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2012 60 Tania Pérez Sánchez Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Departamento Director/es Patología Animal Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Tania Pérez Sánchez SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE CEPAS PROBIÓTICAS PARA LA PREVENCIÓN DE LA LACTOCOCOSIS EN LA TRUCHA ARCO IRIS (ONCORHYNCHUS MYKISS) Director/es Patología Animal Tesis Doctoral Autor 2011 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria Departamento de Patología Animal Unidad de Patología Infecciosa y Epidemiología Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Memoria presentada por Tania Pérez Sánchez Para optar al grado de Doctor julio 2011 Dr. IMANOL RUIZ ZARZUELA, Profesor Ayudante Doctor del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, y Dr. JOSÉ LUIS BALCÁZAR ROJAS, Investigador del Grupo de Microbiología del Institut Català de Recerca de l'Aigua, como Directores, C E R T I F I C A N : Que Dª. TANIA PÉREZ SÁNCHEZ ha realizado bajo nuestra dirección los trabajos correspondientes a su Tesis Doctoral titulada “Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)” que se ajusta con el Proyecto de Tesis presentado y cumple las condiciones exigidas para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, por lo que autorizan su presentación como compendio de publicaciones y con la mención “Doctor Europeo” para que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Y para que conste, firmamos el presente certificado En Zaragoza, a 21 de junio de 2011 Dr. I. Ruiz Zarzuela Dr. J.L. Balcázar Rojas Indice | I Índice I. Justificación 1 II. Introducción 3 I. Presentación de trabajos y justificación de unidad temática 3 II. Estado actual de la acuicultura 5 III. Lactococosis 7 IV. Probióticos 12 IV.1. Selección de cepas probióticas 14 IV.2. Mecanismos de acción de los probióticos 15 IV.2.1. Exclusión competitiva 15 IV.2.2. Optimización de la nutrición y la digestión 16 IV.2.3. Estimulación de la respuesta inmune 17 IV.3. Principales microorganismos probióticos utilizados en acuicultura 18 IV.3.1. Bacterias Gram positivas 19 IV.3.2. Bacterias Gram negativas 21 IV.3.2. Levaduras 22 III. Publicaciones 25 I. Fish & Fisheries (en revisión) 25 II. Mucosal Immunology, 2010 49 III. Journal of Fish Diseases, 2011 57 IV. Fish & Shellfish Immunology, 2011 69 V. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011 77 IV. Resumen general 95 I. Resumen 95 I.1. Resumen 95 I.2. Summary 96 II. Objetivos de los trabajos presentados 98 III. Metodología 100 III.1. Animales 100 III.2. Instalaciones 100 III.3. Aislamiento e identificación de cepas probióticas con efecto inhibitorio frente a Lactococcus garvieae en la trucha arco iris 101 III.4. Caracterización de las cepas probióticas seleccionadas con efecto inhibitorio frente a L. garvieae 102 II | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) II III.5. Evaluación de la supervivencia tras la administración de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris 105 III.6. Evaluación in vivo de la capacidad de colonización de las cepas bacterianas con potencial probiótico 105 III.7. Evaluación in vivo de la capacidad protectora de las cepas probióticas seleccionadas frente a L. garvieae 106 III.8. Identificación de una nueva subespecie, Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. 107 V. Conclusiones 109 I. Conclusiones 109 II. Conclusions 110 VI. Bibliografía 111 VII. Apéndices 121 I. Características de las revistas 121 II. Contribución del doctorando 123 Introducción| 7 III. Lactococosis Dentro de las patologías de origen bacteriano que afectan a los peces, cabe destacar la Lactococosis, cuyo agente etiológico es Lactococcus garvieae, enfermedad de gran relevancia que afecta a numerosas especies de peces tanto dulceacuícolas (trucha arco iris, tilapia, etc.) como marinas (seriola, múgil, etc.) y que causa importantes pérdidas económicas, de hecho constituye una de las patologías que mayor mortalidad produce en la cría intensiva de trucha arco iris. L. garvieae es una bacteria incluida dentro de la familia Streptococcaceae, género Lactococcus descrita por primera en Inglaterra a partir de un caso de mamitis en ganado vacuno (Collins y cols., 1983). También ha sido aislado, a partir de diferentes muestras procedentes del tracto urinario, sangre, y procesos neumónicos, en humanos, lo que ha sugerido por parte de algunos autores que pueda tratarse de un potencial agente zoonótico (Fefer y cols., 1998). Las primeras infecciones causadas por L. garvieae se describieron en Japón en el año 1958 (Hoshina y cols., 1958), y desde entonces se ha ido extendiendo paulatinamente por el resto del mundo, causando importantes pérdidas en el sector acuícola, debido a la mortalidad inducida (superior al 50%), la disminución de la tasa de crecimiento y la imposibilidad de comercializar los peces afectados (Vendrell y cols., 2006). En España, los primeros brotes de Lactococosis datan de finales de los años 80 en piscifactorías de trucha arco iris (Palacios y cols., 1993). Desde un punto de vista morfológico es un coco Gram positivo, inmóvil y se dispone generalmente formando parejas o cadenas cortas. En medio sólido las colonias son esféricas, de superficie lisa y coloración blanquecina. Puede crecer en un rango de temperaturas muy amplio, entre 4 y 45°C, siendo 37°C la temperatura óptima para el crecimiento de la bacteria (Vendrell y cols., 2006). Dicho crecimiento puede darse en medios con pH 9.6 y que contengan un 6.5% de NaCl, 40% de sales biliares y 0.1% de azul de metileno (Kusuda y cols., 1999). También se desarrolla en medios de cultivo Agar Infusión Cerebro Corazón (BHIA), Agar Tripticasa Soja (TSA) y Agar Sangre, entre otros. Según Cheng y Chen (1999), las condiciones óptimas de crecimiento para este patógeno son en medio Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHIB), a pH 7-8 y a una temperatura de 25-30°C. Los primeros signos clínicos de la enfermedad son anorexia, melanosis, letargia y natación errática. Externamente los peces enfermos presentan exoftalmia, que puede ser mono o bilateral, hemorragias periorbitales e intraoculares, en la base de las aletas, en la región perianal, en el opérculo y en la boca (Vendrell y cols., 2006). Debido a la extravasación de sangre que | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 8 provoca la bacteria, el endotelio vascular aparece lesionado, con la consiguiente aparición de hemorragias y petequias en la superficie de diversos órganos, principalmente