Repositorio Institucional de Documentos

2012 85 Miguel Lomba Huguet Estrategias de fotorreticulación alternativas a la fotopolimerización de acrilatos para la preparación de materiales microestructurados de uso en aplicaciones biomédicas Departamento Director/es Química Orgánica Oriol Langa, Luis Sánchez Somolinos, Carlos Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Miguel Lomba Huguet ESTRATEGIAS DE FOTORRETICULACIÓN ALTERNATIVAS A LA FOTOPOLIMERIZACIÓN DE ACRILATOS PARA LA PREPARACIÓN DE MATERIALES MICROESTRUCTURADOS DE USO EN APLICACIONES BIOMÉDICAS Director/es Química Orgánica Oriol Langa, Luis Sánchez Somolinos, Carlos Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA TESIS DOCTORAL ESTRATEGIAS DE FOTORRETICULACIÓN ALTERNATIVAS A LA FOTOPOLIMERIZACIÓN DE ACRILATOS PARA LA PREPARACIÓN DE MATERIALES MICROESTRUCTURADOS DE USO EN APLICACIONES BIOMÉDICAS MIGUEL LOMBA HUGUET Dpto. de Química Orgánica Facultad de Ciencias-ICMA Universidad de Zaragoza-CSIC Zaragoza, octubre de 2012 TESIS DOCTORAL ESTRATEGIAS DE FOTORRETICULACIÓN ALTERNATIVAS A LA FOTOPOLIMERIZACIÓN DE ACRILATOS PARA LA PREPARACIÓN DE MATERIALES MICROESTRUCTURADOS DE USO EN APLICACIONES BIOMÉDICAS Memoria presentada en la Universidad de Zaragoza para optar al grado de Doctor en Ciencias por MIGUEL LOMBA HUGUET Dpto. de Química Orgánica Facultad de Ciencias-ICMA Universidad de Zaragoza-CSIC Zaragoza, octubre de 2012 D. LUIS T. ORIOL LANGA, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias, perteneciente al Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón de la Universidad de Zaragoza-CSIC y D. CARLOS SÁNCHEZ SOMOLINOS, Científico Titular del Consejo Superior de Investigaciones Científicas del Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón de la Universidad de Zaragoza-CSIC, HACEN CONSTAR: Que el trabajo original titulado “ESTRATEGIAS DE FOTORRETICULACIÓN ALTERNATIVAS A LA FOTOPOLIMERIZACIÓN DE ACRILATOS PARA LA PREPARACIÓN DE MATERIALES MICROESTRUCTURADOS DE USO EN APLICACIONES BIOMÉDICAS”, ha sido realizado bajo nuestra supervisión por D. MIGUEL LOMBA HUGUET en el Departamento de Química Orgánica y en el Departamento de Física de la Materia Condensada de la Facultad de Ciencias, pertenecientes al Instituto de Ciencia de Materiales de Aragón de la Universidad de Zaragoza-CSIC y reúne las condiciones para su presentación como tesis doctoral. Zaragoza, a 3 de octubre de 2012 Fdo.: Dr. Luis T. Oriol Langa Fdo.: Dr. Carlos Sánchez Somolinos v  6.4.1. MATERIALES ............................................................................................................ 203 6.4.2. SÍNTESIS DE LOS MACROMONÓMEROS ........................................................... 204 6.4.3. PREPARACIÓN DE PELÍCULAS FOTORRETICULABLES ................................. 205 6.4.4. FOTORRETICULACIÓN DE LOS MACROMONÓMEROS .................................. 206 6.4.5. ESTUDIOS DE BIOCOMPATIBILIDAD ................................................................. 206 6.4.6. ESTUDIOS DE ADHESIÓN CELULAR .................................................................. 206 6.4.7. TÉCNICAS ................................................................................................................. 207 7. CONCLUSIONES ............................................. 209 vi    1. ANTECEDENTES CAPITULO1 3 1.1. BIOMATERIALES En las últimas décadas la Medicina ha evolucionado de forma tal que se ha adquirido un conocimiento más profundo de los procesos biológicos involucrados en el desarrollo y la curación de enfermedades a nivel molecular. De esta forma se puede influir en ellos favoreciendo un determinado proceso curativo, un proceso de regeneración tisular o evitando la aparición de una determinada enfermedad, utilizando para ello metodologías aplicadas en la Biología, la Química o la Física. Muchos autores definen esta aproximación como Biomedicina. Para ello, algunas áreas de la Medicina han hecho uso de materiales que pueden ser introducidos en el cuerpo e interaccionar con él, influyendo así en estos procesos biológicos. Estos materiales se conocen con el nombre de biomateriales. Un biomaterial ha de ser biocompatible, es decir, no ha de provocar respuesta adversa en el organismo (por ejemplo inflamatoria). En ocasiones se busca que este material sea bioactivo de forma que tenga un efecto en el tejido vivo. Esta bioactividad, que está influida por la composición química del material, ha de modularse dependiendo de la aplicación final. La variedad en cuanto a las posibles aplicaciones de estos materiales hace que se haya estudiado en profundidad con el objetivo de optimizarlos para las diferentes aplicaciones médicas.1, 2  1 Park, J.B., Bronzino, J.D. (Editors). Biomaterials: Principles and Applications. CRC Press, Florida, USA, 2000. 2 Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. (Editors). Biomaterials in Tissue Engineering. Principles of Tissue Engineering, 3rd Edition. Elsevier Academic Press, San Diego, USA, 2007, p.263-359. CAPITULO1 4 1.1.1. APLICACIONES MÉDICAS DE LOS BIOMATERIALES El uso de biomateriales, entendidos como materiales que interaccionan con el cuerpo humano, no es reciente tal y como lo demuestra por ejemplo el uso desde la antigüedad de prótesis metálicas para implantes y piezas dentales. No obstante es ya en el siglo XX cuando el campo de los biomateriales experimenta un gran auge gracias al avance en la Ciencia de Materiales. Esto permite diseñar biomateriales específicos para una determinada aplicación (en vez de ser una adaptación de un material ya existente) y fabricar por lo tanto dispositivos médicos mucho más adecuados a su finalidad. El campo de aplicación de los biomateriales es en la actualidad muy amplio, y son diversas las disciplinas de la Medicina que se han aprovechado de los nuevos avances en Ciencia de Materiales ya sea en el ámbito de los materiales metálicos, cerámicos (biocerámicas), poliméricos o composites. Así, por ejemplo, se han utilizado nuevos materiales biocompatibles para recubrir compuestos magnéticos o radiactivos que pueden ser transportados por el cuerpo humano sin provocar respuesta inmune.3 De esta forma pueden ser monitorizados en su recorrido por el cuerpo humano, siendo de gran utilidad en el diagnóstico de enfermedades o para seguir rutas metabólicas. Además, la incorporación de ligandos específicos a estos agentes de contraste ha permitido localizarlos en receptores presentes en determinados órganos o tejidos del cuerpo humano. Estos agentes de contraste son una herramienta muy útil, por ejemplo, para detectar tejidos dañados incluso antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad. Otras disciplinas como la Cirugía también se han beneficiado de la aparición de biomateriales, especialmente de los biomateriales poliméricos. Con este tipo de  3 Kim, J.H., Park, K., Nam, H.Y., Lee, S., Kim, K., Kwon, I.C. Prog. Polym. Sci., 2007, 32, 1031-1053. CAPITULO1 5 materiales se han fabricado suturas que pueden degradarse y ser absorbidas por el cuerpo humano evitando así una posterior intervención quirúrgica para retirarlas y que permiten además incorporar biomoléculas que favorecen la cicatrización de la herida.4 La fabricación de piezas para implantes o prótesis también se ha beneficiado del desarrollo de biomateriales para mejorar los tradicionales implantes metálicos. De esta forma se han podido fabricar dispositivos de polietileno de ultra alto peso molecular (UHMWPE) con una gran capacidad de absorción de impacto y bajo coeficiente de fricción que se utilizan como acetábulos en prótesis de cadera,5 o implantes de poliuretano con una gran estabilidad para la fabricación de válvulas cardiacas y tubos sanguíneos.6 También se han usado formulaciones polimerizables in vivo como los cementos acrílicos que sirven para fijar el implante al hueso y evitar así posibles desplazamientos.7 Diversos composites porosos como las cerámicas se han utilizado para favorecer la integración del implante en el tejido que lo rodea.8 Dos campos que han adquirido una gran importancia en la Medicina actual son la liberación controlada de fármacos y la Medicina Regenerativa. Estas dos disciplinas requieren materiales con unas propiedades físico-químicas muy bien definidas como el tiempo de degradación, la morfología, las propiedades mecánicas o la incorporación de diversas moléculas que interaccionen específicamente con el cuerpo para cumplir una determinada función dentro del mismo. Es por esto que el diseño de materiales para estas aplicaciones es un proceso complejo que está siendo ampliamente investigado en  4 Boateng, J.S., Matthews, K.H., Stevens, H.N.E., Eccleston, G.M. J. Pharm. Sci., 2008, 97, 2892-2923. 5 Kurtz, S.M. (Editor). The UHMWPE Handbook: Ultra-High Molecular Weight Polyethylene in Total Joint Replacement. Elsevier, London, 2004. 6 Gunatillake, P.A., Martin, D.J., Meijs, G.F., McCarthy, S.J., Adhikari, R. Aust. J. Chem., 2003, 56, 545557. 7 Lewis, G. J. Biomed. Mater. Res. B, 2008, 84, 301-319. 8 Mastrogiacomo, M., Muraglia, A., Komlev, V., Peyrin, F., Rustichelli, F., Crovace, a., Cancedda, R. Orthod. Craniofacial Res., 2005, 8, 277-284. CAPITULO1 6 la actualidad. A continuación se comentarán brevemente estos campos en los que los materiales poliméricos han adquirido especial relevancia. 1.1.1.1. Liberación controlada de fármacos Todo fármaco tiene un intervalo de concentraciones en el que resulta eficaz. Por encima de este intervalo puede resultar tóxico y por debajo del mismo, inefectivo. El suministro tradicional de fármacos (línea continua negra de la figura 1) lleva asociado un pico en la concentración del fármaco en el cuerpo, en el que se supera el valor umbral de toxicidad, para después decaer rápidamente hasta valores de inefectividad. La liberación controlada de fármacos trata de conseguir un aporte constante del fármaco evitando así picos de concentración. 9 Esto se consigue mediante sistemas que lo liberan de forma paulatina para lograr una concentración terapéuticamente activa del fármaco libre que sea estable en el tiempo (línea continua gris). Fig. 1. Perfil de exposición del cuerpo humano a un fármaco con suministro tradicional (línea negra) o con sistemas de liberación controlada de fármacos (línea gris).  9 Luo, Y., Prestwich, G. Expert Opin. Ther. Patents, 2001, 11, 1395-1410. CAPITULO1 7 Se puede disminuir todavía más el riesgo de efectos secundarios si, además de evitar los picos de concentración, se consigue una liberación localizada en el tejido dañado (figura 2). Esto se puede conseguir mediante sistemas que encapsulen el fármaco y lo liberen una vez alcanzado el objetivo en respuesta a algún estímulo externo como el pH, la temperatura o la radiación electromagnética. 10 Para guiar el fármaco al tejido dañado se pueden utilizar transportadores funcionalizados con ligandos específicos que interaccionan con los receptores del tejido diana de forma selectiva (figura 2.c). 11, 12 Fig. 2. Distribución por el organismo de un fármaco tradicional (a) y de un sistema de liberación localizada de fármacos (b). Interacción del transportador del fármaco con la célula diana mediante ligandos específicos (c). Los biomateriales empleados en aplicaciones de liberación controlada de fármacos no han de provocar respuesta inflamatoria en el organismo. Además, es  10 Bajpai, A.K., Shukla, S.K., Bhanu, S., Kankane, S. Prog. Polym. Sci., 2008, 33, 1088-1118. 11 Jaracz, S., Chen, J., Kuznetsova, L.V., Ojima, I. Bioorg. Med. Chem., 2005, 13, 5043-5054. 12 Park, T.G., Jeong, J.H., Kim, S.W. Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, 58, 467-486. CAPITULO1 8 recomendable que sean biodegradables ya que así pueden ser metabolizados y eliminados por el organismo. Esto disminuye el riesgo de que estos materiales se acumulen y puedan generar algún tipo de respuesta inflamatoria. El tiempo que debe tardar en liberarse el fármaco depende de la aplicación y puede variar desde unos pocos minutos como en la liberación de fármacos destinados a enfermedades pulmonares13 a varios meses como en la liberación de sistemas anticonceptivos.14 Este proceso de liberación puede estar controlado por la difusión del compuesto fuera del material que lo transporta, o por la degradación del material en el que el fármaco está encapsulado. El primer caso es típico de los hidrogeles, en los que el compuesto se halla en el interior del material y la absorción de agua por parte del mismo hace que el fármaco pueda liberarse al exterior por simple difusión. En dicho proceso de liberación intervienen una gran cantidad de factores que hacen que la difusión sea más o menos rápida15 por lo que el proceso de liberación de la carga es difícil de controlar. En sistemas tipo vesículas en los que la carga no puede difundir al exterior, la liberación puede estar controlada por la degradación del material. Esto permite conseguir un perfil de liberación más constante16 que además se puede modificar controlando el perfil de degradación, el cual se puede optimizar mediante un buen diseño químico del material.17 1.1.1.2. Ingeniería de Tejidos La escasez de órganos para trasplantes, así como la posibilidad de un rechazo por parte del organismo huésped al incorporar un órgano ajeno han provocado un gran interés en el desarrollo de la Ingeniería de Tejidos. Esta disciplina intenta regenerar  13 Cook, R.O., Pannu, R.K., Kellaway, I. J. Control. Release, 2005, 104, 79-90. 14 Dhanaraji, M.D., Vema, K., Jayakumar, R., Vamsadhara, C. Int. J. Pharm., 2003, 268, 23-29. 15 Maderuelo, C., Zarzuelo, A., Lanao, J.M. J. Control. Release, 2011, 154, 2-19. 16 Huang, X., Brazel, C. J. Control. Release, 2001, 73, 121-136. 17 Göpferich, A. Biomaterials, 1996, 17, 103-114. CAPITULO1 15 éstos, al degradarse, generan hidroxiácidos que pueden provocar una cierta acidez local y pueden inducir respuesta inflamatoria en el tejido colindante. Los polifosfacenos también han mostrado utilidad para fabricar recubrimientos de agujas metálicas en los que se puede encapsular vacunas.44 En la tabla 1 se recogen la estructura química y el campo de aplicación en Biomedicina de algunas de las familias de polímeros sintéticos biodegradables más importantes en Medicina, así como sus principales ventajas y desventajas en su utilización como biomateriales. Los grupos R situados en la cadena polimérica suelen ser cadenas alifáticas debido a su menor toxicidad respecto a los compuestos aromáticos. En los grupos R laterales puede haber distintos grupos funcionales que pueden proporcionar al material ciertas propiedades o permitir la funcionalización del mismo por ejemplo con moléculas bioactivas.  