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2013 6 Laura Vela Poves Visualización de las interacciones entre proteínas de la familia BCL-2 mediante BIFC en células vivas Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Marzo Rubio, María Isabel Naval Iraberri, Javier Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Laura Vela Poves VISUALIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2 MEDIANTE BIFC EN CÉLULAS VIVAS Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Marzo Rubio, María Isabel Naval Iraberri, Javier Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular TESIS DOCTORAL VISUALIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2 MEDIANTE BiFC EN CÉLULAS VIVAS Laura Vela Poves Licenciada en Bioquímica Para optar al grado de Doctor en Ciencias Noviembre 2012 Dña. ISABEL MARZO RUBIO, Profesora Titular de la Universidad de Zaragoza y D. JAVIER NAVAL IRABERRI, Catedrático de Biología Celular, adscritos al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza CERTIFICAN que la memoria de la Tesis Doctoral titulada “VISUALIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2 MEDIANTE BIFC EN CÉLULAS VIVAS”, presentada por Dña. Laura Vela Poves, ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de esta Universidad bajo nuestra dirección y que reúne las condiciones requeridas para que su autora pueda optar al Grado de Doctor en Ciencias. Zaragoza, 13 de noviembre de 2012 Isabel Marzo Rubio Javier Naval Iraberri Este trabajo ha sido realizado gracias a una ayuda Predoctoral de Formación de Personal Investigador (BES-2008-004081) asociada al proyecto de investigación SAF2007-60748, del Ministerio de Ciencia e Innovación. Índice v 4.4HOMO Y HETERODIMERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS PROAPOPTÓTICAS BAK Y BAX. ................................................................. 191 4.4.1Comprobación de las homodimerizaciones de Bak y Bax en las líneas celulares HCT116 y HCT116 BaxKO. ............................................................ 197 4.4.2Participación del dominio BH3 y de la hélice α 1 de Bak y Bax en su dimerización. .................................................................................................. 198 4.4.3Discusión sobre el mecanismo de dimerización de las proteínas Bak y Bax. 204 4.5EFECTO DE LA SOBREEXPRESIÓN DE PROTEÍNAS ANTIAPOPTÓTICAS SOBRE LAS INTERACCIONES DETECTADAS POR BIFC. ........................ 206 4.6COMPETICIÓN ENTRE PROTEÍNAS ANTIAPOPTÓTICAS Y BAX/BAK POR UNIRSE A PROTEÍNAS “SÓLO-BH3”. ......................................................... 214 DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................................. 227 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 233 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 237 Índice vi 3 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Antecedentes y Objetivos 3 Uno de los principales mecanismos de muerte celular es la apoptosis, descrita en el año 1972 por Kerr y colaboradores (Kerr et al. 1972). Este proceso de muerte está encaminado a la eliminación de aquellas células que están dañadas, infectadas o resultan prescindibles para el organismo. La muerte por apoptosis presenta una característica morfológica peculiar y es el mantenimiento de la membrana plasmática intacta, de manera que no se libera el contenido celular al exterior. Los cuerpos apoptóticos generados en la etapa final son fagocitados (Savill et al. 2002) y de forma general este proceso cursa en ausencia de procesos inflamatorios (Voll et al. 1997). Apoptosis y cáncer se encuentran estrechamente relacionados. La desregulación de los mecanismos de muerte por apoptosis puede romper el equilibrio que existe entre proliferación y muerte celular. Así, una alteración que favorezca los procesos de proliferación frente a los de muerte favorecería el desarrollo del cáncer. Además, la evasión de la apoptosis es una de las seis características biológicas que se necesitan para que una célula se transforme en tumoral (Hanahan and Weinberg 2000; Hanahan and Weinberg 2011). La apoptosis se puede producir a través de dos vías de señalización. La vía extrínseca o de receptores mortales se desencadena por los denominados ligandos mortales, pertenecientes a la familia del TNF (Factor de Necrosis Tumoral) (Ashkenazi and Dixit 1998). La vía intrínseca o mitocondrial, sin embargo, es inducida por estrés celular como daño al DNA, infección viral… (Shibue and Taniguchi 2006; Youle and Strasser 2008). En esta ruta participan activamente las proteínas de la familia Bcl-2 que, mediante interacciones entre ellas, regulan la permeabilización de las mitocondrias y la salida al citosol de proteínas apoptogénicas. Las proteínas de esta familia comparten al menos uno de los dominios de homología a Bcl-2 (BH). Se pueden diferenciar miembros con actividad antiapoptótica como Bcl-2, Bcl-XL o Mcl-1, y otros con actividad proapoptótica (Cory and Adams 2002). Dentro del segundo grupo se diferencian las proteínas proapoptóticas multidominio como Bak y Bax, efectores responsables de la permeabilización de las mitocondrias, y las proteínas “sólo-BH3” como Bim, PUMA, Noxa, Bid y otras que son inducidas por estímulos apoptóticos (Willis et al. 2003; Certo et al. 2006). A pesar de los avances de los últimos años en cuanto al papel de las proteínas Bcl2 en la ruta de apoptosis, existen cuestiones importantes sobre el mecanismo de acción que siguen sin resolverse. Se han propuesto dos mecanismos principales mediante los cuales las proteínas Bak y Bax se activan para llevar a cabo la Antecedentes y Objetivos 4 permeabilización de las mitocondrias. Por una parte el modelo indirecto de activación propone que Bak y Bax están neutralizados por proteínas antiapoptóticas hasta que son liberadas por proteínas “sólo-BH3” que se inducen con los estímulos apoptóticos (Willis et al. 2005; Willis et al. 2007). Por el contrario, el modelo directo de activación sugiere que ciertas proteínas “sólo-BH3”, denominadas activadoras, son capaces de unirse directamente a Bak y Bax para activarlas, una vez son liberadas de las antiapoptóticas por las “sólo-BH3” sensibilizadoras (Letai et al. 2002; Fletcher and Huang 2008a). Nuestro laboratorio tiene amplia experiencia en el estudio de las proteínas Bcl-2 especialmente en leucemias y mielomas. Trabajo previo del laboratorio ha demostrado que en condiciones normales la mayor parte de Mcl-1 se encuentra unida a Bim en células derivadas de leucemia y mieloma (Lopez-Royuela et al. 2010). Además, se ha comprobado que el silenciamiento de la proteína Bim aumenta la resistencia en modelos celulares que tienen los niveles de Mcl-1 reducidos. Estos resultados muestran que al disminuir Mcl-1 las células derivadas de leucemia y mielomas mueren debido a la liberación de Bim. En este caso los resultados permiten descartar el modelo indirecto, para estos modelos celulares y la proteína Mcl-1 en concreto. También se ha observado que en células Jurkat el tratamiento con doxorrubicina induce la activación de Bak, a pesar de que las caspasas se encuentren inhibidas (Lopez-Royuela et al. 2010). La degradación de Mcl-1 por parte de caspasas es necesaria para la inducción de apoptosis por diferentes estímulos (Nijhawan et al. 2003; Opferman et al. 2003). Probablemente en esta línea celular la degradación de Mcl-1 por las caspasas sea un evento secundario que ocurre de manera tardía. Además, como describen algunos autores, las células de determinados tumores se vuelven “adictas” a proteínas antiapoptóticas y esto hace que estén “pre-marcadas” para morir (Certo et al. 2006; Brunelle and Letai 2009). En este caso, la mayor expresión de proteínas antiapoptóticas haría que más proteínas “sólo-BH3” activadoras estuvieran unidas a ésta. Al inducirse las proteínas “sólo-BH3” sensibilizadoras, las activadoras quedarían libres para activar la ruta apoptótica. De manera complementaria se ha determinado que el papel de las proteínas proapoptóticas depende tanto del estímulo que induce la apoptosis como del modelo celular estudiado. En células Jurkat se ha observado que Bim no es esencial para la inducción de muerte por doxorrubicina, vincristina o bortezomib (Lopez-Royuela et al. 2010) aunque su silenciamiento induce un aumento compensatorio en los niveles de expresión de Noxa y PUMA. Estos datos sugerirían el papel de PUMA como activador Antecedentes y Objetivos 5 de Bak/Bax en ausencia de Bim. El silenciamiento de Noxa ofrece una reducción limitada de la toxicidad inducida por bortezomib en células Jurkat, indicando que esta proteína probablemente no se encuentra implicada en la inducción de la ruta apoptótica en este modelo celular (Galan-Malo 2010). Sin embargo, en células U937 Bim parece tener un papel esencial en la inducción de la apoptosis ya que su silenciamiento protege de la muerte inducida por doxorrubicina(Galan-Malo 2010). En estos dos modelos celulares se ha encontrado que Mcl-1 se encuentra unido a Bim, a Noxa (Galan-Malo 2010; Lopez-Royuela et al. 2010) y también a Bak (Perez-Galan et al. 2006). La inducción de apoptosis por doxorrubicina y bortezomib implicaría la participación de Noxa que se uniría a Mcl-1 y liberaría tanto a Bim, que podría activar a Bak, y también al propio Bak que estuviera neutralizado por Mcl-1 (Galan-Malo 2010). La mayoría de trabajos publicados que abordan el estudio de interacciones entre proteínas de la familia Bcl-2 están basados en las técnicas de inmunoprecipitación, o en el empleo de mitocondrias aisladas o liposomas en sistemas libres de células. Además, en la mayor parte de éstos se usan péptidos derivados del dominio BH3 de estas proteínas, no las proteínas enteras. En células intactas no se ha demostrado la existencia de interacción directa entre proteínas “sólo-BH3” putativamente activadoras y Bak/Bax. Por ello el objetivo general de esta tesis doctoral ha sido estudiar las posibles interacciones que ocurren entre miembros de la familia de proteínas Bcl-2 en células intactas mediante la técnica de Complementación Bimolecular de Fluorescencia (BiFC) (Kerppola 2006). Dentro de este objetivo principal se plantearon los siguientes objetivos concretos: 1. Estudiar el papel de las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL en la neutralización de proteínas “sólo-BH3” y de Bak/Bax. 2. Analizar el posible papel de las proteínas “sólo-BH3” Bim, PUMA y Noxa como activadoras directas de Bak y Bax. 3. Estudiar los mecanismos de dimerización de Bak y Bax. 4. Determinar los posibles dominios implicados en las mencionadas asociaciones. 5. Evaluar el efecto de la sobreexpresión de las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL en las interacciones detectadas por BiFC. INTRODUCCIÓN Introducción 15 2.2.2 Caspasas. Las caspasas pertenecen a una familia de proteasas cuyo centro activo consta de un residuo nucleofílico de cisteína (Alnemri et al. 1996) que reconoce motivos de cuatro aminoácidos, el último de los cuales es un aspártico tras el que realizan el corte (Nicholson and Thornberry 1997). En mamíferos se han descrito 14 miembros dentro de la familia de caspasas, de los cuales hay 12 miembros presentes en humanos. Las caspasas se pueden clasificar según su función en tres grandes grupos: caspasas iniciadoras y efectoras de la apoptosis y caspasas implicadas en procesos de inflamación. La siguiente figura recoge información acerca de la estructura de las caspasas de los tres tipos y la secuencia de corte que reconocen. Figura 2.2 Esquema de la estructura de caspasas y secuencia reconocida por cada una para el corte proteolítico. Modificado de (Rupinder et al. 2007). CARD: Dominio de Reclutamiento de Caspasas. DED: Dominio Efector de Muerte. En general, las caspasas se sintetizan como zimógenos (Gerald 1997), es decir, una conformación no activa que se denomina procaspasas. Estudios estructurales han demostrado que las caspasas se sintetizan como una cadena polipeptídica de entre 32 y 55 kDa que tienen 2 dominios en común: un dominio central grande (p20) que contiene el sitio activo, un dominio C-terminal (p10) también llamado subunidad catalítica pequeña (Fuentes-Prior and Salvesen 2004). Las procaspasas tienen también un prodominio N-terminal de diferente longitud según el miembro de la familia. Mientras que las caspasas ejecutoras tienen un dominio N-terminal muy corto, el de Introducción 16 las caspasas implicadas en inflamación y el de las iniciadoras es más largo y contiene motivos como el motivo de reclutamiento de caspasas (CARD, caspase recruitment domain) y/o el motivo efector de muerte (DED, death effector domain) (Figura 2.2). Para la activación de las procaspasas en respuesta a señales específicas se produce un procesamiento proteolítico entre los dominios p10 y p20 de la procaspasa en residuos específicos de aspártico. Las dos subunidades generadas interaccionan entre ellas y finalmente forman un heterotetrámero que contiene dos subunidades p10 y dos p20 (Nicholson 1999) (Figura 2.3). Destaca la presencia de un residuo de aspártico en el sitio de procesamiento de las procaspasas, lo cual concuerda con la capacidad de estas proteasas de autoactivarse o ser activadas por otros miembros de la familia generando cascadas de amplificación de la señal. Figura 2.3 Procesamiento de las procaspasas (Chowdhury et al. 2008). Para la activación de las caspasas iniciadoras 8 y 10, que participan en la vía extrínseca de la apoptosis, se propuso el modelo de proximidad (Muzio et al. 1998; Boatright et al. 2003). Según éste, la unión de un ligando mortal a su receptor provoca la unión de la proteína adaptadora FADD (Fas Associated Death Domain) al receptor y FADD recluta a varias moléculas de procaspasa a través de sus dominios DED. A continuación hay un procesamiento en trans entre las moléculas de zimógenos debido a la proximidad existente entre ellas (Figura 2.4). En primer lugar una molécula de procaspasa procesa a otra cercana y después la propia molécula de caspasa 8 termina su autoproteolización y madura (Lavrik et al. 2003). Así, la activación de la caspasa 8 se da en el llamado complejo de señalización de muerte celular o DISC (ver Introducción 17 vía extrínseca) para después ser liberada en forma de heterotetrámero al citosol para activar la apoptosis. Figura 2.4 Modelo de activación por proximidad (Bao and Shi 2007). En cuanto a la caspasa iniciadora 9, que participa en la apoptosis mediada por la vía mitocondrial, es también necesaria la oligomerización de varias moléculas de zimógeno (Srinivasula et al. 1998) en este caso a través de la proteína adaptadora Apaf-1 (Factor Activador de Proteasas Apoptóticas). El cambio conformacional de Apaf-1 inducido por la salida de citocromo c de las mitocondrias y la presencia de dATP, permite el reclutamiento de procaspasa-9 a través de los dominios CARD y la oligomerización formando un complejo macromolecular de alrededor de 1.4 MDa denominado apoptosoma (Acehan et al. 2002) (Figura 2.5). Finalmente la activación de la caspasa 9 se da por un cambio alostérico en su conformación y posterior dimerización (Rodriguez and Lazebnik 1999; Boatright et al. 2003). Figura 2.5 Modelo de activación por cambio conformacional (Bao and Shi 2007). La activación de caspasas efectoras 3, 6 y 7 se da en un proceso que comprende dos fases (Han et al. 1997) y que se describe en la figura 2.6. Primeramente, hay un procesamiento entre sus subunidades (p20 y p12). Después se da la dimerización de Introducción 18 estas subunidades y el autoprocesamiento de un dominio del extremo N-terminal de p20 generando una nueva subunidad, p17. La oligomerización de p17 y p12 da lugar a la conformación activa. Según esto, las moléculas de procaspasa efectora deben estar formando dímeros en el citosol para poder ser procesadas por las caspasas iniciadoras y que se forme la estructura heterotetramérica. Figura 2.6 Mecanismo de activación de la caspasa efectora 3 (Aguiló Anento 2009). 2.2.2.1 Inhibidores de caspasas. Los procesos de procesamiento y activación de caspasas están altamente controlados en las células con diferentes mecanismos para activarlos o inhibirlos. Se conocen diversos reguladores de caspasas que actúan bloqueando las caspasas a nivel del DISC o inhibiendo su actividad enzimática. • IAPs (Inhibitors of Apoptosis): son proteínas celulares capaces de bloquear los sitios activos de las caspasas inhibiendo su actividad proteasa. Estas proteínas pueden inhibir a la procaspasa-3 por lo que bloquean la cascada de proteolisis y ofrecen protección frente a la apoptosis que pudiera inducirse a partir de la caspasa 8 (Deveraux and Reed 1999). El miembro más importante es XIAP (X-linked mammalian inhibitor of apoptosis protein) capaz de inhibir tanto a caspasas efectoras como a la caspasa 9. Introducción 19 • Proteínas c-FLIP: son homólogos de caspasas inactivos por alteración en su sitio activo. Cuando se encuentran sobreexpresados en la célula, son capaces de inhibir la activación de la procaspasa-8 en el DISC (Thornberry and Lazebnik 1998). 2.3 VÍA INTRÍNSECA O MITOCONDRIAL DE LA APOPTOSIS. La vía intrínseca de la apoptosis se activa por señales de estrés intracelular como daño al DNA, producción de especies reactivas de oxígeno, infecciones virales, falta de factores de crecimiento o acumulación en el retículo endoplásmico de proteínas mal plegadas (Shibue and Taniguchi 2006; Youle and Strasser 2008). Todos estos estímulos inducen o activan a las proteínas proapoptóticas de la familia Bcl-2 (apartado 2.4) que controlan, mediante interacciones entre ellas, la activación de las proteínas efectoras Bax y Bak para que lleven a cabo la permeabilización de las membranas mitocondriales (Figura 2.1). En la siguiente etapa de la ruta distintos factores apoptogénicos, como el citocromo c son liberados del espacio intermembrana mitocondrial al citosol celular. La salida de citocromo c activa la formación del apoptosoma y de la procaspasa 9. Finalmente la caspasa 9 activa llevará a cabo el procesamiento de las caspasas efectoras 3 y 7 iniciando la cascada de muerte celular. Destaca también el papel de tBid conectando con la vía intrínseca las señales apoptóticas activadas por granzima B (Barry et al. 2000) y por receptores mortales en células de tipo II (Luo et al. 1998). 