayoría de las personas infectadas por Strongyloides que viven en zonas endémicas sean asintomáticas (SegarraNewnham, 2007), y con la difusión de los genotipos asintomáticos de algunos parásitos como Giardia (Sahagún et al., 2008; Goñi et al., 2010). Sin embargo, en personas VIH positivas de la isla, el estado inmunológico se asoció con diarrea pero no con parasitación intestinal específica. Por ello, que resulta de especial interés la determinación de las especies y los genotipos circulantes de algunos parásitos que nos permita asociarlos con síntomas más o menos específicos. Por otro lado, algunos pacientes no parasitados han informado de síntomas, lo que sugiere la posible presencia de otros agentes causales, tales como virus o bacterias que no han sido analizados en este estudio. Discusión Técnicas Microscópicas 111 El número de especies parasitarias encontradas ha sido muy similar en todas las zonas y los grupos de población estudiados, siendo ligeramente superior en los participantes VIH positivos. La proporción total de helmintos patógenos ha sido muy similar en la Región Continental [60,7% (202/333)] y en la Isla de Bioko [61,9% (192/310)]. En los pacientes VIH negativos, los helmintos más frecuentes fueron Trichuris, Ascaris y Strongyloides en el continente y Uncinarias, Ascaris y Schistosoma en la isla. En el presente estudio, en la Isla de Bioko Trichuris trichiura fue significativamente más frecuente en los pacientes VIH positivos aunque en el grupo de los participantes VIH negativos la proporción encontrada fue también alta, con asociación entre la infección por Trichuris y la edad. En el primer grupo, sólo los adultos estaban infectados, pero estos resultados deben considerarse con precaución, debido al bajo número de niños en este grupo. En los VIH negativos, la asociación entre infección por Trichuris y edad dio como resultado una mayor proporción de infección en los niños, hecho justificado por su contacto con el suelo y la escasez de medidas higiénicas, lo que también está relacionado con el hecho de que la parasitación por Trichuris aparezca asociada a participantes con niveles académicos bajos. De acuerdo con lo comentado, la infección por Trichuris es más alta en el cinturón urbano, donde se acumulan las personas más desfavorecidas, con peores condiciones higiénicas y menores posibilidades económicas. En el continente encontramos asociación de la infección por Trichuris con el género, siendo más frecuente la infección en las mujeres que son las que más trabajan en el campo. También se da asociación con los niveles bajos de formación académica, el estatus socioeconómico y la inmunosupresión. Por el contrario, en Bioko Ascaris fue significativamente más frecuente en el grupo de participantes seronegativos. También fue alta la proporción de pacientes VIH positivos (19,2%) que presentaban este helminto. Se ha encontrado asociación entre la infección por Ascaris y el género en el grupo de VIH positivo, lo que sugiere que, como ocurre en el caso de Trichuris, las actividades diarias llevadas a cabo por la mujer en el campo, la venta de los productos agrícolas en el mercado, los hábitos sociales e higiénicos, las precarias condiciones sanitarias del medio ambiente o el consumo de alimentos contaminados puedan ser la causa de la mayor parasitación en mujeres. En diversas publicaciones, algunos autores describen cómo la alta proporción de parásitos intestinales va asociada a niveles socioeconómicos bajos, a lugares donde el suministro de agua es inadecuado y en general, a situaciones sanitarias deficientes (Assefa et al., 2009; Damen et al., 2011). Sin embargo, las actividades ocupacionales también podrían ser un factor de riesgo importante, especialmente entre los agricultores que están en continuo contacto con la tierra contaminada e incluso entre los comerciantes, a los que les gusta humedecer los dedos con saliva para contar el dinero (Hailemariam et al., 2004) y cuyos lugares de trabajo no siempre reúnen las condiciones sanitarias mínimas. Por lo tanto, la asociación entre la infección parasitaria intestinal, el nivel de educación y de información en medidas higiénicas, así como, en menor medida, el lugar de residencia, no ha de sorprendernos ya que estos factores están interrelacionados, de modo que aquellas personas con menores niveles de educación también tienen menos cuidado con el saneamiento y tienden a vivir a su vez en el cinturón urbano. Roche y Benito en 1999, también señalan a Trichuris y Ascaris como los nematodos intestinales más frecuentes y a E. histolytica/dispar como el protozoo más común en heces de los habitantes de la Isla de Bioko (Roche & Benito, 1999). En Bioko, Strongyloides stercoralis fue detectado sólo en pacientes coinfectados con el VIH, mientras que Cryptosporidium y Schistosoma casi duplicaron su frecuencia en el grupo de los participantes VIH negativos. En el continente, la proporción de participantes que presentaban estas parasitosis fue casi similar en los dos grupos y aparecieron asociados a personas con nivel socioeconómico bajo en el grupo de los VIH negativos. La frecuencia de infecciones debidas a Strongyloides se ha incrementado dramáticamente en los últimos años, desde el 0,8% de participantes que presentaron esta parasitosis, según el estudio de Roche y Benito, hasta el 8,8% en la Isla de Bioko y el 10,8% en el continente, según los resultados obtenidos en el presente trabajo. Para explicar este aumento, es necesario tener en cuenta que en el estudio de Roche y Benito no se incluyeron participantes VIH positivos, colectivo en el que el parásito aparece con más frecuencia. Cabe