Repositorio Institucional de Documentos

2013 14 Ariel Gaspar Ramírez Labrada Mecanismo de la apoptosis inducida por el inhibidor de quinasas sorafenib en células de mieloma humano Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Naval Iraberri, Javier Marzo Rubio, María Isabel Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Ariel Gaspar Ramírez Labrada MECANISMO DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR EL INHIBIDOR DE QUINASAS SORAFENIB EN CÉLULAS DE MIELOMA HUMANO Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Naval Iraberri, Javier Marzo Rubio, María Isabel Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA  Universidad de Zaragoza TESIS DOCTORAL Mecanismo de la apoptosis inducida por el inhibidor de quinasas sorafenib en células de mieloma múltiple humano Ariel Gaspar Ramírez Labrada ÍNDICE 1.-ANTECEDENTES Y OBJETIVOS .................................................................................. 1 2.-INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 3 2.1.-MUERTE CELULAR ................................................................................................ 3 2.1.1.-Clasificación de la muerte celular ..................................................................... 3 2.1.2.-Apoptosis o muerte celular Tipo I ..................................................................... 5 2.1.2.1.-Proteínas implicadas en la regulación de la apoptosis ............................. 5 Caspasas ........................................................................................................... 6 Familia de proteínas Bcl-2 ................................................................................. 8 2.1.2.1.-Vía intrínseca .......................................................................................... 13 2.1.2.2.-Vía extrínseca ......................................................................................... 16 2.1.3.-Necrosis programada o muerte celular tipo III ............................................... 20 2.1.3.1.-Inducción de la necroptosis ..................................................................... 21 2.1.3.2.-Ejecución de la necroptosis .................................................................... 22 2.1.4.-Muerte celular asociada a autofágica o muerte celular de tipo II ................... 24 2.1.4.1.-Macroautofagia ....................................................................................... 25 2.1.4.1.-Vías de señalización de la autofagia ...................................................... 25 2.1.4.2.-Autofagia y muerte celular ...................................................................... 28 2.2.-MIELOMA MÚLTIPLE HUMANO ........................................................................... 33 2.2.1.- Microambiente de las células de mieloma .................................................... 34 2.2.2.-Características celulares ................................................................................ 35 2.2.2.1.-Cariotipo .................................................................................................. 35 2.2.2.2.- Alteraciones genéticas ........................................................................... 36 2.2.2.3.- Antígenos de superficie .......................................................................... 37 2.2.3.-Células madre y cáncer .................................................................................. 38 2.2.3.1-Células madres tumorales (CSCs)........................................................... 39 2.2.3.2-Células madres tumorales en mieloma múltiple humano (MM-CSCs) .... 41 2.2.4.-Farmacoterapia del mieloma múltiple humano .............................................. 44 2.2.5.-Sorafenib ........................................................................................................ 47 2.2.5.1.-Las proteínas Raf .................................................................................... 47 2.2.5.2.-Mecanismo de acción del sorafenib ........................................................ 49 2.2.6.-Inhibidores de mTORC ................................................................................... 51 2.2.7.-Inhibidor de Jak .............................................................................................. 52 3.- MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 55 ÍNDICE 3.1.- Cultivos celulares .................................................................................................. 55 3.1.1.- Materiales y medios de cultivo celulares ....................................................... 55 3.1.2.- Líneas celulares utilizadas ............................................................................ 55 3.1.3.- Mantenimiento de cultivos celulares ............................................................. 56 3.1.4.- Congelación y descongelación de líneas celulares ...................................... 56 3.1.5.- Co-cultivo de células estromales con células de mieloma múltiple .............. 57 3.2.- Estudio de proliferación, citotoxicidad, apoptosis y necrosis celular .................... 57 3.2.1Materiales y reactivos para estudios de proliferación y citotoxicidad ............ 57 3.2.2.- Fármacos citotóxicos y citostáticos ............................................................... 58 3.2.3.- Contaje y determinación de la viabilidad celular ........................................... 58 3.2.4.- Determinación de la proliferación celular ...................................................... 58 3.2.5.- Determinación simultánea del potencial mitocondrial (∆Ψm) y la translocación de fosfatidilserina ................................................................................................................ 59 3.2.6.- Citometro de flujo .......................................................................................... 60 3.2.7.- Análisis del ciclo celular................................................................................. 61 3.3.- Análisis de la expresión de proteínas ................................................................... 61 3.3.1.- Materiales y reactivos para análisis de la expresión de proteínas ................ 61 3.3.1.1.- Reactivos para la extracción e inmunoprecipitación de proteínas......... 61 3.3.1.2.- Materiales y reactivos para electroforesis de proteínas y transferencia a membranas .................................................................................................................... 61 3.3.1.3.- Anticuerpos y reactivos inmunoquímicos ............................................... 62 3.3.2.- Métodos para el análisis de proteínas por western blot ................................ 63 3.3.2.1.- Extracción y fraccionamiento de lisados celulares totales con detergentes .................................................................................................................... 63 3.3.2.2.- Inmunoprecipitación de proteínas .......................................................... 64 3.3.2.3.- Separación de proteínas celulares mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS .................................................................................................. 64 3.3.2.4.- Transferencia de las proteínas a membranas de PVDF ........................ 65 3.3.2.5.- Análisis de proteínas por inmunotransferencia y detección de los inmunocomplejos ........................................................................................................... 65 3.3.3.- Análisis de la expresión de proteínas por citometría .................................... 66 3.3.3.1.- Cambio conformacional de Bak y Bax ................................................... 66 3.3.3.2.- Determinación de caspasa 3 activa ....................................................... 66 3.3.3.2.- Determinación de Citocromo c ............................................................... 67 3.3.4.- Análisis de la localización de proteínas por microscopía de fluorescencia .. 67 3.3.5.- Marcaje de antígenos de superficie .............................................................. 68 ÍNDICE 3.4.- Transfecciones transitorias ................................................................................... 68 3.4.1.- Materiales y reactivos usados en las transfecciones transitorias ................. 68 3.4.2.- Transfección mediante electroporación con Nucleofector® ......................... 68 3.5.-Análisis de RNA ..................................................................................................... 69 3.5.1.- Reactivos utilizados en el análisis de RNA ................................................... 69 3.5.1.1.- Reactivos utilizados en la extracción y cuantificación de RNA total ...... 69 3.5.1.2.- Reactivos para la retro-transcripción de RNA (RT-PCR) ...................... 69 3.5.1.3.- Reactivos usados para el análisis de mRNA mediante RT-MLPA ........ 69 3.5.1.4.- Reactivos utilizados en el análisis de RNA a tiempo real (Real Time PCR) ............................................................................................................................... 70 3.5.1.5.- Productos utilizados para la electroforesis de DNA en gel de agarosa . 70 3.5.2.-Métodos utilizados en el análisis de RNA ...................................................... 70 3.5.2.1.- Extracción y cuantificación de RNA total ............................................... 70 3.5.2.2.- Retrotranscripción del RNA a cDNA (RT) .............................................. 71 3.5.2.3.- Análisis de la expresión de RNA por RT-MLPA ..................................... 71 3.5.2.4.- Electroforesis de DNA en gel de agarosa .............................................. 72 3.5.2.5.- Análisis de RNA mediante PCR en tiempo real (Real Time PCR) ........ 73 3.5.2.5.- Desarrollo de la PCR cuantitativa .......................................................... 74 3.6Obtención y análisis de células obtenidas a partir de muestras de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple .............................................................................................. 75 3.6.1.- Obtención de células plasmáticas a partir de aspirados de médula ósea .... 75 3.6.2.- Inmunofenotipado y marcaje de células plasmáticas .................................... 76 3.6.3.- Separación de poblaciones celulares mediante MACS (separación celular basada en campos magnéticos) ........................................................................................ 76 3.7.-Sobreexpresión mediante infecciones retrovirales ................................................ 77 3.7.1.-Generación de los retrovirus .......................................................................... 77 3.7.2.-Infección de células eucariotas con retrovirus ............................................... 78 3.7.3.-Obtención de líneas estables mediante clonaje por dilución limite ................ 78 3.8.- Desarrollo tumoral en ratones .............................................................................. 79 3.9.- Análisis de células madres tumorales de mieloma múltiple ................................. 79 3.9.1.- Marcaje con la sonda aldefluor ..................................................................... 79 3.10.- Análisis informático de datos .............................................................................. 80 3.10.1.- Estadística ................................................................................................... 80 3.10.2.- Análisis del efecto de la combinación de drogas ........................................ 80 ÍNDICE 4.-RESULTADOS .............................................................................................................. 81 4.1-El sorafenib induce apoptosis en células de mieloma múltiple .............................. 81 4.1.1.-El sorafenib inhibe la traducción de señales en células de mieloma múltiple 81 4.1.2.-El sorafenib induce muerte en células de mieloma múltiple .......................... 82 4.1.3.-La muerte celular inducida por el sorafenib es a través de la vía intrínseca de la apoptosis ........................................................................................................................ 85 4.1.4.-Las proteínas de la familia Bcl-2 juegan un papel crucial en la apoptosis inducida por el sorafenib .................................................................................................... 91 4.2.-El sorafenib muestra actividad antitumoral en modelos de mieloma múltiple ex vivo e in vivo ................................................................................................................................. 101 4.2.1.-El sorafenib muestra el mismo perfil de actividad frente a muestras de pacientes que el observado en las líneas celulares ......................................................... 101 4.2.2.-El sorafenib es activo in vivo en tumores generados en ratones nude ........ 103 4.3.-El sorafenib induce autofagia células de mieloma múltiple ................................. 104 4.4.-El sorafenib induce necroptosis en células de mieloma múltiple ........................ 108 4.5.-El Sorafenib muestra potencial en terapia combinada ........................................ 109 4.5.1.-La combinación de Sorafenib y Bortezomib debe ser personalizada .......... 110 4.2.2.- El Sorafenib sensibiliza a células a Apo2L/TRAIL ...................................... 112 4.2.3.-Sorafenib muestra un gran potencial en la combinación con varios fármacos .......................................................................................................................................... 115 4.6.-Optimización del análisis de presuntas células madres de mieloma múltiple. .... 122 5.-DISCUSIÓN ................................................................................................................ 129 5.1-El sorafenib induce apoptosis en células de mieloma múltiple de líneas celulares y de muestras de pacientes ..................................................................................................... 129 5.2.-El sorafenib induce autofagia y necroptosis en células de mieloma múltiple ...... 133 5.3.-El Sorafenib muestra potencial en terapia combinada ........................................ 136 5.4.- Optimización del análisis de presuntas células madres de mieloma múltiple. ... 143 6.-CONCLUSIONES ........................................................................................................ 147 6.-BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 149 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 1 1.-ANTECEDENTES Y OBJETIVOS En el pasado los fármacos antineoplásicos se identificaban mediante la detección a gran escala de sustancias químicas semisintéticas, sintéticas o productos naturales eficaces contra sistemas tumorales en animales, generalmente leucemias murinas. La mayoría de los agentes descubiertos en esta etapa (1950-1970) interactuaban con el DNA o sus precursores e inhibían la síntesis del material génico o causaban daño irreparable al DNA. En años recientes la identificación de nuevos fármacos se ha ampliado desde el área de los productos naturales y sustancias semisintéticas hasta campos totalmente nuevos basados en los avances en el conocimiento de la biología de las células normales y tumorales. El desarrollo de nuevos fármacos se basa en el diseño de moléculas que sean capaces de modular procesos moleculares vitales para las células. Uno de estos procesos celulares es la apoptosis. Esta fue descrita por Kerr en 1972 (Kerr et al. 1972) aunque no ha sido hasta los últimos 20 años que se ha dilucidado el mecanismo molecular por el que trascurre. Este es el principal mecanismo de supresión tumoral que es ejecutado por células no malignas como un mecanismo de protección para eliminar células dañadas o no saludables y que pueden ser potencialmente dañinas. La muerte celular por apoptosis se caracteriza por reducción del volumen celular, fragmentación y condensación nuclear, formación de “blebbing” y finalmente separación de los componentes celulares en el interior de los cuerpos apoptóticos. Durante la apoptosis ocurren una seria de eventos moleculares y bioquímicos que hacen que este sea un tipo de muerte muy controlado sobre el cual se ha tratado de influir mediante el uso de diferentes fármacos (Kroemer et al. 2009). Nuestro grupo de investigación tiene amplia experiencia en el estudio de la apoptosis y de fármacos antitumorales capaces de inducir apoptosis en células tumorales, principalmente de células procedentes de neoplasias hematológicas como leucemias y mieloma múltiple aunque también en células de tumores solidos como colon, páncreas y mama (Gamen et al. 1997; Perez-Galan et al. 2002; Gomez-Benito et al. 2005; Galan-Malo 2010; Lopez-Royuela et al. 2010). El MM es la segunda neoplasia hematológica más frecuente, después del linfoma no Hodgkin y constituye, aproximadamente, el 10% de todas las neoplasias hematológicas, y el 1% de todos los cánceres y causa el 2% de las muertes por cáncer. En Europa tiene una incidencia de 4,5-6,0/100000/año y una mortalidad de 4,1/100000/año (Harousseau and Dreyling 2010; Rajkumar 2011). Actualmente es una enfermedad incurable, aunque en los últimos años gracias a los nuevos fármacos ha aumentado la media de supervivencia, pasando de 3 a 7 años. No obstante se siguen necesitando nuevas moléculas que mejoren el tratamiento y las esperanza de vida de los pacientes de mieloma múltiple. Por ello, este trabajo se ha centrado en esta enfermedad y en el posible uso terapéutico del sorafenib, un fármaco aprobado para INTRODUCCIÓN 8 protein). Estas son una familia de proteínas originalmente identificadas en células de insectos infectadas por baculovirus (Crook et al. 1993). La familia de las IAP está formada por 8 proteínas muy conservadas en mamíferos y con diferentes patrones de expresión en varios tejidos. En los humanos se han identificado 6 de estas proteínas: NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein), c-IAP1/HIAP-2, c-IAP2/HIAP-1, XIAP/hILP (X-linked mammalian inhibitor of apoptosis protein), survivina y BRUCE, y todas se caracterizan por la presencia del dominio de 70-80 aminoácidos llamado BIR (baculoviral IAP repeat), de forma que todos los miembros de esta familia contienen de uno a tres copias de este dominio. Las IAPs se unen a las caspasas inhibiendo su acción, en particular se unen a las caspasas -9, -3 y -7 pero son incapaces de unirse y por tanto de inhibir a la caspasa 8 (Roy et al. 1997; Deveraux and Reed 1999; Mace et al. 2010). Las IAPs no son las únicas proteínas capaces de inhibir a las caspasas. Existen otras proteínas como c-FLIP la cual es capaz de inhibir la activación de la caspasa-8 inducida por la vía extrínseca de activación de la apoptosis. Esta proteína posee dos copias del dominio DED en su extremo N-terminal el cual es esencial para su mecanismo de acción. Existen tres isoformas principales descritas de esta proteína: c-FLIPL, c-FLIPS y c-FLIPR (Golks et al. 2005). Cuando cualquiera de estas isoformas son sobreexpresadas inhiben la activación de la caspasa 8 por la vía extrínseca de la apoptosis. Sin embargo la presencia en bajas concentraciones de la isoforma larga (c-FLIPL) facilita la activación de la caspasa 8 por heterodimerización (Boatright et al. 2004). Familia de proteínas Bcl-2 Esta familia de proteínas desempeña un papel clave en el control de la vía intrínseca de la apoptosis. Las proteínas de esta familia contienen de uno a cuatro dominios de homología con Bcl-2 (BH), llamados BH1, BH2, BH3 y BH4. Esta familia de proteínas se divide en dos subgrupos basados en su similitud estructural y funcional: las proteínas antiapoptóticas y las proteínas proapoptóticas (Figura 2.3) (Adams 2003; Youle and Strasser 2008; Chipuk et al. 2010). Las proteínas antiapoptóticas son las proteínas Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-W, Bcl-B y A1, y excepto Mcl-1 y A1, todas contienen los cuatro dominios BH. Los dominios BH1, BH2 y BH3 forman una cavidad hidrofóbica que permite la interacción con las proteínas sólo-BH3 (Cory and Adams 2002; Michels et al. 2005; Certo et al. 2006). Además, poseen un dominio hidrofóbico C-terminal que facilita su inserción en la membrana externa mitocondrial (OMM: outer mitochondrial membrane) donde se encuentran generalmente, aunque también se pueden encontrar en el citosol o unidas a la membrana del retículo endoplasmático. Estas proteínas evitan la ejecución de la apoptosis por unión directa a las proteínas proapoptóticas (Chipuk et al. 2010). Fi s ó B H tr a o p r c o m e n Fi el e x B a M o gura 2.3.-Fa m ó lo-BH3. Las a H 3, como su a nsmembran a Por otr o efectoras r oapoptótica o ntenían los ás reciente r n Mcl-1 (Kva gura 2.4.-Cu a dominio BH 3 x plicar la form a x o Bak mi e o dificado de ( T m ilia de las p r a ntiapoptótic a nombre lo in d a . o lado, las p r y las sólo - multidomini o dominios B H r evelan la pr e nsakul et al. a ndo Bax y B a 3 a través d e ación de est e e ntras que el T ait and Gre e oteínas Bcl-2 . a s y las proa p d ica, sólo el d r oteínas pro a - BH-3 (figu r o s carecían H 1, BH2 y B e sencia de u 2008). a k son activa d e l cual dimeri z e poro. Una p o otro plantea e n 2010). . Se subdivid e p optóticas pre s d ominio BH3, a poptóticas s r a 2.3). Or i del dominio H3 (Wei et a u n motivo B H d as sufren un z an para for m o stula que se que estas pr o e en tres gru p s entan los cu estas tambi é s e dividen e n i ginalmente BH4, es d e a l. 2001). Si n H 4 conserva d cambio conf o m ar el MOM P forma un ca n o teínas facilit a p os: antiapopt ó atro dominio s n pueden pr e n dos subtip se planteó cir, las prot e n embargo, u d o en estas p o rmacional qu e P . Existen do s n al proteico p o a n la formaci ó INTRO D ó ticas, proap o s , mientras q u e sentar o no e p os: las mult i ó que las e ínas Bak y u n estudio e p roteínas al e hace que s e s teorías que o r la oligomer ón de un po r D UCCIÓN 9 o ptóticas y u e las sólo e l dominio i dominios p roteínas Bax sólo s tructural igual que e exponga tratan de ización de r o lipídico. INTRODUCCIÓN 10 Proteínas sólo-BH3 activadoras directas: Bid, Bim y posiblemente Puma Proteínas sólo-BH3 sensibilizadoras/derepresoras: Bad, Puma, Noxa, Bik, Bmf, Bik La activación de estas proteínas conduce a la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (OMM) (Figura 2.4) por la formación del poro mitocondrial, MOMP (mitochondrial outer membrane pore permeabilization) (Rasola and Bernardi 2007). En condiciones normales, estas proteínas existen como monómeros inactivos, Bax en el citosol y Bak anclado en la membrana externa mitocondrial y una vez activadas Bax es traslocada a la OMM y ambas sufren cambios conformacionales que les permiten oligomerizar y formar el poro mitocondrial, lo cual desencadena diferentes acontecimientos a nivel mitocondrial y celular. Las proteínas sólo-BH3 juegan un papel crucial como sensores del estrés celular y como su nombre indica, tienen sólo el dominio BH3. Este dominio, formado por 9 aminoácidos, es necesario y suficiente para inducir apoptosis (Huang and Strasser 2000; Willis and Adams 2005; Shibue and Taniguchi 2006). Miembros de la subfamilia de las proteínas sólo-BH3 son las proteínas Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, Bmf, Hrk y Bik entre otras. A su vez estas se pueden subdividir en función de su capacidad para interactuar con las proteínas antiapoptóticas o con las proteínas multidominio. Las que interactúan sólo con las antiapoptóticas se llaman “sensibilizadoras” y/o “de-represoras”, en cambio las que pueden interactuar tanto con las antiapoptóticas como con las proapoptóticas se les llama “activadoras directas” (Bid, Bim y posiblemente Puma) y son capaces de inducir la activación de Bax y Bak (Figura 2.5). Estas proteínas están muy reguladas, tanto a nivel transcripcional, como es el caso de Puma, Noxa y Hrk, como a nivel post-transcripcional, como Bad y Bim. Esta última puede ser regulada por fosforilación por Erk, que activa su degradación por el proteasoma. También algunas proteínas sólo-BH3 puede ser activadas por cortes proteolíticos como Bid que es cortada por la caspasa 8 generando su forma activa tBid; que expone el dominio BH3. Además, cada una de estas proteínas tiene un perfil único y característico de unión a las proteínas antiapoptóticas lo que posiblemente permite un control más fino y específico en cada tejido y para cada estímulo apoptótico (Chipuk et al. 2010). Figura 2.5.-Clasificación de las proteínas sólo-BH3 y patrón de interacción con las antiapoptóticas. Bid y Bim serían las activadoras directas, aunque según algunas publicaciones Puma también podría ser incluida en este apartado, en cambio el resto de las proteínas sólo-BH3 serian sensibilizadoras o derepresoras. Modificado de (Chipuk et al. 2010) La activación de las proteínas de la familia de Bcl-2 determina que se ejecute la apoptosis en la célula. De todas estas proteínas, la activación de Bax y Bak provoca la permeabilización de la membrana mitocondrial y que se activen las caspasas y se lleve a cabo INTRODUCCIÓN 11 el desmantelamiento de la célula. La activación de Bax/Bak va a depender de las interacciones entre las proteínas Bcl-2 antiapoptóticas, las proteínas sólo-BH3 y las propias proteínas Bax y Bak. Existen diferentes modelos (Figura 2.6) que tratan de explicar los mecanismos por los que interactúan todas las proteínas de esta familia e inducen la activación Bax y Bak: El modelo directo: se basa en que existen al menos dos proteínas sólo-BH3 que son capaces de inducir directamente la activación de las proteínas multidominio Bax y Bak. Estas son Bid y Bim, aunque posiblemente Puma también podría realizar esta función, aunque existen datos contradictorios. Estas dos proteínas son capaces de inducir el cambio conformacional y la oligomerización de Bax y Bak. En el caso de la activación de Bax por Bid el primer paso es la asociación de Bid a la OMM, seguido del reclutamiento de Bax, el cual se encuentra en forma soluble en el citosol, luego Bax se ancla a la OMM y finalmente oligomeriza (Willis et al. 2007; Gavathiotis et al. 2008). Según este modelo el resto de las proteínas sóloBH3 actuarían desplazando a las activadoras de su unión con las antiapoptóticas, permitiéndo que activación de Bax y Bak (Figura 2.6A). No obstante, la observación de que la apoptosis dependiente de Bax/Bak puede ser realizada en ausencia de Bim y Bid sugiere la existencia de un mecanismo alternativo en el cual serían innecesarios los activadores directos (Willis et al. 2007). El modelo indirecto o de desplazamiento: las proteínas sólo-BH3 actúan fundamentalmente uniéndose a las proteínas antiapoptóticas y no a las proapoptóticas Bax/Bak, ya que este modelo supone que existe una cierta actividad basal de Bax y Bak que es inhibida por las antiapoptóticas al unirse a ellas. Por lo que Bax/Bak son liberada de su inhibición, al unirse, las proteínas sólo-BH3, a las antiapoptóticas con mayor afinidad, permitiendo de este modo la activación y oligomerización de Bax/Bak. Según este modelo Mcl1 y Bcl-XL se unirían a Bak mientras que el resto de las proteínas antiapoptóticas se unirían a Bax y debido a la interacción selectiva de las proteínas sólo-BH3 a un espectro especifico de proteínas antiapoptóticas, se necesitaría la acción conjunta de varias proteínas sólo-BH3 para inducir la apoptosis en células que expresaran varias antiapoptóticas. A pesar de que este modelo se basa en la observación de que Bax y Bak pueden ser activadas en ausencia de tBid y de Bim y una cantidad muy reducida de Puma, no se valora la actividad residual de Puma y de otras proteínas como p53 y Drp1 que podrían activar directamente a Bax/Bak (Figura 2.6B) (Chipuk et al. 2004; Willis et al. 2007; Gavathiotis et al. 2008; Montessuit et al. 2010; ShamasDin et al. 2010). Mientras que ambos modelos proponen una función diferente para las proteínas antiapoptóticas, ambos modelos surgieren que la especificidad se consigue por las diferencias en la afinidad de las proteínas sólo-BH3 por las proteínas antiapoptóticas. Sin embargo, ninguno de los modelos tiene en cuenta las membranas como un ente activo. Estas son vistas sólo como un ente pasivo que sirve de soporte a las proteínas de la familia Bcl-2. Para salvar estas deficiencias, y otras observaciones que no consiguen explicar ninguno de estos modelos por separados se ha propuesto un modelo unificado o mixto al cual se le han INTRODUCCIÓN 12 incorporado las características específicas aportadas por las membranas lipídicas y ha sido llamado “Embedded together model” (Shamas-Din et al. 2010). Modelo mixto en membrana (Embedded together model): en este modelo destaca el papel activo de la OMM donde se encuentran insertadas las proteínas de la familia Bcl-2 y ocurren los cambios conformacionales necesarios para la función de estas proteínas. Según este modelo, las proteínas antiapoptóticas citoplasmáticas son reclutadas a las membranas y activadas, tanto por proteínas sólo-BH3 sensibilizadoras como activadoras, así como por Bax y Bak. Una vez en las membranas las proteínas antiapoptóticas inhiben a las proteínas sólo-BH3 activadoras y a Bax y Bak, inhibiendo la oligomerización y la formación del MOMP. Para que la apoptosis tenga lugar, las proteínas sólo-BH3 sensibilizadoras desplazan a las activadoras y a Bax/Bak de las antiapoptóticas y las proteínas sólo-BH3 activadoras reclutan a Bax desde el citosol a la OMM. Estas interacciones son reversibles y gobernadas por un equilibrio constante que es alterado por la concentración e interacciones entre estas proteínas y las membranas (Figura 2.6C) (Leber et al. 2007; Bogner et al. 2010; Leber et al. 2010; Shamas-Din et al. 2010). Figura 2.6.