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2013 13 Andrés González Rodríguez Nuevas funciones de las proteínas Fur en cianobacterias: Contribución a la definición del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120 Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Fillat Castejón, María Francisca Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Andrés González Rodríguez NUEVAS FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS FUR EN CIANOBACTERIAS: CONTRIBUCIÓN A LA DEFINICIÓN DEL REGULÓN FURA EN ANABAENA SP. PCC 7120 Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Fillat Castejón, María Francisca Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular TESIS DOCTORAL Nuevas funciones de las proteínas Fur en cianobacterias: contribución a la definición del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120 Memoria presentada por: Andrés González Rodríguez Licenciado en Biología, para optar por el Grado de Doctor en Ciencias por la Universidad de Zaragoza Diciembre, 2012 Dª. MARÍA FRANCISCA FILLAT CASTEJÓN, Catedrática del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral “Nuevas funciones de las proteínas Fur en cianobacterias: contribución a la definición del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120”, presentada por el Licenciado D. ANDRÉS GONZÁLEZ RODRÍGUEZ, ha sido realizada bajo su dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, que la misma se corresponde con el proyecto de Tesis aprobado con el mismo nombre, y que reúne los requisitos para ser presentada por su autor para optar por el Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza. Para que así conste, se firma la presente en Zaragoza, 3 de diciembre de 2012. Fdo.: María F. Fillat Castejón A mis padres Estructura de la Tesis Estructura de la Tesis La presente memoria de tesis consta de Resumen, Introducción, Objetivos, cuatro Capítulos que conforman el cuerpo principal de la tesis, un apartado de Discusión General, Conclusiones y Referencias. El Resumen refleja de forma concisa los antecedentes y objetivos del trabajo, la metodología empleada, los resultados obtenidos y las conclusiones generales. La Introducción describe a las cianobacterias como grupo microbiano objeto de estudio, abarcando aspectos generales como sus características morfológicas y fisiológicas, clasificación taxonómica, impacto ecológico y metodologías más empleadas para su manipulación genética. Además, se hace especial referencia a algunos aspectos de la fisiología de este grupo de microorganismos que resultarán de interés para la comprensión de los objetivos y resultados obtenidos en este trabajo, tales como la diferenciación celular a heterocistos o el esencial equilibrio entre la homeostasis del hierro y el estrés oxidativo en cianobacterias. En la introducción se expone una amplia revisión sobre los mecanismos moleculares que regulan la homeostasis del hierro en procariotas, describiendo detalladamente el estado del arte en lo concerniente a la familia de reguladores transcripcionales Fur (ferric upake regulator) y los estudios previos realizados con la proteína FurA de Anabaena sp. PCC 7120. Tras la introducción se indican los Objetivos propuestos, teniendo en cuenta los antecedentes previamente descritos. La metodología empleada para desarrollar los objetivos propuestos y los resultados obtenidos se encuentran reflejados en cuatro Capítulos, cada uno de los cuales presenta la estructura típica de un artículo científico. Los capítulos están redactados en inglés y reproducen el texto íntegro de artículos publicados, en prensa, o manuscritos en fase de revisión. En algunos casos se han introducido pequeñas modificaciones al formato original 13 Estructura de la Tesis 14 del artículo o manuscrito, a fin de garantizar una homogeneidad de formato para todos los capítulos. En cada uno de los capítulos se discuten los resultados obtenidos y sus implicaciones. En el apartado Discusión General se analizan los resultados íntegramente y se discuten aspectos de interés no tratados en detalle en las discusiones de los capítulos. Por último se indican las Conclusiones del trabajo de Tesis y se reflejan las Referencias bibliográficas utilizadas en toda la memoria en su conjunto. Para una mejor comprensión del trabajo, en los apartados Resumen y Discusión General, los resultados reflejados en el capítulo 4 son referenciados como (González et al., In revision). Abreviaturas Abreviaturas -RNA RNA antisentido DNA Ácido desoxirribonucleico DNasa I Desoxirribonucleasa I Dps DNA-binding protein in starved cells DTT Ditiotreitol DtxR Diphteria toxin repressor EDTA Ácido etilén-diamino-tetraácetico EMSA Electrophoretic mobility shift assay (Ensayo de retardo en gel) Fur Ferric uptake regulator FURTA Fur titration assay Fe-SOD Superóxido dismutasa dependiente de hierro gfp Proteína fluorescente verde IMAC Immovilizad metal ion affinity chromatography Irr Iron response regulator (Fur family) kDa Kilodaltons Ma Millones de años Mn-SOD Superóxido dismutasa dependiente de manganeso MS Espectrometría de masas Mur Manganese uptake regulator (Fur family) Nur Nickel uptake regulator (Fur family) PCR Reacción en cadena de la polimerasa pb Pares de bases PerR Peroxide-stress response regulator (Fur family) 15 Abreviaturas 16 PS Fotosistema RNA Ácido ribonucleico RNAm RNA mensajero RNase Ribonucleasa ROS Reactive oxygen species rpm Revoluciones por minuto RT-PCR Reverse transcription-PCR SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment SOD Superóxido-dismutasa sqRT-PCR RT-PCR semicuantitativa TBDT Transportadores de membrana externa dependientes de TonB TCA Ácidos tricarboxílicos tsp Transcriptional start point (Sitio de inicio de la transcripción) Zur Zinc uptake regulator (Fur family) 2-DE Electroforesis bidimensional 2D-DIGE Electroforesis bidimensional diferencial 2-OG 2-oxoglutarato Resumen RESUMEN Las proteínas Fur (ferric uptake regulator) actúan como reguladores globales de la transcripción en procariotas. Con un mecanismo clásico de represión transcripcional, estas proteínas regulan la expresión de los genes implicados en la incorporación y transporte de hierro en dependencia de la disponibilidad de este micronutriente. En situación de abundancia de Fe2+ intracelular, el ión metálico actúa como correpresor y se une al metalorregulador promoviendo en éste un cambio conformacional que incrementa su afinidad por secuencias específicas dentro de los promotores diana denominadas cajas Fur o “iron boxes”. La unión del complejo Fur-Fe2+ bloquea la unión de la RNA polimerasa inhibiendo la transcripción. De forma inversa, en situación de déficit de hierro el metal correpresor se libera del represor, la proteína Fur pierde afinidad por el DNA y se separa del promotor diana permitiendo la transcripción (Escolar et al., 1999). Numerosos estudios demuestran que las proteínas Fur modulan no sólo la expresión de los genes implicados en el metabolismo del hierro, sino además la de una gran variedad de genes y operones pertenecientes a procesos celulares tan diversos como la defensa frente al estrés oxidativo, la expresión de factores de virulencia, la motilidad y quimiotaxis, el metabolismo energético, el metabolismo intermediario o la defensa frente a estrés ácido, entre otras. Asimismo, en los últimos años han sido presentadas evidencias de regulación génica mediada por Fur que se alejan del mecanismo clásico de represión transcripcional, sugiriendo la activación directa o indirecta dependiente de hierro (Delany et al., 2004; Masse & Gottesman, 2002; Mellin et al., 2007) y en algunos casos la modulación transcripcional en ausencia del metal correpresor (Butcher et al., 2012; Delany et al., 2001). Esta variedad en los mecanismos de regulación, unida a la posible modulación de la expresión de otros reguladores transcripcionales (López-Gomollón et al., 2007a; Teixido et al., 2010), confiere a los regulones Fur una notable complejidad. 17 Resumen Los estudios funcionales de proteínas Fur en cianobacterias son escasos y limitados. Este grupo microbiano ampliamente distribuido en nuestro planeta ostenta características únicas entre los organismos procariotas, como la fotosíntesis oxigénica o la capacidad de diferenciación celular, la multicelularidad y la fijación diazotrófica del nitrógeno atmosférico (Flores & Herrero, 2008). Tanto la fotosíntesis oxigénica como la fijación del nitrógeno son procesos altamente sensibles a la disponibilidad de hierro, dados los altos requerimientos de este micronutriente como cofactor de proteínas transportadoras y enzimas esenciales. Por otro lado, las cianobacterias se encuentran más expuestas al daño celular por estrés oxidativo dada la inherente producción de especies reactivas del oxígeno durante la fotosíntesis oxigénica (Latifi et al., 2009). En tal sentido, la regulación de la homeostasis del hierro resultará particularmente importante en este grupo microbiano a fin de asegurar un adecuado suministro de hierro para sus funciones vitales y minimizar al mismo tiempo la producción de radicales libres mediante las reacciones de Fenton. Dadas sus particularidades metabólicas, las proteínas Fur en cianobacterias pudieran estar implicadas en el control de funciones celulares no descritas con anterioridad en bacterias heterotróficas. En el presente trabajo de tesis nos propusimos avanzar en el conocimiento de la funciones de las proteínas Fur en cianobacterias mediante el estudio del regulón FurA de la cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120. FurA parece constituir una proteína esencial bajo las condiciones estándar de cultivo in vitro (Hernández et al., 2006b). Los intentos por obtener un mutante de deleción del gen furA han conducido sólo a la segregación parcial de la mutación en el genoma poliploide, un fenómeno previamente observado con otros homólogos Fur de cianobacterias (Ghassemian & Straus, 1996). Como herramienta de trabajo para el estudio del regulón construimos una estirpe de sobreexpresión de FurA en Anabaena sp. PCC 7120 (González 18 Resumen et al., 2010), empleando un vector lanzadera con orígenes de replicación en E. coli y Anabaena sp. que logró incrementar hasta ~32 veces el nivel de expresión del metalorregulador (González et al., In press). Una vez obtenida la estirpe de sobreexpresión, denominada Anabaena sp. AG2770FurA, se procedió a realizar un análisis fenotípico de la nueva cepa con el objetivo de identificar los posibles cambios morfológicos, fisiológicos y moleculares acontecidos en el microorganismo como consecuencia directa o indirecta de la sobreexpresión del regulador transcripcional. El análisis fenotípico incluyó la evaluación comparativa de la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación en medio BG11, la concentración de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, carotenoides, ficobiliproteínas) y proteínas totales en diferentes fases del crecimiento, así como el estudio por microscopía óptica y electrónica de la morfología celular, la integridad de los filamentos, la autofluorescencia y la ultraestructura de las células. Se evaluó asimismo la actividad fotosintética según la evolución de oxígeno mediante electrodo de Clark y se compararon además actividades enzimáticas tales como catalasa y superóxido-dismutasa, la producción de especies reactivas del oxígeno y la tolerancia a estrés oxidativo tras la exposición a una fuente exógena de peróxido de hidrógeno (González et al., 2010). Como parte del estudio fenotípico se realizó además un análisis proteómico comparativo entre la estirpe de sobreexpresión y la cepa isogénica parental crecidas bajos las mismas condiciones de cultivo (González et al., 2011). Sobre la base de los cambios fenotípicos observados se investigó el impacto de la sobreexpresión de FurA sobre la transcripción de una variedad de genes de interés mediante sqRT-PCR. Posteriormente, a fin de identificar los cambios en la expresión génica directamente mediados por FurA, se analizó mediante retardo en gel (EMSA) la afinidad in vitro de FurA recombinante a cada uno de los promotores de los genes evaluados previamente por sqRT-PCR. 19 Resumen La sobreexpresión del metalorregulador en Anabaena sp. indujo múltiples cambios fenotípicos en la cianobacteria como consecuencia de la variación en la expresión de una variedad de genes de categorías funcionales diversas, tanto dianas transcripcionales directas como otros genes. La combinación de estudios fenotípicos, análisis de la expresión génica/proteica y ensayos de afinidad in vitro del regulador condujeron a la identificación al menos 13 nuevas dianas transcripcionales directas, implicadas en procesos celulares tales como el metabolismo del hierro, las defensas frente el daño oxidativo, la fotosíntesis, la diferenciación a heterocistos, el metabolismo energético, la replicación del DNA, la morfología celular, entre otras (González et al., 2010; González et al., 2011). Los resultados demostraban el papel de FurA como regulador global de la transcripción en cianobacterias, de forma similar a lo observado con proteínas Fur de bacterias heterotróficas. Con el objetivo de profundizar en la función de FurA como regulador de la homeostasis del hierro, realizamos adicionalmente un estudio comparativo de la expresión génica de la estirpe de sobreexpresión en condiciones de suficiencia y deficiencia de hierro, prestando especial interés en varios mediadores del metabolismo de este micronutriente esencial en Anabaena sp. PCC 7120 (González et al., In press). Los resultados obtenidos demostraron el papel de FurA como regulador máster de la homeostasis del hierro en Anabaena sp., modulando la expresión de genes implicados en prácticamente cada etapa del metabolismo del hierro, incluyendo la adquisición, transporte, almacenamiento y consumo del hierro en la célula. Los resultados asociados a este experimento permitieron identificar por primera vez al regulador FurA como modulador transcripcional dual (represor y activador) de ruta de biosíntesis de tetrapirroles. La acción activadora de FurA sobre la transcripción los genes hemK (protoporfirinógeno-oxidasa) y hemH (ferroquelatasa) constituye el primer 20 Resumen ejemplo documentado de activación transcripcional directa de una proteína Fur en cianobacterias. La participación de FurA como modulador transcripcional en procesos celulares típicos de cianobacterias como la fotosíntesis oxigénica o la diferenciación celular constituyó un objetivo de especial interés en nuestra investigación. La sobreexpresión del metalorregulador bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado en el medio de cultivo condujo al bloqueo parcial del proceso de diferenciación a heterocistos en estadios tempranos del desarrollo (González et al., In revision). Estudios de afinidad in vitro mediante EMSA y footprinting demostraron que FurA reconoce y se une específicamente al promotor de ntcA, lo cual determinaba que la sobreexpresión del metalorregulador afectara sensiblemente el incremento transitorio de NtcA que tiene lugar en las primeras horas del desarrollo y que resulta esencial para la ulterior expresión de una variedad de genes implicados en la cascada regulatoria que define al proceso de diferenciación. Los resultados de nuestras investigaciones y de trabajos previos de nuestro grupo sugieren que la expresión de FurA en el heterocisto está ligada al desarrollo del mismo, es regulada por NtcA y su abundancia en cada momento influye directamente en el normal proceso de diferenciación. FurA parece funcionar como un modulador de la expresión de ntcA, que regula adecuadamente los niveles de NtcA en las diferentes fases de desarrollo del heterocisto y constituye un punto clave de conexión entre la homeostasis del hierro y el metabolismo del nitrógeno en cianobacterias. Con la identificación de un gran número de nuevas dianas directas de FurA durante el transcurso de esta tesis fue posible además, mediante análisis in silico de varias secuencias protegidas por FurA en ensayos de footprinting, la definición de una posible secuencia reguladora consenso de 23 pb (TGATAAAAATTCTCAATAAATAA), que gobierna potencialmente la unión del metalorregulador a sus promotores diana (González et al., In 21 Resumen 22 press). En esta secuencia consenso fueron reconocidos al menos tres motivos de unión a proteínas Fur de 8 pb en disposición “head-to-head-to-tail”. De modo general, los resultados del presente trabajo de tesis en su conjunto demuestran el papel de FurA como regulador global de la transcripción en cianobacterias, controlando mediante diferentes mecanismos de regulación no sólo la expresión de los genes implicados en el metabolismo del hierro, sino además la de una variedad de genes y operones implicados en múltiples funciones celulares, algunas de las cuales no descritas con anterioridad en bacterias heterotróficas. Los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al conocimiento del papel de las proteínas Fur en la fisiología de las cianobacterias. Introducción 1.3 Origen, evolución e impacto ecológico La vida en nuestro planeta se originó hace al menos 3500 millones de años (Ma) o incluso antes, durante el Eón Arcaico. Sin embargo, la capacidad bioquímica de utilizar el agua como fuente de electrones en la fotosíntesis evolucionó en un ancestro común de las cianobacterias actuales hacia finales del Arcaico, entre 3000 y 2700 Ma. Las primeras cianobacterias eran unicelulares, no fijaban nitrógeno y habitaban ambientes terrestres o de agua dulce; más tarde colonizaron océanos, aparecieron formas filamentosas y algunas estirpes evolucionaron hacia la fijación diazotrófica del nitrógeno atmosférico (Flores & Herrero, 2008). Tras la aparición de las primeras cianobacterias y su paulatina diversificación y proliferación a finales del Arcaico y principios del Proterozoico, el oxígeno producido por la fotosíntesis oxigénica comenzó a exceder los niveles de consumo de este gas que ocurría como consecuencia de procesos físicos, tales como la oxidación de especies químicas reducidas, predominantemente Fe2+ y gases volcánicos. La acumulación de oxígeno durante varios cientos de millones de años en la atmósfera y los océanos conllevó a una oxigenación permanente de la biosfera hacia el Proterozoico temprano (2450-2320 Ma). Sin embargo, los niveles de oxígeno de esta atmósfera primitiva permanecieron relativamente bajos (quizás el 10% de los niveles actuales) hasta finales del Proterozoico, cuando emergió otro grupo de organismos con fotosíntesis oxigénica, los eucariotas fotosintéticos, en cuyo origen las cianobacterias jugaron también un papel trascendental (Flores & Herrero, 2008). El origen de los eucariotas fotosintéticos se explica en la actualidad a través de la teoría endosimbiótica o endosimbiosis seriada, propuesta por Lynn Margulis en 1967, que describe tres procesos endosimbióticos sucesivos. En un primer proceso, una arqueobacteria se estableció como endosimbionte dentro de una bacteria anaerobia dando 29 Introducción lugar a un organismo unicelular con núcleo definido. En un proceso endosimbiótico posterior, una bacteria aerobia se establecería como endosimbionte dentro del nuevo organismo eucariótico aún anaerobio en lo que sería el origen de las actuales mitocondrias, dando lugar a una nueva célula eucariota más compleja, con la capacidad de metabolizar el oxígeno. Un tercer proceso endosimbiótico daría lugar al ancestro común de todos los eucariotas fotosintéticos actuales, cuando un eucarionte aerobio estableció simbiosis con una cianobacteria dando origen a los cloroplastos actuales (Keeling, 2010). Los primeros organismos eucarióticos fotosintéticos fueron las algas verdes, que proliferaron a finales del Proterozoico en todos los ambientes acuáticos, tanto en formas unicelulares como pluricelulares, dando lugar más tarde a un nuevo grupo de organismos fotosintéticos