44 Adrianov, A.K., DeColibus, D.P., Gillis, H.A., Kha, H.H., Marin, A., Prausnitz, M.R., Babiuk, L.A., Townsend, H., Mutwin, G. PNAS, 2009, 106, 18936-18941. CAPITULO1 16 Tabla 1. Aplicaciones, ventajas, desventajas y ejemplos de los diferentes grupos de polímeros sintéticos biodegradables. Polímeros Aplicaciones1 Ventajas Desventajas Estructura2 Polihidroxialcanoatos IT, LCF Procesabilidad, propiedades mecánicas y perfil de degradación controlables, síntesis sencilla Productos de degradación ácidos Poliacetales LCF Degradación en productos neutros, degradación sensible al pH Bajos pesos moleculares, síntesis compleja Polianhidridos IT, LCF Flexibilidad sintética, perfil de degradación controlable Bajo peso molecular, malas propiedades mecánicas Policarbonatos IT, LCF, FI Propiedades mecánicas controlables, degradación superficial Degradación limitada (requiere copolimerización con otros polímeros) Poliamidas LCF Grupos funcionalizables, productos de degradación altamente biocompatibles Degradación muy limitada, la presencia de cargas (a pH ácido) induce toxicidad Poli(orto ésteres) LCF Perfil de degradación controlable, degradación sensible al pH Malas propiedades mecánicas, síntesis compleja Polifosfoésteres IT, LCF Compatibilidad con biomoléculas, productos de degradación altamente biocompatibles Síntesis compleja Polifosfacenos IT, EV Flexibilidad sintética, propiedades mecánicas controlables Síntesis compleja 1 Aplicaciones: IT (Ingeniería de Tejidos), LCF (liberación controlada de fármacos), EV (encapsulación de vacunas), FI (fijación de implantes). 2 El grupo R es normalmente una cadena alifática. CAPITULO1 17 1.1.2.2. Polímeros naturales Los polímeros naturales son macromoléculas sintetizadas por organismos de origen vegetal o animal entre los que podemos encontrar polímeros muy diversos como el caucho natural, los ácidos nucleicos, los polisacáridos o las proteínas. De todos ellos, las proteínas de la ECM y los polisacáridos son los más utilizados como biomateriales debido a su estructura química única, que está ligada a su función biológica dentro del organismo, y que hace que muestren una gran bioactividad cuando son utilizados como biomateriales.45, 46 Su aplicación se extiende a diversos campos como la liberación controlada de fármacos,47, 48 la Ingeniería de Tejidos,49, 50 el recubrimiento de dispositivos para diagnóstico médico,3 o la fabricación de suturas.4 Su principal limitación es que ofrecen una baja versatilidad sintética por lo que a menudo se combinan con polímeros sintéticos para obtener materiales bioactivos en los que se pueden modular las propiedades de manera precisa.51 PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS Estos compuestos son poliamidas que tienen diversas funciones en el organismo, una de las cuales es su función estructural. Esta función la desempeñan principalmente las proteínas de la ECM, que conforman el entorno natural de las células en los tejidos vivos. Entre las proteínas de la ECM cabe destacar el colágeno que es la más abundante tanto en la piel como en tejidos musculoesqueletales por lo que se utiliza ampliamente  45 Dutta, R.C., Dutta, A.K. Biotechnol. Adv., 2010, 28, 764-769. 46 Friedl, P., Zänker, K.S., Bröcker, E.B. Microsc. Res. Tech., 1998, 43, 369-378. 47 Malafaya, P.B., Silva, G.A., Reis, R.L. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007, 59, 207-233. 48 Dang, J.M., Leong, K.W. Adv. Drug Deliv., 2006, 58, 487-499. 49 Van Vlierberghe, S., Dubruel, P., Schacht, E. Biomacromolecules, 2011, 12, 1387-1408. 50 Badylak, S.F., Freytes, D.O., Gilbert, T.W. Acta Biomater., 2009, 5, 1-13. 51 Sionkowska, A. Prog. Polym. Sci., 2011, 36, 1254-1276. CAPITULO1 18 en suturas biodegradables52 ya que ayuda a regenerar tanto tejidos musculares como la piel o el tejido vascular. También son estudiadas como materiales para la fabricación de andamiajes destinados a la regeneración de tejido óseo, en dónde se combinan con diversos compuestos inorgánicos como fosfato de calcio o hidroxiapatito.53 De esta forma se consigue mimetizar muy bien la composición química del hueso, formado principalmente por colágeno y fosfato de calcio. Otras proteínas como la fibrina y la elastina son polímeros reticulados de fibras de fibrinógeno y de tropoelastina respectivamente. Debido a su estructura química tienen propiedades elásticas por lo que se utilizan en suturas quirúrgicas para la regeneración de tejidos musculares.54 Es notable también el uso de péptidos sintéticos de cadena corta, que son secuencias peptídicas que tratan de imitar la bioactividad de las proteínas naturales a la vez que ofrecen una mayor versatilidad sintética. Se sabe que las proteínas basan su bioactividad en la secuencia química de varios dominios específicos. Uno de los casos más conocidos es la secuencia RGD (Arginina-Glicina-Ácido aspártico) que promueve la adhesión celular.55 Este conocimiento se ha aprovechado para sintetizar polipéptidos de cadena corta con la secuencia específica de interés, de forma que pueden incorporarse a los polímeros sintéticos para dotarlos de la bioactividad propia de las proteínas naturales.56  52 Ruszczak, Z. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, 55, 1595-1611. 53 Chen, G., Ushida, T., Tateishi, T. Macromol. Biosci., 2002, 2, 67-77. 54 Mana, M., Cole, M. Cox, S., Tawil, B. Wound Rep. Reg., 2006, 14, 72-80. 55 Bellis, S.L. Biomaterials, 2011, 32, 4205-4210. 56 Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. Biomaterials, 2003, 24, 4385-4415. CAPITULO1 19 POLISACÁRIDOS Los polisacáridos son polímeros basados en la repetición de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos para dar lugar a compuestos poliméricos. Algunos de estos polímeros, como el sulfato de condroitina, el quitosano o el ácido hialurónico (figura 4) también tienen aplicación en diversos campos de la Biomedicina como el de las suturas quirúrgicas,57 la Ingeniería de Tejidos47 o la liberación controlada de fármacos.58 Así, el sulfato de condroitina (figura 4.a) es un compuesto muy común en el tejido cartilaginoso y, debido a ello, muestra una gran bioactividad en el cultivo de condrocitos59 que son las células presentes en el tejido cartilaginoso. Esto hace que se haya utilizado ampliamente para la fabricación de andamiajes para regeneración de este tipo de tejido.60, 61 El quitosano (figura 4.b) ha sido ampliamente investigado en aplicaciones de liberación controlada de fármacos ya que los grupos amino de la cadena polimérica hacen posible su funcionalización con ligandos específicos,62 le pueden conferir cierta carga positiva que lo convierte en un buen agente de internalización para terapia génica,63 y permiten fabricar dispositivos sensibles al pH62 útiles en liberación localizada de fármacos. El ácido hialurónico y sus sales derivadas (figura 4.c), debido a su interacción con las células tumorales,64 es un material muy útil para la liberación localizada de fármacos anticancerígenos como el paclitaxel65 o la doxorrubicina.66  57 Kirker, K.R., Luo, Y., Nielson, J.H., Shelby, J., Prestwich, G.D. Biomaterials, 2002, 23, 3661-3671. 58 Liu, Z., Jiao, Y., Wang, Y., Zhou, C., Zhang, Z. Adv. Drug Deliv. Rev., 2008, 60, 1650-1662. 59 Van Susante, J.L.C., Pieper, J., Buma, P., Van Kuppevelt, T.H., Van Beuningen, H., Van der Kraan, P.M., Veerkamp, J.H., Van den Berg, W.B., Veth, R.P.H. Biomaterials, 2001, 22, 2359-2369. 60 Ko, C.S., Huang, J.P., Huang, C.W., Chu, I.M. J. Biosci. Bioeng., 2009, 107, 177-182. 61 Chang, K.Y., Cheng, L.W., Ho, G.H., Huang, Y.P., Lee, Y.D. Acta Biomater., 2009, 5, 1937-1947. 62 Park, J.H., Saravanakumar, G., Kim, K., Kwon, I.C. Adv. Drug Deliv. Rev., 2010, 62, 28-41. 63 Saranya, N., Moorthi, A., Saravanan, S., Devi, M.P., Selvamurugan, N. Int. J. Biol. Macromol., 2011, 48, 234-238. 64 Toole, B.P. Nat. Rev., 2004, 4, 528-539. 65 Banzato, A., Rondina, M., Meléndez-Alafort, L., Zangoni, E., Nadali, A., Renier, D., Moschini, G., Mazzi, U., Zanovello, P., Rosato, A. Nuc. Med. Bio., 2009, 36, 525-533. 66 Upadhyay, K.K., Bhatt, A.N., Mishra, A.K., Dwarakanath, B.S., Jain, S., Schatz, C., Le Meins, J.F., Farooque, A., Chandraiah, G., Jain, A.K., Misra, A., Lecommandoux, S. Biomaterials, 2010, 31, 28822892. CAPITULO1 20 Además, el ácido hialurónico está presente en la ECM de muchos tejidos del cuerpo humano (especialmente en los tejidos blandos conectivos) y puede promover diversos procesos biológicos como la proliferación celular, la segregación de nueva ECM o la expresión de genes.67, 68, 69 Esto hace que este polisacárido también sea un precursor muy interesante para la fabricación de suturas y andamiajes para regeneración de tejidos. Fig. 4. Estructura química del sulfato de condroitina (a), del quitosano (b) y del hialuronato de sodio (c).  67 West, D.C., Hampson, I.N., Arnold, F., Kumar, S. Science, 1985, 228, 1324-1326. 68 Chen, W.Y. Abatangelo, G. Wound Repair Reg. 1999, 7, 79-89. 69 Toole, B.P. Cell Dev. Biol. 2001, 12, 79-87.  a) b) c) CAPITULO1 21 1.2. FOTOPOLIMERIZACIÓN Y ESTRUCTURACIÓN CON LUZ Entre los diversos métodos de preparación de polímeros sintéticos, la fotopolimerización ocupa un lugar destacado al emplear un estímulo externo como la luz para desencadenar y controlar el proceso de polimerización, lo que abre la posibilidad de estructurar el material. Tanto la fotopolimerización como la estructuración con luz de materiales poliméricos juegan un papel importante en el campo de los biomateriales. Antes de revisar tales aplicaciones, en este apartado se repasarán aspectos generales y básicos de fotopolimerización y estructuración con luz. 1.2.1. REACCIONES DE FOTOPOLIMERIZACIÓN Se conoce como fotopolimerización a la reacción en la que se utiliza la luz para formar una estructura polimérica.70, 71 En el caso de usar monómeros multifuncionales con varios grupos reactivos, o bien oligómeros o polímeros con varios grupos reactivos (macromonómeros), se obtiene una red polimérica entrecruzada. Este proceso presenta algunas ventajas respecto a la polimerización térmica como son rapidez, bajo consumo de energía y la posibilidad de llevar a cabo la reacción a temperatura controlada. Además, al estar inducido por un estímulo externo como es la luz, permite un control espacio-temporal del proceso ya que se puede elegir dónde y cuándo irradiar para iniciar la reacción. Debido a todas estas ventajas, este tipo de reacciones se han utilizado en diversas aplicaciones como la fabricación de recubrimientos o de dispositivos  70 Odian, G. Principles of Polymerization, Wiley-Interscience, 3ª ed., New York, EEUU, 1991, p.198289. 71 Fouassier, J.P. Photoinitiation, Photopolymerization And Photocuring, Hanser Gardner Publications, 1995, p.145-237. CAPITULO1 22 electrónicos mediante fotolitografía. Estas reacciones también se utilizan para la fabricación de implantes dentales, lentes de contacto y otros dispositivos en aplicaciones médicas. A continuación se va a revisar muy brevemente el proceso de fotopolimerización en cadena, que es el más utilizado en el campo de los fotopolímeros, para posteriormente repasar otros procesos de fotopolimerización menos frecuentes pero relacionados con este trabajo como son la fotopolimerización por reacción de enlaces múltiples con tioles (tiol-enos y tiol-inos) y la fotopolimerización por descomposición de sales de diazonio. La fotopolimerización en cadena es un tipo de polimerización en el cual, a través de un proceso fotoinducido, se genera una especie radicalaria o iónica (a partir de un iniciador) que por reacción con el grupo reactivo del monómero o macromonómero genera una cadena polimérica activada en un extremo. Este extremo activo se transfiere de una unidad monomérica a otra conforme éstas se van incorporando a la cadena en crecimiento (propagación de la cadena). Esta especie reactiva puede ser por ejemplo un catión orgánico como en la polimerización de epóxidos y viniléteres. No obstante, el más común es el proceso de fotopolimerización en cadena radicalaria de compuestos con dobles enlaces, entre los que destacan los derivados acrílicos. Si nos centramos en la fotopolimerización en cadena radicalaria, el mecanismo consta de tres etapas básicas: iniciación, propagación y terminación. En la primera etapa se forma un radical libre por escisión homolítica de un enlace por vía fotoquímica. Esto requiere, en general, de una molécula fotosensible (fotoiniciador) que genere radicales libres por acción de la luz.72 A continuación este radical se adiciona a un monómero para generar la cadena polimérica reactiva (figura 5). En la etapa de propagación o de  72 Hageman HJ. Photoinitiators and Photoinitiation Mechanisms of Free-Radical Polymerization Processes. Finch, C.A., Allen, N.S. (Editor). Photopolymerisation and Photoimaging Science and Technology. Elsevier, Applied Science, London, New York, 1989, p.1-53. CAPITULO1 23 crecimiento de cadena, la cadena polimérica reactiva reacciona con más unidades monoméricas de tal forma que, tras la adición de cada monómero, en el extremo queda siempre un radical que puede seguir reaccionando (figura 5). En cada proceso de adición interviene una cadena polimérica reactiva y una molécula de monómero, por lo que la velocidad de este proceso estará controlada por la concentración de estas dos especies. En la etapa de terminación el radical de la cadena polimérica reacciona con otra especie distinta del monómero por combinación (unión de ambos radicales macromoleculares) o desproporción (transferencia de un hidrógeno de una cadena a otra), de forma que no se genera otro radical reactivo y la cadena deja de crecer. En la figura 5 se esquematizan estos dos procesos de terminación bimoleculares. La desactivación de cadenas en crecimiento puede producirse también por reacción con especies del entorno como disolvente, oxígeno o moléculas de fotoiniciador entre otras. Iniciación: I  I· I· + M  P1· Propagación: Pi· + M  Pi+1· Terminación: Pi· + Pj·  Pi+j Combinación P i· + Pj·  Pi + Pj Desproporción  Fig. 5. Esquema básico de las etapas de iniciación, propagación y terminación en un proceso de fotopolimerización en cadena radicalaria. 1.2.1.1. Fotopolimerización de tiol-enos y tiol-inos El proceso conocido como reacción de tiol-enos está basado en la adición de un grupo tiol a un doble enlace creando un enlace tioéter. Este proceso, que puede ser una adición tipo Michael a dobles enlaces deficientes en electrones o puede transcurrir por CAPITULO1 24 un mecanismo radicalario fotoiniciado,73, 74 permite la formación de redes poliméricas si se utilizan moléculas con varios grupos tiol y varios grupos alqueno como los de la figura 6. Fig. 6. Estructura química de tioles multifuncionales (a, b) y alquenos multifuncionales (c, d, e) utilizados en fotopolimerización por reacción de tiol-enos. En el caso del proceso radicalario, los grupos tiol (en forma de radicales tiilo) pueden reaccionar también con triples enlaces formando un viniltioéter capaz de reaccionar con un segundo grupo tiol.75 Este proceso fue aplicado por primera vez en la obtención de redes poliméricas con monómeros multifuncionales por Bowman y colaboradores.76 Este proceso fue estudiado con el alquino difuncional 1,9-decadiino (DDY) y el tetratiol tetrakis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritoílo (PETMP) representados en la figura 7.  73 Hoyle, C.E., Bowman, C.N. Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 1540-1573. 74 Lowe, A.B. Polym. Chem., 2010, 1, 17-36. 75 Lowe, A.B., Hoyle, C.E., Bowman, C.N. J. Mater. Chem., 2010, 20, 4745-4750. 