señalar que el cultivo de heces proporcionaría un mayor número de positivos para Strongyloides (Joshi et al., 2002), técnica que, como ya se ha comentado anteriormente, no se ha podido realizar por la falta de medios en el país de origen de los participantes en el estudio. La pobreza, la falta de acceso a agua potable, la falta de saneamiento ambiental, la exposición agrícola, el hacinamiento, la escasez de Discusión Técnicas Microscópicas 113 hábitos de higiene, el nivel educativo bajo y el estado inmunológico están bien descritos como factores de riesgo para la infección por helmintos de transmisión a través del suelo (Olsen et al., 2001; Dumba et al., 2008). Otro parásito cuya frecuencia ha sufrido marcadas diferencias en la última década es Schistosoma intercalatum/guineensis, que en los primeros estudios aparecía como causante de esquistosomosis endémica en la región continental (Simarro et al., 1991; Simarro et al., 1993; Jusot et al., 1997; Roche & Benito, 1999), lo que dio lugar a que se llevaran a cabo campañas de tratamiento poblacional para el control de la endemia. Lo sorprendente es que en la actualidad, la infección causada por este parásito se encuentra en la Isla de Bioko con una frecuencia elevada (10,9%) y afectando a personas que nunca han salido de ésta, por lo que se descarta que hayan adquirido la infección en otro lugar. Esto sugiere que la inmigración de personas desde la región continental o desde otros países vecinos, motivada fundamentalmente por el auge del petróleo ha introducido el parásito en la Isla. No obstante, la observación de las características morfológicas de los huevos no permite asegurar si la especie presente es S. intercalatum, S. guineensis, una mezcla de ambos o un híbrido (Figura DVD-1), por lo que serán necesarias investigaciones futuras donde se utilicen técnicas de biología molecular para clarificar esta cuestión. Figura DVD-1: Huevos de Schistosoma spp. En el grupo de participantes VIH negativos, la esquistosomosis se encuentra principalmente en niños con poca información higiénica, mientras que entre los pacientes VIH positivos, existió asociación entre parasitación por Schistosoma y el género, con una proporción mayor de mujeres parasitadas que de varones. En el contexto donde viven los participantes del estudio, son los niños y las mujeres los que más tiempo pasan en los ríos, ya que en ellos realizan las actividades de recogida de agua, lavado de vajilla y ropa así como de juego, en el caso de los niños (Figura DVD2). En la región continental, la frecuencia de la infección fue menor que la encontrada en la Isla de Bioko y similar en los dos grupos de participantes estudiados. En este caso, se observó asociación con el lugar de residencia, siendo mayor la frecuencia en el cinturón urbano, donde la vida se desarrolla principalmente en los ríos. En uno de los estudios realizados en la región continental en 1997, se concluyó que la sospecha de SIDA era un factor de riesgo importante en la adquisición de la esquistosomosis, encontrando también asociación entre la carga parasitaria y los síntomas (Jusot et al., 1997). Esto explicaría la ausencia de síntomas en el presente estudio, debido a la baja carga parasitaria observada en casi todos los casos. En el estudio de Jusot et al. citado se subraya además la ausencia de síntomas cuando el contacto con el parásito es continuo. La menor frecuencia de la infección en la región continental respecto a la insular se puede explicar debido al tratamiento en masa con prazicuantel que se llevó a cabo en la población de Bata y que logró reducir la infección en la población en un 98,9% (Simarro et al., 1991). Figura DVD-2: Río Borabecho, barrio Fishtown (Elá Nguema). Isla de Bioko. Discusión Técnicas Microscópicas 115 La frecuencia total de protozoos patógenos, así como de las diferentes especies consideradas de modo individual, ha sido mayor en la Isla de Bioko que en la Región Continental, con un 47,8% de participantes infectados en el primer caso frente al 39,6% en el segundo caso. Lo mismo ocurre con los protozoos no patógenos, la frecuencia fue mayor en la población de Bioko que en la del continente (35,2% y 33,9% de pacientes infectados, respectivamente). Este resultado se interpreta considerando que la mayor frecuencia de protozoos en Bioko es debida al hacinamiento en que vive la población de la ciudad de Malabo, sobre todo, en el cinturón urbano. En la Isla de Bioko, la proporción de participantes VIH negativos que presentaron protozoos patógenos (48,0%) fue similar que la de los participantes seropositivos (47,7%), al igual que los helmintos patógenos (62,3%) en los participantes VIH positivos y el 60,0% en los VIH negativos. En el continente, la frecuencia de helmintos patógenos fue mayor en los participantes VIH negativos, con una proporción de 71,7% parasitados, comparada con la de los VIH positivos infectados (58,2%). Lo mismo ha ocurrido para la frecuencia de protozoos patógenos el 46,7% de VIH negativos y el 38,1% de VIH positivos presentaban protozoos patógenos; en cambio, para los protozoos oportunistas la proporción ha sido ligeramente mayor en los participantes VIH positivos (34,4%) que en los VIH negativos (31,7%), este hecho puede ser debido, a la tendencia a retardar el TARV en los pacientes que lo necesitan en la UREI de Bata. Los estudios realizados en otros países africanos también describen una mayor proporción de helmintos intestinales que de protozoos en pacientes VIH positivos (Hailemariam et al., 2004). Este hecho no se ha podido demostrar en la región continental. La frecuencia de la infección por Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii observada en este estudio fue mayor (42,0% y 43,0% de los participantes VIH negativos y VIH positivos respectivamente) en la Isla de Bioko que la encontrada por Roche y Benito en 1999 (32,7%) y posteriormente por Fuentes et al., en 2007 (9,8%). En el grupo de participantes VIH negativos, se asoció con la edad y con el género y en el grupo de participantes VIH positivos con el lugar de residencia. También fue mayor que en los estudios anteriores la frecuencia encontrada en la región continental, ya que el 37,0% de los participantes VIH positivos y el 40,0% de los VIH negativos presentaron infección por Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, existiendo asociación entre infección y otros síntomas, niveles bajos de información higiénica y de formación académica, así como el no estar bajo TARV en el grupo de los VIH positivos. De igual manera, en este grupo, Entamoeba coli se asoció a otros síntomas. Una vez más, las altas tasas de infección observadas y las asociaciones encontradas, sugieren que la diseminación de la infección por Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii y por Entamoeba coli se encuentra relacionada con las deficientes condiciones sanitarias de la población. No obstante, y considerando la diferente patogenicidad de estas especies, resulta necesario utilizar técnicas de biología molecular para determinar la distribución de las especies de Entamoeba, diferenciando la patógena E. histolytica de especies no patógenas tales como E. dispar o la recientemente descrita E. moshkovskii y estudiar su posible relación con diarrea o con otros síntomas y con el estado inmunológico de los participantes. En el estudio que presentamos, Giardia duodenalis se detectó con frecuencias similares a las reportadas en los estudios de 1999 y 2007, en los pacientes VIH positivos (Roche & Benito, 1999; Fuentes et al., 2007), pero casi la frecuencia de este flagelado se duplica en el grupo de los participantes VIH negativos en la Isla de Bioko. En el continente, en el grupo de los VIH negativos casi se triplicaron los valores. En otros países africanos como Nigeria, Zambia y Tanzania, la proporción de infección por Entamoeba histolytica/dispar/moshkovskii, Giardia y Cryptosporidium fue mayor en pacientes VIH positivos (Hunter et al., 1992; Gómez-Morales et al., 1995; Babatunde et al., 2010). De acuerdo con varios autores, Giardia y Cryptosporidium son parásitos que preferentemente se encuentran en niños y en los países en desarrollo la criptosporidiosis es más prevalente en niños menores de 2 años de edad (ValentinerBranth et al., 2003; Mor & Tzipori, 2008; Xiao & Fayer, 2008; Xiao, 2010). Por lo tanto, el bajo número de niños en el grupo de participantes seropositivos, puede ser la causa de las diferencias en la proporción de infección que se da en la asociación entre Cryptosporidium y la edad en el grupo de pacientes VIH negativos de Bioko. Otros autores han publicado una relación entre el estado inmunológico y la infección por protozoos, y específicamente por Cryptosporidium (Ramana & Mohanty, 2009), que en nuestro caso no se ha confirmado. Estos autores ponen también de manifiesto los efectos de los ARV inhibidores de la proteasa del VIH sobre la infección por Discusión Técnicas Microscópicas 117 Cryptosporidium, que pueden llegar a modificar la epidemiología de estos protozoos intestinales y que a su vez, pueden ser componentes clave de la terapia en el estado de SIDA. No está muy claro si el efecto se debe a la reconstitución inmune o a efectos antiparasitarios de estos inhibidores (Cabada & White, 2010). Otros estudios señalan que este grupo de ARV, que en principio ayudan a la reducción de la carga viral y la recuperación de las células CD4+, permiten la recuperación clínica y la erradicación de la infección por Cryptosporidium (Maggi et al., 2000; Miao et al., 2000) y que son en la actualidad la terapia de elección para esta parasitosis pudiendo ser usados también como profilaxis (Cacciò & Pozio, 2006). La infección por Giardia se asoció con el género en el grupo de participantes VIH negativos del continente, siendo más frecuente en los varones. La asociación entre criptosporidiosis y el nivel socioeconómico en los pacientes VIH positivos de Bioko, nos lleva a pensar que un nivel adquisitivo bajo conduce a vivir en lugares donde las condiciones sanitarias son deficientes y esto favorece la adquisición de la infección. En el primer estudio llevado a cabo en la Isla de Bioko, (Roche & Benito, 1999) no se realizaron las técnicas necesarias para la detección de este protozoo, pero en 2009, Blanco et al., encontraron un 14,9% (7/47) de parasitación en una muestra de pacientes VIH positivos de Malabo y en Bata un 20,3% (28/138) (Blanco et al., 2009), valor superior al encontrado en nuestro estudio (9,2% en Malabo y 2,9% en Bata), aunque esta diferencia no es estadísticamente significativa posiblemente, debido a la diferencia en el tamaño de la muestra estudiada. El hecho de que se administre de forma regular cotrimoxazol a las personas VHI positivas puede justificar la ausencia de Isospora spp. y Cyclospora spp. Blastocystis hominis, cuya patogenicidad se encuentra en entredicho, y los claramente no patógenos Chilomastix, E. nana, Entamoeba coli, E. hartmanni e I. bütschlii fueron identificados también en el estudio de Roche & Benito (1999), aunque en una proporción mucho menor a la encontrada en nuestro estudio. En el continente, estos parásitos se asociaron al TARV, siendo su frecuencia mayor y significativa en los pacientes que no estaban bajo TARV. Pentatrichomonas se asoció con diarrea. Aunque