-Modelos propuestos para explicar como se activan Bax y Bak para crear el MOMP. A) modelo directo, las proteínas sólo-BH3 sensibilizadoras desplazan a las activadoras directas de su inhibición por las antiapoptóticas, permitiendo que las activadoras activen a Bax y Bak. B) modelo indirecto, asume que existe una fracción de Bax y Bak activa constitutivamente que es inhibido por las antiapoptóticas y son desplazadas por las sólo-BH3 sensibilizadoras. Y C) modelo mixto, en este se tiene en cuenta a la membrana como un ente activo en el mecanismo de activación de Bax y Bak y además combina los dos modelo anteriores. Modificado de (Shamas-Din et al. 2010). ví a B c c e d e ot a c m Fi a c m i M o 2.1.2. 1 Tambié n a bien cara c c l-2 y es de s e lular como p e factores d e t ros. Aunqu e c tivación de itocondrial ( F gura 2.7.-Ví a c tivada Bax/B a i tocondria, ad o dificado de ( T 1 .-Vía int r n llamada v í c terizada de a s encadenad a p uede ser a g e crecimien t e existen un a la apoptos F igura 2.7) ( G a intrínseca d a k se forma e emás de la i n T ait and Gre e r ínseca í a mitocond r a ctivación d e a en respue s g entes quimi t o, daños e n a gran varie d i s todos co n G alluzzi et a e la apoptos i e l MOMP lo q n terrupción d e e n 2010) r ial por la p a e caspasas e s ta a una gr i oterapéutic o n el DNA, a c d ad de estí m n vergen en l. 2011). is. La mitoco q ue permite l a e la fosforilac i a rticipación d e n la que pa a n variedad o s, radiacion e c umulación d m ulos que p u la mitocon d ndria ocupa e a salida de to d i ón oxidativa d e éste org á r ticipan las p de estímulo e s UV, estr é d e proteína s u eden dese n d ria y de a h e l eje central d os los factor e y el colapso e INTRO D á nulo celula r p roteínas de o s que induc e é s oxidativo, s mal plega d n cadenar e s h í el nomb r l de esta vía e s apoptogé n e nergético d e D UCCIÓN 13 r . Es una la familia e n estrés ausencia d as entre s ta vía de r e de vía . Una vez n icos de la e la célula. I N e s c o E n el e in t AI p r di s e s a c bi o Fi pr o 9 e M Ap c a 2. C A d e N TRODUCCI 14 La mit o s pacio inter m o mo la ATP n condicion e e ctrones cr e t ermembran I F (a p optosi s r oteínas pro - s ipa, se dej a s pacio inter m c tivación de o energética gura 2.8.-Fo r ocesamiento e sta es despl a De las p OMP una d p af1 y (d) AT a spasas 9 y 8). El apop t A RD a trav é e los domin i ÓN o condria est á m embrana y sintasa, los e s fisiológica e ar un gradi e a se encue n s inducing f a - apoptóticas a de produci r m embrana a diferentes y metabólic a r mación del a proteolítico. L a zada del ap o p roteínas ap o e las mas i m T P participa n esta a su v e t osoma esta é s de los cu a i os CARD  á formada p la membran component e s normales, e nte electro q n tran diferen t a ctor), entre Bax/Bak y r ATP y son a l citosol. P mecanismo s a . a poptosoma y L a caspasa 9 a o ptosoma por o ptogénicas m portante e s n en la form a e z activa a l formado p o a les se pue d CARD. E s p or una ma t n a exterior. L e s de la cad e estas molé c q uímico o po t es molécul a otras. Cuan d se forma el liberadas u n P or lo que l a s efectores y activación d e a su vez acti v la procaspas a liberadas d e s el citocro m a ción del ap o a caspasa 3 o r 7 molécul d e unir la pr o sto provoca t riz rodead a L a membran a e na transpo r c ulas permit e tencial de m a s como cito d o, por un e poro MOM n a serie de p a activació n de la apop t e la caspasa v a a la procas a 9 comenzan e l espacio in m o c, el cua o ptosoma, l o 3 a través d e a s de Apafo caspasa 9 cambios c o a por una m a interna co n r tadora de e l e n a la cade m embrana, a d cromo c, En s timulo apo p P , el poten c p roteínas ap o n de la vía t osis acopla 9 por cambi o p asa 3. Una v d o un nuevo c t ermembran a l una vez e n o que provo c e una casca d 1 lo que pr o al apoptoso m o nformacion a m embrana i n n tiene prote í lectrones e n e na transpor t d emás, en e n do G, Diabl o p tótico, se a c c ial de mem o ptogénicas intrínseca i a do a una c o conformaci o v ez formada l a c iclo. a una vez f o n el citosol j c a la activa c d a proteolíti c o porciona 7 ma por la in a les que in d n terna, el í nas tales n tre otras. t adora de e l espacio o /Smac y c tivan las brana se desde el nduce la c atástrofe o nal y por a caspasa o rmado el j unto con c ión de la c a (figura dominios teracción d ucen su INTRODUCCIÓN 15 activación sin necesidad de ser procesada proteolíticamente, ya en este estado es capaz de activar a la caspasa 3 por corte proteolítico. No obstante la procaspasa 9 es también activada tanto autocatalíticamente como por procesamiento por la caspasa 3 ya activada, lo que hace que sea desplazada del apoptosoma por moléculas de procaspasa 9, comenzando de esta forma un nuevo ciclo de activación de caspasa 9 (Figura 2.8) (Li et al. 1997; Zou et al. 1997; Wurstle et al. 2012). Sin embargo, para que la activación de las caspasas pueda realizarse es necesario eliminar el efecto inhibitorio de las proteínas IAP, algunas de las cuales ejerce un efecto muy potente, como XIAP. Para esto también son liberadas otras proteínas del espacio intermembrana, como SMAC/DIABLO y HtrA2 las cuales inhiben la función antiapoptótica de diferentes miembros de la familia de las IAP y por tanto contrarrestan la inhibición de las caspasas (Chai et al. 2000; Srinivasula et al. 2003; Yang et al. 2003). Por otro lado, AIF y EndoG se trasloca al núcleo, donde median la fragmentación del DNA de forma independiente de las caspasas (Susin et al. 1999; Li et al. 2001). Adicionalmente, HtrA2 ejecuta un efecto proteolítico independiente de las caspasas debido a su actividad serín-proteasa (Hegde et al. 2002). Todo este mecanismo presenta un considerable grado de redundancia, demostrado por el hecho que en los ratones knockout o en líneas celulares con silenciamiento génico de alguna de estas proteínas individuales no se afecta la ejecución de la vía intrínseca de la apoptosis. En algunos casos, la inhibición de las caspasas ya sea química o genéticamente, sólo retrasa la ejecución de la muerte, la cual, eventualmente exhibe características morfológicas de necrosis (Kroemer and Martin 2005; David et al. 2006). Debido a estas observaciones el NCCD sugiere la siguiente definición de apoptosis intrínseca: proceso de muerte celular mediada por MOMP, y por tanto siempre asociado a disipación irreversible del potencial mitocondrial, liberación de proteínas del espacio intermembrana y su relocalización en otros compartimentos subcelulares e inhibición de la cadena respiratoria. Según estos criterios la apoptosis por la vía intrínseca se puede dividir en: dependiente de caspasas e independiente de caspasas, basada en la magnitud de la citoprotección conferida por la inhibición de las caspasas, ya sea farmacológica o genética (Tabla 2.1 y Figura 2.9). Estas distinciones son particularmente relevantes in vivo, ya que in vitro, en el caso independiente de caspasas, la actividad de AIF o EndoG entre otros, o la depleción de ATP, tiende a prevalecer sobre la inhibición de las caspasas resultando en la muerte de la célula (Figura 2.9) (Chautan et al. 1999; Daish et al. 2004). INTRODUCCIÓN 16 Figura 2.9.-Clasificación de la vía intrínseca de activación de la apoptosis en dependiente de caspasas e independiente de caspasas. Modificado de (Galluzzi et al. 2011). 2.1.2.2.-Vía extrínseca El término apoptosis extrínseca ha sido ampliamente usado para definir la muerte celular apoptótica inducida por señales de estrés extracelular que son detectadas y propagadas por receptores transmembrana específicos. La vía extrínseca de la apoptosis es iniciada por la unión de un ligando de muerte, como Fas/CD95 ligando (FasL/CD95L), factor de necrosis tumoral α (TNFα) y Apo2L/ TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) a sus correspondientes receptores de muerte. De forma alternativa la vía extrínseca de inducción de la apoptosis también se activa por “receptores de dependencia” los cuales sólo ejercen su función letal cuando la concentración de su ligando disminuye por debajo de ciertos límites críticos (Wajant 2002; Schutze et al. 2008; Mehlen and Bredesen 2011). El factor de necrosis tumoral TNF-α es una citoquina que se describió por primera vez en 1975 (Carswell et al. 1975). Es una proteína compuesta por 185 aminoácidos que se sintetiza INTRODUCCIÓN 17 como un precursor inactivo de 212 aminoácidos y que es procesada por la enzima convertidora de TNF-α, (TACE: TNF-alpha converting enzyme). Esta enzima media la rotura de una forma de TNF-α asociada a membrana, lo que induce la formación de la molécula activa (Goto et al. 2004). Esta molécula es secretada por muchos tipos de células tras su estimulación, como macrófagos, monocitos, neutrófilos, granulocitos, eosinófilos, fibroblastos, células endoteliales, células T y células NK. La molécula secretada es un complejo multimérico compuesto por dos, tres o cinco moléculas unidas no covalentemente (Beutler and Cerami 1986). Su receptor inductor de apoptosis es el llamado TNFR1 (55 kDa). Este receptor se expresa principalmente en células hematopoyéticas, como macrófagos, monocitos, células dendríticas o linfocitos. La unión del TNF-α a su receptor desencadena varios tipos de señales, como la activación del factor de transcripción NF-κB, lo que conduce a la expresión de multitud de genes implicados en respuestas proinflamatorias. Sin embargo, la unión del TNF-α a su receptor puede inducir apoptosis si la activación de NF-κB está bloqueada (Nagata 1997). Su papel en la muerte celular es esencial en la citotoxicidad mediada por macrófagos, aunque también está implicado en la muerte mediada por células T (Decker et al. 1987). Otro de los ligandos mortales es CD95L/FasL. Este es una glicoproteína de membrana que se acumula en el citoplasma dentro de cuerpos multivesiculares y es secretado al exterior celular insertado en microvesículas (Martinez-Lorenzo et al. 1999; Monleon et al. 2001). FasL se expresa principalmente en linfocitos B, T, NK y células dendríticas y su capacidad de inducir apoptosis es fundamental tanto en la inmunidad antitumoral como en el mantenimiento de la homeostasis tisular. En el primer caso, la expresión de este ligando en las células efectoras del sistema inmune produce la muerte de la célula diana. En el segundo, su expresión produce la muerte de células T aloreactivas o permanentemente activadas en un proceso conocido como muerte celular producida por activación, AICD (activation induced cell death) (Brunner et al. 1996; Hildeman et al. 2002). Por otra parte, FasL no sólo está implicado en muerte celular sino también en el desarrollo de la respuesta inmune puesto que se ha descrito su implicación en la proliferación y activación de linfocitos T (Bosque et al. 2007; Bosque et al. 2008). Su receptor es Fas/Apo-1/CD95, una glicoproteína de membrana de tipo I, con un dominio mortal. En la superficie celular se encuentra en forma de trímeros pre-formados que se entrecruzan para formar agregados más complejos tras la unión del ligando mortal (Nagata and Golstein 1995). El último de los ligando mortales descrito ha sido Apo2L/TRAIL. Este ligando mortal, descubierto en el año 1995 por dos grupos independientes (Wiley et al. 1995; Pitti et al. 1996) es una proteína transmembrana que se expresa, en humanos, en todos los tejidos. La rotura de su extremo C terminal da lugar a la forma soluble de TRAIL. Este ligando se une a sus receptores en la superficie de la célula en forma de homotrímeros, potenciándose así la transmisión de la señal respecto a la unión de la forma monomérica (Kimberley and Screaton 2004). I N n e ( H c é y a r ( V Fi u n d e d m m d o fi n b a a g c o Y c e p a N TRODUCCI 24 e crosis las c H irt and Lei s é lulas necrót a enferme d r terioesclero s V andenabeel gura 2.13.-R e n a vez se for m e ATP son co m 2.1.4. - e tipo II La auto ecanismos d ediada por c o ble membr a n almente es a sal en la c g regados pr o o ntribuye a l a aunque oc e lulares y s e a tógenos (Y a ÓN c élulas emit e s t 2003; Bro icas puede c d ades com o s is y enf e e et al. 201 0 e presentación m a el necropt o m ponentes cl a - Muerte c fagia fue d e d iferentes: m c haperonas. a na llamada s degradado a c élula, dond e o teicos, prot e a supervive n urre a nive l e ñales fisiol ó a ng and Klio e n señales p u ckaert et a c ontribuir a l a o la enferm rmedades 0 ). esquemática o soma. La for m a ves en la mu e c elular a s e finida hace m acroautofa g La macroa u s autofagos o a l fusionars e e actúa co m e ínas mal pl e n cia celular d l es basales ó gicas com o n sky 2010). p ara ser det a l. 2004) y e a persistenc m edad pulm o autoinmune s a de los event o m ación de es p e rte por necr o s ociada a más de 50 g ia (referida u tofagia, se o mas, las c u e con los lis o m o un mec a e gadas o de d urante los p puede ser o hormonas ectadas y e e l fallo de e s ia de la infla o nar obstru c s como e o s que partici p p ecies reacti v o sis. a autofá g años y est e como autof a caracteriza u ales secue s o somas. Est e a nismo de c larga vida, o p eríodos de e inducido o , factores d liminadas p o s tos proces o mación y al c tiva crónic a l lupus er p an en la eje c v as de oxigen o g ica o m u e término e n a gia), micro a por la form a s tran materi a e proceso s e c ontrol citopl o rgánulos d a e scasez de inhibido s e e crecimien o r células f a o s de elimi n excesivo da a (EPOC), r itomatoso s c ución de la n o junto con la u erte cel n globa al m e a utofagia y a ción de va c a l citoplasm á e mantiene a l asmático el a ñados o pa t nutrientes u e gún las co n n to o infecci a gocíticas n ación de ño tisular diabetes, s istémico e croptosis depleción ular e nos tres a utofagia c uolas de á tico que a un nivel iminando t ógenos y oxígeno. n diciones o nes por INTRODUCCIÓN 25 2.1.4.1.-Macroautofagia En mamíferos el proceso de autofagia se dividide en diferentes etapas (Figura 2.14): iniciación o inducción, nucleación, elongación, cierre, maduración y degradación (Kang et al. 2011). Y en ella intervienen un grupo de proteínas llamadas por consenso autofagicas (ATG Autophagy-related protein), y aunque se han descrito 31 de éstas proteínas, sólo 15 de ellas son necesarias para la ejecución de todas las etapas de la autofagia.(Nakatogawa et al. 2009; Codogno et al. 2012) Figura 2.14.-Etapas y moléculas más representativas que participan en la formación del autofagolisosoma. Modificado de (Codogno et al. 2012). 2.1.4.1.-Vías de señalización de la autofagia Diferentes estudios sugieren que en mamíferos la membrana donde ocurre la nucleación es el retículo endoplasmático, aunque no se descartan que otros orgánulos puedan contribuir como fuente de membrana para el proceso de autofagia. En mamíferos la inducción de la autofagia requiere de la proteína ULK1/2 que se encuentra formando un gran complejo con mATG13, FIP200 y ATG101 y es regulado por mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1). El complejo mTORC1 interactúa con ULK1/2 y las mantiene inhibida mediante fosforilación (Figura 2.15), sin embargo, en condiciones de escasez de nutrientes mTORC1 es inhibida y disociada de las quinasas ULK1/2, éstas son rápidamente desfosforiladas de los INTRODUCCIÓN 26 sitios de inhibición y concomitantemente autofosforiladas en los sitios de activación. Las quinasas ULK1/2 activadas fosforilan a mATG13 y FIP200 y conducen a la subsecuente relocalización de dicho complejo del citosol a la membrana del retículo endoplasmático (Codogno et al. 2012). La activación del complejo ULK induce tanto la activación como el reclutamiento a la membrana del RE del complejo de fosfatidil-inositol 3-quinasa de clase III (PI3K CIII) específica de autofagia. Este complejo es esencial para la producción de fosfatidilinositol 3 fosfato (PI3P) durante el estado inicial de nucleación del fagóforo y el núcleo central lo forman las proteínas beclina-1, la PI3K CIII Vps34 y Vps175/p150 (Figura 2.15). Estas proteínas a su vez facilitan el reclutamiento de otras proteínas ATG que pueden regular positivamente o negativamente este proceso. UVRAG, ATG14L y Ambra1 tienen dominios de unión a beclina-1 y regulan positivamente esta proteína e intervienen en diferentes pasos de la maduración y formación del autofagosoma. Otras moléculas como Rubicon funcionan como regulador negativo de la beclina-1. La producción de PI3P, subsecuentemente, recluta otras proteínas efectoras de los siguientes etapas que incluyen a DFCP1 y proteínas de la familia WIPI constituyendo el omegasoma un ejemplo de sitio de ensamblaje del fagóforo o PAS (Phagophore assembly site). WIPI2, la principal isoforma en la mayoría de las células, parece ser la encargada del reordenamiento de membrana que promueve el desarrollo del omegasoma hacia un sistema de doble-membrana aislado y la subsecuente formación del autofagosoma. La formación del estado final del autofagosoma, la elongación y el cierre de la membrana del fagóforo, requiere de dos sistemas de conjugación tipo ubiquitina (Figura 2.15). El primero constituye el complejo ATG5-ATG12. La formación de este complejo es constitutiva y ocurre inmediatamente después de la síntesis individual de cada proteína por la actividad tipo ubiquitina E1 y E2 de ATG7 y ATG10 respectivamente. El complejo ATG5-ATG12 interactúa con ATG16 y forma un gran complejo múltimerico gracias a la capacidad oligomérica de ATG16. Este complejo es llamado ATG16L y se localiza en la superficie exterior de la membrana del fagóforo. El segundo sistema interviene en la conjugación de ATG8 (MAPLC3 o LC3: Microtubule Associated Protein Light Chain 3). La LC3 es sintetizada como un precursor con una secuencia adicional en el carboxi terminal, la cual es eliminada inmediatamente después de su síntesis por la cistein-proteasa ATG4 dejando expuesto un residuo de glicina. Posteriormente, esta LC3 es conjugada a través del residuo de glicina al lípido fosfatidiletanolamina (PE) vía ATG7 y ATG3 suministrando, esta última, la actividad tipo ubiquitina E2, mientras que el complejo ATG16L suministra la actividad tipo ubiquitina E3. La lipidación de la LC3 ocurre sólo cuando se induce la autofagia y convierte la LC3 de su forma soluble en el citoplasma (LC3-I) a la forma asociada a los autofagosomas unida a la doble membrana (LC3-II), esta es localizada tanto en la superficie exterior como en la interior de la membrana del fagóforo (Nakatogawa et al. 2009). INTRODUCCIÓN 27 ATG9 es otra de las proteínas implicadas en este proceso, ésta es la única proteína integral de membrana descrita entre las proteínas ATG y su función parece ser esencial para la formación de los autofagosomas. Esta proteína se encuentra en reservorios intracelulares formando pequeñas vesículas, las cuales contribuyen directamente como fuentes de membrana a la formación del autofagosoma, fundamentalmente durante el ensamblaje del PAS. Esta proteína se localiza en la membrana externa y no en la interna del autofagosoma y esta distribución asimétrica está relacionada con otras funciones de esta proteína como contribuir a la curvatura de la membrana (Yamamoto et al. 2012). Figura 2.15.-Interacciones proteicas más importantes que intervienen en cada etapa de formación del autofagolisosoma La iniciación depende de que se elimine la inhibición que ejerce mTORC1 sobre ULK1/2. La nucleación depende del complejo formado por Beclina 1/Vps34/vps15. En la elongación participan los dos sistemas de conjugación tipo ubiquitina para formar el complejo ATG5-ATG12 y ATG8PE. Y en la maduración participan Rab7, LC3-II y LAMP entre otras proteínas. Modificado de (Kang et al. 2011) El reclutamiento de la LC3-II al autofagosoma es la etapa limitante de la velocidad del proceso de expansión de la membrana. La LC3-II media el cierre de la membrana y la fusión con el lisosoma (Nakatogawa et al. 2007) y la cantidad de LC3-II en el PAS determina el tamaño del autofagosoma (Xie and Klionsky 2007). Una vez que el autofagosoma está totalmente expandido, la LC3-II de la cara externa del autofagosoma es desconjugada de la PE a través de la acción de Atg4 y es liberado de nuevo al citosol (Yu et al. 2012). Asimismo, el complejo Atg12-ATG5-Atg16 se disocia de la membrana del autofagosoma durante la maduración. Después de la maduración, los autofagosomas se fusionan con los lisosomas para formar el autofagolisosoma (Figura 2.15), lo que requiere la actuación de diferentes proteínas como Rab7 y Vti1p en células de mamíferos (Gutierrez et al. 2004; Jager et al. 2004). Curiosamente, UVRAG, tiene un segundo papel en las etapas posteriores de autofagia en el que regula la maduración de los autofagosomas de forma independiente a la Beclina-1. UVRAG facilita el reclutamiento de la proteína C vacuolar (C-VPS) al autofagosoma. La INTRODUCCIÓN 28 interacción entre UVRAG y el complejo C-VPS estimula la actividad Rab7-GTPasa lo cual junto con otras proteínas como LAMP-1, LAMP-2, entre otras, resulta en la fusión entre el autofagosoma y el lisosoma (Liang et al. 2008). La fusión tiene lugar en la región perinuclear que está enriquecida en lisosomas. Para que esto ocurra, deben moverse los autofagosomas desde el citosol hacia el núcleo. El movimiento de autofagosomas se produce sobre los microtúbulos (Fass et al. 2006; Kochl et al. 2006) y esta mediado por la proteína motora dineína (Jahreiss et al. 2008). Finalmente, el material citoplasmático, proteínas u orgánulos englobados en los autofagolisosomas son degradados por las proteínas lisosomales (Eisenberg-Lerner and Kimchi 2009) El material englobado por los autofagosomas es seleccionado a través de interacciones proteícas, por los receptores específicos de autofagia. Estas proteínas presentan dominios de interaccion con las LC3-II llamado LIR (LC3-interacting region), en el C-terminal un dominio de reconocimiento de ubiquitina llamado UBA (Ub-associated) el cual es capaz de unirse a regiones mono o poliubiquitinadas y en N-terminal un dominio PB1 de oligomerización. El mejor ejemplo de estas proteínas lo constituye p62 o secuestrosoma-1 (p62/SQSTM1). Esta proteína es capaz de reconocer proteínas ubiquitinada a través del dominio UBA, ya sean proteínas mal plegadas o agregados proteicos, formando cuerpos de un tamaño variable gracias al domino de oligomerización, una vez se han formado estos agregados son reconocidos por la LC3-II que se encuentra en la cara interna del autofagosoma siendo reclutados en su interior (Johansen and Lamark 2011). De igual forma también pueden ser reconocidos orgánulos disfuncionales como por ejemplo mitocondrias despolarizadas, proceso en el cual intervienen proteínas de la familia sólo-BH3 como BNIP3 y BNIP3L (Johansen and Lamark 2011). 2.1.4.2.