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2013 28 Paula Vera Estacho Estudio de adhesivos en envase alimentario: desarrollo de métodos de análisis, difusión y migración de sus componentes a los alimentos envasados Departamento Director/es Química Analítica Nerín de la Puerta, M.C. Cristina Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Paula Vera Estacho ESTUDIO DE ADHESIVOS EN ENVASE ALIMENTARIO: DESARROLLO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS, DIFUSIÓN Y MIGRACIÓN DE SUS COMPONENTES A LOS ALIMENTOS ENVASADOS Director/es Química Analítica Nerín de la Puerta, M.C. Cristina Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Ingeniería y Arquitectura Departamento de Química Analítica ESTUDIO DE ADHESIVOS EN ENVASE ALIMENTARIO. DESARROLLO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS, DIFUSIÓN Y MIGRACIÓN DE SUS COMPONENTES A LOS ALIMENTOS ENVASADOS Paula Vera Estacho TESIS DOCTORAL 2012 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Ingeniería y Arquitectura Departamento de Química Analítica ESTUDIO DE ADHESIVOS EN ENVASE ALIMENTARIO. DESARROLLO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS, DIFUSIÓN Y MIGRACIÓN DE SUS COMPONENTES A LOS ALIMENTOS ENVASADOS Paula Vera Estacho TESIS DOCTORAL 2012   La Dra. Cristina Nerín de la Puerta, Catedrática del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Zaragoza CERTIFICAN: Que la presente Memoria, titulada: “ESTUDIO DE ADHESIVOS EN ENVASE ALIMENTARIO. DESARROLLO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS, DIFUSIÓN Y MIGRACIÓN DE SUS COMPONENTES A LOS ALIMENTOS ENVASADOS” presentada por Dña. Paula Vera Estacho para optar al grado de Doctor en Ciencia Analítica, ha sido realizada bajo mi codirección en el Escuela de Ingeniería y Arquitectura de la Universidad de Zaragoza, de acuerdo a los objetivos presentados en el Proyecto de Tesis aprobado por el Departamento de Química Analítica. Por tanto, autorizo su presentación para proseguir con los trámites oportunos y proceder a su calificación por el tribunal correspondiente. En Zaragoza, a 10 de Octubre de 2012. Dra. Cristina Nerín de la Puerta Este trabajo ha sido financiado por el Gobierno de Aragón a través de la beca predoctoral B185/2009. Este trabajo ha sido realizado en el marco del proyecto de investigación: “Research Programme on Migration From Adhesives in Food Packaging Materials in Support of European Legislation and Standardisation: MIGRESIVES" UE, VI FRAME PROGRAM, Collective Research. 20072010.  7.4. Adhesivos acrílicos ........................................................................... 44 8. Origen de sustancias sensorialmente activas ........................................... 45 9. Análisis sensoriales para sustancias sensorialmente activas. ................... 47 10. Análisis de olores mediante cromatogría de gases-olfatometría ............ 49 10.1. Cromatografía de gases-olfatometría ............................................. 50 10.2. Técnicas olfatométricas .................................................................. 52 10.2.1. Técnicas de dilución ............................................................... 52 10.2.2. Técnica de frecuencia de citación: NIF .................................. 53 10.2.3. Técnica de tiempo intesidad ................................................... 53 10.2.4. Técnica de intensidad posterior .............................................. 54 10.2.5. Técnica de frecuencia modificada .......................................... 54 10.3. Obtención de extractos aromáticos representativos ....................... 56 11. Proyecto migresives ............................................................................... 59 SECCIÓN II OBJETIVOS ................................................................ 63 Objetivos ............................................................................................. 65 SECCIÓN III EXPERIMENTAL ................................................... 67 CAPÍTULO  1 : Identificación de compuestos , determinación de su concentración inicial, coeficientes de particion y difusión en dos adhesivos termofusibles ............................................................................................. 71 1. Introducción del capítulo ......................................................................... 75 2. Materiales y métodos ............................................................................... 78 2.1. Materiales ......................................................................................... 78 2.1.1. Reactivos .................................................................................. 78  2.1.2. Fibras de SPME ........................................................................ 79 2.1.3. Muestras de adhesivos y laminados .......................................... 79 2.2. Instrumental ...................................................................................... 82 2.2.1. Cromatógrafía de gases espectrometría de masas .................... 82 2.3. Optimización de la condiciones de HS-SPME ................................. 83 2.3.1. Variables a estudio .................................................................... 83 2.3.2. Optimización ............................................................................ 87 2.4. Identificación y clasificación de los compuestos presentes en los adhesivos termofusibles .......................................................................... 88 2.5. Determinación de la concentración inicial en el adhesivo ............... 90 2.6. Determinación de los coeficientes de partición ................................ 92 2.7. Determinación de los coeficientes de difusión ................................. 96 3. Resultados y discusión ............................................................................. 99 3.1. Optimización de las condiciones HS-SPME .................................... 99 3.2. Identificación y clasificación según la toxicidad de los compuestos detectados en los adhesivos ................................................................... 107 3.3. Concentración inicial en el adhesivo .............................................. 108 3.4. Coeficientes de partición ................................................................ 111 3.5. Coeficientes de difusión ................................................................. 118 4. Conclusiones .......................................................................................... 125 CAPÍTULO2: Estudios de migración de los adhesivos en el envase multicapa para envasar alimentos .............................................................. 127 1. Introducción del capítulo ....................................................................... 131  2. Materiales y métodos ............................................................................. 133 2.1. Materiales ....................................................................................... 133 2.1.1. Reactivos ................................................................................ 133 2.1.2. Fibras de SPME ...................................................................... 134 2.1.3. Laminados y adhesivos ........................................................... 135 2.2. Instrumental .................................................................................... 137 2.2.1. Cromatógrafo de gases espectrometría masas ........................ 137 2.3. Identificación de los compuestos presentes en los laminados. ....... 138 2.4. Determinación de la concentración inicial en los adhesivos Cp0. .. 139 2.5. Optimización del análisis con Tenax .............................................. 140 2.6. Ensayos de migración ..................................................................... 142 2.7. Validación del modelo de predicción de la migración ................... 143 2.8. Relación de valores de migración con las constantes de partición y difusión .................................................................................................. 144 3. Resultados y discusión ........................................................................... 145 3.1. Identificación y Cp0 de los compuestos presentes en los adhesivos145 3.2. Migración ....................................................................................... 154 3.3. Validación ...................................................................................... 166 3.4. Relación de valores de migración con las constantes de partición y difusión .................................................................................................. 167 4. Conclusiones .......................................................................................... 170 CAPÍTULO 3: Identificación y cuantificación de la migración de compuestos no volátiles de dos adhesivos termofusibles .......................... 173  1. Introducción del capítulo ....................................................................... 177 2. Materiales y métodos ............................................................................. 181 2.1. Materiales ....................................................................................... 181 2.1.1. Reactivos ................................................................................ 181 2.1.2. Laminados y adhesivos ........................................................... 182 2.2. Instrumental .................................................................................... 183 2.2.1. Cromatógrafía líquida ultra alta resolución ............................ 183 2.2.2. Detección por espectrometría de masas .................................. 183 2.3. Análisis cualitativo de migración e identificación de los compuestos migrantes en los adhesivos .................................................................... 184 2.4. Determinación de la concentración inicial (Cp0) de los compuestos migrantes en los adhesivos .................................................................... 188 2.5. Ensayo cuantitativo de migración .................................................. 190 3. Resultados y discusión ........................................................................... 190 3.1. Análisis cualitativo de migración e identificación de los compuestos en los adhesivos ..................................................................................... 190 3.2. Concentración inicial de los compuestos migrantes en el adhesivo198 3.3. Migración de compuestos no volátiles ........................................... 200 4. Conclusiones .......................................................................................... 203 CAPÍTULO 4 Identificación y cuantificación de compuestos odorantes presentes en los adhesivos en el envase alimentario .................................. 205 1. Introducción del capítulo ....................................................................... 209 2. Materiales y métodos ............................................................................. 211 2.1. Materiales ....................................................................................... 211  2.1.1. Reactivos ................................................................................ 211 2.1.2. Fibras de SPME ...................................................................... 212 2.1.3. Laminados y adhesivos ........................................................... 212 2.2. Selección del adhesivo más odorífero y análisis sensorial ............. 215 2.3. Instrumental .................................................................................... 217 2.3.1. Cromatografía de gases directa con olfatometría espectrometría de masas (D-GC-O) .......................................................................... 217 2.3.2. Cromatografía de gases-olfatometría-espectrometría de masas. (GC-O-MS) ....................................................................................... 219 2.4. Extracción de los compuestos volátiles desde el adhesivo ............. 221 2.4.1. Extracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (HSSPE) .................................................................................................. 221 2.4.2. Microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (HS-SPME) ....................................................................................... 223 2.5. Identificación de los compuestos odorantes de los extractos obtenidos anteriormente por HS-SPE y HS-SPME ............................... 226 2.6. Determinación de la concentración inicial de los compuestos odorantes en los adhesivos .................................................................... 231 3. Resultados y discusión ........................................................................... 233 3.1. Selección del adhesivo más odorífero de cada tipo y análisis sensorial para cada uno de ellos ............................................................ 233 3.2. Optimización de la microextracción en fase sólida por espacio de cabeza (HS-SPME) ................................................................................ 235 3.3. Identificación de los compuestos odorantes de los extractos del adhesivo mediante HS-SPE-GC-MS y HS-SPME-GC-MS .................. 238  3.4. Cuantificación de los compuestos odorantes por HS-SPME-GC-OMS ......................................................................................................... 245 4. Conclusiones .......................................................................................... 250 CAPÍTULO 5 Estudios de migración de los compuestos odorantes presentes en los adhesivos utilizados en el envase multicapa para envasar alimentos ........................................................................................... 253 1. Introducción del capítulo ....................................................................... 257 2. Materiales y métodos ............................................................................. 258 2.1. Materiales ....................................................................................... 258 2.1.1. Reactivos ................................................................................ 258 2.1.2. Laminados y adhesivos ........................................................... 259 2.1. Instrumental .................................................................................... 260 2.1.1. Cromatógrafía de gases-olfatometríaespectrometría masas (CG-O-MS) ....................................................................................... 260 2.3. Determinación de la concentración inicial (Cp0) de los compuestos odorantes en los laminados .................................................................... 261 2.4. Ensayos de migración ..................................................................... 262 3. Resultados y discusión ........................................................................... 264 3.1. Determinación de la concentración incial (Cp0) de los compuestos odorantes en los laminados .................................................................... 264 3.2. Ensayos de migración ..................................................................... 271 4. Conclusiones .......................................................................................... 275 SECCIÓN IV CONCLUSIONES .................................................. 277 Conclusiones ........................................................................................... 279  SECCIÓN V LEGISLACIÓN Y BIBLIOGRAGÍA .............. 283 Legislación ........................................................................................... 285 Bibliografía ........................................................................................... 287 SECCIÓN VI PUBLICACIONES ................................................ 309 Publicaciones ........................................................................................... 