estos parásitos no sean patógenos, es importante determinar su proporción, ya que puede ser un buen indicador de referencia de las condiciones higiénicas de la población, de la calidad del agua de uso doméstico, del tratamiento de los alimentos, etc. Esto nos lleva a subrayar la importancia de potenciar las actividades encaminadas a la educación para la salud en la población en general y en particular en las PVVIH. Se encontró una asociación entre la infección por Trichuris y Ascaris, Entamoeba spp. y Blastocystis, así como Entamoeba spp. y Giardia en el grupo de participantes VIH positivos de las dos regiones. En el grupo de participantes VIH negativos de Bioko se dio la asociación con Cryptosporidium spp. y entre Trichuris con Ascaris y Entamoeba spp. y entre Giardia y Entamoeba spp. entre otras. Estas asociaciones sugieren una participación importante de la ruta hídrica en la transmisión de las enfermedades parasitarias intestinales. Este hecho quedó confirmado cuando los datos de las personas VIH positivas y VIH negativas que convivían en el mismo hogar, mostraron que las infecciones por Ascaris, Schistosoma y Uncinarias, no se asociaron con la coinfección por el VIH en Bioko. Lo mismo sucedió con las infecciones por Ascaris, Trichuris y Schistosoma en el continente, siendo el porcentaje de parasitismo más alto en personas VIH negativas. Estos resultados sugieren que la infección parasitaria intestinal podría estar relacionada con otros factores como las diferencias en las actividades que desempeñan la mujer y el varón, o un adulto y los niños. Además, debe tenerse en cuenta que la correlación entre la disminución de las tasas de excreción de huevos de Schistosoma y los niveles bajos de las células T-CD4+ ha sido puesta de manifiesto (Harms & Feldmeier, 2002). Este es un hecho que dificulta el diagnóstico de la esquistosomosis. En nuestro caso se encontró una concentración baja de huevos de Schistosoma tanto en el grupo de participantes VIH positivos y como en el de VHI negativos. Cuando se han comparado los resultados obtenidos para las personas VIH positivas y VIH negativas que residían en la misma casa, se ha encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la infección por el VIH y la infección por Entamoeba spp. y Giardia duodenalis; por la que las personas VIH positivas tienen mayor riesgo de adquirir infecciones parasitarias por Entamoeba spp. Giardia duodenalis, Trichuris, Entamoeba coli, Blastocystis, Pentatrichomonas spp y Cryptosporidium, siendo este riesgo significativamente mayor que en las personas VIH negativas en la Isla de Bioko. Sin embargo, en el continente la asociación fue significativa entre la infección por el VIH y la infección por Entamoeba spp, E. nana y Blastocystis. Las personas VIH positivas tienen mayor riesgo de adquirir infecciones parasitarias por Entamoeba spp. Blastocystis, E. nana, Uncinaria y Cryptosporidium Conclusiones Generales 221 Para terminar, esta investigación constituye el estudio más extenso realizado en Guinea Ecuatorial sobre parásitos intestinales en la población VIH-positiva, así como el primer estudio que se lleva a cabo en Guinea Ecuatorial sobre la distribución de especies de E. histolytica/dispar/moshkovskii y que incluye la primera descripción de E. moshkovskii, tanto en el país como en la subregión del África Central. También se describen por primera vez los genotipos circulantes de Giardia duodenalis y se realiza la primera descripción en humanos de Cryptosporidium suis en el país. CAPÍTULO 9: BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 227 17. BIBLIOGRAFÍA Adam RD. 1991. The biology of Giardia spp. Microbiol Rev. 55 (4): 706-32. Aldana E, Goñi P, Clavel A, Cancinos de Orantes B, Buera L. 2011. Identificación de genotipos de Giardia duodenalis en niños del área urbana de Guatemala. Rev. IberoLatinoam. Parasitol. 70 (1): 25-28. Ali IK, Clark CG, Petri WA Jr. 2008. Molecular epidemiology of amebiasis. Infect Genet Evol. 8 (5): 698-707. Ali IK, Hossain MB, Roy S, Ayeh-Kumi PF, Petri WA Jr, Haque R, Clark CG. 2003. Entamoeba moshkovskii infections in children, Bangladesh. Emerg Infect Dis; 9: 580584. Ali IK, Zaki M, Clark CG. 2005. Use of PCR amplification of tRNA gene-linked short tandem repeats for genotyping Entamoeba histolytica. J Clin Microbiol. 43 (12): 58427. Alves M, Xiao L, Sulaiman I, Lal AA, Matos O, Antunes F. 2003. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6): 2744-7. Amar CF, Dear PH, Pedraza-Díaz S, Looker N, Linnane E, McLauchlin J. 2002. Sensitive PCR-restriction fragment length polymorphism assay for detection and genotyping of Giardia duodenalis in human feces. J Clin Microbiol. 40 (2): 446-52. Anonymous. 1997. Amoebiasis. Wkly Epidemiol Rec. 72:97-99. Arendt V y col. 2007. AMATA study: effectiveness of antiretroviral therapy in breastfeeding mothers to prevent post-natal vertical transmission in Rwanda. Fourth International AIDS Society Conference, Sydney, Australia, 22-25 july. Ash LR y Orihel TC. 2010. Atlas de parasitología humana. 5ª edición. Editorial Médica Panamericana. S.A. Pág. 197-203, 217-226. Assefa S, Erko B, Medhin G, Assefa Z, Shimelis T. 2009. Intestinal parasitic infections in relation to HIV/AIDS status, diarrhea and CD4 T-cell count. BMC Infect Dis. 18; 9: 155. Awasthi S, Bundy DA, Savioli L. 2003. Helminthic infections. BMJ. 23; 327 (7412): 431-3. Awole M, Gebre-Selassie S, Kassa T, Kibru G. 2003. Prevalence of intestinal parasites in HIV-Infected adult patients in southwestern Ethiopia. Ethiop J Health. 