-Autofagia y muerte celular El término “muerte celular autofágica” fue definido en base a hechos morfológicos, específicamente a la vacuolización masiva observada por acumulación de autofagosoma que acompaña en algunos casos la muerte celular (Galluzzi et al. 2007). Aunque originalmente esta expresión no tenía ninguna consideración funcional, posteriormente ha sido usada para referirse a una muerte celular que es acompañada por un aumento del flujo autofágico y por tanto a la autofagia que es capaz de provocar daño celular (Kroemer and Levine 2008). Esto se aplica al menos en dos situaciones diferentes: primero a la autofagia que se ha visto media la muerte celular in vivo durante el desarrollo de D. melanogaster (Berry and Baehrecke 2007; Denton et al. 2009). Segundo, a la autofagia que parece ser la responsable de la muerte en algunas células tumorales, especialmente en ausencia de algún modulador apoptótico importante como Bax, Bak o caspasas, en respuesta a algunos agentes quimioterapéuticos in vitro (Fazi et al. 2008; Grander et al. 2009; Laane et al. 2009). No obstante, en la mayoría de los casos conocidos, la autofagia constituye un mecanismo citoprotector que es activado en respuesta a diversos tipos de estrés y su inhibición acelera, mas que prevenir, la muerte celular (Galluzzi et al. 2011). La autofagia probablemente INTRODUCCIÓN 29 evolucionó como un mecanismo celular para sobrevivir a la escasez de nutrientes en el medio extracelular y mantener la síntesis de macromolecular y la producción de ATP. Esta ocurre a un nivel basal bajo en todas las células y tiene función homeostática en el recambio citoplasmático de proteínas y de orgánulos celulares dañados y/o potencialmente peligrosos. Sin embargo, la autofagia se induce rápidamente cuando la demanda de energía celular se incrementa y no se puede suplir con el suministro de nutrientes. Además, la autofagia actúa como un proceso de supervivencia en respuesta a las diferentes formas de estrés, incluyendo la ausencia de factores de crecimiento, hipoxia, estrés del retículo endoplasmático (ER), infecciones microbianas y enfermedades caracterizadas por la acumulación de agregados proteicos (Boya et al. 2005). El papel citoprotector de la autofagia puede prevenir la apoptosis y la necrosis. Sin embargo, este proceso celular podría ser también un mecanismo de muerte celular. La activación de la autofagia más allá de cierto umbral puede promover la muerte celular directa, y provocar el colapso de las funciones celulares dando como resultado la atrofia celular (muerte celular tipo II). Por otra parte, la autofagia puede conducir a la ejecución de programas de muerte celular, apoptosis (tipo I) o necrosis (tipo III), presumiblemente a través de reguladores comunes tales como las proteínas de la familia Bcl-2. La muerte celular por autofagia se ha descrito en Drosophila, Dictyostelium y C. elegans. La inducción directa de la autofagia por la sobreexpresión de ATG1 en Drosophila, demuestra que la autofagia es suficiente para inducir la muerte celular (Scott et al. 2007). Existen pocas evidencias inequívocas de la muerte por autofagia en mamíferos in vivo, no así en cultivos celulares in vitro. No obstante, estudios recientes también han descrito la muerte celular por autofagia en mamíferos en determinadas enfermedades y en líneas celulares tratadas con agentes quimioterapéuticos. En muchos de estos casos, aspectos morfológicos de autofagia y muerte celular apoptótica o autofagia y muerte celular necrótica han sido observados concomitantemente en la misma célula (Eisenberg-Lerner et al. 2009). Además la interrelación entre la autofagia y la muerte celular apoptótica o necrótica es compleja y no completamente entendida. Estos procesos son regulados por factores comunes y comparten componentes comunes y la actividad de uno puede regular la actividad del otro, por lo que es importante determinar sí la célula está muriendo con autofagia o a través de la autofagia. Se han identificado múltiples niveles de interconexión entre la autofagia y la apoptosis. Éstos pueden divididirse en tres categorías (Eisenberg-Lerner et al. 2009): Cooperativo, tanto la autofagia como la apoptosis pueden ser ejecutadas en paralelo para contribuir a la muerte celular o la autofagia puede inducir la apoptosis (Figura 2.16a). Según este modelo de interrelación, si uno de los programas es bloqueado, el otro es capaz de ejecutar la muerte celular eficientemente por lo que un programa sirve de resguardo para el otro. Estos pueden ocurrir simultáneamente e incluso cooperativamente aunque uno INTRODUCCIÓN 30 puede predominar y por tanto ocultar las evidencias del otro o alternativamente el segundo puede ser sólo activado si falla el primero, lo que implica que el primero tiene medios para bloquear al segundo. El objetivo de ambos programas es el mismo, eliminar a la célula. La acción cooperativa y/o la retroalimentación negativa implican que existe una coordinación entre estas dos vías de señalización. Esta puede ocurrir a nivel de la activación o durante la ejecución, de forma que exista una maquinaria molecular que sirva de sensor de la eficiencia con que uno de ellos ocurre permitiéndole a la segunda vía de señalización intervenir si es necesario. El caso más descrito en la bibliografía es en el que la apoptosis inhibe o retrasa la autofagia por la que ésta sólo se hace evidente cuando la apoptosis es inhibida (Yang et al. 2006; Gozuacik et al. 2008; Yokoyama et al. 2008). Antagónico, la autofagia no es parte del mecanismo de muerte celular, en esta situación la célula está muriendo con autofagia (Figura 2.16b). En respuesta a muchos eventos la célula dispara la autofagia para contrarrestar o retrasar la muerte celular en un intento final de sobrevivir y como adaptación al estrés. La autofagia actúa bloqueando la muerte celular y promoviendo la supervivencia. En este caso, la apoptosis y la autofagia son procesos distintos con objetivos dispares. La autofagia no conduce a la muerte celular, sino que actúa para atenuar la apoptosis mediante la creación de un ambiente celular en el que se favorece la supervivencia. Por ejemplo, en diversas situaciones de estrés del ER se ha demostrado que la autofagia puede mantener la función ER a través de la degradación de agregados proteicos y de proteínas mal plegadas, lo que limita así la respuesta al estrés del ER y posterior apoptosis (Ding et al. 2007). También se ha visto inducción de la autofagia en respuesta a la anoikis (Fung et al. 2008) así como durante la radioterapia o quimioterapia. La mitofagia directa puede limitar la apoptosis mediante la prevención de MOMP y la posterior liberación de moléculas proapoptóticas tales como el citocromo c y Smac/Diablo (Kim et al. 2007a). Así, la célula utiliza la autofagia para promover la supervivencia en múltiples circunstancias. La supresión de la autofagia puede por tanto promover la apoptosis de células en circunstancias como la respuesta al daño al DNA, estrés del ER, escasez de nutrientes y vías de señalización de factores de crecimiento. Facilitadora, la autofagia es parte del programa de apoptosis, y actúa tanto como ejecutora de la apoptosis como durante las etapas finales de la apoptosis para colaborar en la eliminación de los cuerpos apoptóticos (Figura 2.16c). Esta tercera hipótesis intenta explicar los altos niveles de autofagia detectados en algunas células que mueren y constituiría un mecanismo de limpieza de las células comprometidas a morir por apoptosis o necrosis. Según el mecanismo canónico, la mayor parte de las células apoptóticas son eliminadas por fagocitosis, siendo los lisosomas de los fagocitos responsables de la degradación final de los cuerpos apoptóticos. Sin embargo, en algunas formas de muerte celular programada, sobre todo durante el desarrollo embrionario (por ejemplo embriogénesis, metamorfosis de los insectos), la disponibilidad de células fagocíticas puede ser insuficiente para la eliminación de las células muertas. En tal caso, las células p o la d q u d e fo p r c u la s e s p r Fi in t s e c a c e M o r e o drían activ a d o, la autof a u e no intrfier e l manteni m sfatidilserin a r oporciona l a u erpos apop t s células ap o s ta etapa. D r oporcionad a gura 2.16.-P o t eracción coo p e a bloqueado a so la autofa g e lular. C) Fac o dificado de ( En la p e gulación co o a r la autofag a gia puede a e con la eje c m iento de a , un proc e a señal de “c t óticos. En a o ptóticas e m D e igual fo r a por la auto f o sibles intera c p erativa, los d el otro es sufi g ia representa ilitadora, en e Eisenberg-Le r p rimera y te r o rdinada de ia para auto s istir a la ap o c ución de la los niveles e so depend ó meme” a l o usencia de a m brionarias p ma la form a f agia (Qu et a c ciones entre d os procesos ciente para p r un intento d e e ste caso la a r ner et al. 20 0 r cera categ o estos efect o o -degradars e optosis, sin q apoptosis. P celulares iente de A o s fagocitos v a utofagia, o p ersisten, lo q ación de l o al. 2007). la apoptosis y cooperan par r oducir la mu e e la célula de autofagia co n 0 9). o rías por ta n o s opuestos e a través d e q ue conduz c P or ejemplo, de ATP, q A TP. In viv o v ecinos y p o una fuente e q ue indica q o s blebs ap o y la autofagia a inducir la m e rte de la cél u adaptarse a n tribuye a la c n to, la auto f de la autofa e sus propio s c a a la muer t la autofagia q ue permit e o , la expo s o r lo tanto m e e xterna de A T ue la autofa g o ptóticos re q cuando se in d uerte de la c é u la B) Interac c las condicion c ompleta eje c f agia partici p gia se basa INTRO D s lisosomas . t e en sí mis m a sería la re s e la expo s s ición fosfa t e dia la elimi n A TP, los cad á g ia es requ e quiere ATP duce muerte é lula y en cas c ión antagóni c n es que induc e c ución de la pa en la m u en una co m D UCCIÓN 31 Por otro m a, por lo ponsable s ición de t idilserina n ación de á veres de e rida para , que es celular. A) o que una c a, en este e n muerte apoptosis. u erte. La m pleja red INTRODUCCIÓN 32 de transducción de señales, la mayoría de las cuales también participan en vías de señalización no autofágicas. Por lo tanto, la autofagia ocupa una posición crucial en el metabolismo de la célula, y su modulación representa una estrategia terapéutica alternativa en escenarios patológicos como el cáncer. La interrelación a nivel molecular entre la apoptosis y la autofagia es evidente por los numerosos genes que son compartidos por ambas vías de señalización (Figura 2.17). Evidencias recientes sugieren que BCL-2/BCL-XL inhiben la autofagia a través de la interacción directa con la proteína beclina-1 a través de su dominio BH3. La beclina-1 es liberada tanto por desplazamiento por otras proteínas BH3 como con BNIP3 o por fosforilación, tanto de la beclina-1 como de BCL-2/BCL-XL (Levine et al. 2008; Wei et al. 2008; Zalckvar et al. 2009). Esta interacción funciona para mantener la autofagia en niveles que son compatibles con la supervivencia celular más que con la muerte celular. En contraste, la sobreexpresión de BCL2/BCL-XL potencia la muerte dependiente de autofagia en MEF tratados con estímulos proapoptóticos. Además, la proteína ATG5, que tiene un papel esencial en la autofagia, puede ser cortada proteolíticamente tanto por la calpaina como por caspasas, formando un fragmento N-terminal que se trasloca a la mitocondria e interactúa con BCL-XL y promueve la liberación del citocromo c (Yousefi et al. 2006). Además, se ha descrito que la autofagia puede eliminar selectivamente la caspasa 8 inhibiendo de esta forma la activación de la vía extrínseca de la apoptosis (Hou et al. 2010), mientras que tanto la caspasa 8 como la caspasa 3 podrían cortar a la beclina 1 con lo cual se inhibe la autofagia y además se genera un fragmento C-terminal que se trasloca a la mitocondria contribuyendo a la activación de Bax y Bak (Djavaheri-Mergny et al. 2010). Sin embargo, el corte de Atg4D, una de las 4 ATG4 descritas en mamíferos, por la caspasa 3 genera un fragmento capaz de activar la autofagia (Betin and Lane 2009). Figura 2.17.-Ejemplo de la interrelación entre la autofagia y la apoptosis. En esta interviene múltiples proteínas que participan en la regulación de los dos procesos simultáneamente. Modificado de (Kang et al. 2011). INTRODUCCIÓN 33 La interrelación de la autofagia no es sólo con la apoptosis, ya que se han visto diferentes interconexiones también con la necrosis. Por ejemplo, la inhibición de la autofagia en células deficientes en apoptosis retrasó la muerte celular por necrosis, en cambio en células capaces de ejecutar la apoptosis las hizo mas sensible a la inducción de muerte por estrés del retículo (Ullman et al. 2008). Diferentes estudios revelan que la autofagia es inducida por estímulos que también inducen necrosis. La activación RIP en células tratadas con inhibidores de caspasas causa una excesiva formación de autofagososmas (Zhang et al. 2011b). Y la disminución de la autofagia por silenciamiento de ATG5, ATG7 y ATG8 interfiere con la muerte neuronal inducida por diferentes agentes (Chu et al. 2007). Mientras que la estimulación de la autofagia induce muerte neuronal por necrosis. La autofagia tiene un efecto sinérgico con la vía proteolítica lisosomal para facilitar la muerte por necrosis. De igual forma se ha observado que la autofagia selectiva de la enzima catalasa, una proteína que se encuentra en el citosol y que tiene un papel clave en la neutralización de las especies reactivas de oxígeno, causa un incremento dramático de las ROS, peroxidación lipídica y pérdida de la integridad de la membrana plasmática, contribuyendo de esta forma a la necrosis (Yu et al. 2006b; Scarlatti et al. 2009). 2.2.-MIELOMA MÚLTIPLE HUMANO El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia que afecta a un clon de las células B plasmáticas que se expanden e infiltran la médula ósea y conduce a citopenias, reabsorción ósea y producción, en la mayoría de los casos, de una inmunoglobulina monoclonal característica. El MM cursa de forma heterogénea por lo cual algunos pacientes mueren en algunas semanas tras su diagnóstico, mientras que otros, sobreviven durante más de 10 años (Fonseca et al. 2009). El mieloma es una enfermedad maligna que se manifiesta clínicamente con pancitopenia, hiperproteinemia, hipercalcemia, disfunción renal, lesiones en la médula ósea, anemia, inmunodeficiencia o disfunción neurológica. El MM es la segunda neoplasia hematológica más frecuente, después del linfoma no Hodgkin. Constituye, aproximadamente, el 10% de todas las neoplasias hematológicas, y el 1% de todos los cánceres y causa el 2% de las muertes por cáncer. En Europa tiene una incidencia de 4,5-6,0/100000/año con una edad media de diagnóstico entre 63 y 70 años y una mortalidad de 4,1/100000/año (Harousseau and Dreyling 2010; Rajkumar 2011). Aun no se conoce con precisión la etiología del mieloma múltiple. Algunos factores de riesgo podrían ser: la estimulación inmune crónica, desórdenes autoinmunes, exposición a radiaciónes ionizante, exposición a pesticidas o herbicidas o exposición a dioxinas (Schwartz 1997). Es un tumor de bajo índice de proliferación, aunque ésta aumenta cuando el tumor sale de la médula ósea, lo que ocurre en las últimas etapas de la enfermedad. Actualmente es incurable, aunque en los últimos años ha aumentado el tiempo medio de supervivencia, INTRODUCCIÓN 40 Figura 2.20.-Esquema del posible origen de las células madre tumorales. Los tejidos surgen de las células madre que crecen y se diferencian para dar origen a las células progenitoras y a poblaciones de células maduras. Mientras que las células madre tumorales surgen de mutaciones en las células madres normales o en las células progenitoras. Modificado de (Jordan et al. 2006) Aunque el concepto de células madre tumorales puede variar en diferentes contexto y las características especificas de las células tumorales pueden ser preservadas en mayor o menor medida en las células madres tumorales, la cuestión clave es que un subgrupo pequeño de células en el tumor. Son esenciales para el mantenimiento de la población de células malignas. Por ejemplo, un pequeño subgrupo de células madres tumorales puede ser la fuente de todas las células malignas en el tumor primario, pueden constituir un pequeño reservorio de células resistentes a las drogas y por tanto ser las responsables de las recaídas después de la quimioterapia, o pueden dar lugar a metástasis en lugares distantes. Se han llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales para identificar a las CSCs. La metodología más usada ha sido la identificación de antígenos de superficie expresado por las células tumorales, siendo los marcadores candidatos aquellos característicos de las células madres y progenitoras normales dentro del tejido de origen. Por ejemplo, CD34 en leucemia mieloide, CD133 en tumores cerebrales, o los marcadores asociados a mal pronóstico, como CD44, en tumores sólidos (Tabla 2.2). Adicionalmente, también se han empleado estudios de citometría de flujo indicativos de resistencia a fármacos, como el ensayo con la sonda de Aldefluor, que mide la actividad aldehído deshidrogenasa, una enzima usada por las células para la eliminación de tóxicos, o la detección de poblaciones celulares con una capacidad incrementada para la expulsión de tóxicos de su interior, llamada “side population” (SP) (Golebiewska et al. 2011). El ensayo de SP se beneficia del espectro de emisión diferencial en dos canales de fluorescencia tras exponer las células a la sonda Hoechst 33342 unida al DNA y fue inicialmente desarrollado para identificar células madres hematopoyéticas (Hadnagy et al. 2006). Todas estas técnicas han sido empleadas para identificar y purificar presuntas CSCs. No obstante, la característica primordial que deben cumplir las células para identificarlas como CSCs es la de tener una mayor capacidad clonogénica y de reproducir la INTRODUCCIÓN 41 enfermedad al ser injertadas en ratones inmunocomprometidos, generalmente NOD/SCID (Matsui et al. 2012). Tipo de cáncer Marcadores usados para identificar y/o purificar CSC Tumores cerebrales, incluidos glioblastoma y meduloblastoma CD133+ Carcinoma de colon CD133+, CD44+/Lin-/ESA+ Carcinoma mamario CD24- /L ow/CD44+ Cáncer de pulmón CD133+ Carcinoma pancreático CD44+/CD24+/ESA+, CD133+ Cáncinoma hepatocelular CD133+ Carcinoma de ovario SP Carcinoma de células escamosas de cuello y cabeza CD44+ Carcinoma de próstata CD44+/α2β1 hi g h /CD133+ Cánceres hematológicos CD34+/CD38Tabla 2.2.-Marcadores usados para identificar presuntas células madres tumorales en diferentes tipos de neoplasias. (Modificado de (Jones and Armstrong 2008) 2.2.3.2-Células madres tumorales en mieloma múltiple humano (MM-CSCs) A pesar de la introducción de nuevas terapias, el mieloma múltiple humano continúa siendo una enfermedad incurable. La introducción de terapias con altas dosis y de nuevos fármacos como el bortezomib, la talidomida y la lenalidomida han mejorado la respuesta de los pacientes a la terapia y aumentado su supervivencia. No obstante, la mayoría de los pacientes tienen recaídas y continúa siendo una enfermedad incurable. Todo esto se atribuiye a las células madres tumorales, las cuales sería las responsables de la iniciación del tumor, así como de su recaída e incluso de las metástasis. Sin embargo, estas células no han sido fehacientemente caracterizadas y en la bibliografía existen datos contradictorios. Diferentes estudios han examinado las CSCs de mieloma múltiple dentro del contexto de la diferenciación de las células plasmáticas normales. De forma esquemática y simplificada en el desarrollo de las células B normales, las células B naïve que poseen el reordenamiento génico, tras ponerse en contacto con el antígeno que reconocen, sufren la hipermutación somática en el centro germinal para producir un único idiotipo de anticuerpo y mejorar la especificidad de unión al antígeno. Estas células dan lugar a células post-centro germinal que mantienen la inmunidad humoral por largo período de tiempo y a células plasmáticas secretoras de anticuerpos tras la exposición al antígeno. Al examinar la secuencia génica de la inmunoglubina de células plasmáticas de mieloma se encuentra que estas han sufrido la hipermutación somática y esta se mantiene constante durante todo el curso de la enfermedad, demostrando un origen clonal de las células de mieloma múltiple. Ésto sugiere que esta enfermedad surge en células post germinales, en las células B de memoria o en las células plasmáticas (Jones and Armstrong 2008; Matsui et al. 2012). INTRODUCCIÓN 42 Diversos estudios con muestras de pacientes, han detectado células B en la médula ósea o en la sangre que presentan el mismo reordenamiento de los genes de la inmunoglobulina que las células plasmáticas de mieloma múltiple (Billadeau et al. 1993; Bakkus et al. 1994; Bergsagel et al. 1995; Rasmussen et al. 2000b). El significado clínico de estas células B clonotípicas no está claro, pero estudios funcionales han demostrado que son tumorigénicas y pueden dar origen a células plasmáticas mielomatosas tanto en ensayos clonogénicos in vitro como en ensayos in vivo en ratones NOD/SCID (Pilarski et al. 2000; Pilarski et al. 2002; Matsui et al. 2008). De igual forma, también han demostrado que estas células B clonotípicas son relativamente resistentes, en comparación con las células plasmáticas, a diferentes quimioterapias usadas en la práctica clínica, tanto a los agentes tradicionales como a los nuevos fármacos como bortezomib o lenalidomida tanto in vitro como in vivo (Rasmussen et al. 2000a; Matsui et al. 2008). En 1994, Pilarski, L. M. et al, proponen que las células B malignas circulantes en sangre que expresan la glicoproteina-P 170 (P-gp), un transportador ABC de fármacos, podrían constituir las células madres tumorales en el caso de mieloma múltiples, ya que las células B expresan esta proteína durante su desarrollo y al diferenciarse al estado final de células plasmáticas lo pierden. Por lo que, las células B mielomatosas periféricas que expresan P-gp al ser más resistentes a los fármacos serían las responsables de las recaídas (Pilarski and Belch 1994). Por otro lado, Matsui, W. et al, plantean que las células con mayor capacidad clonogénica son aquellas que no expresan CD138 y si CD20, por lo que la capacidad clonogénica se ve significativamente reducida al pre incubar estas células con rituximab, un anticuerpo humanizado contra CD20 (Matsui et al. 2004). Y aunque, en otros estudios se ha demostrado que las células de sangre periférica de los pacientes de mieloma, presentan al menos dos poblaciones de células B CD20+ y CD19+, así como células plasmáticas CD138+ y CD20+, esta terapia no es efectiva en la práctica clínica (Pilarski et al. 2008). Una hipótesis similsr es defenddida porJones y Armstrong quienes plantean que las células madres de mieloma podrían tener el mismo fenotipo que las células B memoria, es decir CD19+, CD20+, CD27+ y CD138- (Figura 2.21). Al diferenciarse a células plasmáticas de mieloma ganarían CD138 y perderían el restos de marcadores mencionados anteriormente (Jones and Armstrong 2008). INTRODUCCIÓN 43 Figura 2.21.-Las células B memoria como posibles células madre tumorales del mieloma múltiple. Según esta hipótesis, las células madre tumorales de MM podrían tener el mismo fenotipo que las células B memoria, es decir CD19+, CD20+, CD27+ y CD138Modificado de (Jones and Armstrong 2008). Otro estudio realizado en un modelo de cultivo tridimensional que reconstruía las interacciones heterotípicas de la médula ósea y en el cual se cultivaron muestras de aspirado de médula ósea y de sangre periférica de pacientes diagnosticados de mieloma múltiple, se demostró que las presuntas células madre de mieloma múltiple serían aquellas células quiescentes, resistentes a fármacos, CD20+ con capacidad de autorenovación para originar células B de mieloma múltiple CD20+ y células plasmáticas mielomatosas CD138+ y que residirían en el endostio, un nicho conocido de células progenitoras normales (Kirshner et al. 2008). Sin embargo, Paino, et al, rebaten la hipótesis de que las CSC de mieloma múltiple sean las células CD20+, ya que en un estudio publicado en el año 2012 demuestran que la presencia de células CD20+ en las líneas de mieloma múltiple era indetectable excepto en la línea RPMI 8226 en la que se encontró un 0.3% de células CD20+, las cuales además expresaban marcadores de células plasmáticas como CD38 y CD138 y eran CD19 y CD27 negativas. Además estas células tampoco expresaban otros marcadores de células madres como el observado con el ensayo de Aldefluor. En el mismo trabajo se indica que tras eliminar del cultivo las células CD20+, las células restantes tienen la misma capacidad para inducir plasmacitomas que los cultivos controles. Por ello concluyen que este no es un marcador adecuado para CSC de mieloma múltiple (Paino et al. 2012). Además de los estudios basados en la detección de antígenos de superficie, también se han realizado ensayos de citometría de flujo funcional para identificar células de mieloma clonogénicas. La expresión de la aldehído deshidrogenasa (ADH) es característica de las células madre normales en gran variedad de tejidos adultos y podría identificar las CSCs tanto INTRODUCCIÓN 44 en tumores sólidos como hematológicos (Brennan and Matsui 2009). Tanto in vitro como in vivo se ha observado que las presuntas MM-CSCs expresan niveles relativamente altos de aldehído deshidrogenasa (Matsui et al. 2008). Por otro lado, el ensayo de side population ha sido usado para identificar MM-CSCs y se ha observado que células tumorales clonogénicas expresan el fenotipo de SP. Posteriores análisis de las células de MM-SP también han mostrado un incremento en la expresión de transportadores de fármacos unidos a la membrana (ABCG2 y MDR/Pgp) sugiriendo una resistencia relativa a la quimioterapia (Goodell et al. 1996; Rasmussen et al. 2000a; Matsui et al. 2008; Jakubikova et al. 2011). Diversos estudios examinan la naturaleza de las células B de muestras de MM y han demostrado que estas células carecen de la expresión del antígeno de superficie CD138 característico tanto de las células plasmáticas normales como de mieloma (Goodell et al. 1996; Rasmussen et al. 2000a; Matsui et al. 2004; Matsui et al. 2008; Jakubikova et al. 2011). Por otro lado, estudios que examinan las células de la SP de MM han demostrado que estas células son tanto CD138 positivas como negativas (Matsui et al. 2008; Jakubikova et al. 2011). Además, existen estudios que demuestran que las células CD138 positivas son capaces de implantarse adecuadamente, producir proteína M e incluso metastatizar cuando se implantan dentro de un fragmento de hueso fetal humano o de conejo en ratones inmunodeficientes (SCID-Hu) (Yaccoby et al. 1998; Yata and Yaccoby 2004). A pesar de estos hallazgos, la existencia y fenotipo preciso de las MM-CSCs continúa sin ser aclarado. Estas diferencias observadas por diferentes grupos, pueden ser atribuidas a la variación entre los diseños experimentales usados para analizar la capacidad clonogénica de las células, especialmente por el uso de distintos modelos murinos in vivo, así como por la inherente variabilidad entre los pacientes cuando se realizan estudios en muestras de pacientes. También es importante considerar los datos recientes en los que se muestran como antígenos de superficies, convencionalmente asociados como marcadores de células madres en la población de células tumorales, pueden realmente exhibir una plasticidad significativa. Es decir, existen evidencias crecientes que sostienen la interconversión bidireccional entre las células normales y las células madres, tanto en una población de células normales o malignas (Chaffer et al. 2011; Gupta et al. 2011; He et al. 2011; Jakubikova et al. 2011). Estos resultados proporcionan otra explicación a algunas variaciones observadas entre diferentes grupos al estudiar las características fenotípicas de las CSCs (Matsui et al. 2012) 2.2.4.-Farmacoterapia del mieloma múltiple humano Por muchos años el melfalan y la prednisona han representado el estándar en la terapia del mieloma múltiple, con el trasplante de células madres reservado a un reducido grupo de pacientes. El tratamiento de la enfermedad a evolucionado rápidamente en las ultimas décadas con el desarrollo e utilización de los nuevos fármacos talidomida, lenalidomida y bortezomib (Laubach et al. 2010). INTRODUCCIÓN 45 En la actualidad existen varios tratamientos alternativos para el MM. Se usan unos u otros en función del estadio del tumor en el momento del diagnóstico, además de otros factores, como la edad, indicadores de pronóstico y patologías concomitantes. Para definir el estadio de la enfermedad se pueden usar los criterios de Durie–Salmon (Durie and Salmon 1975), el sistema internacional (Hari et al. 2009) o el de la “Clinica Mayo” (Kumar et al. 2009). Este ultimo clasifica los pacientes de nuevo diagnóstico en pacientes con riesgo estándar, intermedio y alto (Tabla 2.3) (Rajkumar 2011). Riesgo estratificado del Mieloma Múltiple Riesgo estándar Hiperdiploidia t (11;14) t (6;14) Riesgo intermedio t (4;14) Del13 o hipodiploidia Riesgo alto 17p delección t (14;16) t (14;20) Perfil de expresión génica de alto riesgo Tabla 2.3.