76 Fairbanks, B.D., Scott, T.F., Kloxin, C.J., Anseth, K.S., Bowman, C.N. Macromolecules, 2009, 42, 211-217. b)  a) c) d) e) N N N OO O O O SH O O SHO O HS N N N O O O CAPITULO1 31 1.2.2.1. Fotolitografía Las técnicas fotolitográfícas hacen uso de radiación electromagnética para llevar a cabo una modificación selectiva de unas zonas del material fotosensible (figura 9).95, 96 Mediante este proceso se introduce un cambio de solubilidad entre zonas irradiadas y no irradiadas que permite eliminar selectivamente una de estas zonas. En las técnicas de fotolitografía con máscara, la irradiación a través de ésta se realiza con un haz de luz colimado. La máscara, con zonas transparentes y opacas, se pone en contacto con la película fotosensible de manera que el proceso de irradiación permite transferir el patrón de la máscara a la fotorresina. En el caso de materiales fotopolimerizables, como los mencionados en el apartado 1.2.1, la irradiación produce la polimerización del material en las zonas irradiadas (fotorresinas negativas), disminuyendo la solubilidad en estas regiones. El uso de un disolvente selectivo elimina el monómero de las zonas no irradiadas quedando al descubierto las zonas irradiadas fijadas al sustrato. Esta técnica permite preparar estructuras de relieve superficial sobre un sustrato, quedando éste expuesto en las regiones no irradiadas. Existen otro tipo de resinas fotosensibles en las que las zonas irradiadas son las que se pueden eliminar con un disolvente selectivo (fotorresina positiva). Este tipo de resinas están basadas en sistemas que al ser expuestos a la luz evitan una posterior polimerización térmica o que producen una despolimerización del material. De esta forma, tras el lavado se obtiene una estructura polimérica que corresponde a las zonas opacas de la máscara, quedando el sustrato  95 Nie, Z., Kumacheva, E. Nat. Mater., 2008, 7, 277-290. 96 De Witz, C., Sánchez, C., Bastiaansen, C., Broer, D.J. Nanoand Microstructuring of Polymers. Meyer, T., Keurentjes, J. (Editors). Handbook of Polymer Reaction Engineering. Wiley-VCH Verlag GmbH , Weinheim, Germany, 2008, p.995-1014.  CAPITULO1 32 expuesto en las zonas en las que el polímero fue irradiado. Un ejemplo de las fotorresinas positivas son las basadas en diazidas. 97 Fig. 9. Fabricación de microestructuras mediante fotolitografía con máscara. La película de material fotosensible es irradiada selectivamente con una fuente de luz colimada que atraviesa una máscara con zonas opacas y zonas transparentes (a). La irradiación provoca la reacción fotoinducida (b) de forma que se pueden eliminar selectivamente las zonas expuestas (c1) o no expuestas (c2) mediante el lavado con un disolvente. La fotolitografía permite la fabricación de un gran número de estructuras con resoluciones en el orden de la longitud de onda de irradiación a partir de una máscara. Esta capacidad ha convertido a la fotolitografía en una pieza clave en la fabricación masiva de circuitos y dispositivos microelectrónicos. Alternativamente a la irradiación a través de una máscara puesta en contacto con la película de fotorresina, el proceso de sensibilización puede realizarse mediante un  97 Miyagawa, K., Naruse, K., Ohnishi, S., Yamaguchi, K., Seko, K., Numa, N., Iwasawa, N. Prog. Org. Coat., 2001, 42, 20-28. CAPITULO1 33 sistema de proyección, en el que la imagen de la máscara es proyectada con un sistema óptico adecuado sin necesidad de contacto con la muestra. 1.2.2.2. Técnicas de escritura láser El proceso de sensibilización selectiva de fotopolímeros descrito en el apartado anterior también puede llevarse a cabo mediante un haz de luz láser focalizado en la muestra que provoca la fotopolimerización de la zona irradiada (figura 10). En estas técnicas de escritura la irradiación se hace punto a punto (haz de luz láser fijo focalizado sobre un punto) de tal forma que, al mover la película de material fotopolimerizable (o el haz de luz láser), se puede obtener un dibujo predeterminado. Al igual que en la fotolitografía con máscara descrita, tras la irradiación de unas zonas determinadas se lleva a cabo la eliminación de las zonas no irradiadas mediante el lavado con un disolvente selectivo. Esta técnica de fabricación ofrece una gran libertad para crear estructuras de diferentes geometrías, sin necesidad de una máscara para cada diseño, mediante herramientas informáticas, reduciendo costes y tiempos de fabricación en series cortas. Al igual que las fotolitografías con máscara, la resolución alcanzada con este tipo de técnicas de escritura con láser, está limitada por la difracción de la luz y es por lo tanto del orden de la longitud de onda de la luz. CAPITULO1 34 Fig. 10. Fabricación de microestructuras mediante escritura directa con láser. La película fotopolimerizable es irradiada selectivamente con un haz de luz láser (a) de forma que las zonas no expuestas pueden ser eliminadas selectivamente con un disolvente (b). La sensibilización puede también llevarse a cabo mediante el uso de pulsos láser ultracortos (duración del pulso inferior al picosegundo) en el IR, fuera del rango de absorción de los fotopolímeros. Así se ha conseguido inducir en materiales fotopolimerizables basados en acrilatos procesos de absorción a dos fotones del fotoiniciador, generándose de este modo radicales que comienzan el proceso de polimerización. Al tratarse de procesos a dos fotones la probabilidad de absorción aumenta cuadráticamente con la intensidad de manera que la formación de radicales tiene lugar, de manera significativa, donde la intensidad de la luz es elevada. De esta manera, la polimerización tiene lugar fundamentalmente en el punto focal, donde la intensidad de la luz es máxima. Estos procesos permiten la obtención de resoluciones por debajo de la longitud de onda de la luz, por lo que este tipo de técnicas se han CAPITULO1 35 utilizado en diversos campos como la fotónica o la fabricación de biomateriales con motivos geométricos con tamaños de decenas o centenas de nanómetros.98 Mediante el uso de estas técnicas de microestructuración con un haz de luz láser focalizado es posible generar estructuras tridimensionales. Así, la estereolitografía permite obtener estructuras tridimensionales (3D) mediante la generación de sucesivas capas bidimensionales (2D). En este caso, la luz láser es focalizada sobre la superficie de una resina fotopolimerizable. La posición del haz está controlada por ordenador de forma que puede moverse en el plano XY para crear una estructura bidimensional de geometría controlada (figura 11). A continuación, una plataforma móvil desplaza hacia abajo la capa de material reticulado de forma que ésta queda cubierta con una nueva capa delgada de resina fotopolimerizable. Esta nueva capa de resina se fotopolimeriza de la misma forma y así sucesivamente hasta obtener un objeto tridimensional. Esta técnica tiene utilidad en diversas aplicaciones como la fabricación de microtransductores, o en la preparación de implantes ya que permite el prototipado rápido.99, 100  98 Zhang, Y.L., Chen, Q.D., Xia, H., Sun, H.B. Nano Today, 2010, 5, 435-448. 99 Dufaud, O., Le Gall, H., Corbel, S. Chem. Eng. Res. Des., 2005, 83, 133-138. 100 Melchels, F.P.W., Feijen, J., Grijpma, D.W. Biomaterials, 2010, 31, 6121-6130. CAPITULO1 36 Fig. 11. Sistema para la fabricación de estructuras tridimensionales mediante estereolitografía (a). Componente tridimensional obtenido mediante apilamiento de sucesivas capas bidimensionales (b). 1.2.2.3. Otras técnicas de microestructuración de fotopolímeros Existen otras técnicas que permiten llevar a cabo un proceso de estructuración mediante el moldeo de una resina fotopolimerizable y una posterior irradiación con luz. Esta irradiación provoca la fotopolimerización del material, que mantiene la estructura complementaria del molde o sello. Una de las técnicas más importantes en este grupo, es la litografía por nanoimpresión (nanoimprinting lithography - NIL) con una resina líquida fotopolimerizable curada con luz UV (UV-NIL). En esta técnica, la estructuración se consigue realizando presión con un sello trasparente sobre una capa de resina líquida fotopolimerizable. 101, 102 Una vez estructurada, la resina fotopolimerizable es irradiada para llevar a cabo su polimerización. La resolución de esta técnica está en el orden de las decenas de nanómetros (mejor resolución que la obtenida mediante otras técnicas como la fotolitografía o la escritura láser que están limitadas por la difracción de la luz)  101 Guo, L.J. Adv. Mater., 2007, 19, 495-513. 102 Guo, L.J. J. Phys. D. 2004, 37, 123-141. CAPITULO1 37 y permite la fabricación a gran escala de estructuras a partir de un sello. A diferencia de las fotolitografías descritas anteriormente, en las estructuras obtenidas mediante UVNIL queda una película residual en las zonas correspondientes a salientes del sello (véase figura 12). Esta película se puede eliminar mediante la irradiación con un haz de iones, que elimina una fina capa de las estructuras generadas. Fig. 12. Fabricación de microestructuras mediante litografía por nanoimpresión con luz UV (UV-NIL). La resina líquida fotopolimerizable se estructura con un sello transparente (a, b) se irradia con luz UV (c) para dar lugar a un material micro o nanoestructurado (d). La capa de material residual que queda en las zonas más finas se elimina con un haz de iones (e). Existen otras alternativas basadas en moldes transparentes como el micromoldeo por capilares (MIMIC) 103 que evitan la formación de esta película residual en todo el sustrato. En esta técnica la estructuración de la resina fotopolimerizable se hace colocando el sello sobre el sustrato de forma que haya contacto conformal entre ambas superficies, y a continuación se llenan los huecos entre el sustrato y las hendiduras del  103 Xia, Y., Whitesides, G.M. Annu. Rev. Mater. Sci. 1998, 28, 153-184. CAPITULO1 38 sello con la resina fotopolimerizable que se introduce en estos huecos por capilaridad. A continuación se irradia (al igual que en la técnica de UV-NIL) para curar el fotopolímero de modo que al retirar el sello queda el patrón complementario (o réplica inversa) en el que el sustrato queda expuesto al aire en las zonas correspondientes a los salientes del molde (figura 13).  Fig. 13. Fabricación de microestructuras mediante micromoldeo por capilares (MIMIC). Pegado del sello al vidrio por contacto conformal (a), llenado de huecos por capilaridad (b), irradiación con luz UV (c) y retirada del sello (d). En este apartado 1.2.2 se han revisado brevemente algunas de las técnicas disponibles para la estructuración de fotopolímeros. Cada una de estas técnicas posee ventajas e inconvenientes en cuanto a resolución, procesabilidad, rendimiento o coste, por lo que la utilización de una u otra técnica va a depender de las necesidades específicas del proceso de estructuración. CAPITULO1 39 1.3. BIOMATERIALES BASADOS EN FOTOPOLÍMEROS Cómo se ha descrito en el primer apartado de este capítulo de Antecedentes, el desarrollo de biomateriales para aplicaciones biomédicas requiere del control de diferentes parámetros tales como la velocidad de degradación, la composición química, las propiedades mecánicas o la estructura18, 19, 20 Las particularidades de las reacciones de fotopolimerización (reacciones rápidas y eficientes, a temperatura ambiente y desencadenadas por un estímulo externo desacoplado de la temperatura u otro cambio químico) así como la posibilidad de estructuración (control espacio-temporal) han hecho de éstas, unas técnicas muy atractivas para la preparación de biomateriales. Este tipo de reacciones permite además modificar las propiedades del material (por ejemplo las mecánicas) controlando la estructura química del monómero,34 el tipo de grupo reactivo,76, 77, o el porcentaje de agente reticulante79 entre otros factores que intervienen en la reacción de fotopolimerización. Todas estas características permiten llevar a cabo la preparación de biomateriales estructurados y con propiedades controladas de una manera rápida y sencilla. Entre las reacciones de fotopolimerización conocidas, la más empleada dentro del campo de biomateriales es la polimerización radicalaria de acrilatos que se ha utilizado para diversas aplicaciones en Medicina. Sin embargo, el proceso de fotopolimerización basado en la química de tiol-enos ha suscitado un gran interés últimamente ya que evita la formación de cadenas carbonadas no biodegradables como ocurre en el caso de los poliacrilatos. Esto supone una ventaja en determinadas aplicaciones biomédicas en las que es deseable una completa degradación del material. En los siguientes apartados se hará una revisión de la bibliografía sobre preparación de biomateriales por fotopolimerización mediante estas dos reacciones, la de acrilatos por CAPITULO1 40 ser referente en este campo de trabajo y la de tiol-enos por ser antecedente directo de la de tiol-inos (estudiada en esta memoria). En el caso concreto de la fotodescomposición de sales de diazonio, no hay referencias previas en el campo de biomateriales (salvo las derivadas de esta tesis doctoral). 1.3.1. FOTOPOLIMERIZACIÓN RADICALARIA DE ACRILATOS EN BIOMATERIALES Los acrilatos se han utilizado en diversas aplicaciones médicas como la fabricación de cementos acrílicos. Para ello se han preparado sistemas inyectables basados en acrilatos con iniciadores radicalarios térmicos.7 Se han estudiado también la formación de hidrogeles mediante polimerización de monómeros hidrófilos funcionalizados con grupos acrílicos.32 Estos hidrogeles, que se pueden formar por vía térmica, pueden también ser generados por fotopolimerización. Tienen aplicación tanto en la fabricación de lentes de contacto como en la preparación de sistemas implantables tales como suturas, sistemas para liberación controlada de fármacos o andamiajes para Ingeniería de Tejidos. En los siguientes apartados se va a hacer una revisión de los estudios llevados a cabo en la preparación de biomateriales mediante fotopolimerización de monómeros y macromonómeros acrílicos sintéticos y derivados de polímeros naturales. 1.3.1.1. Fotopolimerización de polímeros sintéticos Dentro de los polímeros sintéticos, el PEG es el más utilizado en la obtención de hidrogeles por fotopolimerización para aplicaciones médicas debido a su alta CAPITULO1 47 mediante una adición de Michael de los grupos tiol del polímero (contenidos en el aminoácido cisteína del mismo) a los grupos acrílicos de un compuesto bifuncional (esquema 6). Al añadir este compuesto en exceso, tras la funcionalización quedan grupos fotopolimerizables libres capaces de formar entrecruzamientos durante el proceso de fotopolimerización. Esquema 6. Funcionalización del fibrinógeno con derivados acrílicos de PEG mediante adición de tipo Michael.129 1.3.1.3. Estructuración con luz de fotopolímeros acrílicos en biomateriales En el apartado 1.1.1.2 se ha comentado que el andamiaje para la regeneración de un tejido vivo ha de mimetizar, en la medida de lo posible, al tejido vivo natural. Esto incluye la microestructura ya que en la mayor parte de tejidos, como por ejemplo el vascular, las fibras de la ECM que actúan como soporte estructural (y las propias células alojadas en la ECM) presentan una determinada orientación que provoca una respuesta anisótropa de dichas células y del tejido.130 Estudios detallados de la ECM han  130 Engelmayr, G.C., Cheng, M., Bettinger, C.J., Borenstein, J.T., Langer, R., Freed, L.E. Nat. Mater. 