2.3.1 Papel de la mitocondria y sus cambios estructurales durante la apoptosis. Las mitocondrias son orgánulos implicados en la regulación de procesos indispensables para la célula como la homeostasis del calcio, la producción de energía, la proliferación celular, la senescencia y respuesta a estímulos fisiopatológicos y de estrés genético (Rasola and Bernardi 2007). Como se ha mencionado anteriormente este orgánulo es clave en la vía intrínseca de la apoptosis; además de participar también en la vía extrínseca (con tBid como mediador) así como en la ruta de apoptosis activada por granzima B (iniciada por linfocitos T citotóxicos y células NK, “natural killer”, para la eliminación de células cancerosas o infectadas por virus) (Sheridan and Martin 2010). Cuando hay un estímulo de activación de muerte de la célula que es lo suficientemente fuerte como para romper el equilibrio muerte/supervivencia celular, se producen una serie de cambios ultraestructurales y Introducción 20 fisiológicos en las mitocondrias que conducen a la célula a un punto de “no retorno”. Esto lleva a la liberación de los factores apoptogénicos que en última instancia efectúan el desmantelamiento de la célula (Cereghetti and Scorrano 2006). Además, las mitocondrias forman una red compleja que se extiende por toda la célula y están constantemente elongándose y dividiéndose mediante los procesos de fusión y fisión (Sheridan and Martin 2010). El proceso de fusión mitocondrial consiste en la unión de dos mitocondrias por fusión de sus membranas externa e interna para facilitar el intercambio de DNA y proteínas entre ellas. En él, participan las proteínas mitofusina 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2), dos GTPasas localizadas en la membrana mitocondrial externa (Eura et al. 2003), así como Opa1, una proteína situada en la membrana mitocondrial interna y que participa en el mantenimiento de las crestas mitocondriales (Olichon et al. 2003). En el proceso de fisión está implicada la proteína citosólica Drp1 que es reclutada hacia las mitocondrias en los denominados sitios de constricción donde, al multimerizar en forma de espiral alrededor de la mitocondria, es capaz de fisionarla. Uno de los cambios principales que se da en las mitocondrias durante la apoptosis es la remodelación de sus crestas. Se ha sugerido que en respuesta a un estímulo apoptótico las crestas mitocondriales se fusionen y que haya un ensanchamiento en las llamadas uniones de contacto entre las crestas. Así, el citocromo c que se localiza en un 85% en estas crestas puede redistribuirse al espacio intermembrana y ser liberado a continuación a través del la membrana mitocondrial externa (Scorrano 2009). Parece ser que el desensamblaje de oligómeros de Opa1 y disposición en forma de monómeros, es responsable del ensanchamiento de las crestas y permite la liberación total de citocromo c y progreso de la cascada apoptótica (Perkins et al. 2009; Wasilewski and Scorrano 2009). Por otro lado también se ha observado que durante la apoptosis se produce un incremento de la fisión mitocondrial y una inhibición de la fusión, lo cual lleva a que se produzca fragmentación mitocondrial. Se ha podido detectar reclutamiento de Drp1 a la membrana externa de la mitocondria, en sitios que se cree que sea donde se da preferentemente la oligomerización de Bak/Bax (Karbowski et al. 2002). Sin embargo, existe controversia acerca de la relación causal entre la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la fisión mitocondrial (Parone et al. 2006; Jeong and Seol 2008). Introducción 21 2.3.2 Permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP). Las mitocondrias poseen una doble membrana que define cuatro compartimentos claramente diferenciados: la membrana externa (MME), el espacio intermembrana (IMS), la membrana interna (MMI) y la matriz mitocondrial. En condiciones normales, la MIM es impermeable al paso de iones, permitiendo la existencia de un gradiente electroquímico de protones por el bombeo de protones desde la matriz al IMS, a través de los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria mitocondrial. Esto genera un potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), y es imprescindible para que, a partir de ADP la ATP Sintetasa genere moléculas de ATP. Existe una cierta controversia en cuanto a la forma en que ocurre la permeabilización de la membrana mitocondrial externa, pudiéndose diferenciar un modelo que implica la permeabilización de ambas membranas mitocondriales mediante un poro (PTP) o la permeabilización directa de la membrana externa mitocondrial (MOM) por parte de Bax y/o Bak.  PTP (permeability transition pore) Es un canal dependiente de voltaje y de calcio, que permite el paso de solutos de hasta 1500 kDa a través de la membrana mitocondrial interna (MMI) (Crompton 1999; Rasola and Bernardi 2007). Este PTP forma un complejo supramolecular con componentes de todos los compartimentos mitocondriales: a) VDAC, un canal ianiónico dependiente de voltaje de la membrana mitocondrial externa, b) el translocador de nucleótidos de adenina de la membrana mitocondrial interna, ANT y c) la ciclofilina D presente en la matriz mitocondrial. Se ha descrito que este poro pueda estar regulado por proteínas de la familia Bcl-2, pudiendo ser inhibido por proteínas antiapoptóticas (Marzo et al. 1998a), o bien participando Bax en su ensamblaje (Marzo et al. 1998b). Sin embargo, el PTP puede también formarse sin participación de las proteínas de la familia Bcl-2 (Scorrano et al. 2002), en un proceso dependiente de calcio (Huang et al. 2000) y de estrés oxidativo (Madesh and Hajnoczky 2001). Según este modelo la conexión de la matriz mitocondrial con el citosol causaría un choque osmótico en la mitocondria con la consiguiente ruptura de la membrana externa y salida de factores apoptogénicos. Además, aunque la membrana mitocondrial interna no llega a fragmentarse, sí que sufre una permeabilización que lleva consigo la salida de protones de manera indiscriminada y se da por ello un desacoplamiento de la cadena de transporte electrónico y de la formación de ATP que contribuye a aumentar la disfunción mitocondrial (Marchetti et al. 1996). La Introducción 22 consecuencia inmediata es la disminución del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Zamzami et al. 1995; Chen et al. 2003) seguido de la depleción de ATP (Crompton 1999). La presencia de ROS produce una serie de reacciones en la mitocondria, como es la peroxidación lipídica de la cardiolipina, que pueden favorecer la activación de la ruta intrínseca generando un bucle de retroalimentación positiva (Petrosillo et al. 2003). Además, las propias caspasas tienen como sustratos algunos componentes de la cadena de transporte electrónico, pudiendo a su vez amplificar esta señal (Marzo et al. 1998b).  MAC (mitocondrial apoptosis-induced channel) Es un canal de naturaleza proteica que se propone que formen las proteínas Bak y Bax en la membrana mitocondrial externa (Korsmeyer et al. 2000; Saito et al. 2000). Esta posibilidad se propuso al observar que estas proteínas adoptaban una estructura en horquilla que podría formar poros similares a los de toxinas bacterianas (Schlesinger et al. 1997; Schendel et al. 1998). Existen estudios con liposomas que demuestran que Bak y Bax pueden formar poros en las membranas con la ayuda de tBid y permitir la salida de citocromo c de manera independiente al poro PTP (Kuwana et al. 2002). Así, se ha propuesto que Bax pueda formar este MAC (Martinez-Caballero et al. 2005) y se ha calculado que este canal pueda contener sobre 10 monómeros de Bax para poder permitir la salida de moléculas como citocromo c (Martinez-Caballero et al. 2009). Así como se ha podido demostrar que Bax es un componente de este MAC (Dejean et al. 2005), se ha sugerido que en células carentes de Bax, la función de éste pueda ser reemplazada por Bak (Dejean et al. 2010). A diferencia del modelo PTP, el MAC no induciría despolarización en la mitocondria y se mantiene la integridad de la membrana mitocondrial externa. Además, se ha observado que proteínas pequeñas como citocromo c y Smac/DIABLO son liberadas de la mitocondria antes que otras proteínas más grandes, como AIF o EndoG, por lo que es posible que MAC sea responsable de la liberación de moléculas pequeñas y que otro proceso posterior llevara a cabo la liberación de las proteínas más grandes. Esto ha llevado a plantearse que ambos procesos de permeabilización actúen de forma sinérgica para maximizar la salida de citocromo c y la progresión de los procesos de muerte celular (Rasola and Bernardi 2007; Kinnally et al. 2011).  Poros Lipídicos Diversos trabajos proponen que la permeabilización de la membrana mitocondrial externa pueda darse por la interacción de moléculas de Bak y Bax activas con lípidos Introducción 23 de la membrana que, en última instancia formarían poros que permitirán el paso de proteínas apoptogénicos hacia el exterior (Basanez et al. 1999; Basanez et al. 2002; Tait and Green 2010). Recientemente se ha observado por crio-microscopía electrónica la formación de poros de naturaleza lipídica cuando Bax es activado por tBid y que, en ausencia de cardiolipina, proteínas de la membrana mitocondrial externa colaboran en la formación de estos poros (Schafer et al. 2009). 2.3.3 Salida de factores apoptogénicos y fase final de la apoptosis. Al producirse la permeabilización de las mitocondrias se liberan desde el espacio intermembrana al citosol diversas proteínas con función apoptogénica que van a llevar a cabo la fase final de ejecución de la apoptosis (Newmeyer and Ferguson-Miller 2003; Saelens et al. 2004) (Figura 2.7). Dentro de estos factores apoptogénicos destacan: Citocromo c: una vez en el citosol es capaz de causar un cambio conformacional en la proteína adaptadora Apaf-1, que podrá entonces oligomerizar en un proceso que requiere de la hidrólisis de ATP y formar el denominado apoptosoma. Una vez formada esta estructura, cada molécula de Apaf-1 se asocia a una molécula de caspasa 9 a través de sus dominios CARD y ésta adopta su conformación activa (Acehan et al. 2002). Así, la caspasa 9 activa será capaz de activar a las caspasas ejecutoras 3 y 7 que procederán a la proteolisis de diferentes sustratos celulares. Smac/DIABLO (Second mitochondrial activator of caspases)/(Direct IAP binding protein with low pI): es capaz de inhibir la acción de los inhibidores de apoptosis, IAPs, al romper la unión de estos a la caspasa 9 activa y caspasas ejecutoras (Verhagen et al. 2000). OMI/HtrA2 (High temperature requirement protein 2): es una serin proteasa que en condiciones fisiológicas se localiza en el espacio intermembrana y tiene función de chaperona que degrada o “re-pliega” proteínas mitocondriales mal plegadas. Cuando se induce la apoptosis y es liberada al citosol, esta proteína es capaz de unirse a los IAPs, liberando así las caspasas que podrán activarse y continuar la ejecución de la apoptosis (Srinivasula et al. 2003; Vande Walle et al. 2008). Esta proteína es también capaz de activar vías de apoptosis independientes de caspasas (Suzuki et al. 2001). AIF (Apoptosis Inducing Factor): fue descrito originalmente por Susin y colaboradores (Susin et al. 1999) como una proteína capaz de, al ser liberada de la Introducción 24 mitocondria al citosol, inducir muerte celular independiente de caspasas. En condiciones normales AIF es una flavoproteína, con función oxidorreductasa/NADH oxidasa que podría formar parte del complejo I de la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Vahsen et al. 2004; Vaux 2011). Sin embargo, cuando se activa la apoptosis, AIF es liberado al citosol y se trasloca al núcleo donde, probablemente junto a la endonucleasa G, produce la condensación de la cromatina y la fragmentación de DNA en fragmentos de alto peso molecular (≥ 50 Kpb) (Susin et al. 1999; Broker et al. 2005). También se ha descrito que pueda inducir muerte mediante la inducción de producción de radicales libres (Lipton and Bossy-Wetzel 2002), así como que la proteína antiapoptóticas Hsp70 pueda ejercer un control sobre la función apoptogénica de AIF por unión directa a él (Ravagnan et al. 2001). Endonucleasa G: normalmente se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial, y tras un estímulo apoptótico se transloca al citosol y posteriormente al núcleo para llevar a cabo la fragmentación del DNA en fragmentos oligonucleosomales, similares a los generados por la DNasa activada por caspasas (CAD) (Lorenzo and Susin 2004). Figura 2.7 Rutas extrínseca e intrínseca: activación de caspasas y salida de factores apoptogénicos (Jeong and Seol 2008). Además de la liberación de las proteínas mitocondriales con función apoptogénica descritas anteriormente, las caspasas ejecutoras que se activan por ambas rutas Introducción 31  Proteínas Proapoptóticas “sólo-BH3” Las proteínas de este grupo solamente comparten con el resto de miembros de la familia el dominio BH3. Dentro de esta subfamilia destacan las proteínas Bad, Bid, Bik, Bim, Bmf, bNIP3, Hrk, Noxa, PUMA y Spike. La función del dominio BH3 así como la identificación de la primera proteína “sóloBH3” Bik tuvo lugar el año 1995 (Boyd et al. 1995). La relevancia fisiológica de los miembros “sólo-BH3” como moléculas efectoras de muerte en animales se demostró mediante estudios genéticos en Caenorhabditis elegans, en el que se identificó la proteína “sólo-BH3” EGL-1, cuya actividad está ligada a su interacción con CED-9, el ortólogo en gusano de BCL-2 (Conradt and Horvitz 1998). Estudios filogenéticos del dominio BH3 sugirieron que la parte central de este dominio estaba formada por un motivo LXXXXGDE, donde X es cualquier aminoácido y ni glicina ni ácido glutámico están estrictamente conservados (Lanave et al. 2004). Más recientemente se ha propuesto otro motivo consenso de 13 residuos basándose en estudios estructurales y análisis de secuencias (Day et al. 2008). La leucina y el ácido aspártico son los residuos más conservados y los más importantes en las interacciones con las proteínas antiapoptóticas a través de interacciones hidrofóbicas o iónicas, respectivamente (Hinds and Day 2005). Otros tipos de interacciones como van der Waals, hidrofóbicas o hidrofílicas se han determinado más recientemente entre el dominio BH3 y el bolsillo hidrofóbico de las proteínas antiapoptóticas formado por los dominios BH1-BH4 (Lama and Sankararamakrishnan 2008). En condiciones normales estas proteínas o bien se encuentran en un estado inactivo o se expresan en niveles muy bajos. Cuando la célula recibe un estímulo apoptótico estas proteínas actúan como sensores de dicho estímulo y se produce su activación o una inducción de su expresión para que se active la apoptosis (Harris and Johnson 2001; Willis et al. 2003). El relativamente elevado número de proteínas “sóloBH3” es un indicativo de la especialización que presentan. Cada una tiene localizaciones determinadas en la células, así como los estímulos y los mecanismos por los que se activan son también diferentes (Danial 2007). La actividad de las proteínas “sólo-BH3” está regulada a múltiples niveles:  A nivel transcripcional se ha observado que estímulos apoptóticos activan la transcripción de determinadas proteínas: PUMA y Noxa son dianas transcripcionales de p53 en respuesta a daño en DNA (Oda et al. 2000; Nakano and Vousden 2001); Hrk es diana del factor de transcripción c-Jun en neuronas del cerebelo expuestas a deprivación de potasio (Ma et al. 2007). Por otra parte, las Introducción 32 señales de supervivencia promueven el silenciamiento transcripcional de los genes de proteínas “sólo-BH3”: El represor DREAM activado por IL-3 se une a la secuencia silenciadora de la región 3’ del gen Hrk inactivando su expresión (Sanz et al. 2001), mientras que los promotores de Bnip3, Noxa y Bik están silenciados epigenéticamente por metilación y acetilación de histonas en diferentes contextos celulares (Lomonosova and Chinnadurai 2008).  A nivel de estabilidad de proteínas parece ser que hay una regulación en aquellas células en que la transcripción de los miembros “sólo-BH3” está constitutivamente activa, para prevenir una apoptosis no programada (Lomonosova and Chinnadurai 2008).  Algunas proteínas “sólo-BH3” sufren modificaciones post-traduccionales para regular su actividad apoptótica: Bad es inactivada por fosforilación (Zhou et al. 2000); la fosforilación de Bim en la posición Thr112 hace disminuir su unión a Bcl-2 aumentando la supervivencia celular, mientras que si es fosforilada en Ser55, 65 y 73 se reduce su degradación por proteasoma aumentando la apoptosis (Hubner et al. 2008).  A nivel de localización subcelular se distinguen algunas proteínas “sólo-BH3” como Bik, Bim, BNIP3 y Hrk que poseen dominio transmembrana implicado en su direccionamiento a membranas intracelulares (retículo endoplásmico y mitocondria) (Lomonosova and Chinnadurai 2008). PUMA es dirigida a la mitocondria por un dominio hidrofóbico en su extremo C-terminal (Nakano and Vousden 2001), mientras que la translocación de tBID es facilitada por Nmiristoilación post-traduccional en un residuo de glicina expuesto tras el procesamiento de Bid por caspasa 8 (Zha et al. 2000). Figura 2.10 Activación de las proteínas “sólo-BH3” por diferentes tipos de estrés celular (Willis and Adams 2005a). Introducción 33 Bad es una proteína que se activa en ausencia de factores de crecimiento para ejercer su función apoptótica. Sin embargo, en condiciones normales, es fosforilada por kinasas como PI3K/AKT, lo cual provoca un cambio en su localización intracelular, de la mitocondria al citosol donde se une a proteínas 14-3-3 que la mantienen inactiva (Danial 2008). Se han caracterizado diferentes fosfatasas que defosforilan a Bad, como la calcineurina, que liberan a Bad de las proteínas 14-3-3 y podrá unirse a proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL (Wang et al. 1999). Bid se activa mediante proteolisis por la caspasa 8 al activarse la vía extrínseca de la apoptosis y es capaz de conectar, en células de tipo II, esa vía con la vía intrínseca (Li et al. 1998). También se ha observado activación de Bid por parte de otras proteasas como granzima B (Sutton et al. 2000), calpaína (Chen et al. 2001) y catepsinas (Stoka et al. 2001). En cuanto a su estructura es una proteína con mayor similitud a Bax que a las proteínas “sólo-BH3”. Una vez generado el fragmento truncado de Bid, tBid, éste se dirige a la mitocondria y se inserta en la membrana mitocondrial externa exponiendo su dominio BH3 que podrá activar a Bax. Se ha observado que la forma de integrarse en la membrana mitocondrial es muy similar a la de Bax (Billen et al. 2008b). Otros autores proponen que tBid interaccione con la cardiolipina presente en la membrana mitocondrial externa para integrarse en ésta (Terrones et al. 2008). Bik fue el primer miembro de las proteínas “sólo-BH3” que se identificó, el año 1995 (Boyd et al. 1995). Se localiza principalmente en el retículo endoplásmico aunque también se ha detectado en mitocondrias, y parece ser que actúa a través de la señalización de calcio entre el retículo endoplásmico y la mitocondria (Chinnadurai et al. 2008). Bim y Bmf: ambas proteínas se encuentran asociadas a componentes del citoesqueleto. Bim se encuentra unida en el citosol a la cadena ligera de la dineína, componente de complejo motor de los microtúbulos (Puthalakath et al. 1999) y Bmf se une a DLC2, componente del complejo motor de la miosina V (Puthalakath et al. 2001). Bim presenta tres isoformas generadas por splicing alternativo, BimEL, BimL y BimS, con diferente capacidad apoptótica (O'Connor et al. 1998). Mientras que las dos isoformas más grandes se expresan generalmente en todos los tejidos y líneas celulares, la isoforma BimS no se expresa tanto, probablemente porque es la que mayor actividad proapoptótica tiene (Pinon et al. 2008). La estabilidad de esta proteína está regulada por el sistema ubicuitin-proteasoma, de manera que la fosforilación Introducción 34 mediada por el sistema ERK1/2 lleva a su liberación del citoesqueleto, a su ubicuitinización y posterior degradación en el proteasoma (Ley et al. 2003). Bim es regulado también a nivel transcripcional por el factor de trancripción FOXO3 en respuesta a la falta de citoquinas o por estrés del retículo. Así como Bim es capaz de unirse a todos los miembros antiapoptóticos de la familia, Bmf se une preferentemente a Bcl-2, Bcl-XL y Bcl-w (Chen et al. 2005). Bim se ha visto implicado en la apoptosis de células hematopoyéticas así como de mielomas (Shibue and Taniguchi 2006; Lopez-Royuela et al. 2009) y Bmf es muy abundante en linfocitos B y T inmaduros (Pinon et al. 2008). bNIP3 parece ser la única proteína proapoptótica que ejerce su función a través de una región diferente del dominio BH3, estando implicados el dominio transmembrana y N-terminal. Además, desencadena una muerte celular independiente de Apaf-1 y de caspasas pero se la relaciona con la permeabilización de la membrana mitocondrial interna. Además, parece ser crítica para la inducción de autofagia por hipoxia (Hossini and Eberle 2008). Hrk o Harakiri es capaz de interaccionar con Bcl-XL y Bcl-2. Se expresa en tejidos hematopoyéticos, páncreas, hígado, pulmón, riñón y próstata (Inohara et al. 1997). Su expresión se induce en neuronas por falta del factor de crecimiento neuronal o frente a tratamiento con beta-amiloide. Noxa y PUMA son dianas del factor de transcripción p53 y parece que no requieren modificaciones posttraduccionales para ejercer su función. PUMA es capaz de unirse a todos las proteínas antiapoptóticas de la familia mientras que Noxa sólo lo hace a Mcl-1 y A-1 (Chen et al. 2005). Se ha descrito que la unión de Noxa a Mcl-1 induce la degradación de la última a través del proteasoma (Willis et al. 2005). Se han detectado al menos dos isoformas de PUMA, α y β, (Nakano and Vousden 2001) cuya localización en la mitocondria depende de su dominio C-terminal (Yu and Zhang 2008). La expresión de PUMA es baja en condiciones normales, pero se induce rápidamente en respuesta a diferentes situaciones de estrés celular (Yu et al. 2001). Aunque se considera que PUMA es la proteína que media de manera principal la apoptosis dependiente de p53 en respuesta daño en DNA, también se ha observado que Noxa juega un papel importante dependiendo de los estímulos desencadenantes de la apoptosis y del estado de otros genes (Villunger et al. 2003). Introducción 35 Hay ciertos estímulos como el estrés del retículo, la falta de citoquinas, glucorticoides o hipoxia que son capaces de activar la transcripción de PUMA y Noxa e inducir apoptosis independiente de p53 (Kim et al. 2004; Ploner et al. 2008; Yu and Zhang 2008). Spike presenta una localización diferente a otros miembros de la subfamilia, puesto que no se ha observado asociada al retículo endoplásmico (Mund et al. 2003). Además, no se ha detectado que interaccione con otros miembros de la familia Bcl-2, hecho probablemente indicativo de que activa vías de apoptosis independientes de interacciones mediante el dominio BH3 (Hossini and Eberle 2008). 