-Riesgo estratificado en mieloma múltiple según Kumar S.K. et al, (Kumar et al. 2009). Los tratamientos utilizados actualmente son: la quimioterapia y/o el autotransplante de células madres (ASCT, Autologous Stem Cell Transplantation). Los esquemas terapéuticos pueden variar según los protocolos establecidos por cada comité, pero según la “Clínica Mayo” la terapia adaptada al riesgo sería (Figura 2.22): Pacientes con riesgo estándar: son tratados con agentes no alquilantes como lenalidomida (Revlimid) más dosis bajas de dexametasona (Rd, Revlimid + bajas de dexametasona) seguido por (ASCT). Una estrategia alternativa es continuar la terapia inicial después de colectar las células madre para el trasplante, y recibir el ASCT en la primera recaída. Pacientes con riesgo intermedio y alto: son tratados con un esquema terapéutico basado en bortezomib seguido por ASCT y luego terapia de mantenimiento con un esquema que contenga bortezomib. Los pacientes no elegibles para ASCT son tratados con Rd si son de riesgo estándar o con un régimen que contenga bortezomib si son de riesgo intermedio o alto. Para reducir la toxicidad cuando se usa el bortezomib es preferible usar una dosis subcutánea semanal, de manera similar, es preferida una dosis baja de dexametasona, 40 mg una vez a la semana a no ser que se necesite un rápido control de la enfermedad. No obstante el merfalan, que ha sido usado durante décadas, aun se sigue usando en pacientes no candidatos a ASCT combinado con dexametasona y lenalidomida o bortezomib, estas combinaciones han mostrado mejores resultados aunque más reacciones adversas en varios ensayos clínicos que la combinación de INTRODUCCIÓN 46 merfalan y dexametasona(Kumar et al. 2009) (Kumar 2009). Los pacientes con recaídas pueden ser tratados con combinación de dos o tres fármacos. Los pacientes con recaídas más agresivas pueden requerir terapia con combinación de múltiples agentes. Los nuevos agentes más prometedores en desarrollo son pomalidomida and carfilizomib (Rajkumar 2011). Figura 2.22.-Esquema de la terapéutica de los pacientes de nuevo diagnóstico. A) Elegibles para transplante. B) No elegible para trasplante. ASCT: transplante autologo de células madre, CR: respuesta completa, VGPR: respuesta parcial muy buena, VRD: bortezomib + lenalidomide + dexametasona, VCD; Bortezomib + ciclosfosfamida + dexametasona, Rd: lenalidomida + dosis bajas de dexametasona. Modificado de (Rajkumar 2011). Pacientes de nuevo diagnóstico elegibles para trasplantes Riesgo alto Riesgo intermedia Riesgo estándar VRD x 4 ciclos VCD x 4 ciclos Rd x 4 ciclos ASCT ASCT; 2 d a ASCT si no CR o VGPR ASCT inicial Terapia de mantenimiento basada en bortezomib Terapia de mantenimiento basada en bortezomib por 2 años Terapia de mantenimiento con lenalidomide si no en CR o VGPR seguido de ASCT ASCT tardía Pacientes de nuevo diagnóstico NO elegibles para trasplantes Riesgo alto Riesgo intermedia Riesgo estándar VRD x 1 año VCD x 1 año Rd Bortezomib de mantenimiento Bortezomib de mantenimiento por 2 años si es posible INTRODUCCIÓN 47 2.2.5.-Sorafenib El Sorafenib es un fármaco aprobado por la FDA en 2005 para el tratamiento del carcinoma renal. El fármaco fue inicialmente desarrollado por Bayer como un inhibidor de la quinasa Raf y por tanto de la vía de señalización Ras-Raf-MEK-ERK. El Sorafenib presenta una IC50 de 6 nM para Raf-1 (Tabla 2.4). Químicamente es una bisarilurea con un anillo de piridina en un extremo y un anillo fenil-trifluorometil en el extremo opuesto (Figura 2.23) (Wilhelm et al. 2006) Quinasas Valor de la IC50 en ensayos in vitro (nM) Raf-1 6 B-raf 25 b-rafV600E 38 VEGFR1 26 VEGFR2 90 FLT3 33 P38 38 C-Kit 68 FGFR1 580 MER1, ERK1, PKA, PKB Más de 10 000 Tabla 2.4.-Valor de la IC50 obtenidos en ensayos in vitro para diferentes quinasas Figura 2.23.-Sorafenib. Fármaco desarrollado por Bayer y aprobado en 2005 para el tratamiento del carcinoma renal. Modificado de (Wilhelm et al. 2006) 2.2.5.1.-Las proteínas Raf La familia de las proteínas Raf (Rapidly accelerated fibrosarcoma) en mamíferos comprende tres isoformas: A, B y C-Raf, esta última llamada también Raf-1 o c-Raf-1, y difieren en su patrón de expresión, regulación y función. Son proteínas efectoras de la ruta activada por los receptores con actividad tirosín-quinasa, son activadas por unión a Ras y poseen actividad serín/treonín quinasa y actúan activador apical de la cascada de señalización de las MAPquinasas (RafMEKERK). La mayoría de las investigaciones iniciales se centraron en la isoforma C-Raf, siendo la primera isoforma en ser identificada. Las proteínas Raf están conservadas estructuralmente desde los animales inferiores hasta los mamíferos al igual que ocurre con el módulo de señalización Ras-Raf-MEK-ERK (Leicht et al. 2007). I N fo ti e g e s u Fi si t in h c o R a r e r e e s ( B c o n e R a si t d e c r a r e p r a u q u p a lo s S O N TRODUCCI 48 Raf es a sforila forila e ne sustrat o e nerando u n u pervivencia gura 2.24.-E s t ios de fosfo r h ibidores. Las tre s o nservados ( a s (RBD) y e gión 2 o C R e gulación ne g s rica en res B accarini 20 0 A demá s o nstitutivam e e cesario par a f-1 media l t ios de fosf o e éstas fosf o r eando sitios Raf-1 (S29, e troalimenta c La reg u r oteína, el c u toinhibición u iescente la a ra la proteí n s receptore s O S hasta R a ÓN a ctivada por a su vez a M o s con una n a diversida d (Baccarini 2 s quema de la r ilación en v e s isoformas ( CR) (figura uno rico en R 2 es rica e g ativa de la iduos de se r 0 5; Leicht et s el extre m e nte (S621 e a la activaci a represión o rilación res p o rilaciones s adicionales S43, S289, c ión negativ a u lación de R c ual se une intramolec u fosforilació n n a 14-3-3, l a s tirosín-qui n a s, que une G Ras en res p M EK la cual p variada lo d de respue 2 005). proteína Raf1 e rde son ac t d e Raf com 2.24) la re g cisteína (C R e n residuos actividad q u r ina y treoni n al. 2007). m o carboxi t e n Raf-1), el ón de Raf. L de la activi d p onsables d e s on realizad a de unión p a S296, S30 1 a (Baccarini 2 R af-1 es rea al dominio u lar esta f a n de los resi d a cual estabi n asa, la señ a G TP y se ac t p uesta a la e p osteriorme n o calización c e stas celular e 1 con sus do m t ivadores mi e parten una e g ión 1 o CR 1 R D) involuc r de serina, u inasa y la r e na, que al s e t erminal co cual media La fosforila c d ad quinasa e la represi ó a s por la P K a ra la proteí n 1 y S624) s u 2 005). a lizada en p catalítico s a vorecida p o d uos de ser i i liza la conf o a l de activa c c tiva. La uni ó e stimulación n te fosforila a c elular, co m e s tales co m m inios conser v e ntras que l o e structura c o 1 contiene d r ados en la l los cuales p e gión 3 o C R e r fosforilad o ntiene un l a unión de R c ión de seri n . De hecho, ó n de la acti v K A (S43, S2 n a 14-3-3. E R u giriendo la p a rte por el uprimiendo o r la prote i na 259 y 6 2 o rmación ina c ión se tras m ó n de Ras-G T por factore s a ERK en T e m o membra n m o prolifera c v ados y los sit o s que se e n o mún forma d d os subdomi l iberación d e p or fosforila c R 3 presenta o s estimula n residuo d e R af a la pro t as en la mi t esta regió n v idad quina s 3 3 y S259) R K también e p osibilidad d dominio N-t e la actividad í na 14-3-3, 2 1 de Raf-1 c tiva. Luego m ite vía los T P a Raf-1 d s de crecimi e Y activan d n a, citosol o c ión, diferen t ios de fosforil n cuentran en da por tres nios, uno d e e la autoinhi c ión partici p el dominio q n la activida d e serina f o t eína 14-3-3 t ad aminote r n contiene 7 s a de Raf-1 . o la PKB/A k e s capaz de d e una regul a t erminal de de la enzi m ya que e n crean sitios o de la estim adaptadore s d esplaza a l a e nto. Raf d ola. ERK o núcleo ciación y ación. Los rojo son dominios e unión a bición, la p an en la q uinasa y d quinasa o sforilado y que es r minal de de los 8 A lgunas k t (S259) fosforilar a ción por la propia m a. Ésta n estado de unión ulación a s Grb-2 y a proteína INTRODUCCIÓN 49 14-3-3 en su unión con Raf-1 y fuerza a la vez un cambio conformacional que libera la autoinhibición. Sin embargo, la interacción de Ras-GTP y Raf-1 es insuficiente para lograr la activación de Raf-1 y se requieren subsecuentes fosforilaciones y desfosforilaciones para activar de forma estable a Raf-1 sin requerir la contínua asociación con Ras-GTP. Entre estas modificaciones está la realizada por la fosfatasa PP2A, la cual desfosforila el residuo de serina 259, diana de unión de la proteína inhibitoria 14-3-3, y entre los fosforilaciones que son llevadas a cabo destacan las de la serina 338 y la tirosina 341 o las de serina 494 y la treonina 491 (Dhillon et al. 2002). Finalmente, por retroalimentación negativa, la activación es finalizada por la fosforilación en los sitios inhibitorios por ERK y/o PKB. El restablecimiento de la forma inicial de Raf se produce por la acción conjunta de una prolil isomerasa (Pin1) que convierte los residuos de pSer y pThr de la forma cis a la trans, que es la única reconocida y desfosforilada por la fosfatasa PP2A. Por último la serina 259 es fosforilada nuevamente permitiendo la unión de dímero 14-3-3. En contraste con este complejo mecanismo de regulación, B-Raf se activa de un modo mucho más directo, requiriendo sólo la unión de Ras y la fosforilación del segmento de activación para romper las interacciones intramoleculares responsables de la autoinhibición, siendo B-Raf la principal isoforma kinasa de MAPKKK mientras que Raf-1 y A-Raf son formas divergentes de B-Raf para realizar otras funciones, aunque mutantes de B-Raf incapaces de fosforilar a MEK directamente pueden activar la cascada MEK/ERK a través de la heterodimerización con Raf-1 y su consecuente activación (Baccarini 2005). Raf tiene un papel clave en la oncogénesis de muchos cánceres humanos, ya que el 30% de los cánceres presentan mutaciones en Ras, el activador directo de Raf. B-Raf se encuentra mutado en el 7% de todos los cánceres humanos, aunque la incidencia cambia mucho dependiendo del tipo de cáncer. Por ejemplo, mutaciones de B-Raf han sido detectadas en el 70% de los melanomas, 30% de cáncer de tiroides, 15% de cáncer de colon y en menor frecuencia en otros tipos de cáncer, siendo en el 90% de las mutaciones la sustitución de una valina por el ácido glutámico en el aminoácido 600, referida como (V600E), lo cual es el resultado del cambio de una timidina por una adenosina en el nucleotido 1,799. Esto resulta en una activación constitutiva del dominio quinasa. Además, en algunos cánceres humanos se han detectado mutaciones en receptores tirosín quinasa, así como aumento de la actividad de la cascada de señalización Ras/Raf/MEK/ERK sin haber encontrado ninguna mutación. Por lo anteriormente expuesto existen muchas investigaciones en curso que buscan drogas que puedan inhibir esta vía de señalización (Leicht et al. 2007; McCubrey et al. 2007). 2.2.5.2.-Mecanismo de acción del sorafenib La molécula del sorafenib interacciona con Raf-1, B-Raf y b-Raf V600E a través del dominio quinasa, de tal forma que el anillo piridilo del extremo ocupa el bolsillo de unión de la adenina del ATP en el dominio quinasa y el resto de la molécula establece diferentes MATERIALES Y MÉTODOS 56 Puerta del Mar, Cádiz, España.  La línea OPM-2 fueron obtenidas de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Alemania.  La línea Jurkat, clon E6-1 fue obtenida de American Type Culture Collection (ATCC), USA.  Las sublíneas RPMI/vector, RPMI/Mcl-1, RPMI/Bcl-xL, RPMIshNoxaF8, MM.1S/Bcl-xL, MM.1S/Mcl-1, Jurkat/pLTHV, Jurkat/shBak, Jurkat/shBeclina-1, Jurkat/shBim, fueron generadas en nuestro laboratorio mediante infección lentiviral o retroviral (Galan-Malo 2010).  Las sublíneas Jurkat Neo, Jurkat Bcl-2 y Jurkat/CrmA fueron amablemente cedidas por el Dr. Daniel Jonhson,University of Pittsburgh, USA.  La sublínea Jurkat BclXL fue amablemente cedida por el Dr. Santos A. Susin,INSERM, Paris.  La línea HS-5 fue amablemente cedida por el Dr Reinhard Wallich, Instituto de Inmunología, Universidad de Heidelberg, Alemania.  Las líneas MEF 3T9, MEF/LC3-GFP, MEF/shBak-shBax, MEF/shATG5 fueron amablemente cedidas por la Dr. Cristina Muñoz-Pinedo de IDIBELL, Barcelona. 3.1.3.- Mantenimiento de cultivos celulares Todas las líneas celulares se cultivaron rutinariamente en frascos de cultivo de 25 cm2 (volumen máximo de células en suspensión, 20 ml) ó 75 cm2 (volumen máximo de células en suspensión, 40 ml). Todas las células se sembraron a una densidad de 15 x 104 cel/ml, excepto las de mieloma que se sembraron a una densidad mínima de 30 x 104 cel/ml. Todas las líneas de mieloma y las HS-5 se cultivaron en medio completo con 10% SFB. Mientras que las líneas de leucemia linfoblástica aguda humana y sus sublíneas se cultivaron en medio completo con 5% SFB. Las células adherentes de MEF y sus sublíneas así como las 293T se cultivaron con DMEM 10% SFB. Las células se cultivaron en un incubador termostatizado, a 37ºC, en aire saturado de humedad y con un 5% CO2. A los 3 ó 4 días de cultivo, alcanzada una densidad menor de 1 x 106 cel/ml, se realizó el pase de los cultivos. Todas las manipulaciones con células se realizaron en campanas de flujo laminar vertical en condiciones estériles. El material de vidrio usado en la manipulación de las células se esterilizó previamente en una autoclave durante 2030 minutos a 1,2 atm de presión y las disoluciones añadidas a los cultivos se esterilizaron usando filtros de 0.22 µm. 3.1.4.- Congelación y descongelación de líneas celulares Aproximadamente 6x106 células se centrifugaron a 1200 r.p.m durante 5 minutos, se MATERIALES Y MÉTODOS 57 eliminó el sobrenadante, se resuspendieron en 500 µl de medio completo conteniendo un 7,5% de DMSO y se trasvasó el contenido a un criotubo de congelación estéril. Los viales fueron introducidos rápidamente en un congelador a -80ºC. Pasadas al menos 24 horas, los viales se almacenaron en un contenedor de nitrógeno líquido (-196ºC) hasta su utilización. Para descongelar las células, se añadió lentamente a los criotubos un pequeño volumen de medio completo, hasta la descongelación de las células. En este momento, la suspensión se añadió a aproximadamente 10 ml de medio completo, y rápidamente se centrifugó a 1200 r.p.m durante 5 minutos. Tras la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, se resuspendió el pellet de las células en 5-10 ml de medio completo, según la cantidad de células congeladas. Una vez las células se recuperaron de la descongelación, se sembraron a la densidad normal. 3.1.5.- Co-cultivo de células estromales con células de mieloma múltiple Las células MM.1S fueron co-cultivadas con la línea de células estromales humanas HS5. Las células estromales HS-5 fueron sembradas aproximadamente al 50% de confluencia e incubadas durante la noche a 37°C en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, las células MM.1S fueron adicionadas a la capa de células estromales ya formadas a razón de 30 000 células por pocillo aproximadamente, permitiendo que se adhirieran durante 24h en medio RPMI 1640 completo. Las células no adheridas se eliminaron mediante un lavado suave y posteriormente se adicionaron 200 μL de medio completo con diferentes concentraciones de sorafenib. Tras 24 horas de exposición al sorafenib, las células fueron tripsinisadas, lavadas con PBS e incubadas durante 15 minutos con un anticuerpo anti-CD38 que marca específicamente las células de mieloma múltiple y se analizaron las células por citometría de flujo. De esta forma se diferenciaron las células HS-5 de las MM.1S para posteriores análisis de muerte celular (apartado 3.2.5). 3.2.- Estudio de proliferación, citotoxicidad, apoptosis y necrosis celular 3.2.1Materiales y reactivos para estudios de proliferación y citotoxicidad El azul Trypan procedió de Sigma al igual que el bromuro de dimetil-tiazolil-tetrazolio (MTT) que se utilizó como una solución estéril de 5 mg/ml preparada en suero fisiológico (PBS: NaCl 0.15 M, fosfato potásico 0.01 M, pH 7.4). Los péptidos inhibidores de proteasas benciloxicarbonil-Leu-Glu-His-Asp-fluorometilcetona (Z-LEHD-fmk), benciloxicarbonil-Asp-GluVal-Asp-fluorometilcetona (Z-DVED-fmk), benciloxicarbonil-Ile-Glu-Thr-Asp-fluorometilcetona (Z-IETD-fmk) procedieron de BD Biosciences, Madrid, España, mientras el benciloxicarbonilVal-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona (Z-VAD-fmk) fue de Bachem, Bubendorf, Suiza. MATERIALES Y MÉTODOS 58 La poli-L-lisina fue proporcionada por Sigma y el colorante Hoechst 33342 por Molecular Probes, Leyden, Holanda. La Anexina V marcada con fluoresceína (Anexina-FITC), con ficoeritrina (Anexina-PE) o con DY634 (Anexina-DY634) y el kit basado en la tinción con yoduro de propidio (PI) para analizar la distribución de células en las distintas fases del ciclo celular fue de Inmunostep, Salamanca. La Anexina V marcada con APC (Anexina-APC) procedió de BD Biosciences, Madrid, España. Las sondas fluorescentes yoduro de 3,3´-dihexiloxacarbocianina (DiOC6(3)), el tetrametilrodamina metil éster (TMRE) procedió de Molecular Probes/Invitrogen. 3.2.2.- Fármacos citotóxicos y citostáticos El sorafenib fue proporcionado amablemente por Bayer, Alemania. Apo2L/TRAIL.0 (TRAIL.0), una versión recombinante de Apo2L/TRAIL que carece de la región transmembranal y de las colas endógenas (residuos 114-281) fue amablemente proporcionado por Genentech, California, USA. El inhibidor del proteasoma bortezomib (Velcade®, PS-341) fue amablemente proporcionado por Millenium Pharmaceuticals, Cambridge, Massachussets. 3.2.3.- Contaje y determinación de la viabilidad celular La determinación de la viabilidad celular se realizó de forma rutinaria por contaje con azul Trypan, un colorante capaz de penetrar en las células muertas por tener la membrana plasmática desestructurada, tiñendo de esta forma las células de color azul. Las células vivas y las apoptóticas (que no sufren desestructuración de la membrana plasmática) no se tiñen. Para el contaje se mezclaron 50 µl de la suspensión celular y 50 µl de la solución de azul Trypan (azul Trypan al 0.4% en NaCI 0.15 M), se depositó la mezcla en una cámara Neubauer y se realizó el contaje en un microscopio óptico. Cálculos para determinar la densidad celular:  󰇛ºéó10󰇜 º Siendo 104 el factor de corrección por el volumen de la cámara. Determinación de la viabilidad celular: %decélulasviablesºé ºé100 Siendo las células totales las células vivas + células apoptóticas + células muertas. Todos los experimentos con las células se realizaron partiendo de una viabilidad celular de al menos un 90%. 3.2.4.- Determinación de la proliferación celular Para determinar la proliferación celular tras el tratamiento con drogas citotóxicas se utilizó MATERIALES Y MÉTODOS 59 una modificación del método de Mossman (Alley et al. 1988) Este método relaciona el número de células viables con la cantidad de cristales de azul formazán insolubles en medio acuoso que se produce por oxidación del bromuro de dimetil-tiazolil-tetrazolio (MTT). La cantidad de cristales formados es proporcional a la proliferación celular, lo que incluye tanto inhibición del crecimiento como muerte celular. Para poder distinguir entre ambos efectos se realizó, simultáneamente al MTT, un contaje con azul Trypan. Las células se cultivaron a una densidad de 3x105 cél/ml en placas de 96 pocillos de fondo plano, con un volumen de 100 µl/pocillo y al menos 4 pocillos por punto experimental, en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de droga citotóxica. El cultivo se incubó en la estufa durante 24 y 48 horas. Transcurrido este tiempo se añadió a cada pocillo 10 µl de una disolución de MTT (5 mg/ml) con una pipeta de repetición. Las placas se incubaron 2-3 horas a 37ºC y se centrifugaron 30 minutos, a 3500 r.p.m. Se eliminó el sobrenadante de los pocillos por inversión rápida y enérgica de la placa sobre papel de filtro. Los cristales de formazán se disolvieron añadiendo a cada pocillo 100 µl de DMSO y agitando en una placa vibradora, (Bioblock, Francia). Se midió la absorbancia de los pocillos a 550 nm en un lector de placas, MR5000, Dynatech, U.S.A., frente a los blancos apropiados (medio de cultivo sometido al mismo procedimiento que los cultivos celulares). Los resultados se presentaron como porcentaje de crecimiento de las células expuestas a las distintas concentraciones de la droga citotóxica frente al control, constituido por los cultivos sin droga. 3.2.5.- Determinación simultánea del potencial mitocondrial (∆Ψm) y la translocación de fosfatidilserina El potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) es generado por el gradiente de protones (H+) entre la matriz mitocondrial (cargada negativamente) y el espacio intermembrana (cargado positivamente). El potencial mitocondrial de las células en condiciones normales es alto y constante (~ 130 mV), pero disminuye en las primeras etapas del proceso apoptótico, como consecuencia de la despolarización de las mitocondrias. Para la medida de este potencial se utilizó la sonda fluorescente verde lipofílica DiOC6(3) (λabs=485 nm, λem=505nm) que está cargada positivamente, por lo que se acumula en la matriz mitocondrial de las células viables. Cuando desciende el valor del potencial, es decir, en las primeras etapas de la apoptosis, desciende la cantidad de sonda retenida en la matriz, disminuyendo la fluorescencia. Dado que las sublíneas RPMI/vector, RPMI/Mcl-1, RPMIshNoxaF8 y MM.1S/Mcl-1 expresan también la proteína GFP introducidas en el vector de infección lentiviral como control de estas. En estas células hemos utilizado como sonda alternativa al DiOC6(3) el TMRE, una sonda con la misma función pero que emite fluorescencia roja (λabs=549 nm, λem=574 nm). Cuando la célula ya está en un proceso de apoptosis mas avanzada, se produce la exposición de fosfatidilserina desde la cara interna de la membrana plasmática a la cara externa, lo que conduce, en condiciones fisiológicas, a la fagocitosis de la célula apoptótica por los macrófagos. La exposición de fosfatidilserina es, pues, un evento indicador de apoptosis. MATERIALES Y MÉTODOS 60 Para medir la translocación de fosfatidilserina a la cara externa de la membrana plasmática, se utilizó Anexina V, una proteína que une específicamente este fosfolípido. Hemos utilizado Anexina V unida tanto a la molécula fluorescente roja PE (ficoeritrina) (λabs=480-565 nm, λem=578 nm), como a la molécula fluorescente verde FITC (isocianato de fluoresceína) (λabs=490 nm, λem=514 nm). El tener dos sondas que emiten a longitudes de onda diferentes, tanto para analizar el potencial de membrana mitocondrial como la exposición de fosfatidil serina, nos permite medir los dos parámetros simultáneamente en una misma célula, combinando estas sondas de forma que no interfieran entre ellas. Las células (3x105), control y tratadas, se recogieron en tubos eppendorff y se incubaron en 200 µl de una dilución 2 nM de la sonda DiOC6(3) en un tampón óptimo para el funcionamiento de la anexina V (Hepes/NaOH 10 nM pH 7.4, NaCl 140 mM, CaCl2 2.5 mM) y que llamaremos ABB (Annexin Binding Buffer). Conjuntamente, se añadieron 0.5 µl de Anexina V-PE (0.1 µg/ml) y se incubaron durante 15 minutos a 37 ºC y en oscuridad para permitir la entrada de la sonda DiOC6(3) a las mitocondrias y la unión de la anexina a la fosfatidilserina en la membrana. Finalmente, las muestras se diluyeron con un volumen variable del tampón ABB (dependiendo del número de células que se tuvieran) y se analizaron en un citómetro de flujo. Los resultados obtenidos por citometría se analizaron utilizado los programas informáticos Cell Quest y Weasel. En el caso de las sublíneas modificadas, el protocolo fue exactamente el mismo, pero utilizando TMRE para medir el potencial mitocondrial (25 nM en ABB) y Anexina-V APC o DY634 (1 µl) para determinar la exposición de fosfatidilserina. Este mismo protocolo se utilizó para las líneas celulares RPMI ya que estas células unen inespecíficamente la ficoeritrina (PE). 3.2.6.- Citometro de flujo Durante esta tesis se usaron dos citometros de flujos analizadores. El FACScan BD y el FACSCalibur. Abos citometros cuentan con el laser de 488 nm pero el FACSCalibur cuenta además con el laser de 633 nm, por lo que éste último tiene cuatro canales de detección mientras que FACScan BD solo tres, además del FSC y SSC. Excitación con el laser de 488 nm. FSC Forward Scatter = tamaño celular SSC Side Scatter = Granulocidad FL1 Verde (530 ± 15 nm) DiOC6(3), FITC, Alexa488, GFP, YFP, CFSE, Fluo-4. FL2 Naranja (585 ± 21 nm) TMRE, R-PE (PE), Cy3, Alexa555, PI. FL3 Rojo (670 nm) MATERIALES Y MÉTODOS 61 7AAD, PerCP, PerCP-Cy5.5, RFP Excitación con el laser de 633 nm. FL4 Rojo (661 ± 8 nm) APC, Alexa633, Alexa647, DY634 3.2.7.- Análisis del ciclo celular Se analizó el efecto del sorafenib en la distribución del ciclo celular, ya que muchas drogas citotóxicas producen parada en el ciclo celular, bien en la fase G0/G1, bien en la fase G2/M, lo que explica el efecto inhibidor del crecimiento de la mayoría de ellas. Se recogieron 1x106 células y se lavaron en 500 µl de PBS. Tras el lavado, las células se fijaron con 1 ml de etanol al 70% preenfriado en hielo. El etanol se añadió gota a gota sobre las células, mezclándolas suavemente con un vórtex para resuspender las células y evitar la formación de agregados. Una vez fijadas, las células se pueden guardar a -20ºC hasta su análisis, y de hecho, es aconsejable mantenerlas a esta temperatura al menos 24 horas antes de seguir con el protocolo. Si no se guardaron, se incubaron 30 minutos a 4ºC. Posteriormente, las células se lavaron con 500 µl de PBS, se centrifugaron 10 minutos a 3000 r.p.m. a 4ºC y se resuspendieron en 100 µl de la solución de PI/RNasa. Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, las muestras fueron analizadas en el citómetro de flujo y los datos se procesaron con el software Modfit. 3.3.- Análisis de la expresión de proteínas 3.3.1.- Materiales y reactivos para análisis de la expresión de proteínas 3.3.1.1.- Reactivos para la extracción e inmunoprecipitación de proteínas Para la obtención de proteínas de extractos celulares totales se utilizaron los siguientes productos: Tritón X-100, Tris/HCl, sacarosa, EDTA, ortovanadato sódico (Na3VO4), pirofosfato sódico (Na4P2O5), fluoruro de fenilmetilsulfonio (PMSF), fluoruro de sodio (NaF), leupeptina, βmercaptoetanol, digitonina, DTT, azul de bromofenol y solución de lisis RIPA, todos ellos proporcionados por Sigma, Madrid, España. El cloruro de sodio (NaCl) y el dodecilsulfato de sodio (SDS) fueron de Merck, y el glicerol, de Scharlau. El cóctel de inhibidores de proteasas procedió de Roche. 3.3.1.2.- Materiales y reactivos para electroforesis de proteínas y transferencia a membranas Para la electroforesis de proteínas se emplearon los siguientes productos: 30% MATERIALES Y MÉTODOS 62 acrilamida/bisacrilamida proporcionada por BioRad, persulfato amónico procedente de Serva (Heilderberg, Alemania). N,N,N,N´- tetrametiletilendiamina (TEMED) y rojo Ponceau procedentes de Sigma y marcadores de pesos moleculares coloreados Novex® Sharp Prestained Standars suministrados por Invitrogen. En la transferencia de proteínas a membranas se utilizaron: membranas de nitrocelulosa (Hybond C-extra) proporcionadas por GE Healthcare, metanol (grado HPLC) procedente de Panreac y glicina y Tween 20 obtenidos de Sigma. Para el lavado de las membranas se utilizó NaCl, procedente de Merck y Tris, Tween 20 y timerosal, todos ellos de Sigma. 3.3.1.3.