en aquellos que están más irrigados, como la región perianal, bucal y aletas (Prieta y cols., 1993). Se han identificado diferentes tipos de toxinas, tanto intracomo extracelulares, capaces de producir sintomatología clínica al inocularlo en un hospedador susceptible (Kimura y Kusuda, 1982; Kusuda y Hamaguchi, 1989). Cuando se realiza la necropsia, se observa líquido ascítico, que puede ser purulento o hemorrágico, y los principales órganos afectados son bazo, hígado, cerebro, intestino, riñón y corazón (Pereira y cols., 2004; Austin y Austin, 1999; Afonso y cols., 2003). Los principales factores del medio acuático que condicionan la presentación del proceso son la temperatura y la calidad del agua. La temperatura del agua tiene una gran importancia en el desarrollo del proceso ya que éste presenta una clara estacionalidad. Está asociado a temperaturas altas del agua; por encima de 18ºC se desencadenan brotes agudos con elevadas tasas de mortalidad, aunque no hay que olvidar que la enfermedad se ha descrito igualmente con temperaturas de 14-15ºC (Prieta y cols., 1993; Ghittino y Múzquiz, 1998). Por otra parte, la evolución del proceso está favorecida por una mala calidad del agua, lo que se asocia a deficiencias en las condiciones higiénico sanitarias de la explotación (Ghittino y Múzquiz, 1998). La virulencia de la bacteria se acentúa cuando la calidad del agua es pobre y deficiente en oxígeno (Fukuda y cols., 1997a; Fukuda y cols., 1997b). Así mismo, una excesiva concentración de amonio incrementa la mortalidad (Hurvitz y cols., 1997). La trucha arco iris es la especie más susceptible y la que padece de forma más aguda y con mayores tasas de mortalidad esta enfermedad, afectando en la actualidad, de forma natural a animales de cualquier tamaño, desde juveniles a partir de 5 g hasta animales de más de 1 kg de peso (Chang y cols., 2002; Pereira y cols., 2004). La transmisión del agente y la aparición de brotes de Lactococosis en explotaciones donde nunca antes se habían producido indican que el microorganismo ha llegado del exterior a través de diferentes fuentes de infección, vías de entrada y mecanismos de transmisión (Vendrell y cols., 2006). La introducción de nuevos lotes de animales, huevos o gametos en una piscifactoría es la vía de entrada más frecuente para el agente. Los portadores asintomáticos son la principal fuente de infección, ya que aunque no padecen la enfermedad son portadores de la bacteria en su microbiota intestinal y la eliminan por las heces infectando al resto de la población sana, y de esta forma mantienen latente la infección Introducción| 9 desencadenando el proceso cuando las condiciones ambientales son óptimas para el agente (Ghittino y Múzquiz, 1998). La transmisión de la enfermedad se produce principalmente por mecanismos horizontales, señalándose la vía feco-oral como la forma más frecuente entre peces sanos y enfermos o portadores asintomáticos que eliminan el agente a través de las heces, o del mucus (Múzquiz y cols., 1999; Afonso y cols., 2003). Así mismo, también hay que considerar como posible vía de transmisión el pienso puesto que el agente ha sido descrito como parte de la microbiota intestinal de algunas especies ícticas, utilizadas como materia prima en la elaboración de piensos, que pueden infectar a los peces si los tratamientos térmicos son insuficientes (Minami, 1979; Yasunaga, 1982). Las medidas sanitarias son fundamentales para reducir la entrada de agentes patógenos a las instalaciones. Es importante un adecuado manejo de los animales y mantenimiento de las instalaciones. Disminuir al mínimo la manipulación de los peces, eliminar los peces muertos o enfermos, mantener densidades bajas de cultivo, una limpieza y desinfección periódica de los estanques y de todos los utensilios y aparejos de la piscifactoría, utilizando productos como el sulfato de cobre, formol, amonios cuaternarios, cloramina T, cloruro sódico, agua oxigenada o el permanganato potásico (de Kinkelin y cols., 1991; Romalde, 2004). Así mismo, el control de la alimentación mediante análisis químicos y microbiológicos es de gran importancia ya que L. garvieae ha sido detectado en harinas de pescado, siendo viable incluso después de seis meses de congelación (Yasunaga y cols., 1982). El control de la calidad microbiológica y las características físico-químicas del agua constituye otro factor que se debe considerar para evitar la proliferación de la enfermedad. Todos los peces o huevos que se introduzcan en las explotaciones deben estar libres del agente patógeno, para lo cual se deben exigir certificados sanitarios, además de llevar a cabo los correspondientes controles sanitarios y establecimiento de cuarentenas (De Kinkelin y cols., 1991; Romalde, 2004). El tratamiento de la Lactococosis está basado en la utilización de numerosos antibióticos como la doxiciclina, amoxicilina y eritromicina (Munday, 1994; Treves-Brown, 2000). Por otro lado, para el control de la enfermedad se han desarrollado algunas vacunas adyuvantadas mediante aceites minerales compuestos con distintos títulos de células bacterianas. Algunos autores como Ghittino (1999), observaron tras realizar distintas experiencias en condiciones de campo y/o de laboratorio que la inoculación IP con una dosis única de 0.1 mL, confería una protección completa a las 3 semanas post-vacunación | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 10 con las bacterianas y de 5 semanas con la utilización de vacunas oleosas, obteniendo una duración de inmunidad de 3-4 meses con las primeras, y de 4-5 con las segundas. En la actualidad las estrategias de vacunación para la prevención de la Lactococosis no han variado mucho y consisten en vacunar a los peces, con un peso mínimo de 50 g, por vía IP con una temperatura del agua entre 12 y 14ºC (Ghittino y Múzquiz, 1998). Sin embargo, debido fundamentalmente a las limitaciones actuales existentes en el uso de sustancias terapéuticas y la aparición de resistencias bacterianas, la Lactococosis resulta difícil de controlar. Estas restricciones han hecho que se busquen nuevas estrategias, que permitan mantener la producción y que aumente la resistencia a las patologías. En cuanto a las vacunas para el tratamiento de la Lactococosis, son eficaces cuando se realizan por inyección IP, pero esta vía de administración supone una serie de procedimientos perjudiciales para los peces derivados de una manipulación excesiva. En este contexto, la selección de bacterias probióticas se convierte en una alternativa sumamente interesante