311 Glosario de términos  1   GLOSARIO DE TÉRMINOS AC Acrílico Alm Almidón Δm Variación de masa APAO Poli-alfa-olefina amorfa C Cartón C`(A) Concentración en el adhesivo a cualquier tiempo C`(S) Concentración en el sustrato a cualquier tiempo Ceq(A)  Concentración en equilibrio en el adhesivo Ceq(S) Concentración en equilibrio en el sustrato Ceq(S)* Concentración en equilibrio en el sustrato añadido al sándwich CAR/PDMS Carboxen/ polidimetilsiloxano CF Factor de consumo Cp0 Concentración inicial Cp0(A) Concentración inicial en el adhesivo CPP Cartón laminado con polipropileno d Espesor DA Difusión en el adhesivo D0 Difusión a altas temperaturas DS Difusión en el sustrato D-GC-O Directa gas cromatografía olfatometría DVB/CAR/PDMS Divinilbenzeno / carboxen / polidimetilsiloxano ED Energía de activación EDI Ingesta diaría estimada Glosario de términos  2   ESIIonización por electrospray EVA Acetato de vinilo y etileno F(%) Porcentaje de frecuencia DF Factor de dilución MF Frecuencia modificada GC Cromatográfia de gases GC-O Cromatografía gases -olfatometría GML Límite de Migración Global HS Espacio de cabeza I(%) Porcentaje de intensidad M+ Ión característico iFit Ajuste isotópico IFST Institute of Food Science and Technology KA,S Constante de partición adhesivo-sustrato KoA,S Constante de partición adhesivo-sustrato, temperatura muy elevadas Kfa Constante de distribución fibra-analito KPP,C  Constante de partición polipropileno-cartón LE Extracción líquida LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación MS Espectrometría de masas MS /MSEspectrometría de masas en tándem MSE Espectrometría de masas modo de adquisición a alta y baja energía NIST National Institute of Standards and Technology Glosario de términos  3   PA Poliacrilato PDMS Polidimetilsiloxano PDMS/DVB Polidimetilsiloxano/divinilbenzeno PVA Acetato de polivinilo PVOH  Polivinilalcohol QTOF Cuadrupolo-tiempo de vuelo. RSD Desviación estándar relativa SML Límite de Migración Específica SPE Extracción en fase sólida. SPME Microextracción en fase sólida. T Adhesivo termofusible Text Temperatura de extracción text Tiempo de extracción tdes Tiempo de desorción TOF Tiempo de vuelo UPLC Cromatográfia de líquidos de ultra alta resolución. VAE Copolímero de acetato vinilo y etileno V+Al  Mezcla de adhesivo vinílico más almidón. ρ Densidad ∂A Solubilidad del adhesivo ∂D Fuerzas de dispersión ∂H Fuerzas debido a puentes de hidrógeno ∂m Solubilidad del compuesto migrante ∂P Fuerzas de atracción ∂S Solubilidad del sustrato SECCIÓN I INTRODUCCIÓN Introducción  13   INTRODUCCIÓN En la actualidad, las industrias alimentarias ofrecen al consumidor productos de calidad nutritiva y sensorial en los cuales, el envase juega un papel fundamental para el logro de este objetivo. Pero también, puede convertirse en un serio problema si no se controlan algunos aspectos del envase, como por ejemplo, la transferencia de materia a través de este, conocida como la migración. La migración, tiene un gran interés toxicológico, con el fin de evitar perjudicar la salud del consumidor. Pero también se puede mirar desde el punto de vista de la migración de sustancias sensorialmente activas que normalmente están por debajo de los límites establecidos como toxicológicos, pero perjudican las características sensoriales iniciales del alimento produciendo la aparición de un olor o sabor extraño. La aparición de este tipo de problemas puede dañar la imagen de productos o marcas comerciales generando el rechazo del consumidor. Una parte de esta introducción, hace referencia al envase alimentario y las interacciones entre este, el alimento que contiene y el entorno que le rodea. Posteriormente se detalla el uso de los adhesivos en el envase alimentario, así como la legislación que deben cumplir. Se puntualiza sobre los procesos que rigen la migración en el caso concreto de los adhesivos que forman parte del envase alimentario multicapa. Se clasifican de forma amplia los distintos adhesivos que se pueden encontrar en el mercado y se definen los componentes principales que pueden formar parte de estos, detallando más ampliamente los adhesivos termoplásticos. Introducción  14   Por otro lado, en esta introducción se detalla el origen de las sustancias odorantes en los envases y los ensayos más habituales para la detección de las mismas mediante análisis sensoriales, obteniendo percepciones globales. Y la detección de compuestos de forma individual que se realiza a partir de análisis instrumentales, que constan de cromatografía de gases-olfatometría combinadas con técnicas olfatométricas. Finalmente se expone un breve resumen del proyecto MIGRESIVES en cuyo marco se ha realizado parte del trabajo llevado a cabo en esta tesis. 1. ENVASE ALIMENTARIO Hoy en día los envases además de cumplir la función básica de contener al alimento, protegen y conservan la calidad e integridad de este. Esta protección puede ser pasiva o activa (Risch, 2009): La protección pasiva, evita el deterioro físico del alimento y/o evita el deterioro químico o microbiológico, proporcionando una barrera frente a distintos parámetros como oxígeno, humedad, microorganismos, luz, temperatura, aromas, sabores…que merman la calidad del producto, provocando por ejemplo su alteración microbiológica, oxidación de lípidos, destrucción de vitaminas, pardeamientos, etc. Por otro lado, la protección activa, ayuda a mantener una atmósfera favorable al alimento que evite el deterioro químico y/o microbiológico. Introducción  15   Para eliminar estos daños físicos, químicos y microbiológicos del producto en general, los envases han ido evolucionando a lo largo de los años debido a factores de distinta índole. La idea de envase surgió hace más de 10.000 años con el propósito de contener los bienes necesarios para la supervivencia, especialmente del agua. A mediados del siglo XX la gran transformación de la vida rural a la vida urbana exigió que los alimentos pudieran ser transportados desde el campo a la ciudad y pudieran mantenerse durante periodos de tiempo mayores en buen estado, lo que supuso una revolución en la tecnología y concepto de envase. Durante todos estos años ha sido necesaria una transformación tanto ideológica como tecnológica para adaptar el diseño, tecnología, logística y marketing del envase a las demandas del consumidor cada vez más exigentes velando por su seguridad y el medio ambiente (Catalá and Gavara, 2002a; Risch, 2009; Robertson, 2006). En la actualidad se pueden distinguir tres tipos de envases, según el IFST (Institute of Food Science and Technology), véase Figura 1:  Envase primario: unidad en contacto directo con el alimento. Sus principales funciones son proteger, contener y facilitar el almacenamiento y distribución.  Envase secundario: utilizado generalmente para la protección física del producto. Este es muy útil en cuestiones de logística y marketing ya que facilita el manejo del envase primario durante su almacenamiento y presenta diferente información sobre el producto.  Envase terciario: incorpora el envase secundario al sistema final de transporte, ej. cajas, pallets… Introducción  16   Figura1: Ejemplo de los distintos tipos de envase. La naturaleza de los materiales que se pueden utilizar en estos envases es muy diversa: naturales, mínimamente procesados, totalmente sintéticos, puros…Entre estos se encuentran vidrio, materiales plásticos, celulosas regeneradas, elastómeros, corchos, cauchos, papel, cartón, cerámicas, metales, madera, productos textiles, ceras, resinas de intercambio iónico, siliconas, barnices, tintas de imprenta y adhesivos, véase Figura 2: Figura2: Uso de los distintos materiales en envase alimentario. Fte: World flexible packaging demand by material (2009) Para la selección del material del envase deben considerarse varios criterios (Ashley, et al., 1995):  Coste.  Atracción del consumidor. Envase Primario Envase Secundario Envase Terciario Aluminio Papel y Cartón PP (biorientado y con cloro) PA (polamida) PET (Tereftalato de Polietileno) PE (Polietileno) PVC (Policloruro de vinilo) EVOH (Etil-vinil-alcohol) Películas de celulosa regenerada Introducción  17    Identificación del contenido (etiquetado, impresión…).  Evidencia de apertura.  Desarrollo del envase, incluyendo resistencia mecánica, barrera a los gases, disolventes, olores, humedad, microbios, resistencia térmica e inertidad. Muchos productos, especialmente en el campo de los alimentos, requieren materiales de alta barrera a los gases, como el O2, CO2, H2O, etc., lo que exige el uso de materiales multicapa, ya que ningún material único en capas le proporciona esta exigencia. La mayoría de estos materiales multicapa se construyen por la unión de distintos materiales con adhesivos. El coste es a menudo el factor primario más importante para las industrias en la selección del envase. Otro factor muy importante, es la tecnología del laminado para desarrollar el envase, optimizando el uso de los materiales. 2. INTERACCIONES DEL ENVASE ALIMENTARIO Cuando el alimento es envasado para su distribución o simplemente para ser almacenado, existen unas interacciones entre el entorno, el envase y el alimento que pueden resumirse en:  Permeación: paso de sustancias o gases como dióxido de carbono, oxígeno, vapor de agua, aroma, etc. a través del envase. Introducción  18    Sorción: retención en las paredes del envase de sustancias del alimento o del entorno como puede ser la retención de aromas, radiaciones, etc.  Migración: Transferencia de masa desde el envase al alimento Estas pueden ser desfavorables para la calidad y salubridad del producto, como se muestra en la Figura 3, ya que pueden producir cambios en la calidad del producto como la pérdida de sabor, olores desagradables, cambios de textura y también contaminación (Catalá and Gavara, 2002a). Figura 3: Interacciones entornoenvasealimento. No sólo estas interacciones pueden ser desfavorables para la calidad del producto, sino también puede ser aprovechada positivamente, para aportar compuestos que produzcan un efecto beneficioso en el alimento, como es el caso de los envases activos (active packaging). Se conoce como envase activo al envase capaz de modificar las propiedades del producto que contiene, alargando su vida útil (Bentayeb, et al., 2007; Bentayeb, et al., ENTORNO ENVASE Monómeros Aditivos Residuos Disolventes CO 2 O 2 Humedad Aromas O 2 Humedad Aromas Colorantes Grasas Etc. Radiaciones PERMEACIÓN SORCIÓN MIGRACIÓN MIGRACIÓN Degradación sensorial del alimento. Degradación nutricional del alimento: enranciamiento, pardeamiento, pérdida de textura … Deterioro del envase. ALIMENTO Introducción  19   2009; Ozdemir and Floros, 2004; Rodriguez-Lafuente, et al., 2009; Vermeiren, et al., 1999). 3. ADHESIVOS EN EL ENVASE ALIMENTARIO Actualmente, la mayoría de los envases que están en contacto con alimentos tienen adhesivo en su estructura. Los podemos encontrar de tres formas diferentes, véase Figura 4 (Ashley, et al., 1995):  Formando la estructura del envase por combinación con distintos materiales (generalmente polímeros, papel, cartón o vidrio), y ha esta estructura se le conoce como laminado o multicapa.  Formando la geometría del envase (sellado de cajas, etc.)  En el etiquetado. Estructura del envase Dar geometría envase Etiquetado Figura 4: Utilidad del adhesivo en el envase alimentario La forma más común de encontrar los adhesivos en el envase alimentario es del primer tipo; donde el adhesivo se aplica sobre la superficie total de los materiales o sustratos, uniendo varios y formando los materiales multicapa. Ejemplos de aplicaciones prácticas, son la laminación Introducción  26   concepto termodinámico y se define el coeficiente de partición (K) (Ecuación 1) como la relación entre la concentración en equilibrio del migrante en ambas fases en (mol.m-3) (Catalá and Gavara, 2002a; Tehrany and Desobry, 2004): , 󰇛󰇜󰇛󰇜  (Ecuación 1) Donde K1,2 es el coeficiente de partición, Ceq(1) es la concentración del migrante en la fase1 (envase) y Ceq(2) es la concentración en la fase2 (alimento). Cuando la constante K1,2 (Figura 7) presenta un valor K>1, el elemento tendrá una gran tendencia a permanecer en la fase 1 (envase) y si por el contrario, si el valor es <1 tendrá una tendencia migrar a la fase 2 (alimento) Figura 7: Ejemplo de constantes de partición. La constante de partición depende en gran medida de la solubilidad, es decir la afinidad del migrante con los materiales del envase o con el alimento. Además depende de la temperatura, estructura química y tamaño del compuesto migrante, contenido en grasa y cristalinidad del alimento (Canellas, et al., 2010a; Tehrany and Desobry, 2004). t= 0 min t= ∞ K=1 t= ∞ K<1 Envase Alimento t= ∞ K>1 Envase Alimento Envase Alimento Envase Alimento Introducción  27   5.1.2. DIFUSIÓN La difusión (D) de una molécula en una matriz, es un parámetro cinético que está relacionado con la movilidad de las moléculas en el material. Dicho parámetro está representado por una magnitud de flujo (J) que pasa perpendicularmente a través de un área de distintas secciones de fase homogénea, con un gradiente de concentración de los migrantes. Se basa en un proceso dimensional en estado estacionario, que puede describirse según la primera ley de Fick (Crank and Gupta, 1975), (Ecuación 2):  󰇛󰇜  (Ecuación 2) Donde J es el flujo migrante (mol m-2s-1), D(C) es el coeficiente de difusión (m2s-1), C es la concentración del compuesto migrante (mol m-3) y x es el espesor del material (m). Cuando la concentración varía con el tiempo, el coeficiente de difusión se expresa según la segunda ecuación de Fick (Barnes, et al., 2007a; Catalá and Gavara, 2002a; Dole, et al., 2006; Tehrany and Desobry, 2004), véase Ecuación 3:   󰇛󰇜  (Ecuación 3) Se muestra una figura ilustrativa (Figura 8) para comprender el mecanismo de la difusión. Introducción  28   Figura 8: Ejemplo de coeficientes de difusión. El coeficiente de difusión dependerá en gran medida del tamaño y el peso molecular del compuesto migrante así como su forma y flexibilidad. También dependerán las características del material del envase principalmente tipo de material (papel, polímero…), su cristalinidad, estado vitreo o gomoso, porosidad, orientación, plastificación y formulación (Dole, et al., 2006; Reynier, et al., 2001a; Reynier, et al., 2001b), 5.2. MECANISMOS DE MIGRACIÓN DESDE LOS ADHESIVOS AL ALIMENTO EN EL ENVASE Como ya se ha expuesto anteriormente, los adhesivos se utilizan habitualmente en el envase alimentario. Los encontramos formando una estructura de como mínimo tres capas, conocida como Laminado [sustrato 1-adhesivo-sustrato2]. Hay que descatar que oficialmente al adhesivo no se t= 0 min t= 1 hora t= 5 horas t= 1 hora t= 5 horas Bajo valor de D Alto valor de D Envase Alimento Envase Alimento Envase Alimento Envase Alimento Envase Alimento Introducción  29   le considera una “capa” de material, por lo que esta estructura se identificará como material “bicapa”. Sin embargo, para facilitar la descripción del fenómeno, se considerará el adhesivo como una capa más de la estructura. De esta forma el mecanismo de migración es más complejo, ya que se disponen de más capas. Por tanto el proceso global de migración de un compuesto hacia el alimento se desarrolla en las siguientes etapas (Catalá and Gavara, 2002a), véase Figura 9: I. Difusión del migrante en las áreas amorfas de la matriz polimérica del adhesivo. En este caso, la migración está controlada por el proceso de difusión, que consiste en la transferencia de masa a través de los espacios libres transitorios originados por los movimientos naturales aleatorios de los fragmentos de la matriz polimérica del adhesivo (DA) II. Equilibrio químico entre el adhesivo y los sustratos a los que está adherido. Este puede expresarse de forma simple a través de las concentraciones de cada migrante en las dos fases (constante de partición). (KA,S1, KA,S2) III. Difusión del migrante en las áreas amorfas del sustrato al igual que ocurría en el adhesivo. (DS1, DS2) IV. Etapa de solvatación en la interfase alimento-envase: consiste en una disolución de los migrantes en el alimento, produciéndose el equilibrio químico. (KAL,S2) V. Dispersión en el alimento: el migrante ya disuelto en el alimento difunde en este. La difusión en la matriz polimérica es mayor que en el alimento, por tanto esta etapa no interviene en la práctica ni en el equilibrio ni en la cinética de difusión. Introducción  30   Figura 9: Etapas del proceso de migración de los compuestos del adhesivo al alimento Como se ha mencionado anteriormente (apartado 5.1), el equilibrio y la cinética son los mecanismos que influyen directamente en la migración, y por tanto, estarán relacionados con las características del adhesivo, sustrato, migrante y alimento, como (Catalá and Gavara, 2002a):  La composición química y la estructura de la matriz polimérica del envase. La composición química afecta a la disolución inicialmente del migrante en el sustrato y posteriormente en el alimento (un polímero polar, absorberá preferiblemente las sustancias polares). La estructura del polímero afectará a la densidad del polímero ya que los constituyentes voluminosos y la irregularidad de las cadenas limitará la cristalinidad del material, reduciendo la densidad e incrementando el volumen libre y por tanto incrementando la difusión.  