2.4.1 Interacciones entre las proteínas de la familia Bcl-2. Como se ha explicado anteriormente, las proteínas de la familia Bcl-2 se regulan mediante interacciones entre los diferentes miembros que llevan a la activación de las proteínas Bak y Bax, encargadas de permeabilizar las membranas mitocondriales para que se ejecute la fase final de la apoptosis. Sin embargo, a pesar de que se han realizado numerosos estudios para entender la forma cómo Bak y Bax se activan, los resultados obtenidos son en muchos casos contradictorios y no se ha podido llegar a un modelo de activación consensuado. Actualmente existen dos modelos principales que tratan de explicar cómo ocurre esta activación: El modelo directo (Figura 2.11) defiende que existen proteínas “sólo-BH3” capaces de unirse y activar directamente a Bax y Bak. A éstas se las denomina activadoras y se ha sugerido principalmente que cumplan este papel Bid y Bim (Letai et al. 2002; Kuwana et al. 2005; Certo et al. 2006); aunque algunos trabajos también proponen a PUMA (Gallenne et al. 2009; Kim et al. 2009; Ren et al. 2010), p53 (Kim et al. 2006) y más recientemente a Noxa (Du et al. 2010; Dai et al. 2011) como proteínas activadoras. Por otro lado, según este modelo, el resto de las proteínas “sólo-BH3” serían proteínas sensibilizadoras, que se unirían a las antiapoptóticas liberando así a las activadoras para que activen a Bak y Bax. Introducción 36 Figura 2.11 Modelo directo de activación de Bak y Bax. A. En condiciones normales, las proteínas antiapoptóticas (esferas azules) están unidas y neutralizando a las proteínas “sóloBH3” activadoras (esferas rosas). B. Al activarse la apoptosis, las proteínas “sólo-BH3” sensibilizadoras (esferas azules pequeñas) se unen a las antiapoptóticas, liberando a las activadoras que se unen directamente para activar a las moléculas de Bax (esferas naranjas) y provocan su translocación a la membrana mitocondrial externa. Adaptado de Fletcher y colaboradores (Fletcher and Huang 2008a; Galan-Malo 2010). Algunos trabajos basados en péptidos sintéticos sugieren que los dominios BH3 de Bid y Bim son capaces de unirse directamente a Bak y Bax activándolos y provocando salida de citocromo c de las mitocondrias (Letai et al. 2002; Kuwana et al. 2005; Certo et al. 2006). También hay estudios que, empleando liposomas y la técnica FRET, han determinado que el fragmento truncado de Bid, t-Bid, es liberado por Bad de su unión a Bcl-XL y es capaz de activar a Bax (Lovell et al. 2008). Además, trabajos recientes han detectado por RMN la interacción entre Bax y Bim, que parece darse en una región de Bax diferente al dominio BH3, y que conduce a Bax a su oligomerización (Gavathiotis et al. 2008; Czabotar et al. 2009). Otros autores proponen que PUMA pueda actuar como proteína activadora de Bax y Bak (Gallenne et al. 2009; Kim et al. 2009; Ren et al. 2010). Se ha descrito que PUMA interacciona con Bax en una región muy próxima a la determinada para Bim y que también dista del dominio BH3 de Bax, lo cual concuerda con datos publicados años antes (Cartron et al. 2004a). BH3 BH3 Introducción 37 Respecto a la proteína Noxa, se ha publicado recientemente que pueda tener un papel importante como activadora de Bax en ausencia de Bcl-XL; y que la presencia de Bad en un sistema basado en liposomas hace que Noxa pueda entonces activar a Bax (Du et al. 2010; Dai et al. 2011). El papel de p53 también ha sido discutido en la literatura. Uno de los modelos propone que p53 se une a Bcl-XL hasta que su propia diana transcripcional, PUMA, lo libera y puede así actuar como activador directo de Bax (Chipuk et al. 2004; Chipuk et al. 2005). Otros autores, sin embargo, defienden que p53 actúa como proteína sensibilizadora de manera que tendría el papel de desplazar a Bim de su unión con las proteínas antiapoptóticas Mcl-1, Bcl-2 y Bcl-XL (Han et al. 2010). Existen algunos estudios basados en la técnica de inmunoprecipitación que han detectado una interacción directa de Bim con Bax, aunque también sugieren que Bim pueda actuar a su vez uniéndose a proteínas antiapoptóticas siguiendo el modelo indirecto de activación de Bak y Bax (Marani et al. 2002). Otros autores plantean que, así como en ausencia de Bim las moléculas de Bax están neutralizadas por proteínas antiapoptóticas, cuando Bim se encuentra en las células, éste es capaz de unirse a Bax de forma transitoria y activarlo (Merino et al. 2009). También se ha detectado que solamente cuando Bim se encuentra desfosforilado, lo cual se da en ausencia de factores de crecimiento como IL-3, puede interaccionar con Bax (Harada et al. 2004). Resulta interesante el hecho de que aquellas proteínas que se han considerado durante más tiempo como activadoras son capaces de interaccionar con todas las proteínas antiapoptóticas, mientras que las que se cree que tienen papel de sensibilizadoras tienen preferencias claras por determinados miembros antiapoptóticos (Figura 2.12). Sin embargo, recientemente se ha sugerido que todas las proteínas “sólo-BH3” tengan una cierta capacidad de activar a Bak y Bax, y que éste no sea un fenómeno de “todo o nada”, si no que dependiendo del estímulo que desencadene la apoptosis se induzcan unas u otras proteínas “sólo-BH3” y que éstas actúen bien activando a Bax y Bak, bien inactivando a las proteínas antiapoptóticas (Du et al. 2010). Introducción 38 Figura 2.12 Panel de interacciones entre las proteínas antiapoptóticas y las “sólo-BH3” (Galan-Malo 2010). El modelo indirecto (Figura 2.13) sugiere que las proteínas antiapoptóticas actúan fundamentalmente neutralizando a Bak y Bax. De esta manera, cuando las proteínas “sólo-BH3” se inducen por diferentes estímulos apoptóticos, éstas van a unirse a las antiapoptóticas liberando así a las moléculas de Bax y Bak que podrán activarse y llevar a cabo la permeabilización de la membrana mitocondrial. Figura 2.13 Modelo indirecto de activación de Bax y Bak. En condiciones normales (A), las proteínas antiapoptóticas (esferas azules) se encuentran unidas y neutralizando a las moléculas de Bak activado (esferas amarillas) y de Bax no citosólico (esferas naranjas). Cuando se activa la apoptosis (B) las proteínas “sólo-BH3” (esferas azules pequeñas) van a unirse a las proteínas antiapoptóticas, desplazando a Bak y Bax que se activan a oligomerizan para provocar la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Modificado de Fletcher y colaboradores (Fletcher and Huang 2008a). Introducción 39 Los autores que defienden este modelo, presentan en sus trabajos datos sobre las interacciones que ocurren entre los miembros antiapoptóticos y las proteínas Bax y Bak (Figura 2.14). Así, según estos trabajos Bak es capaz de interaccionar y ser neutralizado por Mcl-1 y Bcl-XL. Estas conclusiones se basan en estudios de inmunoprecipitación y de unión de péptidos in vitro (Willis et al. 2005; Willis et al. 2007). Otros autores también han detectado la unión de Bak a Mcl-1 (Bae et al. 2000) y Bcl-XL (Farrow et al. 1995) mediante ensayos de doble híbrido en levaduras así como de coinmunoprecipitación (Cuconati et al. 2003; Leu et al. 2004) aunque ésta depende de los detergentes empleados en la preparación de los lisados celulares (Germain et al. 2008). Además, se ha descrito que la unión de Mcl-1 y Bcl-XL a Bak es imprescindible para proteger de la muerte mediada por Bak (Nijhawan et al. 2003). En cuanto a la proteína Bax los mismos autores defienden que es controlada e inhibida por todos los miembros antiapoptóticos (Willis et al. 2005; Willis et al. 2007). Aunque no se ha podido detectar su interacción mediante coinmunoprecipitación con miembros antiapoptóticos de la familia como Mcl-1 (Germain et al. 2008), un estudio anterior empleando ensayo de doble híbrido sugiere que esta interacción pueda existir (Sedlak et al. 1995). También hay estudios que descartan la activación de Bak y Bax por unión directa de proteínas “sólo-BH3”. Éste es el caso de los trabajos que muestran la activación de Bax mediada por PUMA, pero descartando la unión de ésta a Bax (Marani et al. 2002; Jabbour et al. 2009). Figura 2.14 La activación de Bak requiere la neutralización de Mcl-1 y Bcl-XL, mientras que para la activación de Bax es necesario que todas las proteínas antiapoptóticas queden neutralizadas por miembros “sólo-BH3” (Fletcher and Huang 2008a). Introducción 40 También destaca la interpretación de las diferentes afinidades de las proteínas “sólo-BH3” por los miembros antiapoptóticos. Así, los autores partidarios del modelo indirecto defienden que las proteínas “sólo-BH3” con mayor capacidad de inducir apoptosis (especialmente Bim y PUMA) son aquellas que pueden neutralizar a todas las proteínas antiapoptóticas; mientras que el hecho de tener un espectro menor de unión (como Bad, Noxa, Baik, Hrk…) condiciona una menor capacidad de provocar muerte (Chen et al. 2005; Uren et al. 2007). Está clara la controversia que existe en cuanto a la activación de Bax y Bak y existen argumentos en contra de ambos modelos de activación. Así, en contra del modelo directo estaría el hecho de no haberse podido detectar una interacción directa en células intactas entre Bak y las proteínas supuestamente activadoras o que la eliminación de Bim y Bid no evite la apoptosis de las células ante determinados estímulos (Adams and Cory 2007; Willis et al. 2007). Y contra el modelo indirecto destacaría el hecho de que la interacción entre Bax y las proteínas antiapoptóticas sólo haya sido detectada al emplearse detergentes no iónicos que es conocido que cambian la conformación de Bax hacia una conformación activa (Hsu and Youle 1997). Debido a esta gran controversia y habiendo visto que hay aspectos de ambos modelos que son ciertos (Ott et al. 2009) diversos autores están proponiendo durante estos últimos años un modelo “alternativo” que pretende unificar los dos anteriores según las evidencias a favor de uno y otro (Brunelle and Letai 2009; Dewson and Kluck 2009; Llambi et al. 2011). Este modelo mixto (Figura 2.15) contempla la posibilidad de que exista una fracción de Bak y Bax que se encuentren en un estado “pre-activado” en la célula, bien por calor (Pagliari et al. 2005) u otros mecanismos espontáneos no conocidos. Las proteínas antiapoptóticas tendrían, pues, el papel de secuestrar a estas moléculas “pre-activadas” de Bak y Bax así como a las proteínas “sólo-BH3” activadoras. La otra subfamilia de “sólo-BH3” sería capaz de desplazar de las proteínas antiapoptóticas a las activadoras y a las formas activas de Bax y Bak. Finalmente, las proteínas activadoras podrían activar más moléculas de Bak y Bax y también se contempla la posibilidad de que las propias Bak y Bax activas sean capaces de amplificar esta señal de activación (Tan et al. 2006). Además, este modelo también sugiere que Bak y Bax activos se localizan insertados en la membrana mitocondrial externa con una conformación tal que las proteínas antiapoptóticas pueden unirse a ellas y evitar la permeabilización de dicha membrana (Leber et al. 2007; Leber et al. 2010). Ya que este modelo plantea que la mayoría de interacciones ocurren cuando las proteínas están insertadas en membrana, se ha propuesto el nombre de Embedded Together Model o Modelo de Inserción en Membrana (Leber Introducción 47 expresión tanto de Bcl-2 como de Bcl-XL e ISIS 20408, que actúa sobre Mcl-1 (Marzo and Naval 2008). 2.5 TÉCNICAS EMPLEADAS PARA EL ESTUDIO DE INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS. Los avances durante la última década en la secuenciación de diferentes genomas han permitido obtener valiosa información acerca de las proteínas codificadas en los diferentes genes. A partir de esa información, muchos investigadores han centrado sus esfuerzos en estudiar las funciones y propiedades de estas proteínas (Piehler 2005). Las proteínas tienen funciones esenciales en la célula, y las interacciones proteína-proteína (IPP) son fundamentales para muchos procesos biológicos, desde la formación de estructuras celulares y complejos enzimáticos hasta la regulación de vías de señalización celular (Lalonde et al. 2008). Por ello, se ha planteado que descifrar las redes de interacciones entre proteínas, interactomas, es imprescindible para entender todos esos procesos a nivel molecular y biofísico. Las interacciones entre proteínas se caracterizan por parámetros cinéticos y termodinámicos, de manera que pueden establecerse interacciones estables o bien transitorias que requieren de una menor afinidad de unión y que, en general, juegan un papel regulador (Lalonde et al. 2008). Se han desarrollado diferentes metodologías para estudiar las interacciones entre proteínas desde varias perspectivas (Figura 2.17), tanto in vitro como in vivo, cada una de las cuales presenta ciertas ventajas y desventajas en cuanto a la aplicabilidad, sensibilidad y exactitud (Edwards et al. 2009). Se ha demostrado que las superficies de unión entre proteínas difieren significativamente en la composición de aminoácidos respecto a otras zonas de la proteína y se les ha denominado “hot spots”. Además, disponer de información estructural es en muchos casos esencial para desarrollar técnicas que determinen de forma precisa interacciones entre proteínas (Shoemaker and Panchenko 2007). Introducción 48 Figura 2.17 Diferentes técnicas para la caracterización de interacciones entre proteínas in vivo e in vitro. Las interacciones entre proteínas se pueden estudiar desde diferentes perspectivas. Es necesario caracterizar en detalle las propiedades moleculares y biofísicas de los complejos formados (estequiometría de los complejos, afinidades por diferentes parejas, constantes cinéticas o sitios de interacción). No obstante, se debe tener muy en cuenta también el ambiente celular en que estas interacciones ocurren, para lo que son imprescindibles las técnicas aplicadas in vivo (Piehler 2005). 2.5.1 Métodos bioquímicos para estudiar interacciones entre proteínas. 2.5.1.1 Coinmunoprecipitación. Una de las técnicas bioquímicas más ampliamente utilizada para estudiar interacciones entre proteínas in vitro ha sido la inmunoprecipitación. Esta técnica consisten en enriquecer una fracción de un lisado celular en una o varias proteínas mediante la unión de un anticuerpo específico contra ella y precipitar el complejo anticuerpo-proteína (Figura 2.18). La precipitación de este complejo se realiza mediante el uso de Proteína G o A (que se unen a la región Fc de las IgG) o de un anticuerpo secundario asociado a bolitas de agarosa que se dirige contra la región Fc del anticuerpo primario usado para inmunoprecipitar. Una de las principales dificultades que presenta este método es la elección del detergente para preparar los lisados celulares. Algunos detergentes, como Tritón X-100, son capaces de inducir interacciones no fisiológicas dando lugar a resultados “falsos positivos”. Además, estos Introducción 49 detergentes se ha comprobado que inducen un cambio conformacional en algunas proteínas (Hsu and Youle 1997; Germain et al. 2008), por lo que las interacciones detectadas por esa técnica serían “artefactuales” en esas condiciones. Por el contrario, existen otros detergentes que no son capaces de extraer de manera eficiente las proteínas asociadas a las membranas por lo que su uso podría suponer una infravaloración de las interacciones detectadas. Otro problema habitual es la disponibilidad de buenos anticuerpos que inmunoprecipiten las proteínas de interés específicamente (Miernyk and Thelen 2008). Figura 2.18 Protocolo general de la inmunoprecipitación de proteínas. En primer lugar se añade un anticuerpo dirigido contra una proteína de interés a un lisado celular. La adición de proteína A o G hace que los complejos proteína-anticuerpo se vuelvan insolubles y la centrifugación del lisado precipita dichos complejos que pueden ser lavado y purificados. (Molecular Station). Este tipo de técnicas bioquímicas basadas en la purificación de proteínas por afinidad se han mejorado al acoplarles una técnica proteómica que permita identificar los componentes del complejo precipitado. Para ello, las proteínas se expresan acoplándoles en fase una etiqueta o “tag” que sirve de epítopo para después, por afinidad, purificar esa proteína y las posibles proteínas que inteaccionan con ella (Piehler 2005). A continuación, los complejos de proteínas se analizan por electroforesis y a las proteínas individuales se las somete a proteolisis para el posterior análisis de los péptidos por espectrometría de masas. Los péptidos resultantes de la digestión de las proteínas son ionizados en fase gas, bien por ionización por electrospray (ESI) o deserción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). La identificación de los péptidos se hace en base a la relación masa/carga (Causier 2004). Esta técnica presenta la desventaja de que las interacciones transitorias entre Introducción 50 proteínas no pueden ser identificados debido a los procesos de purificación a los que se somete a los complejos (Gingras et al. 2007). Otra técnica que se ha acoplado a la inmunoprecipitación es el “crosslinking” químico de proteínas. Consiste en utilizar agentes químicos capaces de reaccionar con grupos reactivos de proteínas de manera que se estabilizan las interacciones de las proteínas permitiendo la posterior purificación y análisis por espectrometría de masas del complejo sin que éste sea destruído en el procedimiento de purificación (Miernyk and Thelen 2008). 