2008, 7, 1003-1010. CAPITULO1 48 mostrado un gran nivel de complejidad en la composición química y la topografía de la superficie, que presenta determinadas características geométricas a escala micro y nanométrica que son específicas para cada tejido. Estas características topográficas podrían servir de pista biológica para las células que pueden modificar su adhesión, movilidad, orientación o incluso diferenciación.18, 19, 20, 22 La influencia de la estructura o la topografía superficial en el comportamiento celular se ha utilizado para controlar la morfología y dirigir la actividad de las células en andamiajes tridimensionales porosos131, 132 o sustratos planos133, 134, 135 generados artificialmente. En este marco, la posibilidad de estructurar los fotopolímeros para poder generar andamiajes con arquitectura y topografía definidas hacen de estos materiales una plataforma muy interesante para aplicaciones en Ingeniería de Tejidos. Entre los diferentes procesos de fotopolimerización, la polimerización radicalaria de acrilatos ha sido el más utilizado en la generación de andamiajes por lo que a continuación se va a revisar brevemente su aplicación para este fin. La estereolitografía, descrita en el apartado 1.2.2.2., permite crear andamiajes porosos tridimensionales a partir de resinas de fotopolímeros. Al ser una técnica de escritura con láser, puede aplicarse para generar andamiajes a la carta cuyo diseño puede definirse con precisión mediante herramientas informáticas que permitan controlar el proceso de irradiación. La combinación de técnicas de imagen médica con esta técnica de estructuración permite obtener andamiajes que además de tener la estructura porosa adecuada, tengan un tamaño y una forma personalizados según el  131 Zhang, F., He, C., Cao, L., Feng, W., Wang, H., Mo, X., Wang, J. Int. J. Biol. Macromol., 2011, 48, 474-481. 132 Kim, K., Dean, D., Wallace, J., Breithaupt, R., Mikos, A.G., Fisher, J.P. Biomaterials, 2011, 32, 37503763. 133 Bettinger C.J., Orrick, B., Misra, A., Langer, R., Borenstein, J.T. Biomaterials, 2006, 27, 2558-2565. 134 Estévez, M., Fernández-Ulibarri, I., Martínez, E., Egea, G., Samitier, J. Soft Matter, 2010, 6, 582-590. 135 Schulte, V.A., Díez, M., Möller, M., Lensen, M.C. Biomacromolecules, 2009, 10, 2795-2801. CAPITULO1 49 tejido dañado del paciente. 136, 137, 138 Además, al ser un proceso de fabricación por capas, se pueden preparar andamiajes con una composición variable. 139 Típicamente, estos andamiajes tienen dimensiones milimétricas y están formados por estructuras geométricas sencillas con poros interconectados (figura 14) para permitir la migración celular y el transporte de nutrientes a través del mismo. 140, 141, 142 El tamaño de los poros, así como de los motivos geométricos que conforman la estructura, suele estar en el orden de las dimensiones celulares (decenas o centenas de micras) y puede controlarse durante el proceso de fabricación. Este control de la microestructura junto con la elección de los monómeros permite modular las propiedades físico-químicas del andamiaje 143, 132 y por ello la respuesta celular. 132 Fig. 14. Imágenes de SEM de andamiajes porosos generados por estereolitografía en formulaciones fotopolimerizables mediante reacción radicalaria de acrilatos.132, 143  136 Hutmacher, D.W., Sittinger, M., Risbud, M.V. Trends Biotechnol., 2004, 22, 354-362. 137 Liska, R., Schuster, M., Inführ, R., Turecek, C., Fritscher, C., Seidl, B., Schmidt, V., Kuna, L., Haase, A., Varga, F., Lichtenegger, H., Stampfl, J. J. Coat. Technol. Res., 2007, 4, 505-510. 138 Schuster, M., Turecek, C., Weigel, G., Saf, R., Stampfl, J., Varga, F., Liska, R. J. Polym. Sci. A, 2009, 47, 7078-7089. 139 Choi, J.W., Kim, H.C., Wicker, R. J. Mater. Process. Technol., 2011, 211, 318-328. 140 Matsuda, T., Mizutani, M. J. Biomed. Mater. Res., 2002, 62, 395-403. 141 Melchels, F.P.W., Feijen, J., Grijpma, D.W. Biomaterials, 2010, 31, 6121-6130. 142 Barry, J.J.A., Evseev, A.V., Markov, M.A., Upton, C.E., Scotchford, C.A., Popov, V.K., Howdle, S.M. Acta Biomater., 2008, 4, 1603-1610. 143 Lee, K.W., Wang, S.F., Fox, B.C., Ritman, E.L., Yaszemski, M.J., Lu, L.C. Biomacromolecules, 2007, 8, 1077-1084. CAPITULO1 50 Las técnicas de fotolitografía y de UV-NIL permiten generar superficies micro y nanoestructuradas sobre las que llevar a cabo el cultivo celular. La topografía de estas superficies puede tener una influencia importante en la respuesta celular tal y como se ha visto en diversos estudios. Así por ejemplo, los estudios de proliferación celular llevados a cabo sobre superficies de materiales bioestables como acrilatos o poliuretanos consistentes en una topografía periódica de líneas han demostrado la posibilidad de inducir una orientación preferente de las células.144, 145 En estas estructuras periódicas, cuyas líneas tienen alturas menores de la micra y están separadas por una distancia entre unas pocas micras y unas pocas decenas de micras, se ha probado que el grado de orientación de las células depende del espaciado entre las líneas, lo cual puede controlarse mediante el uso de estas técnicas de estructuración. Este tipo de sustratos pueden también inducir procesos de diferenciación de una línea celular a otra tal y como probaron Kim y colaboradores,146 que cultivaron células madre embrionarias humanas en sustratos de poliuretano reticulado por fotopolimerización radicalaria de acrilatos. Estos estudios revelaron un mayor grado de diferenciación de estas células en células neuronales, con morfología alargada, en sustratos con una topografía formada por líneas de unos 350 nm de anchura que en sustratos planos. Se ha observado también influencia de la topografía en superficies con salientes en forma de columna o pilar periódicamente distribuidos en la escala micro o nanométrica. Por ejemplo, en superficies de PEG con pilares salientes (también de PEG) de unos 100 nm de anchura y separados por distancias inferiores a la micra, se observó una buena adhesión celular, comportamiento que no se observa en sustratos  144 He, W., Halberstadt, C.R., Gonsalves, K.E. Biomaterials, 2004, 25, 2055-2063. 145 Kim, D.H., Han, K., Gupta, K., Kwon, K.W., Suh, K.Y., Levchenko. A. Biomaterials, 2009, 30, 54335444. 146 Lee, M.R., Kwon, K.W., Jung, H., Kim, H.N., Suh, K., Kim, K., Kim, K.S. Biomaterials, 2010, 31, 4360-4366. CAPITULO1 51 planos de PEG debido a la hidrofilia del polímero.147 Esto indica que las propiedades superficiales del material pueden verse modificadas mediante una distribución adecuada de los pilares en este tipo de estructuras, un parámetro que puede controlarse mediante fotolitografía o UV-NIL tal y como se ha comentado anteriormente. Este hecho se puede utilizar para modular la adhesión de las células en las distintas zonas del material y obtener así una migración controlada hacia las zonas donde las células muestran una mejor adhesión.148 1.3.2. FOTOPOLIMERIZACIÓN POR REACCIÓN DE TIOL-ENOS EN BIOMATERIALES Como se ha visto en el apartado 1.2.1.1, la fotopolimerización por adición de tioles a dobles enlaces (tiol-enos) presenta algunas ventajas sobre la fotopolimerización de acrilatos, como la formación de redes más homogéneas, lo que ha llevado a investigar esta reacción como alternativa en la reparación de defectos en piezas dentales.149, 150 Derivados acrílicos como el 2,2-bis[4-(2-hidroxi-3metacriloiloxipropiloxi)fenil]propano (bisGMA) (figura 15.a) y el dimetacrilato de trietilenglicol (TEGDMA) (figura 15.b), utilizados también en resinas acrílicas con esta misma aplicación,34 pueden ser reticulados por medio de tioles multifuncionales como el tetra(3-mercaptopropionato) de pentaeritritoílo (PETMP) (figura 15.c). Estos procesos de fotopolimerización dan lugar a la formación de redes con menores tensiones  147 Kim, P., Kim, D.H., Kim, B., Choi, S.K., Lee, S.H., Khademhosseini, A., Langer, R., Suh, K.Y. Nanotechnology, 2005, 16, 1-7. 148 Kim, D.H., Seo, C.H., Han, K., Kwon, K.W., Levchenko, A., Suh, K.Y. Adv. Funct. Mater., 2009, 19, 1579-1586. 149 Cramer, N.B., Couch, C.L., Schreck, K.M., Carioscia, J.A., Boulden, J.E., Stansbury, J.W., Bowman, C.N. Dent. Mater., 2010, 26, 21-28. 150 Cramer, N.B., Couch, C.L., Schreck, K.M., Boulden, J.E., Wydra, R., Stansbury, J.W., Bowman, C.N. Dent. Mater., 2010, 26, 799-806. CAPITULO1 52 mecánicas que sus homólogos basados únicamente en acrilatos a la vez que mantienen unas propiedades mecánicas similares.150 Fig. 15. Estructuras químicas del bisGMA (a), TEGDMA (b) y del PETMP (c), utilizados para relleno de piezas dentales por fotopolimerización de tiol-enos. Otra ventaja de estos procesos de fotopolimerización es que se evita la formación de cadenas carbonadas no biodegradables como ocurre en la polimerización de acrilatos (figura 16). De esta forma, si se utiliza un polímero degradable funcionalizado con dobles enlaces, y un reticulante de bajo peso molecular, la degradación de la red polimérica puede dar lugar a productos de bajo peso molecular (figura 16.b). Esta característica resulta interesante en algunas aplicaciones biomédicas como la Ingeniería de Tejidos o la liberación controlada de fármacos en los que se requiere una biodegradación in vivo, y que los productos resultantes no sean tóxicos y fácilmente excretables. b)  a) c) CAPITULO1 53 Fig. 16. Esquema de la degradación de una red polimérica generada por fotopolimerización radicalaria de acrilatos (a) y por fotopolimerización de tiol-enos (b). Los estudios llevados a cabo sobre sistemas tiol-eno han permitido conocer la influencia de la composición y las condiciones de fotopolimerización en las propiedades.151, 152, 153 En el ámbito de los biomateriales se han estudiado  151 Rydholm, A.E., Bowman, C.N., Anseth, K.S. Biomaterials, 2005, 26, 4495-4506. 152 Reddy, S.K., Anseth, K.S., Bowman, C.N. Polymer, 2005, 46, 4212-4222. 153 Rydholm, A.E., Reddy, S.K., Anseth, K.S., Bowman, C.N. Polymer, 2007, 48, 4589-4600. HS HS SH SH HS HS SH SH HS HS SH SH S SS S S SS S S SS S  S SS S S SS S S SS S   UV UV 37ºC PBS (pH 7.4) 37ºC PBS (pH 7.4)   a) b) Polímero biodegradable Cadena acrílica Reticulante multifuncional con grupos tiol HS HSSH SH CAPITULO1 54 fundamentalmente sistemas basados en PEG y polímeros naturales tal y como se va a comentar a continuación. Entre estos estudios se encuentran los llevados a cabo por Anseth y colaboradores (grupo de referencia en este tipo de materiales) que se centran principalmente en copolímeros bloque de polihidroxialcanoatos y PEG funcionalizados con dobles enlaces (figura 17.a) que se entrecruzan con reticulantes tiolados multifuncionales (figuras 17.c y 17.d). De esta forma se consiguen materiales biodegradables en los que se pueden modificar las propiedades del material controlando la composición de la mezcla fotopolimerizable. Por ejemplo la utilización del reticulante tiolado multifuncional en defecto lleva a un proceso de polimerización mixto de acrilatos / tiol-enos.151, 152 Este proceso de fotopolimerización mixto hace que se generen cadenas acrílicas no biodegradables que ralentizan la velocidad de degradación, efecto que también se consigue utilizando un tiol multifuncional sin enlaces hidrolíticamente lábiles (figura 17.f),153 o llevando a cabo el proceso en presencia de disolvente, lo que favorece las ciclaciones que limitan también la degradación.153 Todos estos parámetros (estequiometría, naturaleza del reticulante, concentración de las especies reactivas…) proporcionan una gran versatilidad para obtener redes poliméricas con propiedades definidas y modulables. CAPITULO1 55 Fig. 17. Estructura química de los polímeros con dobles enlaces (a, b) y de los tioles multifuncionales (c, d, e, f) utilizados por el grupo de Anseth para estudiar la degradabilidad de las redes poliméricas generadas por fotopolimerización de tiol-enos.151, 153 Respecto a las aplicaciones biomédicas, se ha estudiado el uso de estas redes de PEG como sistemas transportadores de células para terapia celular debido a la biocompatibilidad del PEG. Con este fin, se ha descrito la funcionalización del PEG con dobles enlaces (grupos acrilato o grupos fumarato) para su reticulación utilizando una cadena de PEG con grupos tiol en sus extremos.154 Se ha estudiado la biofuncionalización de estos materiales con biomoléculas para favorecer la adhesión celular. Para ello se han utilizado péptidos con grupos cisteína (que contienen grupos tiol) que actúan como reticulante de los polímeros de PEG con dobles enlaces (figura 18). Estos materiales, gracias a la bioactividad del reticulante peptídico, pueden favorecer determinados procesos biológicos como la  154 Brink, K.S., Yang, P.J., Temenoff, J.S. Acta Biomater., 2009, 5, 570-579. c) d) e) f)  a) b) CAPITULO1 56 diferenciación celular, 155, 156, 157, 158, 159 o la actividad de un determinado tipo de células funcionales como las pancreáticas. 160, 161 Esta estrategia de reticular un polímero como el PEG con péptidos puede ser utilizada también en liberación controlada de fármacos. Se ha descrito por ejemplo la reticulación del PEG con un péptido que es reconocido específicamente por una enzima para que la carga sea liberada solamente en presencia de dicha enzima. 162 Fig. 18. Esquema de la fotorreticulación de un polímero biodegradable funcionalizado con dobles enlaces mediante química de tiol-enos utilizando un péptido con grupos cisteína como agente reticulante.  155 Salinas, C.N., Cole, B.B., Kasko, A.M., Anseth, K.S. Tissue Eng., 2007, 13, 1025-1034. 156 Salinas, C.N., Anseth, K.S. Biomaterials, 2008, 29, 2370-2377. 157 Cushing, M.C., Liao, J.T., Jaeggli, M.P., Anseth, K.S. Biomaterials, 2007, 28, 3378-3387. 158 Salinas, C.N., Anseth, K.S. J. Biomed. Mater. Res. A, 2009, 90, 456-464. 159 Anderson, S.B., Lin, C.C., Kuntzler, D.V., Anseth, K.S. Biomaterials, 2011, 32, 3564-3574. 160 Lin, C.C., Anseth, K.S. Biomacromolecules, 2009, 10, 2460-2467. 161 Lin, C.C., Anseth, K.S. PNAS, 2011, 108, 6380-6385. 162 Aimetti, A.A., Machen, A.J., Anseth, K.S. Biomaterials, 2009, 30, 6048-6054. CAPITULO2 63 Como se ha visto en el capítulo de Antecedentes, las reacciones de fotopolimerización son una herramienta interesante en la preparación de biomateriales ya que pueden realizarse a temperatura ambiente, de forma eficiente y permiten modular las propiedades de una forma sencilla. Estas reacciones permiten además estructurar el material lo que permite diseñar su topografía e influir así en los procesos celulares, tal y como se ha comentado anteriormente. Dentro de este tipo de procesos, las reacciones de fotopolimerización por reacción de dos grupos funcionales (como la de tiol-enos) permiten la obtención de materiales que pueden ser totalmente degradados, lo que supone una ventaja respecto a la fotopolimerización radicalaria de acrilatos, que es la técnica más utilizada hasta el momento. El objetivo general de esta tesis doctoral es el estudio de dos reacciones de fotopolimerización alternativas a la fotopolimerización de acrilatos, la reacción fotoiniciada de tiol-inos y la fotodescomposición de las sales de diazonio, para la fabricación de estructuras poliméricas con geometría controlada que pueden ser útiles como soportes para el cultivo de células. Este tipo de reacciones no habían sido estudiadas previamente en este campo de biomateriales hasta el comienzo de esta tesis doctoral, y se pretende estudiar su potencial como alternativa a los fotopolímeros convencionales en la preparación de biomateriales. 