para la prevención de procesos bacterianos en general y de la Lactococosis en la trucha en particular, a través de diferentes mecanismos de acción tales como la producción de sustancias inhibitorias, la competición por nutrientes esenciales o sitios de adhesión, o la modulación de la respuesta inmune (Balcázar y cols., 2006; Merrifield y cols., 2010). Brunt y Austin (2005) observaron que tras la administración de Aeromonas sobria, aislada a partir de intestino de trucha arco iris, durante 14 días a una concentración de 5x107 g-1 de pienso, una disminución de la mortalidad en el grupo tratado del 70% con respecto al grupo control. Los resultados obtenidos mostraron una estimulación de la respuesta innata, mediante el incremento de leucocitos y la actividad respiratoria y fagocítica. Por otro lado, Lactobacillus plantarum CLFP 238 y Leuconostoc mesenteroides CLFP 196 fueron administradas durante 30 días a una concentración 107 UFC/g de pienso, observándose una reducción de la mortalidad producida por L. garvieae del 76% en el grupo control al 46% y 54%, respectivamente en los grupos tratados con las cepas probióticas señaladas. Durante los últimos años se han desarrollado numerosos inmunoestimulantes para su uso en acuicultura, se trata de compuestos naturales que modulan el sistema inmune incrementando la resistencia del hospedador frente a las enfermedades. Hasta el momento, se han realizado algunos estudios con peptidoglucanos para el control de la Lactococosis Introducción| 11 administrados por vía IP y oral, con la finalidad de inducir una protección de tipo innato frente a L. garvieae. Los resultados obtenidos demostraron una mayor protección en el grupo tratado con respecto al grupo control como consecuencia de una mayor actividad fagocítica y un incremento de la respuesta inmunitaria inespecífica (Itami y cols., 1996). | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 12 IV. Probióticos En los últimos años la acuicultura se ha convertido en una importante actividad económica en todo el mundo. El incremento en la productividad, así como su intensificación, ha venido acompañado por la incidencia de una amplia variedad de agentes patógenos, especialmente de origen bacteriano. Como ya hemos señalado anteriormente, los antibióticos han sido utilizados en gran parte no sólo para el tratamiento de infecciones bacterianas, sino también, en muchas ocasiones, para la prevención de las mismas, lo que ha supuesto la aparición de fenómenos de transferencia de resistencias bacterianas a otras bacterias acuáticas generalmente de vida saprófita, así como a otros patógenos animales y de origen humano y, el acumulo de residuos en los productos derivados de la acuicultura (Sharifuzzaman y Austin, 2009a). Además, en muchos países, sobre todo en aquellos en vías de desarrollo, el tratamiento con este tipo de moléculas ha supuesto un coste económico muy elevado (Harikrishnan y cols., 2010), suscitando el desarrollo de nuevas estrategias de control y prevención de enfermedades basadas fundamentalmente en el uso de vacunas, inmunoestimulantes y/o probióticos (Gatesoupe, 1999; Balcázar y cols., 2006). Se ha observado que los agentes terapéuticos son capaces de alterar la composición normal de la microbiota intestinal, cuyo papel como barrera de protección frente a la entrada de agentes patógenos es fundamental. Los probióticos son bacterias que forman parte de esta microbiota, y por tanto su presencia puede hacer que una alteración de la misma recupere su composición y estructura habitual. La composición de la microbiota endógena en los animales acuáticos tiene una mayor influencia en el estado de salud del individuo que en los animales terrestres, por lo tanto, la manipulación de dicha microbiota mediante la administración de niveles adecuados de probióticos desempeña un papel importante para el mantenimiento del equilibrio y desarrollo normal (Hansen y Olafsen, 1999). Las superficies mucosas del tracto gastrointestinal son el principal lugar en el que interactúan los agentes patógenos con la microbiota intestinal (Pérez y cols., 2010). Por tanto, la primera barrera de protección del hospedador es la capa de mucus que recubre el epitelio intestinal. Las células epiteliales ante la presencia de microorganismos patógenos son capaces de secretar sustancias antimicrobianas, como componentes del complemento, mucinas, enzimas, piscidinas y defensinas (Silphaduang y cols., 2006; Zou y cols., 2007) (Figura 1). Introducción| 13 Figura 1. La microbiota intestinal constituye una barrera de protección frente a los agentes patógenos al crear un ambiente hostil para los mismos. Los probióticos previenen las enfermedades bacterianas a través de una serie de mecanismos de acción, entre los que destacan, el desarrollo de un ambiente hostil para las bacterias patógenas, la producción de sustancias inhibitorias, la competición por nutrientes esenciales o sitios de adhesión, o la modulación de la respuesta inmune (Balcázar y cols., 2006; Merrifield y cols., 2010). El término probiótico, que deriva del vocablo latín pro (a favor de) y del griego bios (vida), se utilizó por primera vez para denominar a las sustancias producidas por algunos microorganismos capaces de favorecer el crecimiento de otros microorganismos (Lilly y Stillwell, 1965). De acuerdo a la Organización de Naciones Unidas y la Organización Mundial de la Salud, los probióticos se definen como microorganismos vivos que cuando se administran en las concentraciones adecuadas confieren un efecto beneficioso para el hospedador (FAO/WHO, 2001). Los efectos beneficiosos de los probióticos en los peces han sido ampliamente demostrados por numerosos autores (Balcázar y cols., 2006; Gatesoupe, 2007 Kesacordi-Watson y cols., 2008; Merrifield y cols., 2010), por lo que en la actualidad son varios los países que los están incluyendo en sus protocolos de cultivo, con el objetivo de mejorar el rendimiento económico en las explotaciones. Resulta importante señalar, que en acuicultura los efectos beneficiosos no se limitan al tracto gastrointestinal, sino que también pueden mejorar la | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 14 calidad del agua modificando la comunidad microbiana del agua y el sedimento (Verschuere y cols., 2000). Actualmente la utilización de bacterias probióticas está cobrando una gran importancia en el campo de la acuicultura, no sólo porque se ha observado una mejora sustancial en los índices de crecimiento, sino también, una mayor resistencia a las enfermedades, lo que conlleva