2.5.1.2 Cristalografía de Rayos X. Otra técnica muy empleada para determinar la estuctura de proteínas y de complejos proteicos ha sido la cristalografía de rayos X. De forma breve, esta técnica consiste en bombardear el complejo proteico con rayos X e integrar los patrones de difracción obtenidos de manera que se reconstituye la estructura tridimensional del complejo. Esta técnica es capaz de resolver la estructura a nivel atómico por lo que se obtiene información muy detallada de los átomos involucrados en las interacciones. 2.5.1.3 Resonancia Magnética Nuclear (RMN). La espectroscopía de RMN también provee resolución atómica, extrayendo las distancias entre los átomos mediante la medida de las transiciones entre diferentes estados de spin nuclear en un campo magnético. Se ha empleado para identificar los residuos involucrados en determinadas interacciones entre proteínas, aunque generalmente la aplicación de esta técnica está limitada a proteínas de alrededor de 300 residuos. 2.5.1.4 Resonancia de plasma superficial. También se ha aplicado la técnica de resonancia de plasma superficial (SPR), una técnica en fase sólida, que permite detectar la interacción de un ligando soluble con un receptor inmobilizado en una superficie metálica transductora, o “biosensor”. La unión de un ligando provoca cambios en el índice de refracción de la luz por la superficie metálica, que será proporcional a la masa de ligando unida; por lo que este método permite estudiar las cinéticas de equilibrio e interacción (Piehler 2005). Introducción 51 2.5.1.5 “Arrays” de proteínas. Otro tipo de estrategia utilizada para estudiar interacciones entre proteínas han sido los “arrays” o chips de proteínas. Esta técnica requiere la inmovilización de proteínas en un soporte de vidrio o membrana de nitrocelulosa u otro material. La inmovilización se suele llevar a cabo por procesos de adsorción, “cross-linking”, etc, siendo uno de los aspectos más problemáticos el mantenimiento de la conformación nativa de las proteínas. La lectura de estos chips es generalemente indirecta, mediante el uso de sondas fluorescentes. 2.5.1.6 Doble híbrido en levadura. La técnica de doble híbrido en levadura (Y2H) ha supuesto un avance importante para la detección de interacciones entre proteínas. Se basa en el hecho de que muchos factores de transcripción eucariotas tienen un dominio de unión a una secuencia promotora de DNA (BD) y otro que activa la transcripción (AD). Así, cada una de las proteínas a estudiar se fusiona a uno de los dominios y se coexpresan ambas en levaduras, de manera que si esas proteínas interaccionan se reconstituye el factor de transcripción en el núcleo y se activa la transcripción de genes marcadores (Lalonde et al. 2008). El primer sistema de doble híbrido se desarrolló en 1989 (Fields and Song 1989). Típicamente una proteína de interés se fusiona al dominio BD y se analiza frente a una librería de proteínas fusionadas con el AD para hacer un “screening” de parejas de interacción. Figura 2.19 Doble híbrido en levadura. A. Funcionamiento normal de muchos factores de transcripción eucariotas. B. Las proteínas de interés se fusionan a cada dominio de un factor de transcripción, BD o AD. La interacción entre las proteínas fusionadas cuando se expresan en levaduras activa la transcripción de genes marcadores. BA Introducción 52 2.5.2 Métodos basados en fluorescencia para la detección de interacciones entre proteínas. Ninguna de las técnicas anteriormente explicadas aporta información acerca de las interacciones entre proteínas en su ambiente nativo. Para ello, se han desarrollado nuevas técnicas que aplican la tecnología de imagen acoplada al uso de proteínas fluorescentes genéticamente modificadas y que permite identificar interacciones entre proteínas ex vivo. 2.5.2.1 Técnicas basadas en la Transferencia de Energía de Resonancia. El fenómeno por el que hay una transmisión de energía de un dador a un aceptor por acoplamiento dipolo-dipolo (resonancia) fue descrito por Förster el año 1948 (Förster 1948). La aplicación de este fenómeno al estudio de interacciones entre proteínas se denomina FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) y consiste en la fusión de proteínas fluorescentes a dos proteínas cuya interacción se quiere estudiar. Es necesario que el espectro de emisión de una de las proteínas fluorescentes tenga un cierto solapamiento con el espectro de excitación de la segunda proteína fluorescente. De esta manera, y si las proteínas a estudiar interaccionan se encuentran lo suficientemente cerca (~60Å), cuando se excite el primer fluoróforo habrá una transferencia de parte de la energía al segundo y se detectará la fluorescencia emitida por la segunda proteína fluorescente. Habitualmente se emplean proteínas fluorescentes derivadas de la proteína fluorescente verde (GFP), como son la proteína fluorescente cyan (CFP) y la amarilla (YFP) (Tsien 1998). Mediante esta técnica se ha idenificado la unión entre numerosas proteínas entre ellas dos proteínas de la familia Bcl-2, objeto de estudio de este trabajo, como Bax y Bcl-2 (Mahajan et al. 1998). La eficiencia de esta técnica depende de que la orientación de los dipolos del dador y aceptor sea la correcta (Xu et al. 2003). Introducción 53 Fig 2.20. Representación esquemática de la técnica FRET. Se muestran dos proteínas (A y B) fusionadas a un fluoróforo donador (CFP) o un aceptor (YFP). Cuando las proteínas A y B interaccionan, los fluoróforos se encuentran a la suficiente proximidad (< 100 nm) como para ocurra una transferencia de a energía desde el donador al aceptor después de que el primero haya sido excitado (Ciruela 2008). 2.5.2.2 Métodos basados en la complementación de dos fragmentos de una proteína (PCA). Esta técnica consiste en fragmentar el cDNA que codifica una proteína determinada en dos y cada uno de los fragmentos resultantes se fusiona al cDNA de una de las proteínas cuya interacción se quiere estudiar. Se han empleado diferentes proteínas para estos ensayos de complementación; desde enzimas como la dihidrofolato reductasa, β-lactamasa, β-galactosidasa o luciferasa, hasta proteínas fluorescentes (Morell et al. 2009). El método de detección de la complementación de los dos fragmentos y reconstitución de la proteína completa difiere en cada caso. El empleo de proteínas fluorescentes ofrece la ventaja de poder visualizar el complejo formado directamente en células vivas sin necesidad de tinciones ni de moléculas exógenas (Kerppola 2006b). En el caso específico de utilizarse proteínas fluorescentes, la técnica de complementación se denomina BiFC (del inglés, Bimolecular Fluorescence Complementation). Introducción 54 2.5.2.3 BiFC (Complementación Bimolecular Fluorescente). Se basa en la formación de un complejo fluorescente cuando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente son unidos en el espacio por una interacción entre las proteínas A y B a las que los fragmentos están fusionados. Figura 2.21 Esquema representativo de la formación de complejos por BiFC (Kerppola 2008). Una de las principales ventajas de la técnica BiFC es la visualización directa de los complejos formados en células vivas. Además, esta técnica permite detectar interacciones débiles o transitorias puesto que la señal fluorescente que se genera es estable. Esta es una de las limitaciones de la mayoría de técnicas empleadas en interactómica y supone un gran avance ya que la mayoría de las interacciones entre proteínas en la célula son de esta naturaleza. Otra ventaja es que se puede detectar la formación de complejos aunque solamente se dé la interacción entre una fracción de nión de ésta a Bax  ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA (Marani et al. 2002al (Kerppola 2006b). Sin embargo, también existen importantes limitaciones para esta técnica. Una de estas limitaciones es que la formación del fluoróforo requiere de un cierto tiempo, por lo que no se podrían detectar cambios rápidos en las interacciones (Kerppola 2006b). Además, parece ser que cuando los fragmentos de la proteína fluorescente se reensamblan de manera no covalente, lo hacen formando un complejo bimolecular irreversible (Kerppola 2008). No obstante, algunos trabajos sugieren que exista cierta reversibilidad en la formación de estos complejos y que se puedan estudiar algunas interacciones dinámicas (Schmidt et al. 2003; Guo et al. 2005). En cuanto a esto, es difícil descartar que estén interviniendo procesos de degradación de proteínas que afecten a la señal que se detecta en células vivas, y hasta el momento no se ha Introducción 55 podido demostrar la disociación de las proteínas de fusión (Kerppola 2008). La formación de complejos por BiFC ocurre de manera eficiente en ausencia de inductores. Esto puede ser un reflejo de interacciones débiles entre proteínas que se dan independientemente de la presencia de moléculas o señales inductoras (Robida and Kerppola 2009). Mediante estudios in vitro con proteínas purificadas se ha podido estudiar la dinámica de formación de los complejos por BiFC (Hu et al. 2002). El primer paso es la interacción entre las proteínas que están fusionadas a los fragmentos de la proteína fluorescente (Complejo I), lo cual se da en competición con las parejas endógenas alternativas presentes en la célula (Complejos II) (Fig. 2.22). La asociación entre los fragmentos fluorescentes es más lenta y produce un intermediario de plegamiento (Complejo III), que tras la maduración termina generando el fluoróforo (Complejo IV). Los complejos no fluorescentes formados con proteínas endógenas y las proteínas de fusión que no se han asociado con otros fragmentos complementarios forman agregados in vitro cuyo destino final no se conoce exactamente (Kerppola 2006b). Figura 2.22. Mecanismo para la formación de los complejos bimoleculares fluorescentes (Kerppola 2006b). Introducción 56 La técnica BiFC se ha aplicado al estudio de interacciones entre muchos tipos de proteínas (ver Tabla 2.1) y en diversos organismos como células de mamífero, plantas, levaduras, bacterias y hongos filamentosos (Morell et al. 2008). Categoría Características Organismo Péptidos Proteínas de choque térmico E. coli Proteínas Nucleares Dominio bZIP, Familia Rel, Familia SMAD Células Mamífero Familia Ubiquitina Complejos E3-ligasa_sustrato Células Mamífero, S. cerevisiae, Sinapsis alba Proteínas de Señalización Ruta MAPK, fosfolipasas, reguladores de apoptosis, Proteínas G heterotriméricas Complejos Enzimáticos Citocromo P450 Células Mamífero, E. coli Proteínas de Membrana Señalización de integrinas, lectinas, receptores de citoquinas Células Mamífero Proteínas de unión a ácidos nucléicos Proteínas de unión a RNA y a DNA Células Mamífero, in vitro Proteínas de Plantas Factores de transcripción, proteínas reguladoras de la floración y división de plastidios Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana Patógenos de Plantas Secreción Tipo IV, interacciones hospedador-patógeno Agrobacterium tumefaciens, N. Tabacum Tabla 2.1 Ejemplos de las interacciones entre proteínas estudiadas mediante Complementación Bimolecular Fluorescente. Modificado de (Kerppola 2006b). Se han empleado hasta 10 proteínas fluorescentes diferentes con capacidad de complementar los dos fragmentos generados (Shyu and Hu 2008), cubriendo así gran parte del espectro de fluorescencia. Además, se han estudiado diferentes posiciones donde fragmentar cada proteína (Shyu et al. 2006; Shyu and Hu 2008). Cabe destacar que la fragmentación de estas proteínas se ha diseñado de manera que los aminoácidos implicados en la formación del cromóforo queden en el fragmento amino de la proteína. Para la proteína fluorescente verde, GFP, estos residuos son la treonina 65, la tirosina 66 y la glicina 67 (Heim et al. 1994). Este tripéptido sufre una ciclación, dehidratación y posterior oxidación para dar lugar al cromóforo (Reid and Flynn 1997), de tal manera que para que ocurran estas reacciones en la proteína fragmentada es necesario que se dé la complementación de los dos fragmentos. Introducción 63 fluorescentes diferentes fusionados a las parejas de interacción alternativas. Mediante estos ensayos se puede comparar dentro de la misma célula la distribución de diferentes complejos de proteínas y estudiar la competición que se establece entre dos candidatos por interaccionar con una proteína concreta (Hu and Kerppola 2003). Lo ideal sería que ambos complejos formados tuvieran el mismo orden de magnitud en cuanto a la fluorescencia emitida. No obstante, cualquier interferencia de señales entre ambos fluoróforos puede ser corregida mediante una adquisición secuencial de las imágenes y utilizando diferentes ondas de longitud para excitar y recoger la señal generada por los complejos (Kerppola 2008). Figura 2.27 Principio de la técnica BiFC Multicolor. Dos proteínas alternativas, A y B, se fusionan a fragmentos de diferentes proteínas fluorescentes (fragmento N de YFP o Venus y fragmento N de CFP). Se coexpresan estas proteínas en células con una pareja de interacción común, Z, fusionada al fragmento complementario (extremo C de CFP). Los complejos AVN155 con Z-CC155 se pueden diferenciar de los complejos de B-CN155 con Z-CC155 por las diferencias en los espectros de fluorescencia de cada uno (Kerppola 2009). Para realizar un análisis cuantitativo de la eficiencia relativa de la formación de los complejos utilizando ensayos de BiFC multicolor, es necesario que los fragmentos de las proteínas fluorescentes que se emplean se asocien con igual eficiencia para ambos complejos. Para ello es necesario intercambiar los fragmentos entre las proteínas de fusión y realizar los experimentos usando ambas combinaciones (Kerppola 2009). Se han llevado a cabo diversos estudios sobre los fragmentos que mejor complementan a la hora de realizar los experimentos de BiFC multicolor. En estos trabajos se ha podido concluir que la mejor combinación para el análisis de estas interacciones es: el fragmento C155 de la proteína ECFP y los fragmentos N173 de las proteínas Cerulean y Venus (Hu and Kerppola 2003; Shyu et al. 2006). Introducción 64 Mediante el estudio de la formación de los complejos entre la combinación de vectores: A-VN173 y B-CN173 compitiendo por interaccionar con Z-CC155 y por otro lado A-CN173 y B-VN173 compitiendo de nuevo por etablecer una interacción con ZCC155; se pueden detectar diferencias relativamente pequeñas en la eficiencia de la formación de los complejos entre proteínas estructuralmente relacionadas (Kerppola 2008) (Figura 2.28). Figura 2.28 Representación esquemática de la técnica BiFC Multicolor para estudiar diferencias en la formación de complejos usando combinaciones distintas de vectores. Modificado de (Vidi et al. 2010). Para realizar los ensayos de BiFC multicolor, se emplea el mismo procedimiento que el descrito para el BiFC en el apartado anterior. No obstante, hay una consideración que hay que tener en cuenta para estos experimentos: el vector que codifica la proteína por la que las otras dos van a competir por unirse debe encontrarse en una concentración limitante respecto a los otros dos (Hu and Kerppola 2003). Como en los ensayos de BiFC, es necesario determinar los niveles de expresión de las proteínas de fusión y determinar si la mutación en zonas concretas de las proteínas eliminan la señal correspondiente al BiFC (Kerppola 2008). Finalmente cabe destacar que mediante los ensayos de BiFC multicolor no es posible determinar si una proteína tiene más o menos afinidad de unión a otra, solamente se pueden obtener datos acerca de las eficiencias relativas de la formación de los complejos (Kerppola 2008). MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 67 3.1 CULTIVOS CELULARES. 3.1.1 Mantenimiento de los cultivos celulares. En este trabajo se han empleado las siguientes líneas celulares:  La línea de adenocarcinoma de cérvix HeLa, se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, USA).  La línea de fibroblastos embrionarios de riñón 293T fue cedida por el Dr. Atanasio Pandiella (Centro de investigaciones del Cáncer, Salamanca).  Las líneas de carcinoma de cólon HCT116 y HCT 116 BaxKO fueron cedidas por el Dr. Christopher Börner (Institute of Molecular Medicine and Cell Research, University of Freiburg, Germany). Las líneas celulares HeLa y 293T se cultivaron en medio DMEM (PAN Biotech GmbH) y las líneas HCT116 y HCT116 BaxKO en medio McCoy’s (Gibco) suplementados ambos con un 10% de suero fetal bovino (SFB, Sigma), L-glutamina (PAN Biotech GmbH) 2mM y antibióticos (penicilina 100U/ml y estreptomicina, 100μg/ml, Sigma, Madrid). Estos medios se denominarán, en adelante, medio completo. Todas las líneas celulares se cultivaron rutinariamente en frascos de cultivo de 25 ó 75 cm2 con tapón con filtro. Las células se mantuvieron en un incubador termostatizado (Heraeus Cell, Alemania), a 37ºC, en aire saturado de humedad y con un 5% de CO2. Cada 2-3 días se realizaron los pases de los cultivos. Para ello, se determinó el número de células y su viabilidad (en azul Trypan, Sigma, Madrid) con ayuda de un hemocitómetro o cámara Neubauer al microscopio óptico (Nikon Eclipse 50i). Todas las manipulaciones con las células se realizaron en campanas de flujo laminar vertical (Telstar, España) y en condiciones estériles. El material usado, de vidrio y plástico, se esterilizó previamente en un autoclave (Autester, Mod 4376, Selecta, España) durante 20 minutos a 1 atmósfera de presión y las disoluciones añadidas a los cultivos se esterilizaron usando filtros de 0,22 μm (PALL Life Sciences). 3.1.2 Contaje y determinación de la viabilidad celular. La determinación de la viabilidad celular se llevó a cabo mediante la tinción con azul Trypan (Sigma, Madrid) y contaje en una cámara Neubauer. Este colorante es capaz de teñir las células muertas que han perdido la integridad de su membrana, dándoles una tonalidad azulada. Sin embargo, las células vivas o apoptóticas Materiales y Métodos 68 mantienen su membrana plasmática íntegra por lo que el colorante azul Trypan no es permeable a ellas. Para el contaje se mezclaron 50 μl de suspensión celular, previamente homogeneizada, y 50 μl de una solución estéril de azul Trypan al 0,4% en NaCl 0,15M que se depositaron sobre un hemocitómetro y se observaron al microscopio óptico (Optiphot, Nikon). Para determinar la densidad celular se contaron un número de cuadrantes completos de la cámara tal que se obtuvieran como mínimo 100 células totales (viables o no viables). La densidad celular se calculó como el número de células viables dividido del número de cuadrantes contados y multiplicado por la dilución de la suspensión celular y 104 (ajuste del tamaño de la cámara). La viabilidad celular se evaluó considerando el número de células no coloreadas (viables) respecto al número de células totales. 