El proceso de fabricación de los adhesivos y los envases lleva consigo diferencias tanto morfológicas como estructurales de la matriz polimérica. ADHESIVOSUSTRATO2 ALIMENTO Difusión Adhesivo Difusión Sustrato2 Dispersión Equilibrio solvatación ENVASE SUSTRATO1 Difusión Sustrato1 Equilibrio K A,S1 K A,S2 D A D S1 D S2 K AL,S2 Introducción  31    La superficie de contacto y el espesor del adhesivo y del sustrato.  La estructura química de las sustancias migrantes relacionada con la compatibilidad del polímero y por lo tanto con la difusión o la concentración, el tamaño, polaridad y la forma de la molécula relacionada con la transferencia de masa.  Condiciones del medio, factores como la temperatura, presión, tiempo, agitación, etc. 6. COMPOSICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LOS ADHESIVOS 6.1. COMPOSICIÓN DE ADHESIVOS Los adhesivos son las sustancias capaces de unir como mínimo dos superficies juntas de manera fuerte y permanente (Petrie, 2000a). Según la RAE, se definen, como las sustancias que interpuestas entre dos superficies son capaces de pegarlas. El mecanismo de unión de los adhesivos se basa en la propiedad de adhesión, que es la atracción molecular entre dos materiales diferentes debido a las fuerzas intermoleculares entre ambos, llamadas fuerzas de Van der Waals. Para que se produzca la adhesión entre el sustrato y el adhesivo, influyen muchos factores como las fuerzas entre estos, aspectos químicos, etc., no sólo en el momento de la adhesión sino también en la transformación durante la vida útil de estos. Introducción  32   La primera vez que se utilizaron adhesivos fue muchos años atrás, cuando los cazadores para mejorar su caza pusieron plumas en sus flechas pegadas con cera de abeja. Hasta hace relativamente poco tiempo la mayoría de los adhesivos provenían de vegetales, animales y sustancias minerales. A partir de 1900 fue cuando los adhesivos poliméricos sintéticos fueron desplazando a estos productos naturales por su fuerte poder de adhesión, a la vez que se consolidaba la industria de los polímeros. Un importante incremento de estos es en los años 1940-1950 con el desarrollo de adhesivos para la industria militar aeronáutica. Hoy en día, los adhesivos son complejas formulaciones de componentes que realizan funciones especializadas. La selección de los componentes que formarán parte del adhesivo, dependerá de las propiedades finales que se requieren para dicho adhesivo, de la aplicación y de los requisitos del procesamiento, así como del objetivo global de costes. Entre los distintos componentes que constituyen la formulación de los adhesivos se pueden destacar:  La base adhesiva, es el componente principal de un adhesivo y le proporciona muchas de las principales características como mojabilidad, propiedades de curado, la fuerza y la resistencia al medio ambiente. Es a menudo por peso, el componente mayoritario en la formulación y es el que le da el nombre al adhesivo.  El endurecedor o agente de curado es una sustancia añadida con el fin de promover la reacción de polimerización y formar parte en ella por la combinación química con el polímero base.  El catalizador es una sustancia que, añadida al adhesivo, promueve la reacción de polimerización pero sin formar parte de esta, es decir permanecerá sin cambios durante la reacción. Los ácidos, bases, sales, Introducción  33   compuestos de azufre y los peróxidos son ejemplos de catalizadores usados en la industria de adhesivos.  El acelerador, inhibidor, o retardador se incorporan a veces en la formulación del adhesivo para controlar la velocidad de curado (acelerándola o decelerándola). Estos compuestos son importantes para el curado, así como para el tiempo de almacenamiento del adhesivo y la vida útil de este.  Los disolventes son necesarios para dispersar el adhesivo a una consistencia que sea más fácil de aplicar sobre el sustrato, como con brocha o pulverización. También se utilizan para ayudar en la formulación del adhesivo mediante la reducción de la viscosidad del polímero base, de modo que la adición de otros componentes proporcione una mezcla uniforme. Estos deben evaporarse por completo antes de curar el adhesivo para evitar la formación de burbujas.  Las cargas son sustancias que suelen tener algunas propiedades adhesivas y se añaden al adhesivo para reducir la concentración de otro componente del adhesivo y por tanto reducir el coste de la formulación general.  Los polvos de piedra son sustancias no adhesivas que proporcionan en el adhesivo mejoras relacionadas con las propiedades de trabajo como expansión térmica, viscosidad, resistencia termal…Entre los polvos más utilizados estarían la sílica, alúmina, oxido de titanio…  El respaldo suele ser una tela fina, de tela o de papel utilizados para apoyar la composición del adhesivo semicurado para proporcionar una cinta o la película. El respaldo puede ser utilizado para fines funcionales o decorativos. Introducción  34    Plastificantes son sustancias que forman parte de la formulación del adhesivo para proporcionarle flexibilidad y elongación al adhesivo así como, reducir la viscosidad tras la fusión en los adhesivos termofusibles. Estos plastificantes actúan separando las cadenas del polímero y así, hacen posible su deformación.  Taquificantes son promotores de adhesión que se añaden para aumentar la adhesión de los sustratos favoreciendo la resistencia al desgarro y disminuyendo la resistencia al corte.  Espesantes son sustancias que mantienen un espesor del adhesivo razonable a través del ajuste de la viscosidad.  Antioxidantes y estabilizantes son las sustancias que se añaden al adhesivo para retrasar el envejecimiento de este y por tanto alargar su vida útil.  Humectantes y tensioactivos se añaden para estabilizar la emulsión de tantos componentes que forman el adhesivo. Esta descripción de los distintos aditivos utilizados en la formulación de adhesivos es muy genérica y breve, ya que hay miles de aditivos que se pueden utilizar en sistemas adhesivos. 6.2. CLASIFICACIÓN DE ADHESIVOS Los adhesivos se clasifican en la industria (Petrie, 2000b): Según los materiales de los que están fabricados  Sintéticos: Fabricados con materiales sintéticos como por ejemplo polímeros. Introducción  35    Naturales: Fabricados por materiales derivados de productos animales y agrícolas. Un ejemplo de estos serían los adhesivos de almidón, objeto de estudio, que son adhesivos de origen agrícola derivados principalmente de la planta de yuca. El almidón se calienta, por lo general en disoluciones alcalinas, y después en frio se prepara la dispersión. Suelen ser solubles en agua. Estos se suelen aplicar para sustratos porosos (madera, papel y cartón) que se unen por la pérdida de agua. La función que desempeñan  Estructurales: Capaces de soportar grandes fuerzas sin deformarse  No estructurales: Soportan pequeñas cargas y se degradan en periodos cortos de tiempo por exposición a condiciones ambientales como temperaturas adversas, compuestos químicos, etc. Según la composición química (Petrie, 2000b; Ureta, 1996)  Termoendurecibles: Son los adhesivos que se curan mediante una reacción química irreversible llamada reticulada. En esta reacción se produce un entrecruzamiento por polimerización de dos polímeros lineales dando lugar a una estructura química reticulada rígida, véase Figura 10. Figura 10: Estructura reticulada tras el curado de los adhesivos carbonos oxígeno hidrógenos Introducción  42   7.2. ADHESIVOS DE ACETATO DE POLIVINILO. Estos adhesivos termoplásticos son los que comúnmente se conocen como “cola blanca” y están formados por la base adhesiva de polímero acetato de polivinilo (PVA). Junto a la base, también se utilizan habitualmente cargas, plastificantes y pigmentos dependiendo de sus aplicaciones. Se encuentran disponibles en forma de disoluciones, emulsiones de agua o como adhesivos termofusibles. Se utilizan para la pegar materiales porosos en especial la madera y papel cuando se encuentra en forma de emulsión y vidrio, cerámica y plásticos cuando se encuentra en forma de disolución. Se emplea en la industria general de embalajes para el pegado de etiquetas, precintos, etc. diluyéndola con agua hasta lograr la viscosidad deseada. Su proceso de curado es mediante la evaporación del disolvente o del agua cuando se encuentra en forma de disolución o emulsión y en el caso de adhesivos termofusibles por enfriamiento y presión tras el calentamiento previo. Es el tipo de adhesivo más versátil en términos de formulación y uso. Posee un excelente poder adhesivo presentando gran resistencia a la fuerzas de tracción. Muestra una gran resistencia al aceite, grasa y ácidos y menor resistencia al agua. Buena extensibilidad y por tanto fácil manejo en su aplicación. (Petrie, 2000b; Ureta, 1996) Introducción  43   7.3. ADHESIVOS DE POLIVINILALCOHOL Este adhesivo está formado por una base adhesiva del polímero polivinilalcohol (PVOH). A diferencia de muchos polímeros vinílicos, el PVOH no se prepara por la polimerización del correspondiente monómero, dado que el alcohol vinílico es inestable. El PVOH se prepara por alcohólisis (se emplean también los términos menos exactos hidrólisis y saponificación) parcial o total de acetato de polivinilo para eliminar los grupos acetato. Véase figura 13. Figura 13: Formación de polímero de Polivinilalcohol (PVOH) Para efectuar la alcohólisis puede utilizarse etanol o metanol, con un ácido o una base como catalizador. La hidrólisis alcalina es mucho más rápida. Son adhesivos termoplásticos solubles en agua y se utilizan habitualmente para la unión de materiales porosos como papel, catón y tejido, tras su proceso de curado por la evaporación del agua. Entre las propiedades más importantes, se encuentra la pegajosidad en húmedo que los hacen ser muy versátiles y muy útiles aportando una gran facilidad de manejo en fábrica, limpieza y coste razonable. Tiene una gran resistencia a las grasas y los aceites y justa al agua, pero es suficiente para la mayoría de aplicaciones en el interior. Tiene alta resistencia y flexibilidad, así como alta Polivinilacetato Polivinilalcohol Metanol NaOH Introducción  44   propiedades de barrera para el oxígeno y los aromas por consiguiente se utilizan habitualmente para envase alimentario. (Petrie, 2000b) 7.4. ADHESIVOS ACRÍLICOS Los adhesivos acrílicos están formados por una base adhesiva del polímero formado por polimerización de monómeros de acrílico como el metacrilato de metilo. Están disponibles como disoluciones en base acuosa o disolventes, y también como emulsiones donde el polímero está modificado con agentes tensoactivos, de humedad, de liberación de aire y espuma y otros ingredientes que mejoran su desempeño y su habilidad de recubrimiento. Presentan buenas propiedades de adhesión, largo tiempo de vida útil y estabilidad mecánica. Una resistencia media al agua, y muy buena a aceites, sin embargo, una poca resistencia a disolventes orgánicos y al calor. Se utilizan habitualmente para pegar vidrio, metales, papel, textil y plásticos. (Petrie, 2000b) Una vez detallado el uso el de los adhesivos (tipos y componentes que los forman) en el envase alimentario, así como las interacciones de este con el alimento, haciendo hincapié, en los procesos que rigen la migración y la importancia de esta para cumplir unas determinadas legislaciones. Se procede a la segunda parte de la introducción la cual se centra en la procedencia de las sustancias sensoriales activas dentro del envase, así como los análisis sensoriales necesarios para la determinación de estas. Introducción  45   8. ORIGEN DE SUSTANCIAS SENSORIALMENTE ACTIVAS Las posibles fuentes de generación de sustancias sensorialmente activas susceptibles de migrar al alimento pueden ser (Catalá and Gavara, 2002b): I. Materias primas utilizadas para la fabricación de envases como monómeros, polímeros de bajo peso molecular, restos de agentes de polimerización (catalizadores, antioxidantes, estabilizantes…), aditivos utilizados para la formulación del plástico (plastificantes, lubricantes…), impurezas y aditivos utilizados para el procesamiento de envases de papel, cartón, etc. II. Productos de degradación formados por oxidación de componentes orgánicos de los materiales plásticos como aldehídos, cetonas, alcoholes…por termo-oxidación o por foto-oxidación (Hashizume, et al., 2007). La termo-oxidación puede producirse durante el proceso de transformación de los materiales, tratamiento del producto envasado o en el almacenamiento en condiciones inadecuadas (Chen, et al., 2006; Jacobsson, et al., 2004; Lozano, et al., 2007; Raj, et al., 1990; Spitzer and Buettner, 2010). III. Disolventes orgánicos como tolueno, xileno, cetonas….e impurezas de dichos disolventes, utilizados para la aplicación de tintas de impresión, adhesivos de laminación, barnices, recubrimientos, lacas. IV. Promociones que se utilizan como herramientas de marketing como cupones, figuritas, etiquetas…los cuales se colocan en el interior de envases en contacto directo con los alimentos o separados con Introducción  46   materiales utilizados como barreras funcionales. Estos suelen contener metales pesados, disolventes para las pinturas, barnices o adhesivos. V. Productos de limpieza por la contaminación durante el almacenamiento de los mismos en depósitos en que se utilizan detergentes o limpiadores de ambiente perfumados. VI. Compuestos halogenados generados por la acción de microorganismos en maderas tratadas con desinfectantes halo-fenólicos. A continuación se presentan algunos ejemplos (Tabla 2) de trabajos encontrados en bibliografía sobre la migración de compuestos odorantes generados en las distintas fuentes antes mencionadas, produciendo un olor no deseado en el alimento envasado. Tabla2: Ejemplos de migraciones de compuestos odorantes presentes en los envases Ejemplos Migración de un monómero de estireno del envase de plástico a dulce de leche envasado en el mismo (Catalá and Gavara, 2002b). Migración de compuestos odorantes de un elastómero utilizado en los cierres de botellas de cerveza (Linssen, et al., 1998). Migración de compuestos odorantes de un plástico tras la termooxidación, utilizados para envasar carne y vegetales (Kontominas, et al., 2006) Migración de compuestos odorantes de diferentes tipos de plásticos tras la foto-oxidación (por radicación) para envase alimentario (Deschenes, et al., 1995; Goulas, et al., 2004; Welle, et al., 2002). Migración de disolventes de las tinta de impresión utilizados en el envase para conservar chocolate o a bolsas de té (Catalá and Gavara, 2002b). Migración de diclorofenol durante el almacenamiento de un vino en un depósito que había sido previamente desinfectado con dicho compuesto (Catalá and Gavara, 2002b). En la mayoría de casos la migración produce alteraciones en el olor de los alimentos envasados, pero esta migración, se encuentra en concentraciones por debajo de los límites considerados de riesgo toxicológico. Y en muchas de las ocasiones esta concentración se encuentra también por debajo de los límites de detección instrumentales, lo cual supone una dificultad para su análisis. Introducción  47   Esto significa que el único camino para determinar los compuestos responsables de un olor, es utilizar técnicas sensoriales, estudios que únicamente pueden ser llevados a cabo por personas capaces de detectarlos de diferenciarlos. 