mejores resultados en la producción (Nayak, 2010). IV.1. Selección de cepas probióticas La selección de cepas probióticas está condicionada por varios criterios que hay que considerar, entre los que destacan: el origen y la seguridad de la cepa bacteriana; la producción de sustancias antimicrobianas; la capacidad para modular la respuesta inmune en el hospedador o la competición con los agentes patógenos por los sitios de adhesión. Uno de los criterios más empleados para la selección de cepas probióticas es la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas, mediante la realización de pruebas in vitro en las que los productos extracelulares en medio líquido y/o sólido de las bacterias candidatas se enfrentan a los patógenos. Sin embargo, los resultados obtenidos durante el proceso de selección deben ser interpretados con precaución, ya que estudios previos han demostrado que las pruebas in vitro no pueden predecir el efecto que las cepas tendrán en el organismo del hospedador (Gram y cols., 2001). La elección incorrecta de un microorganismo probiótico puede provocar efectos no deseados en el hospedador, por tanto, es fundamental conocer el origen de los mismos y es preferible utilizar aquellas cepas aisladas en el propio hospedador (Fjellheim y cols., 2010), puesto que además se ha demostrado que éstas poseen una mayor capacidad de competir con los microorganismos presentes en la microbiota normal (Sun y cols., 2010). Carnevali y cols. (2004) observaron una disminución significativa de la mortalidad de larvas y alevines de dorada (Sparus aurata), cuando se les administraba Lactobacillus fructivorans. Vine y cols. (2006) propusieron que las cepas candidatas deberían de proceder de individuos sanos, preferentemente de la especie en la que se fueran a utilizar con posterioridad. La capacidad de colonización del tracto gastrointestinal, caracterizada por su atracción a la superficie mucosa, seguida por su asociación en el mucus y/o adherencia a las células epiteliales, es otro factor importante a considerar en el proceso de selección de un probiótico. Balcázar y cols. Introducción| 15 (2007), demostraron que tres cepas aisladas de salmónidos, Lactococcus lactis ssp. lactis, Labtobacillus sakei y Leuconostoc mesenteroides, tenían una gran capacidad de adherirse al mucus intestinal y sobrevivir en el mismo. Por otro lado, estudios llevados a cabo con Pseudomonas chlororaphis administrada en la perca (Perca fluviatilis) revelaron que dicha bacteria colonizaba el intestino de los peces de manera transitoria, por lo que si se quería usar como probiótico habría que administrarlo en intervalos regulares de tiempo (Gobeli y cols., 2009). El tiempo de administración de las cepas probióticas es un factor muy variable, así Sharifuzzaman y Austin (2009), observaron que tras la administración de Kocuria SM1 entre 1 y 4 semanas en trucha arco iris infectadas experimentalmente con Vibrio anguillarum, conseguían reducir la mortalidad de manera significativa, especialmente a las 2 semanas posttratamiento. Por otro lado, dos cepas de Bacillus spp. aisladas del intestino de mero (Epinephleus coioides) disminuyeron significativamente el índice de conversión tras ser administradas durante 60 días (Sun y cols., 2010); sin embargo, la utilización de la cepa Zooshikella JE-34 en platija japonesa (Paralichthys olivaceus) durante una semana no produjo incremento alguno en la ganancia media diaria, pero sí tras su administración durante 4 semanas de tratamiento (Kim y cols., 2010). Dichos estudios demuestran que la aportación de bacterias probióticas debe ser de forma continuada con el fin de que puedan estar presentes en el intestino, en la piel o en el agua de los estanques. IV.2. Mecanismos de acción de los probióticos La mayor parte de los estudios con probióticos en acuicultura han sugerido como principales mecanismos de acción: exclusión competitiva con bacterias patógenas, optimización de la nutrición y digestión por el suministro de nutrientes y enzimas esenciales en los animales y la estimulación de la respuesta inmune en el hospedador (Irianto y Austin, 2002a; Gómez y Balcázar, 2008). IV.2.1. Exclusión competitiva La exclusión competitiva en el tracto gastrointestinal, consiste en la prevención o reducción de la colonización de una bacteria patógena, por parte de las bacterias presentes en el tracto (Lara-Flores y AguirreGuzmán, 2009). | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 16 Una de las principales características que destacan en la exclusión competitiva, es la producción de sustancias inhibitorias. Este fenómeno fue observado por primera vez por De Giaxa (1889), al constatar el efecto inhibitorio producido por bacterias de origen marino sobre el crecimiento de Vibrio spp. Posteriormente, Rosenfeld y Zobell (1947) estudiaron la capacidad de algunos microorganismos marinos como posibles sintetizadores de algunos antibióticos. Estos estudios hicieron que despertara el interés por la búsqueda de microorganismos capaces de producir compuestos inhibitorios, como los antibióticos, ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, enzimas, sideróforos y bacteriocinas (Verschuere y cols., 2000; Balcázar y cols., 2006). En el tracto gastrointestinal, la microbiota endógena constituye una barrera frente a la proliferación de agentes patógenos debido en gran parte a la producción de estas sustancias inhibitorias que pueden actuar de forma independiente o combinada. Se ha demostrado que existen algunas bacterias ácido lácticas (BAL), pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Carnobacterium, que forman parte de la microbiota endógena normal de los peces y que son capaces de producir bacteriocinas que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias patógenas (Ringø y Gatesoupe, 1998). Por tanto, resulta fundamental el establecimiento de una microbiota para mantener el equilibrio ecológico entre los microorganismos beneficiosos y los microorganismos patógenos. Además, la presencia de una microbiota protectora tiene un efecto positivo sobre determinadas funciones inmunoreguladoras, por lo que es esencial el mantenimiento de la misma (Pérez y cols., 2010). En acuicultura las interacciones que se establecen entre la microbiota y las bacterias patógenas no se limitan al tracto gastrointestinal, sino que también están presentes en las branquias, en la piel y en el propio medio acuático (Tinh y cols., 2008). IV.2.2. Optimización de la nutrición y la digestión Los probióticos desempeñan un papel beneficioso en el hospedador