- Anticuerpos y reactivos inmunoquímicos Anticuerpos primarios utilizados en Western Blot Anticuerpo Tipo, Especie, origen Dilución Proveedor α-tubulina Mc, ratón, clon B51-2 1/10000 Sigma β-actina Mc, ratón, clon AG15 1/10000 Sigma Bcl-xL/S Pc, conejo, sc-1041 1/500 Santa Cruz Bcl-xL Pc, conejo 1/1000 Cell Signaling Bcl-2 Pc, conejo, sc-783 1/500 Santa Cruz Beclina 1 Mc, ratón, clon 20/beclin 1/1000 BD Biosciences Bid Pc, cabra, AF860 1/250 R&D Systems Bik Pc, cabra, sc-1710 1/1000 Santa Cruz Bim Pc, conejo, NºCat.202000 1/1000 Calbiochem Caspasa 3 Pc, conejo 1/1000 Cell Signaling Caspasa 3 activa Pc, conejo 1/1000 Cell Signaling Caspasa 8 Mc, ratón, clon 5F7 1/500 MBL Citocromo c Mc, ratón 1/1000 BD Biosciences Erk 2 Pc, conejo 1/10000 Santa Cruz FLIPL/S Mc, ratón, NF6 1/500 Alexis FADD Pc, cabra 1/500 Santa Cruz LC3-B Pc, conejo 1/1000 Sigma Mcl-1 Pc, conejo, sc-819 1/1000 Santa Cruz Noxa Mc, ratón, clon 114C307.1 1/250 Abcam pAkt (s473) Conejo 1/5000 C.I.C. Salamanca p4E BP Conejo 1/2000 Cell Signaling pErk 1/2 Ratón 1/5000 Santa Cruz pGsk 3 Conejo 1/2000 Santa Cruz pMek 1/2 Conejo 1/5000 Santa Cruz pS6 Conejo 1/20000 Santa Cruz pStat 3 Mc, Ratón, clon 4/P-STAT3 1/1000 BD Biosciences pStat 5 Mc, Ratón, clon 47 1/1000 BD Biosciences Puma Pc, conejo, Nº Cat.4976 1/500 Cell Signaling Survivina Pc, conejo, NB500-201 1/2000 Novus XIAP Mc, ratón, clon 28 1/250 BD Biosciences MATERIALES Y MÉTODOS 63 Los anticuerpos secundarios dirigidos contra las IgGs de conejo, ratón o cabra, marcados con fosfatasa alcalina o con peroxidasa, procedieron de Sigma, Madrid, España. Los reactivos utilizados para el revelado por quimioluminiscencia (ECL) fueron Immobilon Western Chemiluminescent HRP/PA Substrate, de Millipore y el film usado para dicho revelado fue Hyperfilm ECL, de GE Healthcare. Los líquidos de revelado y fijado fueron de AGFA. Relación de los anticuerpos primarios utilizados en citometría de flujo. Anticuerpo Especie, origen Concentración (µl/106 cél) Proveedor Bak Mc,ratón, clonTC100 3 Calbiochem Bax Mc, ratón, clon 6A7 1 BD Biosciences Citocromo c Mc, ratón, clon 6H2B4 0.5 BD Biosciences IgG2a Mc, ratón, Nº Cat. MG2a00 3 Invitrogen IgG1 Mc, ratón, Nº Cat. MG100 1 Invitrogen Caspasa 3 activa (FITC) Pc, conejo 20 BD Biosciences CD19-PE Mc,ratón clon HIB19 20 BD Pharmingen CD38-FITC Mc,ratón clon HI72 20 BD Pharmingen CD38-PE Cy5 Mc, ratón, clon HIT2 20 BD Pharmingen CD38-Tricolor Mc, ratón, clon HIT2 20 Caltag CD38-APC Mc, ratón, clon HIT2 20 Invitrogen CD45-PE Mc,ratón clon HI30 20 Caltag CD45-PECy5 Mc,ratón clon HI30 20 BD Pharmingen CD45-APC Mc,ratón clon HI30 20 BD Pharmingen CD56-FITC Mc,ratón clon BI59 20 Caltag CD56-PE Mc,ratón clon BI59 20 BD Pharmingen CD56-APC Mc,ratón clon BI59 20 BD Pharmingen CD138-FITC Mc, ratón, clon MI15 20 BD Pharmingen Los anticuerpos secundarios contra las IgGs de ratón, marcados con Alexa 488, se obtuvieron de Invitrogen. 3.3.2.- Métodos para el análisis de proteínas por western blot 3.3.2.1.- Extracción y fraccionamiento de lisados celulares totales con detergentes Tras someter a las células a diversos tratamientos, se tomaron 5x106 células en tubos de fondo cónico y se centrifugaron 5 minutos a 1200 r.p.m. Se eliminó el sobrenadante, se lavaron con 1 ml de PBS y se transfirieron a tubos eppendorff. Se añadieron 100 µl de solución de lisis y se incubaron 30 minutos a 4 ºC en baño de hielo. Se utilizaron dos tipos de tampones de lisis: Solución de lisis 1x: Se utilizó para la extracción de proteínas citoplasmáticas. Está compuesto de: Tritón X-100 al 1% (v/v), Tris/HCl 50 mM pH 7.6, EDTA 1 mM, ortovanadato MATERIALES Y MÉTODOS 64 sódico 1 mM, pirofosfato sódico 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonio 1 mM, fluoruro de sodio 10 mM, leupeptina 10 µg/ml, cloruro de sodio 150 mM y glicerol 10 % (v/v). Solución de lisis RIPA: Se utilizó para extraer mejor todas las proteínas de la célula, incluidas las mitocondriales y las nucleares. Está compuesto de: Tris/HCl 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, Igepal CA-630 (NP-40) 1%, deoxicolato de sodio 0.5% y SDS 0.1%. Se utilizó una solución u otra dependiendo de la localización celular de la o las proteínas a detectar. Los tubos se centrifugaron 5 min a 12000 r.p.m. a 4ºC y el sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorff, donde se añadieron además 50 µl de un tampón de carga concentrado 3x, con la siguiente composición: Tris/HCl 150 mM pH 7.4, SDS 3%, molibdato de sodio 0.3 mM, pirofosfato sódico 30 mM, fluoruro de sodio 30 mM, glicerol 30 % (v/v), β-mercaptoetanol 30% (v/v) y azul de bromofenol 0.06% (p/v). Finalmente los lisados celulares se calentaron a 100 ºC en un baño seco (Selecta) durante 5 min y se guardaron a -20ºC hasta su utilización. 3.3.2.2.- Inmunoprecipitación de proteínas Esta técnica se utilizó para detectar proteínas que se encontraban a concentraciones muy bajas y específicamente para Erk5 y pAkt. Se partió de 8x106 células, las cuales fueron lavadas con PBS y lisadas con tampón de lisis frio (140 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.0, 10 mM EDTA, 10% glicerol; 1% Tritón X-100, 10 M pepstatina, 10 g/ml aprotinina, 10 g/ml leupeptina, 1mM PMSF, 25 mM -glicerofosfato, 10 mM fluoruro de sodioy 1 mM ortovanadato de sodio). Las células lisadas fueron centrifugadas (10,000 x g, 10 minutos) y Erk5 y fosfo-Akt fueron inmunoprecipitados del sobrenadante (1 mg de proteínas determinada por el ensayo de Bradford) mediante anticuerpos contra estas proteínas los cuales se incubaron a 4ºC overnight. Posteriormente se adiciono proteína A-Sepharose. Los inmunocomplejos fueron recuperados por centrifugación y lavados 3 veces con 1 mL del tampón de lisis frío. Finalmente fueron analizados por electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE y western blotting. 3.3.2.3.- Separación de proteínas celulares mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS La separación de proteínas celulares en función de su peso molecular se realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida que contenían SDS al 0.1%. El porcentaje de poliacrilamida varió entre el 10 y el 15%, dependiendo del tamaño de las proteínas a analizar. Las electroforesis se realizaron en cubetas de electroforesis de BioRad o Hoefer miniVE, GE Healthcare. Las muestras de lisados se calentaron a 100ºC durante 5 minutos, se centrifugaron (30 segundos, 10000 r.p.m) y se cargaron en los pocillos del gel (10 µl / pocillo). Las electroforesis se realizaron a un voltaje de 150 V durante ~ 2 horas. MATERIALES Y MÉTODOS 65 3.3.2.4.- Transferencia de las proteínas a membranas de PVDF Las proteínas separadas en el gel se transfirieron a una membrana de PVDF según un método previamente descrito (Talanian et al. 1997), utilizando un tampón de transferencia compuesto de: Tris/HCl 48 mM pH 8.3, glicina 39 mM, SDS 0.037% y metanol 20 % (v/v), de calidad HPLC. La transferencia se realizó en un equipo de transferencia semiseca de BIO-RAD a 20 V y 400 mA durante 55 minutos. La eficacia de la transferencia se verificó tiñendo la membrana con rojo Ponceau. 3.3.2.5.- Análisis de proteínas por inmunotransferencia y detección de los inmunocomplejos Las proteínas celulares fijadas en las membranas de nitrocelulosa se analizaron con la ayuda de anticuerpos específicos, y los pesos moleculares relativos de las proteínas detectadas, se calcularon en relación a los marcadores de pesos moleculares estándar coloreados Novex® (7µl/pocillo). Tras la tinción con rojo Ponceau, la membrana de nitrocelulosa se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% (p/v), disuelta en PBS, durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Una vez bloqueada, se lavó 3 veces durante 5 min con una solución de lavado que contenía: NaCl 0.12 M, Tris/HCl 10 mM pH 8.0, Tween 20 0.1 % (p/v) y timerosal (0.1 g/L) en PBS pH 7.4 (denominada tampón B). Posteriormente se incubó con el anticuerpo primario específico (diluido en tampón B, con un 2% de leche desnatada en polvo) para detectar la proteína deseada. Las diluciones y el tiempo de incubación se determinaron en cada caso dependiendo del anticuerpo utilizado. Finalizada la incubación, la membrana se lavó abundantemente (3 veces durante 5 min mediante agitación moderada en tampón B) y se incubó esta vez con un anticuerpo secundario (diluído en tampón B con un 2% de leche desnatada en polvo) durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitación suave. La concentración utilizada del segundo anticuerpo (marcado con fosfatasa alcalina o con peroxidasa) fue de 0.2 µg/ml en todos los casos. Finalizada la incubación, se retiró la solución de anticuerpo y se lavó la membrana 3 veces durante 5 min agitando moderadamente con tampón B. Quimioluminiscencia (ECL): está basada en la detección de luz emitida tras la oxidación de un sustrato quimioluminiscente. El anticuerpo secundario puede estar marcado con HRP (peroxidasa de rábano) o con PA (fosfatasa alcalina). La membrana se incubó durante un tiempo determinado con el sustrato para la HRP (en este caso el sustrato fue luminol), bien para la PA (el sustrato fue el dioxetano modificado CPS-Star). Dichas enzimas catalizaron la reacción de oxidación del sustrato, que emite luz al volver a su estado original. Esta luz es captada por películas de tipo radiográfico que posteriormente se revelan en un cuarto oscuro. Después de las incubaciones con los anticuerpos y de haber lavado correctamente para evitar la aparición de fondo oscuro, la membrana se incubó, bien con una solución de luminol Immobilon Western Reagent (Millipore) durante 90 segundos, bien con una solución de sustrato MATERIALES Y MÉTODOS 72 La reacción se llevó a cabo en un termociclador y constó de cuatro etapas, que se desarrollaron siguiendo las instrucciones del fabricante: a) Retrotranscripción. 1 minuto a 80ºC 5 minutos a 45ºC 15 minutos a 25ºC 15 minutos a 37ºC 2 minutos a 98ºC b) Hibridación. 15 minutos a 25ºC 1 minuto a 95ºC 16 horas a 60ºC c) Ligación. 25 minutos a 54ºC 5 minutos a 98ºC 4ºC d) Amplificación. 2 minutos a 95ºC 30 segundos a 95ºC 30 segundos a 60ºC 1 minuto a 72ºC 20 minutos a 72ºC 4ºC Al finalizar la reacción, los tubos se mantuvieron a 4ºC hasta que se procesaron con el secuenciador capilar 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Una vez procesadas las muestras, los datos obtenidos se analizaron con el programa PeakScanner, de Applied Biosystems. 3.5.2.4.- Electroforesis de DNA en gel de agarosa Se preparó el gel de agarosa al 1% disolviendo la agarosa en 30 ml de TBE 1X mediante hervido. Esta mezcla fue vertida en unos moldes para su gelificación. Previamente a ésta, se añadió SYBR a la agarosa (a una concentración 1/10000) para teñir el DNA y poder MATERIALES Y MÉTODOS 73 visualizarlo. A la muestra de DNA se le añadió el tampón de carga coloreado para poder conocer en todo momento la posición del frente de la muestra. Para estimar el peso de los fragmentos se utilizaron los marcadores de los pesos moleculares. La elección del marcador se basó en el tamaño del DNA de trabajo y en si se quiso cuantificar la muestra o simplemente analizarla. En nuestro caso, se utilizó el marcador 100 pb DNA Ladder, con el que sólo se pudo realizar un análisis cualitativo. La electroforesis se realizó a 90V, 400mA durante 30 minutos. Se visualizó en el transiluminador y se analizó el resultado mediante el programa informático Bio-Rad MutiAnalyst (PC versión 1.1). 3.5.2.5.- Análisis de RNA mediante PCR en tiempo real (Real Time PCR) La PCR a tiempo real se utiliza para cuantificar el DNA. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de DNA, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una DNA polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda adecuada, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación, de ahí el nombre de PCR a tiempo real. En la técnica de PCR se pueden utilizar fluoróforos no específicos o sondas moleculares dependientes de la secuencia: En las técnicas basadas en fluorocromos inespecíficos se detecta la generación exponencial de DNA de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecíficamente a aquél. Un ejemplo de colorante que permite esta detección es el SYBR Green que, excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm). Posee la ventaja de requerir sólo un par de cebadores para efectuar la amplificación, lo que abarata su coste; sin embargo, sólo es posible amplificar un producto en cada reacción. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan al menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente. Un tipo de sondas específicas son las sondas TaqMan, que permiten medir la generación de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos. Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el 5' que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener. De este modo, cuando se efectúa la PCR (con la sonda más el par de cebadores específicos), la sonda hibrida en el amplicón, pero, debido a la cercanía del fluoróforo al quencher, no se emite fluorescencia; cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, la emisión de fluorescencia. Fluorescencia que es detectada por el MATERIALES Y MÉTODOS 74 equipo y que está relacionada con la cantidad de amplicón producido. La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la señal de amplificación obtenida con el contenido en DNA empleando una curva de calibrado; para este enfoque es vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de amplificación. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de RNA mensajero (mRNA) interpretado como DNA complementario (cDNA, generado por retrotranscripción del mRNA); esta cuantificación relativa es más fácil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparación entre el nivel de expresión del gen a estudiar versus un gen control (también llamado de referencia, interno o normalizador o, en inglés, housekeeping gene). 3.5.2.5.- Desarrollo de la PCR cuantitativa En nuestro caso, se utilizó, como molde de la reacción, el cDNA obtenido previamente mediante retrotranscripción de mRNA (acápite 3.5.2.2). Para detectar la fluorescencia se utilizaron las sondas específicas TaqMan. Llevamos a cabo una cuantificación relativa, utilizando β-glucuronidasa como gen interno de referencia. Para poder cuantificar, se emplearon rectas patrón compuestas de las células control, es decir, sin el tratamiento con la droga. Del cDNA se realizaron diluciones seriadas del cDNA usándose las siguientes concentraciones referidas a la cantidad total de cDNA: 500ng, 50ng, 5ng y 0,5 ng para algunos casos. Para otros se partió de 100ng de cDNA realizándose las mismas diluciones. Para todas las sondas analizadas se realizó una recta patrón para la sonda problema y para la glucuronidasa. De cada muestra se realizaron triplicados para cada punto, tanto para la sonda problema como para el control endógeno. Como control negativo se usó una muestra de agua libre de RNasas y también se realizaron triplicados. Siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems), para cada muestra se preparó la siguiente mezcla: 10µl de Master Mix. 1µl de Sonda Taqman. Se preparó una mezcla común teniendo en cuenta el número de muestras y se dispensó 11 µl de mezcla por muestra. Tras esto se añadió en cada pocillo 4 µl de muestra y 5 µl de agua libre de RNAsas. La relación de sondas empleadas fue la siguiente: TaqMan® Gene Expression Assay Secuencia Referencia Bim (Hs00375807_m1) Puma (Hs00248075_m1) Glucuronidasa TGACTGAACAGTCACCGACGAGAGT Hs99999908_m1 MATERIALES Y MÉTODOS 75 Como soporte se emplearon las placas de 96 pocillos y se sellaron para la reacción con coberturas adhesivas. La PCR se llevó a cabo según las condiciones del fabricante: 10 minutos a 95ºC 15 segundos a 95ºC 1 minuto a 60ºC La reacción se llevó a cabo en el termociclador StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems) amablemente cedido por el Dr. Carlos Martín (Grupo de Genética de Micobacterias, Universidad de Zaragoza). 3.6Obtención y análisis de células obtenidas a partir de muestras de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple 3.6.1.- Obtención de células plasmáticas a partir de aspirados de médula ósea Se obtuvieron células plasmáticas mielomatosas (MMs) a partir de aspirados de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple. Las muestras fueron proporcionadas por el Servicio de. Hematología del Hospital Clínico de Zaragoza. La muestra de partida consistió en 0.5-1 ml de aspirado de médula ósea obtenido por punción en la cresta ilíaca. En gran parte de las muestras existía contaminación con restos de tejido del estroma medular. Por ello, para evitar posibles conglomerados de granulocitos y otras células que impidieran la total extracción de las células mielomatosas, se realizaron dos extracciones con Ficoll-Paque para cada muestra. En cada extracción un volumen concreto de la muestra diluida en medio RPMI completo se añadió sobre el mismo volumen de FicollPaque. La adición se realizó de forma lenta, evitando la mezcla de las dos fases. Se centrifugaron los tubos a 1400 r.p.m. sin freno durante 20 minutos. Los anillos de células mononucleadas (linfocitos T, linfocitos B, monolitos, células plasmáticas normales, células mielomatosas, células del estroma de la médula, etc.) se aspiraron con una pipeta Pasteur y se trasvasaron a un tubo que contenía 10 ml de medio RPMI completo. Se centrifugaron a 1200 r.p.m. durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 3-5 ml de medio RPMI completo. Se realizó el contaje de las células y se determinaron la viabilidad y la densidad celular. Una parte de las células se reservaron para realizar el inmunofenotipo (ver apartado 3.6.2) y el resto se sembraron a densidad de 5x106 cél/ml en medio RPMI completo para evaluar su sensibilidad a diferentes drogas citotóxicas. Para mejorar la supervivencia in vitro de las células mielomatosas, se añadió 1000 U/ml de interleuquina-6 (IL-6), una citoquina muy importante como factor de crecimiento para las 40 ciclos MATERIALES Y MÉTODOS 76 células de MM. 3.6.2.- Inmunofenotipado y marcaje de células plasmáticas Una característica importante de las células de MM es su heterogeneidad, sobre todo en cuanto a marcadores de membrana. Estos marcadores son muy útiles para distinguir células mielomatosas (MMs) de células plasmáticas normales (PCs) y de linfocitos sanos, presentes en la población heterogénea de células mononucleares de médula ósea obtenida con el método anterior. Para realizar el inmunofenotipado, se tomaron 2x105 células, se centrifugaron y se lavaron con PBS. Se resuspendieron en 100 µl de ABB con 0.2 % de albúmina bovina y la suspensión se dividió en dos tubos eppendorfs; a uno se le añadió la mezcla de anticuerpos A y al otro, la mezcla B: MezclaA : 4 µl CD-138-FITC/ 4 µl CD-56-PE/ 4µl CD 45-PECy5/ 4 µl CD38-APC Mezcla B: 4 µl anexina-FITC/ 4 µl 7-AAD/ 4 µl CD38-APC Se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, se lavaron con ABB y se diluyeron hasta 1 ml con ABB y se analizaron en el citómetro de flujo usando un protocolo de 4 colores específicamente diseñado para este fin. Para evaluar la toxicidad de distintas drogas sobre la mezcla de células, se tomaron 2x105 células por punto, se centrifugaron y se lavaron con ABB. Se resuspendieron en 100 µl de ABB + 0.2% albúmina bovina y se añadió la mezcla B; se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La suspensión se centrifugó y se resuspendió en 500 µl de ABB y se analizó por citometría de flujo. 3.6.3.- Separación de poblaciones celulares mediante MACS (separación celular basada en campos magnéticos) En la realización de algunos experimentos se ha partido de muestras de pacientes, de la cual nos interesaba estudiar sólo la población de células mielomatosas CD138+. Para hacer esto, se han separado las células de interés mediante anticuerpos anti CD138 unidos a microesferas metálicas y posterior selección positiva en columnas colocadas en el interior de un campo magnético (Miltenyi Biotec, Alemania). Para ello, se resuspenden las células en PBS suplementado con 0,5% de BSA o SFB y 2 mM de EDTA (tampón MACS) en una proporción de 80 µl de tampón MACS por cada 1x106 células. Posteriormente, se añadió 20 µl del anticuerpo conjugado con microesferas metálicas, se incubó 15 minutos a 4ºC y se lavó con tampón MACS. A continuación, se procedió a la separación en columnas de tipo LS (Miltenyi), según las instrucciones del fabricante. Existen dos tipos de separaciones, positiva y negativa. En la positiva, se añade directamente el anticuerpo conjugado que reconoce las células que se quieren separar, por lo que obtenemos MATERIALES Y MÉTODOS 77 las células que nos interesan unidas al anticuerpo. También se puede realizar la separación negativa, que consiste en añadir anticuerpos unidos a las microesferas, que reconocen todas las poblaciones presentes en la mezcla excepto la que se quiere obtener. Salvo que se indique lo contrario, en todos los casos se utilizó la separación positiva. 3.7.-Sobreexpresión mediante infecciones retrovirales Esta técnica se ha empleado para obtener células que sobreexpresen un gen de forma estable. Consiste en la generación de retrovirus capaces de integrar parte de su genoma en los cromosomas eucariotas. El gen exógeno introducido en el genoma del virus se inserta en el DNA de las células eucariotas y tras un clonaje por dilución límite, se obtienen líneas celulares estables que sobreexpresan el gen de interés. Se emplearon los vectores, pBave-mRFP-LC3 construido en nuestro laboratorio por Marta Pérez y la construcción MMP-1-AU1-BclXL amablemente cedida por el Dr. X. Pimentel-Muiños (CIC Salamanca). 3.7.1.-Generación de los retrovirus Se empleó la línea celular 293T como células empaquetadoras (ver apartado 3.1) y además de los plásmidos que contienen las secuencias para modificar las células se emplearon dos plásmidos más: -pMDG-VSV: Contiene las secuencias que codifican para las proteínas de envuelta del virus). -pNVUL-MLV-gag-pol (que contiene las secuencias codificantes para las proteínas de la cápside vírica y la retrotranscriptasa del virus). El protocolo seguido (Carvajal-Vergara et al., 2005) consistió en sembrar las células 293T (1,8x106) en 3 ml de DMEM completo en placas de 60 mm. Tras 24 horas se añadió a cada placa 1 μl de cloroquina 25 μM y se agitaron las placas suavemente. Se prepararon las mezclas de transfección (1 ml) con los siguientes componentes: 2.5 μg de plásmido con el inserto. 2.5 μg de pMDG.2. 5μg de pNVUL-MLV-gag-pol. 61 μl de Ca Cl2 2M (Merk). 500 μl de HBS 2X (NaCl 274 mM, Merck; Hepes 50 mM, Sigma; Na2HPO4 1,5 mM, Merck; pH 7). Hasta 1 ml de H2O MilliQ estéril. Se mezcló todo mediante burbujeo durante 15 segundos con una pipeta Pasteur provista de filtro. Se dispensó gota a gota cada mezcla sobre su correspondiente placa, se agitaron las placas suavemente y se mantuvieron en cultivo durante al menos 6 horas. Transcurrido este MATERIALES Y MÉTODOS 78 tiempo se sustituyó el medio de transfección por 4 ml de OptiMEM (GibcoTM, Invitrogen). Tras 48 horas más en cultivo se recogieron los 4 ml de sobrenadante que contenían los virus y se filtró mediante filtros de 0,22 μm (Pall Corporation, USA) para eliminar los restos celulares de 293T. La eficiencia de la transfección se comprobó mediante análisis por microscopía de fluorescencia de la expresión de RFP o por Western blot. 3.7.2.-Infección de células eucariotas con retrovirus Para cada infección se sembraron 1,5-2x105células de la línea correspondiente en el sobrenadante lentiviral. Se centrifugaron durante 2 horas a 1500 r.p.m y a 37ºC. Se añadió a cada infección una concentración final de 6 μg/ml de polibreno (Sigma) para incrementar la eficiencia de infección de los lentivirus. Tras la centrifugación se resuspendieron las células en medio completo y se incubaron 48 horas. Transcurrido este tiempo se analizó la eficiencia de la infección mediante análisis por microscopía de fluoerescencia de la expresión de RFP y se realizó la selección clonal por dilución límite según se indica en el siguiente apartado. Todo el material utilizado hasta aquí se autoclavó para eliminar los posibles restos de virus. 3.7.3.-Obtención de líneas estables mediante clonaje por dilución limite Para obtener líneas estables homogéneas en su nivel de sobreexpresión se procedió a la selección de clones mediante dilución límite. Previamente se preparó medio acondicionado (medio completo de un cultivo de la misma línea celular tras 24 horas, centrifugado y filtrado) para cada una de las líneas modificadas. En 30 mL de medio acondicionado se resuspendieron y se sembraron 150 células, en placas de 96 pocillos de fondo redondo (100 μl/pocillo). De este modo se logra que en alguno de los pocillos sólo haya sido sembrada una célula, que podrá dividirse gracias a las citoquinas y factores de crecimiento presentes en el medio acondicionado. Se mantuvieron en cultivo las placas durante tres semanas. Posteriormente se seleccionaron los pocillos en los que había células fluorescentes, analizadas en el microscopio óptico de fluorescencia (Nikon, TE300/TE200). A los clones seleccionados se les añadió unos 100 μL de medio completo (10% SFB) y aquellos que proliferaron se sembraron en placas de 24 pocillos con 500-1000 μl de medio completo. Aquellos que continuaron proliferando se sembraron en placas de seis pocillos y posteriormente en frascos de cultivo T25 o T75 (TPP). En el caso de la sobreexpresión de Bcl-XL, el plásmido no tenía incorporado ningún gen de proteína fluorescente, por lo que se analizaron por western blot todos los clones obtenido. Una vez que se obtuvo cantidad suficiente de los cultivos se analizó el porcentaje e intensidad de fluorescencia de cada clon por citometría de flujo. Se seleccionaron aquellos clones que presentaban mayor intensidad de fluorescencia y se analizó mediante Western Blot la expresión de la proteína sobreexpresada. Aquellos clones que presentaban mayor nivel de modificación se expandieron y se utilizaron en los experimentos de inducción de apoptosis con drogas antitumorales. MATERIALES Y MÉTODOS 79 3.8.- Desarrollo tumoral en ratones En ratones machos Nude de 8-9 semanas de edad se inyectaron subcutáneamente 1x106 células NCI-H929, recogidas en fase exponencial de crecimiento, en 100 µl de matrigel de Sigma. Posteriormente se analizó el desarrollo del tumor mediante la medición del tumor diaria con un calibre de precisión. Para calcular el volumen del tumor, se midió el ancho (A), largo (L) y alto (T) del tumor y se aplicó la siguiente fórmula: 4 3 2 Cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 100 mm3, se dividieron aleatoriamente en dos grupos (control y tratados) y diariamente durante los siguientes 15 días se les administro vehículo o sorafenib (80 mg/kg de peso). Los ratones se sacrificaron 15 días posteriores a la finalización del tratamiento o cuando el tumor alcanzó 1 cm3 de tamaño. 3.9.- Análisis de células madres tumorales de mieloma múltiple Los datos en la bibliografía son, hasta la fecha, contradictorios en cuanto a que fenotipo deben tener las células madre tumorales de mieloma múltiple. Según diferentes trabajos podrían ser las células CD138 negativas o las células aldefluor positivas. Para las células CD138 negativas se siguieron los mismos protocolos ya descritos para el marcaje (acápite 3.3.5) y separación (acápite 3.7) pero, en este último caso, realizando una separación negativa, es decir quedándonos con las población no unida al anticuerpo y por tanto, no retenida en la columna. 3.9.1.