3.1.3 Detección de micoplasmas en cultivos celulares mediante PCR. La detección de micoplasmas mediante PCR se realizó de modo rutinario en todas las células en cultivo. Para una detección óptima, se tomaron células que habían permanecido en cultivo al menos 48 horas antes de realizar el análisis. Como muestra se tomó una pequeña cantidad de medio de cultivo de cada línea celular. Se centrifugó y se recogió el sobrenadante. En caso de no analizarse en el momento, los sobrenadantes se conservaron a -20ºC hasta su análisis. Las secuencias de los oligonucleótidos usados como cebadores fueron: Mico A: 5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’ Mico B: 5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’ Como control negativo de la amplificación se preparó la misma mezcla anterior sustituyendo el sobrenadante celular por H2O libre de DNasas y como control positivo se utilizó la propia bacteria o el sobrenadante de un cultivo celular contaminado, testado con anterioridad. La amplificación se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía por cada muestra: • 5μl de tampón de reacción 10X (Invitrogen Corporation, Barcelona). • 1,5μl de MgCl2 50mM (Invitrogen Corporation, Barcelona). • 2,5μl de Mico A 100μM • 2,5μl de Mico B 10μM • 5μl de dNTPs 2mM (Invitrogen Corporation, Barcelona). Materiales y Métodos 69 • 2μl de sobrenadante • 0,2 μl de Taq polimerasa (Invitrogen Corporation, Barcelona). • 31,3μl de H2O libre de DNasas. La amplificación se realizó en un termociclador (Applied Biosystem) con el siguiente programa de PCR: - Hot Start 94 ºC 3’. - Desnaturalización 94 ºC 1 - Hibridación 60 ºC 1’. 30 ciclos - Extensión 72ºC 1’ y 30’’ - Extensión 72ºC 5’ Los productos de amplificación obtenidos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% (apartado 3.2.4). 3.1.4 Congelación y descongelación de las líneas celulares. Las líneas celulares se almacenaron congeladas en N2 líquido. En cada criotubo (Nunc, Dinamarca) se congelaron aproximadamente 5 x 106 de células en 500μl de medio completo suplementado con 10% de DMSO (Sigma, Madrid). Tras la resuspensión en el medio de congelación las células se almacenaron lo más rápidamente posible en un congelador de -80ºC, durante 24 horas. Posteriormente se almacenaron en contenedores de N2 líquido. La descongelación se realizó mediante la adición gradual de medio completo atemperado hasta 10 ml. A continuación, la suspensión se centrifugó 5 minutos a 200g y las células se resuspendieron en 8 ml de medio completo. 3.2 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. 3.2.1 Preparación de medios y cultivos bacterianos. Todas las manipulaciones con medio autoclavado y con cultivos bacterianos, se realizaron dentro del área estéril creada por la llama de un mechero de alcohol. Para preparar medio Luria Bertani (LB), se pesaron 10 g de triptona (Panreac), 5 g de extracto de levadura (Panreac) y 5 g de NaCl (Panreac). Se disolvieron en 1L de agua Materiales y Métodos 70 destilada, se vertió la disolución en botellas de vidrio de 500ml y se esterilizaron en un autoclave (Autestar Mod 4376, Selecta). Tras atemperarse, las botellas se almacenaron a 4º C. Para la preparación de placas de LB-agar, se pesaron 17,5 g de Plate Count Agar (Sigma) y se disolvieron en 1 L de agua destilada. Se vertió la mezcla en botellas de vidrio de 500 ml y se esterilizaron en autoclave (Autestar Mod. 4376, Selecta). Una vez atemperado se le añadió el antibiótico de selección (Ampicilina, Roche) a 100 μg/ml, se homogeneizó por agitación suave y se fue vertiendo sobre placas Petri (50 ml/placa). El medio se dejó solidificar con las placas semiabiertas bajo la campana de flujo durante 1-2 horas. Una vez solidificado el LB-agar las placas se cerraron y se almacenaron a 4º C. 3.2.2 Obtención de bacterias competentes y transformación bacteriana. Las bacterias competentes se prepararon a partir de un cultivo de 10 ml de E. coli XL1-Blue. A este cultivo se le añadió 100 ml de medio estéril y se dejó crecer a 37º C en el agitador orbital hasta alcanzar la densidad adecuada (A600nm = 0,4). Se recogió el volumen del cultivo en dos tubos estériles de 50 ml y se dejaron enfriar en hielo. Una vez fríos se centrifugaron 10 min a 4º C y 3500 rpm. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 3 ml de tampón de trituración (100mM CaCl2, Merck; 70mM MgCl2, Merck; 40mM CH3COONa, Panreac), se homogeneizó el pellet y se añadieron 30 ml de tampón de trituración. Se centrifugaron 15 min a 4º C 3500 rpm y se eliminó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 4 ml de tampón de conservación (100mM CaCl2, Merck; 15% glicerol, Panreac). Las células se transformaron inmediatamente o se conservaron a -80º C en alícuotas de 400 μl. Para la transformación de las bacterias se empleó el método de choque térmico para lo cual se descongeló en hielo una alícuota de bacterias competentes para cada transformación y se les añadió, dependiendo del plásmido, entre 50 y 100 ng de DNA. Se incubaron 20 minutos en hielo, y seguidamente 1’ 30’’ a 42º C, en el baño húmedo. Inmediatamente se llevaron al hielo durante 2 minutos, tras lo cual se diluyó cada alícuota con 1ml de LB estéril y se incubaron 15 minutos a 37º C. Se centrifugaron 5 minutos a 3000 rpm, se descartó parte del sobrenadante y se resuspendieron las bacterias ya transformadas para sembrarse en una placa Petri de LB-agar con el antibiótico de selección a 100 μg/ml. Las placas se incubaron a 37º C en la estufa durante 24 horas. Materiales y Métodos 71 Transcurrido este tiempo se seleccionaron varias colonias de la placa, transfiriendo cada una a un tubo estéril con 10 ml de LB suplementado con el antibiótico de selección (100 μg/ml). Esta operación se realizó con un asa de cultivo esterilizada a la llama y rozando con el asa las paredes del tubo para asegurar la correcta resuspensión. La suspensión bacteriana se incubó a 37º C durante 2-5 horas en el agitador orbital. Después, se vertió sobre un erlenmeyer con 50 ml de LB y antibiótico de selección a la concentración antes mencionada. El erlenmeyer se cerró con un tapón hecho de algodón y gasa estéril y se incubó durante toda la noche a 37º C en el agitador orbital. 3.2.3 Extracción de DNA plasmídico. Para obtener pequeñas cantidades de plásmido se utilizó el Kit GFX™ Micro Plasmid Prep Kit (GE Healthcare, Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen de cultivo de partida fueron entre 1,5 y 3 ml y la elución final se realizó con 50 μl de TrisHCl pH 8 o H2O milliQ estéril. Para obtener cantidades mayores de plásmido se necesitaron cultivos de entre 50 y 100 ml, y el kit de extracción de DNA empleado fue el Kit Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit (BioRad, USA). Las eluciones se realizaron en 500 μl de H2O milliQ estéril. 3.2.4 Electroforesis de DNA en gel de agarosa. Los geles de agarosa al porcentaje adecuado en cada caso se prepararon fundiendo la agarosa (Scharlau) en 30 ml de tampón. Para los geles de análisis se empleó el tampón TBE (0,045 M Tris-borato, 1 mM de EDTA) y para los geles destinados a purificación se empleó el tampón TAE (Tampón Tris-Acetato EDTA, Invitrogen). A esta mezcla se añadió SYBR-safe (1:10000, Invitrogen) para teñir el DNA y se vertió en los moldes para su gelificación. A la muestra de DNA se añadió el tampón de carga 6X (Promega) o 10X (Takara) para determinar la posición del frente de la muestra en el gel. La estimación del peso de los fragmentos de DNA se realizó por comparación con marcadores de pesos moleculares. Como marcadores de pesos moleculares se emplearon λ/Hind III, 100bp y 10bp ladder (Invitrogen). Cuando se requirió un análisis cuantitativo de las muestras se emplearon los marcadores High DNA Mass Ladder y Low DNA Mass Ladder Materiales y Métodos 72 (Invitrogen). La electroforesis se realizó a 90V, 400mA, durante 30 minutos. La visualización de los geles se realizó en un transiluminador Gel Doc 2000 (BioRad). 3.2.5 Purificación de fragmentos DNA. La purificación de los fragmentos de DNA de interés, bien tras una separación por técnicas electroforéticas como tras una reacción enzimática como PCR o tras la digestión con enzimas de restricción, se llevó a cabo con el Kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare, Amersham), siguiendo las instrucciones del fabricante. En los casos en que se precisó purificar fragmentos de DNA separados mediante electroforesis, se procedió al corte de la banda de peso molecular deseado empleando un bisturí estéril. 3.2.6 Cuantificación de ácidos nucleicos. La determinación de las concentraciones tanto de vectores como de fragmentos de DNA se realizó usando alícuotas de 3 μl con el espectrofotómetro NanoVue (GE Healthcare, Amersham). 3.2.7 Vectores para los ensayos de BiFC. Para analizar las interacciones entre las proteínas de la familia Bcl-2 se empleó la técnica Complementación Bimolecular de Fluorescencia (BiFC), basada en la complementación de dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente cuando éstos están fusionados traduccionalmente a proteínas que interaccionan entre sí (Hu et al. 2002). Para la técnica de BiFC se emplearon los vectores pBiFC-VN173 y pBiFC-VC155 (Hu and Kerppola 2003). Cada uno de estos vectores contiene un fragmento del cDNA de la proteína fluorescente verde Venus. El vector pBiFC-VN173 contiene el fragmento correspondiente a los aminoácidos 1 hasta el 173 de la proteína, mientras que en el pBiFC-VC155 se encuentra la secuencia que codifica desde el aminoácido 155 hasta el final de la proteína. Inmediatamente delante del fragmento de la proteína fluorescente estos vectores presentan el sitio de clonaje múltiple (MCS) que permite la inserción de las secuencias Materiales y Métodos 79 oligonucleótidos designados como “Primer 2” y “Primer 3” contienen una región complementaria a la zona inmediatamente posterior y anterior, respectivamente, de la secuencia a delecionar. De esta manera al hacer las dos PCR independientes se obtienen unos fragmentos de DNA que tienen una secuencia solapante. El siguiente ciclo de PCR, con cantidades equimolares de ambos fragmentos, requiere el uso de los oligonucleótidos de los extremos para terminar de completar la secuencia a amplificar. Fig. 3.5 Esquema de la técnica de Extensión por PCR Solapada. Los oligonucleótidos empleados para los constructos generados por esta técnica fueron los siguientes: Constructo Cebador Secuencia (5’-3’) BIMΔBH3-VN Bim-Fw BimΔBH3-Rv BimΔBH3-Fw Bim-Rv GACTCGGAATTCAATGGCAAAGCAACCTTGTGAT ATTATTCAAAAATACTGCAGGTTCAGCCTG CAGGCTGAACCTGCAGTATTTTTGAATAAT GACTCGTCTAGAATGCATTCTCCACACCAGGCGGAC Materiales y Métodos 80 BAKΔBH3-VN BakVN-Fw BakΔBH3-Rv BakΔBH3-Fw BakVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGCTTCGGGGCAAGGCCCAGGT CTCTGAGTCATACTGCCCCATGGTGCT AGCACCATGGGGCAGTATGACTCAGAG GACTGCTCTAGATGATTTGAAGAATCTTCGTACCACA BAKΔBH3-VC BakVC-Fw BakΔBH3-Rv BakΔBH3-Fw BakVC-Rv CGAACTGAATTCGGATGGCTTCGGGCAAGGCCCAGT CTCTGAGTCATACTGCCCCATGGTGCT AGCACCATGGGGCAGTATGACTCAGAG AGAACTAGATCTCTGATTTGAAGAATCTTCGTACCACA BAKΔH1α-VN BakVN-Fw BakΔH1α-Rv BakΔH1α-Fw BakVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGCTTCGGGGCAAGGCCCAGGT GGCAGCCACCCCTTCAGAAGCAGAGGGCAG CTGCCCTCTGCTTCTGAAGGGGTGGCTGCC GACTGCTCTAGATGATTTGAAGAATCTTCGTACCACA BAKΔH1α-VC BakVC-Fw BakΔH1α-Rv BakΔH1α-Fw BakVC-Rv CGAACTGAATTCGGATGGCTTCGGGCAAGGCCCAGT GGCAGCCACCCCTTCAGAAGCAGAGGGCAG CTGCCCTCTGCTTCTGAAGGGGTGGCTGCC AGAACTAGATCTCTGATTTGAAGAATCTTCGTACCACA BAXΔBH3-VN BaxVN-Fw BaxΔBH3-Rv BaxΔBH3-Fw BaxVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGACGGGTCGGGGAGCAG CTCTGCAGCTCCATCTTCTTGGTGGAGC CGTCCACCAAGAAGATGGAGCTGCAGAG GACTCGTCTAGAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT BAXΔBH3-VC BaxVC-Fw BaxΔBH3-Rv BaxΔBH3-Fw BaxVC-Rv CGAACTGAATTCGGATGGACGGGTCCGGGGAGCAG CTCTGCAGCTCCATCTTCTTGGTGGAGC CGTCCACCAAGAAGATGGAGCTGCAGAG CGAACTAGATCTCGCCCATCTTCTTCCAGATGGT BAXΔH1α-VN BaxVN-Fw BaxΔH1α-Rv BaxΔH1α-Fw BaxVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGACGGGTCGGGGAGCAG CATTCGCCCTGCTCGCTCAGAGCTGGTG CACCAGCTCTGAGCGAGCAGGGCGAATG GACTCGTCTAGAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT BAXΔH1α-VC BaxVC-Fw BaxΔH1α-Rv BaxΔH1α-Fw BaxVC-Rv CGAACTGAATTCGGATGGACGGGTCCGGGGAGCAG CATTCGCCCTGCTCGCTCAGAGCTGGTG CACCAGCTCTGAGCGAGCAGGGCGAATG CGAACTAGATCTCGCCCATCTTCTTCCAGATGGT PUMAΔΒΗ3-VN PUMA-Fw PUMA-Rv GACTCGAATTCAATGGCCCGCGCACGCCAG GACTCGGTCGACATTGGGCTCCATCTCGG PUMAΔNΔLRR-VN PUMAΔN-Fw PUMAΔNΔLRR-Rv PUMAΔNΔLRR-Fw PUMAΔN-Rv GACTCGGAATTCAGGTCCTCAGCCCTCGCTCT TGCGTTGAGGTCGTCCCCGATCTCCCGGGCCCA TGGGCCCGGGAGATCGGGGACGACCTCAACGCA GACTCGTCTAGAATTGGGCTCCATCTCGGGGGCTCT Tabla 3.2. Secuencias de los oligonucleótidos empleados para la generación de las diferentes deleciones de los constructos en los vectores pBiFC. Las secuencias marcadas en negrita corresponden a los sitios de restricción introducidos para la posterior ligación en los vectores. Materiales y Métodos 81 Se llevó a cabo el primer ciclo de amplificación para cada constructo siguiendo el mismo procedimiento y los moldes especificados en el apartado anterior. Tras esto, se separaron y purificaron los fragmentos obtenidos mediante electroforesis de agarosa (apartado 3.2.5). Para realizar el segundo ciclo de amplificación se usó como molde una mezcla equimolar de los dos fragmentos obtenidos y los oligonucleótidos de los extremos que introducen los nuevos sitios de restricción. A continuación, se pasó a la purificación final del fragmento de DNA, ya sin la secuencia que se quería delecionar. El cDNA de PUMA sin su dominio BH3 (PUMA ΔBH3) fue adquirido en Addgene, clonado en el vector pCEP4 y con la deleción generada, que se usó como molde para su posterior clonaje en el vector pBiFC-VN173. Para la generación de un vector control a partir del cDNA de Noxa, se decidió hacer un cambio de aminoácidos por mutagénesis dirigida en lugar de una deleción. Esto fue debido al menor tamaño de esta proteína respecto al resto de proteínas empleadas de la misma familia, y con el objetivo de alterar lo menos posible ésta. Para ello, se encargó a la empresa estadounidense Mutagenex, la realización de un mutante de Noxa que contuviera una sustitución de la leucina (L) en posición 29 por un glutámico (E). 3.2.7.3 Construcción de un vector de Bcl-XL fusionado al extremo carboxilo del fragmento Venus-C155. Como se ha explicado en los apartados anteriores, los vectores empleados para los ensayos de complementación de fluorescencia están diseñados de manera que la proteína de fusión que se genera tiene siempre el fragmento de la proteína fluorescente Venus fusionado al extremo carboxilo de la proteína de interés. En el caso de la proteína Bcl-XL los controles indicaban que la fusión en el extremo Cterminal afectaba a su localización subcelular (ver Resultados, apartado 4.1.3.2). Por este motivo se decidió generar una fusión de ésta con el fragmento carboxilo de la proteína Venus (VC155) delante de ella. Para construir esta fusión, se decidió mantener la mayor parte de la secuencia del linker (TRPACKIPNDLKQKVMNH) que presenta el vector pBiFC-VC155, para no alterar el plegamiento y flexibilidad que éste aporta. Para la amplificación del fragmento Venus-C155 así como del linker, por separado, se usó como molde el propio vector pBiFC-VC155. Para la obtención de la secuencia de Bcl-XL se utilizó el Materiales y Métodos 82 vector pcDNA3.1(+), como en el apartado 3.2.7.1 Se realizaron 3 ciclos de PCR, para amplificar, por separado cada una de las partes de la fusión. Para cada amplificación se incluyó en los oligonucleótidos empleados parte de la secuencia adyacente a fusionar, de manera que se pudieran llevar a cabo 2 ciclos de PCR solapada y llegar así a generar el constructo final. Las reacciones de PCR se realizaron como se describe en el apartado 3.2.7.1. Los primers empleados fueron los siguientes (como nombre se les ha designado el número al que corresponden en el esquema de la figura 3.6): Primer 1. 5’- GACTCGGAATTCGGGACAAGCAGAAGAACGGCA -3’ Primer 2. 5’- TGCACGCCGGACGGGTACCCTTGTACAGCTCGTCCAT -3’ Primer 3. 5’- ATGGACGAGCTGTACAAGGGTACCCGTCCGGCGTGCA -3’ Primer 4. 5’- GTTGCTCTGAGACATATCGATGTGGTTCATGACTTTCTGT -3’ Primer 5. 5’- ACAGAAAGTCATGAACCACATCGATATGTCTCAGAGCAAC -3’ Primer 6. 5’- GACTCGAGATCTCTCATTTCCGACTGAAGAGT -3’ Como en el resto de clonajes descritos anteriormente, los oligonucleótidos de los extremos incorporan los sitios de restricción (secuencias en negrita) necesarios para la ligación en el vector pBiFC-VC155 y se tiene en cuenta la pauta de lectura, así como la necesidad de eliminar el codón stop del fragmento de la proteína Venus y la incorporación de éste en la secuencia de Bcl-XL (triplete subrayado). Las secuencias marcadas en estos oligonucleótidos en cursiva son las correspondientes a las zonas de solapamiento añadidas para llevar a cabo los diferentes ciclos de PCR. Los nucleótidos con doble subrayado en los primers 4 y 5 corresponden al sitio de restricción ClaI, añadido inmediatamente antes de Bcl-XL y que, juntamente con el otros sitio de restricción incorporado con el primer 6, servirá para el subclonaje de otras proteínas en este vector. V C155 Linke r BclX L Materiales y Métodos 83 Figura 3.6 Esquema de las reacciones de PCR llevadas a cabo para la obtención del constructo VenusC155-Linker-Bcl-XL. 3.2.7.4 Construcción de un vector de Bak fusionado al extremo carboxilo del fragmento Venus-C155. En el caso de la proteína Bak decidimos, al igual que para Bcl-XL, cambiar la orientación de la proteína de fusión. Se decidió verificar los resultados con la proteína VC-Bak, a pesar de que no de detectó una alteración aparente de la localización de Bak-VC en los ensayos de BiFC. Para ello se empleó el vector diseñado anteriormente para generar la fusión VC-Bcl-XL. Se llevó a cabo la digestión de ese vector con las enzimas ClaI y BglII (entre las que se encontraba clonado Bcl-XL) para linearizar el vector (apartado 3.2.9). Por otra parte se amplificó el cDNA de Bak utilizando un olignucleótido que incorporara el sitio ClaI al principio de su secuencia y otro que incorporara el sitio BglII detrás de su codón de parada. Materiales y Métodos 84 Primer 1. 5’- GACTCGATCGATATGGCTTCGGGGCAAGGC -3’ Primer 2. 5’- GACTCGAGATCTCTCATGATTTGAAGAATTTCG -3’ Las reacciones de PCR se realizaron como se describe en el apartado 3.2.7.1. 3.2.7.5 Generación de vectores para BiFC Multicolor. Para generar los vectores para los experimentos de BiFC multicolor, fue necesario subclonar los cDNA de las proteínas objeto de estudio fusionadas al otro fragmento de la proteína fluorescente. Las proteínas “sólo-BH3” Bim, PUMA y Noxa, se clonaron fusionadas al fragmento carboxilo de la proteína fluorescente, para evaluar la formación de complejos con proteínas fusionadas al fragmento amino de la proteína Venus y de la Cerulean (Mcl-1, Bcl-XL, Bak y Bax). Todas las proteínas fueron clonadas tanto en los vectores con el fragmento correspondiente de la proteína Venus así como Cerulean. Debido a que los sitios de clonaje múltiple (MCS) de los vectores con la proteína Venus y Cerulean eran idénticos, se emplearon los mismos oligonucleótidos para los clonajes (Tabla 3.3). Constructo Cebador Secuencia (5’-3’) BIM-VC/CC BimC-Fw BiFC-Rv GACTCGGAATTCGGATGGCAAAGCAACCTCTGAT GACTCGAGATCTCATGCATTCTCCACACCAGGCGGAC MCL1-VN/CN Mcl1N-Fw Mcl1N-Rv GACTCGGAATTCAATGTTTGGCCTCAAAAGAAACGC GACTCGTCTAGATCTTATTAGATATGCCAAACCAGCTC BCLXL-VN/CN Bcl-XLN-Fw Bcl-XLN-Rv GACTCGGAATTCAATGTCTCAGAGCAACCGGGAG GACTCGTCTAGATTTCCGACTGAAGAGTGAGCC BAK-VN/CN BakVN-Fw BakVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGCTTCGGGGCAAGGCCCAGGT GACTGCTCTAGATGATTTGAAGAATCTTCGTACCACA BAX-VN/CN BaxVN-Fw BaxVN-Rv GACTCGGAATTCAATGGACGGGTCGGGGAGCAG GACTCGTCTAGAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT PUMA-VC/CC PUMA-Fw PUMA-Rv GACTCGGAATTCGGATGGCCCGCGCACGCCAG GACTCGAGATCTCATTGGGCTCCATCTCGG NOXA-VC/CC Noxa-Fw Noxa-Rv GACTCGGAATTCGGATGCCTGGGAAGAAGGC GACTCGAGATCTCGGTTCCTGAGCAGAAGAG Tabla 3.3 Secuencias de los oligonucleótidos empleados para la generación de los diferentes constructos para BiFC multicolor. Las secuencias marcadas en negrita corresponden a los sitios de restricción introducidos para la posterior ligación en los vectores. Materiales y Métodos 85 Una vez obtenidos los vectores deseados se procedió a realizar las transfecciones correspondientes (apartado 3.3.1). Debido a la presencia de la proteína fluorescente Cerulean, cuyas longitudes de onda de excitación y emisión son 434 nm y 477 nm repectivamente, para estudiar las interacciones mediante fue necesario un citómetro de flujo equipado con un láser de 405nm (FACSAria, apartado 3.4.2). Para determinar la localización de los complejos por microscopía confocal se empleó el microscopio Leica SP2 (apartado 3.5.2). 