multicelulares, las plantas terrestres. El paso de una atmósfera anoxigénica reductora a una oxigénica, iniciado por las cianobacterias y posteriormente favorecido por los eucariotas fotosintéticos, supuso un profundo cambio medioambiental que condujo a la eventual extinción o reducción significativa de la poblaciones microbianas anaerobias estrictas que hasta el momento dominaban los ecosistemas terrestres, repercutiendo considerablemente en el incremento de la diversidad biológica y el surgimiento de organismos eucarióticos más complejos (Flores & Herrero, 2008; Holland, 2006). En la actualidad las cianobacterias constituyen una parte taxonómicamente diversa, productiva y biogeoquímicamente importante del fitoplancton de océanos, costas y estuarios, jugando un papel esencial en los ciclos del carbono y nitrógeno (Whitton & Potts, 2000). Las cianobacterias contribuyen a la producción primaria y el ciclo de los nutrientes mediante dos formas principales. En primer lugar, son importantes y muchas veces dominantes fijadores fotoautotróficos del CO2, contribuyendo significativamente a la producción primaria y ciclo del carbono. Aproximadamente la mitad del total de la 30 Introducción producción primaria en la Tierra ocurre en los océanos. Algunos géneros de cianobacterias unicelulares como Synechococcus, Prochlorococcus y Synechocystis son comunes y frecuentemente dominantes dentro de las comunidades de fitoplancton en aguas subsuperficiales, donde pueden representar hasta el 80% de la biomasa presente (Partensky et al., 1999; Ting et al., 2002; Whitton & Potts, 2000). La importancia de estas especies bacterianas como productores primarios en la cadena trófica se incrementa sustancialmente si tenemos en cuenta que habitan fundamentalmente en las grandes zonas oligotróficas de los océanos, caracterizadas por la carencia de nutrientes, aspecto limitante para el crecimiento de otros organismos. En segundo lugar, algunos géneros cianobacterianos pueden fijar el nitrógeno atmosférico y convertir el dinitrógeno molecular en amonio. De forma similar, este proceso es de particular relevancia en vastas regiones oceánicas caracterizadas por deficiencias de nitrógeno, donde el amonio producido por la fijación del nitrógeno atmosférico representa una fuente de nitrógeno que soporta al resto de la cadena trófica. La capacidad de fijación de nitrógeno permite a ciertas cianobacterias marinas integrantes del fitoplancton proliferar como densos blooms superficiales en aguas deficientes de nitrógeno en océanos, costas y estuarios (Whitton & Potts, 2000). Varios géneros diazotróficos de cianobacterias marinas aparecen usualmente formando asociaciones mutualistas o simbióticas con microalgas, macroalgas, protistas, plantas y animales. Estas relaciones mutuamente ventajosas para ambas especies son especialmente importantes en ambientes deficientes de nitrógeno. La distribución de las diferentes poblaciones de cianobacterias en los océanos es influenciada por una variedad de factores biológicos y ambientales, tales como la temperatura, la concentración de nutrientes e iones metálicos esenciales, la intensidad y calidad de la luz, la proporción superficie/volumen de la masa de agua, la mortalidad por cianofagos y predadores, entre otras (Behrenfeld & Kolber, 1999; Mann, 2003; Ting et al., 31 Introducción 2002; Whitton & Potts, 2000). En especial, la limitación del crecimiento de las cianobacterias en océanos y otros ambientes acuáticos debido a la baja biodisponibilidad del hierro constituye un aspecto particularmente relevante que abordaremos con mayor profundidad más adelante en este trabajo. El impacto ecológico de las cianobacterias en la naturaleza también se ve reflejado en las denominadas proliferaciones o blooms. El término “bloom” generalmente define un incremento muy significativo de la biomasa de una población microbiana en relación al promedio habitual de esta población en un ecosistema dado. De esta forma se describen en la literatura blooms de cianobacterias, de diatomeas, de dinoflagelados, etc (Qin et al., 2010; Vargas-Montero & Freer, 2004; Watkins et al., 2008). Cuando las condiciones ambientales son apropiadas, las cianobacterias pueden llegar a dominar la microbiota de ríos, lagos y reservorios de agua dulce. Sin embargo, el concepto de bloom de cianobacterias también es relativo; los límites legales de concentración celular que definen las proliferaciones de cianobacterias en aguas de consumo o recreacionales, >20000 células/ml (W.H.O., 2003), son bajos en comparación con los impresionantes blooms que bajo determinadas condiciones ambientales logran formarse en lagos y lagunas (Fig. I.2). La creciente eutrofización de ríos y lagos, debido principalmente al vertido de aguas residuales, detergentes, fertilizantes, entre otras sustancias; unido a condiciones ambientales favorables tales como temperaturas cálidas o templadas, alta intensidad de luz, pH neutro o básico y ausencia de vientos, son algunos de los factores asociados a las proliferaciones incontroladas de cianobacterias (Paerl, 2008; Paul, 2008). Varios estudios coinciden en destacar la relevancia de la eutrofización y la relación fósforo/nitrógeno en el desencadenamiento de proliferaciones de cianobacterias. El incremento de la relación P/N como resultado de la eutrofización a menudo conduce a un aumento significativo de las especies formadoras de blooms dentro del ecosistema (Havens et al., 2003; Paerl, 2008). 32 Introducción Las proliferaciones de mayor impacto ecológico son frecuentemente visibles a simple vista debido a la acumulación superficial de una gran concentración de biomasa procedente de cianobacterias flotantes o mótiles. Las cianobacterias formadoras de estos blooms incluyen tanto especies unicelulares como filamentosas, de tamaños diversos, fijadoras y no fijadoras de nitrógeno, que en muchos casos destacan por la presencia de vacuolas de gas que permiten su proliferación en la superficie. Dentro de las cianobacterias formadoras de blooms podemos encontrar géneros unicelulares como Microcystis y Gomphosphaeria, filamentosos no formadores de heterocistos como Lyngbya y Oscillatoria y filamentosos formadores de heterocistos como Anabaena, Nodularia, Cylindrospermopsis y Aphanizomenon (Havens, 2008; Whitton & Potts, 2000). Figura I.2. Proliferación o bloom de cianobacterias en la laguna “Estanca de Alcañiz”, provincia de Teruel (foto tomada en octubre de 2002 por miembros de nuestro laboratorio). 33 Introducción Las proliferaciones de cianobacterias tienen impactos visibles sobre el ecosistema como la disminución de la calidad del agua (sabor, olor, apariencia), la reducción de las plantas sumergidas debido a la disminución de la radiación solar que penetra en la columna líquida o el cambio de la comunidad de peces y otros miembros de la fauna acuática a causa de anoxia hipolimnética (Havens, 2008). Sin embargo, la capacidad de algunas especies formadoras de blooms de producir metabolitos secundarios altamente tóxicos para la vida silvestre, animales domésticos y el hombre, genéricamente conocidos como cianotoxinas, constituye en la actualidad uno de los aspectos más importantes desde el punto de vista económico y ecológico relacionado con este grupo microbiano. Las cianotoxinas pueden ocasionar la muerte de peces por daños en las branquias, tracto digestivo, hígado y otros órganos (Malbrouck & Kestemont, 2006; Marie et al., 2012). La ingestión directa de cianobacterias en la toma de agua o el consumo de animales acuáticos ocasiona efectos tóxicos y muerte en insectos, moluscos, crustáceos, aves y mamíferos, incluyendo el hombre (Funari & Testai, 2008; Giannuzzi et al., 2011; Stewart et al., 2008). Los efectos en animales superiores pueden incluir reacciones alérgicas, gastroenteritis, daños hepáticos, daños neurológicos, ataxia, fallo respiratorio y muerte. Existe una variedad de especies productoras y tipos de cianotoxinas. Las cianotoxinas pueden ser clasificadas en función de su estructura química como péptidos cíclicos (microcistina y nodularina), alcaloides [anatoxina-a, anatoxina-a(s), saxitoxina, cilindrospermopsina, aplisiatoxina, lingbiatoxina-a] y lipopolisacáridos, o ser clasificadas en función de su toxicidad (dermatotoxinas, hepatotoxinas y neurotoxinas) (Carmichael, 1994; van Apeldoorn et al., 2007). 34 Introducción 1.4 Diferenciación celular y metabolismo del nitrógeno Varias estirpes de cianobacterias, tanto unicelulares como filamentosas, son capaces de crecer diazotróficamente fijando el nitrógeno atmosférico en ausencia de fuentes de nitrógeno combinado como amonio, nitratos, nitritos o urea (Herrero et al., 2001). Dado que el complejo enzimático responsable de la reducción del dinitrógeno molecular hasta amonio, la nitrogenasa, es extremadamente sensible al oxígeno, las cianobacterias han desarrollado diferentes estrategias de protección de la nitrogenasa tanto del oxígeno atmosférico como de aquel producido intracelularmente resultado de la fotosíntesis oxigénica. Estas estrategias están basadas en dos principios fundamentales: la separación temporal de la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno en una misma célula según el reloj biológico circadiano, o la separación espacial de los dos procesos incompatibles mediante la multicelularidad y la diferenciación celular. (Berman-Frank et al., 2003). De esta forma, algunas cianobacterias diazotróficas como la unicelular Cyanothece sp. realizan la fotosíntesis y almacenan glucógeno durante las horas de luz, para luego fijar nitrógeno durante la noche (Toepel et al., 2008). Por su parte la cianobacteria filamentosa no formadora de heterocistos Trichodesmium sp. disminuye la actividad fotosintética en ciertas células especializadas denominadas diazocitos; la fijación de nitrógeno en estas células es máxima incluso durante el día (Sandh et al., 2012). No obstante, una gran variedad de estirpes filamentosas desarrollan células diferenciadas denominadas heterocistos, las cuales han perdido la capacidad de realizar la fotosíntesis y están completamente especializadas en la fijación de nitrógeno (Kumar et al., 2010). Los heterocistos aseguran un ambiente prácticamente anóxico en su interior debido al engrosamiento de la pared celular por la incorporación de dos capas adicionales, una de polisacáridos y otra de glicolípidos. La capa de glicolípidos reduce la permeabilidad al oxígeno, mientras la capa de polisacáridos, más externa, engrosa y aumenta la rigidez de la 35 Introducción envoltura celular protegiéndola de daños físicos (Nicolaisen et al., 2009). Los heterocistos asimismo incrementan su tasa de respiración aerobia para consumir las pocas moléculas de oxígeno que logran atravesar la pared celular, a la vez que degradan las ficobiliproteínas y desmantelan el PSII a fin de eliminar completamente la producción de oxígeno como consecuencia de la fotosíntesis (Kumar et al., 2010). De esta forma, tras la diferenciación a heterocistos la cianobacteria multicelular dispone de dos tipos celulares mutuamente interdependientes: las células vegetativas, que proveen al heterocisto de compuestos carbonados y poder reductor, y los heterocistos, que exportan compuestos nitrogenados en forma de aminoácidos hacia las células vegetativas (Flores & Herrero, 2010). Los heterocistos se diferencian siguiendo un típico patrón de espaciamiento a lo largo del filamento. En el caso de la cianobacteria filamentosa diazotrófica Anabaena sp. PCC 7120, tras la ausencia de nitrógeno combinado se formará un heterocisto por cada 10-12 células vegetativas como promedio. Tanto el proceso de diferenciación en si mismo, como el patrón de formación de los heterocistos a lo largo del filamento estarán determinados por la acción coordinada de una variedad de señales internas y externas ligadas al desarrollo del heterocisto, incluyendo la acción de múltiples factores transcripcionales, enzimas, metabolitos, proteínas de membrana, así como varios reguladores positivos y negativos cuyo mecanismo de acción en muchos casos aún se desconoce (Flores & Herrero, 2010; Kumar et al., 2010; Zhang et al., 2006). En Anabaena sp. PCC 7120, los heterocistos completamente diferenciados se logran apreciar usualmente tras 24 horas de la eliminación de la fuente de nitrógeno combinado, aunque este tiempo puede variar con las condiciones de cultivo empleadas en cada laboratorio. Los heterocistos son usualmente distinguibles de las células vegetativas por su tamaño ligeramente mayor, forma algo más redondeada, pared celular engrosada por la deposición de polisacáridos y glicolípidos, disminución de la pigmentación y pérdida de 36 Introducción autofluorescencia por la degradación de los ficobilisomas, así como la presencia de gránulos de cianoficina en los polos adyacentes a las células vegetativas (Fig. I.3). Los profundos cambios morfológicos y fisiológicos que sufre una célula vegetativa durante la diferenciación a heterocisto son el resultado de una gran variación en la expresión génica, que implica la inducción de unos genes, el silenciamiento de otros, e incluso la escisión y reordenamiento de algunas secuencias génicas en los cromosomas del futuro heterocisto (Ehira & Ohmori, 2006b; Flaherty et al., 2011; Kumar et al., 2010; Mitschke et al., 2011). Estudios de microarrays evaluando las diferencias en los patrones transcripcionales tras 3, 8 y 24 horas de la eliminación del nitrógeno combinado indican que al menos 495 genes aumentan significativamente su expresión y 196 genes disminuyen su expresión en Anabaena durante el proceso de diferenciación a heterocistos (Ehira & Ohmori, 2006b). Sin embargo, la inducción o represión de la mayoría estos genes no ocurre al unísono, los cambios transcripcionales van ligados al desarrollo del heterocisto, lo cual determina que la síntesis y acción de determinado regulador o producto génico ocurra en determinado momento del desarrollo, y muchas veces su efecto es sólo transitorio, llegando a ser inaparente o nulo en otro estadio de la diferenciación (Kumar et al., 2010). La presencia de una fuente de nitrógeno combinado inhibe la diferenciación a heterocistos; de hecho, el proceso de diferenciación una vez iniciado es reversible si se adiciona una fuente de nitrógeno combinado al medio de cultivo dentro de las 9-12 horas después de inducida la deficiencia de nitrógeno, pasado este tiempo las células invariablemente culminarán la diferenciación (Kumar et al., 2010). El proceso de diferenciación a heterocistos se inicia con una señal metabólica de deficiencia de nitrógeno combinado en el medio, la acumulación de un intermediario del ciclo de Krebs: 2-oxoglutarato (2-OG) (Muro-Pastor et al., 2001). 37 Introducción Figura I.3. La diferenciación a heterocistos en estirpes de cianobacterias filamentosas define dos tipos celulares mutuamente interdependientes. (A) Los heterocistos maduros son usualmente distinguibles de las células vegetativas por su mayor tamaño, pared celular engrosada, pérdida de la pigmentación y presencia de típicos gránulos de cianoficina en los polos adyacentes a las células vegetativas. (B) Los heterocistos se diferencian siguiendo un típico patrón de espaciamiento. En la imagen, heterocistos de Anabaena sp. PCC 7120 teñidos con azul de Alcian. (C) Tras la degradación de los ficobilisomas, los heterocistos pierden la capacidad de autofluorescencia que caracteriza a las células vegetativas debido a los pigmentos fotosintéticos. (D) Las células vegetativas proveen al heterocisto de compuestos carbonados y potencial reductor, mientras los heterocistos proveen al resto del filamento de compuestos nitrogenados (Golden & Yoon, 2003). CO2 Carbohidratos CO2 Carbohidratos NH3 N2 A B C D 38 Introducción reordenamientos génicos ligados al desarrollo del heterocisto, que ocurren en los estadios finales de la diferenciación e involucran los dos operones nif antes mencionados y un tercer operón, el hupSL, que codifica para una hidrogenasa específica de heterocistos que recupera poder reductor desde el H2 producido por la nitrogenasa (Carrasco et al., 1995; Carrasco & Golden, 1995). Estos reordenamientos se producen como resultado de recombinaciones sitio-específicas entre secuencias repetitivas que flanquean los elementos que serán eliminados. Un primer reordenamiento escinde un fragmento de 11 kilobases (kb) del gen nifD, mediado por la recombinasa XisA, cuyo gen se encuentra localizado dentro del fragmento escindido (Henson et al., 2008). Un segundo reordenamiento escinde un fragmento de 55 kb del gen fdxN, mediado por la recombinasa XisF y los productos génicos de xisH y xisI (Carrasco et al., 1994; Ramaswamy et al., 1997). El tercer y último reordenamiento programado ocurre en el gen hupL, escinde un fragmento de 10,5 kb y es mediado por la recombinasa XisC (Carrasco et al., 1995; Carrasco et al., 2005). Los tres reordenamientos ocurren en estadios finales de la diferenciación del heterocisto y son esenciales para la expresión de los genes donde se encuentran: nifD, fdxN y hupL (Kumar et al., 2010). 1.5 Paradoja del hierro: estrés férrico frente a estrés oxidativo El paso de una atmósfera reductora a una atmósfera oxidante hace ~2300 Ma, debido a la proliferación de las cianobacterias y la ulterior evolución de los eucariotas fotosintéticos, tuvo un enorme impacto ecológico cuyas consecuencias continúan moldeando la biodiversidad de cada uno de los ecosistemas que existen actualmente en nuestro planeta. La acumulación de oxígeno en la atmósfera como resultado de la fotosíntesis permitió la evolución de los organismos aerobios y el uso metabólico de este elemento como aceptor de electrones; sin embargo, las especies reactivas del oxígeno (ROS) que invariablemente 45 Introducción se generaban como resultado de la reducción del oxígeno molecular durante la respiración aerobia o por su energización durante la fotosíntesis tenían efectos nocivos sobre biomoléculas y redes metabólicas originalmente evolucionadas bajo el ambiente anóxico de la Tierra primitiva (Imlay, 2003). Por otro lado, el oxígeno atmosférico producía la oxidación y precipitación de iones metálicos como el hierro, dando lugar a una muy baja biodisponibilidad de este micronutriente esencial aún cuando su concentración en la corteza terrestre era elevada. La forma ferrosa Fe2+, inicialmente predominante bajo una atmósfera anoxigénica y con una relativamente alta solubilidad (0,1 M a pH 7), pasó mayormente al estado férrico extremadamente insoluble (10-18 M a pH 7) (Andrews et al., 2003). De esta forma, la atmósfera oxigénica impuso dos presiones evolutivas a los organismos vivos cuyos resultados son hoy evidentes en la mayoría de los grupos microbianos: (1) el desarrollo de estrategias de autodefensa frente al daño potencial de las ROS generadas por su propio metabolismo y (2) la generación de mecanismos que contribuyeran a mejorar la biodisponibilidad del hierro. El hierro es un elemento de transición que puede adoptar dos estados redox estables fácilmente intercambiables, la forma ferrosa Fe2+ y la forma férrica Fe3+. A su vez, cada uno de estos estados redox puede adoptar diferentes estados de espín, dependiendo del entorno de su ligando. Esta alta flexibilidad físico-química unida a su gran abundancia como componente de la corteza terrestre hicieron del hierro la elección evolutiva ideal para su incorporación como grupo prostético extremadamente versátil en las proteínas, ya sea como transportador de electrones y mediador redox o como centro catalítico (Andrews et al., 2003). Hoy en día el hierro constituye un elemento esencial para el crecimiento y desarrollo de prácticamente la totalidad de los organismos vivos, actuando como cofactor en una variedad de procesos celulares incluyendo la fotosíntesis, respiración, fijación del 46 Introducción nitrógeno, síntesis de ácidos nucleicos, ciclo TCA, defensa frente estrés oxidativo, entre otros. En organismos fotosintéticos como las cianobacterias, el hierro resulta particularmente necesario como componente esencial de cada complejo proteico de membrana y de algunas proteínas solubles que conforma la cadena transportadora de electrones de la fotosíntesis (Ferreira & Strauss, 1994). Sólo para una unidad funcional del aparato fotosintético en cianobacterias se requieren entre 22 y 23 átomos de hierro como mínimo: 3 átomos de hierro en el PSII, 5 átomos de hierro en el complejo citocromo b6/f, 12 átomos de hierro en el PSI y 2 átomos en el centro Fe-S de la ferredoxina, mientras 1 átomo adicional será requerido si se emplea el citocromo c-553 en lugar de plastocianina (Zhang et al., 1992). El alto contenido en hierro del aparato fotosintético determina que los requerimientos de este micronutriente en cianobacterias excedan con creces aquellos de bacterias heterotróficas; en Synechocystis sp. PCC 6803, el contenido de hierro celular (106 átomos/célula) excede en 1 orden de magnitud al de una bacteria no fotosintética de tamaño similar como Escherichia coli (Keren et al., 2004). La baja biodisponibilidad del hierro en presencia de oxígeno y a pH neutro determina que muchos de los nichos ecológicos ocupados en la actualidad por microorganismos fotosintéticos como las cianobacterias presenten concentraciones tan bajas de este micronutriente esencial, que limitan el crecimiento de los productores primarios (Geider & La Roche, 1994; Morel & Price, 2003). En vastas regiones oceánicas la concentración de hierro se encuentra por debajo de 1 nM, limitando la producción primaria, la acumulación de biomasa y la estructura del ecosistema en regiones de mar abierto del Pacífico ecuatorial, el Pacífico subártico y el océano Glacial Antártico, e incluso en algunas zonas costeras (Street & Paytan, 2005). 