- Marcaje con la sonda aldefluor Para esto se uso el Kit de aldefluor de STEMCELL Technologies Inc. Éste sistema se basa en un método no inmunológico para identificar células madres y progenitoras humanas en base a su actividad aldehído deshidrogenasa (ALDH). Ya que se ha descrito una mayor expresión de esta enzima en las células madre con respecto a las células normales. Las células que expresan altos niveles de esta enzima pueden ser detectadas y aisladas mediante citometría de flujo. Este método ofrece una alternativa a los métodos tradicionales de identificación de células madre mediante antígenos de superficie. Este kit consta de un tampón (TA) que es utilizado para la resuspensión de las células durante el marcaje y para los lavados necesarios, un reactivo llamado DEAB, el cual es un inhibidor de la ALDH y la sonda Aldefluor la cual es sustrato de la ALDH generando una sonda fluorescente que es detectada por citometría de flujo. Se tomaron 1x106 células, se lavaron y se resuspendieron en 1 mL del tampón proporcionado por el Kit (TA). Simultáneamente se tomó otro tubo al que se le adicionó 5 μL del MATERIALES Y MÉTODOS 80 reactivo DEAB y se rotuló como control. A la suspensión de células se le adicionó 5 μL de reactivo aldefluor, se mezcló rápidamente y se transfirió 0,5 mL al tubo control mezclándolo rápidamente. Ambos tubos se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC. Luego se lavó y centrifugó y se resuspendió en 500 μL del tampón TA y se analizó por citometría de flujo. 3.10.- Análisis informático de datos 3.10.1.- Estadística El análisis estadístico de la significancia fue realizado mediante un análisis de varianza (ANOVA) o el cálculo de la t Student empleando el programa GrandPath Prism 4.0. (GrandPath Software, Inc., San Diego, CA, USA) 3.10.2.- Análisis del efecto de la combinación de drogas Se utilizó el programa informático Calcusyn versión 2.0 (BioSoft) para analizar si al combinar diferentes fármacos se observaba un efecto sinérgico, aditivo o antagónico entre las drogas. Tras introducir los datos correspondientes, el programa informático determinó el efecto de la combinación de distintas drogas mediante los cálculos de relación dosis/efecto (Chou and Talalay 1984). Así, un valor aproximadamente igual a 1 indicó efecto aditivo; superior a 1, efecto antagónico y un valor inferior a 1 indicó efecto sinérgico entre ambas drogas. RESULTADOS 81 4.-RESULTADOS 4.1-El sorafenib induce apoptosis en células de mieloma múltiple El sorafenib es un fármaco antitumoral aprobado para el tratamiento del carcinoma renal y hepático por la FDA (Food and Drug Administration) en el 2005. Sin embargo, debido a su mecanismo de acción, también puede tener efecto antitumoral en mieloma múltiple humano. Por lo que en este primer apartado se caracterizó el efecto de este fármaco en líneas celulares de mieloma múltiple. 4.1.1.-El sorafenib inhibe la traducción de señales en células de mieloma múltiple El sorafenib fue diseñado originalmente para inhibir la quinasa Raf, la cual forma parte de una vía de traducción de señales implicada en proliferación celular y en oncogénesis en una gran variedad de tumores. Sin embargo, el sorafenib es capaz de inhibir diferentes quinasas, principalmente algunos receptores tirosín-quinasa implicadas también en proliferación y supervivencia celular. Debido a esto, se diseño un experimento para determinar si en la células de mieloma, este fármaco, era capaz de inhibir diferentes vías de señalización implicadas en supervivencia y proliferación muy relacionadas con los mecanismos fisiológicos de desarrollo de esta enfermedad, como es el caso de la señalización intracelular provocada por la IL-6, citoquina muy importante en el microambiente de las células de mieloma múltiple en la medula ósea. En este experimento se incubaron las células en presencia o ausencia de sorafenib 10 μM durante 1h y posteriormente se incubaron con IL-6 durante 15 y 60 minutos y se analizó mediante western blot la fosforilación de diferentes proteínas implicadas en la traducción de señales de la IL-6. Como se aprecia en la figura 4.1 la IL-6 activa diferentes vías de señalización celular implicadas en proliferación, crecimiento y supervivencia celular. Incluso en ausencia de IL-6 algunas de estas quinasas se encuentran activas y el sorafenib es capaz de inhibir la activación de estas vías por parte de la IL-6 e incluso inhibir la fosforilación de estas proteínas por debajo del valor basal. Por lo que en estas condiciones el sorafenib es un inhibidor de diferentes vías de señalización relacionadas con Raf y con receptores tirosín-quinasa implicadas en proliferación y supervivencia. RESULTADOS 88 010 20 30 40 50 0 25 50 75 100 J NEO J CrmA Sorafenib 24h, M % Anexina+ cells 010 20 30 40 50 0 25 50 75 100 Sorafenib 24h, M % 7-AAD+ cells 010 20 30 40 50 0 25 50 75 100 J NEO J CrmA Sorafenib 48h, M % Anexina+ cells 010 20 30 40 50 0 25 50 75 100 Sorafenib 48h, M % 7-AAD+ cells Figura 4.9.-Efectos del inhibidor de caspasa 8 CrmA sobre la muerte inducida por el sorafenib en células Jurkat. Como se muestra en la figura 4.9, al menos en este modelo no parece que la caspasa 8 tenga una influencia muy marcada en la apoptosis inducida por el sorafenib tanto a 24 como a 48 h. Aunque a 24 h y dosis bajas si se aprecia una pequeña diferencia entre las Jurkat CrmA y las Jurkat controles, diferencia que también se puede apreciar en la necrosis secundaria inducida por sorafenib a 24 h y aún más marcada a 48 h. No obstante, según los resultados obtenidos con inhibidores de caspasas, el sorafenib puede inducir una muerte celular de formas diferente dependiendo del modelo empleado. Por un lado en las RPMI 8226 induce una muerte dependiente en gran medida de la activación de las caspasas, mientras que en las MM.1S, el sorafenib puede inducir muerte aunque las caspasas estén inhibidas. Para analizar este efecto del sorafenib se decidió analizar la activación de la vía intrínseca de la apoptosis en presencia y ausencia de Z-VAD en las dos líneas que presentan un coportamiento más diferentes. RESULTADOS 89 Para esto se incubaron las células de las líneas MM.1S y RPMI 8226 en presencia y ausencia de Z-VAD durante 24 h, y por citometría de flujo, se analizó la exposición de fosfatidil serina, el cambio conformacional de Bax y Bak, la salida de citocromo c de la mitocondria y la activación de la caspasa 3. Figura 4.10.-Efecto del inhibidor de caspasas Z-VAD sobre la activación de la vía intrínseca de la apoptosis en las MM.1S. Las células se incubaron con sorafenib en presencia y ausencia de Z-VAD durante 24h y por citometría de flujo se detectó la exposición de fosfatidil serina, el cambio conformacional de Bax y Bak, la salida de citocromo c de la mitocondria y la activación de la caspasa 3. RESULTADOS 90 Figura 4.11.-Efecto del inhibidor de caspasa Z-VAD sobre la activación de la vía intrínseca de la apoptosis en RPMI 8226. Las células se incubaron con sorafenib en presencia y ausencia de Z-VAD durante 24 h y por citometría de flujo se detectó la exposición de fosfatidil serina, el cambio conformacional de Bax y Bak, la salida de citocromo c de la mitocondria y la activación de la caspasa 3. Según los datos obtenidos en este experimento y que se aprecian en las figuras 4.10 y 4.11, en ambas líneas celulares el porciento de muerte celular observada determinada por la exposición de la fosfatidil serina, se corresponden a los porciento de cambios conformacionales de Bax y Bak, así como al porciento de salida de citocromo c de la mitocondria, tanto en pre s cor r pre s la s así intr í cas en en ne c Fig u apo M c B c Tu Bi m S u C 3 B c XI A P u Pr o s encia com o r esponde c o s encia de Z - s alida de cit o en las MM.1 Según lo s í nseca de l a pasas. 4.1.4.- L la apop t El equilib r la homeost a c esario un d e u ra 4.12.-An á ptosis. c l-1 c l-XL u b m EL L S u rvivina C 3 cleaved c l-2 A P u ma α β o C 3 o en ause n o n los pará m - VAD la exp o o cromo c se v S. s resultados a apoptosis, L as prot e t osis ind r io entre las a sis celular, e sequilibrio e á lisis por in m MM.1S C 82416 n cia de ZV m etros anteri o sición de f o v en signific a obtenidos p aunque pu e e ínas de ucida p o proteínas p r por lo que e ntre estas p m unoblot de N C C8h 16h 24h 0 20 40 60 80 % ANEXINA POSITIVA V AD. En ca m i ores menci o o sfatidil seri n a tivamente r e p arece claro e de inducir m la famili a o r el sora r oapoptótica s para que s e p roteínas a f a los niveles d CI-H929 82416 TIME COURS E C8h 16h 24h C8h 1 6h m bio, la a c o nados en a n a, el cambi o e ducida en e que el sor a m uerte inde p a Bcl-2 ju fenib s y antiapop t e inicie la a p a vor de las p d e expresión U2 6 C 8 E 6h 24h C8h 16h 24h MM.1S NCI-H9 2 U266 RPMI 8 2 tivación de a usencia de o conforma c e l caso de la a fenib induc e p endiente d e u egan un t óticas jueg a p optosis po r roteínas pro a de proteína s 6 6 2416 2 9 2 26 RES U caspasa 3 Z-VAD. Ad e c ional de Ba x línea RPMI e activación e la activaci ó papel c r a un papel i m r la vía intrí apoptóticas. a s relacionad a RPMI 8226 C 8 16 U LTADOS 91 sólo se e más, en x y Bak y 8226, no de la vía ó n de las r ucial m portante n seca es a s con la 24 RESULTADOS 92 Debido a esto en este apartado se analizó la importancia de las proteínas proapoptóticas y de las antiapoptóticas en la apoptosis inducida por el sorafenib. Para analizar el mecanismo por el cual el sorafenib activa esta vía de la apoptosis en las células de mieloma múltiple empleadas, se analizó el efecto de este fármaco sobre los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis. Para esto se trataron las células con una concentración fija de sorafenib a diferentes intervalos de tiempo (0, 8, 16, 24 h), para cada punto se determinó la caída del potencial mitocondrial y se realizaron imunoblots para analizar los niveles de estas proteínas. Como se aprecia en figura 4.12 el sorafenib induce, de forma dependiente del tiempo, disminución de las proteína antiapoptóticas Mcl-1, Bcl-2, Bcl-XL y survivina, así como una disminución de algunas proteínas inhibidoras de caspasas como XIAP. También se observó procesamiento de la caspasa 3 y aumento de los niveles de las proteínas proapoptóticas Bim y Puma α. Aunque el aumento de la expresión de estas dos proteínas proapoptóticas resulta altamente variable dependiendo de la línea analizada y de los niveles de muertes alcanzados. Para detectar si la bajada en la expresión de algunas de estas proteínas se debía a una bajada en los niveles de transcripción de sus mRNA se realizó un análisis semicuantitativo de los niveles de varios mRNA a través de la realización de un RT-MLPA Figura 4.13.-Análisis de los niveles de mRNA de proteínas relacionadas con la apoptosis por RTMLPA. Como se aprecia en la figura 4.13 existen algunas proteínas cuyos mRNA aumentan en las tres líneas ensayadas, como Noxa, Puma y Bcl-XL. Mientras otros mRNA bajan en las tres líneas usadas, Bik, Bnip3L Mcl-1, Bid y survivina, en cambio otros tienen un comportamiento diferente B A D B I K B N IP 3 M C L 1 S N O X A B I D B I M P U M A B A K B A X B C L 2 B C L X M C L 1 L S U R V I V I N X I A P A I F A P A F F L I P S M A C -2 -1 0 1 2 3 H929 SORAF 8µM 24h (37%) RPMI SORAF 8µM 24h (22%) U266 SORAF 8µM 24h (36%) RESULTADOS 93 para cada línea. De estas proteínas lo más significativo es el aumento de los niveles del mRNA de Puma una proteína proapoptótica y la disminución de los niveles de Mcl-1 y survivina, dos proteínas antiapoptóticas. Por lo que la disminución de los niveles de las proteínas Bcl-XL y Bcl-2 parece ser debido exclusivamente a un aumento de su degradación. También merece la pena destacar que el aumento de los niveles del mRNA de Puma en las RPMI 8226 es moderado y concuerda con la única línea en la que no se aprecia un aumento de los niveles de ésta proteína por blots, si no más bien, una reducción. Debido a la importancia que pueden tener las proteínas Puma y Bim y el mecanismo de inducción de muerte del sorafenib, se comprobaron los niveles de mRNA obtenidos en la RTMLPA para estas dos proteínas por otra técnica, en este caso una PCR cuantitiva (Real TimePCR). Las células se incubaron con dos dosis diferentes de sorafenib durante 24 h. Transcurrido este tiempo se extrajo mRNA y posteriormente se realizó una retrotranscripción para obtener cDNA y se realizó la reacción de PCR cuantitativa (ver Materiales y Métodos). Como se muestra en la figura 4.14, los niveles de mRNA de la proteína Bim oscilan, observándose inicialmente un aumento a dosis bajas de sorafenib y posteriormente una disminución a la dosis mayor de este fármaco, comportamiento diferente al observado en el caso del mRNA de Puma, donde inicialmente no parece ocurrir ningún cambio a la dosis de 3 µM pero a la dosis más alta (7 µM) aumenta significativamente, corroborando los resultados obtenido en la MLPA. mRNA (Real time) Control M  Soraf, 3 M  Soraf, 7 Control M  Soraf, 3 M Soraf, 7 Control M Soraf, 3 M Soraf, 7 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Bim Puma Glu MM.1S mRNA relative expresion level Figura 4.14.-Análisis de los niveles de mRNA de Puma y Bim por Real Time. Para analizar el efecto del sorafenib sobre algunas de las proteínas relacionadas con la apoptosis, específicamente Mcl-1, Bcl-XL y Puma, se realizó un análisis de la expresión de estas proteínas tras incubar las células con sorafenib a diferentes intervalos de tiempo en presencia y ausencia de ZVAD. RE S tan t me c co m de g fun d Fig u mit o el a Re a pro t est u lín e de m por S ULTADOS 94 En la fig u t o en MM.1 S c anismo de m o de Bcl-X L g radas por l d amentalme u ra 4.15.-An á o condrial en c é A unque e a nálisis por w a l Time a d o t eína en la a u dio del pa p e a silenciada m ieloma mú nucleofecci ó u ra 4.15 se S como en acción de e s L depende d as caspasa nte por la d e á lisis de la e x é lulas incuba d e n el caso d e w estern blot o sis bajas d a poptosis in d p el de Bim e de forma e s ltiple, tambi é ó n en célula s v e como en RPMI 822 6 s te fármaco. d e la activa c s y de est a e gradación d x presión de p d as con soraf e e l mRNA de B sí parece o d e esta dro g d ucida por e l e n la apopto s table para e é n se usaro n s de MM. presencia d 6 . Esto corr o También s e c ión de las c a forma co n e Mcl-1 y B c proteínas rel a e nib en prese n Bim no se o b o bservarse u g a. Esto hiz o l sorafenib, p o sis inducid a e sta proteín a n siRNA par a d e ZVAD, a u o bora la im p e ve como l a c aspasas p o n tribuyen a c l-X L a cionadas co n cia y ausenc b servó ning u n aumento d o que se c u p or lo que s a por éste f á a , sin embar g a silenciar e s u mentan lo s p ortancia de bajada tant r lo estas p l a amplifica c n la activaci ó ia de Z-VAD. u na tendenci d e esta prot u estionara l a s e usaron d o á rmaco. Por g o, debido a s ta proteína d s niveles de e esta prote í t o de Puma, roteínas pa r c ión de la a ó n de la vía i a en la RTM t eína, así c o a implicació n o s estrategi a un lado, se a que esta lí n de manera t Puma α, í na en el de Mcl-1 r ecen ser a poptosis intrínseca M LPA, en mo en el n de esta a s para el usó una n ea no es ransitoria RESULTADOS 95 Figura 4.16.-Curva dosis respuesta a 24 y 48 h en células silenciada de Bim de forma estable. Se usó las células de la línea Jurkat silenciada para esta proteína de forma estable. Con esta se realizó una curva dosis respuesta (% de anexina positiva) a 24 y 48 h comparándola con la línea control. Como se aprecia en la figura 4.16 no existen diferencias entre las células controles y las silenciadas de Bim. Según estos datos esta proteína no tiene ningún efecto en la muerte inducida por sorafenib en células Jurkat. Debido a que no es el mismo modelo se realizó el silenciamiento transitorio usando siRNA. Figura 4.17.-Silenciamiento transitorio de Bim en las células de mieloma de la línea NCI-H929 En la figura 4.17 se muestra un experimento representativo del silenciamiento transitorio en la línea de mieloma NCI-H929 y aunque el silenciamiento fue parcial, no se detectó ningún efecto protector al silenciar Bim, Pese a esto, no podemos descartar que esta proteína pueda tener algún efecto en la apoptosis inducida por el sorafenib, ya que está descrito que al silencia Bim las células pueden compensar la disminución de esta proteína con el aumento de Puma. Para determinar el efecto de Puma en la apoptosis inducida por el sorafenib se usó la misma estrategia anterior. Se usaron siRNA de Puma para silencia esta proteína de forma transitoria. 010 20 30 40 50 60 0 25 50 75 100 Jurkat shscr Jurkat shBIM Sorafenib 24h, M % Annexin V + cells 010 20 30 40 50 60 0 25 50 75 100 Jurkat shscr Jurkat shBim Sorafenib 48h, M % Annexin V + cells Control Soraf 7 M 0 20 40 60 80 100 siLam siBim % Annexin V+cells C S C S β Actinaa Bim EL L S siBim siLAM RESULTADOS 96 Figura 4.18.-Silenciamiento transitorio de Puma en las células de mieloma de la MM.1S y RPMI 8226 Como se muestra en la figura 4.18 sólo se silenció la isoforma α aunque de forma parcial, sin embargo en las MM.1S se logró un buen silencimiento que conllevo a una protección significativa de la muerte inducida por el sorafenib. Según estos datos la proteína proapoptótica Puma parece tener un papel más relevante que Bim en la apoptosis inducida por el sorafenib. Debido a que tanto Bim como Puma ejercen su efecto interactuando con las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XL y Mcl-1. Como se muestra en la figura 4.7, el sorafenib induce una disminución en los niveles de expresión de estas proteínas y se analizó por técnicas de silenciamiento y sobreexpresión la importancia relativa que tiene cada una de estas proteínas en la apoptosis inducida por el sorafenib. En el caso de Bcl-XL se usó un siRNA para realizar un silencimiento transitorio por nucleofección en las MM.1S. Luego las células se incubaron con sorafenib durante 24 h. Como se muestra en la figura 4.17 el mayor silenciamiento se consiguió entre las 24 y 48 h posteriores a la introducción del siRNA en las células por nucleofección. Tras silenciar las células se esperó 24 h para incubarlas con sorafenib durante 24h más. C ontrol Soraf, 7M C ontrol Soraf, 7M 0 20 40 60 80 siLam siPuma MM.1S RPMI 8226 % Annexin V + cells MM.1S RPMI 8226 RESULTADOS 97 Como se muestra en la figura 4.17 el silenciamiento de esta proteína provocó un aumento de la muerte basal en el experimento lo que muestra la importancia de la proteína en la homeostasis de estas células. De igual forma se observó un marcado incremento en la muerte inducida por el sorafenib, por lo que la disminución de los niveles de esta proteína antiapoptótica observados al tratar estas células con este fármaco pueden jugar un papel importante en la muerte inducida por el sorafenib. Figura 4.19-Silenciamiento transitorio de Bcl-XL en las células de mieloma de la MM.1S. Para confirmar la importancia de la disminución de los niveles de esta proteína en el mecanismo de acción del sorafenib se usaron sublíneas en las cuales se había sobreexpresado Bcl-XL de forma estable. Las sublíneas 8226 Bcl-XL fue obtenidas previamente en nuestro laboratorio y la MM.1S Bcl-XL se obtubo durante este trabajo, usando el mismo plásmido con el que se obtuvo la 8226 Bcl-XL. Esta se obtuvo mediante una infección retroviral y posteriormente una dilución límite (ver materiales y método acápite 3.7) de donde se obtuvieron varios clones. Como se muestra en la figura 4.20 se obtuvo un pool de células que sobreexpresaba BclXL y de dicho pool se obtuvo el clon que posteriormente se usó en este experimento. La sobreexpresión de Bcl-XL se comprobó por blots. En ambos casos se observó una marcada sobreexpresión de esta proteína. Figura 4.20.-Obtención de la sublínea de MM.1S que sobreexpresa Bcl-XL Como se aprecia en la figura 4.21 se observó que la sobrexpresión de Bcl-XL en estas células provoca una marcada protección en ambas líneas, sobre todo a dosis bajas, tanto a 24 como a 48 h. Sin embargo a dosis alta y tiempos largos como 20 μM y 48 h la protección MM.1S siLAM MM.1S siBCLX L 0 20 40 60 80 100 control Soraf 7 M % ANNEXIN V + CELLS siBcl-XL 24 24 48 72h Tubulina BCL-XL Actina Bcl XL C Pool C Pool Clon RE S tu m do s pro t tu m sor a m ú otr a Fig u an a pro c o e n do s aut o S ULTADOS 104 m ores de mi e s ificación ac t t eínas plas m m or puede s a fenib en la 4.3.-El ú ltiple Según la a s funciones u ra 4.30.- Ind u Debido a a lizar la cap a c eso celular n la muerte c Como pri m s is de soraf e o fagia med i e loma múltip t ualmente e n m áticas por l o er mucho m inhibición d e sorafe figura 4.1 el provocan la u cción de aut o a los result a a cidad de in d está implic a c elular asoci a m era aproxi m e nib durante i ante marc a le in vivo. L a n uso está e o que la con c m ayor. Esto e l crecimient o nib ind sorafenib in activación d o fagia en Fibr o a dos observ d ucción de a a da en la m u a da a autof a m ación se tr a 24 h y se a a je con 7A A a concentra c e ntre 10-20 c entración e f puede just o de los tum o uce au t n hibe los co m d e la autofag o blastos emb r v ados al in c utofagia por u erte celular , a gia. a taron las c é a nalizó por c A D y la di s c ión plasmá t μM. No ob s f ectiva que a i ficar, en p a o res implant a t ofagia m plejos mT O ia cuando s o r ionarios de r a c ubar las c é parte de es t , ya sea pro t é lulas MEF B c itometría la s minución d t ica alcanza d s tante, el so a lcanza el s o a rte, el efe c a dos en los r células O RC1 y mT O o n inhibidos. a tón Bax - /Bak - é lulas con s t e fármaco. E t egiendo la c B ax/Bak -/- LC 3 muerte cel u d e los nive l d a con las p o rafenib se u o rafenib en e c to provoca d ratones. de mi O RC2 los cu a . s orafenib, s e E sta descrito c élula de la a 3-GFP con d u lar y la ind u les de la L p autas de u ne a las e l sitio del d o por el eloma a les entre e decidió que este a poptosis d iferentes u cción de L C3-GFP res p par t GF P det e flu o res i so b ind u fusi se inc u us ó Fig u RP M y el en e reg u for m co m est a p ectivament e t e de la LC 3 P desapare c En figura e cta gracia o rescencia d i stente al so r Debido a b rexpresarán u cir autofagi a Las célul a onada a la p seleccionó u u baron con s ó una dosis m u ra 4.31.- Det e M I-8226 y 82 2 Como se sorafenib i n e l patrón de La prote í u lación de l a m a inhibir la m o en las q u a s ultima s e e . Esto últi m 3 es degrad a c e en los aut o 4.30 se ap r a la bajad a e la célula, r afenib por l o a estos r e la LC3-RF P a . a s RPMI 82 2 p roteína fluo r u n clon qu e s orafenib du r m ayor, en es t e cción por mi c 2 6 Bcl-X L tran s observa en n dujo autofa g fluorescenci í na Bcl-X L , a a autofagia, autofagia. S u e se sobre e e aprecia u n m o ocurre c u a da en los p o fagolisoso m r ecia como e a de la flu o de difusa p o que se ne c e sultados, s P para anali z 2 6 y 8226 B c r escente RF e sobreexpr e r ante 24 h. C t e caso 15 µ c roscopía de s fectadas con la figura 4.3 g ia en las d o a de difusa a a demás de ya que est a S in embarg o e xpresa Bcl - n a mayor i n u ando en la p ropios auto f m as debido a e l sorafenib o rescencia d p or todo el c esitaron co n s e decidió z ar si, en est c l-X L se tran f F P mediante e saba de f o C omo las 82 2 M. fluorescencia la proteína d e 1 se obtuvie o s líneas cel u a punteada. ser una p r a descrito q u o , en estas c - X L se indu c n ducción de célula hay n f agolisosom a a l pH ácido d induce auto f d e la LC3G citosol a p u n centracione s obtener u n a s células, e f ectaron con el uso de re o rma establ e 2 6 Bcl-X L so n la inducció n e fusión LC3R ron clones q u lares ensa y r oteína anti a u e es capaz c élulas se v c e autofagia autofagia l o n iveles altos a y porque l a e los mismo f agia en est a G FP y al c a u nteada. Es t s más altas p n as célula s e l sorafenib t un plásmid o t rovirus. Lu e e esta prot e n más resist e de autofagia R FP. q ue sobreex p y adas como a poptótica, e de unirse a e como tan t por este fá r o que se d e RES U de autofagi a fluoresce n o s. t as células, l a mbio del p tas células p ara inducir s de miel o t ambién era o que conte n e go por dilu c e ína de fusi ó e ntes al sor a en células d e p resaban la lo muestra e e stá implica d a Beclina 1 y t o en las R P r maco. De h ebe a que U LTADOS 105 a ya que n cia de la o que se p atrón de son más muerte. o ma que capaz de ía la LC3 c ión límite ó n. Y se a fenib, se e mieloma L C3-RFP e l cambio d a en la y de esta P MI-8226 h echo, en son más RESULTADOS 106 resistente a la apoptosis o a la mayor dosis de sorafenib empleada. La inducción de autofagia también se analizó por blots y se empleó un anticuerpo que reconocía la LC3-I y la LC3-II. Luego se cuantificó la intensidad de estas dos bandas y la relación entre ambas se usó como medida de autofagia. Figura 4.32.-Detección la proteína LC3-I y LC3-II por western blot como medida de la inducción de autofagia. Como se muestra en la figura 4.32, por esta técnica también se corrobora la capacidad de inducir autofagia en las RPMI 8226 y se observa como en otras líneas celulares, en las U266, también el sorafenib es capaz de inducir autofagia. Según estos experimentos las células de mieloma presentan valores basales de autofagia los cuales aumentan al incubarse con sorafenib, alcanzándose los valores máximos a tiempos de 16 y 24 h. Según estos datos el sorafenib es capaz de inducir autofagia en las células de mieloma múltiples ensayadas, no obstante, este proceso celular puede tener un efecto protector de la apoptosis inducida por el sorafenib o puede que el sorafenib induzca muerte asociada a autofagia. Por lo que para analizar la implicación de la autofagia en la muerte inducida por sorafenib se inhibió la autofagia en estas células y se vio cómo responden al incubarlas con este fármaco. Para esto se silenció Beclina 1 por nucleofeción con siRNA de manera transitoria. Como se muestra en le figura 4.33 solo se consiguió un silencimiento parcial, sin embargo suficiente para que se viera representado en los niveles de autofagias medida por la relación entre la LC3-II y la LC3-I. C 8h 16h 24h C 8h 16h 24h 0.0 0.5 1.0 1.5 U266 RPMI 8226 Sorafenib, 8 M LC3II/LC3I Ratio LC3 I LC3 II RPMI 8226 U266 + Fig u en cél u Fig u ind u de clo r la f u de 0 20 40 60 80 100 % 7-AAD + cells u ra 4.33.- Sile n A pesar d la muerte in u las de la lín u ra 4.34.- Efe c u cida por el s o A demás d drogas que r oquina. Est e u sión de es t autofagoso m 0 5 10 15 20 25 LC3 II/LC3 I RATIO ‐ ‐ C siRNA La siRNA B e n ciamiento d e d e esta dismi ducida por e ea 8226-BC c to del silenc o rafenib. d e silenciar b pueden inhi e es un fárm a t os con los a m as. Debido C siRNA Be c siRNA La m + ‐ + ‐ RPMI8226 RPMI822 +S,8  m e clin 1 e Beclina-1 en nución de lo e l sorafenib L-X L (figura 4 imiento de B e b eclina-1, e x bir este pro c a co, que en t a utofagoso m a esto tam +S c lin 1 m + L + + 6  M células RPM o s niveles de en las RP M 4 .34). e clina-1 en c é x isten otras f ceso de dif e t re otros efe c m as, lo que I n m bién se us ó +S24h + siBeclin1 Tubulina Beclina1 L C3I/LC3II 0 20 40 60 80 100 % 7-AAD + cells I 8226 y 8226 autofagia, s M I-8226 y pr á é lulas RPMI 8 f ormas de in e rentes man c tos, inhibe l n hibe la aut o ó esta estra t 0 5 10 15 20 25 LC3 II/LC3 I RATIO ‐ ‐ 8 2 8 C siRNA siRNA - Bcl-X L olo se obse r á cticamente 8 226 y 8226 - h ibir la auto f e ras. Una d a acidificaci ó o fagia e ind u egia para a C siRNA La m siRNA Be c ‐ + 2 26Bcl‐XL 8 226Bcl‐XL RES U +S, 1 Lam Beclin 1 r vó un ligero ningún efe c - Bcl-X L sobre f agia, como e estas dro g ó n de los lis o u ce una ac u nalizar el e f +S m c lin 1 + + U LTADOS 107 1 5 M aumente c to en las la muerte es el uso g as es la o somas y u mulación f ecto que RESULTADOS 108 6.99 33.6 21.9 74.6 60.6 13 37.89.1 Control Soraf 8μM CLQ 25nM CLQ+Soraf MM.1S RPMI 8226 tiene la inducción de autofagia sobre la muerte celular provocada por el sorafenib. En este experimento se incubaron las células con cloroquina 25nM una hora antes de tratar las células con sorafenib durante 24h Figura 4.35.