2.1. SALES DE DIAZONIO Respecto a la reacción de fotodescomposición de sales de diazonio se han planteado los siguientes objetivos específicos: CAPITULO2 64 i) Síntesis de un nuevo reticulante de bajo peso molecular basado en sales de diazonio para evitar el uso de las sales de diazonio poliméricas no degradables utilizadas hasta el momento. ii) Estudio de la reacción de fotorreticulación con polímeros modelo para verificar la viabilidad de la estructuración con luz de películas poliméricas mediante la fotodescomposición de sales de diazonio. iii) Estudio de la fotorreticulación de biopolímeros y polímeros biodegradables sintéticos para la generación de soportes para cultivo celular. iv) Estudio de la biocompatibilidad de los materiales generados. v) Microestructuración con luz de los fotopolímeros. vi) Estudio de la influencia de la topografía en la adhesión y proliferación celular. Los estudios asociados a estos objetivos específicos se describen en los capítulos 3, 4 y 5 de esta memoria. El capítulo 3 recoge los resultados correspondientes a los polímeros modelo, estudio de la reacción y la posibilidad de microestructuración. Los capítulos 4 y 5 recogen los estudios realizados con fotopolímeros basados en polímeros naturales y sintéticos respectivamente, que incluyen los estudios de viabilidad celular, la microestructuración del material y el estudio de la influencia de la microestructura en el crecimiento celular. CAPITULO2 65 2.2. TIOL-INOS Para el estudio de la reacción fotoinducida de tiol-inos, cuyos resultados se recogen en el capítulo 6 de esta tesis, se plantearon los siguientes objetivos específicos: i) Síntesis de nuevos polímeros con grupos alquino terminales para la preparación de formulaciones fotorreticulables por química de tiol-inos. ii) Preparación de materiales con distinto grado de reticulación. iii) Estudio del proceso de fotorreticulación y caracterización de los materiales obtenidos con distinto grado de reticulación. iv) Estudio de la biocompatibilidad de los materiales obtenidos con distinto grado de reticulación. v) Microestructuración con luz de los fotopolímeros. vi) Estudio de la influencia de la topografía en la adhesión y proliferación celular. CAPITULO2 66 3. FOTORRETICULACIÓN DE POLÍMEROS MODELO CON UNA SAL DE DIAZONIO TRIFUNCIONAL (parte de los resultados de este capítulo han sido publicados en las revistas European Polymer Journal, 2009, Vol. 45, p. 1785-1790 y Carbohydrate Polymers, 2012, Vol. 90, p. 419-430) CAPITULO3 69 3.1. INTRODUCCIÓN La descomposición fotoinducida de los grupos diazonio permite la fotorreticulación de polímeros que contengan, por ejemplo, grupos hidroxilo,1 sulfonato,2 carboxilato3 o fosfato.4, 5 Hasta la fecha este proceso de reticulación se ha llevado a cabo principalmente con una sal de diazonio polimérica (figura 1) cuya estructura no está del todo definida (véase apartado 1.2.1.2). Se ha estudiado el uso de estos materiales como fotorresinas para aplicaciones de litografía2, 6, 7, 8 y en la fabricación de sistemas electroópticos.3, 9, 10, 11, 12 Esta sal de diazonio polimérica se ha utilizado también en otras aplicaciones como la implementación de biosensores por reticulación de DNA,4, 5 o la encapsulación de enzimas en vesículas de poliestirensulfonato (PSS),13 si bien no se ha descrito su uso para la preparación de sustratos o andamiajes para el crecimiento de células o ingeniería de tejidos. Fig. 1. Estructura química de la sal de diazonio polimérica utilizada para fotorreticulación.  1 Chen, J., Cao, W. Chem. Commun., 1999, 1711-1712. 2 Cao, W., Ye, S., Cao, S., Zhao, C. Macromol. Rapid Commun., 1997, 18, 983-989. 3 Cao, T., Yang, S., Cao, J., Zhang, M., Huang, C., Cao, W. J. Phys. Chem. B, 2001, 105, 11941-11944. 4 Yu, B., Cong, H.L., Liu, H.W., Lu, C.H., Wei, F., Cao, W. Anal. Bioanal. Chem., 2006, 384, 385-390. 5 Li, Q., Ouyang, J., Chen, J., Zhao, X., Cao, W. J. Polym. Sci. A, 2002, 40, 222-228. 6 Luo, H., Yang, B., Yang, L., Cao, W. Macromol. Rapid Commun., 1998, 19, 291-294. 7 Zhang, Y., Cao, W. J. Polym. Sci. A, 2000, 38, 2566-2571. 8 Liu, J.H., Lee, S.Y., Tsai, F.R. J. Appl. Polym. Sci., 1998, 70, 2401-2407. 9 Zhao, S., Zhang, K., Yang, M., Sun, Y., Sun, C. Mater. Lett., 2006, 60, 2406-2409. 10 Cao, T., Yang, S., Yang, Y., Huang, C., Cao, w. Langmuir, 2001, 17, 6034-6036. 11 Cao, T., Wei, L., Yang, S., Zhang, M., Huang, c., Cao, W. Langmuir, 2002, 18, 750-753. 12 Zhang, L., Peng, Z., Yao, L., Lv, F., Xuan, L. J. Mater. Chem., 2007, 17, 3015-3022. 13 Srivastava, R., Brown, J.Q., Zhu, H., McShane, J. Biotechnol. Bioeng., 2005, 91, 124-131. CAPITULO3 70 Esta reacción presenta una serie de características que la convierten en una estrategia interesante para la preparación de biomateriales. En primer lugar, al ser un proceso de fotorreticulación que implica dos grupos funcionales, es posible evitar la formación de cadenas carbonadas largas no biodegradables, como sucede en la polimerización de acrilatos, que podrían llegar a acumularse en el organismo.Además, es un proceso que no requiere fotoiniciador, que podría (él o alguno de los subproductos generados) generar una respuesta inflamatoria.14 Su reactividad con grupos nucleófilos, presentes en muchos polímeros utilizados en biomateriales como es el caso de los polisacáridos constituye una oportunidad para la preparación de biomateriales, ya que estos polímeros podrían ser reticulados sin necesidad de modificación química alguna. La naturaleza iónica de los grupos diazonio hace que el proceso de reticulación pueda tener lugar en medio acuoso en donde, además, se favorece la reacción por interacción electrostática6, 15 o mediante puentes de hidrógeno1, 9 entre los grupos reactivos. Esto supone evitar el uso de disolventes orgánicos e implica polímeros a fotorreticular que sean solubles en agua. Para la utilización de esta reacción en la preparación de biomateriales es recomendable la utilización de una sal de diazonio multifuncional de bajo peso molecular, en lugar de los derivados oligoméricos empleados habitualmente. De esta forma se evita la formación de residuos de cadena larga y se reduce el riesgo de acumulación en el organismo. Sin embargo, hasta la fecha sólo se ha descrito la utilización de una sal de diazonio de bajo peso molecular como reticulante.16 Este reticulante, preparado por Cao y colaboradores, es un derivado de bifenilo con dos  14 Fridovich, I. J. Exp. Biol., 1998, 201, 1203-1209. 15 Chen, J., Luo, H., Cao, W. Polym. Int., 2000, 49, 382-386. 16 Cao, W., Cui, P., Wang, R. J. Imag. Sci. Technol., 2000, 44, 174-176. CAPITULO3 71 grupos diazonio (figura 2) que se utilizó para la preparación de fotorresinas mediante reticulación de PSS por vía térmica y fotoquímica. Fig. 2. Estructura química de la sal de diazonio bifuncional utilizada para reticular PSS.16 En este capítulo se describe la síntesis de un nuevo reticulante trifuncional de bajo peso molecular, el cloruro de N,N,N-tris((4-diazofenil)amina), que se va a utilizar para el entrecruzamiento de diversos polímeros modelo como el poliestirensulfonato de sodio (PSS), el poliacrilato de sodio (PAA) o el polivinil alcohol (PVA), que contienen diferentes grupos nucleófilos como son el grupo sulfonato, carboxilato e hidroxilo respectivamente (esquema 1). Para ello llevará a cabo la preparación de películas fotorreticulables por la técnica de spin coating y se caracterizará el proceso de irradiación por técnicas espectroscópicas. Se estudiará también la posibilidad de aplicar técnicas de microestructuración con luz como la fotolitografía para generar estructuras poliméricas de geometría controlada. CAPITULO3 72 Esquema 1. Reticulación de un polímero con grupos nucleófilos mediante fotodescomposición del reticulante objetivo de este capítulo. 3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.2.1. SÍNTESIS DEL RETICULANTE La sal de diazonio trifuncional utilizada como reticulante se sintetizó por diazotización de la N,N,N-tri(4-aminofenil)amina. Esta fue seleccionada como precursor porque el átomo de N central mejora la estabilidad de los grupos diazonio. 17 La reacción de diazotización se realiza con nitrito de sodio (NaNO 2 ) en medio ácido y a cero grados. Una vez formada la sal de diazonio trifuncional, ésta se aísla para su caracterización por 1 H-RMN y espectroscopias IR y UV-Vis mediante precipitación de un complejo con ZnCl 2 a partir de la disolución acuosa, según un procedimiento previamente descrito. 17  17Cao,S.,Zhao,C.,Cao,W.Polym.Int.,1998,45,142‐146. CAPITULO3 79 Fig. 7. Fotografías de microscopio óptico de polarización en películas de PSS-27 (a), PAA-30 (b) y PVA30 (c). Los grupos diazonio pueden sufrir procesos de descomposición por acción de la luz, pero también por vía térmica. Esto podría dificultar un manejo apropiado de las muestras desde su preparación hasta su irradiación, en la que se produce la descomposición fotoquímica de los grupos diazonio. Se ha descrito en la bibliografía que una interacción iónica, como la que tiene lugar en disolución entre una diazorresina polimérica y un compuesto aniónico, reduce la degradación térmica de los grupos diazonio. 6 Este tipo de interacción puede tener lugar también en películas (estado sólido) preparadas a partir de disoluciones de la sal de diazonio y polímeros aniónicos, en donde dicha interacción iónica se ve favorecida por la falta de movilidad de las cargas en estado sólido. Sin embargo, no se han descrito estudios para comprobar la estabilidad CAPITULO3 80 en este tipo de películas. Por ello, se llevó a cabo un estudio de la estabilidad térmica de los grupos diazonio tomando las películas fotorreticulables PSS-27 como modelo. El proceso de descomposición de la sal de diazonio se siguió por observación de la banda de absorción correspondiente a la transición π-π* de los grupos diazonio, que en película presenta el máximo en torno a 424 nm, desplazado respecto al PEC en disolución debido a interacciones en el estado sólido. En primer lugar se aplicó un tratamiento a una temperatura moderada a una película fotorreticulable de PSS-27. Esta película se calentó durante 15 min a 60ºC, no observándose ningún cambio en el espectro de absorción antes y después de aplicar dicho tratamiento térmico (figura 8.a). Esto indica una buena estabilidad térmica de las películas a esta temperatura, muy superior a temperatura ambiente. A continuación se determinó la temperatura a la cual comienzan a descomponer significativamente los grupos diazonio. Para ello se aplicaron sucesivos calentamientos de corta duración y cada vez a mayor temperatura (figura 8.b). En la figura 8.b puede verse como el calentamiento a temperaturas cercanas a los 90ºC comienza a provocar un descenso en la banda a 424 nm lo que se asocia a la descomposición de los grupos diazonio. Sucesivos tratamientos térmicos a temperaturas superiores a los 90ºC hicieron disminuir esta banda de absorción hasta cero, lo que indica la completa descomposición de los grupos diazonio a temperaturas superiores a los 160ºC. El porcentaje de grupos diazonio descompuesto tras cada uno de los sucesivos tratamientos térmicos puede calcularse a partir de la absorción de la banda a 424 nm (inset figura 8.b), según la ecuación: %ó󰇛%󰇜 󰇛.󰇜 CAPITULO3 81 Donde Aa es la absorbancia medida a 424 nm tras el tratamiento térmico correspondiente y Ao es la absorbancia de la película fotorreticulable a 424 nm justo después de ser preparada y antes de realizar ningún calentamiento. La banda de absorción se normalizan en relación al máximo de absorción de la banda π-π* de la película inicial, que es la que da un valor de absorbancia más elevado a 424 nm. Fig. 8. Espectros de absorción UV-Vis de películas fotorreticulables, sobre sustratos de vidrio, de PSS-27 antes y después de aplicarles un tratamiento térmico a 60ºC durante 15 min (a), o sucesivos tratamientos térmicos a temperaturas cada vez más elevadas (b). Estos sucesivos tratamientos térmicos se aplicaron durante 1 min a cada temperatura (véase inset para ver las temperaturas a las que se detecta descomposición) De este estudio se concluye que las películas, una vez preparadas, tiene cierta estabilidad, no reticulan de forma térmica, y pueden ser manipuladas sin necesidad de extremar las condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente antes de irradiar. En todo caso, para minimizar posibles degradaciones, se trabaja siempre con películas recién preparadas. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) PSS‐27 PSS‐27(15min60ºC) a) b) TºC 0 50 100 0 50 100 150 % descomposición Temperatura (ºC) CAPITULO3 82 3.2.4. FOTORRETICULACIÓN DE LOS POLÍMEROS MODELO Tras estudiar la interacción de los grupos sulfonato con los grupos diazonio y la estabilidad de las películas fotorreticulables de PSS-27, usadas como referencia, se llevó a cabo la irradiación con luz UV de películas de los tres sistemas modelo para estudiar el proceso de fotorreticulación con polímeros con grupos sulfonato, carboxilato o hidroxilo, mediante espectroscopia UV-Vis e IR. Como se ha descrito anteriormente, los grupos diazonio muestran una banda de absorción a 428 nm en disolución acuosa que también aparece en las películas fotorreticulables preparadas sobre sustratos de vidrio, en este caso aparece desplazada a menores longitudes de onda, próximas a 424 nm. Cuando estas películas son irradiadas con luz UV de 350-450 nm durante 2 min (ver parte experimental para las condiciones de irradiación), esta señal desaparece en todas las muestras (figura 9), lo que confirma que se produce la descomposición fotoquímica de los grupos diazonio.9, 18 CAPITULO3 83 Fig. 9. Espectros de absorbancia UV-Vis de PSS-27 (a), PAA-30 (b) y PVA-30 (c) antes y después de irradiar con luz UV. Para estudiar la reacción que se produce como consecuencia de la fotodescomposición, se registraron también los espectros de IR de las películas fotorreticulables antes y después de la irradiación. Se utilizaron las mismas condiciones que para la medida UV-Vis pero en este caso las películas fueron preparadas por spin coating sobre sustratos de fluorita (CaF2). En todos los casos la banda de absorción en torno a 2252 cm-1, debido a la vibración del triple enlace NN, desaparece tras la irradiación, lo que demuestra la descomposición fotoinducida de los grupos diazonio. También se puede ver una modificación de la banda sobre 1556 cm-1 debida a la vibración de los anillos aromáticos conjugados con los grupos diazonio.9 Tras la irradiación con luz UV, se puede ver en las figuras 10.a, 10.c y 10.e como estas bandas se desplazan a mayores números de onda como consecuencia de la pérdida del grupo diazonio y modificación del sustituyente del anillo. En las ampliaciones de las figuras  0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia nomralizada Longitud de onda (nm) PVA-30 antes de irradiar PVA-30 después de irradiar ‐0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) PSS-27 antes de irradiar PSS-27 después de irradiar 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) PAA-30 antes de irradiar PAA-30 después de irradiar a) b) c) CAPITULO3 84 10.b, 10.d y 10.f pueden verse también dos bandas alrededor de 1328 y 1288 