9. ANÁLISIS SENSORIALES PARA SUSTANCIAS SENSORIALMENTE ACTIVAS. El análisis sensorial es una ciencia multidisciplinaria en la que se analizan e interpretan las reacciones características percibidas por el olfato, la vista, el gusto y el tacto (Catalá and Gavara, 2002b). Esta técnica es muy utilizada en las industrias del envase y de alimentos, permitiendo el control de productos finales, así como la aceptabilidad de nuevos productos. La utilización de análisis sensoriales para la detección de contaminantes capaces de alterar el olor de los alimentos es muy importante, ya que permite discernir con el olfato las sustancias que alteran el olor del alimento natural, aunque estén a muy bajas concentraciones. Esta capacidad de percibir estas especies químicas en los alimentos depende de la estructura química, concentración, tipo de alimento y sensibilidad del sujeto (Catalá and Gavara, 2002b). Los ensayos que se realizan habitualmente para dicho análisis sensorial están recogidos en la norma ISO 6658 (Rock, et al., 2008):  Ensayos de diferenciación: permiten determinar si existe diferencia sensorial entre productos. Introducción  48    Ensayos de escalas y categorías: permiten estimar el orden o magnitud de las diferencias.  Ensayos descriptivos: permiten identificar las propiedades sensoriales de una muestra.  Ensayos de sensibilidad: permiten seleccionar y entrenar evaluadores. Para estudiar los problemas causados por la migración de componentes del envase al alimento, son de gran utilidad los ensayos de diferenciación, entre los que se encuentran:  Comparación por pares: Las muestras se presentan en pares con el fin de compararlas sobre la base de criterios bien definidos.  Ensayo triangular: Presentación simultanea de tres muestras codificadas, dos de las cuales son idénticas y el sujeto debe indicar la muestra diferente.  Ensayo dúo-trío: se presenta una muestra control en primer término y enseguida dos muestras, una de las cuales es igual a la muestra de control que el evaluador debe identificar.  Ensayo A-no A: ensayo en el cual una serie de muestras, que pueden ser A o diferente de A, se presentan a cada evaluador, quien debe indicar si las muestras son A o diferentes de A. Su utilización conlleva como inconveniente la necesidad de emplear un panel de catadores entrenados, constituido por un número considerable de individuos, lo que supone un elevado coste. Por ello, en la actualidad, todos los esfuerzos están relacionados con el desarrollo de instrumentos, que puedan realizar estos análisis como si fuera un catador, pero de manera rápida y objetiva. Se trata de las denominadas “narices electrónicas” (Rock, et al., 2008). Las cuales intentan imitar las Introducción  49   funciones olfativas de los catadores. Consiste en la absorción y desorción de sustancias volátiles en la superficie de sensores que ocasionan cambios en las resistencias eléctricas, al interactuar con los compuestos químicos, dependiendo de la polaridad, tamaño y forma de las moléculas, produciendo perfiles característicos o “mapas de aroma”. Estos se comparan con patrones conocidos. Por tanto realiza un análisis global del aroma aportando información básicamente cualitativa: diferencias y similitudes entre muestras, de manera similar a un panel sensorial, pero no identifica los compuestos no proporciona un resultado en términos absolutos, sino la respuesta de un conjunto de sensores de diferente naturaleza, conectados en serie. Tampoco identifica el olor percibido. Estos tipos de ensayos sensoriales no son válidos para detectar e identificar sustancias individuales, sino que se obtiene una percepción global de la presencia o ausencia del olor en el alimento. Por tanto es necesaria otra herramienta. De ahí la existencia y empleo extendido del análisis instrumental, cromatografía de gases, dado que los compuestos que constituyen el aroma son moléculas volátiles, acoplado a olfatometría, que se explicará en el siguiente apartado. 10. ANÁLISIS DE OLORES MEDIANTE CROMATOGRÍA DE GASES-OLFATOMETRÍA Como ya se ha mencionado anteriormente, los seres humanos no somos capaces de distinguir individualidades que conforman el aroma, sino que percibimos un único estimulo global. Si se busca encontrar los compuestos específicos responsables del olor es necesario llevar a cabo un Introducción  50   análisis cromatográfico que permita la separación individual de compuestos. Pero el perfil cromatográfico obtenido mediante un detector químico convencional, no coincide con el perfil aromático de un producto, ya que existen numerosos compuestos volátiles que no presentan olor pero al encontrarse en concentraciones elevadas, proporcionan picos cromatográficos importantes. Por el contrario, hay odorantes de los que no se consigue señal instrumental porque se encuentran en concentraciones inferiores al límite de detección del detector pero, sin embargo sus umbrales de percepción son tan bajos que contribuyen al aroma en gran medida. Por tanto es necesario acoplar a la cromatografía de gases la detección olfatométrica (GC-O) 10.1. CROMATOGRAFÍA DE GASESOLFATOMETRÍA Esta técnica contribuyó a una nueva etapa y supuso una revolución en el análisis del aroma: poder asignar descriptores olfativos a los picos cromatográficos, y más aún, detectar con la nariz olores originados por compuestos que los detectores instrumentales no conseguían registrar. Fue desarrollada por Fuller y col (Fuller, et al., 1964), y en general consiste en evaluar con la nariz humana las cualidades aromáticas de los compuestos separados que eluyen de la columna cromatográfica, a la vez que el detector instrumental instalado proporciona un cromatograma. Por tanto, se pueden asignar olores a los picos y/o determinarse a qué tiempos de retención se detectan dichos olores. Por tanto la detección olfatométrica e instrumental son simultaneas, lo que permite relacionar la información sensorial con la información química. Introducción  51   En el análisis por GC-O es necesario introducir un extracto aromático representativo a través del puerto de inyección. Tras la separación de los componentes de la mezcla en la columna capilar cromatográfica, a la salida de la misma se divide el flujo, una parte del efluente se dirige al detector químico mientras que la otra va hacia el puerto de olfatométrico donde se sitúa el analista, tal y como se muestra en la Figura 14. Figura14: Esquema del análisis cromatográfico-olfatométrico En los primeros estudios se olía directamente el efluente que salía directamente del cromatógrafo. Pero este era un gas seco y muy caliente lo que provocaba la deshidratación nasal. En 1971 se diseñó el primer cromatógrafo de gases con detector olfatométrico “real”, en el que se Detector Puertode olfacción EXTRACTO AROMÁTICO Introducción  58   parecido posible a la fracción volátil que inhalamos. Estas técnicas se caracterizan por una mínima manipulación de las muestras y proporcionan cromatogramas mucho más limpios, al no incluir el extracto en la matriz. Se dividen en dos grupos: las técnicas estáticas (Landy, et al., 2004) y dinámicas (Campo, et al., 2005; Deschenes, et al., 1995; Linssen, et al., 1998). En las primeras, una vez alcanzado el equilibrio entre la matriz y la fase gaseosa, una porción del espacio de cabeza se introduce directamente en el puerto de inyección, lo que hace que sea una técnica muy sencilla. Tiene una baja sensibilidad para los compuestos semivolátiles, porque no existe etapa de concentración de los compuestos, y por tanto es insuficiente para los compuestos con una menor concentración. Pero por el contrario, es muy adecuada para separar los compuestos mayoritarios del aroma, y por tanto resulta de un gran interés (Rock, et al., 2008). En las técnicas dinámicas, no se deja alcanzar dicho equilibrio, sino que el espacio de cabeza es constantemente desplazado (purgado) de forma continua por un gas inerte hacia una trampa donde son retenidos los compuestos. Las trampas son materiales adsorbentes, como polímeros porosos o carbón activo. Posteriormente la trampa se desorbe térmicamente e introduce todos los compuestos concentrados en la columna cromatográfica (GC-O). Técnicas de extracción en fase sólida. En los últimos años las técnicas de extracción en fase sólida han sido de las más utilizadas para el análisis de compuestos aromáticos de los alimentos, gracias a su rapidez, sensibilidad y a que, emplean cantidades de disolventes mucho menores. De todas las existentes cabe distinguir la extracción en fase sólida (SPE)(Culleré, et al., 2009; Escudero, et al., 2007; Introducción  59   San-Juan, et al., 2010) y la microextracción en fase sólida (SPME) (Culleré, et al., 2009; Ezquerro, et al., 2002; Kataoka, et al., 2000; Kontominas, et al., 2006). La SPE consiste en que en sólido absorbente, en forma de cartuchos o discos, actúa como fase estacionaria (materiales de sílice o copolímeros de estireno-divinilbenzeno) a través de la cual tras un breve acondicionamiento, se hace pasar la muestra. En función de la fase estacionaria y del acondicionamiento puede tener lugar un proceso de adsorción, reparto, intercambio iónico, etc. En el análisis de aromas los mecanismos preferentes son adsorción y reparto. Tras esto, es necesario un proceso posterior de elución mediante disolventes orgánicos, con el objetivo de recuperar los analitos. El rendimiento de esta técnica depende del tipo de fase estacionaria y de los disolventes utilizados. La SPME (Pawliszyn, 1997; Pawliszyn, 2009; Zhang, et al., 1994) permite la extracción y concentración simultaneas de los compuestos. En este caso la fase estacionaria es un capilar de sílice fundida de pequeñas dimensiones que actúa como soporte y de una fase estacionaria polimérica, ligada a la sílice. Posteriormente se lleva a cabo la desorción térmica en el portal de inyección del cromatógrafo de gases. Esta técnica, se explicará ampliamente en el capítulo 1. 11. PROYECTO MIGRESIVES Como se ha descrito anteriormente, los adhesivos utilizados en el envase alimentario no están regulados con un reglamento específico. Por tanto, en el caso de que se aplique la legislación de plásticos como Introducción  60   aproximación, cientos de compuestos contenidos en los adhesivos, que no están en los plásticos, quedan fuera de la misma. Por ello se llevo a cabo el Proyecto MIGRESIVES, cuyos principales objetivos eran:  Proporcionar una evaluación científica del riesgo de los adhesivos en el envase alimentario para una futura legislación europea.  Suministrar una herramienta para las industrias fabricantes de adhesivos que prediga la migración de los compuestos del adhesivo al alimento, permitiéndoles asegurar que los adhesivos que están fabricando, no tienen ningún riesgo sobre la salud del consumidor. En este proyecto europeo, de 3 años duración, han trabajado 7 centros tecnológicos europeos, entre el que se encuentra el grupo GUIA de la Universidad de Zaragoza liderado por la Dra. Cristina Nerín, 7 PYMES europeas, 6 asociaciones nacionales de adhesivos y la asociación europea de adhesivos FEICA. Este proyecto estaba dividido en 8 paquetes de trabajo. WP1.Clasificación de adhesivos comúnmente utilizados en envase alimentario, así como los sustratos para formar el envase multicapa. WP2.Estudios experimentales: Que se distribuyeron en dos grandes grupos; 2.1 Identificación de compuestos en los adhesivos. 2.2 Estudio de la partición y difusión en el adhesivo y los sustratos, que son los mecanismos que rigen la migración (explicadas en el apartado 5.1). WP3.Desarrollo de un modelo matemático de predicción de la migración. WP4.Estudios de migración de al menos 40 muestras representativas del mercado europeo. Introducción  61   WP5.Bioensayos de citotoxicidad y genotoxicidad. WP6.Transferencia de conocimientos desarrollados a la empresa. WP7.Instrucciones del uso de la herramienta de predicción de la migración a la empresa. WP8.Trasferencia de resultados a las autoridades y sectores de interés. De los distintos paquetes de trabajo, el más costoso era desarrollar el modelo predictivo de migración, que estaba basado en modelos matemáticos de migración de plásticos ya existentes (Begley, et al., 2005; Gnanasekharan and Floros, 1997; Lau and Wong, 2000). Para poder desarrollar este modelo, fue necesario un intenso y laborioso trabajo experimental, desarrollado en su mayoría por el grupo GUIA, que consistía en el desarrollo de distintas técnicas analíticas para determinar la composición inicial de los adhesivos, y las concentraciones de los compuestos migrantes en los distintos sustratos, para posteriormente calcular las constantes que influyen en la migración (partición y difusión). Tras el diseño matemático, se realizó la validación del mismo, mediante ensayos de migración con 40 muestras de mercado que contenían 8 tipos diferentes de adhesivos, realizado en su totalidad por el grupo GUIA. La validación, se realizó comparando los datos predichos por el modelo matemático y los datos reales de migración obtenidos experimentalmente.  SECCIÓN II OBJETIVOS Objetivos  65   OBJETIVOS Los objetivos de esta tesis están orientados al estudio de los compuestos presentes en varios tipos de adhesivos termoplásticos y un adhesivo de almidón, todos ellos utilizados en el envase alimentario multicapa fabricado con diferentes sustratos de cartón. También se va a estudiar su posible migración y los parámetros que dependen de esta. En conjunto se han establecido los siguientes objetivos:  Identificación de los principales compuestos volátiles en los adhesivos termoplásticos.  Desarrollo de métodos analíticos para la cuantificación en diferentes matrices (adhesivos, sustratos y simulantes) de los compuestos volátiles identificados.  Determinación de los coeficientes de partición y difusión de los compuestos volátiles identificados en los adhesivos termofusibles en los laminados multicapa elaborados en el laboratorio.  Determinación de la migración experimental y teórica de los compuestos volátiles identificados en 30 muestras de mercado elaboradas con estos adhesivos termoplásticos. Y además validar la predicción de la migración teórica.  Desarrollar un método UPLC-MS/QTOF para identificar y cuantificar los compuestos no volátiles que migran de cuatro laminados fabricados con los adhesivos termofusibles.  Identificación de los compuestos odorantes presentes en cinco tipos de adhesivos termoplásticos diferentes.  Determinar la migración de los compuestos odorantes de doce laminados formados con los adhesivos termoplásticos. SECCIÓN II EXPERIMENTAL   Capítulo 1  75   IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS, DETERMINACIÓN DE SU CONCENTRACIÓN INICIAL, COEFICIENTES DE PARTICION Y DIFUSIÓN EN DOS ADHESIVOS TERMOFUSIBLES. 