47 Introducción La baja disponibilidad de hierro en los océanos limita igualmente la fijación de nitrógeno por cianobacterias diazotróficas (Kupper et al., 2008; Shi et al., 2007). La diazotrofía impone una demanda adicional de hierro, más allá de la necesaria para la fotosíntesis y la respiración, dado que el complejo enzimático de la nitrogenasa contiene hasta 36 átomos de hierro por enzima. De esta forma, los patrones de distribución de la fijación de nitrógeno oceánica se ven usualmente influenciados por la disponibilidad de hierro, muchas veces de forma intermitente debido al enriquecimiento casual por las deposiciones de polvo provenientes, por ejemplo, del desierto del Sahara (Mills et al., 2004; Sohm et al., 2011). La deficiencia de hierro ocasiona una variedad de cambios morfológicos y fisiológicos en las cianobacterias, siendo quizás la pérdida de la pigmentación celular (clorosis) producto de la degradación de los ficobilisomas, la reducción del número de tilacoides y la disminución del contenido de ficocianinas y clorofila el cambio más evidente (Guikema & Sherman, 1983; Sherman & Sherman, 1983). Ante un estrés férrico, las cianobacterias reemplazan las proteínas que contienen hierro como cofactor por otras que desempeñen igual función y no requieren hierro, como la ferredoxina por flavodoxina (IsiB) (Razquin et al., 1994), cambian los patrones de absorción y fluorescencia (Ferreira & Strauss, 1994; Guikema & Sherman, 1983), el crecimiento se ralentiza y las células aparecen algo más pequeñas (Narayan et al., 2011; Sherman & Sherman, 1983; Wilhelm, 1995) y se produce estrés oxidativo (Latifi et al., 2005). Como señal inequívoca de deficiencia de hierro se induce la expresión de IsiA (conocida también como CP43´), una proteína análoga a la proteína de unión a clorofila CP43 del PSII, la cual se asocia al PSI formando un supercomplejo de tres PSsI rodeados por un anillo de 18 moléculas de CP43´ capaces de unir hasta 180 moléculas de clorofila (Boekema et al., 2001). La formación de estos supercomplejos incrementa la capacidad de captación de la luz del PSI y parece constituir 48 Introducción una estrategia de compensación ante la pérdida de los ficobilisomas con la deficiencia de hierro (Bibby et al., 2001). El anillo de CP43´ parece actuar además como disipador no radiactivo de energía, protegiendo al PSII de una excitación excesiva bajo condiciones de deficiencia de hierro, evitando la fotoinhibición (Park et al., 1999; Sandstrom et al., 2001). La limitación de hierro induce además la expresión de otros mecanismos adaptativos en cianobacterias como las proteínas IdiA, IdiB e IdiC descritas en Synechococcus (Michel et al., 1996; Nodop et al., 2008; Pietsch et al., 2007) o el operón sufBCDS (Wang et al., 2004); no obstante, los cambios transcripcionales en respuesta a un déficit de hierro en el ambiente llegan a abarcar hasta 781 genes en Synechocystis sp. PCC 6803 (Singh et al., 2003). Paradójicamente, el hierro es esencial para el crecimiento pero resulta altamente tóxico si no se controlan los niveles de hierro intracelular, dada su tendencia a catalizar la formación de ROS mediante la reacción de Fenton y generar estrés oxidativo (Imlay, 2003; Repine et al., 1981). La presencia de 1 mM de FeSO4 en el medio de cultivo es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de Anabaena sp. (Lammers & Sanders-Loehr, 1982). De esta forma, aunque resulte importante para la bacteria desarrollar mecanismos que aseguren el suministro de hierro para sus funciones vitales, resultará igualmente importante asegurar que el contenido de hierro intracelular sea mantenido por debajo de niveles tóxicos, por lo que toda la maquinaria de incorporación, transporte y almacenamiento de hierro se encuentra estrictamente regulada en función de la disponibilidad de hierro y su empleo por la célula. La regulación de la homeostasis del hierro en bacterias ocurre típicamente a nivel transcripcional, mediado por proteínas reguladoras que modulan la expresión de los genes del metabolismo del hierro en dependencia de la disponibilidad de este micronutriente (Andrews et al., 2003). La descripción y los mecanismos de acción de estos reguladores 49 Introducción transcripcionales en bacterias y en especial en cianobacterias serán abordados en detalle más adelante. Al ser organismos fotoautotróficos, las cianobacterias se encuentran más expuestas al daño oxidativo que las bacterias heterotróficas, debido a la inherente producción de ROS que ocurre durante la fotosíntesis (Imlay, 2003; Latifi et al., 2009). Las ROS, que incluyen al oxígeno singlete (1O2), el anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH·), constituyen poderosos agentes oxidantes que reaccionan con gran número de biomoléculas como proteínas, lípidos, pigmentos y ácidos nucleicos, afectando estructuras celulares, inactivando funciones enzimáticas e inhibiendo procesos metabólicos vitales. Como en el resto de los organismos aerobios, las cianobacterias generan O2y H2O2 durante la respiración aerobia debido principalmente a la autooxidación de flavoenzimas que participan en la cadena transportadora de electrones (Imlay, 2003). Adicionalmente, durante la fotosíntesis la clorofila en estado excitado puede transferir energía al oxígeno originando 1O2, una reacción que ocurre espontáneamente ante la abundancia de clorofila excitada y será proporcional a la intensidad de luz, llegando a inactivar el PSII en un fenómeno conocido como fotoinhibición (Aro et al., 1993; Ohnishi et al., 2005). Por otro lado, si la intensidad de luz sobrepasa las capacidades normales de flujo electrónico durante la fotosíntesis, se producirá un fenómeno conocido como reacción de Mehler, en la cual el oxígeno es utilizado como aceptor de electrones en lugar de la ferredoxina, generando O2como producto primario (Latifi et al., 2009). Las cianobacterias han desarrollado diferentes estrategias de defensa frente al estrés oxidativo, encaminadas a prevenir la producción de ROS o a neutralizar estas especies una vez producidas. La producción de compuestos antioxidantes no enzimáticos como carotenoides y -tocoferol (Latifi et al., 2009), la síntesis de enzimas detoxificantes como catalasas (Banerjee et al., 2012a; Bernroitner et al., 2009), peroxidasas (Banerjee et al., 50 Introducción 2012b; Cha et al., 2007; Hong et al., 2008; Latifi et al., 2007; Ogola et al., 2009) y superóxido-dismutasas (Eitinger, 2004; Li et al., 2002b), la síntesis de proteínas de unión al DNA (proteínas Dps) con actividad ferroxidasa dependiente de H2O2 (Franceschini et al., 2006; Hernández et al., 2007; Peña & Bullerjahn, 1995), así como diferentes mecanismos de disipación de energía y protección del aparato fotosintético frente a altas intensidades de luz (Havaux et al., 2005; He et al., 2001; Kirilovsky, 2007; Latifi et al., 2009) son algunas de las estrategias que conforman el arsenal de defensas de las cianobacterias frente al daño oxidativo. 1.6 Manipulación genética, genómica y postgenómica Desde la segunda mitad del siglo pasado, las cianobacterias han sido utilizadas como modelos para el estudio de numerosos procesos fisiológicos, tales como la fotosíntesis y su control genético, la fotorregulación de la expresión génica, la diferenciación celular y la fijación de nitrógeno, el metabolismo del nitrógeno, del carbono y del hidrógeno, la resistencia a estreses ambientales diversos y la evolución molecular, entre otros (Koksharova & Wolk, 2002a). Asimismo, las cianobacterias han sido empleadas con éxito para fines biotecnológicos incluyendo la producción de productos específicos como pigmentos, la biodegradación de contaminantes orgánicos de aguas superficiales y el control de plagas de insectos, entre otros propósitos (Abed et al., 2009). En los últimos años, las potencialidades de estos microorganismos han aumentado considerablemente con la disponibilidad de sus secuencias genómicas y el desarrollo de herramientas para su manipulación genética. Uno de los puntos críticos en la manipulación genética de las cianobacterias ha sido la transferencia génica (Koksharova & Wolk, 2002a). La transferencia de genes en bacterias puede realizarse por transformación, transducción y conjugación. La electroporación ha 51 Introducción sido utilizada en diversas cianobacterias, tanto unicelulares como filamentosas, pero su eficiencia de transformación puede ser baja y poco reproducible (Moser et al., 1993; Muhlenhoff & Chauvat, 1996; Thiel & Poo, 1989). A pesar de intensos estudios con varios cianofagos, incluyendo cepas lisogénicas, la transducción no ha sido posible en cianobacterias debido a la no existencia hasta la fecha de vectores virales capaces de transducir a estos microorganismos (Koksharova & Wolk, 2002a). La conjugación ha sido y continúa siendo el método más utilizado para la transferencia génica en cianobacterias (Koksharova & Wolk, 2002a; Vioque, 2007). Las cianobacterias presentan una estructura y composición de pared típica de Gram-negativos, siendo posible la transferencia de DNA plasmídico por conjugación desde otras bacterias como Escherichia coli. La familia de plásmidos RP4, perteneciente al grupo de incompatibilidad P (Thomas & Smith, 1987), agrupa plásmidos conjugativos que pueden mediar la transferencia de otros vectores plasmídicos corresidentes entre un amplio rango de bacterias Gram-negativas, incluyendo las cianobacterias (Wolk et al., 1984). Un vector plasmídico podrá ser movilizable por estos plásmidos conjugativos si contiene (o se le incluye) una región conocida como “origen de transferencia” (oriT) o “base de movilización” (bom), así como el gen mob, cuyo producto génico reconoce específicamente la región oriT (Willetts & Wilkins, 1984). Una variedad de vectores plasmídicos ampliamente utilizados en ingeniería genética como el pBR322 conservan la región oriT o sitio bom de su plásmido parental, pero sin embargo han perdido el gen mob; estos vectores podrán ser transferidos sólo si el producto de este gen es proporcionado en trans por otro vector, conocido como plásmido ayudante. De esta forma en la conjugación participarán tres vectores plasmídicos: el plásmido conjugativo (usualmente derivados de RP4), el plásmido de carga (contiene el sitio oriT y el DNA de interés a ser transferido) y el plásmido ayudante (contiene el gen mob y otros genes de interés, Ej: DNA metilasas). 52 Introducción En el proceso participarán tres cepas bacterianas: una cepa de E. coli conteniendo el plásmido conjugativo, una segunda cepa de E. coli conteniendo los plásmidos de carga y ayudante, y la cepa de cianobacteria que recibirá el DNA, por tal motivo la conjugación en cianobacterias también se conoce como apareamiento triparental (Elhai & Wolk, 1988). La construcción de plásmidos de carga con orígenes de replicación tanto para E. coli como para cianobacterias (Ej: origen del plásmido pDU1 de Nostoc 7524) ha permitido la obtención de vectores replicativos o shuttle vectors, capaces de transferirse por conjugación y autorreplicarse en cianobacterias (Wolk et al., 1984). De no contar con esta capacidad de autorreplicación, el vector transferido podrá integrarse al cromosoma bacteriano por recombinación homóloga, si se hubieran incorporado suficientes regiones de homología. El uso de vectores replicativos o de vectores integrativos estará en dependencia de los fines experimentales de la transformación. Los vectores integrativos carecen de origen de replicación en el hospedador, pero cuentan con amplias zonas de homología (cientos de pares de bases) que permiten eventos de recombinación homóloga entre el vector y el cromosoma bacteriano. La recombinación tendrá como consecuencia la integración total de vector en el cromosoma o la sustitución de la región homóloga en el cromosoma por la que contiene el vector, lo cual estará en dependencia de la ocurrencia de simples o dobles entrecruzamientos o crossing-overs; este último evento resultará de especial interés durante la generación de mutantes de deleción o knock out (Hernández et al., 2006b). Sin embargo, dependiendo de la cepa de cianobacteria, la doble recombinación puede resultar un fenómeno poco frecuente, para lo cual la incorporación del gen sacB en el vector a transferir, cuya expresión resulta letal en presencia de altas concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo, pudiera resultar de gran utilidad en la selección de dobles recombinantes (Cai & Wolk, 1990). Eventos de recombinación simple también pueden 53 Introducción conllevar a la inactivación de un gen, si el vector integrado interrumpe la región codificadora (Pernil et al., 2008). Los vectores replicativos por su parte, son de gran utilidad para la expresión de copias extracromosómicas de un gen nativo (Brusca et al., 1990; Buikema & Haselkorn, 2001; Liu & Golden, 2002; Wu et al., 2004; Wu et al., 2007) o para la expresión de genes heterólogos (Li et al., 2003; Wu et al., 2007; Xiaoqiang et al., 1997; Zahalak et al., 1995). Para estos fines ha resultado también de especial interés el uso de promotores fuertes y regulables tanto nativos (Buikema & Haselkorn, 2001; Wu et al., 2007; Xiaoqiang et al., 1997) como heterólogos (Brusca et al., 1990; Elhai, 1993; Xiaoqiang et al., 1997). El empleo de promotores regulables ha sido igualmente una herramienta fundamental en la generación de fenotipos condicionalmente letales, de gran utilidad para la identificación de genes esenciales (Callahan & Buikema, 2001). Para muchas cianobacterias, la presencia de endonucleasas de restricción nativas, que degradan el DNA exógeno transferido, constituye un elemento que limita sustancialmente la eficiencia de transformación. Tal es el caso de los isosquisómeros de las enzimas AvaI, AvaII y AvaIII presentes en Anabaena sp. PCC7120. La eliminación de estas secuencias de restricción en el DNA a transferir, o la metilación del DNA in vivo antes de ser transferido gracias a la inclusión de los genes para DNA metilasas específicas en los vectores “ayudantes”, han permitido incrementar considerablemente la eficiencia de transformación por conjugación en cianobacterias (Elhai et al., 1997). Como marcadores de la transformación en cianobacterias se utilizan usualmente genes de resistencia a antibióticos como neomicina, estreptomicina/espectinomicina y en menor medida bleomicina y cloranfenicol (Koksharova & Wolk, 2002a). La incorporación de genes reporteros como el gen de la luciferasa (luxAB) o de la proteína fluorescente verde (gfp) permite, mediante luminiscencia o fluorescencia, no sólo demostrar la transferencia 54 Introducción 2007). La subclase principal, que da nombre a la familia y se encarga básicamente de la regulación del metabolismo del hierro es Fur. La proteína Fur fue inicialmente identificada como tal en mutantes de Salmonella typhimurium y E. coli que sobreexpresaban constitutivamente sideróforos y sus receptores de membrana. El estudio de estos mutantes permitió la identificación y caracterización de una proteína que actuaba como represor transcripcional, utilizaba Fe2+ como cofactor y regulaba la expresión de la maquinaria de adquisición de hierro en dependencia de la disponibilidad de este nutriente en el medio (Bagg & Neilands, 1987; Ernst et al., 1978; Hantke, 1984). En la actualidad el número de genes fur descritos ha crecido exponencialmente, encontrándose procariotas expresando proteínas Fur en prácticamente todos los ambientes y grupos bacterianos. Con el advenimiento de la era genómica y postgenómica, la secuenciación y análisis de múltiples genomas han permitido predecir la existencia de homólogos de este regulador en virtualmente todas las bacterias conocidas. Los resultados de ulteriores análisis genéticos y bioquímicos con diferentes microorganismos revelaron la enorme diversidad de las proteínas Fur, las cuales no sólo respondían a la disponibilidad de hierro, sino también a la de otros iones metálicos como Zn2+, Mn2+ o Ni2+, o a otros estímulos como el nivel intracelular de hemo o de H2O2, cumpliendo en la célula diferentes cometidos (Lee & Helmann, 2007). Esto conllevó a la subdivisión de la familia Fur en otras subclases funcionales que incluyeron además las proteínas Zur (zinc uptake regulators), Mur (manganese uptake regulators), Nur (nickel uptake regulators), Irr (iron response regulators) y PerR (peroxide stress response regulator). La descripción de más de un homólogo o subclase Fur dentro de un mismo microorganismo ha sido un hecho comúnmente descrito (Bsat et al., 1998; Hantke, 2001). Las proteínas Zur constituyen la segunda subclase más estudiada dentro de la familia Fur (Hantke, 2005). Estas proteínas son las responsables de controlar la adquisición e 61 Introducción incorporación de zinc, utilizan Zn2+ como cofactor y han sido descritas en una gran variedad de microorganismos como Mycobacterium tuberculosis (Maciag et al., 2007), Streptomyces coelicolor (Shin et al., 2007), Xantomonas campestri (Huang et al., 2008), Corynebacterium diphteriae (Smith et al., 2009), entre otros. Las proteínas Mur han sido descritas en Rhizobium leguminosarum, utilizan Mn2+ como cofactor y regulan la transcripción de transportadores de manganeso (Diaz-Mireles et al., 2004). De forma similar a la proteína Fur de E coli, este regulador puede unir in vitro otros cationes divalentes como Fe2+, Zn2+ y Co2+ con constantes de disociación similares a Mn2+ (Bellini & Hemmings, 2006). Las proteínas Nur regulan la adquisición de níquel, han sido descritas en S. coelicolor y utilizan Ni2+ como cofactor. Estas proteínas al parecer también regulan la expresión de los genes de superóxido-dismutasas, pudiendo estar implicadas no sólo en la homeostasis de níquel, sino también en la respuesta a estrés oxidativo (Ahn et al., 2006). Las proteínas Irr controlan la expresión de genes de transportadores de hierro y de otros genes dependientes de hierro no en respuesta directa a Fe2+, sino en respuesta a la disponibilidad de hemo, es decir, sensan indirectamente la disponibilidad de hierro a través del estado de la biosíntesis de hemo. Este regulador se expresa en condiciones limitantes de hierro y se degrada en condiciones de suficiencia de hierro como respuesta a la unión directa con hemo. Han sido descritas en Bradyrhizobium japonicum (Yang et al., 2006) y R. leguminosarum (Small et al., 2009; Todd et al., 2006), entre otros. Las proteínas PerR son represores transcripcionales de genes implicados en la respuesta a estrés oxidativo tales como catalasas, hidroperóxido-reductasas, tiorredoxina-reductasas, entre otras. Estos reguladores constituyen sensores de H2O2 y utilizan Fe2+ o Mn2+ como cofactores (Hantke, 2001). La capacidad de unión al DNA de estos reguladores se reduce in vitro en presencia de H2O2, siendo más sensible al peróxido las PerR con Fe2+ como 62 Introducción cofactor (Herbig & Helmann, 2001). En B. subtilis el H2O2 conduce a la oxidación de histidinas de PerR formando 2-oxo-histidinas, lo que previene la unión al DNA inactivando su actividad represora (Lee & Helmann, 2006a; Traoré et al., 2009). Estudios en S. aureus indican que PerR actúa además como represor transcripcional de Fur, así como de proteínas de almacenamiento de hierro tales como ferritinas y proteínas de tipo Dps, de esta forma PerR pudiera orquestar una respuesta global de protección frente al estrés oxidativo (Horsburgh et al., 2001). 