3.2.8 Vectores retrovirales para la sobreexpresión estable de proteínas. Mediante la generación de retrovirus, capaces de integrar parte de su genoma en los cromosomas de las células eucariotas en división, se pueden obtener líneas celulares que sobreexpresen un determinado gen de manera estable. Los virus que se obtienen mediante este método están modificados de forma que cuando infectan una célula diana pueden insertar en su genoma el fragmento de vector comprendido entre sus secuencias LTR, pero no pueden continuar su propagación por carecer de las secuencias génicas que codifican los factores de virulencia. El primer paso es el clonaje del gen exógeno deseado dentro de esta región de inserción del vector retroviral. El vector empleado en este trabajo fue el pBABE-puro, amablemente cedido por Reinhard Wallich (Alemania), cuyo mapa se presenta en la figura 3.7. Materiales y Métodos 86 Figura 3.7 Mapa del vector pBABE. 3.2.8.1 Vectores retrovirales para la sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas de forma estable. Con el objetivo de conseguir dos líneas derivadas de HeLa que sobreexpresaran las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 o Bcl-XL, se procedió al clonaje de los cDNA completos de estas proteínas siguiendo el mismo protocolo explicado en el apartado 3.2.7.1. La construcción pBABE-Bcl-XL fue realizada y amablemente cedida por Marta Pérez (Universidad de Zaragoza). Los oligonucleótidos empleados para la amplificación de Mcl-1 fueron (las secuencias marcadas en negrita corresponden a los sitios de restricción introducidos): pBABE-Mcl-1 Fw: 5’-CGAACTGAATTCATGTTTGGCCTCAAAGAAACGC-3’ pBABE-Mcl-1 Rv: 5’-CGAACTGTCGACCTATCTTATTAGATATGCCAAAC-3’ Una vez obtenido el fragmento de la proteína Mcl-1 con los sitios de restricción adecuados, se procedió a la digestión con las enzimas de restricción (EcoRI y SalI, Takara), tanto de este fragmento como del vector pBABE, siguiendo las pautas del apartado 3.2.9. Finalmente se purificaron y cuantificaron ambos fragmentos antes de pasar a su ligación (apartado 3.2.10), transformación de bacterias (apartado 3.2.2) y análisis de las colonias (apartado 3.2.11). pBabe 5'LTR 3'LTR AmpR PURO CMV promoter pBR322 ori Acc I (2539) Bam HI (2556) Eco RI (2526) Not I (2549) Sal I (2538) Xho I (2532) Materiales y Métodos 87 3.2.8.2 Vectores retrovirales para la sobreexpresión de proteínas de fusión fluorescentes de forma estable. Para la obtención de líneas derivadas de HeLa que sobreexpresaran las proteínas de fusión Mcl-1-EYFP, EYFP-Mcl-1, Bcl-XL-EYFP y EYFP-Bcl-XL, se procedió generar las fusiones mediante PCR solapada (descrito en la Figura 3.2). Se tuvo en cuenta para ello, la necesidad de eliminar el codón stop de la primera proteína así como de introducir una secuencia espaciadora entre ambos cDNA (secuencia correspondiente a los aminoácidos GSRSIAT). El cDNA de las proteínas Mcl-1 y Bcl-XL se amplificó a partir del vector pcDNA3.1(+) de la biblioteca de vectores del laboratorio y el cDNA de la proteína fluorescente EYFP se obtuvo a partir del vector pEYFP-N1. Los oligonucleótidos empleados se detallan en la siguiente tabla: Constructo Cebador Secuencia (5’-3’) Bcl-XL-EYFP BclXL-Fw BclXL-Rv Linker EYFP-Fw Linker EYFP-Rv TTGATCGAATTCATGTCTCAGAGCAACCGGGA GGTGGCGATGGATCTGAATCCTTTCCGACTGAAGAGTGAGAA GGATCCAGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA CGACGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC EYFP-Bcl-XL EYFP-Fw EYFP-Rv Linker BclXL-Fw Linker BclXL-Rv GACTCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG GGTGGCGATGGATCTGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC GGATCCAGATCCATCGCCACCATGTCTCAGAGCAACCGGGAG CGACGTCGACTCATTTCCGACTGAAGAGTG Mcl-1-EYFP Mcl1-Fw Mcl1-Rv Linker EYFP-Fw Linker EYFP-Rv CGAACTGAATTCATGTTTGGCCTCAAAAGAAACGC GGTGGCGATGGATCTGGATCCTCTTATTAGATATGCCAAACCACTC GGATCCAGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA CGACGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC EYFP-Mcl-1 EYFP-Fw EYFP-Rv Linker Mcl1-Fw Linker Mcl1-Rv GACTCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG GGTGGCGATGGATCTGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC GGATCCAGATCCATCGCCACCATGTTTGGCCTCAAAAGAAAC CGAACTGTCGACCTATCTTATTAGATATGCCAAAC Tabla 3.4 Secuencias de los oligonucleótidos empleados para la generación de las fusiones de Bcl-XL y Mcl-1 con EYFP. Las secuencias marcadas en negrita corresponden a los sitios de restricción introducidos para la posterior ligación en los vectores y la secuencia en cursiva representa el espaciador introducido entre ambos cDNA. Tras los dos ciclos de PCR, y una vez comprobada por electroforesis en gel de agarosa la fusión de ambos fragmentos se procedió a su digestión con las enzimas EcoRI y SalI (Takara) y ligación en el vector retroviral pBabe linealizado con las Materiales y Métodos 88 mismas enzimas (siguiendo las pautas de los apartados 3.2.9 y 3.2.10). A continuación, se transformaron bacterias y se analizaron las colonias positivas como se describe en los apartados 3.2.2 y 3.2.11, repectivamente. 3.2.8.3 Vectores retrovirales para la sobreexpresión de proteínas de fusión de Bax. Con el objetivo de estudiar la localización de la proteína proapoptótica Bax, se generaron dos vectores retrovirales para ser transfectados a las células: pBABE-BaxEYFP y pBABE-EYFP-Bax. La fusión de las proteínas Bax y EYFP se realizó mediante PCR overlap o solapada como se describe en la Figura 3.2. En ambas fusiones, se eliminó el codón stop de la proteína situada en primera posición y entre ésta y la segunda proteína se incluyó una secuencia de nucleótidos correspondiente a los aminoácidos GSRSIAT, que actúa de espaciador o linker para permitir el plegamiento de las dos proteínas de forma independiente. Las parejas de oligonucleótidos empleados para cada fusión fueron: Constructo Cebador Secuencia (5’-3’) BAX-EYFP Bax-Fw Bax-Rv Linker EYFP-Fw Linker EYFP-Rv GACTCGGAATTCATGGACGGGTCCGGGGAGCAG GGTGGCGATGGATCTGGATCCGCCCATCTTCTTCCAGATGGT GGATCCAGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA CGACGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC EYFP-BAX EYFP-Fw EYFP-Rv Linker Bax-Fw Linker Bax-Rv GACTCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG GGTGGCGATGGATCTGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC GGATCCAGATCCATCGCCACCATGGACGGGTCCGGGGAGCAG CGACGTCGACTCAGCCCATCTTCTTCCAGAT Tabla 3.5 Secuencias de los oligonucleótidos empleados para la generación de las fusiones de Bax y EYFP. Las secuencias marcadas en negrita corresponden a los sitios de restricción introducidos para la posterior ligación en los vectores y la secuencia en cursiva representa el espaciador introducido entre ambos cDNA. Una vez obtenidos los fragmentos de las dos proteínas fusionados, se siguió el procedimiento descrito a continuación de digestión enzimática del DNA (EcoRI y SalI; Takara), ligación en el vector pBABE linearizado, transformación bacteriana (apartado 3.2.2) y selección de colonias que hubieran captado el vector con el inserto incorporado (apartado 3.2.11). Materiales y Métodos 95 3.4 CITOMETRÍA DE FLUJO (FACS) 3.4.1 Análisis de las interacciones entre proteínas por BiFC. Después de 24 horas de haber transfectado las líneas celulares con las parejas de vectores pBiFC (apartado 3.3.1), se procedió a cuantificar las interacciones mediante citometría de flujo. Para ello las células se tripsinizaron, se lavaron en PBS y se analizaron en un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences). Las señales de las proteínas Venus (generada por la complementación de sus dos fragmentos e indicativo de interacción entre las proteínas a las que los fragmentos se encuentran fusionados) y mRFP se cuantificaron utilizando los láseres de excitación 488 nm y 635 nm, respectivamente. Se aplicó un proceso de “gating” en el cual se excluían las células no transfectadas, consideradas como aquellas que no presentaban fluorescencia roja. De esta manera se calculó el porcentaje de células verdes respecto a las rojas, dándonos así una relación de las células en las que está ocurriendo interacción entre las proteínas de estudio, dentro de las células que han sido transfectadas. Además, también se calculó la relación de las intensidades de fluorescencia media (Fluorescencia media Venus/ Fluorescencia media mRFP), obteniéndose un índice de la intensidad de esta interacción. El análisis de los datos obtenidos de realizó con el programa Weasel (The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia). 3.4.2 Análisis de las interacciones entre proteínas por BiFC Multicolor. Transcurridas 24 horas desde la transfección de las células con las diferentes combinaciones de vectores se estudió la formación diferencial de complejos fluorescentes mediante citometría de flujo. Para este análisis se empleó un citómetro de flujo Gallios de Beckman Coulter. Este citómetro permite emplear el láser de 405 nm para excitar los complejos que contienen el fluoróforo de la proteína Cerulean, que tiene su máximo de excitación a 434 nm. De esta manera podemos realizar simultáneamente una adquisición de la fluorescencia de los complejos de la proteína Venus y del marcador de transfección mRFP. Materiales y Métodos 96 3.4.3 Determinación de potencial mitocondrial (ΔΨm) y translocación de fosfatidilserina. El potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) generado por el gradiente de protones entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana, es alto y de alrededor de 130 mV en las células en condiciones normales. Sin embargo, su disminución debido a la despolarización de las mitocondrias es un evento temprano del proceso apoptótico. Otro evento que caracteriza la apoptosis es la exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática, lo cual conduce a la fagocitosis de esa célula por parte de macrófagos. Para determinar el potencial mitocondrial se utilizaron las sondas lipofílicas DiOC6(3) (ioduro de 3,3’-dihexiloxa carbocianina, fluorescencia verde) o TMRE (Tetrametildrodamina etiléster, fluorescencia roja) (Molecular Probes, Invitrogen), que se acumulan en la matriz de las células viables, y que conforme disminuye el potencial mitocondrial desciende la cantidad de sonda retenida y consecuentemente la fluorescencia emitida. Para la medida de exposición de fosfatidilserina se empleó Anexina V (Immunostep), proteína que se une específicamente a este fosfolípido, conjugada a ficoeritrina (PE, fluorescencia roja) o isocianato de fluoresceína (FITC, fluorescencia verde). Para realizar el marcaje de Anexina V, las células se recogieron, se lavaron en PBS y se incubaron con 0,5 μg/ml de la Anexina V conjugada con el fluorocromo adecuado en 100 μl de tampón ABB (Annexin Binding Buffer: Hepes 10 mM, Sigma; NaOH 10 mM, Merck; CaCl2 140 mM, Merck; NaCl 2,5 mM, Merck) durante 15 minutos en oscuridad. Para analizar simultáneamente el potencial mitocondrial, a la mezcla anterior se añadió bien 5 nM DiOC6(3) o 60 nM de TMRE y se incubó entonces durante 15 minutos a 37 ºC. Las muestras de analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur de BD Biosciences y el tratamiento de los datos se realizó con el programa Weasel. Materiales y Métodos 97 3.5 LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICROSCOPÍA CONFOCAL DE FLUORESCENCIA Para el estudio de la localización de proteínas mediante su marcaje intracelular con anticuerpos, por visualización directa de complejos formados por BiFC o por sobreexpresión de una proteína fusionada a proteínas fluorescentes se empleó la técnica de microscopía confocal de fluorescencia. La visualización de las diferentes preparaciones se realizó en un microscopio confocal Leica SP2 AOBS. Las imágenes se recogieron empleando el modo secuencial, para garantizar que no hubiera interferencia entre las diferentes fluorescencias utilizadas. Se utilizó un objetivo de inmersión de 63x (HCXPLAPO NA 1.40; Leica). La adquisición de imágenes se realizó con un “line average” de 16, un formato de 1024X1024 pixeles y la apertura confocal fue de una unidad de Airy. Las imágenes se analizaron con Leica Confocal Software y se exportaron a Adobe PhotoShop CS2 v.p. Para determinadas aplicaciones se empleó el microscopio confocal Olympus FV10i. La adquisición de imágenes se realizó en modo secuencial con un objetivo de 60x (Plan S-APO 60xO, NA 1.35), un “line average” de 8 y un formato de 1024x1024 pixels. La apertura confocal fue de una unidad de Airy. El análisis de imágenes se realizó con el software FV10-ASW 2.0 Viewer y se exportaron a Adobe PhotoShop CS2 v.p. 3.5.1 Inmunolocalización de proteínas intracelulares. Por una parte se llevó a cabo la detección de la salida de citocromo c de las mitocondrias al espacio intermembrana mitocondrial ocasionada por la inducción de apoptosis al transfectar las células con los vectores pBiFC. Por otra parte se estudió la localización de las proteínas Bax y Mcl-1 endógenas. Para ello se sembraron 5x104 células en un volumen final de 500 μl de medio en placas de 24 pocillos que contenían cubreobjetos de 13 mm de diámetro. Tras 24 horas de la transfección con los vectores pBiFC o de la siembra para la localización de Bax/Mcl-1 se procedió al inmunomarcaje de las diferentes proteínas. El primer paso fue el lavado de las células con PBS para su posterior fijado en paraformaldehído (Merck) al 4% durante 15 minutos a 4ºC. Transcurrido este tiempo Materiales y Métodos 98 se retiró el paraformaldehído y las células se volvieron a lavar con PBS. A continuación, se sacaron los cubreobjetos de los pocillos y se lavaron consecutivamente en: Saponina (Merck) al 0,1% en PBS, PBS y H2O MilliQ. A continuación, los cubres se colocaron en una cámara húmeda que consistió en un recipiente de plástico con el fondo cubierto de papel de filtro humedecido en agua destilada y una capa de parafilm. Sobre el parafilm se colocaron gotas de 20 μl de la mezcla del anticuerpo correspondiente (190 μl de saponina al 0,1% de PBS y 10 μl de suero de cabra con la dilución adecuada para cada anticuerpo). De esta manera se colocaron los cubreobjetos encima de las gotas con la cara con las células adheridas en contacto con la dilución de anticuerpo, y se incubó durante una hora. Una vez terminada la primera incubación, se volvieron a lavar los cubreobjetos en las tres soluciones anteriormente indicadas. A continuación se procedió a la incubación con el anticuerpo secundario adecuado (dilución 1/1000 en una mezcla que contenía 190 μl de saponina al 0,1% de PBS y 10 μl de suero de cabra) durante una hora. Pasado este tiempo, se lavaron de nuevo los cubreobjetos en las soluciones de Saponina 0,1% en PBS, PBS y agua MilliQ y, una vez secos se colocaron en un portaobjetos sobre una gota de Fluoromount-G (SouthernBiotech) que contenía 20 μM de DRAQ5 (Molecular Probes, Invitrogen) para el marcaje de núcleos. La conservación de las preparaciones se realizó a 4ºC. Los anticuerpos primarios empleados en cada caso se recogen en la siguiente tabla: Anticuerpo Especie Dilución de uso Casa comercial Citocromo c mc, ratón 1/1000 BD Biosciencies, 556432 Mcl-1 pc, conejo 1/1000 Santa Cruz, sc-819 Bax pc, conejo 1/1000 BD Biosciences, 13666E Tabla 3.6 Relación de anticuerpos primarios empleados para marcaje intracelular. De forma paralela se realizó el marcaje con la misma cantidad de IgG de ratón del isotipo correspondiente (IgG1) o IgG de conejo, para valorar la especificidad de señal de fluorescencia del marcaje con los anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: anti-ratón conjugado con Alexa 568 (Invitrogen) en el caso del marcaje de citocromo c y anti-conejo conjugado con Alexa 488 (Invitrogen) para el marcaje de Mcl-1 y Bax. Materiales y Métodos 99 3.5.2 Visualización de los complejos formados por BiFC. Se empleó la técnica de microscopía confocal para visualizar la localización de los complejos entre las proteínas correspondientes al transfectar las células con las diferentes combinaciones de vectores de BiFC. Para ello, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 105 células/ml y sobre cubres de 13mm de diámetro previamente sumergidos en etanol y secos. Tras 24 horas las células fueron transfectadas como se describe anteriormente (apartado 3.3.1) y 24 horas después de la transfección se procedió a la tinción de sus mitocondrias con la sonda MitoTracker Red (50 nM, Invitrogen). Tras 15 minutos a 37ºC se pasó a fijar las células con paraformaldehido al 4% durante 15 minutos a 4ºC y posteriormente se lavaron con PBS y agua MilliQ. Una vez secos los cubreobjetos, éstos se colocaron sobre un portaobjetos que contenía una gota de Fluoromount-G (SouthernBiotech) con 20 μM de DRAQ5 (Molecular Probes, Invitrogen) para el marcaje de núcleos. Las preparaciones se conservaron a 4ºC hasta su visualización. 3.6 ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA NUCLEAR POR TINCIÓN CON HOECHST 33342. Para el análisis de la morfología nuclear tras el inmunomarcaje de las diferentes líneas celulares se empleó el reactivo Hoechst 33342 a una concentración final de 20 μg/ml (dilución en PBS del stock de 20 mg/ml). La visualización de las preparaciones se realizó con un microscopio de fluorescencia confocal Olympus FV10i con las condiciones descritas anteriormente. 3.7 MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA TIME-LAPSE. Para realizar un seguimiento a lo largo del tiempo de la formación de los complejos entre proteínas por BiFC así como para ver la sobreexpresión de una proteína de fusión fluorescente tras transfectar las células, se empleó un microscopio de fluorescencia multidimensional Leica AF6000 LX system. Este microscopio tiene acoplada una cámara termostatizada que permite mantener las células en condiciones de 37ºC y 5% de CO2. Las células se visualizan con un objetivo seco de 40 aumentos (HCX PL S-APO 40.0x0.75) y las imágenes se adquieren a intervalos regulares con una cámara CCD (C9100-02, Hamamatsu) de alta resolución. El software de análisis LAS AF (Leica), permite el montaje de las imágenes adquiridas en forma de vídeo. Materiales y Métodos 100 Para estos estudios las células HeLa, HeLa-Mcl-1 y HeLa-Bcl-XL se sembraron en microplacas de 8 pocillos de Ibidi. En cada pocillo se sembraron 2x104 células en un volumen final de 200 μl de medio DMEM 10% SFB sin antibiótico. Las transfecciones correspondientes con los vectores pBiFC o retrovirales se llevaron a cabo directamente en estas placas. Tras la tranfección se introdujeron las placas en la cámara termostatizada del microscopio para proceder a la elección de los diferentes planos de visualización. 