cm-1 que se atribuyen a la vibración de los enlaces C-N que unen los anillos aromáticos con los grupos diazonio y con el N central, y que también se ven modificadas tras la irradiación con luz UV. Respecto a los grupos nucleófilos del polímero, el PSS tiene dos bandas superpuestas a 1215 cm-1 (hombro) y 1185 cm-1 que se asignan a la vibración del grupo sulfonato (figura 10.b). Tras la irradiación, la primera desaparece mientras que la otra se desplaza a 1176 cm-1 y junto con un hombro en 1155 cm-1 (figura 10.b). Este desplazamiento a menor número de onda se asocia a la formación del éster sulfónico.18 Para las películas de PAA-30 se puede ver una banda ancha alrededor de 1660 cm-1 (figura 10.c) que se atribuye a la vibración de los enlaces C=O de los grupos carboxilato. Tras la irradiación aparece una banda por encima de 1700 cm-1, que se atribuye a la formación de enlaces éster, y que aparece solapada con la anterior a 1660 cm-1 debido a los grupos carboxilato en exceso. Al mismo tiempo, al irradiar también se observa la aparición de una banda ancha en la zona de 1200-1300 cm-1 que se atribuye a la fotodescomposición del reticulante y la consiguiente formación de enlaces ésteres, que muestran bandas en esta región del espectro debido a la tensión del enlace C-O (figura 10.d). Las películas de PVA-30 muestran una banda ancha entre 1200 y 1300, que aparece solapada con las bandas de los grupos C-N del reticulante (figura 10.f) y que se atribuye a la vibración de los enlaces C-O de los grupos hidroxilo. Esta banda, junto a las de los grupos C-N del reticulante, se ve modificada tras el proceso de irradiación con luz UV, a la vez que aparece otra banda nueva a 1317 cm-1. Estos cambios se atribuyen a la fotodescomposición del reticulante y la consiguiente formación de grupos éter, que se solapan con los grupos hidroxilo en exceso del PVA. CAPITULO3 85 Además de los cambios espectrales detectados tras el proceso de irradiación, la reticulación del polímero matriz puede detectarse macroscópicamente por un cambio de solubilidad, por ejemplo en una disolución acuosa básica. Las películas dejan de ser solubles una vez irradiadas, lo que confirma la formación de una red entrecruzada. CAPITULO3 86 Fig. 10. Espectros IR de películas fotorreticulables de PSS-27 (a, b), PAA-30 (c, d) y PVA-30 (e, f) sobres sustratos de fluorita antes (línea continua) y después (línea discontinua) de irradiar con luz UV. Los espectros b, d y f son ampliaciones de los espectros a, c y e respectivamente.     60 70 80 90 100 1000150020002500 Transmitancia (%) Número de onda (cm -1 ) PAA-30 antes de irradiar PAA-30 después de irradiar C=O (carboxilato) C=O (éster) -N 2+ Ar (conj.) Ar 60 70 80 90 100 1000150020002500 Transmitancia (%) Número de onda (cm-1) PVA-30 antes de irradiar PVA-30 después de irradiar -N 2+ Ar (conj.) Ar 40 60 80 100 1000150020002500 Transmitancia (%) Número de onda (cm -1 ) PSS-27 antes de irradiar PSS-27 después de irradiar Ar (conj.) -N2+Ar a) c) e) 40 60 80 100 100011001200130014001500 Transmitancia (%) Número de onda (cm -1 ) -SO 3- -SO 2 OR C-N C-N b) d) f) 60 70 80 90 100 100011001200130014001500 Transmitancia (%) Número de ondas (cm-1) C-N C-N C-O (alcohol) 60 70 80 90 100 100011001200130014001500 Transmitancia (%) Número de onda (cm -1 ) C-N C-N CAPITULO3 87 3.2.5. ESTRUCTURACIÓN CON LUZ El cambio de solubilidad asociado a la fotorreticulación se puede utilizar para crear estructuras de relieve mediante fotolitografía. Esta técnica se ha aplicado a películas obtenidas de las formulaciones fotorreticulables utilizando una máscara consistente en una estructura periódica de líneas transparentes y opacas de igual anchura (ver parte experimental). Tras este proceso de irradiación se pueden eliminar selectivamente las zonas que no han sido irradiadas quedando en el sustrato una estructura polimérica con los mismos motivos geométricos que la región transparente de la máscara fotolitográfica. De esta forma podemos generar por ejemplo líneas de diferentes periodos. En la figura 11 pueden verse imágenes de topografía, obtenidas con un microscopio confocal, de las estructuras generadas mediante fotolitografía en películas fotorreticulables de diferentes polímeros (PSS en la figura 11.a y PVA en la figura 11.b). En estas imágenes puede verse que el material de las zonas no expuestas es eliminado totalmente mediante el proceso de lavado con NaOH 0.06 M, mientras que las zonas expuestas permanecen (con una disminución del espesor del 10-15 % según medidas de perfilometría). Se puede ver también la rugosidad de las superficies, especialmente en PSS-27 (figura 11.a), que se corresponde con la morfología inicial de las películas (figura 7) y que se relaciona con la cristalinidad de las mismas. CAPITULO3 88 Fig. 11. Imágenes de topografía obtenidas con un microscopio confocal en las que se puede observar la topografía de estructuras de relieve obtenidas mediante fotolitografía en películas fotorreticulables de PSS-27 (a) y PVA-30 (b). La altura aproximada h de las estructuras está indicada en la esquina inferior derecha. En el caso del poliacrilato de sodio se llevaron a cabo estudios de estructuración con luz a partir de películas preparadas con polímeros de distinto peso molecular (2000 y 225000). Para el polímero con peso molecular de 225000 (previamente estudiado en los estudios espectroscópicos), se obtuvieron patrones de relieve análogos a los de PSS27 y PVA-30 representados en la figura 11. Estos estudios se llevaron a cabo también con un poliacrilato de sodio de peso molecular 2000, significativamente menor que en el caso anterior. En este caso la película reticula, pero durante el proceso de lavado se soltó del sustrato de vidrio sobre el que había sido preparada. Este hecho se atribuye a que si bien la reticulación efectiva del polímero evita su disolución sin embargo no es lo suficientemente alta para evitar el hinchamiento del polímero y su separación del sustrato. 4. FOTORRETICULACIÓN DE HIALURONATO DE SODIO CON UNA SAL DE DIAZONIO TRIFUNCIONAL (parte de los resultados de este capítulo han sido publicados en la revista Carbohydrate Polymers, 2012, Vol. 90, p. 419-430) CAPITULO4 97 4.1. INTRODUCCIÓN Tal y como se ha comentado en el capítulo de introducción, los polímeros naturales poseen unas propiedades que los hacen muy atractivos para aplicaciones biomédicas. Además de ser generalmente biodegradables, lo cual supone una ventaja en este tipo de aplicaciones,1, 2 los polímeros naturales muestran actividad biológica ya que pueden estimular diversos procesos celulares como la diferenciación, la adhesión, la proliferación o la migración.3, 4 Un ejemplo de este tipo de polímeros es el ácido hialurónico (HA) y sus sales derivadas. Este es un glicosaminoglicano de alto peso molecular (1000000 Da) que se encuentra principalmente en los tejidos conectivos de los mamíferos como por ejemplo el humor vítreo del ojo, el líquido sinovial de las articulaciones o el cordón umbilical. El HA está involucrado en procesos biológicos muy diversos como la angiogénesis,5, 6 la formación de órganos7 o la curación de heridas.8 Debido a estas características, el HA es un precursor interesante para la preparación de biomateriales y se ha estudiado ampliamente la modificación de su estructura química para tratar de modular sus propiedades.9, 10, 11 En particular, se ha investigado la posibilidad de reticular el polímero para obtener biomateriales con  1 Gomes, M.E., Reis, R.L. Int. Mater. Rev., 2004, 49, 261-273. 2 Nair, L.S., Laurencin, C.T. Prog. Polym. Sci., 2007, 32, 762-798. 3 Dutta, R.C., Dutta, A.K. Biotechnol. Adv., 2010, 28, 764-769. 4 Friedl, P., Zänker, K.S., Bröcker, E.B. Microsc. Res. Tech., 1998, 43, 369-378. 5 Raines, A.L., Sunwoo, M.H., Gertzman, A.A., Thacker, K., Guldberg, R.E., Schwartz, Z., Boyan, B.D. J. Biomed. Mater. Res. A, 2011, 96, 575-583. 6 Perng, C.K., Wang, Y.J., Tsi, C.H., Ma, H. J. Surg. Res., 2011, 168, 9-15. 7 Masters, K.S., Shah, D.N., Leinwand, L.A., Anseth, K.S. Biomaterials, 2005, 26, 2517-2525. 8 Chen, W.Y.J., Abatangelo, G. Wound Rep. Reg., 1999, 7, 79-89. 9 Rinaudo, M. Polym. Int., 2008, 57, 397-430. 10 Malafaya, P.B., Silva, G.A., Reis, R.L. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007, 59, 207-233. 11 Burdick, J.A., Prestwich, G.D. Adv. Mater., 2011, 23, H41-H56. CAPITULO4 98 posible aplicación como andamiajes para Ingeniería de Tejidos7, 12, 13, 14 o como transportador para liberación controlada de fármacos.15, 16 Los grupos funcionales que se encuentran en el HA han permitido el desarrollo de diversas estrategias de reticulación (figura 1). Por ejemplo, el HA se ha entrecruzado químicamente usando carbodiimidas17 o dihidrazidas18 como agente reticulante. También se ha estudiado la funcionalización con grupos acrilato o metacrilato para su posterior entrecruzamiento mediante polimerización radicalaria7, 19 o por reacción de adición de Michael con tioles multifuncionales.14, 20, 21, 22, 23, Estos estudios han demostrado que se pueden modificar las propiedades del material controlando los parámetros del proceso de reticulación. Por ejemplo, un cambio en el grado de metacrilación, y por lo tanto en el grado de reticulación de la red resultante, lleva a la obtención de biomateriales con distintas propiedades mecánicas.24 Entre las distintas estrategias utilizadas para llevar a cabo la reticulación del HA, aquellas inducidas por luz han demostrado ser de gran interés en la generación de biomateriales,25, 26 ya que permiten aplicar técnicas de estructuración con luz para generar estructuras de  12 Nuernberger, S., Cyran, N., Albrecht, C., Redl, H., Vécsei, V., Marlovits, S. Biomaterials, 2011, 32, 1032-1040. 13 Camci-Unal, G., Aubin, H., Ahari, A.F., Bae, H., Nichol, J.W., Khademhosseini, A. Soft Matter, 2010, 6, 5120-5126. 14 Lei, Y., Gojgni, S., Lam, J., Segura, T. Biomaterials, 2010, 32, 39-47. 15 Inukai, M., Jin, Y., Yomota, C., Yonese, M. Chem. Pharm. Bull., 2000, 48, 850-854. 16 Patterson, J., Siew, R., Herring, S.W., Lin, A.S.P., Guldberg, R., Stayton, P.S. Biomaterials, 2010, 31, 6772-6781. 17 Tomihata, K., Ikada, Y. J. Biomed. Mater. Res., 1997, 37, 243-251. 18 Vercruysse, K.P., Marecak, D.M., Marecek, J.F., Prestwich, G.D. Bioconjugate Chem., 1997, 8, 686694. 19 Kutty, J.K., Cho, E., Lee, J.S., Vyavahare, N.R., Webb, K. Biomaterials, 2007, 28, 4928-4938. 20 Kim, J., Park, Y., Tae, G., Lee, K.B., Hwang, C.M., Hwang, S.J., Kim, I.S., Noh, I., Sun, K. J. Biomed. Mater. Res. A, 2009, 88, 967-975. 21 Ji, Y., Ghosh, K., Shu, X.Z., Li, B., Sokolov, J.C., Prestwich, G.D., Clark, R.A.F., Rafailovich, M.H. Biomaterials, 2006, 27, 3782-3792. 22 Shu, X.Z., Liu, Y., Palumbo, F.S., Luo, Y., Prestwich, G.D. Biomaterials, 2004, 25, 1339-1348. 23 Shu, X.Z., Ahmad, S., Liu, Y., Prestwich, G.D. J. Biomed. Mater. Res. A, 2006, 79, 902-912. 24 Bencherif, S.A., Srinivasan, A., Horkay, F., Hollinger, J.O., Matyjaszewski, K., Washburn, N.R. Biomaterials, 2008, 29, 1739-1749. 25 Van Tomme, S.R., Storm, G., Hennink, W.E. Int. J. Pharm., 2008, 355, 1-18. 26 Oh, J.K., Drumright, R., Siegwart, D.J., Matyjaszewski, K. Prog. Polym. Sci., 2008, 33, 448-477. CAPITULO4 99 geometría controlada. 27, 28 Estas estructuras pueden servir para controlar y dirigir la adhesión y proliferación celular. 12, 29, 30 Fig. 1. Estructura química del HA (sal sódica) y posible modificación química de sus grupos funcionales. Hasta la fecha, la fotorreticulación del HA se ha llevado a cabo principalmente por fotopolimerización radicalaria de grupos acrilato introducidos en la cadena del HA. 7, 19 Como se ha comentado en capítulos anteriores, este proceso de polimerización da lugar a la formación de cadenas acrílicas no biodegradables de alto peso molecular que pueden resultar difíciles de eliminar por el organismo. Una alternativa a esta fotoquímica basada en grupos acrilatos son las reacciones fotoinducidas que implican dos grupos funcionales diferentes (A y B) como es el caso de la fotoquímica de tiolenos. 31 Sin embargo, la aplicación de la química de tiol-enos a la fotorreticulación de HA requiere de una modificación química previa de las cadenas poliméricas del HA para introducir los grupos reactivos (ya sean tioles o dobles enlaces). La  27 Bratton, D., Yang, D., Dai, J., Ober, C.K. Polym. Adv. Technol., 2006, 17, 94-103. 28 Melchels, F.P.W., Feijen, J., Grijpma, D.W. Biomaterials, 2010, 31, 6121-6130. 29 Khetan, S., Burdick, J.A. Soft Matter, 2011, 7, 830-838. 30 Seidlits, S.K., Schmidt, C.E., Shear, J.B. Adv. Funct. Mater., 2009, 19, 3543-3551. 31 Hoyle, C.E., Bowman, C.N. Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 1540-1573. CAPITULO4 100 fotorreticulación del HA, así como de polímeros naturales en general, mediante una reacción que no requiera una modificación previa del mismo es una aproximación interesante para su aplicación en la preparación de biomateriales. En este sentido, en el capítulo 3 se ha descrito que la fotodescomposición de sales de diazonio permite la fotorreticulación de polímeros con grupos nucleófilos tales como los grupos carboxilato e hidroxilo. La presencia de estos grupos nucleófilos en el HA constituye una oportunidad para la fotorreticulación de este polímero natural sin modificación alguna con compuestos multifuncionales de sales de diazonio. Esta estrategia se podría extender además a otros polímeros naturales como la heparina o el sulfato de condroitina, por ejemplo, que contienen grupos sulfato capaces de reaccionar con las sales de diazonio.32, 33, 34 Este proceso permite además aplicar técnicas de estructuración con luz, tal y como se ha comprobado en el capítulo anterior, y no requiere de fotoiniciador, que podría resultar tóxico para las células.35 En este capítulo se describe el uso de la sal de diazonio trifuncional de bajo peso molecular descrita en el capítulo 3 para la reticulación de hialuronato de sodio sin necesidad de modificarlo químicamente (esquema 1), y utilizando formulaciones fotorreticulables preparadas en disolución acuosa gracias a la naturaleza iónica de ambos componentes. Se prepararán formulaciones con distinto porcentaje de reticulante a partir de las cuales se procesarán películas fotorreticulables por spin coating. Estas películas serán utilizadas para estudiar el proceso de reticulación con luz mediante técnicas espectroscópicas. En los biomateriales preparados a partir de estos sistemas con distinto porcentaje de reticulante, se estudiará la biocompatibilidad para su aplicación como sustratos para el crecimiento celular con dos líneas celulares distintas: células  32 Cao, W., Ye, S., Cao, S., Zhao, C. Macromol. Rapid Commun., 1997, 18, 983-989. 33 Zhang, Y., Cao, W. J. Polym. Sci. A, 2000, 38, 2566-2571. 34 Sun, J., Wu, T., Sun, Y., Wang, Z., Zhang, X., Shen, J., Cao, W. Chem. Commun., 1998, 1853-1854. 35 Fridovich, I. J. Exp. Biol., 1998, 201, 1203-1209. CAPITULO4 101 tumorales HeLa y fibroblastos COS-7 como línea celular sana. Con ellos se prepararán estructuras bidimensionales de geometría controlada mediante escritura directa con láser (Direct Laser Writing - DLW) para estudiar la adhesión de las células sobre dichas estructuras. Esquema 1. Esquema de la reticulación fotoinducida del hialuronato de sodio con un reticulante multifuncional basado en sales de diazonio. 