Repositorio Institucional de Documentos

2013 1 Jorge Escartín Valderrama Efectos del tratamiento con melatonina en el alotrasplante de páncreas en el cerdo Departamento Director/es Cirugía, Ginecología y Obstetricia García Gil, Francisco Agustín García García, José Joaquín UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA, GINECOLOGÍA Y OBSTETRICIA Efectos del tratamiento con melatonina en el alotrasplante de páncreas en el cerdo Tesis Doctoral presentada por: Jorge Escartín Valderrama Directores de la tesis doctoral: Prof. Dr. Francisco Agustín García Gil Prof. Dr. José Joaquín García García -2Los Dres. D. Fco Agustín García Gil y D. José Joaquín García García Certifican: Que D. Jorge Escartín Valderrama, licenciado en Medicina y Cirugía, ha realizado bajo su dirección el presente trabajo de investigación sobre: “EFECTOS DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EN EL ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS EN EL CERDO”, que va a ser presentado como Tesis Doctoral, que han revisado dicho trabajo, estimando que cumple las condiciones científicas y formales que deben serle exigidas. Zaragoza, a 27 de febrero 2012 Fdo. Dr. D. Fco Agustín García Gil Fdo. Dr. D. José Joaquín García García -3A mi hija, Irene, porque representa el amor de mi esposa, padres y hermano y porque es el mejor ejemplo de que las mejores cosas de la vida vienen sin manual de instrucciones. -4AGRADECIMIENTOS Quiero mostrar mi agradecimiento al profesor y director de esta tesis Dr. Fco Agustín García Gil. Muchas son las razones para ello. Primero, porque como profesor me atrapó con su ilusión por la cirugía. Segundo, como cirujano me ha servido de modelo por su entrega incondicional al trabajo bien hecho. Y tercero, como director de mi Tesis Doctoral, pues sin su ilusión ni su tesón no hubiera sido yo capaz de llevarla a buen puerto. Tambien deseo mostrar mi gratitud al Prof. José Joaquín García García, Catedrático de Fisiología, codirector de esta Tesis, y a todos los entusiastas colaboradores de su grupo de investigación. Sin su ayuda, este trabajo no se hubiera podido llevar a cabo. -5INDICE I INTRODUCCIÓN 10 1 DIABETES MELLITUS Y TRASPLANTE DE PÁNCREAS 11 2 LA LESIÓN DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EL RECHAZO AGUDO 15 3 EL ESTRÉS OXIDATIVO/NITROSATIVO 15 4 BASES PARA EL ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIÓN DE MELATONINA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS 18 II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 22 II HIPOTHESIS AND OBJECTIVES 25 III MATERIAL Y MÉTODOS 28 1 MODELO QUIRÚRGICO 29 1.1 Animales 29 1.2 Procedimiento anestésico 29 1.3 Procedimientos quirúrgicos y preservación del injerto 33 2 CUIDADO GENERAL DE LOS ANIMALES RECEPTORES EN EL POSTOPERATORIO 58 3 DISEÑO EXPERIMENTAL. 58 3.1 Grupos experimentales 58 3.2 Muestras de sangre 59 3.3 Muestras tisulares para estudio del estrés oxidativo 60 3.4 Muestras tisulares para estudio histopatológico 60 4 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS 61 4.1 Estudio de la función pancreática 61 4.2 Medición de la concentración sérica de la pMAP/ITIH4 61 5 ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO 61 5.1 Cuantificación de MDA+4-HDA 61 5.2 Cuantificación de los restos carbonilo de las proteínas 62 6 EXAMEN HISTOPATOLÓGICO 62 -67 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 63 IV RESULTADOS 65 1 PROCEDIMIENTO ANESTÉSICO 66 2 TIEMPO DE ISQUEMIA 67 3 PESO DE LOS INJERTOS 67 4 SUPERVIVENCIA DEL INJERTO PANCREÁTICO 69 5 FUNCIÓN ENDOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE PÁNCREAS 70 6 FUNCIÓN EXOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE PÁNCREAS 73 7 CONCENTRACIONES DE MDA y 4-HDA EN LOS INJERTOS PANCREÁTICOS 75 8 CONCENTRACIÓN DE LOS RESTOS CARBONILO EN LOS INJERTOS PANCREÁTICOS 77 9 RESPUESTA DE LA pMAP/ITIH4 AL TRASPLANTE DE PÁNCREAS 78 10 ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO 79 V RESULTADOS INDIVIDUALIZADOS DE LOS ALOTRASPLANTES DE PÁNCREAS EN EL CERDO 84 VI DISCUSIÓN 109 MODELO QUIRÚRGICO EXPERIMENTAL 110 1. Animal de experimentación 110 2. Procedimiento quirúrgico 111 3. Procedimiento anestésico 116 INFLUENCIA DE LA MELATONINA EN LA EVOLUCIÓN DEL ALOTRASPLANTE DE PANCREAS EN EL CERDO 120 RESPUESTA DE FASE AGUDA EN EL ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS EN EL CERDO EVALUADA POR LAS CONCENTRACIONES SÉRICAS DE LA pMAP/ITIH4. INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA 125 Introducción -13A lo largo de la historia del TP se han desarrollado clínica y experimentalmente numerosos métodos de manipulación de la secreción exocrina: ligadura del conducto pancreático (9-14); obliteración del conducto pancreático con diversos polímeros sintéticos tales como neoprene (15-18), prolamina (19, 20), silicona (21) y cianocrilatos (22, 23); drenaje libre del jugo pancreático en la cavidad peritoneal (24, 25); mantenimiento de la secreción exocrina mediante la anastomosis del sistema ductal al estómago (26), esófago (27), uréter (28, 29) y pelvis renal (30, 31). Estos procedimientos mencionados han sido abandonados y, en la actualidad, prácticamente sólo se utiliza la derivación de la secreción exocrina a vejiga urinaria y a intestino delgado (yeyuno o íleon), con evidente preferencia en los últimos años por la derivación entérica en combinación con el drenaje sistémico del retorno venoso del injerto (32). El drenaje exocrino a vejiga urinaria ha sido el método preferido en la mayoría de los centros de TP hasta algo más de mediados de los años 90 (32). Nosotros también lo utilizamos experimentalmente en aquélla época (33). El procedimiento es seguro, permite la monitorización urinaria de la secreción pancreática encaminada al diagnóstico del rechazo (descenso de las amilasas y lipasas urinarias como marcador de rechazo) (34), proporciona el acceso a la biopsia cistoscópica del injerto, es más accesible a la biopsia percutánea por su emplazamiento en el cuadrante abdominal inferior y facilita el tratamiento conservador de los problemas anastomóticos con la colocación de una sonda vesical (35, 36). Sin embargo, la derivación a vejiga urinaria se asocia con una morbilidad significativa, fundamentalmente por no ser un anastomosis fisiológica, tal como hematuria, infección recidivante del tracto urinario (37, 38), uretritis -irritación genitourinaria-, deshidratación (39), acidosis metabólica secundaria a la pérdida por orina del bicarbonato excretado por el injerto, pancreatitis de reflujo (40, Introducción -1441) y fuga de anastomosis (35, 42, 43). Se requirió una conversión del drenaje vesical a drenaje entérico en un 9% al año y 17% a los 3 años de los receptores con TP registrados entre los años 2000-2003 (32). Debido a las mencionadas complicaciones del drenaje a vejiga urinaria y su impacto negativo en la calidad de vida y a los buenos resultados con la conversión entérica después del drenaje vesical, el drenaje exocrino a intestino delgado ha resurgido desde la segunda mitad de los años noventa. Efectivamente, según el IPTR, antes del año 1996 menos del 10% de todos los TP fueron realizados con derivación entérica. Desde entonces, la proporción de este procedimiento se incrementa constantemente de manera que en los años 2002-2003 el 82 % de los TPSR, el 72% de los TPDR y el 57 % de los TPS, se realizaron con derivación entérica de la secreción exocrina y, la mayoría de ellos, con una anastomosis directa del segmento duodenal del injerto al intestino delgado del receptor, es decir, sin asa desfuncionalizada en Y de Roux (32). Se ha señalado una menor incidencia de complicaciones con la duodenoenterostomía directa que con la Y de Roux (44). El drenaje exocrino a intestino delgado es un procedimiento sencillo, más fisiológico, con menor morbilidad, no presenta las complicaciones metabólicas ni urológicas y no requiere la conversión de la derivación urinaria (42, 45). Los principales inconvenientes incluyen la imposibilidad de monitorizar la amilasa urinaria como marcador de rechazo, una tasa sólo ligeramente superior de abscesos abdominales, aunque con mayor gravedad y difusión intraperitoneal puesto que sucede en un terreno intestinal contaminado y en un injerto con emplazamiento medioabdominal, y menor accesibilidad a las biopsias percutáneas. Introducción -152 LA LESIÓN DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EL RECHAZO AGUDO: DOS OBSTÁCULOS DEL TRASPLANTE DE PÁNCREAS Durante la última década se han alcanzado importantes progresos en el TP debido a a los avances en la terapia inmunosupresora, refinamientos en los procedimientos quirúrgicos, mejor tratamiento postoperatorio y mejoras de los protocolos de preservación (2, 3, 32, 46). Sin embargo, la disfunción precoz aguda del injerto todavía representa una morbilidad postoperatoria significativa. La no función primaria del injerto se ha descrito en el 3-5% de los receptores (32); la pancreatitis del injerto, un factor de alto riesgo de trombosis vascular, se ha observado en el 20% de los receptores (47). Además, el rechazo agudo (RA) se sigue produciendo en 13-22% de los TP en los primeros tres meses (48) y es la causa más frecuente de pérdida del injerto entre los días 8 y 30 post-trasplante (49). La no función primaria y la pancreatitis del injerto son dos causas importantes de pérdida del injerto y pueden ser desencadenadas por una grave lesión de isquemia-reperfusión (IR) (50, 51). El daño de IR también puede aumentar la inmunogenicidad del injerto haciéndolo más susceptible al RA ácido ascórbico (52-55). Hasta donde hoy sabemos, una lesión tisular no inmune-específica puede llevar a la aloactivación de células T y, por tanto, inducir la respuesta aloinmune (56). 3. EL ESTRÉS OXIDATIVO/NITROSATIVO: MEDIADOR CLAVE EN LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN Y EN EL RECHAZO AGUDO La IR inicia una cascada de eventos no inmunológicos antígeno independientes en el injerto. Estos eventos incluyen disfunción de la microcirculación que conlleva un fallo de la perfusión vascular, liberación de mediadores proinflamatorios que provocan la Introducción -16infiltración de los tejidos con leucocitos, necrosis celular y apoptosis que ponen en peligro la supervivencia del injerto (51, 57). La lesión pancreática por IR también involucra el estrés oxidativo (EO) que surge del desequilibrio entre la producción excesiva de radicales libres (RL) y una insuficiente defensa antioxidante (50, 56, 58). Los mecanismos específicos por los que se produce la formación de RL en la IR no están suficientemente explicados. Sin embargo, se han propuesto varias fuentes potenciales que causan sobreproducción de RL, tales como defectos en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial, activación de la xantina/xantina oxidoreductasa y la combustión fagocítica de los leucocitos polimorfonucleares que, por quimiotaxis, se concentran en el área tisular de lesión (57, 59-61). Hay gran evidencia de que el exceso de producción de especies reactivas del oxígeno (EROs) y del nitrógeno (ERNs) juega un papel fundamental en las alteraciones que se producen durante la reperfusion postisquémica de los órganos trasplantados (51, 56, 62-64). Se ha demostrado también que la isquemia fría promueve la producción de EROs, probablemente debido al daño mitocondrial (65, 66). Durante la isquemia fría se produce descenso del adenosín trifosfato (ATP) celular, degradación del ATP a adenosina, inosina e hipoxantina, y conversión de la xantindeshidrogenasa en xantinoxidasa (62). En la reperfusión, los metabolitos del ATP acumulados sirven como sustrato para la producción y liberación de EROs: la xantinoxidasa en presencia de oxígeno cataliza la degradación de hipoxantina a xantina y ácido úrico y formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión superóxido (•O2‾) (67, 68). A partir de estas dos EROs, en presencia de metales de transición (Fe, Cu), se forma radical hidroxilo (•OH) que es un radical libre extremadamente reactivo. El hierro libre o chelatable no es sólo un catalizador de la formación de EROs, sino que también contribuye directamente a la lesión inducida por la hipotermia por mediación de daño mitocondrial y la inducción de Introducción -17la apoptosis (69-71). El •OH extrae un átomo de hidrógeno de un ácido graso poliinsaturado de los fosfolípidos de membrana, lo que inicia la peroxidación lipídica (PL), produciéndose una reacción en cadena de oxidaciones sucesivas que se propagan por toda la bicapa lipídica de la membrana (72) (Figura A). El daño de los EROs también se extiende gravemente a las proteínas y a los ácidos nucleicos (73-74). El mecanismo de muerte celular posterior parece ser dependiente del ATP. El ATP es necesario para la ejecución del programa de muerte celular apoptótica, mientras que el completo agotamiento de ATP dará lugar a necrosis (75, 76). Fig. A. Efectos mediados por los RL derivados del oxígeno. Introducción -18También se acepta que el estrés oxidativo y nitrosativo ejerce un papel perjudicial en el proceso patogénico del rechazo (77-81). Las EROs y ERNs dañan el aloinjerto, activan el sistema inmune innato tanto del donante como del receptor, e inician e inducen la respuesta adaptativa aloinmune (rechazo agudo) predominantemente a través de las células presentadoras de antígeno (56). Se ha observado experimental y clínicamente que la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la generación de óxido nítrico (ON) están incrementadas durante el desarrollo del RA del injerto pancreático (77, 82), renal (83, 84), cardiaco (85-88), hepático (89-93), pulmonar (94) e intestinal (95). El ON, generado en exceso, reacciona con el •O2‾ para formar ERNs, tal como peroxinitrito (ONOO–) que tiene efectos tóxicos que conducen a la PL de los fosfolípidos de la membrana celular, oxidación de proteínas y daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN) (96). La PL altera la fluidez normal y la permeabilidad de las membranas celulares provocando edema celular, sobrecarga masiva de Ca2+ y Na+ y lisis celular. Sin duda, la IR es una de las principales cuestiones a resolver en trasplante de órganos y en consecuencia hay un enorme interés en las moléculas antioxidantes que limitan el daño causado por los RL y que pueden prevenir los efectos deletéreos de la IR, inluyendo la PL (78). 