mediante la mejora del suministro de nutrientes y/o vitaminas (Ringø y Gatesoupe, 1998). Sakata (1990) describió la producción de ácidos grasos y vitaminas por algunos microorganismos pertenecientes a los géneros Bacteroides y Clostridium. En algunas especies como la tilapia (Oreochromis niloticus) o la anguila japonesa (Anguilla japonica), se ha observado la implicación de los géneros Introducción| 23 En carpas indias (Catla catla) se han evaluado las cualidades probióticas de diversas bacterias y levaduras, observando un incremento en la supervivencia y en el índice de masa corporal (Mohanty y cols., 1996). La inclusión de Phaffia rhodozyma al 1% en la dieta de L. vannamei mostró un efecto positivo en el porcentaje de supervivencia y de crecimiento, a la vez que se incrementó la resistencia frente a la Vibriosis (Scholz y cols., 1999). Resultados similares fueron obtenidos con Sacharomyces cerevisae en la producción de tilapia (Lara-Flores, 2003). Reyes-Becerril y cols. (2008) demostraron que una dieta suplementada con Debaryomyces hansenii estimulaba el sistema inmune de la cabrilla sardinera (Mycteroperca rosacea). | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 24 Publicaciones | 25 III. Publicaciones I. Fish & Fisheries (en revisión) Tania Pérez-Sánchez, José L. Balcázar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela. Probiotics in aquaculture: a current assessment. Fish & Fisheries. (en revisión). | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 26 Publicaciones | 27 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 28 Publicaciones | 29 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 30 Publicaciones | 31 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 32 Publicaciones | 39 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 40 Publicaciones | 41 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 42 Publicaciones | 43 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 44 Publicaciones | 45 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 46 Publicaciones | 47 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 48 Publicaciones | 55 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 56 Publicaciones | 57 III. Journal of Fish Diseases, 2011 Tania Pérez-Sánchez, José Luis Balcázar, Yaneisy García, Nabil Halaihel, Daniel Vendrell, Ignacio de Blas, Daniel Merrifield, Imanol Ruiz-Zarzuela. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) with inhibitory activity against Lactococcus garvieae. Journal of Fish Diseases. 2011; 34: 499-507. | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 58 Publicaciones | 59 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 60 Publicaciones | 61 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 62 Publicaciones | 63 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 64 Publicaciones | 71 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 72 Publicaciones | 73 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 74 Publicaciones | 75 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 76 Publicaciones | 77 V. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2011 Tania Pérez, José L. Balcázar, Álvaro Peix, Ángel Valverde, Encarna Velázquez, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela. Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. isolated from the intestinal mucus of brown trout (Salmo trutta) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2010; doi:10.1099/ijs.0.023945-0. (enviado, referencia VETMIC-D08-2577). | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 78 Publicaciones| 79 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 80 Publicaciones| 8 7 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 88 Publicaciones| 89 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 90 Publicaciones| 91 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 92 Publicaciones| 93 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 94 Resumen general | 95 IV. Resumen general I. Resumen I.1. Resumen Durante los últimos años la acuicultura se ha convertido en una importante actividad económica en todo el mundo. El incremento en la productividad derivada de esta actividad, así como su intensificación ha venido acompañado por diversos impactos ecológicos, entre los cuales destaca la aparición de una gran variedad de agentes patógenos y de resistencia antimicrobiana. Dichos impactos son debidos en parte al uso indiscriminado de agentes quimioterápicos, que ha sido la vía más común para controlar hasta el momento las principales enfermedades de origen bacteriano. Se han propuesto numerosas estrategias para el control y prevención de estas enfermedades, entre ellas el uso de vacunas, inmunoestimulantes y probióticos. El uso de probióticos, los cuales controlan los patógenos a través de una serie de mecanismos, constituye una alternativa al tratamiento antibiótico, lo que permite que puedan ser utilizados para prevenir enfermedades bacterianas en acuicultura. El efecto beneficioso de los probióticos viene mediado mediante la competición por receptores específicos en la superficie mucosa, producción de compuestos inhibitorios, competición por componentes nutricionales o por un incremento de la respuesta inmune tanto innata como adaptativa. Lactococcus garvieae es el agente etiológico de la Lactococosis, enfermedad de gran relevancia que afecta a numerosas especies de peces tanto de agua dulce como salada y que causa importantes pérdidas económicas, principalmente cuando la temperatura del agua supera los 16ºC. Esta tesis incluye en primer lugar una visión general de la relación que se establece entre las bacterias presentes en la microbiota intestinal y el sistema inmune de los peces, centrándonos en los efectos de determinadas bacterias en el desencadenamiento de la respuesta inmune. A continuación, hemos seleccionado aquellas cepas microbianas aisladas de trucha arco iris, que presenten exclusión competitiva frente al agente etiológico responsable de la Lactococosis de los peces y analizado algunas de sus principales características probióticas. 