1. INTRODUCCIÓN DEL CAPÍTULO El trabajo realizado en este capítulo está enmarcado dentro del proyecto europeo MIGRESIVES, cuyo objetivo era crear la base científica necesaria para poder proponer una legislación europea que regule el uso de adhesivos en envases alimentarios con la máxima seguridad alimentaria, así como diseñar un modelo teórico de predicción de la migración. Dentro de este proyecto, como se ha mencionado, existen distintos paquetes de trabajo. El estudio realizado en este capítulo correspondería al WP 2 y 3, que consistía en la identificación de componentes en los adhesivos, así como la determinación de sus constantes de partición y difusión, para proporcionar los datos científicos para implementar modelos teóricos de predicción de migración. Se ha trabajado con dos adhesivos termofusibles, uno basado en acetato de vinilo y etileno (EVA) y otro en poli-alfa-olefina amorfa (APAO). Los adhesivos se estudiaron de forma individual, para la identificación de compuestos volátiles. También junto con los soportes sobre los que se aplican para formar laminados, que se emplean en Capítulo 1  76   materiales multicapa en envases alimentarios, para calcular sus concentraciones iniciales, así como sus constantes de partición y difusión. El objetivo principal del trabajo fue determinar la composición de dichos adhesivos y el potencial de migración de los compuestos detectados en ellos, estimado a partir de sus coeficientes de partición y difusión. Este trabajo estaba centrado especialmente en el estudio de compuestos volátiles presentes en los adhesivos, ya que estos compuestos son los que difunden más rápidamente a través del envase y logran más fácilmente alcanzar el alimento (Begley, et al., 2005; Canellas, et al., 2010a; Dole, et al., 2006; Gnanasekharan and Floros, 1997; Lau and Wong, 2000; Lopez, et al., 2008; Nerín and Asensio, 2004; Tehrany and Desobry, 2004). Actualmente la técnica más utilizada para la identificación de compuestos volátiles es la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (Hoffmann and Stroobant, 2007; Scott, 2003a; Scott, 2003b). Por otro lado, para trabajar con muestras complejas, los métodos basados en el análisis directo de espacio de cabeza de la muestra permiten una rápida identificación de los compuestos volátiles pero proporcionan baja sensibilidad. Sin embargo, el uso de la microextración en fase sólida (SPME) mejora mucho la sensibilidad (Kataoka, et al., 2000; Nerin, et al., 2009b; Pawliszyn, 1997; Pawliszyn, 2009; Zhang, et al., 1994). Por estos motivos se ha utilizado esta técnica en muchas ocasiones para la identificación de compuestos volátiles (Félix, et al., 2011; Felix, et al., 2008; Nerin, et al., 2009a). Para ello, se seleccionó como técnica de estudio la microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas (HS-SPME-GC-MS). Sin embargo, para la determinación de su concentración inicial y de los coeficientes de partición y difusión, se utilizó la extracción líquida, debido a la complejidad Capítulo 1  77   inherente de cuantificar los componentes en las muestras sólidas (Ezquerro, et al., 2003a; Ezquerro, et al., 2003b; Ezquerro, et al., 2003c). (LE-GC-MS) El resumen del trabajo desarrollado en este capítulo es el siguiente: I. Identificación de los compuestos presentes en los adhesivos. Para ello, se llevó a cabo una optimización de los parámetros más importantes en la HS-SPME-GC-MS. Seleccionando la fibra más adecuada tiempo de adsorción, temperatura de adsorción y tiempo de desorción. Para ello se utilizó el programa de diseño experimental Modde v.6 software (Umetrics AB). Los compuestos identificados se clasificaron según su toxicidad con el software Toxtree v1.51 (Ideaconsult Ltd.) basado en las Reglas de Cramer. II. La determinación de la concentración inicial de los compuestos en los adhesivos Cp0. Se realizaron tres extracciones con diclorometano (procedimiento previamente optimizado) y se analizó por inyección directa en GC-MS. La cuantificación se realizó por calibración externa. III. El estudio de los coeficientes de partición de los compuestos en los laminados, mediante la determinación de las concentraciones de equilibrio en los correspondientes soportes y adhesivos utilizados en estos laminados. IV. El estudio de la difusión de los compuestos en los correspondientes soportes, mediante la determinación de las concentraciones en los soportes, usados en los laminados. Tanto los ensayos de partición como los de difusión se realizaron según el método de Moisan. Los ensayos se analizaron por extracción Capítulo 1  78   líquida (LE) con diclorometano e inyección directa por GC-MS y con calibración externa. La Figura 1.1 muestra un esquema del desarrollo del trabajo realizado en este capítulo. Figura 1.1: Esquema de trabajo realizado en el capítulo 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. MATERIALES 2.1.1. REACTIVOS 2,6-di-tert-butil-1,4-benzoquinona (CAS 719-22-2); 2,6-di-tert-butil4-metilfenol (CAS 128-37-0); hexadecano (CAS 544-76-3); eicosano (CAS 112-95-8); antraceno 9,10-dihidro (CAS 613-31-0); reteno (CAS 483-65-8); octadecano (CAS 593-45-3); docosano (CAS 629-97-0); tetracosano (CAS Identificación de compuestos volátiles HS-SPME-GC-MS 2 adhesivos Termofusibles (EVA y APAO) Clasificación de compuestos por toxicidad Reglas Cramer Determinación de constantes partición Determinación de constantes difusión LE-GC-MS Determinación de concentración inicial LE-GC-MS LE-GC-MS 4 tipos de laminados con adhesivo EVA y APAO 2 tipos de laminados con adhesivo EVA y sus soportes Soportes de los 2 tipos de laminados con adhesivo EVA Optimización LE (disolvente y número de extracciones) Optimización HS-SPME (fibra, temperatura y tiempo extracción, tiempo desorción) Capítulo 1  79   646-31-1); 4-tert-butilfenol (CAS: 98-54-4) suministrados por SigmaAldrich Química S.A (Madrid, España). Diclorometano, metanol y hexano fueron suministrados por Scharlau Chemie S.A (Sentmenat, España), todos ellos con calidad HPLC. Se utilizó:  Una disolución (Disolución A) de 4-tert-butilfenol de 1000 μg/g en diclorometano como estándar interno. 2.1.2. FIBRAS DE SPME Se emplearon: Fibra de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 μm de espesor, fibra de poliacrilato (PA) de 85 μm de espesor, fibra de Divinilbenzeno / carboxen / polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) de 50/30 µm, fibra de polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB) de 65 μm de espesor. Todas ellas suministradas por Supelco (Bellefonte, EE.UU) 2.1.3. MUESTRAS DE ADHESIVOS Y LAMINADOS Se estudiaron dos adhesivos termofusibles “hotmelt” suministrados por la misma empresa fabricante de adhesivos. El primer adhesivo llamado T_01, se trataba de un adhesivo termofusible convencional de base EVA (copolímero acetato de vinilo y etileno), véase Figura 1.2, y el otro, T_02, se trataba de un adhesivo termofusible no reactivo que contenía de base un polímero poliolefínico y rico en propeno, véase Figura 1.3. Capítulo 1  80   Ambos adhesivos contenían otras sustancias como taquificantes, antioxidantes…pero no se disponía de más información sobre su formulación, por razones de confidencialidad de la empresa. Figura 1.2: Adhesivo T_01 Figura 1.3: Adhesivo T_02 Ambos adhesivos se estudiaron individualmente (para la identificación de sus compuestos), así como formando el laminado cuya estructura era [sustrato1-adhesivo-sustrato2], para el resto de estudios. Este laminado era la forma habitual de encontrarlos en el envase alimentario para darle forma geométrica de cajas o estuches. El adhesivo se aplica normalmente sobre cartón mediante inyectores, y este puede estar cubierto con polipropileno, polietileno o acetato de celulosa, en el exterior del envase, en el interior o en ambos lados. Los laminados se prepararon en el laboratorio, con las instrucciones suministradas por la empresa. Estos estaban constituidos por dos sustratos del mismo material unidos por un determinado gramaje de adhesivo. Los sustratos utilizados para preparar los laminados fueron:  Cartón (C) de 380 μm de espesor  Cartón con una lámina plástica de polipropileno (CPP) de 30 μm de espesor, siendo el total del laminado de 410 μm de espesor Capítulo 1  81   Para elaborar los laminados en el laboratorio, el primer paso fue calentar el adhesivo, para fundirlo, entre una temperatura de 160-180ºC. Una vez que el adhesivo estaba fundido, se aplicaba sobre el sustrato previamente cortado con unas dimensiones de 1x1 dm (Figura 1.4) y seguidamente se extendía sobre el sustrato dejando una capa uniforme (Figura 1.5). Para ello, se empleaba una pieza de metal con tres orificios para añadir el adhesivo, cuya base tenía un desnivel que permitía depositar una capa uniforme de adhesivo de aproximadamente 100 μm. Posteriormente se colocaba el otro sustrato encima para formar el laminado (Figura 1.6). Tras esta etapa, se ponía peso encima para que se pegaran adecuadamente los sustratos y se almacenaba a 23 ºC. La cantidad de adhesivo en cada laminado se controlaba por pesada una vez seco y correspondía aproximadamente a 31,2±2,5 gadhesivo/m2laminado Figura1.4: Aplicación del adhesivo fundido Figura1.5: Extensión del adhesivo con capa uniforme Figura1.6: Formación del laminado Las láminas fabricadas fueron las siguientes:  Laminado 1 [C-T_01-C]  Laminado 2 [CPP-T_01-CPP]  Laminado 3 [C-T_02-C]  Laminado 4 [CPP-T_02-CPP] Capítulo 1  82   2.2. INSTRUMENTAL 2.2.1. CROMATÓGRAFÍA DE GASES ESPECTROMETRÍA DE MASAS Para el análisis de la muestras se trabajó en un inyector automático CTC Combipal suministrado por Agilent Technologies (Madrid, España). El sistema cromatográfico de gases era un 6890 Series conectado a un detector selectivo de masas, 5973 Series. La separación cromatográfica se llevó a cabo en una columna DB-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm) de Agilent Technologies (Madrid, España). El resto de parámetros utilizados, se muestran en la siguiente Tabla 1.1 Tabla 1.1: Parámetros utilizados para los análisis por extracción por HS-SPME y LE acoplada a GG-MS Instrumentación CombiPal HS-SPME (Para identificación) Tiempo de preincubación (min) 2 Tiempo extracción (min) 25 Temperatura de extracción (ºC) 80 Tiempo de desorción (min) 1 Temperatura de desorción 250 CombiPal inyección directa (Para Cp0, constantes partición y difusión) Volumen inyectado (µL) 1 Inyector 250ºC Split (1:20) Condiciones GC Flujo de Helio (mL/min) 1 Inyector 250ºC Splitless (2min) Rampa temperatura del horno 40ºC (2min) 15 °C/min 165ºC 10 °C/min 300ºC (2min) Condiciones masas (EI) Rango de masas (m/z) 45-450 Temperatura fuente (ºC) 230 Temperatura cuadrupolo (ºC) 150 Energía electrones (eV) 70 Capítulo 1  83   2.3. OPTIMIZACIÓN DE LA CONDICIONES DE HSSPME 2.3.1. VARIABLES A ESTUDIO Las variables más importantes que influyen en el proceso de microextración en fase sólida por espacio de cabeza para muestras sólidas son las siguientes (Kataoka, et al., 2000; Nerin, et al., 2009a; Nerin, et al., 2009b; Pawliszyn, 1997; Pawliszyn, 2009; Zhang, et al., 1994):  Tipo de fibra  Temperatura de extracción (Text)  Tiempo de extracción (text)  Tiempo de desorción (tdes) Tipo de fibra La eficiencia del proceso de extracción depende de la constante de distribución Kfa entre la fibra y el analito, y está determinada por las propiedades del recubrimiento de la fibra así como por la afinidad del compuesto respecto a los componentes de la matriz. Por tanto, el primer paso era seleccionar la fibra que tuviera un recubrimiento que mejorara las propiedades de extracción entre la fibra y los distintos compuestos que forman los adhesivos. Existen en el mercado varios tipos de fibras que se diferencian en el grosor y la polaridad de sus fases estacionarias. También se diferencian en como estén inmovilizadas las capas de la fase estacionaria sobre la fibra de sílice fundida; encontramos fases ligadas, no ligadas, parcialmente entrecruzadas o fuertemente entrecruzadas, véase la Figura 1.7 . Las fases Capítulo 1  90   funcionales que aumenten la toxicidad, si la respuesta es SI: compuesto clasificado clase III y si es NO: pasar a la pregunta 3 y así sucesivamente. Tras la evaluación con el árbol de decisión, nos muestra la clasificación del compuesto que se busca, según su toxicidad, véase Figura 1.9. Figura 1.9: Resultado de la clasificación del compuesto reteno en el programa Toxtree 2.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL EN EL ADHESIVO Para determinar la concentración inicial en el adhesivo (Cp0) se llevó a cabo una extracción liquida (LE) de las láminas, con diferentes disolventes, de distinta polaridad: diclorometano, metanol y hexano. Se seleccionó el disolvente que extrajera mayor número de compuestos y en mayor cantidad. Capítulo 1  91   Para llevar a cabo la extracción, se cortaron las láminas en pequeños trozos y 0,5 gramos se extrajeron una, dos, tres y cuatro veces consecutivas con 2,5 mL del disolvente seleccionado, para optimizar el número de extracciones necesarias. Cada extracto se extrajo durante 24 horas en un horno a una temperatura de 40ºC. Los extractos procedentes de las extracciones secuenciales se juntaron y se evaporaron posteriormente hasta obtener el mismo peso de extracto final en cada caso. De esta forma, se comparó la eficiencia de la extracción y se optimizó el número de extracciones necesarias. Se seleccionó el número de extracciones necesarias para extraer más del 90% de todos los compuestos identificados previamente. Una vez seleccionadas las condiciones de extracción, se extrajeron las láminas (laminado 1, 2, 3 y 4) y se les añadió 10 μL de disolución A como estándar interno. Se concentraron mediante una corriente de N2 hasta 200 μL. Finalmente, los extractos se analizaron por GC-MS (tres réplicas de cada laminado). Para completar el estudio, se extrajeron los sustratos del laminado ( C y CPP) sin los adhesivos con el mismo método optimizado, para comprobar y determinar la concentración de los compuestos comunes en estos con el adhesivo. Para construir las rectas de calibrado, se prepararon disoluciones de los compuestos identificados a distintas concentraciones en diclorometano y se analizaron por GC-MS. Se analizaron tres réplicas de cada concentración. Capítulo 1  92   2.6. DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE PARTICIÓN Los ensayos de partición se realizaron para determinar las constantes de partición de los compuestos entre el adhesivo y los sustratos correspondientes. La constante de partición adhesivo-sustrato (KA,S) se define como el cociente entre la concentración del compuesto en el adhesivo y la concentración de este en el sustrato tras alcanzar el equilibrio. Esta se calcula según la Ecuación 1 (Sección1, apartado 5.1.1) donde las fases 1 y 2 corresponden al adhesivo Ceq(A) y a los sustratos Ceq(S) respectivamente. Es decir, véase Ecuación 1.1 , 󰇛󰇜󰇛󰇜  (Ecuación 1.1) Para conocer estas concentraciones, sería necesario separar la capa de sustrato y la de adhesivo una vez alcanzado el equilibrio, cosa que es muy difícil al estar totalmente adheridos. Por tanto se propuso la siguiente metodología (Canellas, et al., 2010a; Dole, et al., 2006): Se colocaron dos láminas iguales de ambos sustratos de 1 dm x1dm a cada lado del laminado de las mismas dimensiones y a dicho sistema se le denominó, sándwich, véase Figura 1.10  C-[C-T_01-C]-C  CPP- [CPP-T_01-CPP]-CPP Capítulo 1  93   Figura 1.10: Ensayo de partición Estas dos láminas de sustrato añadidas a cada lado del laminado, permitieron calcular la concentración del compuesto en el sustrato, ya que, al estar en equilibrio el sistema, los sustratos que forman parte del laminado Ceq(S) y los añadidos al sándwich Ceq(S)*, tendrán la misma concentración, es decir, Ceq(S) = Ceq(S)* Este sistema se colocó en una celda de migración propuesta por Dole y col. (Dole, et al., 2006) y Moisan y col. (Moisan, 1980), véase Figura 1.11. Dicha celda, consistía en dos placas de aluminio de 1,5x1,5 dm2 de superficie donde se le aplicaba un par de 0,8 Nm al apretar cuatro tornillos con una llave dinamométrica, véase Figura 1.12. Laminado MIGRACIÓN Sustrato receptor izquierdo Sustrato receptor derecho k Concentración de equilibrio perfil de concentraciones Capítulo 1  94   Figura 1.11: Celda de migración con el sándwich objeto estudio Figura 1.12: Celda de migración cerrada por la llave dinamométrica Tras preparar la celda de migración con los ensayos de partición, se introdujeron en una estufa a unas temperaturas de 40 y 60 ºC (para cada sándwich se estudiaron dos réplicas a dos temperaturas) durante 30 días para asegurarse que el sistema alcanzaba el equilibrio y así, poder calcular las constantes de partición de los compuestos para ambos sustratos. Tras este periodo, se cortó la parte central de los sustratos añadidos en el sándwich, se extrajeron y se analizaron según la metodología descrita en el apartado 2.5. Al realizar este ensayo, se están asumiendo dos suposiciones:  El tiempo de migración de 30 días a 40 ºC y 60 ºC se considera un tiempo lo suficientemente largo para que todos los compuestos migrantes alcancen el equilibrio a través de las capas de los sustratos que forman el sándwich (Canellas, et al., 2010a; Mercea, et al., 2009). Para confirmar esta suposición, se colocan dos sustratos idénticos de espesor ds, donde uno contiene un compuesto perfectamente distribuido uniformemente, de concentración Cpo(S), y el otro sustrato no contiene nada de este compuesto. Capítulo 1  95   Uniendo los sustratos en las condiciones de estricto contacto, según la metodología anterior, el tiempo t necesario para que el sistema alcance el equilibrio (la misma concentración en ambos sustratos), se obtiene mediante la Ecuación 1.2: ~7.5   (Ecuación 1.2) Donde ds es el espesor del sustrato y Ds es la difusión en dicho sustrato. Si los espesores de los sustratos estudiados correspondían a 380 y 410 µm y suponiendo una difusión de 1x10-10 cm2/s (Mercea, et al., 2009)  daría t=20 días, por tanto 30 días es más que suficiente.  