4. BASES PARA EL ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIÓN DE MELATONINA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS La melatonina (N-acetil-5-metoxi-triptamina) es un derivado indólico del triptófano que se produce en la glándula pineal de los mamíferos. La melatonina tiene influencia en los ritmos biológicos y es, así como sus metabolitos, un importante componente del sistema de defensa antioxidante (97-99). Estas moléculas proporcionan una protección Introducción -19sustancial frente a los RL generados en una variedad de condiciones experimentales como las lesiones de IR (100-104). La melatonina es actualmente la única molécula disponible que reune en sus acciones la capacidad de depurar EROs, como el anion superóxido y el radical hidroxilo, y ERNs, incluyendo el peroxinitrito, así como la capacidad de inhibir enzimas pro-oxidantes como la iNOS, de activar los enzimas antioxidantes a nivel de la expresión ácido ribonucleico (ARN) y de bloquear los factores de transcripción como el factor nuclear-kappaB (NF-kB) que inducen citoquinas proinflamatorias (96). La melatonina también aumenta la eficiencia de la cadena respiratoria disminuyendo la formación de RL y aumentando la síntesis de ATP (105), procesos muy alterados en la fisiopatología de la IR. La vitamina C o ácido ascórbico (AA) es otro “barredor” de RL y antioxidante ampliamente conocido (106, 107). Gracias a su hidrosolubilidad el AA puede acceder al ambiente acuoso de la célula y por tanto proteger los componentes citosólicos contra el daño oxidativo, pero el hecho de que el AA no sea liposoluble limita su capacidad para proteger la membrana celular. En cambio la melatonina es altamente soluble en lípidos (108), además de poseer una considerable capacidad hidrosoluble (109). Así, la melatonina supera fácilmente las barreras fisiológicas y puede alcanzar una concentración suficiente para proporcionar protección frente a los EROs (97, 98). La melatonina tiene también propiedades anti-inflamatorias (110, 111). En estudios in vivo se ha demostrado que esta indolamina reduce el edema y la peroxidación lipídica causados por pancreatitis aguda inducida por ceruleína o por IR del páncreas (112, 113). En los últimos años se ha destacado la importante relación de la melatonina con el sistema inmune. Se ha documentado ampliamente la existencia de receptores de membrana y receptores nucleares de melatonina en las células inmunocompetentes y se Introducción -20han estudiado sus implicaciones (114-122). Se ha evidenciado la síntesis de melatonina por los linfocitos humanos (123). También se ha observado que la melatonina participa en la regulación de la apoptosis de las células T (124) y B (125). En distintos modelos experimentales, la administración exógena de melatonina ha tenido un efecto modulador positivo de la respuesta inmune celular (126), de la respuesta inmune humoral (127), de la producción de citoquinas (128-130) y de la respuesta inmune no específica (131). Estas acciones inmunopotenciadoras de la melatonina han sido más evidentes en situaciones en las que el sistema inmune está deprimido que en situaciones de normalidad (132). Contrariamente, también se ha atribuido a la melatonina una acción inmunosupresora. En estudios in vitro, la melatonina ha ejercido un efecto inhibitorio sobre la producción de citoquinas (133) y sobre la proliferación de linfocitos (134). En un modelo de trasplante cardiaco en ratas, el tratamiento con melatonina a dosis elevadas ocasionó un retraso en el advenimiento del RA y una disminución de la respuesta inmune humoral y celular (135). No están claras las razones de estas propiedades aparentemente opuestas de la melatonina sobre la respuesta inmune. En este contexto puede estar implicada la cantidad administrada, dosis bajas serían inmunopotenciadoras y dosis altas ejercerían un efecto contrario inmunodepresor (98, 135, 136). Debido a que se piensa que la melatonina es un importante modulador del sistema inmune y un antioxidante eficaz, se ha propuesto recientemente la idea de que la melatonina podría aplicarse al trasplante de órganos (70, 98, 137). Sin embargo, la aplicabilidad de la melatonina en el trasplante de órganos ha sido poco estudiada. Hasta el momento sólo se han dado a conocer tres estudios, realizados todos en ratas. En los tres se han observado efectos favorables con la administración de melatonina: 1) retraso en el advenimiento del RA, con prolongación significativa de la supervivencia del Introducción -21injerto, en un modelo de trasplante cardiaco (135); 2) protección de las lesiones de reperfusión después de isquemia prolongada en un modelo de trasplante ortotópico de pulmón (138); 3) efecto beneficioso sobre la recuperación de la función renal y celular después de la reperfusión e incremento de la supervivencia del receptor en un modelo de trasplante renal (139). Hipótesis de trabajo.Objetivos -22II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Material y métodos -291 MODELO QUIRÚRGICO 1.1 Animales Hemos utilizado 48 cerdos Landrace hembras (24 donantes y 24 receptores) de 40 ± 5 kg de peso para realizar 24 alotrasplantes de páncreas con derivación entérica de la secreción exocrina y drenaje venoso sistémico. Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo Licencia del Proyecto PI036/09 aprobado por Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza. El cuidado y uso de los animales se realizaron de acuerdo con la Política Española de Protección de los Animales RD1201/05, que cumple con la normativa de la Unión Europea (Directive 86/609/EEC) sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. 1.2 Procedimiento anestésico 1.2.1 Evaluación preoperatoria La fase experimental se llevó a cabo en las instalaciones de la Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza. La evaluación preoperatoria se llevó a cabo valorando el estado de salud de los cerdos, mediante el registro de los siguientes parámetros fisiológicos: temperatura rectal, frecuencia cardiaca, color de las mucosas, tiempo de relleno capilar, peso corporal y auscultación torácica, evaluando tanto la frecuencia como la profundidad de la respiración. Los valores de los parámetros fisiológicos resultaron ser normales, dentro de los límites fisiológicos de la especie porcina, en todos los animales. Se sometió a los mismos a un ayuno previo de 12 horas para sólidos y 6 horas para líquidos. Material y métodos -301.2.2 Premedicación anestésica Debido al difícil manejo de los animales, y a la imposibilidad de cateterizar una vía periférica sin una sedación previa, la premedicación para lograr una inmovilización farmacológica de los mismos se realizó en la jaula de estabulación mediante la administración intramuscular de los siguientes fármacos: - Tiletamina-zolazepam, (Zoletil®), a dosis de 3,5 mg/kg; y - Medetomidina, (Domtor®), a dosis de 0,03 mg/kg. Estos fármacos se asociaron a atropina (Atropina Braum®) 0,02 mg/kg, para evitar el exceso de secreción salivar, bradicardia y arritmias cardiacas durante la anestesia. La administración se realizó con una jeringa conectada a una aguja hipodérmica con prolongador, para evitar la movilidad de la misma durante la inyección intramuscular en la región cervical posterior del animal. Una vez conseguida la inmovilización y decúbito lateral del animal (5-10 minutos), se procedió a su traslado hasta la mesa de quirófano para realizar el acceso a venas periféricas. Para evitar la hipotermia y prevenir la aparición de paresias o úlceras cutáneas por decúbitos prolongados durante la intervención, se colocó al cerdo en decúbito dorsal sobre un lecho mullido con una manta eléctrica. 1.2.3 Cateterización intravenosa La punción se realizó en la vena auricular de la cara dorsal de la oreja, con catéteres intravenosos (Abbocatt®) de calibre 18-20 G. Tras cateterizar la vía, ésta se fijó con cinta adhesiva para evitar su salida accidental y se conectó a una llave de tres vías y línea de infusión para la administración de fluidoterapia y fármacos. Material y métodos -311.2.4 Intubación endotraqueal y anestesia inhalatoria A los 10 minutos de la premedicación, se procedió a la intubación de cada animal, con tubos endotraqueales de los números 7-7,5, ayudados de laringoscopio con pala recta de Miller del nº 3, y en posición de decúbito prono. Si fuese necesario, se emplearía una dosis reducida de propofol para completar las maniobras de intubación. Se procedió a inflar el balón de neumotaponamiento y se fijó el tubo con cinta adhesiva. Posteriormente el tubo se conectó a un circuito circular cerrado de un sistema de anestesia general (mod. Aestiva/5, Datex-Ohmeda) equipado con ventilador mecánico. Se administró sevoflurano a 0,75 veces la concentración alveolar mínima (CAM), EtSEVO = 2,0%, en oxígeno, con su vaporizador específico (Sevotec, Datex-Ohmeda), en un flujo de gas fresco de 2 l/min. 1.2.5 Fluidoterapia y analgesia intraoperatoria La analgesia intraoperatoria se proporcionó mediante la administración intravenosa de un bolus de 2 mcg/kg de fentanilo (Fentanest ®), seguido de una infusión intravenosa continua a dosis de 4,5-6,5 mcg/kg/hora, cubriendo los requerimientos necesarios y manteniendo la frecuencia cardiaca y la presión arterial media dentro de los límites considerados como normales. Durante la intervención se administró la fluidoterapia adecuada con solución ringer lactato (Ringer Lactato, B/Braun ®) a un ritmo de infusión de 10 ml/kg/hora. 1.2.6 Ventilación mecánica Se instauró la ventilación a presión positiva intermitente (VPPI), fijando la frecuencia respiratoria en el ventilador (modelo 7100, Datex-Ohmeda) a 10 resp/min, con una relación inspiración:espiración de 1:2, con una presión media en vías aéreas de 6 cm H2O, y variando el volumen tidal para mantener estables los valores de saturación de Material y métodos -32oxígeno en hemoglobina (95-100 %) y normocapnia (34-36 mm Hg) durante todo el periodo anestésico. 1.2.7 Monitorización anestésica Se procedió a la instalación y monitorización completa de cada animal, tanto de los parámetros cardiacos y hemodinámicos (frecuencia cardiaca, electrocardiograma, presión arterial), como respiratorios (frecuencia respiratoria, volumen minuto y tidal, saturación de oxígeno en hemoglobina, fracción inspirada de oxígeno y fracción espirada de dióxido de carbono), que fueron registrados por un monitor de parámetros cardiorrespiratorios (Cardiocap/5, Datex-Ohmeda) (Tabla 1). La monitorización de la dosificación de sevoflurano se realizó mediante la concentración final espirada del mismo. Otro parámetro monitorizado durante el periodo anestésico fue la temperatura rectal. Se realizó la aspiración gástrica continua mediante una sonda gastroesofágica colocada por vía oral. La cirugía se inició con la cateterización de la vena yugular externa en el lado derecho, para mantener una vía venosa permeable durante todo el periodo de seguimiento del animal en el postoperatorio y extracción de muestras de sangre. 