2.3.2 Unión al DNA y mecanismos de regulación El modelo clásico de regulación propone que Fur actúa como un represor transcripcional dependiente de hierro, que regula la expresión de los genes implicados en el sistema de incorporación y transporte de hierro a la célula. Este represor en E. coli es un dímero conformado por monómeros de 17 kDa, cada uno con dos sitios de unión a metal: un sitio de unión a un átomo de Zn2+ estructural en el dominio N-terminal y un sitio de unión a un átomo de Fe2+ correpresor en el dominio C-terminal. En situación de abundancia de Fe2+ intracelular, el metal correpresor se une a Fur y promueve un cambio conformacional en la proteína permitiendo la unión al DNA en secuencias específicas de los promotores diana, impidiendo la unión de la RNA polimerasa y con ello evitando la transcripción. De forma inversa, en situación de déficit de hierro, disminuyen los niveles de Fe2+ intracelular y el metal correpresor se libera del represor, la proteína Fur pierde afinidad por el DNA y se separa del promotor diana permitiendo la transcripción (Escolar et al., 1999). La secuencia de unión al DNA, denominada caja Fur o “iron box” ha sido objeto de numerosos estudios e interpretaciones, y aun cuando en la actualidad ha logrado definirse una secuencia consenso tras el estudio de múltiples promotores regulados por Fur, la misma puede variar considerablemente en los diferentes géneros bacterianos. Los primeros 63 Introducción estudios de protección frente a la digestión con DNasa I (footprinting) con más de 30 promotores génicos que respondían a la disponibilidad de hierro, permitieron la definición de una secuencia palindrómica consenso de 19 pb (De Lorenzo et al., 1987). Ensayos in vivo mostraron que cualquier gen heterólogo en cuyo promotor fuera incluida esta secuencia, pasaba a estar regulado por la presencia de hierro (Calderwood & Mekalanos, 1988). De esta forma, la interacción Fur-DNA parecía similar a la de los represores bacterianos clásicos, en los cuales un dímero de proteína reconoce y se une a secuencias palindrómicas (Escolar et al., 1999). Sin embargo, los resultados de otros estudios no eran compatibles con esta interpretación. Estudios de protección de Fur sobre el promotor de aerobactina frente a radicales hidroxilo revelaba un patrón de dos bases protegidas y cuatro bases no protegidas, repetido tres veces a lo largo de la secuencia de unión (De Lorenzo et al., 1988a). Por otro lado, muchos promotores que respondían a hierro parecían tener no una, sino varias cajas Fur en ocasiones solapadas, mientras los experimentos de protección frente a la DNasa demostraban que Fur podía proteger una región mayor que la caja de 19 pb. Análisis por microscopía electrónica y otros estudios sugerían una oligomerización helicoidal de la proteína alrededor de la doble hélice del DNA (Frechon & Le Cam, 1994; Le Cam et al., 1994). La interacción de Fur con el DNA parecía iniciarse en una secuencia de alta afinidad correspondiente a la caja Fur, que estimulaba luego la interacción con sitios secundarios de menor afinidad, de esta forma en la unión del represor eran importantes no sólo las interacciones DNA-proteína sino también las interacciones proteína-proteína. Estos resultados conllevaron a una nueva interpretación de la secuencia consenso de 19 pb, la cual no sólo constituía un palíndrome de 9 pb repetidas e invertidas, sino también podía ser la combinación de tres repeticiones adyacentes de un consenso de 6 pb (Fig. I.5) (Escolar et al., 1998). 64 Introducción Aunque eran necesarios al menos tres motivos o hexámeros N ATA/TAT para una unión efectiva de la proteína Fur al DNA, su número total y orientación relativa no parecían importantes; de hecho fueron identificadas hasta 18 repeticiones en tándem de este hexámero en el promotor de aerobactina (Escolar et al., 2000). Figura I.5. Primeras interpretaciones de la caja Fur o iron box (Escolar et al., 1999). Posteriores reinterpretaciones de la secuencia consenso proponen las regiones de interacción con Fur como motivos solapantes de 13 pb en ambas hebras, dispuestos como “6-1-6” (Lavrrar et al., 2002) (Fig. I.6A) o como motivos solapantes de 15 pb dispuestos como “7-1-7” (Baichoo et al., 2002) (Fig. I.6B). Ambas interpretaciones sugieren la unión de dos dímeros de Fur en cada caja Fur, dispuestos en caras opuestas de la doble hélice sobre sitios desplazados aproximadamente media vuelta de hélice (Fig. I.6C). Estas reinterpretaciones explicarían el fenómeno de unión cooperativa de Fur sobre el promotor y las observaciones de microscopía electrónica donde la proteína parece cubrir helicoidalmente al DNA, así como el hecho de no encontrar bases individuales esenciales para la formación del complejo Fur-DNA por experimentos de mutagénesis dirigida (Stojiljkovic et al., 1994). El modelo clásico de represión transcripcional de Fur, propuesto inicialmente para la regulación de los genes implicados en el transporte de hierro en E. coli y basado en la 65 Introducción existencia de dos configuraciones de Fur en dependencia de la disponibilidad de Fe2+ (Escolar et al., 1999), justifica la inducción de los genes diana en situaciones de deficiencia de hierro (Fig. I.7). Sin embargo, determinados genes en E. coli eran reprimidos y no inducidos bajo situación de estrés férrico (Dubrac & Touati, 2000), lo cual entraba en discordancia con el modelo clásico de regulación y sugería una regulación positiva de Fur. A B C Figura I.6. Nuevas interpretaciones de la caja Fur o iron box. (A) Motivos solapantes de 13 pb dispuestos “6-1-6” (Lavrrar et al., 2002). (B) Motivos solapantes de 15 pb dispuestos “7-1-7” (Baichoo et al., 2002). (C) Esquema de la disposición de los dímeros de Fur sobre la caja Fur teniendo en cuenta estas interpretaciones (Imagen tomada de Pohl et al., 2003). 66 Introducción Estas reinterpretaciones explicarían el fenómeno de unión cooperativa de Fur sobre el promotor y las observaciones de microscopía electrónica donde la proteína parece cubrir helicoidalmente al DNA, así como el hecho de no encontrar bases individuales esenciales para la formación del complejo Fur-DNA por experimentos de mutagénesis dirigida (Stojiljkovic et al., 1994). El modelo clásico de represión transcripcional de Fur, propuesto inicialmente para la regulación de los genes implicados en el transporte de hierro en E. coli y basado en la existencia de dos configuraciones de Fur en dependencia de la disponibilidad de Fe2+ (Escolar et al., 1999), justifica la inducción de los genes diana en situaciones de deficiencia de hierro (Fig. I.7). Sin embargo, determinados genes en E. coli eran reprimidos y no inducidos bajo situación de estrés férrico (Dubrac & Touati, 2000), lo cual entraba en discordancia con el modelo clásico de regulación y sugería una regulación positiva de Fur. El descubrimiento de un RNA antisentido (-RNA) denominado RyhB (Masse & Gottesman, 2002), cuya expresión estaba bajo el control de Fur y que a su vez regulaba postranscripcionalmente la expresión de varios genes de ferroproteínas constituye la clave de esta regulación positiva de Fur. RyhB es un RNA de 90 bases cuya transcripción es regulada por Fur según el mecanismo clásico de represión transcripcional. Cuando este -RNA se transcribe induce la degradación de los RNA mensajeros (RNAm) de proteínas implicadas en el almacenamiento de hierro como ferritina y bacterioferritina (genes ftnA y bfr) y de otras proteínas que contienen hierro como la succinato-deshidrogenasa (operón sdhCDAB), la Fe-SOD (gen sodB), entre otras. En situación de abundancia de hierro Fur reprime la transcripción de este -RNA, permitiendo la expresión de los genes antes mencionados; sin embargo, bajo condiciones de estrés férrico se induce la transcripción del -RNA y con ello se reprime postranscripcionalmente la expresión de estos genes (Fig. I.7). Este 67 Introducción mecanismo de regulación permite a la célula reprimir la síntesis de proteínas de almacenamiento de hierro y otras proteínas férricas no esenciales en situación de limitación de hierro, mientras induce la expresión de genes para el secuestro y transporte de hierro extracelular, a fin de garantizar la homeostasia en una situación de estrés nutricional (Masse & Gottesman, 2002). Un mecanismo similar de regulación indirecta de Fur mediada por un -RNA denominado NrrF ha sido igualmente descrito en Neisseria meningitidis (Mellin et al., 2007) y N. gonorrhoeae (Jackson et al., 2010), sobre los mismos genes regulados por RhyB en E. coli (bacterioferritinas, Fe-SOD, succinato deshidrogenasa, etc). En la actualidad, el papel de estas pequeñas moléculas de RNA regulatorio en el control de la homeostasis del hierro en varios organismos microbianos es un hecho reconocido (Masse et al., 2007). Inducción indirecta por represión de -RNA (RyhB, NrrF) Represor Figura I.7. Mecanismo clásico de represión transcripcional mediada por Fur La acción de Fur como posible activador directo de la transcripción ha sido adicionalmente descrita en N. meningitidis (Delany et al., 2004). Los autores plantean una regulación positiva de la transcripción mediada por Fur y corregulada por Fe2+ de los genes norB, Disponibilidad de hierro [ [ F Fe e2+ 2+ ] ]   Caja Fur +1 activo Represión Represor [ [ F Fe e2 2+ + ] ]     RNA-pol +1 inactivo Transcripción 68 Introducción pan1 y nuoA, por unión directa de la proteína a cajas Fur ubicadas en los promotores de estos genes, sugiriendo que Fur actúa como activador o coactivador de la transcripción. Hasta la fecha, en la inmensa mayoría de los mecanismos documentados de regulación génica mediada por Fur, ya fuera actuando como represor transcripcional clásico o como activador directo o indirecto (mediado por -RNAs), la actividad de unión al DNA de Fur requiere la presencia de Fe2+ como metal correpresor. Sin embargo, varios estudios en H. pylori (Delany et al., 2001; Ernst et al., 2005) y más recientemente en C. jejuni (Butcher et al., 2012) evidencian la existencia de un nuevo mecanismo de regulación mediante el cual la proteína es capaz de unirse a los promotores de ciertos genes en ausencia de metal correpresor. Curiosamente, esta regulación apo-Fur ha sido propuesta para explicar la inducción mediada por Fur que tiene lugar en los genes para ferritina y Fe-SOD bajo condiciones de suficiencia de hierro. A diferencia de E. coli y N. meningitidis, la proteína Fur de H. pylori es capaz de reconocer y unir in vitro de forma específica los promotores de estos genes, lo cual sugiere un mecanismo de regulación directa; sin embargo, la unión al DNA en este caso ocurre en ausencia de Fe2+ e incluso la afinidad resulta seriamente afectada en presencia del metal correpresor (Ernst et al., 2005). De esta forma, el nuevo modelo de regulación apo-Fur hasta ahora sólo descrito en Helicobacter y Campylobacter sugiere que Fur se une al DNA en ausencia de hierro, y que la desrepresión ocurre cuando se forma el complejo Fur-Fe2+. 2.3.3 Estudios estructurales Desde que la estructura primaria de la primera proteína Fur fue conocida, con la publicación de la secuencia del gen fur de E. coli en el año 1985 (Schaffer et al., 1985), hasta la resolución de la primera estructura tridimensional por cristalografía de rayos X con la Fur de P. aeruginosa en el año 2003 (Pohl et al., 2003), se han llevado a cabo múltiples 69 Introducción estudios a fin de obtener información acerca de la estructura terciaria y lograr un modelo funcional de este regulador transcripcional. Mediante digestión con diferentes proteasas de la proteína Fur de E. coli y análisis de los fragmentos generados, Coy y Neilands en 1991 proponen un modelo funcional de esta proteína, en el que el extremo N-terminal participa en el reconocimiento y unión al DNA, mientras el extremo C-terminal confiere la capacidad de dimerización (Coy & Neilands, 1991). Este modelo fue confirmado más adelante mediante construcción de proteínas quiméricas formadas por cada uno de los dominios de Fur y el represor cI del fago lambda. El análisis de la capacidad de dimerización y de la regulación del gen lacZ controlado por un promotor reconocido por Fur, coincidía con el modelo inicial (Heidrich et al., 1996; Stojiljkovic & Hantke, 1995). Estudios espectroscópicos indicaron además la presencia de dos sitios de unión a metal, un sitio de unión al metal correpresor Fe2+ en el dominio Cterminal, que podía ser ocupado in vitro por otros cationes metálicos como Mn2+ y Co2+ (Adrait et al., 1999), y un segundo sitio de unión a un metal estructural en el dominio de reconocimiento al DNA, ocupado por Zn2+ (Althaus et al., 1999; Jacquamet et al., 1998). Asimismo, la modificación química selectiva de determinados residuos y su seguimiento por espectroscopía de masas llevaron a proponer la existencia de un motivo hélice-girohélice no clásico de unión al DNA en el dominio N-terminal, similar al existente en la familia DtxR. La unión del metal correpresor induciría cambios en la conformación de este motivo, permitiendo su interacción directa con el surco mayor del DNA (González de Peredo et al., 2001). Una característica notable de la secuencia primaria de las proteínas Fur es la presencia de múltiples residuos de histidina y ocasionalmente varios residuos de cisteínas (motivos H3-5X2CX2C y CX2-5C). Varios estudios de mutagénesis dirigida han sido encaminados a demostrar el papel de estos residuos en la estabilidad estructural y funcional de este 70 Introducción cianobacteria siendo imposible la obtención de mutantes con la totalidad de la copias del gen fur delecionadas en el genoma poliploide de la cianobacteria (Ghassemian & Straus, 1996). En 1996 también se produce la secuenciación completa del primer genoma de un organismo fotoautotrófico, la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 (Kaneko et al., 1996). El advenimiento de la era genómica y postgenómica facilitó sustancialmente el estudio de las bases moleculares de diferentes procesos celulares, permitiendo a las cianobacterias convertirse en modelos de estudio para procesos como la fotosíntesis, la diferenciación celular o la fijación de nitrógeno. En la actualidad se conoce la existencia de ortólogos Fur en la totalidad de las especies de cianobacterias cuyos genomas han sido secuenciados (Botello-Morte et al., In press). Sin embargo, sólo existen reportes de estudios funcionales de proteínas Fur en Synechocistis sp. PCC 6803 (Li et al., 2004; Shcolnick et al., 2009), Synechococcus elongatus PCC 7942 (Ghassemian & Straus, 1996; Michel & Pistorius, 2004), Microcystis aeruginosa PCC 7806 (Martin-Luna et al., 2006a; Martin-Luna et al., 2006b) y Anabaena sp. PCC 7120 (Hernández et al., 2004a; Hernández et al., 2007; Hernández et al., 2009; López-Gomollón et al., 2007a; López-Gomollón et al., 2009; Napolitano et al., 2012). En Synechocistis sp. PCC 6803, el regulador PerR es inducido bajo situación de estrés oxidativo, funciona como un represor transcripcional autorregulable y modula la expresión de una gran variedad de genes (Li et al., 2004), incluyendo las proteínas inducibles bajo estrés férrico IsiA e IdiA (Michel & Pistorius, 2004), la peroxirredoxina AhpC (Kobayashi et al., 2004) y la proteína de tipo Dps, MrgA (Shcolnick et al., 2007; Shcolnick et al., 2009). En S. elongatus PCC 7942, la proteína Fur reprime la transcripción de IsiA bajo condiciones de suficiencia de hierro (Michel & Pistorius, 2004); mientras en M. 77 Introducción aeruginosa PCC 7806, Fur participa en la regulación de la expresión de los genes implicados en la síntesis de microcistinas (Martin-Luna et al., 2006b). El análisis de la secuencia genómica de Anabaena sp PCC 7120 condujo a la identificación de tres marcos abiertos de lectura que contenían la secuencia H2XHX2CX2C, altamente conservada en proteínas Fur, que se corresponden con las secuencias génicas all1691, all2473 y alr0957 descritas en la Cyanobase (http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase). Los tres productos génicos, denominados FurA, FurB y FurC, respectivamente (Hernández et al., 2004a), aunque poseen las características propias de la familia Fur, tienen secuencias muy diferentes, lo que probablemente implica funciones diferentes en la célula, algo comúnmente descrito en microorganismos con más de un homólogo Fur (Bsat et al., 1998; Hantke, 2001; Lee & Helmann, 2007). La proteína FurA (gen all1691) comparte la mayor homología con las proteínas Fur de bacterias heterotróficas, está constituida por 152 aminoácidos, tiene un peso molecular de 17,5 kDa, un punto isoeléctrico de 6,9 y un coeficiente de extinción molar teórico de 12690 M-1cm-1; contiene en su secuencia 5 cisteínas y 12 histidinas. Los estudios funcionales sugieren que este metalorregulador se comporta como un regulador global de la transcripción, controlando no sólo el metabolismo del hierro, sino además modulando la expresión de una variedad de genes de diversas categorías funcionales (Hernández et al., 2006a; Hernández et al., 2007; López-Gomollón et al., 2007a). Por su parte FurB (gen all2473) contiene 132 aminoácidos, un peso molecular de 15,2 kDa, un punto isoeléctrico de 8,7 y un coeficiente de extinción molar teórico de 5720 M-1cm-1; presenta 5 cisteínas y 7 histidinas y comparte un 45% de homología y un 26% de identidad con FurA. Recientemente se ha identificado a este regulador como una proteína Zur (Napolitano et al., 2012). Algunos estudios sugieren que esta proteína pudiera cumplir 78 Introducción además un papel protector del DNA bajo condiciones de estrés oxidativo (LópezGomollón et al., 2009). Finalmente, FurC (gen alr0957) tiene 149 aminoácidos, un peso molecular de 17,4 kDa, un punto isoeléctrico de 5,3 y un coeficiente de extinción molar teórico de 13730 M-1cm-1; presenta 3 cisteínas y 6 histidinas y comparte un 34% de homología y un 18% de identidad con FurA. Poco se conoce sobre el papel de FurC en la fisiología de Anabaena sp. Aunque la proteína se induce bajo situación de estrés oxidativo (López-Gomollón et al., 2009), hasta la fecha no existen evidencias de su participación directa o indirecta en un mecanismo de defensa frente a este tipo de estrés. Estudios in vitro sugieren un posible papel cooperativo o regulatorio sobre la acción de FurA y FurB. Ensayos de retardo en gel demostraron que tanto FurA como FurB se unen a las regiones promotoras de los tres reguladores, no así FurC, que no reconoce secuencias de unión en ninguno de los tres promotores. Sin embargo, la presencia de FurC afectó la capacidad de unión de cada uno de sus homólogos a sus respectivas secuencias dianas, potenciando la unión de FurA e inhibiendo la de FurB, pudiendo indicar una posible coordinación o efecto combinado en la cascada de regulación (Hernández et al., 2004a). 