4.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2.1. FOTORRETICULACIÓN DEL HIALURONATO DE SODIO El ácido hialurónico contiene grupos hidroxilo y carboxilato tal y como puede verse en su estructura química, presentado en la figura 1. En el capítulo 3 se ha descrito la reactividad de la sal de diazonio trifuncional derivada de la N,N,N-tris(4aminofenil)amina con polímeros que contienen estos grupos funcionales utilizando poliacrilato de sodio y polivinil alcohol como polímeros modelo. Consecuentemente es CAPITULO4 102 factible plantear la fotorreticulación del hialuronato de sodio utilizando el mismo reticulante. Para verificar la reacción se llevó a cabo la irradiación de películas fotorreticulables obtenidas a partir de formulaciones de ácido hialurónico con diferentes cantidades de reticulante y se caracterizó el proceso por espectroscopia UV-Vis e IR tal y como se hizo con los sistemas modelo. Las películas fotorreticulables se prepararon por spin coating a partir de formulaciones con un 5% y 20% en peso del reticulante (codificadas como H5 y H20 respectivamente). Con porcentajes superiores (30% en peso, como se había hecho con los compuestos modelo) se obtenían disoluciones no homogéneas. Debido a la viscosidad de las formulaciones fotorreticulables, el segundo ciclo del proceso de spin coating a 3000 rpm fue extendido hasta 180 s para favorecer una adecuada eliminación del disolvente en la preparación de la película. Estas películas muestran una banda de absorción debida a la transición π-π* de los grupos diazonio que aparece en torno a 424 nm. El proceso de descomposición fotoinducida de los grupos diazonio, monitorizado por espectroscopia UV-Vis, muestra la completa desaparición de esta banda tras la irradiación con luz UV (figura 2), lo que confirma la descomposición fotoinducida de estos grupos diazonio. Fig. 2. Espectros de Abs UV-Vis de H5 (a) y H20 (b) antes y después de irradiar con luz UV. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) H20 antes de irradiar H20 después de irradiar 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 300 400 500 600 700 800 Absorbancia normalizada Longitud de onda (nm) H5 antes de irradiar H5 después de irradiar a) b) CAPITULO4 103 También se caracterizó el proceso de reticulación por espectroscopia IR, para lo que se seleccionó la muestra de H20, que contiene mayor cantidad de reticulante y por lo tanto facilita la detección de cambios en las bandas de los grupos funcionales tras el proceso de irradiación. En la figura 3 puede verse la desaparición de la banda del grupo diazonio a 2266 cm-1, a la par que se produce un desplazamiento de la banda ArC=C (1562 cm-1 en el reticulante) lo que indica la descomposición fotoinducida del grupo diazonio. Junto a estas modificaciones, aparece una nueva señal a 1740 cm-1 que se atribuye a la vibración del enlace C=O del grupo éster formado tras la irradiación. El proceso de irradiación también provoca una serie de cambios en la zona de 1200-1350 cm-1 donde inicialmente se pueden ver dos bandas a 1305 cm-1 y 1340 cm-1 que se atribuyen a los enlaces C-N de los grupos aromáticos del reticulante con la sal de diazonio y el N central. Tras la irradiación, estas dos señales desaparecen y aparecen una banda a 1323 cm-1 y otra banda ancha centrada en 1250 cm-1. Estos cambios pueden atribuirse al proceso de descomposición fotoinducido del reticulante y a la consiguiente formación de enlaces éster y éter que dan lugar a bandas en esta zona por la vibración de los enlaces C-O. Además, tanto las películas de H5 como las de H20, se vuelven insolubles en disolución acuosa de NaOH tras la exposición con luz UV, lo que confirma el proceso de fotorreticulación efectivo del polímero. A diferencia de los procesos descritos hasta la fecha, esta fotorreticulación se ha llevado a cabo sin necesidad de modificar previamente el polímero y sin la adición de fotoiniciador. CAPITULO4 104 Fig. 3. Espectro IR de una película fotorreticulable de H20 antes y después de irradiar con luz UV. La descomposición fotoinducida de las sales de diazonio puede ser extendida a la reticulación de otros polímeros naturales. Por ejemplo, la heparina contiene grupos sulfato, carboxilato e hidroxilo que pueden reaccionar con el reticulante trifuncional una vez producida la fotodescomposición, dando lugar a la reticulación del polímero. Para estudiar esta posibilidad se llevó a cabo la reticulación de heparina (figura 4) con un 30% en peso del reticulante (formulación codificada como Hep-30). Fig. 4. Estructura química de la heparina. 60 70 80 90 100 1000150020002500 Transmitancia (%) Número de onda (cm -1 ) H20 antes de irradiar H20 después de irradiar C=O (éster) Ar(conj.) -N 2+ C-O (éter) CAPITULO4 111 película. La altura de las estructuras resultantes (figura 9) es del orden de 150 nm para H5 y 400 nm para H20, menor que el grosor inicial de la película (500 nm para H5 y 1000 nm para H20). Esta disminución se atribuye a una eliminación parcial del material reticulado durante el proceso de lavado con NaOH. Fig. 9. Imagen de topografía obtenida con un microscopio confocal en las que se puede observar la topografía de una estructura de relieve obtenida mediante fotolitografía en películas fotorreticulables de H5. La altura aproximada (h) de las estructuras está indicada en la esquina inferior derecha. 4.2.4. ESTUDIOS DE ADHESIÓN CELULAR Con el fin de estudiar la adhesión celular sobre los diferentes materiales poliméricos, se llevó a cabo el cultivo de las células tumorales HeLa y los fibroblastos COS-7 sobre películas estructuradas de H5 y H20 soportados en vidrio que fueron fotorreticuladas selectivamente por DLW. A continuación se llevó a cabo el marcaje fluorescente de las fibras de actina que es uno de los principales componentes estructurales del citoesqueleto celular y nos permite obtener información de cómo se CAPITULO4 112 distribuye éste y si la célula muestra alguna orientación preferente.44, 45 Estos estudios se llevaron a cabo fijando la membrana celular mediante reticulación de las proteínas de la misma con formaldehido. A continuación se llevó a cabo el marcaje de la actina mediante anticuerpos marcados fluorescentemente (fluoróforo verde Alexa Fluor 488) que se unen específicamente a esta proteína. Los núcleos por su parte fueron marcados con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se intercala entre el ADN de los mismos y da fluorescencia de color azul. Estos estudios revelaron que tanto las células tumorales HeLa como los fibroblastos COS-7 tienden a adherirse selectivamente al vidrio cuando son cultivados sobre patrones del material H5 microestructurado. En la figura 10 puede verse que, tras 72 h de cultivo, las áreas de vidrio sin material están cubiertas de células casi en su totalidad, por lo que estas áreas se visualizan en color verde debido al marcaje fluorescente de las células. Sin embargo, en las líneas de material polimérico no se ha adherido ninguna célula por lo que no se detecta fluorescencia y son visualizadas en color negro.  44 Reisler, E. Curr. Opin. Cell Biol., 1993, 5, 41-47. 45 Furukawa, R., Fechheimer, M. Int. Rev. Cytol., 1997, 175, 29-90. CAPITULO4 113 Fig. 10. Imágenes de microscopía confocal de un marcaje fluorescente de las fibras de actina con el fluoróforo verde Alexa Fluor 488 y de los núcleos con DAPI (ver parte experimental) en células tumorales HeLa (a, b) y fibroblastos COS-7 (c, d) tras 72 h de cultivo sobre patrones del material polimérico H5. En los patrones de H20 no se observa esta adhesión selectiva de las células en el vidrio sino que ambas líneas celulares proliferan indistintamente sobre el material polimérico H20 y sobre las áreas de vidrio sin polímero H20 (figura 11). En estas películas, con mayor cantidad de reticulante, puede llegar a verse la línea de material en color rojo (figuras 11.a y 11.d) debido a la emisión del reticulante en esta región del visible. Las células, marcadas con el fluoróforo verde Alexa Fluor 488, se ven localizadas tanto en las líneas de material polimérico (en rojo), como en las zonas con vidrio (cuadrados en negro). Este hecho se aprecia en las imágenes de contraste de fase CAPITULO4 114 obtenidas con el objetivo de 60 aumentos (figuras 11.c para células HeLa y 11.f para fibroblastos COS-7) en las que se ha observado en algunas células HeLa una cierta orientación a lo largo del material polimérico (sombreada en blanco para mayor claridad en las imágenes de contraste de fase) y una orientación de las fibras de actina en la misma dirección. Fig. 11. Imágenes de microscopía confocal de un marcaje fluorescente de las fibras de actina con Alexa Fluor 488 y los núcleos con DAPI en células tumorales HeLa (a, b, c) y fibroblastos COS-7 (d, e, f) tras 72 h de cultivo sobre patrones del material polimérico H20. Las imágenes 7.a y 7.d son composiciones de imágenes para el mapeo de la muestra. Las imágenes 7.c y 7.f son las imágenes de contraste de fase de las imágenes 7.b y 7.e respectivamente; en estas imágenes de contraste de fase se ha añadido una banda sombreada en blanco para indicar la localización del material polimérico. De estos resultados se concluye que el porcentaje de reticulación afecta al comportamiento de adhesión celular sobre el material polimérico. Para caracterizar mejor la adhesión selectiva de las células al vidrio en los patrones poliméricos de H5 CAPITULO4 115 se monitorizó el cultivo de las células tumorales HeLa sobre dichos sustratos. Se eligió esta línea celular porque, debido a su mayor movilidad,46 tiene una mayor capacidad de deformación y mayor velocidad de migración, lo que permite ver más fácilmente la respuesta de la célula al interaccionar con cada tipo de material (líneas poliméricas de H5 o sustrato de vidrio sin película). Estos estudios se realizaron cultivando las células en una cámara esterilizada y acondicionada, capturando imágenes de contraste de interferencia diferencial a diferentes tiempos en una misma posición del cultivo. En la figura 12 se puede observar que al iniciar el cultivo todas las células están en suspensión (no están adheridas al sustrato) por lo que muestran una morfología esférica. Se puede ver también como aquellas que están localizadas sobre la línea de material polimérico (marcada con una banda blanca) tienden a migrar hacia los laterales de la misma donde se encuentra el sustrato de vidrio sin material y donde por fin se adhieren adquiriendo una morfología extendida. Este comportamiento está en consonancia con las imágenes obtenidas por microscopia de fluorescencia confocal mostradas en la figura 10, en las que las células ocupan la zona con vidrio quedando las líneas poliméricas sin cubrir.  46 Small, J.V., Anderson, K., Rottner, K. Biosci. Rep., 1996, 16, 351-368. CAPITULO4 116 Fig. 12. Secuencia de imágenes de contraste de interferencia diferencial adquiridas para células tumorales HeLa cultivadas en patrones poliméricos de H5 sobre sustratos de vidrio. Se ha incluido una banda blanca en las imágenes para indicar la situación del material polimérico. El intervalo entre imágenes es de 2 h. Con objeto de entender mejor el comportamiento de adhesión mostrado por las células en los patrones microestructurados, se cultivaron ambas líneas celulares (células tumorales HeLa y fibroblastos COS-7) sobre películas sin estructurar de los distintos materiales (H5, H20 y también sustratos de vidrio sin recubrir como referencia) a estas células se les realizó un marcaje fluorescente de las fibras de vinculina por un CAPITULO4 117 procedimiento análogo al realizado en el marcaje de las fibras de actina. La vinculina es una proteína involucrada en los procesos de adhesión celular y suele acumularse en aquellos puntos donde la célula está interaccionando con el sustrato. De esta forma, el marcaje fluorescente de esta proteína (con Texas Red® como fluoróforo) permite visualizar los puntos de las células que están interaccionando con el correspondiente sustrato (H5, H20 o vidrio),47 denominados puntos focales de adhesión. Como puede verse en la figura 13, ambas líneas celulares cultivadas en películas de H5 sin estructurar muestran cierta interacción con la superficie, lo que puede explicar los porcentajes de viabilidad celular (próximos al 100%) obtenidos en este material en el que las células han mostrado poca tendencia a adherirse cuando está estructurado. Sin embargo, las células adquieren una morfología esférica (figuras 13.a para células tumorales HeLa y 13.d para fibroblastos COS-7) y muestran tendencia a crecer en colonias en el caso de los fibroblastos COS-7 (figura 13.d). De esta forma consiguen minimizar la interacción con el material polimérico H5, lo que indica una baja afinidad de ambas líneas celulares por este material, en consonancia con los resultados obtenidos en las películas estructuradas.48, 49 En el vidrio, por su parte, las células adquieren una morfología extendida y establecen muchos más puntos focales de adhesión, representados por la sobreexpresión de vinculina y por tanto por una mayor intensidad de fluorescencia, que cuando son cultivadas sobre el sustrato de H5. Este hecho indica una mayor afinidad por el vidrio que por el sustrato polimérico lo que es acorde con la adhesión selectiva de las células a las zonas con vidrio en los patrones de H5. Esta adhesión selectiva al vidrio en las estructuras poliméricas de H5 se ve favorecido además por la alta capacidad de migración de las células sobre sustratos con los que interaccionan débilmente como es el caso del material H5.4  47 Ziegler, W.H., Liddington, R.C., Critchley, D.R. Trends Cell Biol., 2006, 16, 453-460. 48 Owen, G.R., Meredith, D.O., Gwynn, I., Richards, R.G. Eur. Cells Mater., 2005, 9, 85-96. 49 Geiger, B., Spatz, J.P., Bershadsky, A.D. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 21-33. CAPITULO4 118 Cuando las células se cultivan sobre películas sin estructurar de H20 (figuras 13.b para células tumorales HeLa y 13.e para fibroblastos COS-7), material en el que no mostraban esta adhesión preferente al vidrio en los patrones microestructurados, se adhieren con una morfología más extendida que en las películas de H5. Esta morfología es similar a su morfología típica en los sustratos de vidrio (figuras 13.c para células tumorales HeLa y 13.f para fibroblastos COS-7), que es un sustrato adherente para ellas. Esto indica una mayor afinidad por el material más reticulado (H20) que por el material menos reticulado (H5). Fig. 13. Imágenes de microscopía confocal de un marcaje fluorescente de las fibras de vinculina con Texas Red y los núcleos con DAPI en células tumorales HeLa (a, b, c) y fibroblastos COS-7 (d, e, f) tras 72 h de cultivo sobre películas de H5 (a, d) y H20 (b, e) sin estructurar y sobre sustratos de vidrio (c, f). La morfología esférica de las células en películas fotorreticuladas de H5 sin estructurar se caracterizó también por microscopía electrónica de barrido (Scanning CAPITULO4 119 Electron Microscopy - SEM) para ambas líneas celulares una vez cultivadas y fijadas (esta vez con glutaraldehído). Cuando las células se cultivan sobre sustratos de vidrio (control), que es un sustrato adherente para ellas, extienden su citoplasma para establecer más puntos focales de adhesión como se observa en las figuras 14.b para células tumorales HeLa y 14.d para fibroblastos COS-7. Estos resultados están en consonancia con los observados en el marcaje fluorescente con vinculina (figuras 13.c para células tumorales HeLa y 13.f para fibroblastos COS-7). Sin embargo, cuando se cultivan las células sobre películas de H5 se observa una morfología esférica (figuras 14.a para células tumorales HeLa y 14.c para fibroblastos COS-7), tal y como se había observado también en los estudios de inmunomarcaje (figuras 13.a para células tumorales HeLa y 13.d para fibroblastos COS-7). Tal y como puede verse por las dimensiones de las células, esta morfología esférica sobre el material polimérico H5 consigue reducir la interacción con el material, comportamiento típico de las células en sustratos por los que siente poca afinidad. CAPITULO4 120 Fig. 14. Imágenes de SEM de células tumorales HeLa (a, b) y fibroblastos COS-7 (c, d) cultivados sobre películas de H5 (a, c) sin estructurar y sobre sustratos de vidrio (b, d). La menor afinidad de las células por el material polimérico H5 podría estar relacionada con la hidrofilia del material, ya que se ha descrito en la bibliografía que las células no se adhieren bien sobre superficies hidrófilas como algunas basadas en ácido hialurónico. 