-Efecto de la inhibición del flujo autofágico mediante cloroquina sobre la muerte inducida por el sorafenib en células MM.1S y RPMI 8226. Como se aprecia en la figura 4.35 la inhibición de la autofagia con esta estrategia sí provoco un aumento marcado de la muerte inducida por el sorafenib. Por lo que con estos datos podemos decir que la autofagia que se genera cuando las células son incubadas con sorafenib parece tener un efecto protector de la muerte inducida por esta droga. 4.4.-El sorafenib induce necroptosis en células de mieloma múltiple Según los resultados obtenidos el sorafenib induce muerte apoptótica en las células de mieloma múltiple empleadas. No obstante, es capaz de inducir muerte en aquellas células en las que la apoptosis esta inhibida. La apoptosis es el principal mecanismo de muerte celular programa. Sin embargo, existen otras formas de muerte celular descritas. Una de ellas es la necrosis programa o necroptosis. Como se muestra en la figura 4.8 y 4.10, el ZVAD es incapaz de inhibir la muerte inducida por el sorafenib en las MM.1S, mientras que en las RPMI 8226 la inhibición es muy notable y en el resto de las líneas tiene un efecto parcial. Además, al incubar estas células con un inhibidor de caspasa 8 (IETD) y al tratarlas con sorafenib, aumenta la muerta (figura 4.8). Los modelos en que esta descrita la necroptosis tienen un comportamiento similar a las MM.1S al incubarlas inhibidores de caspasas. Por lo que se hipotetizó que el sorafenib puede estar induciendo necroptosis en esta línea celulares. Para comprobar esta hipótesis se trataron las células con sorafenib previa incubación con RESULTADOS 109 0 20 40 60 80 100 CONTROL SORAF 5uM ZVAD+SORAF NEC1+SORAF ZVAD+NEC1+SORAF MM.1S RPMI 8226 % Annexin V + cells ZVAD, Necrostatina-1 (inhibidor de la necroptosis) y la combinación de los dos durante una hora antes de adicionar el sorafenib. Figura 4.36.-Efecto de la inhibición del flujo autofágico mediante cloroquina en células MM.1S y RPMI 8226 sobre la muerte inducida por el sorafenib. Como se muestra en la figura 4.36 la combinación de ambos inhibidores en las MM.1S provoca una disminución de la muerte inducida por el sorafenib mucho mayor que cualquiera de los dos inhibidores por sí solo. Además, la necrostatina aumenta la muerte inducida por el sorafenib, efecto similar al observado al inhibir la caspasa 8 con el IETD. Este efecto no se aprecia en el caso de la línea RPMI 8226 ya que en este caso el Z-VAD sí inhibe la muerte causada por el sorafenib, al menos a las concentraciones y tiempos ensayados en este experimento. Según estos datos, la muerte independiente de caspasa descrita en el acápite 4.1.3 puede ser debida a la que el sorafenib es capaz de inducir necroptosis en aquellas células que las caspasas se encuentran inhibidas. Esto también podría explicar la muerte observada en aquellas células que tienen inhibida la maquinaria apoptótica, ya sea por sobreexpresión de proteínas antiapoptótica o por silenciamiento de proteínas proapoptóticas, en las cuales si se ve una protección de la muerte inducida por el sorafenib a tiempos cortos y dosis bajas pero no a tiempos largos y dosis más altas. 4.5.-El Sorafenib muestra potencial en terapia combinada En la práctica clínica habitual se suelen emplear combinaciones de fármacos para obtener mejores resultados terapéuticos y de esta forma atacar varias dianas terapéuticas y evitar la aparición de células resistentes y las recaídas. El mieloma múltiple es un buen ejemplo del empleo de estas combinaciones para el tratamiento de esta enfermedad. Debido a esto, en este trabajo se realizaron varias combinaciones de este fármaco con otras drogas que se usan en la práctica clínica para el tratamiento de esta patología, así como RESULTADOS 110 RPMI 8266 Bort 24h + Soraf 24h C 0 2 4 8 16 32 0 20 40 60 80 100 0.663 0.7050.705 0.594 0.866 BORT 48h BORT 24h+Soraf 7M 24h BORT, nM % Annexin V + cells MM.1S Bort 24h + Soraf 24h C 0 2 3 4 5 6 8 16 32 0 20 40 60 80 100 3.428 1.925 1.571 1.415 1.249 1.247 2,214 4.652 BORT, nM % Annexin V + cells NCI-H929 Bort 24h + Soraf 24h C 0 2 3 4 5 6 7 8 16 32 0 20 40 60 80 100 1.769 1.809 1.183 1.008 1.024 1.332 1.247 2.313 4.607 BORT, nM % Annexin V + cells U266 Bort 24h + Soraf 24h C 0 2 3 4 5 6 7 8 16 32 0 20 40 60 80 100 1.880 1.659 1.378 0.905 0.922 0.859 1.128 1,319 2.566 BORT, nM % Annexin V + cells con otros fármacos que podrían tener futuras aplicaciones para el tratamiento del mieloma múltiple. 4.5.1.-La combinación de Sorafenib y Bortezomib debe ser personalizada El Bortezomib es un inhibidor del proteosoma que se utiliza actualmente en el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple en cualquier estadio de la enfermedad (Richardson et al. 2003). El funcionamiento óptimo del proteosoma es esencial para la supervivencia celular y las células plasmáticas tumorales tienen una gran necesidad de este mecanismo, en primer lugar porque todas las células tumorales tienen una alta tasa de recambio proteico, mayor que las células normales, y por otro lado porque las células plasmáticas tumorales son productoras de inmunoglobulinas y dependen en gran medida de un correcto funcionamiento del proteosoma. A pesar de la mejora que ha supuesto el uso del bortezomib en el tratamiento del mieloma múltiple, el hecho es que esta enfermedad sigue siendo incurable, de aquí la necesidad de que se sigan buscando nuevas combinaciones con el bortezomib que mejoren el pronóstico de esta enfermedad. Figura 4.37.-Combinación de Bortezomib y Sorafenib. Las células se incubaron inicialmente con diferentes dosis de bortezomib y transcurrido 24h se incubaron con sorafenib 7 μM durante 24 h más. Como se observa solo en las 8226 se produjo un efecto sinergico claro. RESULTADOS 111 RPMI 8226 Soraf 24h+Bort 24h C 0 2 3 4 5 6 7 8 16 32 0 20 40 60 80 100 0.75 0.71 0.75 1.05 2.04 0.42 0.51 0.64 0.82 1,47 Bortezomib 24 h (nM) Soraf 3M 48h+Bort 24h Soraf 7M 48h+Bort 24h BORT, nM % Annexin V + cells MM.1S Soraf 24h+Bort 24h C 0 2 4 8 16 32 0 20 40 60 80 100 1.371.36 1.27 2.26 4.31 2.05 2.49 1.13 2.11 4.2 BORT, nM % Annexin V + cells NCI-H929 Soraf 24h+Bort 24h C 0 2 3 4 5 6 7 8 16 32 0 20 40 60 80 100 1.788 1.836 2.496 1.226 1.066 1.038 1.707 3.524 1.384 1.324 1.473 1.432 1.022 1.0190.934 1.667 3.310 BORT nM % Annexin V + cells U266 Soraf 24h+Bort 24h C 0 2 3 4 5 6 7 8 16 0 20 40 60 80 100 2.856 3.002 3.236 2.946 1.651 1.496 1.312 1.158 3.9973.891 3.992 3.492 1.875 1.664 1.204 1.435 BORT nM % Annexin V + cells Se diseñaron varios experimentos para buscar si la combinación entre sorafenib y bortezomib pudiera tener un efecto sinérgico. En un primer experimento se incubaron las células con varias dosis de bortezomib durante 24 h, transcurridas estas, las células se incubaron con una dosis fija de sorafenib durante 24 h más. Como se observa en la figura 4.37 solo se observó efecto sinérgico, determinado por el CI, en la línea RPMI 8226, mientras que en el resto de las líneas el efecto observado fue antagónico. Como el resultado obtenido no fue el esperado ni el reportado en otros estudios (Yu et al. 2006a; Ramakrishnan et al. 2009) se decidió realizar el mismo estudio pero cambiando el orden en el cual se expusieron las células a los fármacos. En un segundo experimento se cambio el orden en que se incubaron las células con cada fármaco y se usaron dos dosis diferentes de sorafenib, una baja, 3 μM, que induce muy poca muerte y una más alta 7 μM. Inicialmente se incubaron las células con sorafenib durante 24 h y posteriormente se incubaron con diferentes dosis de bortezomib. Como se muestra en la figura 4.38 se obtiene el mismo resultado que en el experimento anterior, solo se observa efecto sinérgico en la línea RPMI 8226, tanto a unas dosis bajas de sorafenib, 3 µM, como a una dosis más alta 7 µM. En el resto de las líneas, ninguna de las dosis ensayadas, mostró efecto sinérgico, más bien se detecto un efecto antagónico, siendo este más marcado en la línea U266. Figura 4.38.-Combinación de Sorafenib y Bortezomib. Las células se incubaron inicialmente con dos dosis de sorafenib y transcurrido 24h se incubaron con diferentes dosis de bortezomib durante 24 h más. Como se observa solo en las 8226 se produjo un efecto sinergico claro y llama la atención el efecto marcadamente antagonico observado en las U266. RESULTADOS 112 Por último se decidió realizar un último experimento en el que se incubaban las células simultáneamente con los dos fármacos a una relación de concentración 1:1000. Para este experimento solo se escogió la línea NCI-H929 ya que en esta línea, a algunas dosis se apreció un efecto aditivo. Como se observa en la figura 4.39, tampoco se observo ningún efecto sinérgico en esta línea, tampoco se observo el ligero efecto aditivo hallado en los experimentos anteriores. En cambio, se observo el mismo efecto antagónico previamente descrito, el cual, fue mucho mayor a las dosis más bajas. Figura 4.39.-Incubación simultanea con Bortezomib y sorafenib. Las células se incubaron simultaneamente con sorafenib y bortezomib en una relación 1:1000 durante 24 h. Como se observa no se detecto ningún efecto sinergico, si no antagonico, muy marcado éste a las dosis más bajas. Aunque previamente se había reportado que la combinación de sorafenib y bortezomib podrían tener un efecto sinérgico, en este estudios se demuestra que esta combinación puede tener un efecto altamente variable pudiendo provocar un efecto antagónico en unas líneas, ligeramente aditivo en otras y mostrando un potente efecto sinérgico en otras. Este resultado no descarta la posibilidad del uso combinado de estos dos fármacos, si no que refuerza la necesidad de que la implementación de tratamientos personalizados con el objetivo de aprovechar el máximo potencial terapéutico del arsenal farmacológico disponibles en el mercado. 4.2.2.- El Sorafenib sensibiliza a células a Apo2L/TRAIL Apo2L/TRAIL es un ligando mortal que es capaz de inducir apoptosis en líneas de MM. Sin embargo, no todas las células de mieloma son sensibles a Apo2L/TRAIL. La sensibilidad depende de varios factores como pueden ser la expresión de los receptores de muerte DR4 ó DR5, la expresión de la caspasa 8 o la facilidad de estos receptores para oligomerizar. Por 234567 0 20 40 60 80 100 1.619 1.978 1.275 1.193 1.195 1.196 BORT 24h nM SORAF 24h M BORT+SORAF (1:1000) 24h NCI-H929 Bort + Soraf 24h % Annexin V + cells RESULTADOS 113 MM.1S Control 0 10 75 100 150 200 0 20 40 60 80 100 TRAIL ng/mL Sorafenib 0M Sorafenib 3M Sorafenib 4M Sorafenib 5M % m NCI-H929 Control 0 10 75 100 150 200 0 20 40 60 80 100 TRAIL ng/mL %m IM-9 Control 0 10 75 100 150 200 0 20 40 60 80 100 TRAIL ng/mL %m U266 Control 0 10 75 100 150 200 0 20 40 60 80 TRAIL ng/mL %m ejemplo, las células tumorales de pacientes con mieloma múltiple refractario a menudo dejan de expresar los receptores DR4 y DR5, lo que aumenta la resistencia a Apo2L/TRAIL de estos pacientes. Se decidió evaluar el efecto de la combinación de sorafenib con Apo2L/TRAIL, con el objetivo de ver si células que fueran poco sensibles a Apo2L/TRAIL podrían ver aumentada su sensibilidad al ser tratadas con esta droga. Se usaron 4 líneas celulares, 3 de mieloma y una leucemia las que en estudios anteriores en este laboratorio habían mostrado ser poco sensible a Apo2L/TRAIL. Figura 4.40.-Efecto sensibilizador de sorafenib a la inducción de muerte mediada por APO2L/TRAIL. Las células se incubaron previamente con sorafenib durante 24 h. transcurrido este tiempo se adicionaron dosis creciente de APO2L/TRAL durante 24 h más. En todos lo casos se observo un efecto sencibilizdor por parte del sorafenib. Con estas líneas se realizaron curva dosis respuestas de Apo2L/TRAIL previa incubación durante 24 h con sorafenib a tres dosis diferentes. Como se muestra en la figura 4.40 se observo una potenciación del efecto de Apo2L/TRAIL, incluso a dosis bajas de este ligando mortal. Aunque el efecto observado fue variable de una línea a otra, se observo el efecto mas significativo en las MM.1S y en las U266, en las cuales, incluso la dosis más bajas de sorafenib, la cual por si sola no induce muerte, logro potencia significativamente el efecto citotóxico de Apo2L/TRAIL. Para tratar de analizar el mecanismo por cual el sorafenib contribuye a sensibilizar las células a Apo2L/TRAIL se escogió la línea celular U266 y las dosis de sorafenib de 3 µM y RESULTADOS 120 Ruxolitinib+OSI-027 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M OSI-027+Ruxolitinib, nM OSI-027+Ruxo+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells 72h OPM-2 Ruxolitinib 48H 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M Ruxolitinib, nM Ruxolitinib+Soraf, 1/10 Dosis % Annexin V + cells Ruxolitinib 72H 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M Ruxolitinib, nM Ruxolitinib+Soraf, 1/10 Dosis % Annexin V + cells Ruxolitinib+OSI-027 48H 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M OSI-027+Ruxolitinib, nM OSI-027+Ruxo+Soraf, 1/10 Dosis % Annexin V + cells H92948h 72h aumento es mucho mayor al incubar además con un inhibidor de mTORC durante 48 h. Figura 4.48.-Citotoxicidad inducidad en las células NCI-H929 de MM tras incubar con OSI-027, Ruxolitinib y sorafenib. Las células se incubaron durante 24 h con ruxolitinib o con ruxolitinib+OSI-027, trascurradas 24 h se adicono sorafenib durante 24 o 48 h más. El efecto citotoxico se midio por exposición de fosfatidil serina. En el caso de las OPM-2 también se observo un aumento significativo al incubar las células con estos tres fármacos, figura 4.49, en este caso durante 72 h, es decir 24 h con ruxolitinib+OSI-027 y posteriormente se adiciono durante 48 h el sorafenib. Estas células debido a la mutación en PTEM son sensibles a los inhibidores de mTORC, Sin embargo, se observa un mayor efecto al combinarlo con un inhibidor de Ras/Raf-1/Mek/Erk y Jak/Stat. Figura 4.49.-Citotoxicidad inducidad en las células OPM-2 de MM tras incubar con OSI-027, Ruxolitinib y sorafenib. Las células se incubaron durante 24 h con ruxolitinib+OSI-027, trascurradas 24 h se adiconó sorafenib durante 48 h más. El efecto citotoxico se midio por exposicion de fosfatidil serina. RESULTADOS 121 Efecto similar aunque mucho más modesto se observa en las RPMI 9226, figura 4.50, aunque si se tiene en cuenta que el OSI-027 es prácticamente inactivo frente a estas células se puede decir que al combinar con ruxolitinib se consigue un aumento significativo de la actividad de estos fármacos. En el caso de la línea U266 que no mostró ser sensible a ninguno de los inhibidores de mTORC, llama la atención que si aumentó la inducción de la apoptosis al incubarlo con ruxolitinib. Lo que podría sugerir que la vía de las Jak/Stat tiene mayor importancia en unas líneas celulares que en otras. Figura 4.50.-Citotoxicidad inducidad en las células RPMI 8226 de MM tras incubar con OSI-027, Ruxolitinib y sorafenib. Las células se incubaron durante 24 h con ruxolitinib+OSI-027, trascurradas 24 h se adiconó sorafenib durante 48 h más. El efecto citotoxico se midio por exposicion de fosfatidil serina. Figura 4.51.-Citotoxicidad inducidad en las células U266 de MM tras incubar con OSI-027, Ruxolitinib y sorafenib. Las células se incubaron durante 24 h con ruxolitinib+OSI-027, trascurradas 24 h se adiconó sorafenib durante 48 h más. El efecto citotoxico se midio por exposicion de fosfatidil serina. Ruxolitinib 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M Ruxolitinib, nM Ruxolitinib+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells Ruxolitinib+OSI-027 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M OSI-027+Ruxolitinib, nM OSI-027+Ruxo+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells Ruxolitinib+OSI-027 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M OSI-027+Ruxolitinib, nM OSI-027+Ruxo+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells 72h 48h RPMI-8226 Ruxolitinib 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M Ruxolitinib, nM Ruxolitinib+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells 72h U266 Ruxolitinib+OSI-027 0200 400 600 0 20 40 60 80 100 Soraf, M OSI-027+Ruxolitinib, nM OSI-027+Ruxo+Soraf, 1/10 Dosis, nM % Annexin V + cells RESULTADOS 122 4.6.-Optimización del análisis de presuntas células madres de mieloma múltiple. Según lo descrito en la bibliografía las células madres de mieloma son las células CD138 negativas (Matsui et al. 2004). Por lo que para identificar estas células se marcaron con anticuerpo anti CD138 y anexina ya que las células de mieloma pierden la expresión de este antígeno de superficie celular cuando sufren apoptosis. Inicialmente se hizo una región sobre la población de células para de esta forma eliminar los fragmentos celulares y agregados, luego se hizo otro sobre las células anexinas negativas para eliminar las células apoptóticas y finalmente identificar las células CD138 negativas. Figura 4.52.- Identificación de las células CD138 negativas en diferentes líneas de mieloma múltiple. El porciento de la población de células CD138 negativas fue de un 2.2 a un 3.4 % Como se aprecia en la Figura 4.52, en estas líneas, se encontró solo de un 2,2% a un 3,4% de células CD138 negativas. Esto concuerda con lo reportado en la literatura donde el porciento de células madres tumorales se encuentra por debajo del 5 % en mieloma múltiple (Matsui et al. 2004). Para realizar subsecuentes experimentos con estas células se procedió a su purificación mediante selección negativa por procedimientos magnéticos (ver materiales y métodos acápite 3.6.3). Se separaron 100 x 106 células por columna. Las células CD138 negativas se separaron mediante MACS con anticuerpo anti CD138. Se recogió la fracción negativa y se fenotiparon con anticuerpo anti CD138 y anexina. Como se muestra en la Figura 4.53, se logro enriquecer el cultivo en células CD138 negativa pero seguían quedando células CD138 positivas aunque la mayoría de las células CD138 negativas obtenidas eran células anexina positivas, es decir apoptóticas, solo una pequeña fracción pertenecían a células vivas. RESULTADOS 123 Figura 4.53.- Purificación de la población de células CD138 negativas. Se separaron 100 x 106 células por columnas. Se recogió la fracción no unida a la columna y se fenotiparon. Para poder obtener una mayor eficiencia de separación se necesitó separa solo 40 x 106 células por columna ya que con cantidades mayores se saturaba la capacidad de retención de la columna. De esta forma, se obtuvo una mayor fracción de células CD138 negativas, aunque de estas, solo aproximadamente el 20% eran células vivas, es decir anexina negativas/7AAD negativas, Figura 4.54, y de estas más del 60% eran células CD138 negativas aunque se obtuvo una gran variabilidad entre experimentos. Figura 4.54.- Puesta a punto de la purificación de la población de células CD138 negativas. Se separaron 40 x 106 células por columnas. Se recogió la fracción no unida a la columna y se fenotiparon. Una vez enriquecido el cultivo en células CD138 negativas, estas se trataron con sorafenib durante 14h con el objetivo de detectar si el sorafenib era activo sobre las presuntas células madres de mieloma múltiple. Al enriquecer el cultivo en células CD138 negativas, un alto porciento de las células son anexina positiva, por lo que se seleccionaron las células anexina negativas, y en esta población se analizó como respondían las poblaciones de células CD138 positivas y negativas al sorafenib. Como se aprecia en la Figura 4.55, ambas fracciones procedente de la separación magnética, es decir la población enriquecida en células CD138 negativa y la depletada de estas células, se enriquecieron en las células CD138 negativas al tratarlas con sorafenib. Aunque en la fracción negativa, a la mayor concentración de sorafenib se aprecia que la población de células CD138 negativas disminuye con respecto a la concentración RESULTADOS 124 anterior. Esto indica que las células CD138 negativas son más resistentes al sorafenib que las células CD138 positivas. Figura 4.55.- Respuesta de las células CD138 negativas al tratarlas con sorafenib. Como se aprecia en este experimento, éstas parecen ser más resistente al sorafenib que las CD138 positivas. Para corroborar este resultado se realizó el mismo experimento pero usando el cultivo completo, es decir sin separa las células CD138 negativas. Y como se aprecia en la figura 4.56 el resultado es muy similar al del experimento anterior. A medida que se aumenta la dosis aumenta la población de células CD138 negativo, indicativa que estas células son más resistentes al sorafenib. Figura 4.56.- Células tratadas con sorafenib durante 14 h. se ve como el cultivo celular se enriquece en las células CD138 negativas. RESULTADOS 125 Debido a que estas células sólo representan una fracción muy pequeña del cultivo celular resulta muy complicado trabajar con estas células. Una de las formas descrita en la bibliografía para enriquecer el cultivo en estas células es inyectándolas en ratones inmunodeficientes. Para esto se tomaron ratones NOD/SCID a los cuales se le inyectaron de forma subcutánea 1 x 106 células en resuspendidas en 100 µL de matrixgel durante 7 semanas. Trascurrido este tiempo se extrajeron se fenotiparon y se realizó un ensaya de formación de colonias. Como se observa en la Figura 4.57 la población de células CD138 negativa se incrementó de forma que a las 24 h se tenía un 7% de estas células aunque descendió de manera progresiva de forma que a las 72 h solo quedaba un 2.7% de dichas células. Figura 4.57.-Evolución de la población de células CD138 negativas tras ser extraídas del raton. Se inyectaron de forma subcutánea 50 000 células de la línea MM.1S en 100 µL de matrixgel durante 7 semana y posteriormente se extrajeron. En el momento de la extracción si se detectó un porciento mayor de células CD138 negativas pero debe ser analizado con cuidado ya que la tripsina utilizada para disgregar el tumor también elimina el antígeno de superficie CD138. Al analizar este hecho, se constató lo dicho anteriormente y que hasta transcurridas 9 h no se recupera casi en su totalidad dicho antígeno de superficie (Figura 4.58) Figura 4.58.-Cinética de recuperación del antígeno de superficie CD138 tras incubar las células RPMI 8226 con tripsina durante 5 min. Como se aprecia a las 9 h se ha recuperado la proteína de superficie CD138 casi en su totalidad. RESULTADOS 126 A pesar del aumento de la población de las células CD138 negativas, el porciento de colonias formadas no mostro diferencias significativas al comparar las células injertadas en el ratón con las células de la línea que procedían (Figura 4.59). Figura 4.59.-Comparación del porciento de formación de colonias entre las células extraídas de ratón y las células de la línea que proceden. El uso del antígeno de superficie CD138 como un marcador negativo de presuntas células madres tumorales presenta varios inconvenientes como es el hecho de que es un marcador negativo, que las células lo dejan de exponer cuando entran en apoptosis y que puede ser cortado proteolíticamente por varias metaloproteasas. Además al purificar estas células de un cultivo celular, se obtienen conjuntamente un gran porciento de células en apoptosis. Esto hace que los experimentos que se realicen con estas células, sobre todo los de citotoxicidad tengan el inconveniente de que las células se encuentren en un entorno desfavorable. Al tener en cuenta estos motivos, se decidió buscar otro marcador de células madres de mieloma múltiple. Sin embargo existe una extensa controversia sobre las características fenotípicas de estas células y se encontraron muchas contradicciones en la bibliografía consultada (Matsui et al. 2004; Matsui et al. 2008; Pilarski et al. 2008; Paino et al. 2012). Existe un marcador de células madres desarrollado gracias a la mayor capacidad que poseen estas células para destoxificarse. Estas células poseen mayor actividad de la enzima aldehído deshidrogenasa (ALDH) y esta característica la comparten todas las células madres, tanto las normales como las tumorales, por lo que se uso el kit de STEMCELL Technologies Inc (ver acápite 3.9.1). Como se aprecia en la figura 4.60 las MM.1S muestran una población de células Aldefluor positivas perfectamente distinguible. Cultivo Tumor 0 5 10 15 20 Cultivo Tumor % de colonias RESULTADOS 127 Figura 4.60.- Células de la línea MM.1S marcadas con la sonda Aldefluor para identificar las células madres de mieloma múltiple. Se detecta claramente un 1,3% de células brillantes para la sonda aldefluor y que son anexina negativas. En este experimento se realizó inicialmente el marcaje con Aldefluor y posteriormente el marcaje con antiCD138 y anexina. Como se aprecia en la Figura 4.61, a diferencia de lo reportado en la bibliografía estas células Adefluor positivas tienen un porciento (32 %) de células CD138 positivas aunque la mayoría son negativas. También se observa que todas las células que expresan el antígeno de superficie CD138 no son Aldefluor positivas. En este experimento el porciento de células Aldefluor positiva fue ligeramente mayor que en el mostrado anteriormente. Figura 4.61.-Caracterización de las células Aldefluor positivas en la línea MM.1S. Como se aprecia estas células son mayoritariamente CD138 negativas aunque existe una pequeña población CD138 positivas. DISCUSIÓN 129 5.-DISCUSIÓN 5.1-El sorafenib induce apoptosis en células de mieloma múltiple de líneas celulares y de muestras de pacientes A pesar de los nuevos fármacos y estrategias introducidas en la terapia del mieloma múltiple humano, esta continúa siendo una enfermedad incurable. Por esto, la introducción de nuevas estrategias y la búsqueda de nuevos fármacos es una prioridad en las investigaciones relacionadas con esta enfermedad. Las nuevas aproximaciones en el tratamiento del mieloma múltiple deben beneficiarse de los avances recientes en la comprensión de la biología de esta enfermedad, especialmente en los mecanismos de supervivencia y su interacción con el microambiente en que se desarrolla. El microambiente tumoral en el mieloma múltiple humano juega un papel crucial en el desarrollo de esta enfermedad. La interacción entre las células tumorales y el microambiente está mediada por varios mecanismos que incluyen citoquinas tales como VEGF, IL-6, IGF-1 y HGF entre otras (Ogata et al. 1997; Ferlin et al. 2000). La vía de señalización Ras/Raf/MEK/ERK se encuentra por debajo de la mayoría de los receptores de estas citoquinas y tiene un importante papel en esta dolencia (Platanias 2003). El bloqueo de esta vía de señalización puede inducir apoptosis en células de mieloma múltiple incluso en presencia de estroma, el cual típicamente protege a estas células de terapias convencionales como dexametasona (Chatterjee et al. 2002; Chatterjee et al. 2004). Esta vía de señalización puede también ser activada por oncogenes como Ras, las mutaciones en esta proteína se encuentran en el 30-50% de las células plasmáticas de pacientes de MM. Su hallazgo es más frecuente en los estados tardíos de esta patología (Bezieau et al. 2001; Rasmussen et al. 2005), en cambio en los pacientes de nuevo diagnóstico, las mutaciones de Ras se detectan solo en un tercio de los pacientes y se suelen correlacionar con menor supervivencia y poca respuesta a los tratamientos (Liu et al. 1996) y su progresiva adquisición se relaciona con progresión de la enfermedad (Liu et al. 1996) Esta vía de señalización también esta implicada en el efecto angiogénico de VEGF (Podar et al. 2001; Giuliani et al. 2004), que es secretado tanto por las propias células de MM como por BMSC (Gupta et al. 2001). Está demostrado que la inhibición de esta vía de señalización en células, tanto de líneas de MM como en muestras primarias, induce apoptosis (Tai et al. 2007). Dada la importancia de la vía de señalización de Raf en la progresión tumoral del MM, es lógico examinar esta vía de señalización como posible diana terapéutica en el MM (Roberts and Der 2007). Por lo que la posibilidad de inhibir varias quinasas involucradas en diversas vías de señalización sería una aproximación prometedora. En este contexto el sorafenib podría tener un sitio en el tratamiento del mieloma múltiple. El sorafenib es un fármaco diseñado para inhibir a B-Raf y C-Raf, sin embargo, este también inhibe otras quinasas como VEGFR (Wilhelm et al. D I m in t in d in v m 2 0 s o h e Fi d e c a di a e f s o c o e s I SCUSIÓN 136 A pesa r odelos de m t errelación d ependient e v olucra sol o uerte celula 0 09; Yang e t o n solo activ a e cho de que gura 5.1.