Debido a un contacto perfecto entre el laminado y las láminas de sustrato añadidas, se considera que no existe partición entre la interfase del laminado-sustratos que forman el sándwich. Por tanto, la concentración en ambos casos, en los sustratos que forman el laminado, Ceq(S), y en los sustratos añadidos a ambos lados el laminado, Ceq(S)*, es la misma. Esta consideración no puede comprobarse directamente, ya que al final del experimento de partición no es posible determinar la migración local en los sustratos que forman el laminado. Además, trabajos previos (Mercea, et al., 2009) demuestran que con una constante de par de fuerzas de 0.8 Nm aplicada a una superficie de 10x10cm2, es suficiente para comprimir el sándwich de tal forma que no haya resistencia en la interfase laminado-sustrato para los compuestos migrantes. Por tanto, si Ceq(S) = Ceq(S)*, se puede calcular mediante el siguiente balance de materia (véase Ecuación 1.3) la concentración en equilibrio en el Capítulo 1  96   adhesivo, Ceq(A), para calcular las constantes de partición, ya que Ceq(S)* y Cpo(A) pueden ser calculadas fácilmente, según: 󰇛󰇜4 󰇛󰇜󰇛󰇜 (Ecuación 1.3) Donde:  Cpo(A) es la concentración inicial del migrante en el adhesivo (calculada previamente)  Ceq(S) es la concentración de equilibrio del migrante en los sustratos  Ceq(A) es la concentración de equilibrio del migrante en el adhesivo (la incognita)  dA y dS es el espesor del adhesivo y de los sustratos  ρA y ρS es la densidad del adhesivo y de los sustratos La densidad tanto del adhesivo curado, como la de los sustratos, se calculó pesando un determinado volumen de ambos. Conocida la concentración de adhesivo en equilibrio, se pudo calcular la constante de partición, KA,S, según la Ecuación 1.1. 2.7. DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE DIFUSIÓN Para determinar los coeficientes de difusión de los compuestos migrantes tanto en el adhesivo como en los sustratos, se realizó un ensayo similar al de la partición, pero sustituyendo un sustrato a cado lado del laminado, por 10 sustratos idénticos como se muestra en la Figura 1.13. Capítulo 1  97   Figura 1.13: Experimentos de difusión Este sistema se introdujo en la celda de migración antes mencionada, en las mismas condiciones que el ensayo previo de partición, para una temperatura de 40 y 60 ºC (dos réplicas por cada sustrato) durante 24, 48 y 72 horas. Tras este periodo de tiempo, se cortó la parte central de cada sustrato, un total 2x10 sustratos para cada ensayo, y se llevó a cabo la extracción según la metodología del apartado 2.5, para así, calcular la concentración de los migrantes en todo el sistema, es decir, la concentración del migrante en cada sustrato C`(S) . Así se pudo conocer la concentración en el adhesivo C`(A) para un determinado tiempo t, obteniéndose un perfil de concentración del migrante dependiente del tiempo. Para el cálculo de las constantes de difusión, se requería la ecuación de Fick (Crank and Gupta, 1975) (Ecuación 3, sección I, introducción), donde para resolverla, se utilizaron métodos numéricos de diferencias finitas de una dimensión (Tosa, et al., 2008; Tosa and Mercea, 2008). Este trabajo se llevó a cabo dentro del Proyecto MIGRESIVES en colaboración de Dr. MIGRACIÓN DIFUSIÓN DIFUSIÓN RECEPTORES RECEPTORES 12132344556776889910 10 perfil de concentraciones Capítulo 1  98   Peter Mercea de la empresa FABES. Para el cálculo era necesario que se cumplieran las siguientes consideraciones:  Todas las capas del sistema laminado-sustratos eran homogéneas y constantes respecto a su espesor.  Se realizaba a una determinada temperatura para que los coeficientes de partición y difusión fueran constantes  No había pérdida de sustancia migrante en el sistema, por ejemplo por degradación o por otros procesos.  Al igual que ocurría en la partición, se suponía que no existía partición entre la interfase del laminado-sustratos añadidos Este algoritmo permitía ajustar los valores de concentración obtenidos experimentalmente C`(S) y C`(A) a un perfil de concentración calculado matemáticamente a partir de unos supuestos valores de difusión, conociendo la concentración inicial del compuesto en el adhesivo Cpo(A), los parámetros geométricos como los espesores tanto del adhesivo y el sustrato (dA y dS) y densidad de ambos (ρA y ρS) así como las constantes de partición calculadas anteriormente. Para un mejor ajuste se necesitaba que los compuestos migrantes difundieran hasta la última capa. Para comenzar con el ajuste, el valor de entrada de KA,S era el calculado en los experimentos de partición y un valor de coeficiente de difusión en el sustrato DS y del adhesivo DA que podían ser tomados por similitud con los trabajos anteriores (Mercea and Piringer, 2008; Mercea, et al., 2009; Tosa, et al., 2008; Tosa and Mercea, 2008). Con estos valores se obtenía una curva de concentración calculada con el algoritmo numérico y se comparaba con la calculada experimentalmente (C`(S)), calculando la desviación de ambos datos ∑1. Capítulo 1  99   Si los datos de la curva de concentración calculados matemáticamente eran considerablemente superiores o inferiores a la curva experimental, se ajustaba el valor de los coeficientes de KA,S aumentando o disminuyendo en consecuencia. Pero si las diferencias son más pronunciadas se ajusta DS, y se calcula una segunda desviación ∑2. Si ∑2<∑1, se ha mejorado la calidad del ajuste y por tanto se continua con el ajuste hasta un mínimo valor de ∑, proporcionando el valor de DS y un valor de matemático de KA,S. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES HSSPME El primer objetivo del trabajo fue la identificación de los compuestos volátiles presentes en los dos adhesivos termofusibles mediante la técnica HS-SPME-CG-MS debido a su alta sensibilidad. El primer paso, era elegir la fibra más apropiada para cada adhesivo, es decir, la fibra que extrajera el mayor número de compuestos y con una mayor sensibilidad. Para este propósito, las fibras estudiadas se han especificado en el apartado 2.1.2. Para completar el trabajo, se realizó el ensayo tanto para los adhesivos crudos como curados, para comparar las diferencias entre ambos. La Tabla 1.2, muestra los compuestos identificados en cada adhesivo para las 4 fibras estudiadas. Capítulo 1  106   Las variables cruzadas text*Text indican si se produce un aumento o disminución de la señal cuando aumentamos las dos variables a la vez. En este caso, cuando incrementamos las dos variables a la vez, para los compuestos como el 5-metilpentadecano se produce una disminución de señal. En cambio para el resto de compuestos, al incrementar ambas se produce un incremento de la señal. Por tanto, este hecho puede ser debido a que en los compuestos menos volátiles, al aumentar ambas variables se favorece el paso de los compuestos menos volátiles al espacio de cabeza del vial, se produce un desplazamiento en los centros activos de la fibra y en consecuencia los compuestos menos volátiles se extraen mas. Por tanto las condiciones óptimas suponen una solución de compromiso, ya que las condiciones buscadas son aquellas para las que se extraen el mayor número de compuestos y en mayor proporción, aunque para algunos compuestos las condiciones utilizadas no sean las mejores. Finalmente las condiciones seleccionadas fueron:  Temperatura de extracción: 80 ºC.  Tiempo de extracción: 25 minutos.  Tiempo de desorción: 1 minuto, el menor, ya que, no era una variable significativa para los compuestos estudiados. Capítulo 1  107   3.2. IDENTIFICACIÓN Y CLASIFICACIÓN SEGÚN LA TOXICIDAD DE LOS COMPUESTOS DETECTADOS EN LOS ADHESIVOS Una vez seleccionadas las condiciones óptimas, se llevó a cabo la identificación de los compuestos comparando el tiempo de retención y el espectro de masas con los estándares puros. La Tabla 1.2 muestra los compuestos identificados en ambos adhesivos así como su nivel de toxicidad según las reglas de Cramer (apartado 2.4). En el adhesivo T_01 curado, se detectaron 22 compuestos. La mayoría de estos compuestos presentaban una toxicidad baja o moderada, sólo dos compuestos presentaban una toxicidad alta según las reglas de Cramer, el 9,10-dihidroantraceno y el reteno. Estos compuestos son derivados del ácido abiético que es el compuesto principal de las resinas ácidas utilizadas para la fabricación de este adhesivo. Este se utiliza como taquificante para aumentar la pegajosidad y así mejorar la adhesión con los sustratos (Petrie, 2000a; Petrie, 2000b). Cuando el adhesivo se calienta para ser curado, el ácido abiético experimenta una degradación térmica. Varios autores consideran que la degradación comienza con la deshidrogenación del ácido abiético a dehidroabietato de metilo (21a), y este experimenta una descarboxilación para dar 10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno (16a) y posteriormente una aromatización a reteno (19a). Los compuestos 15a, 17a y 20a serían los compuestos intermedios de la degradación térmica del ácido abiético (Marchand-Geneste and Carpy, 2003; Rogge, et al., 1998; Simoneit, et al., 1993). Los compuestos 4a, 6a son aceites esenciales de las resinas ácidas (Jeong-Ho, et al., 2008). Capítulo 1  108   En el adhesivo T_02, únicamente se detectaron dos compuestos cis y trans-decahidronaftaleno y ninguno de estos tenía un nivel considerable de toxicidad según las reglas de Cramer. Según bibliografía, los adhesivos basados en poliolefinas están formados por compuestos puros con elevado peso molecular (Petrie, 2000b), por esta razón únicamente se detectaron dos compuestos volátiles por HS-SPME. 3.3. CONCENTRACIÓN INICIAL EN EL ADHESIVO De los tres disolventes estudiados para la extracción de los compuestos presentes en el adhesivo, el disolvente que presentaba mejores resultados era el diclorometano frente al metanol y el hexano, debido a su alto poder de extracción de los compuestos del adhesivo. Con el metanol solo se detectaron los compuestos más polares como el 2,5-di-tert-butil-1,4benzoquinona, 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol y el 9,10-dihidroantraceno. El disolvente hexano extraía todos los compuestos, igual que el diclorometano, pero su poder de extracción era menor para otros compuestos, como por ejemplo los alcanos alifáticos. Para extraer más del 98% de todos los compuestos del adhesivo, se necesitaron tres extracciones. Las rectas de calibrado se prepararon a partir de disoluciones de distintas concentraciones de los distintos patrones en diclorometano y se analizaron por GC-MS. Los parámetros analíticos se muestran en la Tabla 1.4. Capítulo 1  109   Tabla 1.4: Parámetros analíticos del método GC-MS Compuestos Ecuación R2 Rango lineal (μg/g) LOD (μg/g) RSD (%) 2,6-di-tert-butil-1,4 - benzoquinona y = 0,066x-0,004 0,999 0,59-23,8 0,18 5,31 2,6-di-tert-butil-4metilfenol y = 1,82x 0,997 0,09-13,8 0,03 3,66 Hexadecano y = 0,570x-0,093 0,996 0,36-9,61 0,12 8,44 9,10-dihidro antraceno y = 1,42x 0,999 0,13-4,78 0,04 4,42 Octadecano y = 0,580x-0,093 0,995 0,99-7,43 0,29 8,61 Eicosano y = 0,557x+0,004 0,999 1,556,97 0,46 2,31 Docosano y = 0,241x-0,004 0,999 0,79-6,09 0,24 9,70 Reteno y = 0,641x-0,012 0,998 0,23-48,6 0,07 6,22 Tetracosano y = 0,311x-0,003 0,991 0,16-13,8 0,05 7,39 Todos los compuestos presentaban una RSD menor del 10%. Los límites de detección (LODs) estaban comprendidos entre 0,03 μg/g de 2,6di-tert-butil-4-metilfenol a 0,46 μg/g para eicosano. La Tabla 1.5 muestra los valores de concentración inicial (Cp0) del adhesivo T_01, ya que para el adhesivo T_02, no se detectaron los dos compuestos para poder cuantificarlos en el laminado. Por tanto únicamente se trabajó con los laminados 1 y 2. Por otro lado, se cuantificó la concentración de los compuestos del adhesivo en ambos sustratos utilizados para formar el laminado 1 y 2. Capítulo 1  110   Tabla 1.5: Concentración inicial en el adhesivo T_01 (CP0) expresado en μg de compuesto por g de adhesivo curado y concentración de los compuestos en los sustratos expresados en μg de compuesto por dm2 de sustrato. Compuestos CPo (μg/g) Concentración en el sustrato C (μg/dm2) Concentración sustrato CPP (μg/dm2) 2,5-di-tert-butil-1,4-benzoquinona 250±41 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol 220±36 1,63±0,13 Hexadecano 430±65 0,4±0,03 1,69±0,13 9,10-dihidroantraceno 15±4 Octadecano 1000±150 1,85±0,15 4,42±0,35 Eicosano 1300±200 0,85±0,07 2,74±0,22 4b-8-dimetil-2isopropilfenantreno 120±19 10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno 630±79 1-metil-10,18-bisnorabieta8,11,13-trieno 140±26 Docosano 2300±63 8,6±0,69 7,41±0,59 Reteno 34±5 Dehidroabietal 340±58 0,42±0,03 Dehidroabietato de metilo 700±85 0,32±0,02 Tetracosano 4000±540 14,82±1,19 14,23±1,14 Los compuestos 4b-8-dimetil-2-isopropilfenantreno, 10,18bisnorabieta-8,11,13-trieno , 1-metil-10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno y dehidroabietal, dehidroabietato de metilo se cuantificaron con reteno como estándar,debido a su estructura química similar y a la dificultad de encontrar estos compuestos. Los compuestos mayoritarios en el adhesivo T_01 eran los alcanos con una concentración desde 430±65 para el hexadecano hasta 4000±540 μg/gadhesivo para el tetracosano. Estos provenían de la parafina que se utiliza habitualmente como cera para reducir viscosidad, alterar la velocidad de fijación y reducir costos en los adhesivos termofusibles EVA (Petrie, 2000b). Los compuestos derivados del ácido abiético estaban también presentes en el adhesivo a alta concentración, como por ejemplo dehidroabietato de metilo, con una concentración de 700±85 μg/gadhesivo. Capítulo 1  111   De los compuestos presentes en ambos sustratos se encontraban los alcanos y algunos derivados del ácido abiético, ya que este compuesto proviene del ester de colofonia que forma parte de la resina de los pinos que se emplea para la fabricación de papel (Valto, et al., 2008). 