1.2.8 Fin de la anestesia y analgesia postoperatoria Al finalizar la intervención, se cerró el vaporizador de sevoflurano, cesando la anestesia. Durante la recuperación inmediata, se procedió a la extubación tras comprobar que respiraba espontáneamente y mantenía una ventilación y una saturación adecuadas. Para continuar la analgesia durante el periodo postoperatorio, se adminisitró buprenorfina a dosis de 10 mcg/kg a los 15 minutos antes de cerrar el vaporizador y Material y métodos -33finalizar la infusión de fentanilo y, posteriormente, se colocó un parche transdérmico de buprenorfina (Transtec® 35 mcg/h) en la región cervical posterior. A continuación se trasladó a la jaula de estabulación individual en el animalario, donde tuvo lugar la recuperación postoperatoria en condiciones de luminosidad y homeotermia adecuadas. Tabla 1: parámetros fisiológicos a mantener durante la anestesia Parámetros Frecuencia cardiaca 50-160 latidos/minuto M Frecuencia respiratoria 8-15 respiraciones /minuto Saturación O2 95-100% Volumen Tindal corriente 10 ml/kg T Volumen minuto 4,5/7,5 l/min Relación inspiración/espiración 1:2, 1:3 Presión en vías aéreas Máxima 15-20 cm de agua Mínima 1 cm de agua Media 5-8 cm de agua Et CO2 34-36 mm Hg FiO2 85-99 Temperatura 36-39 grados centígrados Presión de insuflación 15-20 cm de agua 1.3 Procedimientos quirúrgicos y preservación del injerto 1.3.1 Intervención en el donante Del animal donante extraemos en bloque un injerto pancreático-duodenal que comprende la totalidad del páncreas, un segmento del duodeno con la desembocadura de los conductos pancreáticos, un parche de aorta que incluye el tronco celíaco (TC) y la arteria mesentérica superior (AMS) con las ramas que irrigan el injerto (arteria esplénica, arteria hepática común, arteria gastroduodenal (AGD) y arterias pancreático- Material y métodos -34duodenales superiores e inferiores), y el drenaje venoso constituido por las venas mesentérica superior, esplénica y porta. Incisión. Se aborda la cavidad peritoneal a través de una laparotomía media suprainfraumbilical (Figura 1). Preparación del injerto a nivel del hilio hepático. Manteniendo levantada la cara ántero-inferior del hígado, se expone el hilio hepático (Figura 2) Fig. 1. Aspecto de la cavidad addominal porcina tras la laparotomía Fig. 2. Exposición del hilio hepático Material y métodos -35Se diseca el colédoco (Figura 3) que se secciona entre ligaduras de seda 2/0 en la proximidad del borde superior del duodeno (Figura 4). Fig. 3. Disección del colédoco en el hilio hepático Fig. 4. Sección del colédoco entre ligaduras Se liberan y seccionan entre ligaduras de seda 3/0 las ramas de la arteria hepática propia (Figura 5) y las ramas que desde esta arteria se dirigen hacia la curvadura menor del Material y métodos -36estómago. Es imprescindible conservar AGD ya que de ella depende fundamentalmente el riego del duodeno y del lóbulo derecho del páncreas. Se diseca la vena porta (Figura 6) en la proximidad del hígado, con cuidado de preservar la vena gastroduodenal (VGD). Se ha de ligar también una pequeña rama arterial que transcurre por la cara posterior de la porta. Fig. 5. Disección de las ramas de la arteria hepática propia previamente a su ligadura Fig. 6. Se han seccionado las ramas de la arteria hepática propia. Se ha disecado la vena porta. La peparación del injerto a nivel del hilio hepático ha quedado ultimada. Material y métodos -37Preparación del cuerpo y cola (lóbulo izqquierdo) del páncreas y su vascularización. El lóbulo izquierdo del páncreas (LIP) es largo y se extiende transversalmente de izquierda a derecha desde la proximidad del hilio esplénico hasta la vena mesentérica superior. En una anatomía comparada, el LIP porcino correspondería al cuerpo y cola del páncreas humano. Traccionando del estómago cranealmente, del colon transverso en sentido caudal y del bazo, que es muy grande, alargado y móvil, hacia la izquierda, se ponen tensos los epiplones gastrocólico y gastroesplénico (Figura 7) que son finos, tenues, carentes de grasa, por lo que siendo transparentes dejan ver a su través el páncreas. Se secciona el epiplon mayor, así como los vasos gastroepiplóicos izquierdos y los vasos gastroesplénicos (vasos cortos) para acceder al LIP, que yace fijo a la pared dorsal de la cavidad abdominal (Figura 8), adherido a las estructuras adyacentes por finísimas capas avasculares de tejido conjuntivo. Fig. 7. Epiplon gastrocólico y gastroesplénico. Bazo. Lóbulo izquierdo del páncreas. Material y métodos -38Fig. 8. Bazo, ya liberado, con los vasos esplénicos en su hilio. El lóbulo izquierdo del páncreas yace fijo en la pared abdominal dorsal. En el hilio esplénico se disecan y seccionan entre ligaduras la arteria (Figura 9) y la vena esplénicas por separado (Figuras 10). De esta manera queda ultimada la esplenectomía y libre el extremo izquierdo del páncreas. Fig. 9. Ligadura, para su sección, de la arteria esplénica. Material y métodos -45Fig. 18. Extremo distal del duodeno seccionado y suturado, donde están ligados los vasos pancreático-duodenales inferiores Debajo del píloro, se han preparado los vasos gastroepiplóicos derechos para su inmediata ligadura y sección. Fig. 19. Segmento duodenal, incluido en el injerto, completamente preparado. Material y métodos -461.3.2 Perfusión-lavado ex situ y almacenamiento frío del injerto Una vez extraído, el injerto se pesa (Figura 20). Se coloca en un recipiente metálico estéril y se procede a su lavado y perfusión a través del TC y de la AMS con la solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (UW) (Viaspan®) a 4ºC, a una presión de 100 cm H2O y con un volumen suficiente (150-200 cc) hasta que el líquido de perfusión que drena a través de la porta sale completamente limpio (Figura 21). Después de la perfusión, se vuelve a pesar el injerto pancreático-duodenal (Figura 20) y luego se almacena sumergido en UW dentro de una convencional bolsa ésteril que cerramos herméticamente. El injerto se embala en otra bolsa estéril y ésta en una tercera. De esta manera los injertos son almacenados durante 8 horas a 4º C. Fig. 20. Se ha pesado el injerto pancreático-duodenal inmediatamente después de su extracción (izquierda) y después del lavado-perfusión ex situ con la solución de preservación UW (derecha). Nótese en la pantalla de la balanza que después del lavadoperfusión el peso del injerto ha disminuido. Material y métodos -471.3.3 Intervención en el receptor El aloinjerto pancreático-duodenal se implanta mediante anastomosis del parche de aorta y de la vena porta del injerto a la aorta y vena cava infrarrenales del receptor. El duodeno del injerto se anastomosa a una asa ileal del receptor. Fig. 21. Injerto pancreático-duodenal después del lavado-perfusión ex situ. Parche de aorta con los orificios del tronco celíaco y de la arteria mesentérica superior. 1.3.3.1 Canalización de la vía venosa central Una vez realizada la inducción anestésica y la intubación endotraqueal, se procede a canular la vena yugular externa en el lado derecho. Se realiza una incisión vertical en la cara anterolateral del cuello a unos dos traveses de dedo de la línea media y unos 3-4 cm por encima del cartílago tiroides. Se secciona el platisma y en la cara posterolateral del músculo esternocefálico se identifica la vena yugular externa, que se diseca y se liga distalmente con seda 3-0. A continuación se realiza una incisión en la vena, se introduce el catéter en dirección de la vena cava superior (Certofix ®) y se fija con una ligadura doble de seda 3-0. Material y métodos -48El extremo distal del catéter se tuneliza por el tejido subcutáneo hasta la región cervical posterior, donde se fija con puntos de seda 2-0 (Figura 22). La vía venosa se mantendrá durante todo el postoperatorio. Fig. 22. Catéter venoso central insertado en la vena yugular externa y exteriorizado por la región póstero-lateral cervical derecha. 1.3.3.2 Preparación de la zona del implante El aloinjerto pancreático-duodenal se coloca en posición heterotópica en la cavidad peritoneal. Se realiza una laparotomía media supra-infraumbilical (Figura 23). A continuación, se disecan la aorta y la vena cava inferior distalmente a los vasos renales. Rechazando las asas intestinales en sentido craneal y el recto lateralmente hacia la izquierda, se expone el peritoneo parietal posterior que cubre la cava y la aorta infrarrenales. Por delante de la cava inferior, distalmente a las venas renales, se secciona el peritoneo parietal posterior hasta cerca de la bifurcación iliaca, disecando dicha vena cava por sus caras anterior y lateral en una extensión de 4-5 cm. De igual forma, se procede a la Material y métodos -49disección de la aorta infrarrenal, algo más distalmente que la de la cava, para facilitar las anastomosis vasculares (Figura 24). Fig. 23. Laparotomía media supra-infraumbilical en el receptor Fig. 24. Vena cava inferior y aorta abdominal disecadas por debajo de los vasos renales. Material y métodos -501.3.3.3 Preparación del pedículo arterial del injerto Tras extraer el injerto pancreático-duodenal de su almacenamiento con la solución fría de preservación UW y colocarlo en un recipiente sumergido en dicha solución, se prepara un parche de Carrel de la aorta que engloba el TC y la AMS (Figuras 25 y 26). Fig. 25. Preparación de un parche de Carrel de la aorta que engloba el TC y la AMS. Fig. 26. Injerto pancreático duodenal con el parche de aorta un momento antes de implantarlo en el receptor. Material y métodos -511.3.3.4 Realización del implante Se coloca el injerto en la cavidad peritoneal del receptor de manera que el duodeno quede orientado en sentido craneal. Se procede al clampaje lateral de la aorta infrarrenal del receptor con un clamp de Satinsky (Figura 27). Se efectúa un corte longitudinal en la cara anterior de la aorta y se procede a la anastomosis término-lateral entre el parche de Carrel aórtico del injerto y la aorta infrarrenal del receptor con suturas continuas de polipropileno 4/0 (Figuras 28 y 29). Se coloca a continuación un clamp de Satinsky en la vena cava infrarrenal, se efectúa una venotomía elíptica anterior longitudinal y se confecciona la anastomosis término-lateral entre la vena porta del injerto y la vena cava receptora, mediante suturas continuas de polipropileno 5/0, un poco por encima del lugar de la anastomosis arterial (Figuras 30-32). Fig. 27. Clampaje de la aorta abdominal infrarrenal. Material y métodos -52Fig. 28. Anastomosis entre el parche de aorta del injerto y la aorta infrarrenal del receptor. Puntos de polipropileno 4/0 en los extremos de la anastomosis. Fig. 29. Anastomosis entre el parche de aorta del injerto y la aorta infrarrenal del receptor. Se está realizando la sutura de la cara posterior. Material y métodos -53Fig. 30. Anastomosis entre la vena porta del injerto y la cava infrarrenal del receptor. Puntos de polipropileno 5/0 en los extremos de la anastomosis. Fig. 31. Anastomosis entre la vena porta del injerto y la cava infrarrenal del receptor. Se está realizando la sutura de la cara posterior. Material y métodos -54Fig. 32. Anastomosis ultimada entre la vena porta del injerto y la cava del receptor. Terminadas las anastomosis se retiran los clamps vasculares, primero el de la vena cava y luego el de la aorta, y se observa la recuperación del latido arterial, el adecuado drenaje venoso y la buena coloración del injerto (Figura 33). Fig. 33. Tras el desclampaje, la excelente coloración del injerto pancreático-duodenal, similar a la de las estructuras vecinas, testimonia la adecuada reperfusión del injerto. Material y métodos - 61 - 4 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS 4.1 Estudio de la función pancreática La concentración de glucosa se determinó por análisis enzimático con hexoquinasa, y las concentraciones de amilasa y lipasa por técnicas enzimáticas colorimétricas, realizadas todas ellas en un autoanalizador Roche/Hitachi Cobas c 711 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). La insulina y el péptido-C se midieron por técnicas de radioinmunoensayo (RIA) con kits comerciales (LINCO Research, Missouri, USA). Los injertos se consideraron funcionantes cuando se detectó normoglucemia al menos los cinco primeros días del postoperatorio. Asimismo, se diagnosticó que un animal estaba diabético cuando la glucosa sanguínea en ayunas era superior a 150 mg/dL en dos días consecutivos. 4.2 Medición de la concentración sérica de la pMAP/ITIH4 Las concentraciones séricas de la pMAP/ITIH4 se determinaron por inmunodifusión radial con gel de agarosa al 1% que contenía el antisuero específico (144) y utilizando un suero porcino como estándar secundario. La concentración de pMAP/ITIH4 en este suero se determinó previamente por inmunodifusión radial usando la proteína purificada como estándar referencia primaria. 5 ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO 5.1 Cuantificación de MDA+4-HDA Se utilizó para la medición de la peroxidación lipídica un kit Calbiochem LPO-586. Este protocolo consiste en un reactivo cromogénico que reacciona con el MDA y 4- Material y métodos - 62 - HDA a 45° C para producir un cromóforo estable con una absorbancia máxima a 586 nm de longitud de onda. Se utilizó 1,1,3,3-tetrametoxipropano como estándar. Los resultados se expresaron como nmol de MDA + 4-HDA por mg de proteínas totales. Las concentraciones de proteínas se midieron por el método de Bradford (145) con albúmina bovina como estándar 5.2 Cuantificación de los restos carbonilo de las proteínas Este test se realizó en homogeneizados de los tejidos extraídos. El contenido de restos carbonilo se valorará utilizando la metodología de Levine y cols. (146). Se trata de un test espectrofotométrico que se lee a 350 nm. La concentración se expresará en nmol de grupos carbonilo / mg de proteína. 