- Es q e mieloma mú 5.3.- E En la t e a ncerígenas, a nas terap é f ectividad d e o rafenib. S e o mbinación c s pecíficame n r del gran p m uerte celul a entre la a e mente o s o uno de es t r combinad o t al. 2010). E a das si la ví la autofagia q uema del me ltiple E l Sorafe e rapia actua lo habitual e é uticas para e l tratamient o e analizó l a c on APO2/T n te mTORC y p rogreso rea a r, la muert e a poptosis, imultáneam e t os proceso s o en respue s E n otros cas o a dominant e puede actu a canismo atre v nib mue s l del mielo m e s el uso de evitar la a o . En este t r a combinaci RTAIL rec o y Jak. a lizado últim a e celular in la necrosi s e nte. En al s , pero en o s ta al mism o os, una vía e es inhibida a r tanto com v es del que el stra pot e m a múltiple, e más de un a parición d e r abajo se e s ón con bo r o mbinante y a mente en v i vo normal s y la au gunas situ a o tras situaci o o estimulo ( p uede pred o . Esto tiene u o pro-super v sorafenib ind e ncial e n al igual qu e fármaco, de e resistenci a s tudiaron tra r tezomib, u n la combina c l a clasificaci mente com p t ofagia. Es t a ciones, un o nes, se ob s S amara et a o minar sobr e u na complic a v ivencia o pr o uce el efecto c n terapia e del resto d forma que s a y de esta s combinaci n inhibidor c ión con inhi i ón de los d p rende una s tas puede n estimulo e s erva un fe n a l. 2008; B e e las otras, l a a ción adicio n o-muerte. citotóxico en l combin d e las enfe r s e ataquen d a forma au m ones posibl e del proteo s bidores de q d iferentes compleja n ocurrir e specifico n otipo de e llot et al. a s cuales n al por el l as células ada medades d iferentes m entar la e s con el s oma; la q uinasas, DISCUSIÓN 137 Uno de los nuevos fármacos introducidos con éxitos en el tratamiento del mieloma múltiple es el bortezomib. Este fármaco es un inhibidor del proteosoma 26S. Este es un complejo enzimático con actividad proteasa que está compuesto de un núcleo catalítico, denominado 20S, donde se produce la proteólisis de las proteínas, y una o dos subunidades reguladoras 19S, que contienen los sitios de unión a las cadenas de poliubiquitina y la actividad isopeptidasa necesaria para la rotura y liberación de la ubiquitina. Para que una proteína sea degradada por el proteosoma es necesario que esté unida a la ubiquitina, una proteína de 76 aminoácidos, muy conservada evolutivamente, lo cual es realizado por una cascada de enzimas que activan la ubiquitina libre y se encargan de su unión a la proteína diana. Aunque este fármaco ha logrado mejorar significativamente la respuesta de los paciente de MM a la terapia, ésta continua siendo una enfermedad incurable con una esperanza de vida de aproximadamente 7 años, sin embargo la introducción de este fármaco ha representado una evolución en el tratamiento de esta patología. Debido a esto, decidimos combinar el sorafenib con el bortezomib. Además, en líneas celulares de otros tipos tumorales como leucemia y glioma, entre otros, se ha descrito un potente efecto sinérgico al combinar estos dos fármacos (Yu et al. 2006a). Figura 5.2.-Modelo propuesto para el efecto sinérgico observado entre el sorafenib y el bortezomib. Tomado de (Yu et al. 2006a) Estos dos fármacos actúan en dianas terapéuticas diferentes por lo que se esperaba que se observara un efecto beneficioso. Sin embargo, al combinar estos dos fármacos, solo en una de las líneas empleadas se demostró la existencia de un efecto sinérgico mientras que en el resto se detecto un efecto antagónico y solo en algunos puntos un efecto aditivo. Estos resultados no coinciden con los descritos por (Ramakrishnan et al. 2009) quienes plantean que al combinar sorafenib y el bortezomib se obtiene un efecto sinérgico en su caso en las MM.1S, en cambio nosotros solo encontramos efecto sinérgico en las RPMI 8226, y no en las NCI- D I H 9 e f c o q u la e s a n in d d e 2 0 ta p a lí n c o Z h Fi I SCUSIÓN 138 9 29, MM.1S f ecto sinérgi c o mo en éste u e la combi n vía Jnk por Sin em b s tablecer un n tagónico o b Sin em b d uce un au e gradación d 0 12). Debid o nto induce a a rte del bor t n eas. De h e o njuntament e h ang et al. 2 0 gura 5.3.- Pa p , U266 y O P c o lo descri b trabajo. En o n ación de es t lo que prop o b argo, debid o único mec a b servado. b argo, se ha mento de l a d e las prote o a que el s o a utofagia, e s t ezomib y d e e cho vario s e con inhibi d 0 11a; Zang e p el de la auto f P M-2 donde e b en en inhibi c o tras public a t os dos fárm o nes el esqu e o a la divers a nismo que descrito qu e a autofagia í nas por es t o rafenib, co m s to podría c e esta form a s estudios d d ores del pr o e t al. 2012). a gia en la mu RPMI 822 6 e l resultado c ión de la p r a ciones (Yu e m acos consig ema Figura 5 idad de efe c sea capaz e el bortezo m como mec a t a vía (Zhu e m o se ha e x c ontribuir a c a contribuir d escriben q o teosoma p r erte inducida 6 es antagóni c r oliferación, y e t al. 2006a ) uen una inh i 5 .2. c tos que ind u de explica r m ib, al igual a nismo com e t al. 2009; x plicado ant e c ompensar al efecto a n ue el uso r esenta un e por la combi n 82 2 c o. Es impor t y no en la in d ) el efecto si n bición de A k u cen estos d r tanto el e f que la inhibi pensatorio a Zhang et a l e riormente, i l a inhibición n tagónico o b de inhibido e fecto sinér g ación de sor a 2 6 BCL-XL r tante desta c ducción de a n érgico lo at k t y una acti v os fármaco s f ecto sinérg i i ción del pro t a la inhibici l. 2011a; Z a inhibe mTO R del proteo s b servado e n o res de la g ico (Zhu et a fenib y borto z c ar que el a poptosis ribuyen a v ación de s es difícil i co como t eosoma, ón de la a ng et al. R C y por s oma por n algunas a utofagia al. 2009; z omib. DISCUSIÓN 139 No obstante también se ha descrito que la autofagia puede contribuir a la muerte celular, por lo que un aumento excesivo de este proceso por estos dos fármacos podría contribuir a la muerte. Esto concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo donde al silenciamiento de Beclina-1 tanto en células capaces de realizar apoptosis como en células en las cuales la apoptosis esta inhibida por sobreexpresión de Bcl-xL, muestra que en las primeras la autofagia contrarrestaría la inducción de la muerte de esta combinación mientras que en las últimas la autofagia puede contribuir a la muerte al combinar sorafenib y bortezomib. Según los resultados obtenidos podemos decir que el efecto que se obtendrá al combinar el sorafenib con el bortezomib puede estar condicionado a las características de las células de MM. Por lo que se necesitaría analizar cada caso específico para decidir si esta combinación de fármacos es de utilidad. La otra combinación estudiada fue con APO2/TRAIL. Este es uno de los ligandos mortales de la familia de TNF. A diferencia del resto de los ligandos mortales, TRAIL induce apoptosis en diversas líneas tumorales mientras que exhiben poca toxicidad hacia células normales (Ashkenazi 2002). Esto lo convierte en una molécula antitumoral muy atractiva. El MM es una de las patologías candidatas para el uso de este fármaco y de hecho existen numerosas citas respecto al efecto de esta molécula sobre células de mieloma múltiple aunque usando una molécula diferente mucho más tóxica a la empleada en este trabajo (Gazitt 1999; Lincz et al. 2001; Mitsiades et al. 2001). Aquí se ha usado una forma recombinante y soluble de esta molécula (APO2L/TRAIL.0) mucho menos toxica. Muchos trabajos realizados indican que no todas las líneas de mieloma múltiple son sensibles a APO2L/TRAIL (Lincz et al. 2001). En algunos estudios atribuyen esta falta de sensibilidad a bajos niveles de procaspasa 8, a los niveles de expresión relativa de DR4, DR5, DcR1 y DcR2, o a la dificultad para que los receptores trimericen por estar fuera de las balsas lipídicas (Gomez-Benito et al. 2007). En cambio otros lo atribuyen al papel protector de la vía PI3K/Akt, por lo que usando inhibidores de esta vía aumenta la sensibilidad a APO2L/TRAIL (Chen et al. 2001; Kim and Lee 2005). En concordancia con esto se ha descrito que el sorafenib muestra un potente efecto sinérgico al combinarlo con APO2L/TRAIL en células de leucemia (Rosato et al. 2007). Una vez que TRAIL se une a sus receptores DR4 y DR5, induce su trimerización y la fonación del DISC. La proteína adaptadora FADD es reclutada al DISC y facilita la incorporación de la procaspasa 8 lo que conduce a su activación. La vía extrínseca se puede conectar a la vía intrínseca a través de la proteína sólo BH3 Bid, la cual es activada por la caspasa 8. La activación de la vía intrínseca induce liberación del citocromo c. la activación simultanea de la vía intrínseca y extrínseca conduce a una amplificación y una marcada potenciación de la apoptosis (Rosato et al. 2003; Gomez-Benito et al. 2007). Como se observa en nuestros resultados la preexposición con sorafenib de las células de mieloma resistente a TRAIL, sensibiliza éstas al efecto de este ligando mortal. El sorafenib reduce los niveles de Mcl-1, lo cual puede tener un papel esencial en los efecto observados en DISCUSIÓN 140 esta combinación al facilitar la conexión entre la vía extrínseca e intrínseca. Además, también se observa que el sorafenib reduce los niveles de cFLIPL y aumenta ligeramente los niveles de FADD. El aumento de FADD por un lado facilita la formación del DISC y por tanto el reclutamiento de la caspasa 8 mientras que la reducción de cFLIPL facilitaría la activación de la caspasa 8 y por tanto la activación de Bid, lo que unido a la bajada de Mcl-1, proteína antiapoptótica que bloquea a tBid (Clohessy et al. 2006), facilita la ejecución de la vía intrínseca. Aunque en nuestro laboratorio se ha demostrado que la resistencia de la línea U266 a TRAIL es debida a la dificultad que presentan los receptores mortales para trimerizar lo cual puede ser mejorado con ácido valproico (Gomez-Benito et al. 2007), en este caso parece que el aumento en los niveles de FADD y fundamentalmente la disminución de los niveles de Mcl-1 y cFlipL cooperan para que la vía intrínseca potencie el efecto apoptótico de los receptores mortales lo cual queda demostrado al observarse una mayor salida de citocromo c y mayor procesamiento de la caspasa 8. Estos resultados coinciden con otros estudios en los que demuestran el papel de Mcl-1 en la apoptosis inducida por TRAIL (Clohessy et al. 2006; Han et al. 2006; Menoret et al. 2006). En el caso de cFLIPL la relación es más compleja ya que unos niveles muy alto bloquean la activación de la caspasa 8 al impedir el reclutamiento de esta al DISC, en cambio unos niveles intermedios son capaces de cooperar en la activación de la caspasa 8 al heterodimerizar con ésta (Boatright et al. 2004) aunque se le atribuyen funciones diferentes que al homodímero (van Raam and Salvesen 2011). Numerosos estudios han sugerido la existencia de un bucle de retroalimentación mTORCPI3K y en 2006 el grupo de Neil Rosen y Jose Baselga demostró que la inhibición de mTORC1 conduce a la activación de AKT (O'Reilly et al. 2006). Este descubrimiento tiene importantes implicaciones terapéuticas ya que explica en parte los pocos beneficios obtenidos de los compuestos que inhiben a mTORC y permite mejorar el potencial antitumoral de estos compuestos al poder bloquear la vía de PI3K. Sin embargo otro grupo, recientemente ha demostrado que la inhibición de mTORC activa la vía de señalización de las MAPK (Carracedo et al. 2008b). En muestras de biopsias de pacientes incluidos en un ensayo clínico encontraron una fuerte estimulación de la vía de las MAPK lo que se expresaba en la fosforilación de Erk. Esto también explicaría la pobre actividad antitumoral de los inhibidores de mTORC. Esta fosforilación de Erk es dependiente de Ras y de Mek1/2 así como del bucle de retroalimentación de PI3K y de S6K aunque el mecanismo exacto aun no ha sido dilucidado (Carracedo et al. 2008a; Carracedo et al. 2008b). Fi d e la c o s e ti r M a p O S m c o a u in s e ci t m m h a a a gura 5.4.- Bu c e estos fárma c Si las actividad a n o n inhibidore e ñalización d r osín-quinas a ek y de m T p optótica de Debid o SI-027 han m TORC2 (Ho o n sorafenib , u nque tambi hibición de l a e rina 473 re s A mbo s t otóxica en ostró ser re s ás sensible a a ce muy de p PP242. El r e PP242. c le de retroali m c os. Para con s MAPK son a n titumoral d e s de Mek1/ 2 d ebido al pa p a , en Ras o T ORC han los inhibido r o a esto se m ostrado te n ang et al. 2 0 , que inhibe én tiene al g a fosforilaci ó s pectivamen t s fármacos , la mayoría s istente a l o a l PP242 pe p endiente de e sto de las l í m entación tra s s eguir una in h a ctivadas en e esta famili a 2 . Actualmen p el de esta v en Raf (Dh demostrad o r es de mTO R seleccionar n er un pote n 0 10; Bhagw a la vía de la s o de efecto ó n de 4E BP, t e. , PP242 y de las líne a o s dos fárm a ro no al OSI - la vía PI3K  í neas mostr ó s la inhibición h ibición eficie n n respuesta a a de compu te se están e v ía en onco g illon et al. 2 o un fuerte R C. r on dos fár m n te efecto in at et al. 201 s MAPK co m sobre mT O , S6, Gsk-3 OSI-027, m a s de mielo m a cos. En ca m -027. Esta lí  AktmTO ó una sensi b de mTORC q n te se necesit a a la inhibició n esto combi n e studiando m g énesis ya s 2 007). Difer e aumento d e m acos inhibi d hibidor no s o 1; Hoang e t o se demos t O RC1 y 2 c o y la inhibici ó m ostraron t e m as ensay a m bio la líne a nea tiene m u RC lo que e x b ilidad inter m q ue justifican e a inhibir tambi n de mTOR C n ando los in h m uchos inhi b e a por muta ntes estudi o e la activid a d ores de m T o lo de mTO R t al. 2012). E t ró anterior m mo lo dem u ó n de la fosf o e ner activid a a das, no ob s a OPM-2 m o u tado la fosf a x plicaría su m m edia entre l a DI S e l poco benef i en estos bucl C 1, se pued e h ibidores d e b idores de e s a ciones en r e o s con inhib i a d antiproli f T ORC1 y 2. R C1 sino ta m E stos se co m ente en est e u estra el he c o rilación de A a d antiprolif e s tante la lí n o stró ser lig e a tasa PTEM m ayor susc e a s U266 y l a S CUSIÓN 141 i cio clinico es. e mejorar mTORC s ta vía de e ceptores dores de f erativa y PP242 y m bién de m binaron e trabajo, c ho de la A KT en la e rativa y ea U266 e ramente lo que la e ptibilidad a s OPM-2 DISCUSIÓN 142 En cambio la sensibilidad a OSI-027 no tuvo el mismo comportamiento. Las U266 continuaron siendo poco sensibles pero además, las RPMI 8226 mostraron una sensibilidad muy similar a las U266 y las OPM-2 se comportaron como las MM.1S y NCI-H929. mTORC es esencial para el crecimiento tumoral, por eso se ha hecho popular como diana terapéutica. Sin embargo el uso de fármacos que tengan esta diana terapéutica es complicado debido a diferentes bucles de retroalimentación que activan diferentes vías compensatorias. Estos fármacos originalmente inhibían alostericamente mTORC1. La inhibición de mTORC1 evitaba la inhibición por parte de p70S6k y del propio mTROC1 de IRS-1 (insulin receptor substrate-1). La de-represión de IRS-1 hiperactiva la vía receptor IGF-1/PI3K/AKT lo cual aumenta la actividad de AKT limitando el efecto antitumoral de estos fármacos, esto también ha sido descrito en MM (Shi et al. 2005). mTORC también participa en un segundo complejo, mTORC2, el cual media la fosforilación de AKT en S473. Esta fosforilación es requerida para la completa activación de AKT (Ma and Blenis 2009). Sin embargo, la segunda generación de inhibidores de mTORC, como PP242 y OSI-027, inhiben tanto mTORC1 como mTORC2 lo cual induce una mayor actividad antitumoral comparado con rapamicina, incluido en MM (Hoang et al. 2010). Aunque esta segunda generación de inhibidores de mTORC parcialmente contrarrestan el bucle de retroalimentación PI3K/AKT aun existe un segundo mecanismo de retroalimentación compensatorio, por parte de MAPK, que puede contrarrestar la actividad de estos compuestos (Hoang et al. 2012). Por lo que la resistencia observada de la línea U266 podría ser debido a una gran dependencia de esta línea de la vía de señalización Ras/Raf/Mek/Erk. Sin embargo al combinar los inhibidores de mTORC con sorafenib, un inhibidor de Raf y por tanto de la vía de las MAPK, el mayor efecto sinérgico se obtuvo en las líneas MM.1S y H929 alcanzándose altos índices de muerte celular a dosis subletales de estos fármacos. También se obtuvo cierto efecto aunque en menor medida en las RPMI 8226 y OPM-2. Mientras que en las U266 no se observo ningún efecto. Este resultado se obtuvo de forma muy similar tanto con el PP242 como con el OSI-027. Esto corrobora que la activación de Erk producida por los inhibidores de mTORC contrarresta la actividad antitumoral de la inhibición de mTORC. No obstante, las U266 continuaron siendo insensibles a estos inhibidores por lo que la hipótesis de que la activación de las MAPK fuera responsable de la resistencia de esta línea a los inhibidores de mTORC no es correcta. Una hipótesis alternativa es que esta línea sea más dependiente de la vía de Jak/Stat. Jak es una tirosín quinasa activada por receptores como el de la IL-6, una citoquina con un papel muy importante en la progresión del mieloma múltiple. La activación de Jak fosforila el receptor de la IL-6 y la proteína gp130 lo que permite la activación de Stat-3 entre otras vías de señalización. Al igual que la IL-6 otras citoquinas también pueden activas a Jak. Esta vía de señalización IL-6/IL-6R/Jak/Stat esta sujeta a una regulación negativa por tres familias de fosfatasa (Valentino and Pierre 2006; Xu and Qu 2008). Y puede estar activada aberrantemente, tanto por mutaciones, como la encontrada en la enfermedad mieloproliferativa DISCUSIÓN 143 (JAK2V617F) como por inactivación epigenética de sus reguladores negativos como SOCS1 encontrado en hepatoma o SHP-1 encontrado en el 63-80% de los pacientes de mieloma (Chim et al. 2004). Esta última es una tirosín fosfatasa expresada en células hematopoyética y considerado un posible gen supresor tumoral. La línea de mieloma múltiple U266 comparte esta característica de presentar hipermetilado el promotor de SHP-1 por lo que su expresión génica esta inhibida y Stat-3 hiperactivada (Catlett-Falcone et al. 1999b; Chim et al. 2004). Debido a esto seleccionamos un fármaco como el Ruxolitinib el cual es un potente inhibidor de Jak1/2 lo cual interrumpiría la constante activación de Stat-3 (Eghtedar et al. 2012). A pesar de esto, al tratar las líneas de mieloma múltiple con este fármaco no se apreció ningún efecto antiproliferativo o citotóxico, al menos a la las dosis ensayadas. Esto en parte coincide con lo descrito con otros compuestos de este perfil donde solo han encontrado alguna actividad en las U266 al usar el fármaco de forma individual, no así al combinarlo con otras moléculas (Li et al. 2010). Sin embargo, al combinar el Ruxolitinib con sorafenib o con sorafenib y OSI-027 si se observa cierto efecto citotóxico en prácticamente todas las líneas de mieloma múltiple ensayadas. Este efecto fue significativamente notable en las H929 al combinar ruxolitinib+OSI-027+sorafenib y en las OPM-2 mientras que en las RPMI 8226 fue modesto. En cambio en las U266 se pudo observar potenciación del efecto, tanto del sorafenib, como del sorafenib+OSI-027. Aunque esta potenciación fue modesta en las U266 a estas dosis ensayadas estos experimento muestran que la inhibición de Jak1/2 potencia los efectos de otros drogas al antagonizar los efectos protectores de la vía IL-6/IL-6R/Jak/Stat y sugiera que la falta de efectividad clínica de algunos compuestos pude ser debida a la activación de esta vía. Según todos estos resultados podemos decir que se necesita una cuidadosa e individualizada evaluación de los beneficios con respecto a la toxicidad de cada terapia, así como una cuidadosa estratificación de los pacientes con el objetivo de optimizar y obtener los mejores resultados posibles del arsenal farmacoterapéutico que se dispone. 5.4.- Optimización del análisis de presuntas células madres de mieloma múltiple. A pesar de los avances en la terapia del mieloma múltiple, esta continúa siendo una enfermedad incurable. Los nuevos tratamiento consiguen una remisión casi completa entre el 80 y 90% de la enfermedad, pero nunca la cura y los pacientes casi siempre recaen. Una posible explicación a este hecho es la novedosa pero controvertida hipótesis de las células madres tumorales. Esta hipótesis plantea que la quimioterapia consigue la erradicación de las células plasmáticas malignas pero deja un reservorio de células madres tumorales que siguen creciendo y pueden producir más células plasmáticas malignas. Estas células madres son actualmente resistentes a los fármacos disponibles, por lo que si una nueva terapia consiguen erradicar estas células tumorales se conseguiría la cura de la enfermedad. En base a esta hipótesis nos propusimos analizar si el sorafenib tenía alguna actividad sobre las presuntas células madres tumorales de mieloma múltiple. Para esto inicialmente se DISCUSIÓN 144 identificaron estas células. Según Matsui estas células sería CD138 negativas y CD20 positivas aunque según Paino este antígeno de superficie es indetectable en las líneas en cultivo por lo que no sería un buen marcador (Matsui et al. 2004; Matsui et al. 2008; Paino et al. 2012). En este trabajo se ha realizado un estudio preliminar de la actividad del sorafenib sobre esta población de presuntas células madres utilizando inicialmente como marcador de estas células la falta de expresión del antígeno de superficie CD138. Se detectó que en todas las líneas estudiadas existe una pequeña población de células CD138 negativas siempre por debajo del 5% aunque con gran variabilidad de un experimento a otro. Esto coincide con el porciento de presuntas células madres detectada en estos cultivos por otras técnicas como es la detección de la “side population” (SP) (Jakubikova et al. 2011). Al tratar, tantos los cultivos completos como las fracciones enriquecidas o depletadas de células CD138 negativas, aumenta la población de las presuntas células madres por lo que estas células parecen ser menos sensibles a este fármaco. Esto está justificado por el hecho demostrado de que estas células presentan una expresión incrementada de trasportadores de fármacos (ABCG2 y MDR/Pgp) lo que justifica, en parte, una relativa resistencia a la terapia ya que producen una disminución de la concentración de drogas en el interior de las células (Jakubikova et al. 2011). Además, las células madres, tanto normales como tumorales, presentan mecanismos intracelulares de destoxificación lo que también contribuyen a una mayor resistencia a los fármacos como es una mayor actividad de la enzima ALDH (Matsui et al. 2004; Matsui et al. 2008). Y por último, la mayoría de las células madres se encuentran quiescentes y esta característica también contribuye a los mecanismos de resistencia a fármacos (Cheng et al. 2000). Aunque purificando las células CD138 negativo o incluso trabajando con los cultivos completo se pudo apreciar que las presuntas células madres son más resistente al sorafenib que las células CD138 positivas. El uso de este marcador presenta numerosas desventajas. Al tratar de purificar estas células por MACS la población de células obtenidas es mayoritariamente células anexina positiva ya que las células una vez inician la ejecución de la apoptosis pierden este antígeno de superficie. Además existen contradicciones en cuanto al fenotipo real de las presuntas células madres tumorales y diferentes grupos se contradicen en cuanto a los antígenos de superficie que expresa esta población de células, por lo que se decidió analizar las células madres tumorales usando otro marcador ampliamente aceptado como característico de células madres, tanto tumorales como normales (Rasmussen et al. 2000b; Matsui et al. 2004; Matsui et al. 2008; Pilarski et al. 2008; Jakubikova et al. 2011; Hosen et al. 2012; Paino et al. 2012). La ALDH, específicamente ALDH1A1, media la biosíntesis del ácido retinoico todo trans, así como la destoxificación de una gran variedad de compuestos tales como etanol y metabolitos activos de ciclofosfamida. Las células madres adultas exhiben unos niveles relativamente altos de actividad ALDH con respecto a su progenie diferenciada y la sonda fluorescente Aldefluor, sustrato de esta enzima, puede diferenciar las células madres de tejidos DISCUSIÓN 145 adultos (Jones et al. 1995). Al marcar las células MM.1S con esta sonda se observó que esta línea presenta una pequeña población de células con unos niveles mayores de actividad de esta enzima. Al marcar simultáneamente con anticuerpo anti CD138 se detectó que el 68 % de estas células son CD138 negativas pero el restante 32 % son CD138 positivas y todas las células CD138 negativas no eran Aldefluor positivas. Existen publicaciones resientes que ya han llamado la atención sobre este hecho (Jakubikova et al. 2011). Diferentes antígenos de superficies han sido usados para identificar las presuntas células madres tumorales y diferentes estudios han intentado identificar y estudias estas células. Algunos estudios han identificado las propiedades clonogénicas de la fracción celular CD138 negativa por lo que se han propuesto estas como presuntas células madres de mieloma múltiple, sin embargo estas células no se solapan completamente con otros marcadores de células madres como el SP (Jakubikova et al. 2011). En este estudio se observa como tampoco hay una completa concordancia con la expresión de ALDH, otro marcador característico de células madres. Aunque este ha sido un estudio preliminar, que ha consistido más en poner a punto las técnicas para la identificación y separación de la presuntas células madres de mieloma múltiple, estos resultados, junto con los publicados por otros grupos podrían indicar que las presuntas células madres de mieloma múltiple tienen una expresión heterogénea del antígeno de superficie CD138 aunque con una predominio de una expresión baja.