3.8 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 3.8.1 Extracción y fraccionamiento de lisados celulares totales. Tras someter a las células a diferentes tratamientos o transfecciones, se recogieron 5x105 células y se lavaron con 1ml de PBS. Posteriormente, se les añadió 10 μl de tampón de lisis 1X para la extracción de proteínas citoplasmáticas (Triton-X100 al 1%, Sigma; NaCl 150 mM, Merck; Tris/HCl 50 mM pH 7,6, Sigma; glicerol 10% v/v, Scharlau; EDTA 1 mM, Sigma; ortovanadato sódico 1 mM, Sigma; pirofosfato sódico 10 mM, Sigma; leupeptina 10 μg/ml, Sigma; fluoruro de sodio 10 mM, Sigma; fluoruro de fenilmetilsulfonio 1 mM, Sigma) y se incubaron durante 30 minutos en hielo. A continuación, los lisados se centrifugaron 10 minutos a 10.000 rpm a 4ºC y el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf nuevo sobre el que se añadió 5 μl de tampón de carga 3X (Tris/HCl 150 mM pH 7,4, Sigma; 3% dodecilsulfato de sodio, SDS, Merck; molibdato de Sodio 0,3 mM, Sigma; pirofosfato de sodio 30 mM, Sigma; fluoruro de sodio 30 mM, Sigma; glicerol 30% v/v, Scharlau; 2-β-mercaptoetanol 30% v/v, Sigma; azul de bromofenol 0,06% p/v). Estos lisados celulares se calentaron a 100ºC durante 5 minutos en un baño seco (Selecta) para ser cargados en los geles de electroforesis o bien fueron conservados a -20ºC para su uso posterior. En determinados casos se realizó un análisis de proteínas totales, incluyendo las nucleares, se utilizó otro tampón de lisis cuya composición era: 2% SDS, Merck; 20 mM Tris/HCl pH 6,6, Sigma. En este caso los lisados se hirvieron durante 20 minutos a 100ºC antes de ser cargados en los geles de electroforesis. Materiales y Métodos 101 3.8.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. La separación de proteínas celulares en función de su peso molecular se realizó en geles discontínuos de poliacrilamida con un 0,1% de SDS. El porcentaje de acrilamida varió entre el 10-15% según el tamaño de las proteínas a analizar. Las composiciones del gel concentrador o “stacking” y separador o “resolving” se encuentran en la siguiente tabla: Reactivos Gel concentrador Gel separador (X%) 30% Acrilamida/Bisacrilamida (Bio Rad) 0,65 ml 0,33X ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 1,26 ml / Tris-HCl 3 M pH 8,8 / 2,5 ml Persulfato amónico (Sigma) 50 μl 50 μl Dodecilsulfato de sodio (SDS) (Merck) 50 μl 100μl H2Od 3 ml 7,35-0,33X ml N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TMED) (Sigma) 5 μl 5 μl Tabla 3.7 Composición química de los geles de electroforesis. Las electroforesis se realizaron en cubetas de Hoefer miniVE (GE Healthcare) con 1 litro de tampón de electroforesis (Trizma 19mM, Sigma; glicina 1.9, Panreac; 0,01% SDS, Merck). Una vez hervidos, los extractos celulares se centrifugaron 60 segundos a 12.000 rpm a temperatura ambiente antes de cargarlos en el gel concentrador. Se cargaron 5 μl de marcadores de pesos moleculares (SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder). Las electroforesis se realizaron a un voltaje de 180V durante 2-3 horas. 3.8.3 Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas separadas en el gel se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond C-extra, GE Healthcare) según el método descrito previamente ((Talanian et al. 1997). La transferencia se realizó en un equipo de transferencia semiseca (Bio Rad) a 20 V y 400 mA durante 55 minutos en tampón de transferencia (Tris/HCl 48mM pH 8,3, Sigma; glicina 39 mM, Sigma; 0,0373% SDS, Merck; 20% metanol grado HPLC, Panreac). La eficacia de la transferencia se comprobó tiñendo las membranas con Rojo Ponceau (0,1% en acético al 5%, Merk). Materiales y Métodos 102 3.8.4 Análisis de proteínas mediante inmunotransferencia (Western Blotting) y detección de los inmunocomplejos. Las membranas de nitrocelulosa con las proteínas celulares fijadas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5% (p/v) disuelta en tampón B (Tris/HCl 10mM pH 8, Sigma; NaCl 0,12 M, Sigma; Tween-20 0,1%, Sigma; timerosal, Merck 0,1 g/L) durante unos 30 minutos. La detección de proteínas concretas se realizó con la ayuda de anticuerpos específicos y los marcadores de pesos moleculares coloreados sirvieron para calcular los pesos moleculares relativos de las proteínas detectadas. La incubación con el anticuerpo primario específico (Tabla 3.7) se realizó en tampón B con un 2% de leche desnatada en polvo, a una concentración y tiempo de incubación determinado para cada anticuerpo utilizado (Tabla 3.7). Tras esta incubación, se realizaron tres lavados de 15 minutos en agitación con tampón B. Posteriormente, se realizó la incubación con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa o fosfatasa alcalina (ambos de Sigma) a una dilución de 1/20.000 en la misma disolución de tampón B al 2% de leche desnatada en polvo. La incubación con el anticuerpo secundario se mantuvo durante 1-2 horas a temperatura ambiente y en agitación, tras lo cual se realizaron tres nuevos lavados de 15 minutos con tampón B para eliminar exceso de anticuerpos. Anticuerpo Especie Dilución de uso Casa comercial Bim pc, conejo 1/1000 Calbiochem Mcl-1 pc, conejo 1/1000 Santa Cruz, sc-819 Bak pc, conejo 1/1000 Millipore Bak pc, conejo 1/1000 Santa Cruz, sc-832 Bax pc, conejo 1/1000 BD Biosciences Bcl-XL pc, conejo 1/1000 Cell Signalling Noxa mc, ratón 1/250 Abcam PUMA pc, conejo 1/500 Cell Signalling α-Tubulina mc, ratón 1/5000 Sigma Tabla 3.8 Relación de anticuerpos primarios empleados para Western-Blotting. Materiales y Métodos 103 La detección de los complejos se llevó a cabo mediante revelado por quimioluminiscencia (ECL). Esta técnica se basa en la detección de la luz emitida por la oxidación de un sustrato quimioluminiscente por parte de la peroxidasa. Esta luz fue captada por películas fotográficas (High performance chemiluminescence film, GE HealthCare) en oscuridad y previa incubación de las membranas con Immobilon Western Reagent (Millipore) durante 90 segundos. Los tiempos de exposición de la película a la membrana variaron desde unos segundos hasta varios minutos dependiendo del anticuerpo. La exposición de las películas se llevó a cabo dentro de un cassette de revelado radiológico (HypercassetteTM, Amersham Bioscience) y en un cuarto oscuro con iluminación adecuada para revelado fotográfico. Las películas se revelaron, tras la exposición, mediante inmersión en soluciones de revelador - agua destilada - fijador, variando el tiempo en solución de revelador según la señal obtenida. La preparación de las soluciones de revelador (Sigma) y fijador (Kodak) se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante. 3.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS. El análisis estadístico de la significancia de los datos se realizó mediante el cálculo de la t-Student, empleando el programa GraphPad Prism 4.0. (GrandPath Software, Inc., San Diego, CA, USA). Resultados y Discusión 111 También se analizó la expresión de las proteínas de fusión delecionadas para verificar que eran capaces de expresarse en las células y que las variaciones en las interacciones que detectamos por BiFC no son consecuencia de una expresión anómala (Figuras 4.4, 4.5 y 4.6). Los western-blot presentados corresponden como en la figura anterior a la transfección con las diferentes parejas de proteínas de fusión correspondientes al primer conjunto de vectores (Figura 3.2). En las transfecciones de dos proteínas proapoptóticas se trataron las células previamente con zVAD-fmk (50μM) y se redujo la cantidad de vectores transfectados a la mitad (1,5 μg/106 células de cada vector), con el fin de evitar la sobreexpresión de dichas proteínas. Figura 4.4 Niveles de expresión de las proteínas de fusión mutantes BimΔBH3-VN (A) y PUMAΔBH3-VN (B) analizados por western-blot, respecto a las proteínas endógenas. El peso molecular de las proteínas de fusión corresponde a la suma del peso de la proteína endógena y el peso del fragmento correspondiente de la proteína fluorescente Venus (VN ~ 17,5 KDa; VC ~ 10,5 KDa). B A Resultados y Discusión 112 Figura 4.5 Niveles de expresión de las proteínas de fusión mutantes BakΔBH3-VN/VC y BakΔH1α-VN/VC analizados por western-blot, respecto a las proteínas endógenas. El peso molecular de las proteínas de fusión corresponde a la suma del peso de la proteína endógena y el peso del fragmento correspondiente de la proteína fluorescente Venus (VN ~ 17,5 KDa; VC ~ 10,5 KDa). La banda marcada con un * corresponde a una banda inespecífica que reconoce el anticuerpo empleado (Santa Cruz, ver Tabla 3.8). Resultados y Discusión 113 Figura 4.6 Niveles de expresión de las proteínas de fusión mutantes BaxΔBH3-VN/VC y BaxΔH1α-VN/VC analizados por western-blot, respecto a las proteínas endógenas. El peso molecular de las proteínas de fusión corresponde a la suma del peso de la proteína endógena y el peso del fragmento correspondiente de la proteína fluorescente Venus (VN ~ 17,5 KDa; VC ~ 10,5 KDa). 4.1.2 Verificación de la funcionalidad de las proteínas de fusión Una cuestión importante a destacar es el hecho de que fusionar una proteína fluorescente, o un fragmento de ésta, a otra proteína puede alterar de alguna manera su localización y funcionalidad. Una característica de las proteínas de la familia Bcl-2 es su estrecha relación con las membranas mitocondriales a la hora de ejercer su función en la ruta intrínseca de la apoptosis (Lindsay et al. 2010). Por ello, se analizó si fusión de fragmentos de la proteína Venus necesaria para los ensayos de BiFC podría estar influyendo en la localización y función de las proteínas cuya interacción se quería estudiar. En primer lugar se decidió comprobar que las proteínas proapoptóticas al ser transfectadas eran capaces de inducir muerte en las células. Para tener un control con Resultados y Discusión 114 el que comparar se generaron dos líneas estables que sobreexpresaran las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL, respectivamente. La obtención de estas líneas se llevó a cabo por infección retroviral como se describe en el apartado 3.3.3 con los vectores pBabe-Mcl-1, pBabe-Bcl-XL y pBabe vacío. Para verificar la sobreexpresión de ambas proteínas de fusión se seleccionaron varios clones, por la resistencia a puromicina codificada en el vector, y se analizaron sus niveles de expresión por western-blot. En la Figura 4.7 se puede observar un aumento de la expresión de las proteínas de interés en los clones seleccionados, respecto a la línea con el vector pBabe vacío (HeLa-Vector). Figura 4.7 Niveles de expresión de Mcl-1 y Bcl-XL en las líneas HeLa-Vector y las dos sublíneas obtenidas por infección retroviral. A continuación se estudió la inducción de apoptosis por parte de las proteínas proapoptóticas y la protección que las sublíneas generadas ofrecían (Figura 4.8). Se midió la exposición de fosfatidilserina por citometría de flujo por unión de AnnexinaVPE y se pudo observar que, efectivamente, la sobreexpresión de las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL protege de manera importante a la muerte inducida por sobreexpresión transitoria de las proteínas de fusión proapoptóticas. Resultados y Discusión 115 Figura 4.8 Datos de la muerte celular inducida a las 24h de la transfección con proteínas proapoptóticas, analizada por exposición de fosfatidilserina por citometría de flujo. Los resultados son media ± SD de 3-4 experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. Cabe mencionar que se observa una disminución en el porcentaje de células apoptóticas al transfectar con las proteínas “sólo-BH3” Bim y PUMA carentes de sus dominios BH3. Estos datos parecen indicar que las proteínas de fusión que generamos eran funcionales al ser transfectadas a las células. 4.1.3 Efecto de la generación de fusiones sobre la localización y función de las proteínas. La función de las proteínas de la familia Bcl-2 en la ruta intrínseca de la apoptosis está vinculada a las mitocondrias y a su localización en la membrana externa de dichos orgánulos. La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el DNA nuclear y se transportan a la mitocondria después de traducirse (Neupert 1997). Muchas de las proteínas localizadas en la membrana mitocondrial externa (MME) tienen una señal de localización interna que no se procesa tras el transporte de dichas proteínas (Setoguchi et al. 2006). Según su topología, las proteínas de la MME se dividen en dos clases: las que están ancladas a la membrana a través de un segmento transmembrana localizado en su extremo N-terminal (proteínas N-TA) y las que tienen el sitio de anclaje en el extremo C-terminal (proteínas C-TA) y exponen su extremo Nterminal hidrofílico al citoplasma (Setoguchi et al. 2006). El segmento transmembrana de hidrofobicidad moderada y las secuencias ricas en aminoácidos básicos que lo flanquean funcionan como señales para dirigir y distribuir a las proteínas N y C-TA en las mitocondrias (Rapaport 2003). Resultados y Discusión 116 Los vectores utilizados inicialmente para generar las proteínas de fusión para los estudios de interacciones por la técnica BiFC tienen, por defecto, la fusión del fragmento de la proteína fluorescente Venus en el extremo carboxilo de la proteína de interés. Según lo explicado en el párrafo anterior, y dependiendo de a qué clase de proteínas mitocondriales pertenezcan, esto podría alterar la localización y función de las proteínas de la familia Bcl-2. Por ello, nos planteamos analizar si la fusión de una proteína en el extremo carboxilo de algunas de las proteínas objeto de estudio podía afectar su funcionalidad. 4.1.3.1 Influencia de la fusión en el extremo carboxilo de Mcl-1. Por un lado quisimos verificar que la fusión del fragmento correspondiente de la proteína fluorescente Venus en el extremo carboxilo de Mcl-1 estaba afectando a su localización subcelular. Para ello generamos, mediante la técnica PCR solapada (apartado 3.2.7.2), dos constructos de la proteína Mcl-1 con la proteína fluorescente EYFP fusionada en su extremo amino (EYFP-Mcl-1) y en su extremo carboxilo (Mcl-1EYFP), respectivamente. Estos constructos se clonaron en el vector pBabe y posteriormente se obtuvieron, por infección retroviral de la línea celular HeLa, dos líneas estables que sobreexpresaban las proteínas de fusión fluorescentes (Figura 4.9). Figura 4.9 Análisis mediante western-blot de la sobreexpresión estable de las proteínas de fusión Mcl-1-EYFP y EYFP-Mcl-1 en células HeLa. El peso molecular de la proteína sobrexpresada corresponde con el peso teórico calculado mediante la herramienta informática Expasy. El carril marcado como Control corresponde a la línea HeLa-CN, obtenida mediante la transfección estable con el vector pBabe vacío. Peso molecular EYFP ~ 27kDa. Una vez obtenidas estas líneas derivadas de HeLa se estudió la localización subcelular de ambas proteínas de fusión por microscopía confocal (apartado 3.5). Como se puede apreciar en la Figura 4.10 ambas proteínas presentan un patrón de localización muy similar y se detectan tanto en citoplasma como en mitocondrias, Resultados y Discusión 117 como se ha descrito anteriormente (Nijhawan et al. 2003; Xue et al. 2005). Es importante destacar, además, que el extremo N-terminal de Mcl-1 es esencial para su localización mitocondrial aunque no suficiente, y que requiere de un dominio Cterminal funcional para su inserción en las membranas (Germain and Duronio 2007). Además, se ha descrito un motivo EELD en la secuencia de Mcl-1 implicado en su importación a mitocondrias vía interacción con Tom70 (Chou et al. 2006). Figura 4.10 Imágenes de microscopía confocal representativas de diferentes planos donde se puede observar la distribución subcelular de las proteínas de fusión Mcl1EYFP y EYFP-Mcl-1 en células HeLa. Escala, 50μm. De manera complementaria se llevó a cabo un inmunomarcaje intracelular de la proteína endógena Mcl-1 en células HeLa (protocolo descrito en el apartado 3.5.1). Las preparaciones se analizaron por microscopía confocal de fluorescencia y en la figura 4.11 se muestra una fotografía representativa. Como se puede observar en las fotografías el marcaje de la proteína Mcl-1 endógena muestra una distribución preferentemente mitocondrial, coincidiendo con el marcaje obtenido con la sonda mitocondrial MitoTracker Red, aunque también se observa una localización  Resultados y Discusión 118 Figura 4.11 Inmunolocalización de Mcl-1 en las células HeLa. Se realizó un marcaje intracelular de la proteína Mcl-1 y en paralelo se hizo otro marcaje con IgG de conejo para descartar la fluorescencia inespecífica, ambos con Alexa 488. Simultáneamente se visualizaron las mitocondrias utilizando la sonda MitoTracker Red. Asimismo analizamos el efecto de la fusión en el extremo C-terminal de Mcl-1 sobre su papel protector frente a estímulos apoptóticos. Para ello, la línea estable HeLa-Mcl-1-EYFP fue sometida al tratamiento con dos dosis de etopósido (inhibidor de la topoisomerasa II con potente efecto citotóxico sobre diferentes neoplasias (Lock and Stribinskiene 1996) y comparada con la línea control (Figura 4.12). Se puede observar que la sobreexpresión de la proteína Mcl-1 no bloquea de forma total la muerte inducida por este fármaco aunque sí la reduce significativamente. Figura 4.12 Análisis de la muerte celular inducida por etopósido en las líneas celulares HeLa y HeLa-Mcl-1-EYFP tras 24 horas de tratamiento. La apoptosis se cuantificó analizando la caída de potencial mitocondrial con la sonda fluorescente TMRE. Los resultados son media ± SD de 2 experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. Resultados y Discusión 119 Todos los datos obtenidos anteriormente ponen en evidencia que la fusión de una proteína en el extremo carboxilo de Mcl-1 genera una proteína quimera funcional y que su localización subcelular no se ve alterada respecto a la proteína endógena. La proteína de fusión de Mcl-1 empleada para los estudios de interacciones por la técnica BiFC fue en todos los casos la que presenta el fragmento de la proteína Venus en su extremo carboxilo. 