6 EXAMEN HISTOPATOLÓGICO Para el estudio histológico las muestras se fijaron en formaldehido tamponado al 10% durante 36 horas y posteriormente fueron laminadas y procesadas para su inclusión en parafina. Se realizaron secciones de 4 micras, que se tiñeron con técnica de la hematoxilina-eosina para su visualización al microscopio. Las imágenes fueron captadas con una cámara Olympus DP71 a través de un microscopio Olympus Provis. El diagnóstico de RA y su gradación se realizó de acuerdo con el esquema de Banff (143, 147,148). Definimos el fracaso del injerto por RA como el estado diabético (glucemia > 150 mg/dL) del receptor en ausencia de trombosis vascular (arterial o venosa) del injerto u otras complicaciones técnicas en las reintervenciones y con demostración histopatológica de signos de rechazo celular agudo en las biopsias. Material y métodos - 63 - 7 ANALISIS ESTADÍSTICO Para controlar la homogeneidad de los grupos determinados por el tratamiento antioxidante, se han utilizado distintos contrastes según la escala de medida de las variables: para las categóricas se ha considerado el contraste de Chi-Cuadrado con la corrección por continuidad de Yates o la prueba exacta de Fisher, en caso necesario. Para las variables de tipo cuantitativo se ha examinado la normalidad de la distribución mediante el contraste de Kolmogorov-Smirnov con la modificación de Lilliefors; si la normalidad es asumible se ha aplicado el test de la t-Student, en caso contrario el test no paramétrico de la U de Mann-Whitney. El comportamiento de las determinaciones analíticas tras el trasplante se ha evaluado utilizando el análisis de la varianza de medidas repetidas con un factor entresujeto que es el tratamiento antioxidante utilizado, y un factor intra-sujeto que son las determinaciones en los días posteriores a la operación; también se ha considerado la interacción entre ambos. Para llevar a cabo estos análisis se han escogido contrastes polinomiales, para así contrastar relaciones lineales y cuadráticas. Se ha escogido el enfoque univariante debido a que las condiciones para el mismo se cumplían y siendo el tamaño de muestra escaso, sus resultados tienen más potencia que el enfoque multivariante. Para contrastar si la matriz de varianzas-covarianzas es similar en los grupos (control, melatonina y AA) se utilizó la generalización multivariante del contraste M de Box. Para contrastar que las varianzas de las variables creadas para los contrastes polinomiales es la misma y su covarianza nula, se utilizó el test de esfericidad de Mauchly; en caso de que esta última hipótesis no se cumpliera se han corregido los grados de libertad de la F de los contrastes mediante la Epsilon de Huynh-Feldt. Material y métodos - 64 - Para el análisis de la supervivencia, definida como días de normoglucemia, se ha utilizado un conjunto de técnicas estadísticas denominadas “análisis de supervivencia”. Estas técnicas son de tipo no paramétrico, ya que únicamente se pretende contrastar cómo se modifica el riesgo de fallo por efecto de variables externas. En primer lugar, se ha procedido a analizar la función de supervivencia y la función de riesgo acumulado (estimador producto límite de Kaplan-Meier), contrastando si la función de riesgo cambia dependiendo del tratamiento antioxidante utilizado. Para ello, se ha considerado el estimador producto límite de Kaplan-Meier, haciendo el contraste de MantelHaenszel (log-rank) entre los grupos. P ≤ 0.05 fue considerado significativo. Los datos se expresan como media ± error estándar. Resultados - 65 - IV RESULTADOS Resultados - 66 - 1 PROCEDIMIENTO ANESTÉSICO Después de la administración de la asociación tiletamina/zolazepam/medetomidina, en menos de 5 minutos se produjo la inmovilización farmacológica de todos los animales, permitiendo su manejo y manipulación. Además, a los 10 minutos después de administrar la premedicación, se pudo intubar a todos los animales en condiciones idóneas. El tiempo medio de anestesia, desde la intubación e inicio de la anestesia con sevoflurano hasta el cierre del vaporizador, fue de 234  31 minutos, siendo el tiempo medio de cirugía, desde la primera incisión hasta el último punto de sutura, de 205  16 minutos. La concentración en aire espirada de sevoflurano, necesario para obtener el plano anestésico adecuado, fue próxima o igual a 0,75 veces la CAM. La dosis media de fentanilo por infusión continua intravenosa para todos los animales, necesario para mantener los requerimientos analgésicos intraoperatorios durante el TP, fue de 5,7  0,7 mcg/kg/hora (intervalo de confianza al 95 %: 5,2-6,1). Hubo una disminución significativa (P = 0,0065) de la frecuencia cardiaca en el minuto 60 en comparación con el inicio de la anestesia. Desde el minuto 120 hasta el final de la anestesia, no se presentaron más diferencias en la misma. La presión arterial media presentó medias significativamente menores desde el minuto 120 hasta el final de la anestesia, siendo muy significativas, con respecto al inicio de la anestesia, en los minutos 120 (P = 0,0047) y 180 (P = 0,0046). La temperatura disminuyó significativamente, con respecto al inicio, desde el minuto 60 hasta el final de la anestesia, siendo muy significativo el descenso de la misma en los minutos 120 (P = 0,0057), 180 (P = 0,0043) y final (P = 0,009). Resultados - 67 - La disminución de estos parámetros durante el mantenimiento de la anestesia no tiene relevancia clínica, ya que se encuentran siempre dentro de los límites considerados como normales. Además, las medias de la frecuencia cardiaca y de la presión arterial, durante ningún momento de la anestesia, mostraron valores elevados, lo cual indica que no se apreciaron signos clínicos de dolor durante el procedimiento anestésicoquirúrgico. En los 24 receptores intervenidos, no se presentó ninguna complicación grave relacionada con el procedimiento anestésico. No hubo ningún animal que presentara despertar intraoperatorio o movimientos durante la anestesia. En los 24 receptores se pudo finalizar la intervención y efectuar el seguimiento postoperatorio del animal trasplantado. 2 TIEMPOS DE ISQUEMIA El tiempo de isquemia fría fue de 8 horas. El tiempo de isquemia caliente (desde la substracción del injerto de la solución fría hasta su revascularización) varió de 30 a 60 minutos, siendo de 51,7 ± 3 minutos en el grupo control, de 48,7 ± 2 minutos en el grupo melatonina y de 49,5 ± 1 minutos en el grupo AA (P=0,8). 3 PESO DE LOS INJERTOS El peso de los injertos pancreático-duodenales, perfundidos y preservados con la solución UW, se midió en tres momentos diferentes: inmediatamente después de la extracción, tras la perfusión-lavado ex situ con la solución de preservación, y tras las 8 horas de preservación fría. En los tres grupos el peso de los injertos experimentó una disminución significativa tras la perfusión-lavado y un descenso todavía más acusado tras las 8 horas de almacenamiento hipotérmico (P <0,001). Entre los grupos no hubo Resultados - 68 - diferencia estadística significativa en el peso de los injertos en los tres momentos mencionados (P >0,8) (Tabla 2, Figura 42). Tabla 2: peso del injerto pancreático-duodenal Después de la extracción Después del lavado ex situ Después de 8 horas de preservación fría GC 141,3 ± 9 136,3 ± 8,2* 126,7 ± 8,4*† GA 135,3 ± 6,9 129,9 ± 7* 121,3 ± 6,2*† GM 136,5 ± 5,8 130,1 ± 5,3* 121,9 ± 5*† Se muestran los resultados en gramos, como media ± error estándar. GC (n = 8), grupo control; GA (n = 8), grupo ácido ascórbico; GM (n = 8), grupo melatonina. *P < 0.001 vs el peso después de la extracción del injerto. †P < 0.001 vs el peso después del lavado ex situ del injerto. Weight Extracted graft w eight Washed graft weight Preserved graft weight 110 120 130 140 150 160 Control Ascorbic acid Melatonin Weight (g) Fig. 42. Evolución del peso de los injertos pancreático-duodenales: inmediatamente después de la extracción, tras el lavado-perfusión ex situ y después de de 8 horas de almacenamiento hipotérmico con la solución UW Resultados - 69 - 4 SUPERVIVENCIA DEL INJERTO PANCREÁTICO Inmediatamente después del trasplante los 24 aloinjertos funcionaron normalmente. El RA del injerto, confirmado por estudio histopatológico, acabó sobreviniendo en todos los TP. Los animales del grupo control rechazaron el aloinjerto pancreáticoduodenal entre los día 7 y 12 postoperatorios (media de supervivencia de 8.1 ± 0.8 días). El grupo AA fracasó sustancialmente en modificar el curso del RA y la supervivencia del injerto (9.4 ± 1.6 días) fue similar a la del grupo control (P=0.457). El tratamiento con melatonina difirió el comienzo del RA (25.1 ± 7.7 días) e incrementó significativamente la supervivencia del aloinjerto (P=0.013 y P=0.049 vs aninales no tratados y con AA, respectivamente) (Figuras 43 y 44). El 50% de los aloinjertos en el grupo melatonina fueron normofuncionantes después del día 16 postrasplante, 37.5% después de 30 días, y 25% después de 50 días. Ninguno de los injertos de los grupos control y AA alcanzó 16 días de normoglucemia, excepto uno del grupo AA que fue normofuncionante durante 17 días. Normoglycemie Control Ascorbic acid Melatonin 0 10 20 30 40 Normoglycemie (days) Figura 43. El tratamiento con melatonina incrementó significativamente la supervivencia del aloinjerto pancreático respecto al grupo control (P=0.013) y al grupo tratado con ácido ascórbico (P=0.049). Resultados - 70 - Figura 44. Supervivencia, expresada como días de normoglucemia, de los aloinjertos pancreático-duodenales. Todos los animales receptores del grupo control sin tratamiento rechazaron el aloinjerto antes del día 12 postoperatorio. La terapia con melatonina difirió el rechazo agudo y prolongó la supervivencia de los aloinjertos. El tratamiento con ácido ascórbico no modificó significativamente el curso del rechazo agudo. 5. FUNCIÓN ENDOCRINA DESPUES DEL TRASPLANTE DE PÁNCREAS La media de glucemia basal (preoperatoria) fue de 89.6 ± 2.6 mg/dL en el grupo control, 80.1 ± 4 mg/dL en el grupo melatonina y 86.3 ± 5.5 mg/dL en el grupo AA. La figura 45 ilustra los niveles de glucosa sérica observados los días 1-10 postoperatorios. Durante los cinco primeros días los niveles de glucosa tendieron a estar más bajos que Survival of Data 1:Survival proportions 010 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Control Ascorbic acid Melatonin Normoglycemie days Percent survival Días de normoglucemia Resultados - 78 - 9. RESPUESTA DE LA pMAP/ITIH4 AL TRASPLANTE DE PÁNCREAS La media basal (antes del trasplante) de los niveles séricos de pMAP/ITIH4 fueron 1.07 ± 0.09 mg/mL en el grupo control, 0.82 ± 0.19 mg/mL en el grupo melatonina y 0.86 ± 0.15 mg/mL en el grupo AA (P> 0,05). Despues del TP se observó un acusado incremento en la concentración sérica de la proteína en todos los grupos. El incremento comenzó el día 1, donde fue cinco-seis veces los valores basales, y continuó hasta alcanzar un pico el día 3. Este pico de la pMAP/ITIH4 alcanzó ocho-nueve veces el nivel basal en el grupo control (8.72 ± 1.26 mg/mL) y en el grupo AA (9.95 ± 1.86 mg/mL), pero sólo alrededor de 5 veces el nivel basal en el grupo melatonina (5.39± 0.61 mg/mL). Así, en el día 3 postrasplante, la pMAP/ITIH4 en el grupo melatonina fue significativamente inferior que en el grupo control (P=0.049) y el grupo AA (P=0.021). La figura 52 ilustra los niveles de pMAP/ITIH4. Día postoperatorio Resultados - 79 - Figura 52. Concentraciones séricas de la pig-major acute-phase protein/inter-- trypsin inhibitor heavy chain 4 (pMAP/ITIH4) basales y en los cuatro primeros días después del alotrasplante de páncreas en el cerdo, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW. Grupo control (▲) y grupos de tratamiento con melatonina (●) y ácido ascórbico (■) (n=8 cada grupo). Los datos se expresan como media ± error estándar. *Denota diferencias estadísticamente significativas (P≤ 0.05) vs animales controles y animales tratados con ácido ascórbico. 10 ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO En las reintervenciones de los receptores, realizadas cuando la glucemia era mayor de 150 mg/dL durante dos días consecutivos, los hallazgos fueron constantes: el injerto pancreático se encontraba endurecido, aumentado de grosor dos-tres veces lo normal, de color rosa-grisáceo, sin trombosis arterial ni venosa; la anastomosis duodeno-ileal era normal y sin fugas, pero el duodeno estaba adelgazado y de coloración rosa-purpúrea. El aloinjerto pancreático-duodenal estaba fuertemente adherido a estructuras vecinas y a asas intestinales que lo circundaban. El estudio histopatológico mostró en todos los aloinjertos hallazgos acordes con rechazo celular agudo, mayoritariamente de grado severo (grado III en la clasificación con esquema de Banff) (143), con áreas de grado moderado (grado II): inflamación acinar difusa, con pérdida de estructuras acinares secundarias a necrosis confluente y fibrosis resolutiva, permeación linfocitaria del epitelio ductal (Figuras 53 y 54), y signos de arteritis severa, con afectación de capas intimal, medial, y adventicial (Figuras 55 y 56), sin llegar a configurar un cuadro de arteritis necrotizante. Resultados - 80 - Figura 53. Rechazo celular agudo de acuerdo con el esquema de Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW. Pérdida del parénquima exocrino con infiltrado linfoide y atrofia acinar (hematoxilina-eosina, 400x). Resultados - 81 - Figura 54. Rechazo celular agudo de acuerdo con el esquema de Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW. Infiltrado linfoide ductal y cambios reactivos asociados (hematoxilina-eosina, 400x). Resultados - 82 - Figura 55. Rechazo celular agudo grado III de acuerdo con el esquema de Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW. Infiltrado linfoide de la pared vascular reflejando arteritis (hematoxilina-eosina, 400x). Resultados - 83 - Figura 56. Rechazo celular agudo grado III de acuerdo con el esquema de Banff en aloinjerto de páncreas porcino, sin inmunosupresión, con 8 horas de preservación fría en solución UW. Detalle de la vasculitis de la capa intima y medial de un mismo vaso (hematoxilina-eosina, 400x). Resultados individualizados - 84 - V RESULTADOS INDIVIDUALIZADOS DE LOS ALOTRASPLANTES DE PÁNCREAS EN EL CERDO Resultados individualizados - 85 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (1) Antioxidante Tiempo preservación Solución preservación Isquemia caliente Melatonina 8 horas Viaspan 45 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 119,3 g 112,8 g 105,5 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,1 1,4 1,6 2,1 2 LI; 2-3LD 11 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 93 62 59 72 78 84 93 99 101 113 112 Amilasas 849 4279 2941 1337 685 724 635 547 570 560 543 Lipasas 13,8 604,9 397,5 80,2 25,7 14,2 9,4 9,6 8,4 7,4 5,1 Insulina 1,75 15,4 11,9 3,5 3,5 3,6 3,2 2,9 2,6 2,2 1,75 C-péptido 0,1 0,61 0,42 0,23 0,25 0,27 0,27 0,29 0,25 0,23 0,21 