3.2 Antecedentes en la caracterización bioquímica y funcional de FurA de Anabaena sp. PCC 7120 3.2.1 Propiedades físico-químicas La proteína FurA de Anabaena sp. fue inicialmente descrita en la cepa PCC 7119 (Bes et al., 2001) y ulteriormente en la cepa PCC 7120 (Hernández et al., 2004a). Dada su similitud genética, la proteína es idéntica en ambas cepas. La proteína ha sido clonada, sobreexpresada en E. coli y usualmente purificada mediante IMAC (Immovilized metal affinity chromatography) aprovechando su propia secuencia de 79 Introducción poli-histidinas. La cromatografía de afinidad a metal se realiza preferentemente con zinc en lugar de níquel, dado que este último ha permitido menores rendimientos en la purificación de FurA y mayor número de impurezas. Una vez purificada la proteína no puede ser concentrada a pH neutro o básico debido a una marcada precipitación, lo cual no ocurre tras dializar con 10 mM de acético/acetato pH 4 (Hernández et al., 2002) o si purificamos en presencia de bajas concentraciones de cloruro de guanidinio y luego dializamos en acético/acetato (Pellicer et al., 2010). La proteína recombinante purificada mediante IMAC-Zn2+ o IMAC-Ni2+ no mostró ningún contenido de metales tras su análisis mediante espectrometría de masas (Hernández et al., 2002), lo cual resulta de particular interés dada la común existencia de Zn2+ estructural en los miembros de la familia Fur (Lucarelli et al., 2007; Pecqueur et al., 2006; Pohl et al., 2003; Traoré et al., 2006). Tras su purificación, FurA recombinante dimeriza en solución en ausencia de agentes reductores como DTT o 2-mercaptoetanol, mientras la presencia de agentes oxidantes como diamida incrementan la formación de otros estados oligoméricos como trímeros, tetrámeros o pentámeros en una proporción dependiente de la concentración de proteína, sugiriendo la ocurrencia de puentes disulfuro intercatenarios. La oligomerización no es totalmente reversible y su ocurrencia es influenciada además por la concentración de sales, lo cual sugiere también la participación de interacciones hidrofóbicas (Hernández et al., 2002). 3.2.2 Reconocimiento y unión al DNA Ensayos de retardo en gel demostraron que FurA recombinante era capaz de unirse de forma específica a su propio promotor y al promotor de la flavodoxina (isiB) en presencia de Mn2+ y esta unión era inhibida con la adición de un agente quelante como EDTA (Bes et al., 2001). Estudios ulteriores demostraron que la interacción de FurA con el DNA era 80 Introducción influenciada además por el estado redox de sus cisteínas, siendo favorecida sustancialmente con la presencia de un agente reductor como DTT e inhibida por H2O2 o diamida, lo cual pudiera sugerir que las condiciones redox in vivo pudieran modular la interacción del Fur con el DNA en Anabaena sp. (Hernández et al., 2006a). La proteína FurA recombinante muestra una capacidad de unión al grupo hemo en el rango de concentración micromolar, esta unión es saturable y en una proporción molar de 1:1 a pH 8 (Hernández et al., 2004b). La interacción con el grupo hemo afecta sensiblemente la unión del represor a sus promotores diana en ensayos de retardo en gel, lo cual pudiera constituir la base molecular de un posible mecanismo de regulación postraduccional de FurA. Las características físico-químicas de la unión del grupo hemo a FurA sugieren que el metalorregulador pudiera funcionar como una proteína sensora de hemo en la célula (Pellicer et al., 2012). Análisis de protección frente a la acción de la DNasa I o footprinting con los promotores de los genes isiB y furA indicaron que FurA protegía dos sitios o regiones en cada promotor, las cuales podían subdividirse en agrupaciones de varios motivos consecutivos ricos en A/T (Hernández et al., 2006a). El alineamiento de cada una de estas regiones protegidas con la secuencia consenso de 19 pb propuesta para E. coli mostró una identidad entre el 42 y 58%, aunque permitiendo sustituciones A/T esta identidad podía incrementarse considerablemente (Hernández et al., 2006a). Sin embargo, la escasa homología entre las cuatro secuencias de unión encontradas en los dos promotores de la cianobacteria no dejaba claro una secuencia consenso de unión de FurA a sus promotores diana, más allá del reconocimiento de una secuencia claramente rica en residuos de A/T. Algunos estudios sugieren que la arquitectura de la iron box es más importante que la identidad de bases individuales en la afinidad del Fur por el DNA (Lavrrar et al., 2002). Para algunos microorganismos como H. pylori, no se ha logrado definir una secuencia 81 Introducción consenso de unión del regulador Fur al DNA (Carpenter et al., 2009). Las diferencias en los sitios de unión del represor pudieran responder a las diferencias existentes en la secuencia aminoacídica del motivo hélice-giro-hélice del dominio N-terminal de Fur en los diferentes microorganismos, el cual reconoce e interactúa directamente con el surco mayor del DNA (González de Peredo et al., 2001). 3.2.3 Regulación de FurA La regulación de FurA está sujeta al parecer a diferentes mecanismos. Hasta el momento han sido encontradas evidencias de que la expresión de FurA es regulada a nivel transcripcional por ella misma (Bes et al., 2001) y por el regulador NtcA (López-Gomollón et al., 2007a), postranscripcionalmente por el -RNA dicistrónico alr1690-α-furA (Hernández et al., 2006b) y quizás su actividad y/o concentración pudiera modularse a nivel postraduccional mediante el estado redox de sus cisteínas (Hernández et al., 2006a) o por la interacción con el grupo hemo (Hernández et al., 2004b). Los niveles de FurA aumentan considerablemente en proheterocistos y heterocistos maduros (López-Gomollón et al., 2007b), lo cual pudiera indicar un papel relevante de este metalorregulador en el proceso de diferenciación o en la propia fisiología del heterocisto. Asimismo, los niveles de FurA se incrementan ligeramente durante la exposición del microorganismo a estrés férrico (Hernández et al., 2002) u oxidativo (López-Gomollón et al., 2009). 3.2.4 Estudios previos en la definición del regulón Tradicionalmente el análisis global comparativo de transcriptomas y/o proteomas entre mutantes de deleción de fur y sus estirpes silvestres parentales ha permitido la definición o caracterización de los regulones Fur en bacterias heterotróficas (Baichoo et al., 2002; Gao 82 Introducción 83 et al., 2008; McHugh et al., 2003; Wan et al., 2004). Varios intentos por obtener un mutante de deleción del gen furA mediante eventos de doble recombinación han resultado insatisfactorios (Hernández et al., 2006b). En ninguno de los casos se lograron obtener exconjungantes con una completa segregación y la totalidad de las copias del gen en todos los cromosomas interrumpidas, lo cual pudiera sugerir un papel esencial de este regulador en Anabaena sp, de forma análoga a lo que ocurre con proteínas Fur en otros microorganismos (Bigas et al., 2006; Ghassemian & Straus, 1996; Vasil & Ochsner, 1999). A pesar de este inconveniente práctico, algunos avances se han llevado a cabo en la definición del regulón FurA de Anabaena sp. Los estudios en tal sentido han permitido la identificación de varios genes cuyos promotores son reconocidos in vitro por FurA mediante ensayos de retardo en gel. Además de su autorregulación, FurA se une de forma específica al promotor de la flavodoxina (Bes et al., 2001; Hernández et al., 2006a), a los promotores de otros análogos Fur en Anabaena sp. como FurB y FurC (Hernández et al., 2004a), al promotor de un análogo en Anabaena sp. de la proteína DpsA de Synechococcus sp. (Hernández et al., 2007), al promotor del regulador global del metabolismo del nitrógeno NtcA y a un variado número de genes corregulados por ambos reguladores (López-Gomollón et al., 2007a), entre otros. Objetivos OBJETIVOS Tomando como base los resultados previos obtenidos por nuestro grupo de investigación sobre el papel regulador de la proteína FurA en la fisiología de las cianobacterias, nos propusimos en este trabajo de tesis contribuir a la definición del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120, prestando especial interés en la posible implicación de este metalorregulador en la modulación de mecanismos moleculares propios de las cianobacterias, no descritos con anterioridad en bacterias heterótrofas. Objetivo General: Identificar nuevas funciones de las proteínas Fur en cianobacterias mediante el estudio del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120 Objetivos específicos:  Construir una estirpe de sobreexpresión de FurA en Anabaena sp. como herramienta para el estudio del regulón.  Analizar los posibles cambios fenotípicos que tengan lugar en la cianobacteria, tanto morfológicos como fisiológicos y moleculares, asociados a la sobreexpresión del regulador transcripcional FurA.  Identificar los cambios de la expresión génica en la estirpe de sobreexpresión que son consecuencia directa de la acción de FurA.  Estudiar el papel regulador de FurA en el metabolismo del hierro.  Analizar la influencia de FurA en el proceso de diferenciación a heterocistos.  Definir una secuencia reguladora consenso o “caja FurA” que gobierne la unión del regulador a sus promotores diana en Anabaena sp. 84 Capítulo 1 CAPÍTULO 1 Obtención y caracterización fenotípica de una estirpe de sobreexpresión de FurA en Anabaena sp. PCC 7120 González A, Bes T, Barja F, Peleato ML, Fillat MF. Overexpression of FurA in Anabaena sp. PCC 7120 reveals new targets for this regulator involved in photosynthesis, iron uptake and cellular morphology. Plant and Cell Physiology 2010; 55 (11): 1900-1914. 85 Capítulo 1 1.1 ABSTRACT Previous genomic analyses of the filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 have identified three ferric uptake regulator (Fur) homologs with low sequence identities and probably different functions in the cell. FurA is a constitutive protein that shares the highest homology with Fur from heterotrophic bacteria and appears to be essential for in vitro growth. In this study, we have analysed the effects of FurA overexpression on the Anabaena sp. phenotype and investigated which of the observed alterations were directly operated by FurA. Overexpression of the regulator led to changes in cellular morphology, resulting in shorter filaments with rounded cells of different sizes. The furA-overexpressing strain showed a slower photoautotrophic growth and a marked decrease in the oxygen evolution rate. Overexpression of the regulator also decreased both catalase and superoxide dismutase activities, but did not lead to an increase in the levels of intracellular reactive oxygen species. By combining phenotypic studies, reverse transcription-PCR analyses and electrophoretic mobility shift assays, we identified three novel direct targets of FurA, including genes encoding a siderophore outer membrane transporter (schT), bacterial actins (mreBCD) and the PSII reaction center protein D1 (psbA). The affinity of FurA for these novel targets was markedly affected by the absence of divalent metal ions, confirming previous evidence of a critical role for the metal corepressor in the function of the regulator in vivo. The results unravel new cellular processes modulated by FurA, supporting its role as a global 1.2 INTRODUCTION Iron is a scarce nutrient essential for almost all organisms. However, an excess of free iron in the cell is potentially toxic under aerobic conditions due to its ability to catalyze the formation of active species of oxygen by Fenton reactions (Andrews et al., 2003). Bacteria 86 Capítulo 1 described methods. Total soluble protein present in cell extracts after sonication was determined using the BCA™ Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific). Pigments and protein contents were expressed in micrograms per microliter of PCV. 1.3.6 Microscopy Bright-field and fluorescence microscopic examinations of Anabaena sp. filaments were carried out with a Nikon Eclipse 50i Epi-fluorescence microscope. Micrographs were taken with a Nikon DXM1200F camera coupled to the microscope. The images were processed with Adobe Photoshop version 6.0. For electron microscopy, filaments were fixed in 2.5% (v/v) glutaraldehyde prepared in 66 mM phosphate buffer for 1 h at room temperature. After fixation, the samples were washed in phosphate buffer and then fixed again in 2% (w/v) osmium tetroxide for 1 h at room temperature. Dehydration was performed in a series of cold ethanol dilutions allowed to warm to room temperature at the higher concentrations, followed by infiltration with Spurr resin. Sections were cut on a Reichert Om U2 ultramicrotome, collected on nickel grids, stained with uranyl acetate and examined with a TECNAI G200 transmission electron microscope (FEI) operated at 120 V. The images were processed with Adobe Photoshop version 6.0. 1.3.7 Photosynthetic oxygen evolution Oxygen evolution of exponentially growing cells was measured at 25°C with a Clark-type oxygen electrode model Chlorolab 2 (Hansatech). Cell suspensions (10 μg ml−1 Chl a) were illuminated with white light at saturating intensity (400 μE m−2 s−1). Dark respiration was estimated from O2 uptake by cells incubated in the dark. Total oxygen evolution was calculated as the sum of the apparent oxygen evolution in the light and dark respiration. 93 Capítulo 1 1.3.8 Antioxidant enzymes assays Cyanobacterial cells were grown to late log phase in 50 ml of standard BG-11 medium, collected by centrifugation, and sonicated in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7). Supernatant obtained after centrifugation of the crude extracts was used for enzyme assays. Protein concentration was determined using the BCA™ Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific). CAT activity was determined according to the method of Beers and Sizer (Beers & Sizer, 1952). Dissociation of H2O2 was followed spectrophotometrically at 240 nm in a 3 ml reaction mixture containing 20 mM H2O2 and crude extract (600 μg ml−1 total proteins) at 25°C. One unit of enzyme was defined as the quantity that catalyzes the decomposition of 1 μmol of H2O2 in 1 min. SOD activity was determined according to the method of Winterbourn et al. (Winterbourn et al., 1975), based on the ability of SOD to inhibit the photochemical reduction of nitro-blue tetrazolium (NBT) by superoxide in a 3 ml reaction mixture containing 2 μM riboflavin, 50 μM NBT, 0.06 M EDTA, 20 μM sodium cyanide and crude extract (600 μg ml−1 total proteins). One unit of enzyme was defined as the amount causing half maximal inhibition of NBT reduction. Activities of enzymes were expressed as units per milligram of protein. 1.3.9 Tolerance to oxidative stress induced by H2O2 Tolerance of Anabaena sp. cells to the oxidative stress caused by H2O2 exposure was measured according to Shcolnick et al. (Shcolnick et al., 2009) with slight modifications. Basically, the strains were grown to late log phase in standard BG-11 medium, washed, and adjusted to an optical density at 750 nm of 1.0 in BG-11 medium. Aliquots of 200 μl of adjusted cultures were put on a microtiter plate and incubated for 48 h in the presence of 0-4 mM H2O2 in darkness. The results were documented by photography, and chlorosis 94 Capítulo 1 was estimated by reading the absorbance at 620 nm using a Multiskan EX microplate photometer (Thermo Fisher Scientific). 1.3.10 ROS determination Levels of intracellular ROS in Anabaena sp. strains were quantified according to Latifi et al. (Latifi et al., 2005) by using the fluorescent probe CM-H2DCFDA, which detects H2O2, hydroxyl radicals and peroxynitrite anions. Cyanobacterial cells were grown to late log phase in 50 ml of standard BG-11 medium, washed twice with 10 mM phosphate buffer and incubated with 25 μM CM-H2DCFDA (Invitrogen) for 5 min at room temperature in darkness. Fluorescence was measured using an Aminco Bowman Series 2 spectrofluorometer (Thermo Fisher Scientific), with excitation and emission settings of 488 nm and 530 nm, respectively. Cells of the wild-type strain treated with 1 mM H2O2 for 30 min were used as the fluorescent-positive control. Additionally, the amount of intracellular H2O2 was specifically determined by the ferrithiocyanate method (Thurman et al., 1972). Briefly, 95-100 mg of fresh cells were homogenized with 5% trichloroacetic acid (TCA), centrifugated at 12000 × g for 5 min at 4°C, and the supernatant obtained was used for peroxide estimation. Reaction mixtures contained 800 μl of crude extract, 160 μl of 50% TCA, 160 μl of ferrous ammonium sulfate and 80 μl of potassium thiocyanate. The absorbance of the ferrithiocyanate complex was read at 480 nm using a Cary 100 Bio UV-Visible spectrophotometer (Varian), and compared with H2O2 standard. Peroxide content was expressed as micromoles per milligram of FW. Cells of the wild-type strain treated with 1 mM H2O2 for 30 min were used as the control. 95 Capítulo 1 1.3.11 Semi-quantitative RT-PCR Total RNA (1 μg) was heated at 85°C for 10 min and used as template for the first-strand cDNA synthesis. Residual DNA in RNA preparations was eliminated by digestion with RNase-free DNase I (Roche, Basel, Switzerland). The absence of DNA was checked by PCR. Reverse transcription was carried out using SuperScript retrotranscriptase (Invitrogen) in a 20 μl reaction volume containing 150 ng of random primers (Invitrogen), 1 mM deoxyribonucleotide triphosphate mix (GE Healthcare) and 10 mM DTT. The sequences of the specific primers used for each RT-PCR analysis are given in Table 1.2. The housekeeping gene rnpB (Vioque, 1992) was used as an internal control to compensate for variations in the input of RNA amounts and normalize the results. The exponential phase of PCR for each gene was determined by measuring the amount of PCR product at different numbers of cycles. For the final results, 20-23 cycles were used for the analysis at the early exponential phase of PCR in all genes tested. The PCR products were resolved by electrophoresis in 1% agarose gel, stained with ethidium bromide and analyzed using a Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad). 