3.4. COEFICIENTES DE PARTICIÓN Los coeficientes de partición para los laminados 1 y 2, entre el adhesivo-sustrato (KA,S), se calcularon según la Ecuación 1.1, que representa la relación entre la concentración en el adhesivo Ceq(A) frente a el sustrato Ceq(S) ambas en equilibrio. Para calcular este coeficiente, tras permanecer los sándwich en la celda de migración, se analizaron 0,5 g de sustrato extrayendo 3 veces consecutivas con diclorometano según la metodología optimizada en el apartado 2.5 y determinando así la Ceq(S). Posteriormente se calculó la Ceq(A) a partir del balance de materia, ecuación 1.3, a partir de la Cp0 calculada anteriormente. La Tabla 1.6 muestra los coeficientes de partición entre el adhesivo T_01 y ambos sustratos C y CPP (KT_01,C y KT_01,CPP) en los laminados 1 y 2. Estos coeficientes se calcularon a dos temperaturas 40ºC y 60ºC. Capítulo 1  112   Tabla 1.6: Coeficientes de partición entre al adhesivo-cartón (KT_01/C) y adhesivo-cartón con polipropileno (KT_01/CPP) a dos temperaturas Compuestos KT 01/C KT 01/CPP 40ºC 60ºC 40ºC 60ºC 2,5-di-tert-butil-1,4-benzoquinona 720 36 1130 110 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol 20 28 140 80 Hexadecano 150 70 60 26 9,10-dihidroantraceno 15 0,5 220 190 Octadecano 110 67 53 20 Eicosano 90 64 110 50 4b-8-dimetil-2-isopropilfenantreno 110 35 820 370 10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno 170 45 2800 620 1-metil-10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno 380 80 930 430 Docosano 68 33 70 40 Reteno 30 9 150 45 Dehidroabietal 370 70 1700 750 Dehidroabietato de metilo 850 130 2700 540 Tetracosano 100 40 500 130 Como puede observarse, se obtuvieron un amplio rango de coeficientes de partición según el tipo de compuesto estudiado. Este hecho, se podría atribuir a la diferencia de solubilidad de los compuestos tanto en el adhesivo como en los sustratos. Esta solubilidad, llamada solubilidad Hildebrand (∂), es un parámetro numérico que indica la relativa afinidad de un compuesto en un medio determinado. Dos materiales son solubles cuando sus fuerzas intermoleculares son similares, y por tanto tienen similares valores de ∂. Es decir un pequeño valor de diferencia de solubilidad ∂ (∂ = |∂1 - ∂2|) entre dos sustancias 1 y 2 indica una buena solubilidad entre ambos (AIC, 1984; Durkee, 2004a; Durkee, 2004b; Tehrany and Desobry, 2004; Wisniewski, et al., 1995). Por tanto, se puede definir la solubilidad para el adhesivo ∂A, y para el compuesto migrante ∂m. Si la diferencia entre ambos valores es pequeña (∂Am = |∂A - ∂m|) indicará una buena solubilidad del migrante en el adhesivo. Por el mismo razonamiento, se puede definir ∂Sm = |∂S - ∂m| donde ∂S corresponde a la solubilidad del sustrato. Capítulo 1  113   En general, como todos los valores de partición entre el adhesivo y el sustrato, KA,S son muy superiores a la unidad, esto indica que la solubilidad de los compuestos era mucho mayor en los adhesivos que en los sustratos utilizados para la fabricación de los laminados y por tanto, Δ∂Am< Δ∂Sm, con lo que los compuestos van a presentar una gran tendencia a permanecer en el adhesivo. De acuerdo con la literatura, el valor de solubilidad de Hildebrand para el polímero EVA (∂A ) corresponde aproximadamente a 17,5 MPa1/2 a 25 ºC (Barton, 1990b). Y para los migrantes (∂m) como el hexadecano corresponde a 16,3 MPa1/2, 20,3 MPa1/2 para el 9,10-dihidroantraceno, 16,4 MPa1/2 para el octadecano, 16,5 MPa1/2 para el eicosano, 20,2 MPa1/2 para el reteno (Barton, 1991) y 24,1 para el 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (AIC, 1984). Para el resto de compuestos estudiados no se encontraron datos de solubilidad bibliográfica. Se observa en la Tabla 1.6, que los coeficientes de partición entre el adhesivo y el cartón C (KT_01,C) eran mayores para los compuestos con valores más bajos de Δ∂Am como el hexadecano (Δ∂Am=1,2), el octadecano (Δ∂Am=1,1) y el eicosano (Δ∂Am=1,0), que los compuestos con valores superiores de Δ∂Am como el 9,10-dihidroantraceno (Δ∂Am=4,3), reteno (Δ∂Am=2,7) y 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (Δ∂Am=6,6), en los cuales se obtenían valores inferiores de KT_01,C. Esto indica que la solubilidad de los compuestos en el adhesivo juega un papel muy importante en el valor de KT_01,C. Para el laminado 2, fabricado con el sustrato de cartón laminado con polipropileno, se observaron dos tendencias claras en las constantes de partición KT_01,CPP . Por un lado, todos los compuestos presentaban mayores valores de constantes de partición en este laminado que en el laminado Capítulo 1  114   fabricado únicamente con cartón, exceptuando tres compuestos. Esto indicaba que la solubilidad de la mayoría de compuestos en la lámina de polipropileno, CPP, era menor que para el sustrato formado únicamente de cartón C, y por tanto, tendrían más tendencia a permanecer en el adhesivo, con lo que la cantidad de estos compuestos en el sustrato de CPP en equilibrio sería más pequeña (KT_01,CPP mayores). Por otro lado, los tres compuestos que presentaban menores constantes de partición KA,CPP eran el hexadecano, octadecano y eicosano. Según los valores de solubilidad señalados anteriormente y el valor de solubilidad de Hildenbrand para el polímero de polipropileno, ∂S, 16 MPa1/2 (Barton, 1990c), la diferencia de solubilidad ∂Sm entre los compuestos hexadecano, octadecano y eicosano con el polipropileno son menores que con el adhesivo ∂Am (0,3, 0,4 y 0,5 frente a 1,2, 1,1 y 1,0 respectivamente), por tanto implica una mejor solubilidad en el polipropileno que en el adhesivo. Este hecho se refleja en una disminución de las constantes de partición KT_01,CPP frente a KT_01,C, para estos tres compuestos. Como ya se ha mencionado anteriormente, para el resto de compuestos no se encontraron sus valores de solubilidad de Hildebrand en bibliografía. Pero esta se puede explicar mediante la ecuación de Hansen, Ecuación 1.4, la cual expresa una versión actualizada de la solubilidad de Hildebrand, donde depende de tres tipos de interacciones: fuerzas de dispersión (∂D), fuerzas de atracción entre compuestos polares (∂P) y fuerzas debidas a puentes de hidrógeno (∂H) (AIC, 1984; Tehrany and Desobry, 2004; Wisniewski, et al., 1995), y corresponde a:      (Ecuación 1.4) Capítulo 1  115   Para los compuestos aromáticos el principal parámetro que influye en la solubilidad de Hildebrand son las fuerzas de dispersión, las cuales son más importantes en los hidrocarburos aromáticos que en los alifáticos. Cuanto mayor sea el número de anillos aromáticos en un compuesto, mayor serán estas fuerzas de dispersión y por tanto, será más difícil que se disuelvan en el adhesivo (un hidrocarburo alifático). Esto podía explicar por qué el reteno (3 anillos aromáticos) y el 9,10-dihidroantraceno (2 anillos aromáticos) tenían coeficientes de partición más bajos (Chen, et al., 2005). Además de todo lo explicado anteriormente, hay que tener en cuenta, que los coeficientes de partición estarán también influenciados por la afinidad de los compuestos por ser adsorbidos por el cartón. Esta afinidad depende principalmente de la polaridad y de la estructura de los compuestos migrantes ya que interaccionarán de forma distinta con la pulpa según el cartón (Chen, et al., 2005; Nerín and Asensio, 2004). Para estudiar la influencia de la temperatura en las constantes de partición, la Tabla 1.6 muestra que todos los compuestos, excepto el 2,6-ditert-butil-4-metilfenol (que podría ser debido a fluctuaciones experimentales), presentaban valores de constantes de partición KT_01,C o KT_01,CPP inferiores al incrementar la temperatura desde 40 a 60 ºC. Esto significa un incremento de la concentración de los compuestos en los sustratos. Este resultado se puede explicar según la ecuación de Arrhenius (Tehrany and Desobry, 2004), Ecuación 1.5, que expresa la dependencia de la solubilidad de un compuesto en un polímero con la temperatura: ,  , exp 󰇛 󰇜 (Ecuación 1.5) Capítulo 1  122   dimetil-2-isopropilfenantreno y octadecano que para los compuestos de menor peso molecular. Los valores obtenidos para los compuestos de menor peso molecular como el hexadecano, 2,5-di-tert-butil-1,4-benzoquinona y 9,10-dihidroantraceno presentaban un coeficiente de difusión similar a trabajos bibliográficos en un polímero EVA (Dole, et al., 2006). La misma tendencia se encontró para los coeficientes de difusión de los compuestos en el sustrato de cartón DC. La temperatura también tenía una gran influencia en la difusión de las moléculas. La Tabla 1.8 muestra que los coeficientes de difusión se incrementaban en función de la temperatura. Los coeficientes de difusión para el adhesivo y el sustrato eran significativamente superiores a 60ºC que a 40ºC (p<0.01) y (p<0.05) respectivamente. Según bibliografía la difusión en polímeros elásticos (por tanto en el adhesivo) es un proceso térmicamente activo según la ecuación de Arrhenius (Crank and Park, 1968; Gajdos, et al., 2001; Klopffer and Flaconneche, 2001), Ecuación 1.6: 󰇛󰇜 󰇡 󰇢 (Ecuación 1.6) Donde D0 es el coeficiente de difusión para temperaturas muy altas. T ∞ y y ED es la energía de activación para la difusión de un compuesto. Ambos parámetros dependen de la morfología del polímero, de su tamaño, que afecta a la capacidad de penetración, y también están influenciados por la temperatura (Crank and Park, 1968; Gajdos, et al., 2001; Klopffer and Flaconneche, 2001). Al incrementar los coeficientes de difusión con la temperatura, según la Tabla 1.8, significaba que ED era positiva tanto para el adhesivo como para el sustrato. Como consecuencia, D es una función que se incrementa al Capítulo 1  123   aumentar la temperatura, como un volumen libre directamente relacionado con la expansión de las cadenas de los compuestos que forman el polímero, permitiendo más fácilmente la difusión de las moléculas (Gnanasekharan and Floros, 1997; Klopffer and Flaconneche, 2001). Dado que no se encontró literatura sobre difusión en cartón, la discusión sobre los resultados obtenidos se basó en las propiedades del papel o cartón. El papel es una red de fibras de celulosa naturales formadas por microfibras porosas las cuales están compuestas de cadenas largas higroscópicas en un estado cristalino, con regiones amorfas. Las propiedades del transporte en este medio poroso dependerán principalmente de su porosidad, tortuosidad y su permeabilidad (Dury-Brun, et al., 2006; Eggleston and Peirce, 1995; Horgan, 1999; Kacem, et al., 2009; Moldrup, et al., 1998; Triantafyllou, et al., 2005). Para la mayoría de los compuestos la difusión en el cartón fue mayor que en el adhesivo. Se puede reducir en una determinada aplicación, el efecto de la porosidad y higroscopicidad de papel y cartón cubriéndolos con un material no poroso (por ejemplo una película polimérica de los laminados 3 y 4). Este recubrimiento puede disminuir considerablemente el transporte de compuestos a través del papel o sustrato de cartón. Esta es probablemente la razón por la cual no se obtuvieron resultados en los experimentos de difusión llevados a cabo en el sándwich formado por láminas de CPP. Según la ecuación de Arrhenius, Ecuación 1.6, la constante de difusión depende de las constantes D0 y ED. Al igual que en el estudio de partición, estos valores se podían calcular por una regresión lineal de los valores de difusión obtenidos para estas dos temperaturas junto con valores de difusión a temperatura ambiente de trabajos previos del Dr Peter Mercea de la empresa FABES. La Figura 1.20 muestra un ejemplo de la regresión Capítulo 1  124   lineal de los valores de difusión experimentales obtenidos, tanto para el adhesivo como para el cartón, para el compuesto del octadecano. Figura 1.20: Dependencia del coeficiente de difusión con la temperatura para el octadecano, resultados experimentales (puntos negros para la difusión en el cartón y puntos rojos para la difusión en el adhesivo) y regresión lineal calculada por Peter Mercea. En la siguiente tabla, Tabla 1.9, se muestran los parámetros D0 y ED para cada compuesto en el adhesivo T_01 y en el cartón C calculados a partir de estas regresiones lineales. 3,0 3,2 3,4 -9 -8 -7 60°C 40°C D C = 3.828*10 3 *exp - 65337/RT D A1 =6.442*10 3 *exp - 71233/RT 25°C Coeficiente de Difusión , logD, (cm/s2) Temperatura, 1000/T (K-1) Capítulo 1  125   Tabla 1.9: Parámetros de la ecuación de Arrhenius, DO y ED, para el laminado 1. Compuestos Parámetros de la ecuación de Arrhenius para T_01 Parámetros de la ecuación de Arrhenius para C DO(T_01) (cm2/s) ED(T_01) (kJ/mol) DO(C) (cm2/s) ED(C) (kJ/mol) 2,5-di-tert-butil-1,4benzoquinona 8,4E+05 82,99 7,5E+04 74,64 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol 5,5E+04 83,16 3,7E+03 68,50 Hexadecano 6,6E+06 88,86 9,6E+06 83,79 9,10-dihidroantraceno 7,4E+04 77,24 12 52,84 Octadecano 6,4E+03 71,23 3,8E+03 65,34 Eicosano 8,9E+03 73,26 1,2E+04 71,79 4b-8-dimetil-2isopropilfenantreno 2,1E+05 80,82 2,1E+03 69,84 10,18-bisnorabieta-8,11,13-trieno 1,8E+05 80,44 26 55,90 Docosano 2,4E+06 88,12 64 58,83 Al igual que ocurría en la partición, la naturaleza del compuesto migrante va a depender principalmente de los parámetros que afectan a la difusión con un cambio de temperatura. 4. CONCLUSIONES Se ha desarrollado un método HS-SPME-GC-MS para identificar los compuestos presentes en dos adhesivos termofusibles ampliamente utilizados para envase alimentario multicapa. La formulación de ambos era muy diferente dependiendo del polímero base. Mientras que para el adhesivo base EVA se detectaron un total de 22 compuestos, para el adhesivo base APAO únicamente se detectaron dos compuestos, resultado muy interesante para la industria alimentaria. De los compuestos procedentes del adhesivo base EVA muchos eran derivados del ácido abiético, un compuesto utilizado como promotor de adhesión en el proceso Capítulo 1  126   de fabricación de dicho adhesivo. Dos de estos compuestos presentaban una toxicidad alta según el modelo teórico de Cramer, 9,10-dihidroantraceno y reteno. También se ha desarrollado un método de LE-GC-MS para determinar sus concentraciones iniciales en el adhesivo, así como sus coeficientes de partición y difusión en los diferentes materiales utilizados para la fabricación del laminado, formados con sustratos de cartón y cartón con polipropileno. Estos datos proporcionaban una herramienta muy útil para evaluar su potencial de migración al alimento. Los resultados mostraban que los sustratos utilizados para la fabricación de dichos laminados jugaban un papel importante en los coeficientes de partición y difusión de los compuestos ya que el uso de cartón recubierto con una lámina de polipropileno, reducía la migración de la mayoría de estos compuestos. Por otro lado, los coeficientes de partición dependían principalmente de la solubilidad de los compuestos, tanto en el adhesivo como en el sustrato, y de la facilidad de dichos compuestos para ser absorbidos por el cartón. Y los coeficientes de difusión dependían de la naturaleza del compuesto migrante, de la matriz del adhesivo y del sustrato. Otro factor importante que afectaba a estas constantes era la temperatura, mostrando efectos contrarios. Cuando esta se incrementaba, todos los coeficientes de difusión aumentaban, al contrario de los coeficientes de partición que disminuían, lo cual significaba que su incremento favorecía la migración de los compuestos, como cabía esperar. CAPÍTULO 2: ESTUDIOS DE MIGRACIÓN DE LOS ADHESIVOS EN EL ENVASE MULTICAPA PARA ENVASAR ALIMENTOS  Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Determinación de los coeficientes de partición entre el adhesivo y los sustratos Estudio de la migración de los laminados Determinación de los coeficientes de difusión de los compuestos en los sustratos Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos VAE, PVA, PVOH , AC y Alm Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos VAE, PVA, PVOH , AC y Alm COMPUESTOS VOLÁTILES Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Estudio de la migración de los laminados Adhesivos termofusibles EVA y APAO COMPUESTOS NO VOLÁTILES Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Estudio de la migración de los laminados Adhesivos VAE, T, PVA, AC y Alm COMPUESTOS ODORANTES Capítulo 2  131   ESTUDIOS DE MIGRACIÓN DE LOS ADHESIVOS EN EL ENVASE MULTICAPA PARA ENVASAR ALIMENTOS. 