PIG-MAP 0,82 2,88 3,17 2,88 Parámetro Día 11 Día 12 Glucemia 148 289 Amilasas 480 439 Lipasas 5 4,7 Insulina 1,70 1,75 C-péptido 0,19 0,11 MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,428 0,225 0,364 0,551 Carbonilos 8,864 9,790 10,820 11,385 Resultados individualizados - 86 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (2) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Melatonina Viaspan 8 horas 55 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 144 g 137,7 g 128,8 g bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 0,90 1,4 1,5 1,5 2-3 LI; 1-2 LD 10 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 87 78 57 51 61 69 97 93 96 112 116 Amilasas 924 8673 5143 2729 1700 1083 814 763 719 619 600 Lipasas 8 470 370,5 258,2 149 81,9 51,4 43 19,8 15,6 11,3 Insulina 1,75 10 4,8 6,5 11,75 2,5 2,3 4 3,9 2,6 1,75 C-péptido 0,1 0,12 0,13 0,28 0,28 0,28 0,29 0,34 0,31 0,3 0,28 PIG-MAP 0,59 5,3 8,19 7,81 4,44 Parámetro Día 11 Día 12 Glucemia 252 318 Amilasas 543 433 Lipasas 10,2 9,6 Insulina 1,75 1,75 C-péptido 0,12 0,14 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,192 0,290 0,158 Carbonilos 6,009 8,207 7,973 6,340 Resultados individualizados - 93 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (9) Solución preservación Tiempo preservación Antioxidante Isquemia caliente Viaspan 8 horas Ac. ascórbico 55 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 193,3 g 188,3 g 176,3 Bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. - - - - 2 LI; 2-3LD 10 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 74 36 57 49 53 60 86 93 98 116 127 Amilasas 1641 1969 2239 1898 1020 713 654 554 517 487 434 Lipasas 5,9 993 402,3 250,6 127,5 51 34,4 21,6 15 10,4 7,2 Insulina 1,75 14,8 18,4 10,2 4 3,2 2,4 3,9 3,2 2,5 1,75 C-péptido 0,1 0,85 0,96 0,81 0,4 0,44 0,34 0,5 0,51 0,3 0,21 PIG-MAP 1,52 4,73 15,97 16,75 10,41 Parámetro Día 11 Día 12 Glucemia 216 224 Amilasas 389 376 Lipasas 5,4 4,9 Insulina 1,75 1,75 C-péptido 0,11 0,11 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,313 0,324 0,424 0,284 Carbonilos 10,217 11,584 14,534 15,027 Resultados individualizados - 94 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (10) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 45 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 172,8 g - 148,5 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,1 1,3 1,9 1,9 3 LI; 1 LD 15 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 90 36 44 62 66 68 77 75 66 59 80 Amilasas 1067 12.470 7.519 2818 971 679 748 758 708 482 653 Lipasas 4,5 1083,5 437,5 102,8 80,8 73 69 77,4 44 30 20 Insulina 1,75 14,3 9,8 2,9 8 7 10,2 14,5 6,4 13,4 8 C-péptido 0,11 0,44 0,38 0,23 0,38 0,48 0,59 0,47 0,46 0,64 0,64 PIG-MAP 1,29 2,53 7,42 9,04 6,49 Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Día14 Día 15 Día 16 Día 17 Glucemia 78 98 109 114 119 212 280 Amilasas 662 687 729 634 575 537 462 Lipasas 12,8 8,7 6,8 6,5 6,2 5,6 4,1 Insulina 6,5 7,5 13,6 5,4 4,3 2,3 2,2 C-péptido 0,68 0,58 0,38 0,24 0,17 0,11 0,11 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,473 0,445 0,572 0,591 Carbonilos 8,603 9,855 11,891 9,854 Resultados individualizados - 95 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (11) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 50 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 126 g - 108,6 g Bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,3 1,4 2,1 2,2 4 5 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 85 73 46 59 82 92 156 179 196 199 247 Amilasas 731 7377 4610 3146 2038 1425 846 716 669 393 350 Lipasas 6,4 183,7 423 99,3 58,6 29 18,4 11,5 8 6,3 4,4 Insulina 11,75 14,1 9,6 2,8 8,3 2,5 3 1,75 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,12 0,49 0,28 0,18 0,48 0,36 0,22 0,13 0,1 0,1 0,1 PIG-MAP 0,99 3,65 9,7 4,73 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,361 0,204 0,201 0,455 Carbonilos 8,285 7,196 6,686 5,883 Resultados individualizados - 96 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (12) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 48 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 125,5 g 121 g 114,9 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1 1,5 1,2 1,7 1 10 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 96 61 58 53 55 67 87 81 79 74 74 Amilasas 609 6004 3.600 1981 1065 744 605 490 462 417 397 Lipasas 5,9 292,1 132,8 50 29 10 6,4 5,3 5,5 5,2 4,5 Insulina 1,75 20,4 24,1 10,7 10,9 7,8 11,2 5,3 6 8,7 5,3 C-péptido 0,1 0,58 0,76 0,45 0,45 0,45 0,45 0,35 0,37 0,37 0,28 PIG-MAP 0,9 6,18 8,95 5,33 Parámetro Día 11 Día 12 Glucemia 216 372 Amilasas 382 348 Lipasas 3,8 4,2 Insulina 6,7 1,75 C-péptido 0,42 0,12 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,440 0,276 0,354 0,441 Carbonilos 0,865 7,381 10,435 8,866 Resultados individualizados - 97 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (13) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 48 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 85,5 g 80,5 g 74,9 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,3 1,4 2 1,9 3-4 LI; 1 LD 6 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 76 60 46 43 47 68 103 218 238 252 254 Amilasas 609 5586 3831 1823 898 627 803 710 663 625 666 Lipasas 9,2 1011,1 488,9 148 51,8 26 22,3 10,2 7 8 9 Insulina 1,75 8,9 2,3 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,1 0,35 0,14 0,19 0,2 0,16 0,1 0,1 0,1 0,1 0,13 PIG-MAP 0,83 3,3 3,85 2,78 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,106 0,224 0,272 0,435 Carbonilos 9,728 11,160 10,406 10,869 Resultados individualizados - 98 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (14) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 45 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 122,4 g 115,4 g 105,4 g Bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,1 1,3 1,5 1,5 3 LI; 3 LD 5 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 68 63 69 72 74 95 219 239 260 Amilasas 460 5979 2812 1562 368 193 176 191 201 Lipasas 6,7 567,2 193,3 87,3 22,4 11 7,4 5,3 4,7 Insulina 1,75 7,9 3,7 5,7 4,7 1,75 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,1 0,31 0,28 0,26 0,26 0,11 0,1 9,1 0,1 PIG-MAP 0,33 4,91 7,67 5,34 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,197 0,158 0,207 0,408 Carbonilos 6,563 7,468 8,802 1,724 Resultados individualizados - 99 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (15) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente Ac. ascórbico Viaspan 8 horas 55 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 128 g 124,2 g 118,8 g Bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,2 1,7 1,9 2 3 LI; 2 LD 7 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 118 40 40 19 54 57 64 87 151 178 204 Amilasas 815 17670 11043 3162 1934 1441 1322 1120 1046 986 780 Lipasas 6,9 950 579 137,8 70 78,2 52 32,7 22,8 15,9 11,1 Insulina 1,75 7,5 3,6 8,7 7,8 3,6 2,5 2,6 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,13 0,21 0,38 0,54 0,55 0,29 0,41 0,41 0,38 0,16 0,1 PIG-MAP 0,47 6,18 8,93 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,271 0,321 0,227 0,342 Carbonilos 4,960 1,872 5,735 4,727 Resultados individualizados - 100 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (16) Solución preservación Tiempo preservación Antioxidante Isquemia caliente Viaspan 8 horas Ac. ascórbico 50 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 138,4 g 132,8 g 123,6 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,1 1,4 1,45 1,55 2-3 LI; 1-2 LD 17 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 84 22 66 58 73 73 68 64 50 67 68 Amilasas 924 1674 1380 1004 825 768 704 596 649 612 546 Lipasas 5,2 112,5 62 29,8 17,3 27,9 18,8 11,8 12,6 8,8 6,1 Insulina 1,75 29,9 14 5,9 2,5 8,9 4,6 3,5 1,75 2,3 2,1 C-péptido 0,1 1 0,51 0,43 0,4 0,56 0,52 0,35 0,18 0,18 0,18 PIG-MAP 0,53 4,27 8,65 5,08 Parámetro Día 11 Día 15 Día 16 Día17 Día 18 Día 19 Glucemia 68 132 149 145 160 224 Amilasas 536 561 543 490 460 457 Lipasas 7,4 5,8 5,3 5,9 4,7 4,6 Insulina 1,75 2,9 1,75 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,18 0,26 0,11 0,1 0,1 0,1 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA 0,154 0,210 0,260 0,428 Carbonilos Resultados individualizados - 101 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (17) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente No Viaspan 8 horas 45 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 143,6 g 143,1 g 131,8 g Muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 0,9 1,5 1,6 2,4 4 LI; 1 LD 11 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Glucemia 92 46 47 50 53 65 67 71 70 68 89 Amilasas 788 9749 3588 1708 1229 799 696 507 580 453 335 Lipasas 4,6 2084 503,9 154 100,2 50 50 50,1 42 26,2 19,8 Insulina 1,75 6,3 9,2 7,3 5,4 5,8 6,3 6,4 6,4 6,5 5,4 C-péptido 0,11 0,38 0,4 0,4 0,4 0,44 0,36 0,5 0,51 0,55 0,31 PIG-MAP 1,16 4,75 8,86 9,29 7,25 Parámetro Día 11 Día 12 Día 13 Glucemia 125 189 204 Amilasas 339 326 343 Lipasas 9,3 6,4 5,7 Insulina 4,3 1,75 1,75 C-péptido 0,21 0,11 0,11 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos Resultados individualizados - 102 - ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS CON DERIVACIÓN ENTÉRICA EN EL CERDO (18) Antioxidante Solución preservación Tiempo preservación Isquemia caliente No Viaspan 8 horas 40 min Peso injerto tras extrac. Peso injerto tras lavado Peso injerto tras preserv Aspecto injerto postreperfusión 123,3 g 118 g 109,2g muy bueno LI (cm) antpost donante LD (cm) antpost donante LI ant-post post-reperfusión LD ant-post post-reperfusión Grado edema 0, 1, 2, 3, 4 Días normogluc. 1,2 1,4 1,4 1,4 1 LI; 1 LD 6 Parámetro Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Glucemia 85 61 63 78 84 81 80 203 203 272 Amilasas 980 2572 1527 1060 755 705 750 774 631 527 Lipasas 5,7 226,1 92,6 48,1 26,7 18,5 71 51 14 6,2 Insulina 1,75 14,2 5,8 8,9 10,4 6,7 8,1 1,75 1,75 1,75 C-péptido 0,1 0,83 0,38 0,5 0,54 0,41 0,46 0,16 0,1 0,1 PIG-MAP 0,68 3,29 5,5 5,57 4,15 Parámetro MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C MUESTRA D MDA + 4HDA Carbonilos Discusión - 109 - VI DISCUSIÓN Discusión - 110 - MODELO QUIRÚRGICO EXPERIMENTAL 1. Animal de experimentación Hemos empleado el cerdo en nuestro modelo experimental de alotrasplante pancreáticoduodenal con derivación entérica de la secreción exocrina y drenaje venoso sistémico. El empleo de un animal de experimentación de especie grande, por su mayor similitud con la especie humana, permite que los resultados obtenidos en el laboratorio estén más próximos a ser extrapolables a la clínica. La mayoría de los TP experimentales en grandes animales han sido realizados en perros y en cerdos. Desde el primer trasplante experimental funcionante realizado en 1957 por Lichtenstein y Barschak (149) hasta el año 1990 el modelo canino ha sido el más ampliamente utilizado (8). Luego, al menos en los paises occidentales, el modelo porcino ha adquirido una mayor preponderancia por razones anatómicas, fisiológicas y prácticas. El cerdo ofrece numerosas ventajas. Es un animal de cómodo manejo, fácil de obtener en granjas autorizadas a un precio asequible, su aporte nutritivo es simple pues está habituado a los piensos comerciales y alcanza un peso óptimo en breve plazo de tiempo. Muchos órganos y sistemas de esta especie, así como las respuestas fisiológicas y fisiopatológicas, se asemejan a la especie humana. La anestesia no ofrece grandes dificultades. El catéter de la yugular externa, que sistemáticamente colocamos, puede mantenerse durante un periodo prolongado, lo que facilita las extracciones sanguíneas y la administración de fármacos. El páncreas es compacto, de estructura bien definida; su anatomía y las relaciones con otras vísceras guardan cierta semejanza a las del hombre y, presentando como en éste alguna complejidad, permite adquirir y mantener una buena destreza quirúrgica. Discusión - 111 - Por último, debido a que la diabetes mellitus tipo 1-like espontánea es muy rara en los cerdos, la diabetes debe ser inducida quirúrgica o químicamente (150); en el cerdo la pancreatectomía total para inducir la diabetes nos parece el procedimiento más eficaz y puede efectuarse conservando el duodeno y su irrigación (33, 141, 151, 152). 2. Procedimiento quirúrgico Nuestro modelo experimental se asemeja al tipo de TP clínicamente más utilizado en la actualidad. La técnica que empleamos tiene varias fases bien definidas: 1. Extraemos en el animal donante un injerto que incluye la totalidad del páncreas, un segmento de duodeno donde desembocan los conductos pancreáticos, un pedículo arterial constituido por un parche aorta que incluye el TC y la AMS, y un pedículo venoso con las venas mesentérica superior, esplénica y porta. El 99% de los TP clínicos se realizan actualmente con un injerto total de páncreas y un segmento duodenal (2ª-3ª porciones) donde drenan los conductos pancréaticos (1). El injerto segmentario, que comprende el cuerpo y la cola de páncreas vascularizados por los vasos esplénicos, prácticamente no se utiliza en la clínica humana salvo en el trasplante de donante vivo, que sólo representa el 1% de todos los TP (1, 48). 