1.3.12 EMSAs Recombinant Anabaena sp. FurA protein was produced in E. coli BL21(DE3) using the expression vector pET28a (EMD Biosciences), and purified according to a previously described method (Hernández et al., 2002). The promoter regions of each gene of interest were obtained by PCR using the primers listed in Table 1.2. EMSAs were performed as described previously (Hernández et al., 2006a). Briefly, 100-120 ng of each DNA fragment were mixed with recombinant FurA protein at a concentration of 150, 300, 500 and 700 nM in a 20 μl reaction volume containing 10 mM bis-Tris (pH 7.5), 40 mM KCl, 100 μg ml−1 bovine serum albumin, 1 mM DTT, 100 μM MnCl2 and 5% (v/v) glycerol. In some 96 Capítulo 1 experiments, EDTA was added to a final concentration of 200 μM. To insure the specificity of EMSA, the promoter region of the Anabaena sp. nifJ (alr1911) gene was included as non-specific competitor DNA in all assays (López-Gomollón et al., 2007a). Binding assay of the promoter region of the gene furA was included as the EMSA positive control (Hernández et al., 2004a; Hernández et al., 2006a). Mixtures were incubated at room temperature for 20 min and subsequently separated on a 4% non-denaturing polyacrylamide gel in running buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine) at 90 V. The gel was stained with SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen) and processed with a Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad). Table 1.2. List of oligonucleotides used in this study Primer Sequence (5´to 3´) Purpose 2770FurA_up CATATGACTGTCTACACAAATACTTCG Cloning of furA into pAM2770 FurA_dw GGATCCCTAAAGTGGCATGAGCG Cloning of furA into pAM2770 rnpB_up AGGGAGAGAGTAGGCGTTG RT-PCR rnpB_dw AAAAGAGGAGAGAGTTGGTGG RT-PCR FurA_up CGGGATCCATGACTGTCTACACAAATAC RT-PCR FurA-5last_dw ACGCGTCGACCTAACGTTGGCACTTGGG RT-PCR psaA_up TGGCAGTTGTGACAATTTGG RT-PCR psaA_dw GGGCGAACAATACACCTTTC RT-PCR psaB_up CTTCGGTCACCTGGCAATC RT-PCR psaB_dw GCCAGGGCCAATTGTTAAG RT-PCR psaL_up ATGGCGCAAGCAGTAGACG RT-PCR psaL_dw AGTAAGCGACTACTGCACCACC RT-PCR psbA_up GCTAATTTATGGCATAGATTCGG RT-PCR psbA_dw GAAAGAAATGCAAAGAACGGG RT-PCR psbB_up GTAGTTCTGAATGACCCAGGGC RT-PCR psbB_dw CGGCGTGACCAAAGGTAAAC RT-PCR 97 Capítulo 1 Table 1.2. List of oligonucleotides used in this study (Cont.) Primer Sequence (5 to 3´) Purpose psbZ_up TTATGAAGCGCTATTGGTCACG RT-PCR psbZ_dw ACCCCGTTTTAGTGCTGATTC RT-PCR sodA_up CTCTGTGGCAACGGTTTATTG RT-PCR sodA_dw CTTTGCCGTGAAGCTTGG RT-PCR sodB_up CCACTACCCTACGACTTTAATGC RT-PCR sodB_dw AAGCTGGGCGAGCATTTC RT-PCR GCT1_up ATGCCAGTTAAAGTTGG RT-PCR GCT1_dw CTATTTACTCGCCAACTG RT-PCR GCT3_up ATGCCTCTAGCGGTTGGTAC RT-PCR GCT3_dw TTACAGTCCCAAAGCCGC RT-PCR gor_up GGCTGCTTCTAAACGAGCTGC RT-PCR gor_dw GGAGGGATGAATGCCAACG RT-PCR mreB_up GTGGGGCTTTTTAGGAACTTTC RT-PCR mreB_dw CTACATATTTCGAGATCGTCCG RT-PCR mreC_up ATGGTTACTGTACGTCGTTGGTG RT-PCR mreC_dw CTAGTTGGACTTTTGTTGCTGTG RT-PCR alr0397_up CATTAATCAGCCATCCTGGC RT-PCR alr0397_dw GTTTCGCGGAGATAAAATGC RT-PCR FurB_up ATGAGAGCCATACGCAC RT-PCR FurB_dw CTAAATTTCACTCGCGTG RT-PCR FurC_up ATGCAGCAACAGGCAATATC RT-PCR FurC_dw GAGGATGCCGATATCCATAG RT-PCR IsiA_up CTGCTCTGACAACCCTCTGG RT-PCR IsiA_dw CAGCTAACTTGACTGTATCGGC RT-PCR PnifJ_up GCCTACTCTGCGAGTTCTCCG EMSA PnifJ_dw GGCCTGTGAGAGTTGCTGCAC EMSA PfurA_up CTCGCCTAGCAATTTAACAAC EMSA PfurA_dw GCCTTGAGCGAAGTATTTGTC EMSA PpsaAB_up GCAAACTCAGCAAATTTGTCG EMSA PpsaAB_dw GAGGACTAATTGTCATTCGACC EMSA All0107-1 GCAGCTACTATCTGGCTGAC EMSA All0107-2 GATGCGTCTACTGCTTGCG EMSA Alr3742-1 CAGCATTGGCAACGGCTCC EMSA Alr3742-2 CATACATTCGATTTTCCGTACTG EMSA Ppsb_up GTAACGGCGATCTGTGGGAAG EMSA Ppsb_dw CATCGACTACGCTCCTCCTCG EMSA 98 Capítulo 1 Table 1.2. List of oligonucleotides used in this study (Cont.) Primer Sequence (5 to 3´) Purpose All1258-1 GCACATAAGCAGACTACACAAG EMSA All1258-2 GACAAGGGCAAGCAGACGTG EMSA PsodA_up GATAGAATCAATGACTGCTC EMSA PsodA_dw GTTGTTGCCTCTTATTTG EMSA PsodB_up GCTTAGTAGTCCCTTTGC EMSA PsodB_dw CATTTTGTGAAGTCCTCTC EMSA GCT1-Prom_up GGTTTGGCTGTAATTTATCG EMSA GCT1-Prom_dw CAGAGTCTCCAACTTTAACTG EMSA GCT3-Prom_up GATCGCACCTACGGAAACG EMSA GCT3-Prom_dw GGCATAATGAACCTTTCCTG EMSA PGor-1 CTCTCTGGACATCGCTTAGT EMSA PGor-2 CCAGAACCAGCACCAATTAC EMSA PmreBC_up GCCTTATCCTTTAGTAC EMSA PmreBC_dw GAAAGTTCCTAAAAAGC EMSA Palr0397_up CATCCTACATGAAGATTAATG EMSA Palr0397_dw CGCCTATTATTATTGACTTG EMSA 1.4 RESULTS 1.4.1 FurA overexpression from the copper-inducible petE promoter A derivative strain of Anabaena sp. PCC 7120 showing a high level of expression of FurA was generated using the shuttle vector pAM2770 (Lee et al., 2003); it contained an extra copy of the wild-type furA gene located downstream of the copper inducible petE promoter (Buikema & Haselkorn, 2001). The strain obtained, named AG2770FurA, showed increased levels of the FurA protein both in standard BG-11 medium and in BG-11 supplemented with copper to 0.4 μM, according to Western blot analysis (Fig. 1.1). However, there was no appreciable increase in the amount of FurA after supplementation of BG11 with additional copper, suggesting a high induction of the petE promoter with the concentration of copper normally present in this medium. 99 Capítulo 1 Consequently, standard BG-11 was used in further analyses. As previously found in cyanobacterial FurA (Pellicer et al., 2010), as well as in other Fur family proteins (Lee & Helmann, 2006b; Ortiz de Orué Lucana & Schrempf, 2000), additional minor bands of FurA with different gel mobility appear as a result of oxidation of cysteines in the air and intrafragment disulfide bond formation. PCC 7120 AG2770FurA FurAr - + - + 17.5 kDa Cu 2 + Figure 1.1. Levels of FurA protein in wild-type Anabaena sp. strain PCC 7120 and furA-overexpressing strain AG2770FurA revealed by Western blotting. Total cell extracts from filaments grown in BG-11 medium with (+) and without (-) additional supplementation with copper were separated by SDS-PAGE, electrotransferred, and challenged with anti-FurA antiserum. Recombinant FurA overexpressed and purified from E. coli was included as control. Molecular weight is indicated. 1.4.2 Overexpression of FurA alters cyanobacterial morphology Photoautotrophic growth of wild-type and furA-overexpressing strains in BG-11 medium was compared by following the cell yields during 24 d in terms of optical density at 750 nm (Fig. 1.2). The strain AG2770FurA showed a slower growth, with a doubling time of 4.07 d and a specific growth rate of 0.17 d–1 (in contrast to 3.15 d and 0.22 d−1 for the wild type), which determined minor cell yields in all growth phases. Values of packed cell volume (PCV) were in accordance with spectrophotometrical readings, showing a linear relationship. For this reason, the PCV was used as the parameter for cell mass in further determinations. 100 Capítulo 1 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Time (days) Packed-cell volume (μl mL¯ ¹) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Optical density (750 nm) PCC 7120 AG2770FurA PCC 7120 AG2770FurA Figure 1.2. Growth of furA-overexpressing strain AG2770FurA in comparison to the wild-type strain PCC 7120, expressed as both packed-cell volume (columns) and optical density (lines). Values are the averages of three independent experiments; standard deviations are represented by vertical bars. Please note that in some instances the error is smaller than the symbols used. Microscopic examination of cultures in the exponential phase of growth revealed appreciable morphological changes in the strain AG2770FurA compared with its parental strain PCC 7120. Unlike the wild type, whose filaments formed large chains of elliptically shaped cells and highly uniform size (Fig. 1.3A), the furA-overexpressing strain showed an abundance of short filaments and even single cells, with rounded shape and loss of the characteristic uniformity in cell size, resulting in cells with both increased and diminished sizes compared with the wild type (Fig. 1.3B). In addition, the intrinsic fluorescence of cells appeared partially affected, since changes in the intensity of fluorescence of individual cells were observed along a single filament (Fig. 1.3C, D). 101 Capítulo 1 E C F D A B Figure 1.3. Overexpression of FurA induced morphological and ultrastructural changes in Anabaena sp., as shown in photomicrographs of wild-type strain PCC 7120 (A, C, E) and furA-overexpressing strain AG2770FurA (B, D, F) taken at the exponential phase of growth. Bright-field (A, B) and fluorescence (C, D) microscopic examinations revealed alterations in filament length, cell shape/size and intrinsic fluorescence. Transmission electron microscope analysis (E, F) showed differences in thylakoids arrangement. Photomicrograph of each strain is representative of at least 10 different images. Bars, 1 µm. 102 Capítulo 1 regulatory proteins, such as PsbZ (Bishop et al., 2007), could produce an imbalance among components of the photosystems in AG2770FurA cells. Table 1.S1. Relative induction ratio of selected genes in strain AG2770FurA in relation to wild-type PCC 7120 strain, as result of semiquantitative RT-PCR analysisa Gene SignalAG2770FurA / Signalwild-type furA (all1691) 3.23 ± 0.02 psaA (alr5154) 3.86 ± 0.68 psaB (alr5155) 4.34 ± 0.38 psaL (all0107) 1.07 ± 0.05 psbA (alr3742) 1.23 ± 0.06 psbB (all0138) 4.58 ± 0.36 psbZ (all1258) 0.56 ± 0.04 sodA (all0070) 2.82 ± 0.23 sodB (alr2938) 0.63 ± 0.02 alr3183 0.55 ± 0.01 all2375 0.50 ± 0.01 gor (all4968) 5.81 ± 1.23 mreB (all0087) 3.18 ± 0.42 mreC (all0086) 1.59 ± 0.05 schT (alr0397) 2.73 ± 0.14 isiA (all4001) 1.64 ± 0.03 furB (all2473) 0.38 ± 0.04 furC (alr0957) 0.88 ± 0.03 aSignal assigned to each gene corresponded to the intensity of DNA band in the agarose gel stained with ethidium bromide, normalized to the signal observed for housekeeping gene rnpB in each strain. Values are means of two independent determination ± SD. The expression of several antioxidant enzymes described in Anabaena sp. PCC 7120 was also analyzed. Transcripts of the most abundant thiol peroxidases, namely GCT1 (alr3183) and GCT3 (all2375) (Cha et al., 2007), were reduced in the furA-overexpressing strain, while transcripts of glutathione reductase were increased. Interestingly, the transcriptional patterns of SODs observed in the furA-overexpressing strain resembled those previously described in wild-type strains of Pseudomonas aeruginosa (Hassett et al., 1996) and E. coli 109 Capítulo 1 (Dubrac & Touati, 2000) after iron deprivation. While transcripts of manganese-containing SOD (sodA) appeared increased, the amounts of the iron-containing SOD (sodB) were reduced. Additionally, some of the iron-responsive genes described in Anabaena sp. seemed to be up-regulated in the furA-overexpressing strain AG2770FurA, such as those encoding the siderophore outer membrane transporter SchT (Nicolaisen et al., 2008) and the IsiA protein. The overexpression of FurA also led to an increase in the transcription of some genes involved in control of cellular morphology, such as those for the bacterial actins MreB and MreC (Hu et al., 2007). Conversely, a second ferric uptake regulator described in Anabaena, FurB, with a possible role in oxidative stress protection (López-Gomollón et al., 2009), seemed to be down-regulated, while transcript levels of FurC decreased only slightly in the AG2770FurA strain. 1.4.6 Identification of novel FurA direct target genes To determine whether the expression of genes previously analyzed by RT-PCR was directly regulated by FurA, we investigated the ability of FurA to bind in vitro the promoter regions of such genes by using EMSAs. To confirm the specificity of bindings, all assays included the promoter region of nifJ as non-specific competitor DNA, while binding of FurA to the promoter region of its own gene was used as a positive control. All gene promoters used in the analyses consisted of a 300-400 bp DNA fragment upstream of ATG. We assumed that genes giving a positive result in both RT-PCR analyses and EMSAs were direct targets of FurA. Despite the high variation in transcript levels of photosynthesis genes under a FurA overexpression background, the EMSAs showed only a clear binding of FurA to the promoter region of psbA , a PSII gene coding for the reaction center protein D1 (Fig. 110 Capítulo 1 1.7B). Interestingly, psbA has been previously shown to respond to iron deprivation by increasing its transcriptional level (Singh & Sherman, 2000), but this is the first evidence, to the best of our knowledge, of a direct regulation by a Fur. None of the other analyzed components of both photosystems showed specific binding to FurA according to EMSA (data not shown). A B C D PnifJ 0 150 300 500 0 300 500 700 0 300 500 700 0 300 500 700 Figure 1.7. Electrophoretic mobility shift assays showing the ability of FurA to bind in vitro the promoter regions of target genes psbA (B), schT (C), and mreBCD (D). Binding of FurA to its own promoter (A) was included as positive control. DNA fragments free or mixed with increasing concentrations of recombinant FurA protein were separated on a 4% PAGE. In gels, protein concentration (indicated in nM) increases from left to right. The promoter region of nifJ gene was used as non-specific competitor DNA in all assays. Similarly, no apparent direct regulation by FurA of antioxidant enzyme expression was seen according to binding assays. Neither promoters of both SODs nor those of GCT1 and GCT3 thiol-peroxidases showed specific affinity of FurA. A similar result was also observed with the glutathione reductase promoter (data not shown). It has been previously shown that the binding affinity of FurA for its target promoters is greatly affected by the redox status of the protein and the presence of divalent metal ions (Hernández et al., 2006a). Thus, the optimal binding conditions have been observed in the 111 Capítulo 1 presence of both dithiothreitol (DTT) and Mn2+, which are routinely used in the FurA EMSA experiments. Taking into account the tight connection between iron homeostasis and oxidative stress defenses, as well as previous reports of Fur direct regulation of SOD gene transcription in other bacteria (Ernst et al., 2005), we further characterized the effect of divalent metal ion and redox conditions on the DNA-binding of FurA to SOD promoters, in order to determine whether pre-established binding conditions affected the affinity of FurA for these putative targets. Neither the absence of Mn2+ (+EDTA) nor nonreducing conditions improved the affinity of FurA for SOD promoters (data not shown). As expected, the EMSA analysis showed that FurA bound with high affinity to the promoter region of schT (Fig. 1.7C), a gene encoding a membrane transporter of the siderophore schizokinen (Nicolaisen et al., 2008). Likewise, the mreBCD operon, encoding the bacterial actins MreB, MreC and MreD (Hu et al., 2007), seemed also to be directly regulated by FurA according to the binding assays (Fig. 1.7D). In agreement with the EMSA results, computational analysis of the promoter regions of those targets allowed the identification of potential AT-rich iron boxes (Fig. 1.S1). PpsbA1.---------------CTTGACAACTATATTATTATAAAGTTATATATGATTGTAAGAC------- PschT1 ---------------GTTATTAATGATAATGTCAGCAAGAATAATTCCTAACAGTAAATAGACA PschT2.--------ATATTTTAATAAAATCAAAAACTATTGCTAATGCAAGTCAATAATAA---------- PmreB1 --------------GTATTTCTGCATATTTTTATACTGTAAATTTATTGCTA------------- PmreB2 ----------GTCACAATTAGTTATGATTAAAGTCAAAATTAATAAGTA---------------- PfurA(site II)----------TTAATAAATATTCTCAATAAGCAATGTTTGTTGCAAA----------- PfurA(site I) -TCCAAATATTTTGTTATATTCTCAATTAACAAGCTTT-------------------- PisiB(site II)--------TTTAATAATTATTTAATGCAAAATAGTCTAATAAATCTGATACTATA--- PisiB(site I) --------------CAAAGCTTATTGAAATAAATATTCAATCCGTTAAC--------- Consensus E.coli ---GATAATGATAATCATTATCGATAATGATAATCATTATC-------------- Figure 1.S1. Alignment of psbA, schT and mreB promoter regions with FurA-binding sites experimentally determined in Anabaena sp. PCC 7120 (Hernández et al., 2006a) and the Fur consensus in E. coli (Escolar et al., 1999). 112 Capítulo 1 Overall, the combination of RT-PCR analyses and EMSAs led us to identify three novel FurA direct targets: the photosynthesis gene psbA, the iron metabolism gene schT and the morphology-related operon mreBCD . 1.4.7 Metal co-repressor and reducing conditions are critical for the affinity of FurA for direct target genes The overexpression of FurA showed two different effects on the transcriptional pattern of direct target genes. While most of those targets seemed to be up-regulated, at least one of them, furB, decreased its transcript level. In order to determine whether these different effects were a consequence of differences in the mechanism of regulation, we further analyzed the impact of several binding conditions (by removing Mn2+ and/or DTT) on the affinity of FurA for the promoters of targets that had shown different transcriptional response in RT-PCR analyses. Notably, the affinity of FurA for all the target promoters analyzed was markedly affected in the absence of Mn2+ (and addition of EDTA) and/or DTT (Fig. 1.8). The results demonstrated that the presence of a metal co-repressor and reducing conditions are critical in the function of FurA, confirming previously obtained evidences (Hernández et al., 2006a). Thus, differences in the transcriptional patterns of target genes in a FurA overexpression background might reflect a coordinated action of more than one transcriptional regulator, rather than differences in the mechanism of regulation of FurA on its direct target genes. 113 Capítulo 1 A B C 1234 1 234 12 34 PnifJ D E 1234 12 34 PnifJ Figure 1.8. Impact of metal correpressor and reducing conditions on the in vitro affinity of FurA to target genes psbA (A), schT (B), mreBCD (C), furB (D) and isiA (E). DNA fragments free (line 1) or mixed with recombinant FurA protein at concentration of 500 nM (lines 2 to 5) in presence of Mn2+ and DTT (2), EDTA and DTT (3), Mn2+ without DTT (4), and EDTA without DTT (5) were separated on a 4% PAGE. The promoter region of nifJ gene was used as non-specific competitor DNA in all assays. 1.5 DISCUSSION Although numerous studies have revealed insights into the structure, mechanism of action and functions of Fur proteins in heterotrophic bacteria (Escolar et al., 1999; Hantke, 2001; Baichoo et al., 2002; Andrews et al., 2003; McHugh et al., 2003; Danielli et al., 2006; Lee 114 Capítulo 1 & Helmann, 2007; Gao et al., 2008), comparatively little is known about the role of this family of proteins in cyanobacteria. In the present study, we have constructed a strain of Anabaena sp. that overexpresses active FurA by using a shuttle plasmid with the copperresponsive petE promoter fused to a furA gene copy. Overexpression of FurA induced changes in the transcriptional pattern of a variety of genes, leading to alterations in photoautotrophic growth, filament integrity, cell morphology, ultrastructure, photosynthetic function and defense against oxidative stress. Although some of the effects observed in the FurA overexpression phenotype could result from an aberrant response unrelated to the normal function of the protein, the overexpression approach led us to identify novel direct targets of this apparently essential transcriptional regulator by combining the analysis of the phenotypic changes with both transcriptional profile variations and FurA-DNA interactions. Perhaps the most evident effects of the overexpression of FurA on the Anabaena phenotype were the slowing down of photoautotrophic growth and the altered morphology of cells. These effects appeared to be directly associated with the overexpression of the regulator, since the wild-type Anabaena sp. PCC 7120 and the Anabaena sp. strain harboring the empty vector pAM2770 showed identical phenotypes (data not shown). Measurement of oxygen evolution of the strain AG2770FurA indicated a strong effect on the photosynthetic activity, while RT-PCR analyses revealed different effects of FurA overexpression on the transcriptional pattern of several genes involved in photosynthesis. At least one of those genes, psbA, encoding the PSII reaction center protein D1, was directly regulated by FurA according to EMSA. Although only a few genes were analyzed, at least one (psbZ) seemed to be down-regulated with the overexpression of FurA. The PsbZ subunit of PSII has been described in Synechocystis sp. as a modulator of the electron flow through the photosynthetic electron transfer chain (Bishop et al., 2007). Deletion 115 Capítulo 1 mutants of the pbsZ gene showed a retarded photoautotrophic growth compared with the wild type. Since expression of photosynthesis genes is influenced by multiple factors and modulated by several transcriptional regulators (Fujimori et al., 2005; Li & Sherman, 2000; Seino et al., 2009), our results could suggest not only a direct influence of FurA on photosynthesis regulation, but also an indirect effect, perhaps as a result of a coordinated action of different regulators, as observed with FurA and NtcA in nitrogen metabolism (López-Gomollón et al., 2007a). The depletion in photosynthetic function undoubtedly had additional consequences on cellular physiology; many of these effects could be pleiotropic effects of FurA overexpression. The slightly increased amount of photosynthetic pigments and/or the rearrangement of thylakoid membranes could be adaptive responses of the microorganism in an attempt to improve the photosynthesis performance. Our experiments led us to identify another direct target of FurA, the operon mreBCD. In particular, the bacterial actin MreB has been shown to play a critical role in determination of cell shape of Anabaena sp. PCC 7120 (Hu et al., 2007). Either mreB deletion or mreBCD -inducible overexpression caused drastic morphological changes in Anabaena cells. The increased level of mreB/mreC transcripts observed in a FurA overexpression background could explain the morphological alterations seen in the strain AG2770FurA. Likewise, although the increased fragility of filaments in the furA-overexpressing strain could be a result of different factors, the overexpression of FurA could directly or indirectly affect the expression of genes associated with filament integrity (Bauer et al., 1995; Nayar et al., 2007). The intimate relationship between iron metabolism and oxidative stress has been extensively recognized in bacteria (Zheng et al., 1999; Andrews et al., 2003; Latifi et al., 2005). In E. coli, the expression of Fur is modulated by oxidative stress response regulators, and Fur directly or indirectly regulates the expression of antioxidant enzymes. 