17: 71-8. Ayed SB, Aoun K, Maamouri N, Abdallah RB, Bouratbine A. 2008. First molecular identification of Entamoeba moshkovskii in human stool samples in Tunisia. Am J. Trop Med Hyg. 79 (5): 706-7. Babatunde SK, Salami AK, Fabiyi JP, Agbede OO, Desalu OO. 2010. Prevalence of intestinal parasitic infestation in HIV seropositive and seronegative patients in Ilorin, Nigeria. Ann Afr Med . 9 (3): 123-8. Barta J and R Thompson. 2006. What is Cryptosporidium? Reappraising its biology and phylogenetic affinities. Trends Parasitol. 22 (10): 463-468. Baruch AC, Isaac-Renton J, Adam RD. 1996. The molecular epidemiology of Giardia lamblia: a sequence-based approach. J Infect Dis. 174: 233–6. Beck DL, Doğan N, Maro V, Sam NE, Shao J, Houpt ER. 2008. High prevalence of Entamoeba moshkovskii in a Tanzanian HIV population. Acta Trop. 107 (1): 48-9. Bergquist R, Johansen MV, Utzinger J. 2009. Diagnostic dilemmas in helminthology: what tools to use and when? Trends Parasitol; 25: 151–156. Blanco, MA., Iborra, A., Vargas, A., Nsie, E., Mbá, L., Fuentes, I. 2009. Molecular characterization of Cryptosporidium isolates from humans in Equatorial Guinea. Trans R Soc Trop Med Hyg. 103 (12): 1282-4. Borowski H, Clode P and R Thompson. 2008. Active invasion and/or encapsulation? A reappraisal of host-cell parasitism by Cryptosporidium. Trends Parasitol. 24 (11): 50916. Brooker S, Clements AC, Bundy DA. 2006. Global epidemiology, ecology and control of soil-transmitted helminth infections. Adv Parasitol. 62: 221-61. Cabada MM, White AC Jr. 2010. Treatment of cryptosporidiosis: do we know what we think we know? Curr Opin Infect Dis. 23 (5): 494-9. Caccio SM, De Giacomo M, Pozio E. 2002. Sequence analysis of the beta-giardin gene and development of a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human faecal samples. Int J Parasitol. 32: 1023–1030. Cacciò SM, Pozio E. 2006. Advances in the epidemiology, diagnosis and treatment of cryptosporidiosis. Expert Rev Anti Infect Ther. 4 (3): 429-43. Cacciò SM. 2005. Molecular epidemiology of human cryptosporidiosis. Parassitologia. 47 (2): 185-92. CDC. Consultada 25-junio-2012. Disponible en: http://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2012/chapter-3-infectious-diseases-related-totravel/strongyloidiasis.htm Cama V, Gilman RH, Vivar A, Ticona E, Ortega Y, Bern C, Xiao L. 2006. Mixed Cryptosporidium infections and HIV. Emerg Infect Dis. 12 (6): 1025-8. Cama VA, Ross JM, Crawford S, Kawai V, Chavez-Valdez R, Vargas D, Vivar A, Ticona E, Navincopa M, Williamson J, Ortega Y, Gilman RH, Bern C, Xiao L. 2007. Differences in clinical manifestations among Cryptosporidium species and subtypes in HIV-infected persons. J Infect Dis. 1; 196 (5): 684-91. Bibliografía 229 Caputo C, Forbes A, Frost F, Sinclair MI, Kunde TR, Hoy JF, Fairley CK. 1999. Determinants of antibodies to Cryptosporidium infection among gay and bisexual men with HIV infection. Epidemiol. Infect. 122: 291297. Certad G, Arenas-Pinto A, Pocaterra L, Ferrara G, Castro J, Bello A, Nuñez L. 2003. Isosporiasis in Venezuelan adults infected with human immunodeficiency virus: Clinical characterization. Am Trop Med Hyg. 69: 217222. Chacín-Bonilla L, Panunzio AP, Monsalve-Castillo FM, Parra-Cepeda IE, Martínez R. 2006. Microsporidiosis in Venezuela: Prevalence of intestinal microsporidiosis and its contribution to diarrhea in a group of Human Immunodeficiency Virus-infected patients from Zulia State. Am. J. Trop. Med. Hyg. 74: 482-486. Chacín-Bonilla L, Cheng-NG R. 2008. Criptosporidiosis en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana. INCI. vol.33, no.10, p.708-716. ISSN 0378-1844. Chacin-Bonilla L. 2010. Amibiasis: Implicaciones del reconocimiento de Entamoeba dispar e identificación de Entamoeba moshkovskii en humanos. Invest. Clín. vol. 51, no.2, p.239-256. ISSN 0535-5133. Chalmers RM, Campbell B, Crouch N, Charlett A, Davies A. 2011. Comparison of the diagnostic sensitivity and specificity of seven Cryptosporidium assays used in the United Kingdom. J Med Microbiol. doi: 10.1099/jmm0.034181.0. Chalmers R, Jackson C, Elwin K, Hadfield S, Hunter P. 2007. Investigation of genetic variation with in Cryptosporidium hominis for epidemiological purposes. DWI 70/2/199 (851). Consultada 22-junio-2012. Disponible en: http://dwi.defra.gov.uk/research/completed-research/reports/0851.pdf Chalmers RM, Robinson G, Elwin K, Hadfield SJ, Xiao L, Ryan U, Modha D, Mallaghan C. 2009. Cryptosporidium sp. rabbit genotype, a newly identified human pathogen. Emerg Infect Dis. 15 (5): 829-30. Chitsulo L, Engels D, Montresor A, Savioli L. 2000. The global status of schistosomiasis and its control. Acta Trop. 23; 77 (1): 41-51. Cieloszyk J, Goñi P, García A, Remacha MA, Sánchez E, Clavel A. 2012. Two cases of zoonotical cryptosporidiosis in Spain by the unusual species Cryptosporidium ubiquitum and Cryptosporidium felis. Enf. Infecc. Microbiol. Clin. Jun 22. [Epub ahead of print]. Clark CG, Diamond LS. 1991. The Laredo strain and other Entamoeba histolytica-like amoebae are Entamoeba moshkovskii. Mol Biochem Parasitol. 46: 11-18. Clavel A, Arnal AC, Sánchez EC, Ramírez de Ocariz I, Varea M, Castillo FJ & Quilez J. 1994. Morphological and staining alterations of Cryptosporidium oocysts contained in 10 % formalin-preserved faeces. Research and Reviews in Parasitology, 54 (4): 273275. Clavel A, Doiz O, Morales S, Varea M, Seral C, Castillo FJ, Fleta J, Rubio C, GómezLus R. 2002. House fly (Musca domestica) as a transport vector of Cryptosporidium parvum. Folia Parasitol (Praha). 49 (2): 163-4. Crompton DW. 1999. How much human helminthiasis is there in the world? J Parasitol. 85 (3): 397-403. Current W and C Reese. 1986. A comparison of endogenous development of three isolates of Cryptosporidium in suckling mice. J Protozool. 