2. Efectuamos “ex situ” la perfusión-lavado del injerto con la solución fría de preservación. En este estudio, el tiempo de almacenamiento frío ha estado en torno a las 8 horas y la solución de preservación utilizada ha sido la de la Universidad de Wisconsin (UW). El páncreas, por su peculiar microarquitectura, es particularmente lábil a las maniobras de extracción y perfusión. El edema se desarrolla rápidamente incluso después de una manipulación quirúrgica menor. El flujo sanguíneo a través del Discusión - 112 - parénquima es bajo y una elevación en la presión de perfusión durante el lavado puede causar edema y disrupción del endotelio vascular. El tejido exocrino parece ser más susceptible a la lesión de preservación que el tejido endocrino. Tanto experimental como clínicamente, la perfusión del injerto pancreáticoduodenal con la solución fría de preservación puede realizarse in situ, que es lo habitual en una extracción multiorgánica de un donante en muerte encefálica, o bien ex situ una vez extraído el injerto y colocado en un recipiente estéril, como se hace en caso de trasplante de donante vivo. En la extracción aislada del páncreas en el cerdo nos parece mejor la perfusión ex situ del injerto y así procedemos en nuestro modelo experimental. La perfusión se efectúa a través del TC y de la AMS con la solución de preservación a 4ºC, infundida por la acción de la gravedad a una altura de 80100 cm y con un volumen suficiente (150-200 cc) hasta que el líquido que drena a través de la vena porta sale completamente limpio. Con la perfusión ex situ se puede observar la velocidad del goteo, el inmediato retorno por la vena porta y el limpio aspecto del líquido frío de preservación y la decoloración del páncreas (153). La perfusión y el almacenamiento frío los hemos realizado con la solución de preservación UW que es la estándar y universalmente aceptada en la preservación de órganos abdominales. Descrita en 1986 por Folkert O. Belzer y James H. Southard en la Universidad de Wisconsin (154), fue diseñada inicialmente para la preservación experimental del páncreas canino, consiguiendo una supervivencia del 100% de los animales con 72 horas de isquemia fría (155). La solución UW es el paradigma de las “soluciones intracelulares” así denominadas por poseer una composición electrolítica Discusión - 113 - parecida a la que existe en el interior de las células, con una elevada concentración de potasio y baja en sodio. La solución UW fue formulada para contrarrestrar los efectos perjudiciales clásicamente descritos del almacenamiento frio y de la reperfusión: edema celular, expansión del espacio intersticial, acidosis intracelular, reducción del metabolismo energético celular y generación de RL derrivados del oxígeno (156). Así, contiene lactobionato y rafinosa para la prevención del edema celular, hidroxietil-almidón para luchar contra la expansión del espacio intersticial, fosfato potásico como sustancia tampón (buffer) para contrarrestar la acidosis intracelular, glutation y alopurinol para la prevención del daño por RL de oxígeno, y adenosina para proporcionar sustratos en la regeneración de los fosfatos de alta energía (157). 3. Revascularizamos el alotrasplante pancreático-duodenal anastomosando el TC y la AMS con parche aórtico de Carrel del injerto a la aorta infrarrenal del receptor. Experimentalmente en el cerdo es mucho mejor efectuar la anastomosis entre el pedículo arterial del injerto y la aorta infrarrenal del receptor que con la arteria iliaca. Las arteria ilíacas porcinas son de poco diámetro y por tanto el riesgo de trombosis es muy alto si la anastomosis arterial se realizara con cualquiera de ellas. Preferimos utilizar el tramo infrarrenal de la aorta receptora por buena ubicación, gran amplitud de la luz de la anastomosis y muy buen aporte sanguíneo. De esta manera, en este estudio no se ha presentado caso alguno de trombosis arterial del injerto. 4. Realizamos el drenaje venoso en la circulación sistémica, practicando la anastomosis de la porta del injerto con la cava infrarrenal del receptor. Discusión - 114 - En la mayoría de los TP realizados en el mundo los injertos se han colocado heterotópicamente en la pelvis con anastomosis de los vasos del injerto a la arteria y a la vena iliaca receptora, por tanto, con aflujo venoso en la circulación sistémica. En nuestro modelo experimental el drenaje venoso también ha sido efectuado en la circulación sistémica, pero practicando la anastomosis de la porta del injerto en la cava infrarrenal del receptor en lugar de realizarlo en la vena iliaca que es con la que habitualmente se efectúa. Preferimos realizar la anastomosis en la cava infrarrenal receptora porque se confecciona de manera más sencilla, el injerto queda mejor ubicado en la cavidad peritoneal, con menos compromiso de espacio, es más fácil su manipulación, se obtiene gran amplitud de anastomosis y muy buen drenaje venoso. Así, no hemos observado caso alguno de trombosis venosa del injerto en nuestro modelo. En la clínica, los TP con derivación de la secreción exocrina a vejiga urinaria se realizan con drenaje venoso sistémico, mientras que los TP con derivación entérica pueden realizarse con drenaje venoso sistémico o portal. La tasa de drenaje venoso portal se ha incrementado del 6% en 1995 al 18% en 2001, pero sólo supone todavía el 24% de los TP con drenaje entérico (32, 158). 5. El drenaje entérico de la secreción exocrina del páncreas lo efectuamos mediante anastomosis látero-lateral del duodeno del injerto a un asa ileal del receptor. El TP tiene la particularidad de que la masa insular, fundamento del trasplante, sólo supone menos del 5 % de la glándula pancreática. El objetivo del trasplante no radica en el tejido exocrino del injerto y, sin embargo, es causa de importantes complicaciones después del mismo. Se han realizado grandes esfuerzos en el manejo quirúrgico del componente exocrino del injerto. Discusión - 115 - En nuestro modelo actual de TP en el cerdo hemos empleado el drenaje entérico de la secreción exocrina mediante la anastomosis látero-lateral del duodeno del injerto a un asa ileal del receptor. La elección de este procedimiento se justifica por ser un procedimiento sencillo, relativamente fisiológico, que no ocasiona problemas en nuestra experiencia experimental y que se adapta a la tendencia más extendida en la época actual. Además de los beneficios antes señalados, el drenaje entérico en el TP porcino tiene la ventaja añadida de que se vierten los fermentos pancreáticos al intestino, con lo que no se requiere el aporte oral de los mismos para compensar la insuficiencia pancreática exocrina provocada por la exéresis del páncreas nativo del receptor, que sistemáticamente realizamos con objeto de que la secreción de insulina dependa exclusivamente de la función del injerto. 6. Efectuamos en el animal receptor una pancreatectomía total con conservación del duodeno para que la única fuente de insulina sea la proporcionada por el aloinjerto de páncreas. La pancreatectomía del órgano nativo es la mejor forma de inducir la diabetes y, dadas las características anatómicas del páncreas y duodeno porcinos, se puede extirpar la totalidad de la glándula pancreática respetando la integridad del duodeno y su vascularización. Requiere el procedimiento cierta meticulosidad pero es perfectamente factible (151). En nuestra experiencia y en el presente estudio, la pancreatectomía para inducir la diabetes no se ha seguido de complicación alguna permaneciendo el duodeno del receptor perfectamente viable a lo largo de todo el seguimiento. Discusión - 116 - 3. Procedimiento anestésico Como hemos mencionado en líneas anteriores, en la actualidad la mayoría de los TP experimentales en grandes animales se realizan en cerdos (152); muchos órganos y sistemas de esta especie, así como las respuestas fisiológicas y fisiopatológicas, se asemejan a los del hombre. Sin embargo, el empleo del cerdo en investigación biomédica es costoso en personal, espacio y equipamiento técnico. Por otra parte, el TP en el cerdo puede requerir bastante tiempo, de 3 a 4 horas. En consecuencia, se requiere un procedimiento anestésico seguro y eficaz, que evite muertes intraoperatorias o en el postoperatorio inmediato que supondrían un gasto improductivo y una pérdida de los objetivos de los distintos estudios (159-161). El cerdo se considera difícil de inmovilizar y anestesiar comparado con otras especies animales. La falta de cooperación en la inmovilización física del cerdo hace necesaria la administración de fármacos que proporcionen la sedación adecuada para el manejo del mismo (162). Para obtener este propósito, en estudios anteriores se ha empleado la asociación tiletamina/zolazepam (Zoletil) junto a otro antagonista alfa-2adrenérgico, como la xilacina (162, 163), pero en pocos estudios se ha asociado tiletamina/zolazepam con medetomidina (Domtor) (164). Los resultados obtenidos en nuestro modelo demuestran la gran eficacia y seguridad de la técnica anestésica practicada, aunque los descensos observados en la presión arterial y la temperatura sugieren que la misma puede mejorarse. La premedicación intramuscular asociando tiletamina/zolazepam/medetomidina consigue la inconsciencia del animal en 1-2 minutos, manteniéndola el tiempo necesario para efectuar la intubación endotraqueal y la cateterización intravenosa (162, 163, 165). Esta asociación permite cierto grado de analgesia por el efecto de la tiletamina, fármaco disociativo de la familia de las fenciclidinas, a la que pertenece también la ketamina, por Discusión - 117 - antagonización de los receptores del ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). Además, su administración conjunta con el zolazepam, de la familia de las benzodiazepinas, permite una relajación muscular adecuada (1162, 163) con una duración de efecto mayor que otras similares como el midazolam o el diazepam, sin necesidad de emplear agentes bloqueantes neuromusculres durante el periodo postoperatorio. La asociación de tiletamina/zolazepam/medetomidina (Zoletil® + Domtor®) potencia la inmovilidad y contención del animal para acceder a una IV sin movimientos. La medetomidina posee efecto analgésico al ser un antagonista alfa-2-adrenérgico (166-170), potenciando la acción de los anestésicos inhalatorios, como el empleado en nuestro método, el sevoflurano. Esto aporta una disminución de la dosis de sevoflurano espirada (2,02,1%), necesaria para el mantenimiento anestésico seguro y eficaz, y reduce de un 20 a un 25% su concentración alveolar mínima, que en la especie porcina es 2,66% (171, 172). De esta forma, evitamos el riesgo de sobredosificación de anestésico, además de disminuir la aparición de efectos adversos y, por tanto, de complicaciones. Por otra parte, la medetomidina cuenta con antagonista, el atipamezol, que se puede administrar en caso de aparición de efectos adversos, como una bradicardia intensa. La dosis de propofol, como agente anestésico intravenoso inductor, hubiera sido de 3-10 mg/kg, pero ha sido evitada o reducida al mínimo, gracias al empleo inicial de la premedicación, permitiendo una pérdida de consciencia rápida en el animal y unas condiciones óptimas para la intubación endotraqueal. Al contrario que en otros modelos (173), no ha sido preciso el empleo de agentes bloqueantes neuromusculares durante la anestesia, ni mayor grado de profundidad de la misma, para realizar la intubación, favorecido por la administración de la premedicación anestésica. Discusión - 118 - El mantenimiento anestésico, asociando sevoflurano por vía inhalatoria y fentanilo en perfusión continua, como analgesia intraoperatoria, ha conseguido mantener al animal cardiaca y hemodinamicamente dentro de los límites considerados como normales en todo momento, con ausencia de dolor y una relajación aceptable a lo largo de la intervención, a pesar de no administrar agentes bloqueantes neuromusculares, y adaptándose a la ventilación mecánica, necesaria para mantener la normocapnia durante el procedimiento. La frecuencia cardiaca disminuyó puntualmente en el minuto 60, sólo explicable por reflejo de un estímulo vagal intenso en la primera hora de cirugía. La disminución de la presión arterial a partir del minuto 120 indica que el descenso de la misma es debido, más que a la acción sinérgica de los fármacos anestésicos empleados, al fin del efecto de la atropina (duración de la acción de 60 a 90 minutos) administrada en la premedicación (174). Por otra parte, también sugiere que se pueda reducir las dosis tanto de sevoflurano como de fentanilo durante el mantenimiento anestésico. Así, se puede evitar ese descenso significativo de la presión arterial. Futuros trabajos son necesarios para contrastar esta hipótesis. También, a pesar de disponer de un medio para preservar la temperatura corporal, como una manta térmica, se aprecia que en anestesias de larga duración, en este estudio, disminuyó la temperatura a partir del minuto 60, aunque dentro de los rangos clínicos, hasta el final de la misma, pero que después recuperó sus valores basales durante el periodo postoperatorio inmediato. Al finalizar la anestesia con el cierre del vaporizador de sevoflurano y el cese de la infusión de fentanilo, los animales recuperaron de forma progresiva los reflejos y función respiratoria, levantándose a las 2-3 horas. La farmacocinética particular del sevoflurano, con un mínimo metabolismo hepático (3%) y una una baja solubilidad en Discusión - 125 - se han utilizado las muestras tisulares pancreáticas obtenidas basalmente antes del clampaje en el donante, después de la perfusión-lavado del injerto, tras 8 horas de preservación hipotérmica pancreática y a los 30 minutos de la revascularización del injerto. Hemos observado que los restos carbonilos de las proteínas experimentan una moderada elevación después del lavado-perfusión del injerto y tras el tiempo de preservación de 8 