4.1.3.2 Influencia de la fusión en el extremo carboxilo de Bcl-XL. La proteína antiapoptótica Bcl-XL está en algunos modelos celulares inicialmente asociada a las mitocondrias (Gonzalez-Garcia et al. 1994) aunque otros autores han descrito que se localiza en citosol y se transloca a las mitocondrias al recibir un estímulo apoptótico (Hsu et al. 1997; Cuttle et al. 2001). El extremo C-terminal de BclXL, constituído por una secuencia de 21 aminoácidos, forma una hélice hidrofóbica que, junto a una serie de residuos básicos que la flanquean, funciona como dominio de inserción en la MME (Kaufmann et al. 2003). Otros posibles dominios transmembrana se han localizado en la hélice α 5 de esta proteína (Garcia-Saez et al. 2004) y algunos estudios de mutagénesis dirigida muestran que la horquilla formada por las hélices α 5 y 6 de Bcl-XL es importante para su capacidad de formar poros iónicos in vitro (Schendel et al. 1997) y para su actividad antiapoptótica (Matsuyama et al. 1998). Además otros autores han sugerido la existencia de una conformación alternativa de Bcl-XL anclada a la membrana a través de su dominio N-terminal (Thuduppathy et al. 2006). Se ha observado también, que en el citosol de células sanas Bcl-XL se encuentra formando homodímeros mediante la inserción de su dominio C-terminal en el bolsillo hidrofóbico que forman las regiones BH1-BH3 de otra molécula de Bcl-XL (Jeong et al. 2004). Sin embargo, datos de cristalografía de rayos X han demostrado que los bolsilos hidrofóbicos de las moéculas de Bcl-XL implicadas en la formación de dímeros están accesible para la unión de dominios BH3 (O'Neill et al. 2006). Como en en el caso de Mcl-1, quisimos ver si la fusión de una proteína en el extremo C-terminal de Bcl-XL afectaba a la localización subcelular de esta proteína. Para ello generamos dos líneas estables derivadas de HeLa mediante infección retroviral con los vectores pBabeBcl-XL-EYFP y pBabe-EYFP-Bcl-XL. Al observar ambas líneas celulares por microscopía confocal se comprobó que la posición de la proteína fluorescente respecto a Bcl-XL alteraba la localización de ésta de manera importante (Figura 4.13). Mientras que la proteína Bcl-XL-EYFP presentaba una Resultados y Discusión 120 localización totalmente citosólica, la distribución de EYFPBcl-XL era completamente mitocondrial. Figura 4.13 Imágenes de microscopía confocal representativas de diferentes planos donde se puede observar la distribución subcelular de las proteínas de fusión Bcl-XLEYFP y EYFP-Bcl-XL en células HeLa. Escala, 50 μm. Esta clara diferencia nos hizo plantearnos que quizás las interacciones que pudiéramos detectar mediante BiFC empleando la proteína de fusión con el fragmento de Venus en el C-terminal de Bcl-XL podrían tener una localización errónea. Por ello, como se explica más adelante, decidimos estudiar las interacciones de Bcl-XL con el resto de miembros de la familia utilizando dos constructos diferentes, con el fragmento de la proteína fluorescente Venus fusionado a uno u otro extremo de Bcl-XL. 4.1.3.3 Influencia de la fusión en el extremo carboxilo de Bax. Bax es una proteína principalmente citosólica en células sanas que se transloca a las mitocondrias al darse un estímulo apoptótico (Wolter et al. 1997; Goping et al. 1998). Existe mucha controversia acerca de los dominios que dirigen a Bax a las membranas mitocondriales y promueven su inserción en éstas (Lalier et al. 2007). Por Resultados y Discusión 127 Figura 4.18 Análisis de la morfología nuclear tras la transfección con las proteínas de fusión de Bax mediante tinción con Hoechst 33342 (1000X). Imágenes representativas de diferentes planos. Después de realizar las comprobaciones anteriores, podemos afirmar que las proteínas de fusión generadas a partir de Bax para los experimentos de estudio de interacciones mediante BiFC presentan una localización subcelular normal y son funcionales en cuanto a su capacidad de inducir apoptosis en las células y de realizar la translocación del citosol a las mitocondrias. 4.2 INTERACCIONES DE LAS PROTEÍNAS ANTIAPOPTÓTICAS Mcl-1 Y Bcl-XL CON MIEMBROS PROAPOPTÓTICOS DE LA FAMILIA Bcl-2. Como se ha mencionado en el apartado 2.4.1 de la Introducción, uno de los puntos discrepantes entre el modelo directo y el indirecto es el mecanismo por el cual las proteínas antiapoptóticas como Mcl-1 y Bcl-XL ejercen el bloqueo de las proteínas proapoptóticas multidominio Bak y Bax. Por una parte, según el modelo indirecto de activación, las proteínas antiapoptóticas interaccionan directamente con Bak y Bax evitando así la permeabilización de las mitocondrias (Willis et al. 2005; Willis et al. 2007). Por otra parte, se sabe que en determinadas células sanas Mcl-1 y Bcl-XL interaccionan con gran afinidad con proteínas proapoptóticas “sólo-BH3”, como Bim y PUMA (Chen et al. 2005; Gomez-Bougie et al. 2005) y también Noxa (Zhang et al. 2011). Sin embargo, determinados estímulos apoptóticos, como los glucocorticoides, hacen aumentar los niveles de proteínas como Bim y PUMA, excediendo la capacidad Resultados y Discusión 128 de las proteínas antiapoptóticas de bloquear dichas proteínas “sólo-BH3”. De esta manera quedarán libres moléculas de proteínas proapoptóticas “sólo-BH3” que podrán llevar a cabo la activación de Bak y Bax para proseguir con la ruta intrínseca de la apoptosis (Erlacher et al. 2005; Lopez-Royuela et al. 2009; Lopez-Royuela et al. 2012). Con el objetivo de analizar la capacidad de Mcl-1 y Bcl-XL para bloquear las proteínas Bak y Bax o bien para neutralizar a las proteínas “sólo-BH3” que pudieran activar a las anteriores, se estudiaron las interacciones que estas dos proteínas antiapoptóticas establecen con uno y otro subgrupo de proteínas mediante BiFC. 4.2.1. Interacciones de la proteína antiapoptótica Mcl-1 con proteínas proapoptóticas “sólo-BH3” y con las proteínas multidominio Bak y Bax. Las células HeLa se cotransfectaron (apartado 3.3.1) con cantidades equivalentes de dos vectores, uno que codifica Mcl-1 fusionada al fragmento carboxilo de la proteína fluorescente Venus (Mcl-1-VC) y otro que contiene el fragmento amino de dicha proteína fluorescente fusionado a Bim (Bim-VN), PUMA (PUMA-VN), Noxa (Noxa-VN), Bak (Bak-VN) o Bax (Bax-VN). A las 24 horas de la transfección, las células se recogieron para su análisis mediante citometría de flujo. También se estudiaron los complejos formados por microscopía confocal de fluorescencia. Asimismo, se estudiaron algunas de las interacciones intercambiando el fragmento de la proteína Venus al que se encuentran fusionadas nuestras proteínas. Se ha descrito que las proteínas “sólo-BH3” establecen interacciones con el resto de proteínas de la familia Bcl-2 mediante su dominio BH3, insertándolo en un bolsillo hidrofóbico que forman los dominios BH1-BH3 de las segundas (Liu et al. 2003). Además, se ha observado que la deleción del dominio BH3 de Bim (Puthalakath et al. 1999) y de PUMA (Nakano and Vousden 2001; Yu et al. 2001) bloquea la acción proapoptótica de estas proteínas. Por esta razón, analizamos también la interacción de Mcl-1 con los mutantes de las proteínas Bim y PUMA cuyo dominio BH3 fue delecionado mediante técnicas de PCR solapada (apartado 3.2.7.2) (BimΔBH3 y PUMAΔBH3). Por otra parte, se estudió también esta interacción con el mutante de Noxa en el que se realizó una sustitución de la leucina 29, perteneciente al dominio BH3 de la proteína, por un ácido glutámico (NoxaL29E). Resultados y Discusión 129 Nuestros datos indican que Mcl-1 es capaz de interaccionar con las tres proteínas “sólo-BH3” analizadas en un porcentaje elevado de células, respecto a las células que han sido efectivamente transfectadas (Figura 4.19 A). Por otra parte, el cálculo del ratio de la intensidad media de fluorescencia de los complejos formados por BiFC respecto de la intensidad media de fluorescencia emitida por la mRFP (Figura 4.19 B) muestra que la interacción de Mcl-1 con las proteínas “sólo-BH3” resulta en valores mayores que las interacciones con Bax o Bak (Figura 4.23). Esto sugiere que Mcl-1 podría estar principalmente implicado en la neutralización de proteínas “sólo-BH3”. La gran afinidad de Mcl-1 por las tres proteínas “sólo-BH3” estudiadas ya se había descrito anteriormente por otras técnicas (Cory et al. 2003), pero no en células intactas. Cuando delecionamos el dominio BH3 de Bim y PUMA la interacción de éstas con Mcl-1 disminuye significativamente, tanto en el porcentaje de células que presentan complejos fluorescentes, como en la intensidad de fluorescencia que emitida por estos complejos (Figura 4.19). La mutación del aminoácido Leucina 29 de Noxa por un ácido glutámico, que modifica la secuencia de su dominio BH3, también causa una reducción importante en su interacción con Mcl-1. Estos resultados indican que el dominio BH3 de las proteínas “sólo-BH3” juega un papel esencial en las interacciones establecidas entre los miembros de esta familia. Por otra parte, la reducción de las interacciones cuando modificamos la superficie de interacción entre estas proteínas nos permite verificar que las interacciones que observamos entre Mcl-1 y las proteínas “sólo-BH3” silvestres son específicas. Es importante mencionar que las proteínas mutantes de deleción de Bim y PUMA se expresaron correctamente y a niveles equivalentes a las proteínas silvestres cuando son transfectadas con Mcl-1 (Figura 4.4 A y B). A Resultados y Discusión 130 Figura 4.19 Análisis mediante citometría de flujo de la formación de complejos por BiFC entre Mcl-1 y las proteínas proapoptóticas Bim, PUMA y Noxa y sus respectivos mutantes de deleción o mutación puntual. Los resultados son media ± SD de siete experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. El análisis de la estructura tridimensional de varios dominios BH3 en complejo con proteínas antiapoptóticas ha revelado la especial importancia de 4 residuos conservados en el motivo BH3 para dicha interacción (Liu et al. 2003; Lee et al. 2008), siendo dos de ellos los aminoácidos Leucina y Aspártico que establecen contactos hidrofóbicos e interacciones por puente salino respectivamente con otros residuos conservados de las proteínas “tipo-Bcl-2” (Lanave et al. 2004; Day et al. 2005; Hinds and Day 2005). Como ya se ha mencionado anteriormente, la mutación puntual del residuo leucina 29 de Noxa, perteneciente a su dominio BH3, a un residuo ácido como es el ácido aspártico hace disminuir mucho su interacción con Mcl-1 (figura 4.19 A y B). Este dato concuerda con lo publicado por Lee y colaboradores, que observan que solamente la sustitución de la leucina conservada en el dominio BH3 de Bim por un aminoácido ácido hace disminuir sustancialmente la afinidad por Mcl-1 (Lee et al. 2007). Por otra parte, datos estructurales y de mutagénesis presentados en trabajos anteriores han demostrado que la unión de Bim y PUMA mediante su dominio BH3 al bolsillo hidrofóbico de Mcl-1 causa la estabilización de dicha proteína antiapoptótica (Mei et al. 2005; Czabotar et al. 2007). Sin embargo, la unión de Noxa a Mcl-1 promueve la ubicuitinación de la última y su degradación vía proteasoma (Willis and Adams 2005a; Czabotar et al. 2007). Dicha diferencia entre estas proteínas BH3 radica en la distinta composición de aminoácidos del dominio BH3. Se intentó B Resultados y Discusión 131 visualizar esta degradación de Mcl-1 al unirse a Noxa mediante microscopía confocal a diferentes tiempos después de la transfección. Como se observa en la Figura 4.20 a las 24 horas de transfectar las células los complejos de Noxa y Mcl-1 tienen una localización mitocondrial (ver también fotografía de Figura 4.22) y la morfología de las células es normal. Conforme pasa el tiempo las células que presentan fluorescencia presentan una morfología más redondeada, y esta fluorescencia parece disminuir en intensidad. Es probable que esté ocurriendo la degradación de este complejo, no solamente de la proteína Mcl-1, ya que los complejos formados por BiFC son esencialmente irreversibles (Kerppola 2008). Figura 4.20 Fotografías de microscopía confocal de fluorescencia de los complejos formados por la pareja de proteínas Mcl-1 y Noxa a diferentes tiempos después de la transfección. Un dato interesante que se observa en las gráficas de la Figura 4.19 tiene que ver con la proteína denominada PUMAΔN. Esta proteína corresponde a la secuencia de aminoácidos común entre las isoformas α y β de PUMA, de manera que carece de los primeros 92 aminoácidos del extremo amino. La interacción de esta proteína con Mcl-1 es significativamente menor a la observada para la isoforma PUMA α completa; sin embargo, sorprendentemente, la deleción de tres aminoácidos (LRR) del dominio BH3 de PUMA hace aumentar la interacción con Mcl-1, aunque sin alcanzar los valores de fluorescencia vistos para PUMA. La deleción de estos aminoácidos se llevó a cabo en la isoforma sin el dominio amino terminal puesto que era ésta la proteína con la que se trabajó inicialmente. Nuestros resultados discrepan con otros trabajos que observan Resultados y Discusión 132 una importante disminución de la interacción de PUMAΔLRR con la proteína antiapoptótica Bcl-2 (Nakano and Vousden 2001; Yee and Vousden 2008). Como se explica en la Introducción (Apartado 2.5.2.3) para cada pareja de proteínas cuya interacción se quiere estudiar sería necesario analizar 8 combinaciones de parejas de proteínas de fusión. Para esto se necesitaría generar 4 fusiones distintas para cada proteína: fusión en extremo amino y en carboxilo del fragmento VN y del fragmento VC. En nuestro caso, hemos generado un segundo conjunto de vectores intercambiando los fragmentos de la proteína Venus (Figura 3.3), en todos los casos con el fragmento de Venus fusionado al extremo carboxilo de nuestra proteína. Para las interacciones de Mcl-1 se llevaron a cabo diferentes transfecciones empleando el vector con la proteína de fusión Mcl-1-VN y las proteínas “sólo-BH3” y sus correspondientes mutantes fusionados al fragmento VC. Se siguió el mismo protocolo que para las otras interacciones en cuanto a tiempos y cantidades de transfección. Las gráficas obtenidas a partir de los datos de citometría de flujo (Figura 4.21) indican que las interacciones ocurridas reproducen lo observado con el primer conjunto de proteínas de fusión (Figura 4.19). De nuevo, Mcl-1 es capaz de interaccionar con las tres proteínas “sólo-BH3” en un alto porcentaje de las células transfectadas (Figura 4.21 A). Las intensidades de fluorescencia de estos complejos son también elevadas e incluso más altas que con la otra combinación de vectores (Figura 4.21 B). En los tres casos las interacciones se ven significativamente reducidas al delecionar el dominio BH3 de Bim y PUMA o al modificar un aminoácido clave de este dominio en la proteína Noxa. Comparando con los datos del otro conjunto de vectores, mostrados en la Figura 4.19, podemos ver un ligero aumento tanto del porcentaje como de la intensidad de fluorescencia de los complejos formados con las proteínas silvestres. Esto sugiere que la complementación de los fragmentos de la proteína Venus es más favorable con esta combinación de vectores. Resultados y Discusión 133 Figura 4.21 Análisis mediante citometría de flujo de la formación de complejos por BiFC entre Mcl-1 y las proteínas proapoptóticas Bim, PUMA y Noxa y sus respectivos mutantes de deleción o mutación puntual. Los resultados son media ± SD de tres experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. Por otro lado, como ya se ha indicado anteriormente, la técnica BiFC nos ha permitido analizar la localización de los complejos mediante microscopía confocal. En las fotografías mostradas en la Figura 4.22 se observa que la interacción de Bim con Mcl-1 ocurre en el citosol de células HeLa. Este dato estaría de acuerdo con otros trabajos que describen que Bim es una proteína que se localiza en el citoplasma de algunas células, pudiendo estar asociado a proteínas del citoesqueleto, y en membranas mitocondriales (Puthalakath et al. 1999; Zhu et al. 2004). Por otro lado, los complejos de PUMA con Mcl-1 muestran un patrón punteado que, al compararse con la tinción de mitocondrias con MitoTracker Red en la ampliación mostrada dentro de la fotografía, parece indicar que estas proteínas interaccionan en dichos orgánulos. De nuevo, este dato coincide con la localización mitocondrial de PUMA descrita anteriormente por otros autores (Nakano and Vousden 2001; Yee and Vousden 2008). Finalmente, los complejos formados por la interacción entre Mcl-1 y Noxa se localizan en el citosol con un patrón punteado, que colocaliza parcialmente con las B A Resultados y Discusión 134 mitocondrias, como se observa en la imagen superpuesta y ampliada, y que coincide con trabajos publicados anteriormente (Oda et al. 2000). Figura 4.22 Localización de los complejos Mcl-1/Bim, Mcl-1/PUMA y Mcl-1/Noxa. Imágenes de microscopía confocal representativas de diferentes planos donde se pueden observar los complejos formados por Mcl-1 con las diferentes parejas de proteínas indicadas. Escala, 50μm. A continuación se estudiaron las posibles interacciones entre Mcl-1 y las proteínas multidominio Bak y Bax. Los resultados de nuestros experimentos de BiFC sugieren que Mcl-1 sería capaz de unirse al menos a Bax (Figura 4.23). La unión de Mcl-1 a Bak se ha podido detectar en alrededor de un 20% de las células transfectadas, mientras que los complejos con Bax ocurren en el 50% de las células que se han transfectado (figura 4.23 A). El nivel de fluorescencia emitido por los complejos de Mcl1 con Bax también es mayor al de Bak (figura 4.23 B). Estos resultados indican que estas interacciones parecen tener menos importancia que las ocurridas entre Mcl-1 y las proteínas “sólo-BH3”, ya que se detectan en un porcentaje menor de células y con una intensidad de fluorescencia también más baja. Probablemente la dificultad de detección de estas interacciones mediante estudios de coinmunoprecipitación se deba Resultados y Discusión 135 a una baja incidencia de éstas y a que dichas interacciones no sean demasiado fuertes y puedan romperse en el propio proceso de obtención de los extractos celulares. Figura 4.23 Resultados del análisis de la formación de complejos por BiFC entre Mcl-1 y las proteínas proapoptóticas mutidominio Bak y Bax y sus respectivos mutantes de deleción mediante citometría de flujo. Los resultados son media ± SD de siete experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. Cabe destacar que la deleción del dominio BH3 de las proteínas proapoptóticas multidominio supone una reducción tanto del porcentaje de complejos formados como de la fluorescencia emitida por éstos. Estos mutantes de deleción del dominio BH3 se expresaron correctamente en las células, como se puede observar en la Figura 4.5 y 4.6, cuando se compara con las proteínas silvestres (Figura 4.3). La implicación del dominio BH3 de las proteínas Bak y Bax en su interacción con proteínas antiapoptóticas ha sido descrito por otros autores anteriormente (Kazi et al. 2010; Czabotar et al. 2011; Ku et al. 2011). No obstante, la disminución que se aprecia en la interacción de Mcl-1 con Bak al delecionar el dominio BH3 de la segunda no es estadísticamente significativa, probablemente debido a la poca relevancia de esta interacción. Otros mutantes que se han estudiado son los que presentan una deleción de la primera hélice α de Bak y Bax (ΔH1α). Curiosamente, se observa una disminución de las interacciones tanto a nivel de porcentaje de células como de B A Resultados y Discusión 136 fluorescencia de los complejos, más evidente en el caso de Bax. Los niveles de expresión de estos mutantes no se ven reducidos (Figura 4.5 y 4.6), por lo que podríamos descartar que la ausencia de interacción fuera consecuencia de una baja expresión en las células. Una posible explicación a la disminución observada con estos mutantes podría ser la existencia de diferentes zonas de interacción con las proteínas antiapoptóticas, tal y como se describe detalladamente en el apartado 4.2.3. Las interacciones de Mcl-1 con Bak y Bax detectadas con el segundo conjunto vectores muestran unos datos muy similares a los obtenidos con los vectores iniciales (Figura 4.23). Mcl-1 es capaz de interaccionar con Bak y Bax (Figura 4.24) aunque de nuevo con unos porcentajes y niveles de fluorescencia más bajos que con Bim, PUMA o Noxa (Figura 2.21). La única diferencia notable respecto al primer conjunto de proteínas de fusión es que en este caso la deleción del dominio BH3 de Bak, pero no así el de Bax, reduce significativamente la interacción con Mcl-1, coincidiendo con datos de otros autores (Cuconati et al. 2003; Willis et al. 2005). Figura 4.24 Resultados del análisis de la formación de complejos por BiFC entre Mcl-1 y las proteínas proapoptóticas mutidominio Bak y Bax y sus respectivos mutantes de deleción mediante citometría de flujo. Los resultados son media ± SD de tres experimentos independientes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001. B A Bibliografía 239 Acehan, D., Jiang, X., Morgan, D.G., Heuser, J.E., Wang, X., and Akey, C.W. 2002. Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell 9(2): 423-432. Adams, J.M. 2003. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev 17(20): 2481-2495. Adams, J.M. and Cory, S. 2007. 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