50 En las muestras de H20, con mayor cantidad de reticulante (hidrófobo tras la descomposición de los grupos diazonio), y con mayor grado de reticulación, es de esperar una disminución en la capacidad del material para absorber agua, lo que llevaría a un carácter más hidrófobo que en el caso de H5. Esto podría explicar la mejor adhesión de las células en H20 que en H5.  50 Wang, Y.W., Wu, Q., Chen, G.Q. Biomaterials, 2003, 24, 4621-4629. CAPITULO4 127 Para los estudios de biocompatibilidad se utilizó bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) suministrado por Invitrogen, que se disolvió en una disolución tampón fosfato (PBS) con una concentración de 5 mg/mL. Esta disolución fue añadida al cultivo en una relación 1:20 (50 L de MTT en PBS y 950 L de medio de cultivo). Para el marcaje fluorescente del citoesqueleto celular se utilizó una disolución de formaldehido (Sigma-Aldrich) al 4% en PBS con 1% de sacarosa como tampón de fijación. El tampón de permeabilización fue preparado disolviendo 10.3 g de sacarosa (Sigma-Aldrich), 0.292 g de NaCl (Panreac), 0.06 g MgCl2 hexahidratado (Panreac) y 0.476 g de Hepes (Sigma-Aldrich) en 100 mL de PBS. El pH de esta disolución fue ajustado a 7.2 para finalmente añadir 0.5 mL de Tween 20 (Panreac) en 100 mL de PBS. El tampón de bloqueo se preparó disolviendo 1 g de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich) en 100 mL de PBS, mientras que el tampón de lavado se preparó disolviendo 0.5 mL de Tween 20 (Panreac) en 100 mL de PBS. Para el marcaje de vinculina se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-humano IgG1 crecido en ratones (Sigma-Aldrich) como anticuerpo primario, y un anticuerpo monoclonal anti-ratón biotinilado (IgG) de Vector Laboratories como anticuerpo secundario. Como marcador fluorescente se utilizó estreptavidina conjugada con el fluoróforo Texas Red, de Vector Laboratories. Para el marcaje de actina se utilizó faloidina conjugada con Alexa Fluor 488 que fue proporcionada por Invitrogen. Todas estas disoluciones fueron diluidas 1:50 en el tampón de bloque de BSA antes de la incubación. Para el marcaje del núcleo celular se utilizó 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como marcador fluorescente. El DAPI fue disuelto en PBS (5 mg/mL) y diluido 104 veces antes de la incubación con las células. Para montar las muestras sobre el CAPITULO4 128 portaobjetos se utilizó el medio de montaje Prolong ® Gold Antifade Reagent de Invitrogen. Para la caracterización morfológica de las células mediante SEM se utilizó una disolución al 2.5% de glutaraldehído (Sigma-Aldrich) en PBS como tampón de fijación. Las muestras se deshidrataron utilizando disoluciones de etanol / H2O con porcentajes crecientes de EtOH cuyas composiciones fueron 25%, 50%, 70%, 90% y 100% de EtOH respectivamente. 4.4.2. PREPARACIÓN DE PELÍCULAS FOTORRETICULABLES Para la preparación de películas fotorreticulables se añadió la cantidad correspondiente del agente reticulante, generado in situ tal y como se describe en el apartado 3.4.2 del capítulo 3, sobre una disolución de hialuronato de sodio en agua Milli-Q. Se prepararon formulaciones con hialuronato de sodio con un 5% y un 20% en peso del reticulante que fueron codificadas como H5 y H20 respectivamente. En el caso de la heparina se prepararon formulaciones con un 30% en peso de la heparina que se codificaron como Hep-30 Estas disoluciones se utilizaron para preparar películas por spin coating (un ciclo de 1000 rpm durante 5 s y otro ciclo de 3000 rpm durante 180 s) utilizando sustratos de vidrio limpiados mediante un tratamiento con ozono. Para la caracterización espectroscópica por absorción UV-Vis se utilizaron sustratos de vidrio previamente tratados con ozono durante unos minutos. Para la caracterización por IR se utilizaron sustratos de fluorita (CaF2). Para los estudios celulares, las películas fotorreticulables se prepararon sobre cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm de diámetro, que también fueron previamente tratados con ozono. CAPITULO4 129 4.4.3. PROCESO DE FOTORRETICULACIÓN Para los estudios de caracterización por espectroscopia UV-Vis e IR, los ensayos de viabilidad celular, los estudios del ciclo celular por citometría de flujo y los estudios de morfología por SEM se llevó a cabo un proceso de fotocurado de toda la película empleando para ello una lámpara de Hg de 300 W (Oriel, modelo #6286; portalámparas de Oriel, modelo #66902) conectada a un filtro reflectante de luz UV (Oriel, Model #66218). Estas muestras fueron irradiadas durante 2 min con luz UV con una intensidad de 160 mW/cm2 en el intervalo de longitudes de onda de 350-450 nm, tal y como se describe en el capítulo anterior. Para los estudios de adhesión celular se utilizaron estructuras de geometría controlada generadas por DLW. La fuente de luz en los experimentos de DLW fue un haz de luz láser de 1.7 mm de diámetro y 1.75 mW focalizado sobre la muestra con un objetivo de microscopio para luz UV de 39 aumentos. La muestra se desplazó en el plano horizontal mediante una plataforma XY motorizada y controlada por ordenador para generar las líneas de material fotorreticulado. Una vez se ha llevado a cabo la reticulación fotoinducida se realiza un lavado con una disolución acuosa de NaOH 0.06 M, un reflujo de agua destilada y finalmente un secado con aire comprimido. 4.4.4. ESTUDIOS DE BIOCOMPATIBILIDAD Los estudios de biocompatibilidad se llevaron a cabo mediante ensayos de toxicidad con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) sobre poblaciones de células tumorales HeLa o fibroblastos COS-7 cultivadas sobre películas de material fotorreticulado depositadas sobre vidrios redondos de 12 mm de diámetro. Estas películas fueron esterilizadas con etanol al 70% durante 15 min y posteriormente CAPITULO4 130 lavadas con PBS estéril durante otros 15 min antes de cultivar las células. A continuación se cultivaron las células durante 24, 48 y 72 h respectivamente en placas de 24 pocillos y con una densidad de 50000 células en 1 mL de medio de cultivo. Una vez cultivadas el tiempo deseado, el sustrato de vidrio con la película de material, con las células ancladas en su superficie, fue trasferido a otra placa de 24 pocillos, donde se incubó durante 4 h en oscuridad con una disolución de MTT diluido en medio de cultivo fresco. Tras el periodo de incubación, el medio fue retirado y los cristales de formazán generados fueron disueltos en 1 mL de DMSO. A continuación, 200 L de esta disolución morada fueron trasvasados a una placa de cultivo de 96 pocillos para llevar a cabo las medidas de absorbancia a 570 nm en un lector de placas Biotek ELX800. El lector de placas se calibra tomando como cero la absorbancia de 200 L de DMSO. Los porcentajes de viabilidad celular, relativos a un control llevado a cabo sobre sustratos de vidrio, fueron calculados mediante la siguiente ecuación: % 󰇟󰇠 󰇟󰇠󰇛.󰇜 Cada experimento fue repetido con 5 muestras para obtener el valor medio y la desviación estándar. 4.4.5. ESTUDIOS DE ADHESIÓN CELULAR Los estudios de adhesión celular se llevaron a cabo cultivando las células sobre patrones de geometría controlada generadas por DLW. Estos sustratos fueron previamente esterilizados con EtOH 70% durante 15 min y lavados con PBS estéril CAPITULO4 131 durante otros 15 min. El cultivo se realizó en placas de 24 pocillos con una densidad de 10000 células en 1 mL de medio de cultivo. Tras el tiempo de cultivo deseado, las células adheridas a estos sustratos de vidrio con estructuras poliméricas fueron fijadas con tampón de fijación a 37ºC durante 15 min. A continuación las muestras fueron lavadas con PBS y se incubaron con tampón de permeabilización a 4ºC durante 5 min y posteriormente con tampón de bloqueo durante otros 5 min a 37ºC. Para el marcaje de vinculina, a continuación se añadió el anticuerpo primario de vinculina y se incubó durante 1 h a 37ºC. Las muestras se lavaron con tampón de lavado para posteriormente incubarlas con el anticuerpo secundario durante 1 h a 37ºC. Tras otro proceso de lavado, se incubaron con el marcador de estreptavidina conjugada con el fluoróforo Texas Red durante 30 min a 4ºC, seguido de otro proceso de lavado. Para el marcaje de actina, tras la etapa de permeabilización se incubaron las células con faloidina (marcada con Alexa Fluor 488) durante 1 h a 37ºC. Por último, las células fueron incubadas con DAPI durante 5 min a temperatura ambiente, lavadas con agua destilada y montadas sobre el portaobjetos con medio de montaje Prolong ® Gold Antifade Reagent. Para los experimentos de microscopía secuencial, los sustratos fueron esterilizados con EtOH 70% durante 15 min y lavados con PBS estéril durante otros 15 min. A continuación fueron fijados con fibronectina en una placa Petri de cultivo celular (µ-Dish para cultivo celular de Ibidi) y se dejó secar durante unas horas en un ambiente estéril. Las células se cultivaron durante 24 h en una cámara a 37ºC y 5% CO2 acoplada al microscopio y en una densidad de 50000 células HeLa en 1 mL de medio de cultivo. Durante este tiempo, se adquirieron imágenes de contraste de interferencia diferencial cada 15 min en diversos puntos de la muestra. CAPITULO4 132 Para la caracterización morfológica de las células por microscopía electrónica de barrido se cultivaron las células (células tumorales HeLa o fibroblastos COS-7) sobre películas de H5 fotorreticuladas sin estructurar o sobre sustratos de vidrio. Ambos tipos de sustratos fueron previamente esterilizados con etanol 70% durante 15 min y lavados con PBS estéril durante otros 15 min. El cultivo se realizó en placas de 24 pocillos con una densidad de 20000 células en 1 mL de medio de cultivo. Tras el tiempo de cultivo deseado, las células adheridas a la película polimérica o al sustrato de vidrio fueron fijadas con el tampón de fijación con un 2.5 % de glutaraldehído a 4ºC durante 1 h. A continuación las muestras fueron lavadas 3 veces con PBS a 4ºC durante 20 min y otras 3 veces con agua destilada a 4ºC durante 20 min. El proceso de deshidratación se llevó a cabo por sucesivos lavados a 4ºC durante 10 min con etanol al 25%, 50%, 70%, 90% y 100% (el lavado con etanol al 100% fue repetido dos veces). Finalmente las muestras fueron cubiertas con un depósito de oro de aproximadamente 15 nm de espesor para obtener una muestra conductora. Los estudios del ciclo celular se llevaron a cabo por citometría de flujo. Estos estudios fueron llevados a cabo cultivando las células sobre películas de H5 fotorreticuladas sin estructurar o sobre sustratos de vidrio (como control). El cultivo se realizó en placas de 24 pocillos con una densidad de 100000 células en 1 mL de medio de cultivo. Tras 24 h de cultivo, los sustratos fueron transferidos a otra placa de 24 pocillos donde se soltaron las células mediante una incubación con 100 L de tripsina (2 min a 37ºC y 5% CO2) que fue neutralizada a continuación con 1 mL de medio de cultivo completo (este experimento fue repetido en 20 muestras). Las células obtenidas en todas las muestras se juntaron y se centrifugaron a 300 g durante 7 min. El medio de cultivo sobrenadante fue decantado y las células se resuspendieron en 200 L de PBS para ser fijadas con EtOH frío (-20ºC) durante una noche a 4ºC. A continuación las CAPITULO4 133 células se centrifugaron a 300 g durante 7 min, se lavaron con 500 L de PBS y se centrifugaron otra vez a 300 g durante 7 min. Finalmente las células fueron teñidas con 1 mL de la disolución marcadora (50 g/mL de yoduro de propidio y 100 g/mL de RNAsa en PBS) durante 30 min en oscuridad y a temperatura ambiente. 4.4.6. TÉCNICAS Las películas fotorreticulables fueron preparadas utilizando el spin coater KarlSuss CT60 tal y como se describió en el capítulo 3. La caracterización espectroscópica del proceso de irradiación y la caracterización topográfica de las películas y patrones obtenidos también se llevaron a cabo con los instrumentos descritos en el capítulo 3. Las medidas de absorbancia en los ensayos de MTT se realizaron en un espectrofotómetro de placas Biotek ELX800. Para los estudios de adhesión, las secciones teñidas con marcadores fluorescentes se visualizaron en un microscopio confocal Olympus FV10i con un objetivo de 60 aumentos con aceite de inmersión (lentes UPLSAPO 60x con apertura numérica 1.35) con una resolución de 1024x1024 píxeles y un pinhole de 1 unidad. Para el visionado completo de la muestra (imagen mapa) que se utiliza para localizar el punto a observar con el objetivo de 60 aumentos, se utilizó un objetivo de microscopio de 10 aumentos (lentes UPLSAPO 10x con apertura numérica 0.4) con el que se adquirió un campo de 7x7 imágenes que se combinaron en una imagen mapa. Para la microscopía secuencial, las células fueron cultivadas en placas Petri de cultivo celular (µ-Dish para cultivo celular de Ibidi). Las fotografías fueron registradas durante 24 h usando un microscopio Leica AF6000 LX con una cámara que proporciona CAPITULO4 134 una atmósfera a 37ºC y 5% CO2 para el cultivo celular. El objetivo utilizado fue un objetivo 40x HCX PL S-APO de contraste de interferencia diferencial. Las imágenes fueron tomadas con una cámara CCD (Model Orca 9100-02; Hamamatsu) a intervalos de 15 min y registradas como conjuntos de imágenes usando un software LAS AF (Leica Microsystems). Las imágenes fueron procesadas usando este mismo software. Las imágenes de SEM se tomaron usando un microscopio de barrido electrónico Inspect F50 trabajando a alto vacío (< 6·e-4 Pa) con un voltaje de aceleración de 200 V a 30 kV. Los estudios del ciclo celular se llevaron a cabo mediante citometría de flujo en un citómetro FACSARRAY de BD y los datos fueron analizados con el software Modfit 3.0 de Verity Software. 5. FOTORRETICULACIÓN DE POLIÉSTERES ALIFÁTICOS CON UNA SAL DE DIAZONIO TRIFUNCIONAL (parte de los resultados de este capítulo han sido enviados a la revista Reactive and Functional Polymers)