horas, por tanto, durante el periodo de isquemia fría. Sin embargo, no se ha podido demostrar un incremento de los restos carbonilos después de la revascularización del injerto pancreático. La variedad de reacciones que se pueden generar en el estrés oxidativo es muy elevada debido a que las proteínas son estructuras muy grandes y complejas, compuestas por un gran número de aminoácidos. Aunque los RL pueden reaccionar con otras macromoléculas celulares in vitro, los ácidos grasos poiinsaturados de los lípidos parece ser la diana preferida in vivo durante la reperfusión post-isquémica (210). En nuestro estudio, a pesar de la evidencia de la peroxidación lipídica en la isquemia fría y reperfusión del injerto pancreático, las proteínas no muestran aumento en el contenido de carbonilos tras la reperfusión. RESPUESTA DE FASE AGUDA EN EL ALOTRASPLANTE DE PÁNCREAS EN EL CERDO EVALUADA POR LAS CONCENTRACIONES SÉRICAS DE LA pMAP/ITIH4. INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA La respuesta de fase aguda (RFA) es una reacción generalizada y compleja de un organismo frente a la inflamación, las infecciones y/o el daño tisular. Un rasgo destacado de esta respuesta es el aumento en la síntesis hepática de las denominadas proteínas de fase aguda (PFA), término utilizado para designar las proteínas que Discusión - 126 - modifican su concentración plasmática en un 25 por ciento o más como consecuencia de estímulos inflamatorios (211). Las PFA son biomarcadores inespecíficos pero muy sensibles, cuya concentración plasmática se modifica incluso antes de la aparición de los primeros síntomas clínicos. Por esta razón, además de reflejar fielmente la evolución de los procesos patológicos, pueden servir también como marcadores precoces de los mismos (212-214). La 2 globulina pMAP (pig-Major Acute-phase Protein) es una PFA principal en la especie porcina (144), cuya concentración aumenta entre 10-30 veces en cerdos con inflamación inducida por trementina o sometidos a un trauma quirúrgico (215). Esta proteína es homóloga a la humana P-120 (Plasma kallikrein-sensitive protein) (215, 216), y está también presente en otras especies animales (217, 218). Todas estas proteínas presentan homología con las cadenas pesadas H1, H2, H3 de los inhibidores de tripsina inter  (ITI). Por esta razón, esta nueva proteína plasmática ha recibido el nombre de ITIH4, es decir cadena pesada H4 de los ITI (219). La pMAP/ITIH4 es una PFA dependiente de la IL-6 (tipo II), como se ha demostrado en estudios con cultivos primarios de hepatocitos (140). La IL-6 es una potente citocina proinflamatoria que activa el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal y regula la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado (220). Estudios recientes sugieren que la ITIH4 humana puede actuar como una proteína antiinflamatoria, ya que se ha demostrado que inhibe la polimerización de la actina y la fagocitosis de las células polimorfonucleadas (221). El trasplante de órganos es extremadamente agresivo para el organismo receptor y desencadena una RFA similar a la producida en la inflamación pero de mayor duración (222-224). Algunos estudios han sugerido que la determinación de las PFA en trasplantes de órganos podría ser de utilidad para el seguimiento de la función del injerto y la detección temprana del RA. Entre las PFA que se han propuesto como Discusión - 127 - marcadores en trasplantes realizados en humanos están: la 1-glicoproteína ácida, 1antitripsina, haptoglobina, proteína C-reactiva (PCR) y preabúmina en el trasplante hepático (223-225), amiloide A sérico en el trasplante renal (222) y la PCR en el trasplante simultáneo de riñón y páncreas (47), entre otras. En estudios previos propusimos el uso de pMAP/ITIH4 como biomarcador de RA tras el TP en cerdos (141). Nuestros resultados actuales demuestran que la concentración de pMAP/ITIH4 aumenta en los días 2-3 postrasplante y que en el grupo melatonina se produjo una reducción significativa de los niveles de esta PFA. Esto sugiere que el daño a los tejidos, que es uno de los factores que inducen la RFA, se habría reducido en los animales tratados con melatonina. Por el contrario, los niveles de pMAP/ITIH4 en el grupo del AA fueron similares a los observados en el grupo control. En sintonía con nuestros datos, un estudio previo demostró que el tratamiento con melatonina provocó una reducción de la IL-6 en neonatos humanos después de cirugía abdominal (226). Wullstein et al (47) subrayan que el pico de los niveles séricos de la PCR dentro de las 72 horas después del trasplante clínico de páncreas-riñón es un buen parámetro para evaluar el grado de lesión tisular pancreática precoz. En nuestro modelo de TP en el cerdo, la concentración sérica de la pMAP/ITIH4 en los tres primeros días también se ha mostrado como un buen parámetro predictivo de la evolución del trasplante; niveles más bajos, como sucede en el grupo melatonina, se correspondieron con una mayor supervivencia del injerto. OTRAS PROPIEDADES DE LA MELATONINA QUE JUSTIFICAN SU APLICACIÓN EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS Discusión - 128 - Aparte de la eficacia de la melatonina en reducir el daño de IR mediado por el EO y su capacidad para disminuir las citokinas proinflamatorias, esta indolamina tiene otras características que podrían proporcionar beneficios adiccionales antes, durante y después del trasplante. Primero, varios ensayos clínicos randomizados han demostrado que la administración preoperatoria de la melatonina reduce la ansiedad preoperatoria (227); en pacientes que se van a someter a una prostatectomía, la premedicación con melatonina disminuye el dolor y mejora la calidad del sueño y los niveles de sedación en el postoperatorio (228). Segundo, estudios previos describen la actividad antibacteriana y antiviral que posee la melatonina (229, 230). Las infecciones virales y bacterianas son una causa importante de morbilidad tras el trasplante de órganos (137). La melatonina disminuye el daño oxidativo del liposacarido bacteriano y ha sido propuesta para combatir el shock endotoxico (231, 232). Una consideración final es la seguridad de la melatonina en el uso clínico. En estudios experimentales, dosis de melatonina de hasta 800 mg/Kg no provocaron fallecimiento en ratones; además, la dosis letal para el 50% de ratones (LD50) no ha podido ser determinada aun a pesar de los intentos para conseguirlo (233, 234). Tampoco se observó toxicidad con dosis altas de melatonina (200 mg/Kg) administradas a ratas embarazadas (235). Incluso la administración intravenosa de melatonina durante cirugía vascular no provocó cambios en los parámetros hemodinámicos, como la presión arterial o el pulso (236). Parece, por tanto, seguro asumir que la administración de melatonina podría ser protectora en la IR y podría tener un uso terapéutico en el manejo clínico del TP. Conclusiones - 129 - VII CONCLUSIONES Conclusiones - 130 - 1. Nuestro modelo quirúrgico de alotrasplante pancreático-duodenal con derivación entérica de la secreción exocrina y drenaje venoso sistémico en el cerdo y el procedimiento anestésico, con premedicación mediante la asociación de tiletamina/zolazepam/medetomidina, son de gran eficacia y seguridad. Presentan una escasa incidencia de complicaciones técnicas, ausencia de pérdida de animales donantes y receptores por problemas intraoperatorios, es especialmente útil para estudios de isquemia-reperfusión y preservación de órganos, y se asemeja a los procedimientos de trasplante clínico de páncreas más empleados en la actualidad. 2. La respuesta endocrina-metabólica en nuestro modelo de alotrasplante de páncreas en el cerdo, sin inmunosupresión, se ha caracterizado en el postoperatorio inmediato por una tendencia a la hipoglucemia y por elevadas concentraciones plasmáticas de insulina y c-péptido. También es típica y universal la gran elevación de los niveles séricos de enzimas pancreáticos, amilasa y lipasa, con pico el primer día y ulterior tendencia a la normalización. 3. El tratamiento con melatonina ha demostrado un efecto muy favorable en la evolución del alotrasplante de páncreas en el cerdo. Se ha comportado de forma eficaz y segura y, de manera primordial, ha prolongado significativamente la supervivencia del aloinjerto y ha retrasado la aparición del rechazo agudo. El ácido ascórbico, otro antioxidante bien conocido, fracasó en la prolongación de la supervivencia del aloinjerto pancreático. 4. La mayor supervivencia del injerto pancreático puede explicarse por la capacidad de la melatonina para neutralizar radicales libres y la peroxidación lipídica; también por sus propiedades antiinflamatorias atenuando el daño tisular, como se desprende Conclusiones - 131 - de la reducción observada en las concentraciones séricas de pMAP/ITIH4, una proteína de fase aguda positiva IL-6 dependiente. 5. La concentración sérica de la pMAP/ITIH4 en los tres primeros días del alostrasplante pancreático en el cerdo puede ser un parámetro predictivo de la evolución del trasplante; niveles más bajos se corresponderían con mejor evolución del injerto. 6. Basándonos en nuestras observaciones y en artículos previos, en los efectos positivos de la administración de melatonina en procedimientos quirúrgicos mayores y en la ausencia de efectos secundarios, podemos considerar a la melatonina como una valiosa terapia coadyuvante en el trasplante de órganos. Hay que continuar con los estudios, especialmente en ensayos clínicos, para completar el ciclo de la llamada Medicina Traslacional dirigida a amortizar en beneficio social (médico y económico) todo el ingente esfuerzo dedicado a la investigación básica preclínica. Conclusiones - 132 - VII CONCLUSIONS Conclusiones - 133 - 1. Our surgical model of pancreatic-duodenal allotransplant with enteric derivation of the exocrine secretion and systemic venous drainage and the anaesthetic protocol with premedication with tiletamine/zolazepam/medetomidine, is a safe and effective model. There is a low rate of technical complications, no lost of donor or recipient animals due to intraoperative complications. It is especially useful for ischemiareperfusion injury studies, organ preservation and is pretty similar to the clinical procedure used at present. 2. The endocrine-metabolic response in our model of pancreas allotransplant in pigs without immunosuppression is characterized by a tendency toward hypoglycaemia and a high plasmatic concentration of insulin and c-peptide in the early postoperative period. It is also typical and generalized the great elevation of the pancreatic enzymes, such as amylase and lipase, with the peak during the first day and a posterior normalization. 3. The addition of melatonin has showed a positive effect in the outcome of the pancreatic allotransplant in pigs. It has been safe and effective and basically has prolonged the survival rate of the graft and delayed the onset of the acute rejection. 4. The increase of the pancreatic graft survival might be due to free radical and lipid peroxidation scavenger capacity of melatonin. Also because of some antiinflammatory properties, with the reduction of the plasmatic concentrations of pMAP/ITIH4, an acute-phase protein related with Interluekin-6. 5. The serum concentration of pMAP/ITIH4 during the first three days could have a predictive value in the outcome of the transplant, where lower levels are related with a better evolution of the graft. Conclusiones - 134 - 6. Based on these observations and on previous papers, the positive effects of melatonin administration in major surgical procedures and the lack of side effects suggest that melatonin could be a valuable co-adjuvant therapy in organ transplantation. More studies are needed, specially clinical trials, to complete cycle of the so-called Translational Medicine, the process of turning appropriate biological discoveries into drugs and medical devices that can be used in the treatment of patients. Bibliografía - 141 - 39. Monroy-Cuadros M, Salazar A, Yilmaz S, McLaughlin K. Bladder vs enteric drainage in simultaneous pancreas-kidney transplantation. Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 483-487 40. Adamec M, Janousek L, Lipar K, Tosenovsky P, Hampl F, Saudek F, Koznarova R, Boucek P, Havrdova T. A prospective comparison of bladder versus enteric drainage in vascularized pancreas transplantation. Transplant Proc. 2004; 36: 1524-1525. 41. Stratta RJ, Gaber AO, Shokouh-Amiri MH, Reddy KS, Egidi MF, Grewal HP, Gaber LW. A prospective comparison of systemic-bladder versus portal-enteric drainage in vascularized pancreas transplantation. Surgery 2000; 127: 217-226. 42. Demartines N, Schiesser M, Clavien PA. An evidence-based analysis of simultaneous pancreas-kidney and pancreas transplantation alone. Am J Transplant 2005; 5: 2688-2697. 43. Sollinger HW, Messing EM, Eckhoff DE, Pirsch JD, D'Alessandro AM, Kalayoglu M, Knechtle SJ, Hickey D, Belzer FO. Urological complications in 210 consecutive simultaneous pancreas-kidney transplants with bladder drainage. Ann Surg 1993; 218: 561-542. 44. Steurer W, Malaise J, Mark W, Koenigsrainer A, Margreiter R; Euro-SPK Study Group. Spectrum of surgical complications after simultaneous pancreas-kidney transplantation in a prospectively randomized study of two immunosuppressive protocols. Nephrol Dial Transplant 2005; 20 Suppl 2: 54-62. 