116 Capítulo 1 Anabaena sp. PCC 7120 has a quorum of oxidative stress defenses, including Mnand Fecontaining SODs (Li et al., 2002), peroxidases (Cha et al., 2007), glutathione reductase (Jiang et al., 1995) and several non-characterized CATs. In our experiments, the overexpression of FurA decreased both CAT and SOD activities, and had different effects of the transcriptional pattern of SODs, thiol-peroxidases and glutathione reductase. However, the results suggest that FurA does not directly regulate the expression of these antioxidant enzymes according to EMSA analyses. This fact could reflect a possible regulatory cascade or an indirect pathway of regulation of antioxidant enzyme gene expression by FurA, as previously described in other bacteria (Masse & Gottesman, 2002). Likewise, the existence of two additional Fur homologs in Anabaena sp. (Hernández et al., 2004a) makes it possible that there are other Fur-mediated regulation pathways, as described in microorganisms with more than one Fur protein (Horsburgh et al., 2001). In cyanobacteria, siderophore-mediated iron uptake is thought to be a contributing factor in their ability to dominate eukaryotic algae. Anabaena sp. PCC 7120 synthesizes schizokinen as its major siderophore, although it also shows iron uptake from aerobactin and ferrioxamine B (Goldman et al., 1983). Recently, Nicolaisen and co-workers described an outer membrane transporter for schizokinen in Anabaena, named SchT, whose expression is induced under iron-limited conditions (Nicolaisen et al., 2008). Our results indicate that schT is a direct target of FurA. Unexpectedly, most of the novel and previously described FurA direct targets seemed to be up-regulated rather than down-regulated in a transcriptional repressor overexpression background, including those recognized as iron-responsive genes. Additionally, the transcriptional patterns observed in SOD genes resembles those described in wild-type strains of P. aeruginosa (Hassett et al., 1996) and E. coli (Dubrac & Touati, 2000) after iron deprivation. It has been previously hypothesized that Fur proteins might act as ferrous 117 Capítulo 1 118 ion “buffers” in the cell, and consequently have a dual action during redox stress, regulating the iron uptake and iron storage systems, but also themselves increasing the Fe2+-binding capacity of the cytosol (Andrews et al., 2003). Since metal co-repressors seem to be essential for FurA DNA binding, we speculate that the high level of FurA overexpression achieved by the strain AG2770FurA using the PpetE-pAM2770 system strongly reduces the free iron pool in the cytosol and leads to the release of the corepressor from some FurA-Fe2+ complexes, allowing the transcription of target genes. A similar phenomenon has been observed in Saccharomyces cerevisiae when ferritins were overexpressed under iron-replete conditions (Kim et al., 2007). Our data provide evidence that in Anabaena sp. PCC 7120, FurA acts directly or indirectly on the expression of genes involved in a variety of physiological processes, including iron metabolism, cellular morphology, photosynthesis and defense against oxidative stress. Taken together, the results strongly support the hypothesis that, as other Fur homologs described in heterotrophic bacteria, FurA is a global transcriptional regulator in cyanobacteria. Capítulo 2 maps in biological variation analysis module. The internal standard image gel with the greatest number of spots was used as a master gel. Average ratio and unpaired Student's ttest were calculated between groups, applying the False Discovery Rate (Bland & Altman, 1995) to reduce false positives. Protein spots with an average ratio ≥ ± 1.5 and a p < 0.05 were considered as differentially expressed with statistical significance between the groups compared. 2.3.5 MALDI-TOF MS analysis and protein identification After the fluorescence scanning, the 2-DE gels were stained following the colloidal Coomassie blue protocol (Neuhoff et al., 1988). Protein identification was done at the Proteomic Facility from Universidad Complutense de Madrid-Parque Científico de Madrid, Spain (UCM-PCM), a member of ProteoRed Network. Spots of interest were manually excised from micro preparative gels using biopsy punches. Proteins selected for analysis were in-gel reduced, alkylated and digested with trypsin according to Shevchenko (Shevchenko & Shevchenko, 2001). Briefly, spots were washed twice with water, shrunk 15 min with 100% acetonitrile and dried in a Savant SpeedVac (Thermo Electron) for 30 min. Then, the samples were reduced with 10 mM dithioerythritol in 25 mM ammonium bicarbonate for 30 min at 56°C and subsequently alkylated with 55 mM iodoacetamide in 25 mM ammonium bicarbonate for 15 min in the dark. Finally, samples were digested with 12.5 ng μl-1 sequencing grade trypsin (Roche) in 25 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5) overnight at 37°C. After digestion, the supernatant was collected and 1 μl was spotted onto a MALDI target plate and allowed to air-dry at room temperature. Then, 0.4 μl of a 3 mg ml-1 of α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid matrix (Sigma) in 50% acetonitrile were added to the dried peptide digest spots and allowed again to air-dry at room temperature. 125 Capítulo 2 MS analyses were performed in a MALDI-TOF/TOF spectrometer 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems). The instrument was operated in reflector positive ion mode, with an accelerating voltage of 20000 V. All mass spectra were internally calibrated using auto-digested trypsin peptides. MALDI-TOF spectra with a S/N > 20 were collated and represented as a list of monoisotopic molecular weights. Proteins for which peptide mass fingerprints provided an ambiguous identification were subjected to MS/MS sequencing analyses. MALDI TOF/TOF fragmentation spectra with a signal-to-noise > 10 were collected by selecting the suitable precursor ions of each MALDI-TOF peptide mass map. Fragmentation was carried out using the acquisition method 1 kV ion reflector mode CID on and precursor mass window ± 10 Da. For protein identification, the non-redundant NCBI database was searched using MASCOT 2.1 (www.matrixscience.com) through the Global Protein Server v3.6 from Applied Biosystems. The MASCOT search parameters were: (i) species: all; (ii) allowed number of missed cleavages: 1; (iii) fixed modification: carbamidomethyl cysteine; (iv) variable modification: oxidized methionine; (v) peptide tolerance: ± 50-80 ppm; (vi) MS/MS fragment tolerance: ± 0.3 Da; and (vii) peptide charge: +1. Identifications were accepted as positive when at least 4 matching peptides and at least 10% peptide coverage of theoretical sequences matched, setting the probability score at p < 0.05. The CyanoBase (http:// genome.kazusa.or.jp/cyanobase) nomenclature was followed for gene identity assignation. 2.3.6 Reverse transcription (RT)-PCR Total RNA from exponentially growing Anabaena sp. strains was isolated as described previously (Olmedo-Verd et al., 2005). Samples of 1 μg RNA were heated at 85°C for 10 min and used as template for the first strand cDNA synthesis. Residual DNA in RNA preparations was eliminated by digestion with RNase-free DNase I (Roche). The absence 126 Capítulo 2 of DNA was checked by PCR. Reverse transcription was carried out using SuperScript retrotranscriptase (Invitrogen) in a 20 μl reaction volume containing 150 ng of random primers (Invitrogen), 1 mM dNTP mix (GE Healthcare) and 10 mM DTT. The sequences of the specific primers used for RT-PCR reactions are defined in Table 2.S1. Housekeeping gene rnpB (Vioque, 1992) was used as a control to compensate for variations in the input of RNA amounts and normalize the results. Exponential phase of RT-PCR for each gene was determined by measuring the amount of PCR product at different time intervals. For the final results, 20-23 cycles at the early exponential phase were used in all genes analyzed. The PCR products were resolved by electrophoresis in 1% agarose gels, stained with ethidium bromide and analyzed using a Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad). Relative induction ratio for each gene was calculated as the ratio between signals observed in AG2770FurA and wild-type strains in at least two independent determinations. Signal assigned to each gene was corresponded to the intensity of DNA band in the agarose gel stained with ethidium bromide normalized to the signal observed for housekeeping gene rnpB in each strain (González et al., 2010). 2.3.7 Electrophoretic mobility shift assays The promoter regions of each gene of interest were obtained by PCR using the primers described in Table 2.S1. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were performed as described previously (Hernández et al., 2006a). Briefly, 120-140 ng of each DNA fragment were mixed with recombinant FurA protein at concentration of 300, 500 and 700 nM in a 20 μl reaction volume containing 10 mM bis-Tris (pH 7.5), 40 mM potassium chloride, 100 μg ml-1 bovine serum albumin, 1 mM DTT, 100 μM manganese chloride, and 5% glycerol. In some experiments, EDTA was added to a final concentration of 200 μM. To 127 Capítulo 2 insure the specificity of EMSA, the promoter region of Anabaena sp. nifJ (alr1911) gene (López-Gomollón et al., 2007a) was included as nonspecific competitor DNA in all assays. In addition, the promoter region of furA was included as positive control, (Hernandéz et al., 2004; Hernández et al., 2006a), while promoters from Anabaena sp. sodA and sodB genes were used as negative controls (González et al., 2010). Mixtures were incubated at room temperature for 20 min, and subsequently separate on 4% non-denaturing polyacrylamide gels in running buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine) at 90 V. Gels were stained with SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen) and processed with a Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad). Table 2.S1. Primers used in this study Primer Sequence (5´-3´) RT-PCR rnpB_up AGGGAGAGAGTAGGCGTTG rnpB_dw AAAAGAGGAGAGAGTTGGTGG alr4641_RT-up GCCTCCGCGTTGGTCAAC alr4641_RT-dw CGGGAGTCATGGTCTTTTCCC all1541_RT-up CGAGAAGGTCAAAGAGTTCCTC all1541_RT-dw GGCTTCTGAGCCACCAATTAATAC all0737_RT-up CTGGTGCAACTGCCAAGC all0737_RT-dw GCGCTACTGGCTGAGTTTCTAAC all5219_RT-up GCCCGTGATATTCGCTTAAC all5219_RT-dw GCACCAACACTACCGCCAC all5218_RT-up CCGGCTATCAAAGGTGTACC all5218_RT-dw CACACCAGCGTGCAGAGC all0865_RT-up GGGACTTCAATTAGAGCCGATG all0865_RT-dw CGCACATACTCGCCACTATGG all0982_RT-up GGGGAAGAATGATTATCCCAG all0982_RT-dw CCCTTCTACCATCACCTGTACATC alr3768_RT-up GATCATGACCTAACCAGAATGG 128 Capítulo 2 Table 2.S1. Primers used in this study (Cont.) Primer Sequence (5´-3´) alr3768_RT-dw CCGCTTGGGTACGGTCATC all3556_RT-up GCGATCGCAAGCTCTGCAAG all3556_RT-dw CGCGGCAATACAAGATTGTCC all1940_RT-up GGTGGGGATGGACACCAG all1940_RT-dw CCGGTCGTCTGTAAGGATG EMSA PfurA_up CTCGCCTAGCAATTTAACAAC PfurA_dw GCCTTGAGCGAAGTATTTGTC PnifJ_up GCCTACTCTGCGAGTTCTCCG PnifJ_dw GGCCTGTGAGAGTTGCTGCAC PsodA_up GATAGAATCAATGACTGCTC PsodA_dw GTTGTTGCCTCTTATTTG PsodB_up GCTTAGTAGTCCCTTTGC PsodB_dw CATTTTGTGAAGTCCTCTC Pall0865_up CGAGGTAGCCGCAGATAATAG Pall0865_dw GCTGCGGACTGCCATTG Pall3556_up CGATAATGGGATTGGCATGAG Pall3556_dw GCGATCGCCATTGCCTAAC Pall1541_up CCACCAAGCAGCTTTGAC Pall1541_dw GGTGACTTGAGGAACTCTTTGAC Palr4641_up CATCCATTTGCTACTCAAAATCG Palr4641_dw CCTGATCAACTACAGCTGTTGC Pall0737_up CCTATCCACTGCGGCGG Pall0737_dw CTACTAGCTTGAGCCACTTCAAG Pall5219_up CCTCCACAATTACAGAAAGATTC Pall5219_dw GGGTACTTGTAAGCATGAATAGC Pall5218_up GGGTTGTGAATAAGCAGGAG Pall5218_dw GGGCATAAGTAGCGATTTC Palr3768_up CCTTACTTTCATAAAGTTGAC Palr3768_dw CACTCATCGTTACACTCACTC Pall0982_up GGCTGCTGATGTCACTATCC Pall0982_dw CCGCATATGAAATTCCCTC Pall1940_up CTTCGGCTACACCTGCG 129 Capítulo 2 Table 2.S1. Primers used in this study (Cont.) Primer Sequence (5´-3´) Pall1940_dw CGCGATATTGAACGACTAAG Ironboxfrag1-5_up CCTTGTGATTGGAGTTTATAC Ironboxfrag1_dw CTTTTAATCAAGATTAGTGAAAATC Ironboxfrag2_dw GCTTATTGAGAATATTTATTAAAC Ironboxfrag3_dw GATTTGCAACAAACATTG Ironboxfrag4_dw GAATATAACAAATATTTGGAGTG Ironboxfrag5_dw CTCAACAAAGCTTGTTAATTG Ironboxfrag6_up GCAATGTTTGTTGCAAATCAC Ironboxfrag7_up TCCAAATATTTGTTATATTC Ironboxfrag8_up CTCAATTAACAAGCTTTGTTGAG Ironboxfrag9_up GTTGAGAAAAATTAGTATGACTG Ironboxfrag6-9_dw GCTTGTGTCCTTCGCCTAATTC 2.4 RESULTS 2.4.1 Proteomic profiles of Anabaena wild-type and furA-overexpressing strains In order to analyse the effect of FurA overexpression on the Anabaena proteome, we cultured wild-type Anabaena sp. PCC7120 and its derivative furA-overexpressing strain AG2770FurA in standard BG-11 medium to mid-log phase in triplicate experiments. The set of six samples was treated with a multidetergent buffer in order to maximize protein extraction, and whole-cell cleared lysates were subjected to 2-D DIGE analysis. Using a pH gradient of 3-11, a total of 1326 different protein spots could be observed in each gel image. After gel-to-gelmatching, PMF analysis was performed on the spots for which abundance was considered as significantly different (≥ ± 1.5-fold) between the wildtype and furA-overexpressing strains. Based on these criteria, a total of 23 spots showed significant different expression (Fig. 2.1). Globally, more proteins showed underexpression (n=15) than overexpression (n=8) in the AG2770FurA strain in relation to the wild-type. 130 Capítulo 2 pH 3 pH 11 A 10 KDa 150 KDa B Figure 2.1. 2-DE profile of the compared proteomes of Anabaena sp. strains PCC 7120 (wild-type) and AG2770FurA (furA-overexpressing strain, derivative from PCC 7120). One of the three gels obtained is shown. (A) Spots identified by fluorescence; protein extracts from AG2770FurA and wild-type strains were respectively labelled with Cy3 and Cy5 fluorescent dyes, while a pooled internal standard was labelled with Cy2. Red spots corresponded to proteins that are more abundant in the wild-type, green spots to proteins that are more abundant in the furA-overexpressing strain, and yellow spots to proteins that are equally abundant in both strains. (B) Spots visualized by staining with Coomassie blue; numbered spots corresponded to those that vary in intensity ≥ 1.5-fold (p < 0.05) between both strains. 131 Capítulo 2 132 These spots were excised from gel and subject to PMF analysis in order to identify their putative genes and to deduce their putative functions. Of these spots, 18 could reliably be analyzed by MS, yielding a total of 10 different identified proteins (Table 2.1), which were classified according to their putative biological functions. Thus, proteins differentially expressed by Anabaena strain AG2770FurA appeared involved in a variety of cellular processes including photosynthesis, energy metabolism, oxidative stress defences, redox regulation, DNA replication, signal transduction mechanisms, thiamine biosynthesis and heterocyst differentiation. Notably, proteins involved in oxidative stress defences and redox regulation, like the peroxiredoxins Alr4641 and All1541, and the thioredoxin reductase TrxB (all0737) displayed the most striking changes in protein levels (Table 2.2). Three of the 10 identified proteins displayed more than one spot on the 2-D DIGE gels. Thus, the CO2 concentrating mechanism protein CcmM (all0865) was found in six spots with different pI but grouped, as expected (Long et al., 2010), in two molecular sizes, all of them showing similar average volume ratios. Likewise, the heterocyst differentiation protease Abp1 (all1940) and the thioredoxin reductase TrxB (all0737) appeared in three and two spots at different pI values, respectively (Fig. 2.1B), maybe as a result of posttranslational modifications. Capítulo 2 Table 2.1. List of proteins differentially expressed by the furA-overexpressing strain AG2770FurA, identified by mass spectrometry Spot Gene IDa Protein descriptiona Functional categoryb NCBI access no.c Mrd pId Scored Sequence coveraged Peptides matchedd 258 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 113 15 6 260 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 139 21 8 267 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 245 10 4 268 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 223 10 4 691 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 55 TGSWTSCQPIEAR (55)e 692 all0865 CO2 concentrating mechanism protein, CcmM FS NP_484908 59827 6.77 163 12 5 431 all3556 Succinate-semialdehyde dehydrogenase EM NP_487596 49018 5.13 92 YYAENAADFLADVSVK (61)e TDASHSFVR (32)e 962 all1541 Peroxiredoxin 2 family protein/glutaredoxin OD NP_485581 27692 5.02 89 33 9 1219 alr4641 Peroxiredoxin OD NP_488681 22731 4.87 268 43 5 415 all0737 Thioredoxin reductase, TrxB RR NP_484780 53356 5.53 312 19 6 416 all0737 Thioredoxin reductase, TrxB RR NP_484780 53356 5.53 298 19 6 374 all5219 Putative modulator of DNA gyrase, TldD DR NP_489259 53665 5.48 183 19 6 458 all5218 Putative modulator of DNA gyrase, PmbA DR NP_489258 48300 5.07 127 15 5 1040 alr3768 Two-component response regulator, OrrA ST NP_487808 26219 5.33 153 30 5 445 all0982 Thiamine biosynthesis protein, ThiC TB NP_485025 51180 5.62 329 14 5 133 Capítulo 2 134 Table 2.1. List of proteins differentially expressed by the furA-overexpressing strain AG2770FurA, identified by mass spectrometry (Cont.) Spot Gene IDa Protein descriptiona Functional categoryb NCBI access no.c Mrd pId Scored Sequence coveraged Peptides matchedd 371 all1940 Protease, Abp1 HD NP_485980 59570 8.77 276 21 9 377 all1940 Protease, Abp1 HD NP_485980 59570 8.77 151 VPTSIQPYLDR (33)e IGTENYQAEKPLLER (35)e QLDDIVAVTPADIQR (83)e 381 all1940 Protease, Abp1 HD NP_485980 59570 8.77 98 28 15 aGene identification and protein description according to the cyanobacteria genome database CyanoBase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). bFunctional categories: FS, photosynthesis; EM, energy metabolism; OD, oxidative stress defences; RR, redox regulation; DR, DNA replication; ST, signal transduction mechanisms; TB, thiamine biosynthesis; HD, heterocyst differentiation. cAccession number from the NCBI Protein resource (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). dTheoretical Mr and pI (calculated from the amino acid sequence of the translated gene), score, sequence coverage and number of peptides matches as per Mascot Search results. eAmino acid sequence identified by MS/MS; the ion score is indicated in parentheses. Capítulo 2 The EMSA results indicated that FurA bound with higher affinity to the promoter fragment III, which distinctively included an A/T-rich sequence that covers the -35 region. Interestingly, the FurA-fragment III complex yielded a retarded single defined band in EMSA gels, in contrast to the smeared bands observed with larger fragments or those commonly obtained with complete target promoters in FurA binding assays, a fact that could indicate the existence of secondary siteswith less affinity that causes polymerization of the protein and extended DNA protection. However, gel retardation assays using a 27bp synthetic DNA sequence containing the putative iron boxes showed only a quite feeble binding of FurA (Fig. 2.4B), suggesting that the regulator could not efficiently recognize its binding site in such short fragment. Thus, a proper DNA conformation that apparently takes place in fragment III seems to be necessary for efficient recognition and high affinity bindings, rather than a define iron box sequence. 