33 (1): 98-108. Current W and L Garcia. 1991. Cryptosporidiosis. Clin Microbiol Rev. 4 (3): 325-58. Damen JG, Luka J, Biwan EI, Lugos M. 2011. Prevalence of Intestinal Parasites among Pupils in Rural North Eastern, Nigeria. Niger Med J. 52 (1): 4–6. De la Parte-Pérez M, Brito A. 2004. Frecuencia de Cryptosporidium en pacientes adultos con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y diarrea. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 24: 4-12. De Silva NR, Brooker S, Hotez PJ, Montresor A, Engels D, Savioli L. 2003. Soiltransmitted helminth infections: updating the global picture. Trends Parasitol. 19 (12): 547-51. DeHovitz JA, Pape JW, Boncy M, Johnson WD Jr. 1986. Clinical manifestations and therapy of Isospora belli infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome. New Engl. J. Med. 315: 87-90. Diamond LS, Clark CG. 1993. A redescription of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 separating it from Entamoeba dispar Brumpt, 1925. J Eukaryot Microbiol; 40: 340-344. Doiz O, Clavel A, Morales S, Varea M, Castillo FJ, Rubio C, Gómez-Lus R. 2000. House fly (Musca domestica) as a transport vector of Giardia lamblia. Folia Parasitol (Praha). 47 (4): 330-1. Dumba R, Kaddu JB, Wabwire Mangen F. 2008. Intestinal helminths in Luweero district, Uganda. Afr Health Sci. 8: 90–96. Egger M, May M, Chene G, et al. 2002. Prognosis of HIV-1-infected patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies. Lancet. 360 (9327): 119-129. Ekdahl K, Andersson Y. 2005. Imported giardiasis: impact of international travel, immigration, and adoption. Am J Trop Med Hyg. 72 (6): 825-30. el-Shewy K, Kilani RT, Hegazi MM, Makhlouf LM, Wenman WM. 1994. Identification of low-molecular-mass coproantigens of Cryptosporidium parvum. J Infect Dis. 169 (2): 460-3. Equatorial Guinea. Factsheets of health statistics. 2010. WHO Regional Office in África. Consultada 4-mayo-2012. Disponible en: www.afro.who.int. Ethelberg S, Lisby M, Vestergaard L, Enemark H, Olsen K, Stensvold C, Nielsen H, Porsbo L, Plesner A and K Mølbak. 2009. A foodborne outbreak of Cryptosporidium hominis infection. Epidemiol Infect. 137 (3): 348-56. Bibliografía 237 Paglia MG, Visca P. 2004. An improved PCR-based method for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in formalin-fixed stools. Acta Trop. 92 (3): 273-7. Pangasa A, Jex AR, Nolan MJ, Campbell BE, Haydon SR, Stevens MA, Gasser RB. 2010. Highly sensitive non-isotopic restriction endonuclease fingerprinting of nucleotide variability in the gp60 gene within Cryptosporidium species, genotypes and subgenotypes infective to humans, and its implications. Electrophoresis. 31 (10): 163747. Parija SC, Khairnar K. 2005. Entamoeba moshkovskii and Entamoeba dispar-associated infections in pondicherry, India. J Health Popul Nutr. 23 (3): 292-5. Pedersen C, Danner S, Lazzarin A, Glauser MP, Weber R, Katlama C, Barton SE, Lundgren JD. 1996. Epidemiology of cryptosporidiosis among European AIDS patients. Genitourin. Med. 72: 128-131. Pieniazek NJ, Bornay-Llinares FJ, Slemenda SB, da Silva AJ, Moura IN, Arrowood MJ, Ditrich O, Addiss DG. 1999. New Cryptosporidium genotypes in HIV infected persons. Emerg. Infect. Dis. 5: 444-449. Pönka A, Kotilainen H, Rimhanen-Finne R, Hokkanen P, Hänninen M, Kaarna A, Meri T and M Kuusi. 2009. A foodborne outbreak due to Cryptosporidium parvum in Helsinki. Eurosurvillance. 14 (28): 13. Pritt BS, Clark CG. 2008. Amebiasis. Mayo Clin Proc. 83 (10): 1154-9; quiz 1159-60. Protocolo de diagnóstico y seguimiento por laboratorio del VIH/SIDA en Guinea Ecuatorial. 2009. MINSABS. Protozoan parasites (Cryptosporidium, Giardia, Cyclospora). Guidelines for drinkingwater quality. WHO. Disponible en: http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/en/admicrob5.pdf Proyecto de Reforzamiento de las capacidades y competencias nacionales de gestión de las actividades y servicios integrados de lucha contra el VIH/SIDA. Annual Report, January to December 2008. Global Fund HIV Grant GNQ-405-G01H. Equatorial Guinea. R. Salvatella y C. Eirale. 1996. Examen coproparasitario. Metodología y empleo. Revisión técnico metodológica. Rev. Med. Uruguay; 12: 215-223. Rabbani GH, Islam A. 1994. Giardiasis in humans: populations most at risk and prospects for control. In: Thompson RCA, Reynoldson JA, Lymbery AJ, eds. Giardia: from molecules to disease. Wallingford, England, CAB International. 217–249. Ramana KV, Mohanty SK. 2009. Opportunistic intestinal parasites and TCD4+ cell counts in human immunodeficiency virus seropositive patients. J Med Microbiol. 58 (Pt 12): 1664-6. Read C, Walters J, Robertson ID, Thompson RC. 2002. Correlation between genotype of Giardia duodenalis and diarrhoea. Int J Parasitol. 32 (2): 229-31. Registro de secuencias. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Rendtorff RC, Holt CJ. 1954. The experimental transmission of human intestinal protozoan parasites. III. Attempts to transmit Endamoeba coli and Giardia lamblia cysts by flies. Am J Hyg. 60 (3): 320-6. Rendtorff RC. 1954. The experimental transmission of human intestinal protozoan parasites. II. Giardia lamblia cysts given in capsules. Am J Hyg. 59 (2): 209-20. Robinson G, Elwin K, Chalmers RM. 2008. Unusual Cryptosporidium genotypes in human cases of diarrhea. Emerg Infect Dis. 14 (11): 1800-2. Robinson RD, Lindon JF, Neva FA. 1990. Interaction between HTLV-I and S. stercoralis infection resulting lower IGE levels in Jamaica. W Ind Med J. 39:35-7. Roche J, Benito A. 1999. Prevalence of intestinal parasite infections with special reference to Entamoeba histolytica on the island of Bioko (Equatorial Guinea). Am J Trop Med Hyg. 60 (2): 257-62. Sahagún J, Clavel A, Goñi P, Seral C, Llorente MT, Castillo FJ, Capilla S, Arias A, Gómez-Lus R. 2008. Correlation between the presence of symptoms and the Giardia duodenalis genotype. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 27 (1): 81-3. Samie A, Obi LC, Bessong PO, Stroup S, Houpt E, Guerrant RL. 2006. Prevalence and species distribution of E. Histolytica and E. Dispar in the Venda region, Limpopo, South Africa. Am J Trop Med Hyg. 75 (3): 565-71. Sanyaolu AO, Oyibo WA, Fagbenro-Beyioku AF, Gbadegeshin AH, Iriemenam NC. 2011. Comparative study of entero-parasitic infections among HIV sero-positive and sero-negative patients in Lagos, Nigeria. Acta Trop. 120 (3): 268-72. Sarfati C, Bourgeois A, Menotti J, Liegeois F, Moyou-Somo R, Delaporte E, Derouin F, Ngole EM, Molina JM. 2006. Prevalence of intestinal parasites including microsporidia in human immunodeficiency virus-infected adults in Cameroon: a cross-sectional study. Am J Trop Med Hyg. 74 (1): 162-4. Savioli L, Smith H, Thompson A. 2006. Giardia and Cryptosporidium join the 'Neglected Diseases Initiative'. Trends Parasitol. 22 (5): 203-8. Scaglia M, Gatti S, Strosselli M, Grazioli V, Villa MR. 1983. Entamoeba moshkovskii (Tshalaia, 1941): morpho-biological characterization of new strains isolated from the environment, and a review of the literature. Ann Parasitol Hum Comp. 58:413-422. Scowden EB, Schaffner W, Stone WJ. 1978. Overwhelming strongyloidiasis: an unappreciated opportunistic infection. Medicine (Baltimore). 57 (6): 527-44. Segarra-Newnham M. 2007. Manifestations, diagnosis, and treatment of Strongyloides stercoralis infection. Ann Pharmacother. 41: 1992–2001. Siddiqui U, Bini EJ, Chandarana K, Leong J, Ramsetty S, Schiliro D, Poles M. 2007. Prevalence and impact of diarrhea on health-related quality of life in HIV-infected Bibliografía 239 patients in the era of highly active antiretroviral therapy. J Clin Gastroenterol. 41: 48490. Simarro PP, Ndong P, Mir M, Nguem E. 1993. Urban schistosomiasis in Equatorial Guinea. Res Rev Parasitol. 53: 93–95. Simarro PP, Sima FO, Mir M, Ndong P. 1991. Effect of repeated targeted mass treatment with praziquantel on the prevalence, intensity of infection and morbidity due to Schistosoma intercalatum in an urban community in Equatorial Guinea. Trop Med Parasitol. 42 (3): 167-71. Singh A, Houpt E, Petri WA. 2009. Rapid Diagnosis of Intestinal Parasitic Protozoa, with a Focus on Entamoeba histolytica. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2009:547090. Epub 2009 Jun 25. PubMed PMID: 19584941; PubMed Central PMCID: PMC2703877. Singh S. 2002. Human strongyloidiasis in AIDS era: its zoonotic importance. J Assoc Physicians India. 50:415-22. Siwila J, Phiri I, Vercruysse J, Goma F, Gabriel S, Claerebout E and T Geurden. 2007. Asymptomatic cryptosporidiosis in Zambian dairy farm workers and their household members. Trans R Soc Trop Med Hyg. 101: 733-4. Smith HV, Cacciò SM, Tait A, McLauchlin J, Thompson RC. 2006. Tools for investigating the environmental transmission of Cryptosporidium and Giardia infections in humans. Trends Parasitol. 22 (4): 160-7. Smith R, Chalmers R, Elwin K, Clifton-Hadley F, Mueller-Doblies D, Watkins J, Paiba G and M Giles. 2009. Investigation of the role of companion animals in the zoonotic transmission of cryptosporidiosis. Zoonoses Public Health. 56 (1): 24-3. Smith, H.V., Grimason, A.M., 2003. Giardia and Cryptosporidium in water and wastewater. In: Mara, D., Horan, N. (Eds.), The Handbook of Water and Wastewater Microbiology. Elsevier Science Limited, Oxford, UK, pp. 619–781. Soliman RH, Fuentes I, Rubio JM. 2011. Identification of a novel Assemblage B subgenotype and a zoonotic Assemblage C in human isolates of Giardia intestinalis in Egypt. Parasitol Int. 60 (4): 507-11. Sorvillo FJ, Lieb LE, Kerndt PR, Ash LR. 1994. Epidemiology of cryptosporidiosis among persons with acquired immunodeficiency syndrome in Los Angeles County. Am. J. Trop. Med. Hyg. 51: 326-331. Spano F, Putignani L, Crisanti A, Sallicandro P, Morgan U, Le Blancq S, Tchack L, Tzipori S and G Widmer. 1998. Multilocus genotypic analysis of Cryptosporidium parvum isolates from different hosts and geographical origins. J Clin Microbiol. 36 (11): 3255-9. Stanley SL Jr. 2003. Amoebiasis. Lancet. 22; 361 (9362): 1025-34. Steinmann P, Keiser J, Bos R, Tanner M, Utzinger J. 2006. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6 (7): 411-25. Strong WB, Gut J, Nelson RG. 2000. Cloning and sequence analysis of a highly polymorphic Cryptosporidium parvum gene encoding a 60-kilodalton glycoprotein and characterization of its 15and 45-kilodalton zoite surface antigen products. Infect Immun. 68 (7): 4117-34. Sulaiman IM, Fayer R, Bern C, Gilman RH, Trout JM, Schantz PM, Das P, Lal AA, Xiao L. 2003. Triosephosphate isomerase gene characterization and potential zoonotic transmission of Giardia duodenalis. Emerg Infect Dis. 9 (11): 1444-52. Sulaiman IM, Hira PR, Zhou L, Al-Ali FM, Al-Shelahi FA, Shweiki HM, Iqbal J, Khalid N, Xiao L. 2005. Unique endemicity of cryptosporidiosis in children in Kuwait. J Clin Microbiol. 43 (6): 2805-9. Sun T. 1988. Opportunistic parasitic infections in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Pathol Annu. 23 Pt 2:1-32. Tannich E, Burchard GD. 1991. Differentiation of pathogenic from non-pathogenic Entamoeba histolytica by restriction fragment analysis of a single gene amplified in vitro. J Clin Microbiol. 29:250-255. Tanyuksel M, Petri WA Jr. 2003. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clin Microbiol Rev. 16 (4): 713-29. Tanyuksel M, Ulukanligil M, Guclu Z, Araz E, Koru O, Petri W A Jr. 2007. Two cases of rarely recognized infection with Entamoeba moshkovskii. Am J Trop Med Hyg. 76:723-724. Thompson JE Jr, Freischlag J, Thomas DS. 1983. Amebic liver abscess in a homosexual man. Sex Transm Dis. 10 (3): 153-5. Thompson RC, Hopkins RM, Homan WL. 2000. Nomenclature and genetic groupings of Giardia infecting mammals. Parasitol Today. 16 (5): 210-3. Thompson RC. 2000. Giardiasis as a re-emerging infectious disease and its zoonotic potential. Int J Parasitol. 30 (12-13): 1259-67. Thompson RC. 2004. The zoonotic significance and molecular epidemiology of Giardia and giardiasis. Vet Parasitol. 9; 126 (1-2): 15-35. Traub RJ, Monis PT, Robertson I, Irwin P, Mencke N, Thompson RC. 2004. Epidemiological and molecular evidence supports the zoonotic transmission of Giardia among humans and dogs living in the same community. Parasitology. 128 (Pt 3): 25362. Tshalaia LE. 1941. On a species of Entamoeba detected in sewage effluents. Med Parazit (Moscow). 10: 244-252. UN DESA. Word Population Prospects: The 2008 Revision. Department for Economics and Social Affairs. Consultada 5-mayo-2012. Disponible en: http://www.un.org/esa/population/publications/wpp2008/wpp2008_highlights.pdf. Bibliografía 241 UNAIDS. 2009 Report on the global AIDS epidemic. Consultada 20-abril-2012. Disponible en: http://www.unaids.org/documents/20101123_GlobalReport_em.pdf. Ungar BL. 1990. Enzyme-linked immunoassay for detection of Cryptosporidium antigens in fecal specimens. J Clin Microbiol. 28 (11): 2491-5. Valderrama A, Hlavsa M, Cronquist A, Cosgrove S, Johnston S, Roberts J, Stock M, Xiao L, Xavier K and M Beach. 2009. Multiple risk factors associated with a large statewide increase in cryptosporidiosis. Epidemiol Infect. 137 (12): 1781-8. Valentiner-Branth P, Steinsland H, Fischer TK, et al. 2003. Cohort study of Guinean children: incidence, pathogenicity, conferred protection, and attributable risk for enteropathogens during the first 2 years of life. J Clin Microbiol. 41:4238–45. Vreden SG, Visser LG, Verweij JJ, Blotkamp J, Stuiver PC, Aguirre A, Polderman AM. 2000. Outbreak of amebiasis in a family in The Netherlands. Clin Infect Dis. 31 (4): 1101-4. Walsh JA. 1986. Problems in recognition and diagnosis of amebiasis: estimation of the global magnitude of morbidity and mortality. Rev Infect Dis. 8:228-238. Webster BL, Southgate VR, Littlewood DT. 2006. A revision of the interrelationships of Schistosoma including the recently described Schistosoma guineensis. Int J Parasitol. 36 (8): 947-55. WHO /CDS /IPI /92.2. WHO/PAHO. 1991. Informal consultation on intestinal protozoal infections, Mexico. WHO Antiretroviral drugs for treating pregnant women and preventing HIV infection in infant: toward universal access. 2006. World Health Organization. Geneva WHO. Towards Universal Access Progress Report 2008-2009. 2010. WHO guidance. Consultada 20-abril-2012. Disponible en: http://www.who.int/hiv/mediacentre/en/index.ht. World Health Organization, 2006. Preventive Chemotherapy in Human Helminthiasis: Coordinated Use of Anthelminthic Drugs in Control Interventions: A Manual for Health Professionals and Programme Managers. World Health Organization Press, Geneva. Disponible en: http://whqlibdoc.who.int/publications/2006/9241547103_eng.pdf. World Health Organization. Department of Measurement and Health Information. February 2009. Consultada 4-mayo-2012. Disponible en: http://apps.who.int/ghodata/?vid=720 . Wu Z, Nagano I, Boonmars T, Nakada T, Takahashi Y. 2003. Intraspecies polymorphism of Cryptosporidium parvum revealed by PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) and RFLP-single-strand conformational polymorphism analyses. Appl Environ Microbiol. 69 (8): 4720-6. Xiao L and U Ryan. 2008. Molecular Epidemiology. In: R Fayer and L Xiao (Eds.), Cryptosporidium and cryptosporidiosis. CRC Press and IWA Publishing, Boca Raton. FL. Pp. 119-69 Xiao L, Escalante L, Yang C, Sulaiman I, Escalante AA, Montali RJ, Fayer R, Lal AA. 1999. Phylogenetic analysis of Cryptosporidium parasites based on the small-subunit rRNA gene locus. Appl Environ Microbiol. 65 (4): 1578-83. Xiao L, Fayer R. 2008. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. International Journal for Parasitology. 38 (11): 1239-1255. Xiao L, Limor J, Bern C, Lal AA. 2001. Epidemic Working Group. Tracking Cryptosporidium parvum by sequence analysis of small double-stranded RNA. Emerg Infect Dis. 7 (1): 141-5. Xiao L, Morgan UM, Fayer R, Thompson RCA, Lal AA. 2000. Cryptosporidium systematics and implications for public health. Parasitol. Today. 16: 287-292. Xiao L. 2010. Molecular epidemiology of cryptosporidiosis: an update. Exp Parasitol. 124 (1): 80-9. Zulu I, Veitch A, Sianongo S, McPhail G, Feakins R, Farthing MJ, Kelly P. 2002. Albendazole chemotherapy for AIDS-related diarrhoea in Zambia--clinical, parasitological and mucosal responses. Aliment Pharmacol Ther. 16 (3): 595-601. CAPÍTULO 10: ANEXOS ANEXOS Anexos 253 Anexo 6. Consentimiento informado y firmado. Fotos. Anexo 7. MINSABS. Dirección General de Coordinación Multisectorial de lucha contra el VIH/SIDA. Anexos 255 Anexo 8. MINSABS. Secretario General. Anexo 9. MINSABS. Ministro de Estado. Anexos 257 Anexo 10. OMS. EQG/MMB/09-566. Anexo 11. OMS. EQG/MMB/10-679. Anexos 259 Anexo 12. Publicación. Roka M, et al. Prevalence of intestinal parasites in HIV-positive patients on the island of Bioko, Equatorial Guinea: Its relation to sanitary conditions and socioeconomic factors. Sci Total Environ (2012), doi:10.1016/j.scitotenv.2012.06.023