96 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Posteriormente, con las bacterias seleccionadas se llevaron a cabo experimentos in vivo para determinar la capacidad de colonización, así como la capacidad de incrementar los mecanismos de defensa del hospedador aumentando de esta forma la resistencia a dicho proceso. Finalmente, tras el proceso de selección e identificación de cepas candidatas, hemos identificado una nueva subespecie perteneciente al género Lactococcus, denominada Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. I.2. Summary In the last few years, aquaculture has become an important economic activity in the world. The increase in the productivity of this activity and its intensification has been accompanied by ecological impacts, including emergence of a large variety of pathogens and the appearance of antimicrobial resistance among pathogenic bacteria. These impacts are in part due to the indiscriminate use of chemotherapeutic agents, which have been the most common way to control diseases. Several alternative strategies for the prevention and control of diseases have been proposed, such as the use of vaccines, immunostimulants and probiotics. The use of probiotics, which control pathogens through a variety of mechanisms, is increasingly viewed as an alternative to antibiotic treatment; therefore they can be used to prevent bacterial diseases in aquaculture. The beneficial effects of probiotics may be mediated by competition for specific pathogen receptor sites on the mucosal surface, production of inhibitory compounds, competition for nutritional substrates, or by enhancement of the host innate and adaptive immune response. Lactococcus garvieae is the etiological agent of lactococcosis, a relevant disease which affects many fish species and causes important economic losses both in marine and freshwater aquaculture when water temperature increases over 16ºC. Firstly, this thesis includes a general overview of the relationship between the fish immune system and the bacteria that are present in its intestinal microbiota, focusing on the bacterial effect on the development of certain immune responses. Next, we have selected potential probiotic bacteria isolated from rainbow trout with competitive exclusion against the etiological agent of lactococcosis in fish and analyzed some of the main probiotic characteristics. Resumen general | 103 posteriormente a 22ºC durante 24-48 h para determinar las UFC/mL. El diluyente utilizado fue solución salina al 0.85 % (p/v). La velocidad específica de crecimiento (µ) se calculó mediante la ecuación descrita por Prescott y cols. (2003): 0 ttt 0t Nlog - Nlog  donde Nt: UFC/mL en un tiempo t (tt) y N0 las UFC/mL en un tiempo anterior (t0), correspondiente a la fase exponencial del cultivo. A partir de este valor se calculó el tiempo medio de duplicación (td): td=log 2/µ. La hidrofobicidad (H%) se determinó como la habilidad de los microorganismos de adherirse a los hidrocarburos, según la metodología descrita por Vinderola y Reinheimer (2003), con algunas modificaciones. Los cultivos bacterianos en fase estacionaria se centrifugaron a 5000 g durante 5 min. Posteriormente, se lavaron dos veces con PBS (pH 6.5) y se resuspendieron en la misma solución tamponada. La densidad óptica (DO) a 560 nm de la suspensión se ajustó con PBS (pH 6.5) a un valor de 1.0 (A0). De esta solución se tomaron 3 mL, a los que se añadieron 600 µL del tolueno (Lab-Scan) y se mezclaron durante 2 min. Después de 1 h de incubación a 37ºC, para facilitar la separación de las fases, se retiró la fase acuosa y se determinó nuevamente su DO a 560 nm (A1). La prueba se realizó por triplicado y el porcentaje de hidrofobicidad se calculó mediante la fórmula: 100 A A-A H% 0 10  La tolerancia a pH ácidos y a las sales biliares se determinó a partir de cultivos en caldo MRS en fase estacionaria, cuyas DO a 600 nm se ajustaron a 0.6. Para el estudio de la tolerancia a pH ácidos se utilizó el procedimiento descrito por Prasad y cols. (1998). Los cultivos bacterianos en fase estacionaria se concentraron mediante centrifugación a 2500 g durante 10 min; posteriormente, se lavaron con PBS y se resuspendieron 500 µL en 4.5 mL de la misma solución tamponada, previamente ajustada con HCl a valores de pH de 1.0, 2.0 y 3.0, respectivamente. Las suspensiones se incubaron durante 0, 1, 2 y 3 h, y finalmente se determinó el número de colonias en agar MRS. Para determinar la tolerancia a las sales biliares se utilizó el procedimiento de Klaenhammer y Kleeman (1981). Los cultivos se sembraron por duplicado en agar MRS con 0%,0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8% y 1.0% de sales biliares (Ox-Gall, Oxoid) y se incubaron durante 24 h a 22ºC. 104 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Para confirmar la síntesis de posibles sustancias antibacterianas, todas las cepas que presentaron inhibición in vitro frente a L. garvieae, fueron cultivadas en 50 mL de caldo MRS durante 48 h a 22ºC. Tras este periodo de incubación, las cepas fueron sedimentadas por centrifugación y los sobrenadantes fueron esterilizados mediante filtros con un tamaño de poro de de 0.45 µm (Millipore). Después de la esterilización, la mitad del sobrenadante (25 mL) fue neutralizado con NaOH 5N hasta alcanzar un pH de 6.8 (Nikoskelainen y cols., 2001). La cepa patógena de L. garvieae se cultivó en caldo MRS durante 24 h a 22ºC, posteriormente fue centrifugada y lavada dos veces con tampón fosfato salino (PBS; pH 7.2) y resuspendida finalmente en la misma solución tamponada. Dicha suspensión bacteriana (100 µL; 107 UFC/mL) fue sembrada en placas de MRS por triplicado, sobre las que se habían realizado previamente cuatro pocillos de 6 mm de diámetro con una pipeta Pasteur estéril, para depositar en dos de ellos 50 µL de sobrenadante neutralizado (pH 6.8) y sin neutralizar. En los dos pocillos restantes, se agregó caldo MRS neutralizado y sin neutralizar para determinar la posible actividad inhibitoria del medio. Tras un periodo de incubación de 24 h a 22ºC, se evaluó la presencia de áreas de inhibición en el crecimiento de L. garvieae, indicando la producción de sustancias antibacterianas (Nikoskelainen y cols., 2001). La sensibilidad a diversos antibióticos se analizó mediante la técnica de difusión en agar Mueller-Hinton. Los antibióticos elegidos fueron amoxicilina/ácido clavulánico (30 µg, bioMérieux), ampicilina (10 µg, bioMérieux), cloranfenicol (30 µg, Bio-Rad), clortetraciclina (30 µg, MastDiagnostics), clindamicina (2 µg, Bio-Rad), doxiciclina (30 µg, bioMérieux), enrofloxacina (5 µg, Bio-Rad), eritromicina (15 µg, BBL), florfenicol (30 µg, BBL), flumequine (30 µg, Bio-Rad), gentamicina (10 µg, Bio-Rad), kanamicina (30 µg, BBL), ácido nalidíxico (30 µg, BBL), nitrofurantoína (300 µg, Bio-Rad), ácido oxolínico (2 µg), penicilina (10 µg, bioMérieux), estreptomicina (10 µg, BBL), tetraciclina (30 µg, bioMérieux), trimetoprim/sulfametoxazol (1.25/23.75 µg, Bio-Rad), tilosina (150 µg, NeoSensitabs) y vancomicina (30 µg, bioMérieux). A partir de cultivos de 1824 h en caldo MRS de las cepas seleccionadas, se diluyeron con caldo hasta obtener una turbidez de 0.5 en la escala de McFarland (bioMérieux, Francia) y se sembraron en placas de MRS. El periodo de incubación fue de 48 h a 22ºC, tras el cual se midieron los halos de inhibición y se interpretaron los resultados obtenidos siguiendo las recomendaciones establecidas por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). Tras comprobar una distribución normal con el test de Kolmogorov– Smirnov, los datos se analizaron mediante un ANOVA de una vía y posteriormente con la prueba de Duncan. Resumen general | 105 III.5. Evaluación de la supervivencia tras la administración de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris Se prepararon cinco grupos experimentales constituidos por 45 animales cada uno, tres de los cuales fueron alimentados diariamente con una dieta suplementada con cada una de las cepas bacterianas seleccionadas (tras 24 h de cultivo, una suspensión bacteriana en PBS fue mezclada con el pienso hasta alcanzar una concentración de 1 x 106 UFC/g pienso) durante 36 días. Mientras que los otros dos grupos fueron alimentados con el mismo pienso pero sin tratar. Durante este tiempo la temperatura del agua se fue incrementando progresivamente hasta alcanzar los 19 ± 1ºC. Tras 21 días de tratamiento con las cepas probióticas, se procedió a realizar la infección experimental mediante la técnica de cohabitación con truchas (procedentes de uno de los grupos sin tratar), a las cuales se les inoculó 0.1 mL de suspensión bacteriana (L. garvieae) a una concentración de 1.0 × 104 UFC/ml, por vía IP, que representaban el 20% de la población. La infección se llevó a cabo en los tres grupos tratados y en un cuarto que sirvió como testigo de la actividad del agente. A continuación, los peces se mantuvieron en observación 15 días más, durante los cuales fue registrada la mortalidad en todos los grupos así como determinada la presencia del agente patógeno en todas las bajas mediante métodos microbiológicos y moleculares. III.6. Evaluación in vivo de la capacidad de colonización de las cepas bacterianas con potencial probiótico El análisis mediante DGGE es una técnica molecular mediante la cual se separan fragmentos de DNA, producto de una amplificación por PCR, que tienen una misma longitud pero difieren en la secuencia. Las regiones más conservadas se utilizan para el diseño de los cebadores, mientras que las variables para establecer diferencias entre las secuencias y poder así analizarlas filogenéticamente. Esta técnica se utilizó para determinar el grado de colonización de las cepas probióticas seleccionadas, así como para establecer la ruta de infección de L. garvieae. Para la recogida de las muestras, se seleccionaron al azar 5 peces de cada uno de los tratamientos con probióticos, así como del grupo control. Inmediatamente después de la eutanasia se tomaron muestras del intestino distal, las cuales se congelaron a -80ºC hasta su posterior utilización. Utilizamos el kit de extracción QIAamp Stool Mini Kit (Qiagen) para 106 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) obtener un DNA de gran pureza, aislado del resto de componentes celulares y cualquier otra sustancia que pueda inhibir la PCR posterior. Los cebadores utilizados se diseñaron según las regiones específicas de los organismos de interés, en el caso de las bacterias, se utiliza generalmente la región V3 del RNAr. El DGGE para V3 se realizó en un gel con un 8% de acrilamida y entre un 40 y un 60% de agente desnaturalizante, que estuvo corriendo durante 16 h a 60 Voltios (V). Tras una tinción con SYBR Green, la visualización de las bandas se realizó con un transiluminador acoplado a un sistema de captación de imágnes (Bio-Rad Universal Hood II). III.7. Evaluación in vivo de la capacidad protectora de las cepas probióticas seleccionadas frente a L. garvieae A partir de las muestras de intestino y riñón anterior se procedió a la extracción del RNA, para la cual se utilizó el método TRIZOL con algunas modificaciones, descrito previamente por Zhang y cols. (2009). Para ello, se diseñaron cebadores específicos, mediante el programa informático PrimerBLAST (National Center for Biotechnology Information), que nos permitieron amplificar las siguientes citoquinas IL-1β, TNF-α, IL-10 en riñón anterior e IL-8, Tlr5, IgT en intestino. En la Tabla 2 se especifican las secuencias de los cebadores utilizados. Tabla 2. Cebadores utilizados para detectar los genes estudiados. Gen Nº acceso GenBank Tamaño (pb) Sentido Cebador IL-1β AJ223954 91 5’ - 3’ ACATTGCCAACCTCATCATCG 3’ – 5’ TTGAGCAGGTCCTTGTCCTTG IL-10 AB118099 70 5’ - 3’ CGACTTTAAATCTCCCATCGAC 3’ – 5’ GCATTGGACGATCTCTTTCTTC TNF-α AJ277604 75 5’ - 3’ GGGGACAAACTGTGGACTGA 3’ – 5’ GAAGTTCTTGCCCTGCTCTG IL-8 AJ279069 69 5’ - 3’ AGAATGTCAGCCAGCCTTGT 3’ – 5’ TCTCAGACTCATCCCCTCAGT IgT AY870265 72 5’ - 3’ AGCACCAGGGTGAAACCA 3’ – 5’ GCGGTGGGTTCAGAGTCA Tlr5 AB091105 89 5’ - 3’ GGCATCAGCCTGTTGAATTT 3’ – 5’ ATGAAGAGCGAGAGCCTCAG β actina AJ438158 167 5’ - 3’ ACAGACTGTACCCATCCCAAAC 3’ – 5’ AAAAAGCGCCAAAATAACAGAA 60s NM001165047 147 5’ - 3’ AGCCACCAGTATGCTAACCAGT 3’ – 5’ TGTGATTGCACATTGACAAAAA Resumen general | 107 Para la síntesis del DNA complementario (DNAc) se utilizó un kit iScript DNAc Synthesis kit (Bio-Rad), tras la cual se realizaron las PCR por duplicados para cada una de la muestras mediante el método de SYBR Green, utilizando un termociclador iQ5 iCycler (Bio-Rad). El programa informático iQ5 optical system (Bio-Rad) fue utilizado para calcular los niveles de expresión de las citoquinas estudiadas en comparación a la expresión de la β-actina y el gen 60S, utilizados como controles. Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente mediante el método de Kaplan-Meier y el test log-rank. Para determinar diferencias significativas entre la respuesta inmune de los grupos tratados y el control se utilizó el test ANOVA de una vía y la prueba de Tukey. III.8. Identificación de una nueva subespecie, Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. Las tres cepas bacterianas aisladas a partir de muestras de mucus intestinal procedente de ejemplares de trucha arco iris y de trucha común, fueron sembradas en MRS e incubadas posteriormente a 22ºC durante 24 h. Una vez crecidas se determinó la morfología y movilidad de las colonias. La amplificación y secuenciación del gen 16S RNAr, se realizó según la metodología descrita por Rivas y cols. (2007). Las secuencias obtenidas se compararon con las del GenBank, utilizando el programa informático BLAST (Alschul y cols., 1990) y alineadas con el programa informático Clustal W (Thompson y cols., 1994). Las distancias se calcularon según el modelo de Kimura (1980) y los árboles filogéneticos fueron construidos según la metodología previamente descrita por Saitou y Nei (1987). Para llevar a cabo todos los análisis se utilizó el programa MEGA 4.0 (Tamura y cols., 2007). Con el objetivo de determinar el patrón de bandas de las cepas aisladas, se realizó una rep-PCR, utilizando el cebador GTG5 (5´-GTG GTG GTG GTG GTG-3´) y siguiendo la metodología propuesta por Marilley y cols. (2004). Para determinar la diversidad genética de las cepas aisladas se analizaron mediante una amplificación al azar de las regiones polimórficas del DNA (RAPD), con el cebador M13 (5’-GAG GGT GGC GGT TCT-3’), de acuerdo con el método de Rivas y cols. (2006). Para el análisis filogenético de distintas especies bacterianas, entre las que se incluyen cocos Gram positivos del género Streptococcus (Maiden, 2006), se ha demostrado la utilidad de los genes constitutivos. En este estudio se analizaron dos genes rpoB y recA. Para la amplificación y posterior 108 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) secuenciación se utilizaron los siguientes cebadores; rpoBLac1F (5’-TAC GGK AAA CAC CGTA-3’), rpoBLac1R (5’-TCA ARC CAW GCT CCA CGG-3’), recALac1F (5’-GCA GCC TTT ATC GAT GCTG-3’) y recA1R (5’- GCA CGA CCA CCA GG-3’), diseñados a partir de las regiones conservadas de las especies L. lactis subsp. lactis KF147 (número de acceso CP001834) y L. lactis subsp. cremoris SK11 (número de acceso CP000425). El análisis del contenido en Guanina-Citosina (G+C) se realizó en el Servicio de Identificación de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), para lo cual el DNA fue extraído y purificado según la metodología descrita por Cashion y cols. (1997). Posteriormente, el DNA fue hidrolizado con la nucleasa P1 y los nucleótidos desfosforalizados con la fosfatasa alcalina bovina (Mesbah y cols., 1989). El porcentaje de G+C se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) según Mesbah y cols. (1989). Los análisis de hibridación del DNA se realizaron de acuerdo al método de Ezaki y cols. (1989), siguiendo las recomendaciones de Willens y cols. (2001). Los ácidos grasos fueron analizados en el Servicio de Identificación de DSMZ, siguiendo las instrucciones del Sistema de Identificación Microbiológica (MIDI). Para determinar la producción de ácido de los carbohidratos, se utilizaron los sistemas de identificación rápida API 20Strep y API 50CH (bioMérieux). Los resultados se interpretaron según las indicaciones de Schleifer y cols. (1985). También se determinó el crecimiento en presencia de un 4% de NaCl en agar TSA. La sensibilidad a diversos antibióticos se analizó mediante la técnica de difusión en agar sangre (Sharlau). Los antibióticos elegidos fueron ampicilina (2 µg), eritromicina (2 µg), ciprofloxacina (5 µg), penicilina (10 UI), polimixina (300 UI), cloxacilina (1 µg), oxitetraciclina (30 µg), gentamicina (10 µg), cefuroxime (30 µg) y neomicina (5 µg), (BBL). Conclusiones | 109 V. Conclusiones I. Conclusiones Bajo nuestras condiciones de estudio, se han obtenido las siguientes conclusiones: PRIMERA: Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ha demostrado ser la cepa más adecuada para su aplicación oral como probiótico frente a la Lactococosis de la trucha. SEGUNDA: La respuesta inmune desencadenada mediante la liberación de citoquinas en el grupo tratado con Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, ha permitido un mayor grado de protección frente a Lactococcus garvieae. TERCERA: Las interacciones que se establecen en el intestino entre las bacterias probióticas y la microbiota endógena, no constituye un requisito necesario para desencadenar un efecto protector frente a la enfermedad. CUARTA: La manipulación de la microbiota normal del hospedador mediante la administración de cepas probióticas podría constituir una vía para la prevención de trastornos patológicos en los peces. | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) 110 II. Conclusions Based on the study conditions, the results from the experiments carried out in this study and its discussion, the following conclusions have been obtained: FIRST: Lactobacillus plantarum subsp. plantarum has demonstrated to be the most appropriate strain for use as oral probiotic against Lactococcosis in rainbow trout. SECOND: The immunological responses in the group treated with Lactobacillus plantarum subsp. plantarum were responsible for mediating elevated disease resistance against Lactococcus garvieae. THIRD: Direct probiotic-microbiota interactions with the intestine are not always necessary to induce a protector effect against the disease. FOURTH: The manipulation of the host microbiota through the administration of probiotic bacteria may represent a new possibility in the prevention of pathological disorders. Bibliografía | 111 VI. Bibliografía Afonso A, Silva J, Gomes S. Lactococcus garvieae trout infections in Portugal: a new challenge on fish vaccinology. 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Revista Fish & Fisheries JIF 6.434 Año 2010 Áreas temáticas Fisheries (1/46) Revista Mucosal Immunology JIF 6.817 Año 2010 Áreas temáticas Immunology (15/134) Revista Journal of Fish Diseases JIF 1.603 Año 2010 Áreas temáticas Fisheries (13/46) Marine & Freshwater Biology (37/92) Veterinary Sciences (27/145) 122 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Revista Fish & Shellfish Immunology JIF 3.044 Año 2010 Áreas temáticas Fisheries (5/46) Immunology (58/134) Marine & Freshwater Biology (8/92) Veterinary Sciences (4/145) Revista International J. of Systematic & Evolutionary Microbiology JIF 1.930 Año 2010 Áreas temáticas Microbiology (68/107) Apéndices | 123 II. Contribución del doctorando El doctorando es el primer autor de todos los trabajos presentados en esta tesis, lo que justifica plenamente su contribución. Además, debemos indicar que todos los coautores son doctores, con la excepción de Dª Yaneisy García Hernández, quien renuncia expresamente a presentar el trabajos del que es coautora como parte de otra tesis doctoral, en función de lo cual firma el presente documento. Dª Yaneisy García Hernández 124 | Selección y evaluación de cepas probióticas para la prevención de la Lactococosis en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)