45. Leeser DB, Bartlett ST. Evolving surgical strategies for pancreas transplantation. Curr Diab Rep 2004; 4: 310-315. Bibliografía - 142 - 46. Gruessner AC, Sutherland DE, Gruessner RW. Long-term outcome after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant 2012; 17: 100-105. 47. Wullstein C, Drognitz O, Woeste G, Schareck WD, Bechstein WO, Hopt UT, Benz S. High levels of C-reactive protein after simultaneous pancreas-kidney transplantation predict pancreas graft-related complications and graft survival. Transplantation 2004; 77: 60-64. 48. Sutherland DER, Gruessner RW, Dunn DL, Matas AJ, Humar A, Kandaswamy R, Mauer SM, Kennedy WR, Goetz FC, Robertson RP, Gruessner AC, Najarian JS. Lessons learned from more than 1000 pancreas transplants at a single institution. Ann Surg 2001; 233: 463-501. 49. Drachenberg CB, Papadimitriou JC, Farney A, Wiland A, Blahut S, Fink JC, Philosophe B, Schweitzer E, Lal T, Anderson L, Bartlett ST. Pancreas Transplantation: The histologic morphology of graft loss and clinical correlations. Transplantation 2001; 71: 1784-1791. 50. Witzigmann H, Ludwig S, Armann B, Gäbel G, Teupser D, Kratzsch J, Pietsch UC, Tannapfel A, Geissler F, Hauss J, Uhlmanm D. Endothelin-A receptor blockade reduces ischemia/reperfusion injury in pig pancreas transplantation. Ann Surg 2003; 238: 264-274. 51. Drognitz O, Obermaier R, von Dobschuetz E, Pisarski P, Neeff H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas 2009; 38: 226-227. 52. Land W, Schneeberger H, Schleibner S, Illner WD, Abendroth D, Rutili G, Arfors KE, Messmer K. The beneficial effect of human recombinant superoxide Bibliografía - 143 - dismutase on acute and chronic rejection events in recipients of cadaveric renal transplants. Transplantation 1994; 57: 211-217. 53. Kiuchi T, Schlitt HJ, Oldhafer KJ, Nashan B, Ringe B, Kitai T, Tanaka A, Wonigeit K, Yamaoka Y, Pichlmayr R. Backgrounds of early intragraft immune activation and rejection in liver transplant recipients. Impact of graft reperfusion quality. Transplantation 1995; 60: 49-55. 54. Halloran PF, Homik J, Goes N, Lui SL, Urmson J, Ramassar V, Cockfield SM. The “injury response”: a concept linking nonspecific injury, acute rejection, and long-term transplant outcomes. Transplant Proc 29: 79-81, 1997. 55. Jang HR, Rabb H. The innate immune response in ischemic acute kidney injury. Clin Immunol 2009; 130: 41-50. 56. Land WG. The role of postischemic reperfusion injury and other nonantigendependent inflammatory pathways in transplantation. Transplantation 2005; 79: 505-514. 57. Zaouali MA, Ben Abdennebi H, Padrissa-Altés S, Mahfoudh-Boussaid A, Roselló-Catafau J. Pharmacological strategies against cold ischemia reperfusion injury. Expert Opin Pharmacother 2010; 11: 537-555. 58. Petersson U, Kallen R, Montgomery A, Borgstrom A. Role of oxygen-derived free radicals in protease activation after pancreas transplantation in the pig. Transplantation 1998; 65: 421-426. 59. Jaeschke H. Reactive oxygen and ischemia/reperfusion injury of the liver. Chem Biol Interact 1991; 79: 115-136. Bibliografía - 144 - 60. Hirata Y, Taguchi T, Nakao M, Yamada T, Hirose R, Suita S. The relationship between the adenina nucleotide metabolism and the conversion of xanthin oxidase enzyme system in ischemia-reperfusion of the rat small intestine. J Pediatr Surg 1996; 31: 1199-1204. 61. Casillas-Ramírez A, Mosbah IB, Ramalho F, Roselló-Catafau J, Peralta C. Past and future approaches to ischemia-reperfusion lesion associated with liver transplantation. Life Sci 2006; 79: 1881-1894. 62. McCord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. N Engl J Med 1985; 312: 159-163. 63. He SQ, Zhang YH, Venugopal SK, Dicus CW, Perez RV, Ramsamooj R, Nantz MH, Zern MA, Wu J. Delivery of antioxidative enzyme genes protects against ischemia/reperfusion-induced liver injury in mice. Liver Transpl 2006; 12:18691879. 64. Mehrabi A, Mood ZhA, Sadeghi M, Schmied BM, Müller SA, Welsch T, Kuttymuratov G, Wente MN, Weitz J, Zeier M, Morath Ch, Riediger C, Schemmer P, Encke J, Büchler MW, Schmidt J. Thymoglobulin and ischemia reperfusion injury in kidney and liver transplantation. Nephrol Dial Transplant 2007; 22 Suppl 8: viii54-viii60. 65. Ahlenstiel T, Burkhardt G, Köhler H, Kuhlmann MK. Improved cold preservation of kidney tubular cells by means of adding bioflavonoids to organ preservation solutions. Transplantation 2006; 81: 231-239. 66. Salahudeen AK, Huang H, Patel P, Jenkins JK. Mechanism and prevention of cold storage-induced human renal tubular cell injury. Transplantation 2000; 70: 14241431. Bibliografía - 145 - 67. Schachter M, Foulds S. Free radicals and the xanthine oxidase pathway. In: Grace P, Mathie R, eds. Ischaemia-Reperfusion Injury. Boston: Blackwell Science 1999: 137-156. 68. Kuppusamy P, Zweier JL. Characterization of free radical generation by xanthine oxidase. Evidence for hydroxyl radical generation. J Biol Chem 1989; 264: 98809884. 69. Huang H, Salahudeen AK. Cold induces catalytic iron release of cytochrome P450 origin: A critical step in cold storage-induced renal injury. Am J Transplant 2002; 2: 631-639. 70. Vairetti M, Ferrigno A, Bertone R, Richelmi P, Bertè F, Freitas I. Apoptosis vs. necrosis: glutathione-mediated cell death during rewarming of rat hepatocytes. Biochim Biophys Acta 2005; 1740: 367-74. 71. Lemasters JJ. Rusty notions of cell injury. J Hepatol 2004; 40: 696-698. 72. Gutteridge JMC. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chem 1995; 41: 1819-1828. 73. Byrne AT, Johnson AH. Lipid peroxidation. In: Grace P, Mathie R, eds. Ischaemia-Reperfusion Injury. Boston: Blackwell Science, 1999: 148-156. 74. Kosieradzki M, Kuczynska J, Piwowarska J, Wegrowicz-Rebandel I, Kwiatkowski A, Lisik W, Michalak G, Danielewicz R, Paczek L, Rowinski WA. Prognostic significance of free radicals: mediated injury occurring in the kidney donor. Transplantation 2003; 75: 1221-1227. 75. Kang KJ. Mechanism of hepatic ischemia/reperfusion injury and protection against reperfusion injury. Transplant Proc 2002; 34: 2659-2661. Bibliografía - 146 - 76. Kim JS, He L, Qian T, Lemasters JJ. Role of the mitochondrial permeability transition in apoptotic and necrotic death after ischemia/reperfusion injury to hepatocytes. Curr Mol Med 2003; 3: 527-35. 77. Xiaoguang N, Zhong L, Hailong C, Ping Z, Xiaofeng B, Fenglin G. The relation between apoptosis of acinar cells and nitric oxide during acute rejection of pancreas transplantation in rats. Transpl Immunol 2003; 11: 15-21. 78. Ma A, Qi S, Chen H. Antioxidant therapy for prevention of inflammation, ischemic reperfusion injuries and allograft rejection. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2008; 6: 20-43. 79. Shiraishi T, Kuroiwa A, Shirakusa T, Kawahara K, Yoneda S, Kitano K, Okabayashi K, Iwasaki A. Free radical-mediated tissue injury in acute lung allograft rejection and the effect of superoxide dismutase. Ann Thorac Surg 1997; 64: 821-825. 80. Pieper GM, Roza AM. The complex role of iNOS in acutely rejecting cardiac transplants. Free Radic Biol Med 2008; 44: 1536-1552. 81. Hasegawa T, Iwanaga K, Hultquist DE, Liao H, Visovatti SH, Pinsky DJ. Suppression of nitrosative and oxidative stress to reduce cardiac allograft vasculopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 296: H1007-H1016. 82. Tanaka S, Kamiike W, Ito T, Uchikoshi F, Matsuda H, Nozawa M, Kumura E, Shiga T, Kosaka H. Generation of nitric oxide as a rejection marker in rat pancreas transplantation. Transplantation 1995; 60: 713 –717. Bibliografía - 147 - 83. Albrecht EW, van Goor H, Tiebosch AT, Moshage H, Tegzess AM, Stegeman CA. Nitric oxide production and nitric oxide synthase expression in acute human renal allograft rejection. Transplantation 2000; 70: 1610-1616. 84. Suzuki A, Kudoh S, Mori K, Takahashi N, Suzuki T. Expression of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase in acute renal allograft rejection in therat. Int J Urol 2004; 11: 837-844. 85. Yang X, Chowdhury N, Cai B, Brett J, Marboe C, Sciacca RR, Michler RE, Cannon PJ. Induction of myocardial nitric oxide synthase by cardiac allograft rejection. J Clin Invest 1994; 94: 714-721. 86. Szabolcs MJ, Ravalli S, Minanov O, Sciacca RR, Michler RE, Cannon PJ. Apoptosis and increased expression of inducible nitric oxide synthase in human allograft rejection. Transplantation 1998; 65: 804-812. 87. Worrall NK, Misko TP, Botney MD, Sullivan PM, Hui JJ, Suau GM, Manning PT, Ferguson TB Jr. Time course and cellular localization of inducible nitric oxide synthases expression during cardiac allograft rejection. Ann Thorac Surg 1999; 67: 716-722. 88. Akizuki E, Akaike T, Okamoto S, Fujii S, Yamaguchi Y, Ogawa M, Maeda H. Role of nitric oxide and superoxide in acute cardiac allograft rejection in rats. Proc Soc Exp Biol Med 2000; 225: 151-159. 89. Kuo PC, Alfrey EJ, Krieger NR, Abe KY, Huie P, Sibley RK, Dafoe DC. Differential localization of allograft nitric oxide synthesis: comparison of liver and heart transplantation in the rat model. Immunology 1996; 87: 647-653. Bibliografía - 148 - 90. Yamaguchi Y, Okabe K, Matsumura F, Akizuki E, Matsuda T, Ohshiro H, Liang J, Yamada S, Mori K, Ogawa M. Peroxynitrite formation during rat hepatic allograft rejection. Hepatology 1999; 29: 777-784. 91. Romero M, García-Monzón C, Clemente G, Salcedo M, Alvarez E, Majano PL, Moreno-Otero R. Intrahepatic expression of inducible nitric oxide synthase in acute liver allograft rejection: evidence of modulation by corticosteroids. Liver Transpl 2001; 7: 16-21. 92. Shah V, Kamath PS. Nitric oxide in liver transplantation: pathobiology and clinical implications. Liver Transpl 2003; 9: 1-11. 93. Westerholt A, Himpel S, Hager-Gensch B, Maier S, Werner M, Stadler J, Doehmer J, Heidecke CD. Intragraft iNOS induction during human liver allograft rejection depresses cytochrome p450 activity. Transpl Int 2004; 17: 370 378. 94. Worrall NK, Boasquevisque CH, Misko TP, Sullivan PM, Ferguson TB Jr, Patterson GA Inducible nitric oxide synthase is expressed during experimental acute lung allograft rejection. J Heart Lung Transplant 1997; 16: 334-339. 95. Schaefer N, Tahara K, Pech T, Websky MV, Fujishiro J, Pantelis D, Abu-Elmagd K, Kalff JC, Hirner A, Türler A. Inducible nitric oxide synthase expression in the intestinal muscularis mediates severe smooth muscle dysfunction during acute rejection in allogenic rodent small bowel transplantation. J Surg Res 2008; 150: 159-168. 96. Korkmaz A, Reiter RJ, Topal T, Manchester LC, Oter S, Tan DX. Melatonin: an established antioxidant worthy of use in clinical trials. Mol Med 2009; 15: 43-50. Bibliografía - 149 - 97. Tan DX, Chen LD, Poeggeler B, Manchester LC, Reiter RJ. Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocr J 1993; 1: 57-60. 98. Reiter RJ, Maestroni GJM. Melatonin in relation to the antioxidative defense and immune systems: possible implications for cell and organ transplantation. J Mol Med 1999; 77: 36-39. 99. Haderland R, Tan DX, Reiter RJ. Kynuramines, metabolites of melatonin and other indoles: the resurrection of an almost forgotten class of biogenic amines. J Pineal Res 2009; 47: 109-126. 100. Ates B, Yilmaz I, Geckil H, Iraz M, Birincioglu M, Fiskin K. Protective role of melatonin given either before ischemia or prior to reperfusion on intestinal ischemia-reperfusion damage. J Pineal Res 2004; 37: 149-152. 101. Kurcer Z, Oguz E, Ozbilge H, Baba F, Aksoy N, Celik H, Cakir H, Gezen MR. Melatonin protects from ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats: this effect is not mediated by proinflammatory cytokines. J Pineal Res 2007; 43: 172178. 102. Kim SH, Lee SM. Cytoprotective effects of melatonin against necrosis and apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury in rat liver. J Pineal Res 2008; 44: 165-171. 103. Liang R, Nickkholgh A, Hoffmann K, Kern M, Schneider H, Sobirey M, Zorn M, Büchler MW, Schemmer P. Melatonin protects from hepatic reperfusion injury through inhibition of IKK and JNK pathways and modification of cell proliferation. J Pineal Res 2009; 46: 8-14. Bibliografía - 150 - 104. Chen Z, Chua CC, Gao J, Chua KW, Ho YS, Hamdy RC, Chua BH. Prevention of ischemia/reperfusion-induced cardiac apoptosis and injury by melatonin is independent of glutathione peroxdiase 1. J Pineal Res 2009; 46: 235-241. 105. López A, García JA, Escames G, Venegas C, Ortiz F, López LC, AcuñaCastroviejo D. Melatonin protects the mitochondria from oxidative damage reducing oxygen consumption, membrane potential, and superoxide anion production. J Pineal Res 2009; 46: 188-198. 106. Niki E, Noguchi N, Tsuchihashi H, Gotoh N. Interaction among vitamin C, vitamin E, and beta-carotene. Am J Clin Nutr 1995; 62: 1322S-1326S. 107. Block G, Jensen CD, Morrow JD, Holland N, Norkus EP, Milne GL, Hudes M, Dalvi TB, Crawford PB, Fung EB, Schumacher L, Harmatz P. The effect of vitamins C and E on biomarkers of oxidative stress depends on baseline level. Free Radic Biol Med 2008; 45: 377-384. 108. Costa EJ, Lopes RH, Lamy-Freund MT. Permeability of pure lipid bilayers to melatonin. J Pineal Res 1995; 19: 123-126. 109. Shida CS, Castrucci AM, Lamy-Freund MT. High melatonin solubility in aqueous medium. J Pineal Res1994; 16: 198-201. 110. Lee YD, Kim JY, Lee KH, Kwak YJ, Lee SK, Kim OS, Song DY, Lee JH, Baik TK, Kim BJ, Kim JY, Baik HW. Melatonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation in sleep-deprived mice. J Pineal Res 2009; 46: 53-57. 111. Chahbouni M, Escames G, Venegas C, Sevilla B, García JA, López LC, MuñozHoyos A, Molina-Carballo A, Acuña-Castroviejo D. Melatonin treatment normalizes plasma pro-inflammatory cytokines and nitrosative/oxidative stress in