2.5 DISCUSSION Comparative global analyses of the transcriptomes and proteomes for fur deletion mutants and their parental wild-type strains have been extensively used to characterize Fur regulons in several bacteria (Baichoo et al., 2002; McHugh et al., 2003; Wan et al., 2004; Danielli et al., 2006; Gao et al., 2008). However, gene knockout not always resulted in the method of choice to define gene function in the cell, especially in the case of essential genes, when silencing implies death. Overexpression of such genes, including transcriptional regulators, often leads to overcome this limitation and constitutes an alternative tool to describe functions, unravel mechanism of regulation or identify direct targets within regulatory networks (Agervald et al., 2010; Liu & Golden, 2002; Olmedo-Verd et al., 2005; Wu et al., 2004). 141 Capítulo 2 It is interesting to note that overexpression of FurA induced two different effects on the pattern expression of the direct target genes described here. Whereas some targets resulted down-regulated, as expected under a transcriptional repressor overexpression background, others appeared up-regulated. Previous studies show an up-regulating effect of FurA overexpression on the transcriptional pattern of well-recognized iron-responsive FurA direct targets, including the siderophore outer membrane transporter SchT and the iron stress-induced protein IsiA (González et al., 2010). Since metal co-repressor appeared essential for the in vitro DNA-binding to these promoters, the observed up-regulating effect could result from a sudden decrease of the free iron pool in the cytosol by a “buffering” action of the overexpressed FurA protein. However, differences in the DNA binding affinity of FurA to different targets in vivo, as well as the possible combined action of other transcriptional regulators could influence the final expression pattern of FurA targets in the furA-overexpressing strain. The most dramatic changes in protein abundance observed in the present work occurred in antioxidant enzymes. A marked repression of two peroxiredoxins (alr4641 and all1541) in the furA-overexpressing strain was confirmed to be at the transcriptional level. Regulation of peroxiredoxins expression by Fur has been previously reported in heterotrophic bacteria (Lee et al., 2004; Wan et al., 2004). As other photosynthetic organisms which standardly produce substantial amount of reactive oxygen species as metabolic intermediaries, Anabaena is equipped with an array of antioxidant molecules including two superoxide dismutases, several peroxidases and catalases (Li et al., 2002; Cha et al., 2007). Peroxiredoxins, a superfamily of thiol-specific peroxidases which catalyse the reduction of a broad range of different peroxides including H2O2, alkyl hydroperoxides and peroxinitrite (Tripathi et al., 2009), are specially abundant in Anabaena sp. PCC 7120 (Cha et al., 2007; Latifi et al., 2007; Mishra et al., 2009). The down-regulation of antioxidant 142 Capítulo 2 enzymes under a FurA overexpression background observed here is consistent with previous results in physiological studies of the AG2770FurA strain, which reflected dramatic drops in both catalase and superoxide dismutase activities, as well as decrease in transcript levels of iron-containing superoxide dismutase SodB and the log-phase thiolperoxidases GCT1 (alr3183) and GCT3 (all2375) (González et al., 2010). However, neither promoters of superoxide dismutases nor those of GCT1/GCT3 peroxidases showed specific binding to FurA in EMSA analyses, suggesting an indirect mechanism of regulation orchestrated by FurA or the other two interconnected ferric uptake regulators of Anabaena, FurB and FurC (Hernández et al., 2004a). By contrast, specific bindings to the promoters of the differentially expressed peroxiredoxins Alr4641 and All1541 were observed in the present study, indicating that these two proteins are direct targets of FurA. Taken together, the results of both studies with the strain AG2770FurA suggest the presence of different types of regulation of antioxidant enzymes expression via Fur in Anabaena. Other previously recognized direct targets of FurA with proved role in protecting cells from oxidative stress damage are the DpsA-homologue Alr3808 (Hernández et al., 2007) and the DNA protecting protein FurB (López-Gomollón et al., 2009). Thioredoxin reductase TrxB (all0737) was also found to be significantly down-regulated in the AG2770FurA strain compared to the wild-type. Levels of TrxB transcripts showed a sensible reduction under a FurA overexpression background, while FurA specifically binds to the trxB promoter in EMSA. Notably, previous studies have also demonstrated specific binding of FurA to the thioredoxin (trxA) promoter (López-Gomollón et al., 2007a). Thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH, known as the thioredoxin system, is an ubiquitous mechanism of redox regulation of protein function and signalling, but also a cell antioxidant that maintain the cytosol redox status (Arner & Holmgren, 2000; Koharyova & 143 Capítulo 2 Kolarova, 2008). Thioredoxins, with a dithiol/disulfide active site, are the major cellular protein disulfide reductases, serving as electron donors for a variety of enzymes and transcriptional factors, thereby modulating their activities. In plants and cyanobacteria, several photosynthetic enzymes are regulated by light via ferredoxin/thiorredoxin, a redox regulatory cascade where ferredoxin receives reducing equivalents from the photosynthetic electron transport in the light and reduces Trx by means of ferredoxin-Trx reductase (Lindahl & Florencio, 2003). Like other member of the Fur family, the PerR regulator of Sthaphylococcus aureus (Horsburgh et al., 2001), FurA appears to have a direct regulatory role in transcription of genes for the thioredoxin system and thiol-peroxidases in Anabaena. Controlling the thioredoxin/thioredoxin reductase expression, FurA could regulate not only the expression of a variety of proteins and enzymes, but also indirectly modulate their functions in the cell, connecting thereby iron metabolism, redox signalling and oxidative stress defences. Photosynthesis is a major iron-consuming process in phototrophic microorganisms. Iron is an essential component of every membrane-bound protein complex and other mobile electron carriers of the light reactions (Ferreira & Strauss, 1994). Considering the wide range of iron-deficiency mediated alterations in microbial photosynthesis and carbon metabolism, as well as the observed changes in photosynthesis-related gene expression patterns during iron limitation (Allen et al., 2008; Ferreira & Strauss, 1994; Singh & Sherman, 2000), it is highly likely that iron-responsive transcriptional regulators directly mediate some of such adaptive responses. Previous studies have indicated direct FurA regulation on some photosynthesis genes expression. Specific in vitro binding of FurA to promoters of RuBisCo large subunit (alr1524), chlorophyll-binding protein IsiA (all4001), flavodoxin (alr2405) (López-Gomollón et al., 2007a) and photosystem II reaction-center protein D1 (alr3742) (González et al., 2010) has been clearly demonstrated by EMSA. In 144 Capítulo 2 the present work, the β-carboxysome shell protein CcmM (all0865), which forms two independently translated peptides of different sizes due to an internal ribosomal entry site within the ccmM transcript (Long et al., 2010), appeared significantly up-regulated under a FurA overexpression background, while specific binding occurred in EMSA. Hence, Fur proteins in cyanobacteria play novel regulatory functions not previously described in ynthesis 0 ó heterotrophic bacteria. Punctual mutations or knockout of fur genes have been usually reported to have pleiotropic effects (Friedman et al., 2006; McHugh et al., 2003; Staggs et al., 1994; Thompson et al., 2002). Similarly, furA overexpression in Anabaena sp. appeared to have a broad effect on gene expression profiles (González et al., 2010). In the present study we observed significant changes in both protein abundance and mRNA levels for a variety of genes involved in different cellular processes including tricarboxylic acid cycle (all3556), DNA replication (all5218 and all5219), signal transduction (alr3768), and thiamine bios (all0982). All of these genes showed specific binding to FurA in EMSA analyses. Finally, we found an unexpected evidence of a putative FurA direct modulation of heterocyst differentiation under the nitrogen-replete conditions employed in our experiments. As a heterocyst-forming diazotrophic bacterium, Anabaena sp. PCC 7120 provides a model for the study of nitrogen fixation and prokaryotic cell differentiation (Zhang et al., 2006). Previous studies have demonstrated a cross-talk between FurA and the trigger regulator of the heterocyst differentiation process, NtcA, identifying overlapping genes in both regulons (López-Gomollón et al., 2 07a; L pez-Gomollón et al., 2007b). Under combined nitrogen starvation, NtcA senses the increase of 2-oxoglutarate levels and activates its own transcription as well as a complicated regulatory cascade which results in the development of morphologically and physiologically differentiated cells specialized in nitrogen fixation called heterocysts 145 Capítulo 2 (Flores & Herrero, 2010). Heterocyst differentiation involves a chorus ofmetabolic signals, transcriptional regulators and enzymes. Like NtcA, some of the proteins implicated in this process are constitutively expressed under nitrogen-replete conditions, including the DNA binding proteins Abp1 (all1940) and Abp2 (all1939), denoted as a protease and a processing proteinase, respectively, due to their extensive similarity to proteins that have such roles in other bacteria (Koksharova & Wolk, 2002b). Abp1 andAbp2 are encoded by two closely spaced ORFs that may constitute an operon. Both proteins have demonstrated in vitro specific binding to an upstream sequence of hepC, while their deletion mutants showed developmental defects and a greatly reduced or slowed down expression of neighbouring genes hepC and hepA, required for the normal formation of the polysaccharide layer of heterocyst envelope (Koksharova & Wolk, 2002b). Here we observed a significant down-regulation of protease Abp1 under a FurA overexpression background, a phenotype which could resemble a natural iron stress response in Anabaena. Iron is important in heterocyst function because of its presence in several key enzymes of nitrogen fixation like nitrogenase, ferredoxin, and uptake hydrogenase. However, iron is also crucial for other essential processes like photosynthesis and respiration. Under iron limitation, the marine cyanobacterium Trichodesmium erythraeum selectively sacrifices nitrogen fixation to conserve iron for photosynthetic and respiratory electron transport (Shi et al., 2007). Similarly, in a context of iron deprivation, Anabaena appears to slowdown the heterocyst differentiation in order to reduce iron-consuming processes and guarantee viability. Little is currently understood about the sequences recognized by FurA within its target promoters. Previous DNaseI footprinting assays with promoters of two known FurA regulated genes, furA and isiB, revealed two quite near A/T-rich protected sites in both promoters covering a total region of 77and 87-bp, respectively (Hernández et al., 2006a). 146 Capítulo 2 147 With the increased number of FurA regulon components described so far, we further analyzed the architecture of sequences that could govern the binding of this transcriptional regulator to target promoters. A consensus DNA sequence for FurA binding was illdefined, since the target promoters described here and other previously recognized shared only minimal homology. Furthermore, gel retardation assays failed to define a functional FurA box, whereas strong in vitro binding required large DNA fragments. Taking together, the results seem to suggest that FurA recognizes particular DNA structures of A/T rich sequences with characteristic local conformations, rather than a defined iron box sequence for proper regulation of its target genes, as occurs with Fur of Helicobacter pylori (Carpenter et al., 2009). Little variations in these conformations would explain the different affinities observed in vitro with different targets, and could also explain how a ems to be determined by secondary structures rather than by a defined iron box sequence. simple protein controls the expression of a variety of genes with different functions. To summarize, the comparative proteomic analysis presented here led to identify 10 novel direct targets of FurA involved in variety of cellular functions, including major cyanobacterial processes like photosynthesis and heterocyst differentiation. Although this study is not a full description of the regulon, the findings provide new evidences that FurA functions as a global transcriptional regulator in Anabaena sp. PCC 7120, unravelling novel regulatory functions of Fur proteins in cyanobacteria. Likewise, the results suggest that binding sites in DNA se 148 Capítulo 3 CAPÍTULO 3 FurA es el regulador máster de la homeostasis del hierro en Anabaena sp. PCC 7120 González A, Bes T, Valladares A, Peleato ML, Fillat MF. FurA is the master regulator of iron homeostasis and modulates the expression of tetrapyrrole biosynthesis genes in Anabaena sp. PCC 7120. Environmental Microbiology 2012, doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02897.x (In press). 149 Capítulo 3 3.1 ABSTRACT Knowledge on the regulatory mechanisms controlling iron homeostasis in cyanobacteria is limited. In Anabaena sp. PCC 7120, the ferric uptake regulator FurA is a constitutive and essential protein whose expression is induced under iron deprivation. Our previous analyses have shown that this protein acts as a global transcriptional regulator, controlling the expression of several genes belonging to different functional categories, including schT, a gene coding for a TonB-dependent schizokinen transporter. In the present study we analyzed the impact of FurA overexpression and iron availability on the transcriptional modulation of a broad range of Anabaena iron uptake, transport, storage, and cellular iron utilization mechanisms, including enzymes involved in siderophore biosynthesis, TonBdependent siderophore outer membrane transporters, siderophore periplasmic binding proteins, ABC inner membrane permeases, ferritin Dps family proteins, and enzymes involved in tetrapyrrole biosynthesis. By combining reverse transcription-PCR analyses, electrophoretic mobility shift assays and DNase I footprinting experiments, we defined a variety of novel direct iron-dependent transcriptional targets of this metalloregulator, including genes encoding at least five enzymes involved in the tetrapyrrole biosynthesis pathway. The results unravel the role of FurA as the master regulator of iron homeostasis in Anabaena sp. PCC 7120, providing new insights into the Fur regulons in cyanobacteria. 3.2 INTRODUCTION The control of iron homeostasis in oxygenic photosynthetic organisms requires an effective balance between the use of iron as an essential nutrient and as a catalyser of reactive oxygen species (ROS) formation. Iron plays a critical role in photosynthetic electron transfer, serving as cofactor of every membrane-bound protein complex and other mobile electron carriers on the light reactions (Ferreira & Strauss, 1994). Thus, the demand for 150 Bibliografía Lloyd, G., Landini, P. & Busby, S. (2001). Activation and repression of transcription initiation in bacteria. Essays Biochem 37, 17-31. Maciag, A., Dainese, E., Rodriguez, G. M. & other authors (2007). Global analysis of the Mycobacterium tuberculosis Zur (FurB) regulon. J Bacteriol 189, 730-740. Madigan, M. T., Martinko, J. M. & Parker, J. (2003). Brock Biology of Microorganisms, 10th edn. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall/Pearson Education. 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Hydroxylamine reduction to ammonium by plant and cyanobacterial hemoglobins. Biochemistry 50, 10829-10835. 262 Agradecimientos Agradecimientos Muchos han sido los compañeros que de una forma u otra durante estos cinco años de experiencia profesional han contribuido a fortalecer mi formación como investigador y a la realización de este trabajo, a todos mi más sincero agradecimiento. Quisiera agradecer de modo especial a quienes han sido durante estos años mis más cercanos maestros y compañeros de trabajo: A mi tutora Dra. María Fillat y a la Dra. Marisa Peleato, por sus acertadas sugerencias, confianza y experiencia entregadas desde el principio. Gracias por el apoyo incondicional, tanto en el plano científico como en el personal, siempre les estaré agradecido. A la Dra. Teresa Bes, no solo por la ayuda y consejos brindados, sino por sus valiosas críticas y las buenas discusiones científicas. A los compañeros de laboratorio durante estos años: Emma, Silvia, Laura Botello, Violeta, Esther, Tais, Irene, pero muy especialmente a Vladimir, Xabi, Angela, Laura Calvo y David por la amistad y las cervezas compartidas. A Emilio, Renzo, Juanjo, Reyes, Laura, Sonia, Ana, por los ratos libres y los Oktoberfests. A Marta Fajes por toda la ayuda brindada, tu labor es encomiable. A Pili, Mariví e Ismael por su imprescindible asistencia en todo momento. Gracias por la paciencia y la constante disposición de ayudar. A la Dra. Raquel Moreno por su esmerada contribución en las qPCRs, al Dr. José Ramón Peregrina por su asistencia en las lecturas espectrofluorométricas y a la Dra. Inmaculada Yruela por su ayuda con el electrodo de oxígeno. Al resto de los compañeros del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular que también dieron su aporte. Gracias a Ana Valladares, Sergio, Victoria y demás miembros del grupo de Biología del Desarrollo en las Cianobacterias del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Mi 269 Agradecimientos 270 especial agradecimiento a los Dres Enrique Flores y Antonia Herrero por acogerme en su laboratorio como un miembro más durante mi breve estancia en el IBVF. Mi total agradecimiento al Programa de Becas de Doctorado del Banco Santander, sin la cual el inicio de mis estudios hubiera sido imposible. Gracias al Programa Europa de Caja Inmaculada por la financiación de mi estancia en el IBVF. Doy gracias por la nueva familia que inesperadamente he encontrado tan lejos de casa. En Zaragoza he realizado mis estudios de Doctorado, pero también he encontrado a un segundo padre, Juanjo, y a una extraordinaria mujer, amiga, compañera. Soy afortunado de tenerlos. Gracias a mi suegro por todo el cariño y la confianza depositados, no te defraudaré. De Marimar, qué puedo decir de Marimar? Lo eres todo para mí. Agradezco a mi padre por haber sabido guiarme por el camino correcto, y a mi madre por su amor infinito; a ellos les debo lo que soy. Gracias a mi hermana por su cariño, su apoyo constante, su paciencia y consejos. Ha sido duro tenerlos lejos. A todos, muchas gracias.