1. INTRODUCCIÓN DEL CAPÍTULO Como se ha comentado en el capítulo anterior, los adhesivos están presentes en la mayoría de los envases alimentarios. Sin embargo, no existe una legislación vigente específica acerca de la migración de estos. Todos los materiales para contacto alimentario deben de cumplir con el Reglamento Marco 1935/2004/CE. En ausencia de legislación específica, europea y nacional, debería aplicarse el Reglamento 10/2011/EU relativo a los materiales y artículos plásticos, y la legislación española, Real Decreto 847/2011, de 17 de junio, así como, el principio de barrera funcional, que establece que se pueden utilizar sustancias que no estén en listas positivas de las anteriores legislaciones, siempre que su migración este por debajo de 10 µg/Kg de alimento o que dicho compuesto no haya sido clasificado como mutagénico, carcinogénico o tóxico para la reproducción en la directiva 67/548/EEC. Para estudiar si dichos adhesivos estaban cumpliendo la normativa anteriormente descrita, se llevaron a cabo ensayos de migración con treinta muestras de mercado suministradas por distintas compañías de adhesivos dentro del paquete de trabajo IV del proyecto MIGRESIVES. Estas estaban formadas por la estructura de laminado [sustrato-adhesivo-sustrato], en la que los sustratos, en todos los casos, eran algún tipo de cartón o papel. Se Capítulo 4  234   Tabla 4.6: Resultados del test triangular (diferencias entre los laminados y los sustratos) para los adhesivos VAE y los termofusibles a temperatura ambiente y 40ºC Laminado (adhesivo) Nº aciertos Tamb Diferencia significativa (p) Nº aciertos T40ºC Diferencia significativa (p) Lam_1 (VAE_01) 5 NO 8 SI (0,4) Lam_8 (VAE_04) 7 NO 13 SI (0,01) Lam_11(VAE_05) 3 NO 12 SI (0,01) Lam_28 (T_03) 9 SI (0,2) 10 SI(0,1) Lam_29 (T_01) 11 SI (0,05) 16 SI (0,001) Lam_31 (T_02) 7 NO 7 NO Por tanto, se seleccionó el adhesivo VAE_04 ya que el número de aciertos en el test triangular tanto a temperatura ambiente como a 40ºC era mayor. Como muestra la Tabla 4.6, en los adhesivos termofusibles se encontraron diferencias significativas a temperatura ambiente y a 40ºC. El mayor número de aciertos se encontró para el adhesivo T_01 donde a temperatura ambiente existían diferencias significativas entre el lam_29 y los sustratos con una (p< 0,05) y a 40ºC con una (p< 0,001). Una vez seleccionados los adhesivos más odoríferos (VAE_04, T_01), se realizó un análisis descriptivo de los mismos junto con los otros adhesivos de otros tipos (Alm_01, PVA_01 y AC_03). Los atributos descritos por los catadores se muestran en la siguiente Tabla 4.7: Tabla 4.7: Atributos descritos por los catadores para los distintos adhesivos Adhesivo Atributos descritos VAE_04 Olor a pegamento blanco, plástico, punzante y humedad. T_01 Olor a madera, leñoso, cera depilatoria, fenólico, cuero y neumático. Alm_01 Olor a rancio, fermentación, pegamento blanco y humedad pero menos intenso que el VAE_04. PVA_01 Olor punzante, vinagre. AC_03 Olor a humedad, musgo y alcanfor. Capítulo 4  235   3.2. OPTIMIZACIÓN DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA POR ESPACIO DE CABEZA (HSSPME) Para la extracción con HS-SPME, se llevó a cabo la optimización, seleccionando el tipo de fibra así como el tiempo de extracción. Selección de la fibra más adecuada La siguiente Figura 4.8, muestra los resultados de similitud, (media de los seis catadores) respecto al olor global obtenido por D-GC-O, entre la muestra de adhesivo y los cuatro extractos obtenidos para las distintas fibras de SPME. Figura 4.8: Rangos de similitud desde 0 (distinto al de referencia) a 10 (similar al de referencia) entre los extractos con las distintas fibras de SPME y la muestra de adhesivo. Como muestra la figura, los máximos valores de similitud obtenidos corresponden a valores comprendidos entre 6,3 y 8,4. 012345678910 Fibra de PA Fibra de PDMS Fibra de PDMS/DVB Fibra de DVB/CAR/PDMS PVA_01 AC_03 T_01 VAE_04 Alm_01 0,5 6,3 5,5 4,5 0.5 1,3 2,3 6,5 3,5 2,2 3,7 6,8 1,0 2,2 4,4 8,4 1,0 3,8 6,2 7,5 Capítulo 4  236   Para el adhesivo VAE_04, el mayor valor medio de similitud fue 6,5 para la fibra de DVB/CAR/PDMS, valor significantemente mayor que para el resto de fibras, cuyos valores medios estaban por debajo de 2,3. La misma tendencia presentaron los adhesivos PVA_01 y Alm_01 cuyos valores de similitud correspondían con valores de 6,8 y 8,4 respectivamente para la fibra DVB/CAR/PDMS. Sin embargo para el adhesivo acrílico AC_03, los extractos más representativos se obtuvieron para las fibras PDMS y DVB/CAR/PDMS, aunque esta última se seleccionó también, ya que el valor medio fue más alto (7,5 frente a 6,2) La fibra de DVB/CAR/PDMS es una fibra con una estructura de microporos por tanto sólo extrae compuestos de bajo peso molecular, presenta una polaridad media y posee gran capacidad de extracción (Kataoka, et al., 2000). (Véase la Figura 1.7 del capítulo 1). Para el adhesivo T_01 los extractos más representativos fueron los obtenidos por las fibras de PDMS, PDMS/DVB y DVB/CAR/PDMS (medias de 6,3, 5,5 y 4,5 respectivamente). Al contrario, la fibra PA presentó el extracto con un valor medio de similitud significativamente más bajo. De las tres fibras anteriores, se seleccionó la fibra de PDMS por tener el valor más alto de la media de similitud y además, por ser la fibra utilizada para los estudios previos de la identificación de los compuestos volátiles en este adhesivo en el capítulo 1 (Vera, et al., 2011). La fibra de PDMS es una fibra apolar con capacidad de extracción media (Kataoka, et al., 2000). Probablemente la mayoría de los compuestos odorantes encontrados en este tipo de adhesivo serán de poca polaridad, igual que ocurrió en los estudios previos descritos en el capítulo 1 (Vera, et al., 2011). Capítulo 4  237   Selección del tiempo de extracción. Una vez seleccionada la fibra para cada adhesivo, se continuó con la optimización del tiempo de extracción. La Figura 4.9 muestra la media de los valores de similitud para los distintos tiempos de extracción. Figura 4.9: Rangos de similitud obtenidos para distintos tiempos de extracción en un panel de 6 catadores; los rangos de la escala desde 0 (distinto al de referencia) a 10 (similar al de referencia) La mayoría de adhesivos mostraron diferencias significativas entre 1 y 5 minutos (rangos medios de similitud entre 1,2 y 4,6) con respecto a 15 y 25 min (rangos entre 5,6 y 8,5). Para los tiempos superiores de extracción se consiguieron rangos de similitud mayores y al no existir diferencias significativas entre 15 y 25 minutos, se seleccionó el menor tiempo de extracción, es decir, 15 minutos. 012345678910 1min 5min 15min 25min 2,0 2,2 6,3 6,4 1,2 1,6 6,5 5,6 4,0 6,5 4,6 6,8 3,5 4,2 6,5 8,4 3,1 3,8 7,1 6,0 PVA_01 AC_03 T_01 VAE_04 Alm_01 Capítulo 4  238   3.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS ODORANTES DE LOS EXTRACTOS DEL ADHESIVO MEDIANTE HS-SPE-GC-MS Y HS-SPME-GC-MS Las Figuras 4.10, 4.11, 4.12, 4.13 y 4.14 muestran los cromatogramas de los extractos de VAE_04, T_01, Alm_01, PVA_01 y AC_03 respectivamente, analizados por HS-SPE-GC-MS y HS-SPME-GC-MS. Figura 4.10: Cromatograma del adhesivo VAE_04 analizado por HS-SPE-GC-MS (parte superior) y HS-SPME-GC-MS con la fibra DVB/CAR/PDMS (parte inferior) Capítulo 4  239   Figura 4.11: Cromatograma del adhesivo T_01 analizado por HS-SPE-GC-MS (parte superior) y HS-SPME-GC-MS con la fibra de PDMS (parte inferior) Figura 4.12: Cromatograma del adhesivo Alm_01 analizado por HS-SPE-GC-MS (parte superior) y HS-SPME-GC-MS con la fibra DVB/CAR/PDMS (parte inferior) Capítulo 4  240   Figura 4.13: Cromatograma del adhesivo PVA_01 analizado por HS-SPE-GC-MS (parte superior) y HS-SPME-GC-MS con la fibra de DVB/CAR/PDMS (parte inferior) Figura 4.14: Cromatograma del adhesivo AC_03 analizado por HS-SPE-GC-MS (parte superior) y HS-SPME-GC-MS con la fibra de DVB/CAR/PDMS (parte inferior) Capítulo 4  241   Como muestran las figuras, se detectaron treinta y tres compuestos en los adhesivos, ordenados por sus índices de retención (RI). La Tabla 4.8 muestra los compuestos identificados para cada adhesivo, de forma ordenada según sus índices de retención. También se muestran los olores descritos por los catadores, así como sus MF(%) calculadas según la técnica de extracción. Capítulo 4  242   Tabla 4.8: Compuestos odorantes identificados con IR y sus atributos de olor percibidos por los catadores y sus MF (%) según las técnicas de extracción HS-SPE y HS-SPME MF (AC_03) SPME 81,6 64,5 100 59,7 76,42 62,3 100 85 SPE 57,7 84,7 52,7 79,9 64,5 72,7 60,9 52,7 MF(PVA_01) SPME 54,4 64,5 100 85 100 SPE 54,9 83,3 57,7 100 40,8 MF (Alm_01) SPME 13,6 51,8 53,6 28,9 50,9 69,3 43 59,1 SPE 33,2 65 50,2 71,4 35,2 31,5 50,2 MF (T_01) SPME 50,3 9,2 78,3 68,9 50 51,1 SPE 52,6 58,3 50,9 62,4 54 45,3 37,4 47,3 55,3 MF(VAE_04) SPME 68,3 50,3 16,3 54 51 79,1 51,5 31,2 SPE 65,3 44,7 76,1 53,8 65,3 38,2 50 Descripción del olor Frutal, dulce Punzante Frutal Pintura, humedad Hierba, grasa Punzante, desagradable Dulce Tierra, dulce Medicina Punzante, frutal Champiñón Gasolina, balsámico Gasolina, disolvente Hierba, resina Resina, verde Punzante Fresco, verde Alcanfor Desagradable, madera Vinagre, agrio Verde Alcanfor Rancio Azúcar quemado Musgo, champiñón Madera , pino Rancio, queso Aromático, dulce Queso Bolas de polillas Plástico pegamento Dulce, floral Picante, herbal Compuesto Acetato de etilo No identificado (N.I) 2-metil-2-propenoato metilo Tolueno Hexanal 2,4,6-trimetil-1,3,5-trioxano P-dimetilbenceno Propanoato de butilo 1-butanol Acrilato de butilo No identificado Estireno P-cimeno 2-octanona 1-hexanol Acetato de 2-etilhexil Nonanal Ciclohexanol No identificado Ácido acético 2-etil-1-hexanol Alcanfor Ácido propanoico Benzaldehido 1-octanol Longifoleno Ácido butírico Benzoato de metilo Butirato de metilo Naftaleno No identificado Benzoato de alilo Calameneno RI 907 1005 1022 1035 1077 1092 1098 1120 1168 1170 1216 1241 1280 1285 1359 1382 1400 1411 1427 1466 1487 1491 1536 1539 1553 1570 1626 1627 1689 1785 1797 1823 1835 N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Capítulo 4  243   Se detectaron un 33% de los compuestos por ambas técnicas de extracción: el p-dimetilbenceno, 1-butanol, estireno, 1-hexanol, ciclohexanol, ácido acetico, benzaldehido, 1-octanol, longifoleno, benzoato de alilo y calameneno. Aunque algunos de ellos presentaron distintas MF (%), por ejemplo el p-dimetilbenceno encontrado en el adhesivo VAE_04 con mayor valor de MF(%) para la extracción por HS-SPE que para la extracción HS-SPME (un 65,3% frente a un 50,3% respectivamente). Lo contrario ocurrió con el 1-octanol, encontrado en el adhesivo AC_03 con un 72,7% frente a un 85,0% con HS-SPE y HS-SPME respectivamente. El resto de compuestos únicamente se identificaron con una MF(%)>50 para una de las dos técnicas de extracción (HS-SPME o HSSPE). Para la otra técnica, o bien su MF(%) era menor que 50 o simplemente no fueron detectados por los catadores en el portal de olfacción. Esto resalta la importancia del uso de estas dos técnicas de extracción, que se comportan como complementarias para este trabajo, incrementando la lista de compuestos odorantes detectados para su posterior identificación. Consecuentemente también se incrementó la lista de los posibles compuestos migrantes para estudios posteriores. Por ejemplo, los compuestos con un índice de retención menor que 1092 (donde se detectaba el disolvente), sólo se detectaron al extraerlos por HS-SPME. Esto se produce porque esta técnica es libre de disolvente, y por tanto, permitía que los catadores olieran en el tiempo en el que para la otra técnica salía el disolvente, enmascarando los compuestos odorantes. Entre los compuestos identificados se encontraron varios ácidos como acético, propanoico y butírico que proporcionan características organolépticas comunes a los adhesivos como punzante, agrio, rancio y queso. También varios ésteres, como butirato de metilo, con olor a queso y Capítulo 4  250   (mg/m3) para Devos y col. o 0,00389 (mg/m3) para SchiMFFan y col (Czerny, et al., 2008; Schiffman, et al., 2001). Esto significa que el ácido butírico será más perceptible en el portal de olfacción que el ácido acético porque su umbral de olfacción es más bajo, por tanto, con una MF(%) similar, la concentración de este será menor. El compuesto odorante más abundante encontrado en todos los adhesivos fue el ácido acético y su concentración estaba comprendida entre 23±2,1 a 8900±790 µg/g dependiendo del tipo de adhesivo. El adhesivo PVA_01 presentó la mayor concentración, coincidiendo con los catadores que en el ensayo sensorial habían asignado a este adhesivo los atributos de punzante y vinagre. Otros compuestos con concentraciones altas fueron pcimeno (28±2,5 µg/g) encontrado en el adhesivo T_01, acetato de etilo (460±41 µg/g) y 1-butanol (60±5,4 µg/g) para el adhesivo PVA_01 y 2metil-2-propenoato de metilo (56±4,5 µg/g), acetato de 2-etilhexil (69±5,5 µg/g) y 2-etil-1-hexanol (510±41 µg/g) para el adhesivo AC_03. 4. CONCLUSIONES Se ha desarrollado un método GC-O-MS para identificar los compuestos odorantes presentes en cinco adhesivos (VAE, termofusible, almidón, PVA y acrílico) que formar parte del envase alimentario. Para ello, dichos adhesivos se extrajeron por dos metodologías complementarias HSSPE y HS-SPME (optimizando previamente el tipo de fibra y el tiempo de extracción por una técnica novedosa D-GC-O). Estas resultaron ser unas herramientas muy útiles para identificar un gran número de compuestos odorantes en estos adhesivos. Se identificaron un total de 33 compuestos, Capítulo 4  251   entre los que se encontraban, en todos los adhesivos, algunos ácidos como el acético y butírico con olor a vinagre y queso rancio, también el butirato de metilo, nonanal y 1-butanol. Además de la identificación se llevó a cabo la cuantificación de la concentración inicial en el adhesivo, resultando el ácido acético el compuesto más abundante con un rango de concentración entre 23±2,1 y 8900±790 µg/g Este estudio resalta la importancia de determinar los compuestos odorantes responsables de los olores en los adhesivos, ya que es una gran ayuda para las compañías de adhesivos, para reformular o reemplazar estos compuestos odorantes por otros que no lo sean cumpliendo su misma función. Así, se evitaría, que la presencia de estos compuestos provoque cambios organolépticos en el alimento envasado, que se traducen en mala imagen de la empresa y lleva consigo costes elevados asociados a la pérdida de mercado.   CAPÍTULO 5 ESTUDIOS DE MIGRACIÓN DE LOS COMPUESTOS ODORANTES PRESENTES EN LOS ADHESIVOS UTILIZADOS EN EL ENVASE MULTICAPA PARA ENVASAR ALIMENTOS    Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Determinación de los coeficientes de partición entre el adhesivo y los sustratos Estudio de la migración de los laminados Determinación de los coeficientes de difusión de los compuestos en los sustratos Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos VAE, PVA, PVOH , AC y Alm Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos termofusibles EVA y APAO Adhesivos VAE, PVA, PVOH , AC y Alm COMPUESTOS VOLÁTILES Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Estudio de la migración de los laminados Adhesivos termofusibles EVA y APAO COMPUESTOS NO VOLÁTILES Identificación de los compuestos en los adhesivos Determinación de la concentración inicial Estudio de la migración de los laminados Adhesivos VAE, T, PVA, AC y Alm COMPUESTOS ODORANTES  Capítulo 5  257   ESTUDIOS DE MIGRACIÓN DE LOS COMPUESTOS ODORANTES PRESENTES EN LOS ADHESIVOS UTILIZADOS EN EL ENVASE MULTICAPA PARA ENVASAR ALIMENTOS 1. INTRODUCCIÓN DEL CAPÍTULO El objetivo de este capítulo fue determinar la migración de los compuestos odorantes identificados en los cinco adhesivos estudiados en el capítulo anterior. Para ello, se disponía de muestras de mercado para envasar alimentos, en las que los adhesivos formaban parte de los laminados [sustratoadhesivo-sustrato] estudiados en el capítulo 2. Se estudiaron dichos laminados, primero determinando la concentración de los compuestos odorantes en los propios laminados, y posteriormente determinando su migración. Estos estudios ya se han descrito en el capítulo 2, con la salvedad de que ahora se determinará la migración específica de compuestos odorantes que no habían sido identificados en el capítulo 2. Por tanto a diferencia del estudio anterior se requería la técnica GC-O-MS. Una vez realizados los ensayos de migración, con igual metodología que los desarrollados en el capítulo 2, los simulantes se analizaron por GC-O-MS, con dos propósitos: Capítulo 5  258   I. Que el panel de catadores que antes había identificado los compuestos, realizara el mismo ensayo y detectara si los compuestos migrantes eran percibidos por el olfato, determinando sus intensidades. II. Se calculara su valor de migración, con el fin de comprobar si dichas concentraciones se encontraban por debajo de los límites establecidos como toxicológicos. La Figura 5.1 muestra un esquema del desarrollo del trabajo realizado en este capítulo. Figura 5.1: Esquema trabajo desarrollado en el capítulo 5 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. MATERIALES 2.1.1. REACTIVOS Acetato de etilo (141-78-6), 2-metil-2-propenoato de metilo.(80-62-2), tolueno (108-88-3), hexanal (66-25-1), 2,4,6-trimetil-1,3,5-trioxano (12363-7), p-dimetilbenceno (106-42-3), propanoato de butilo (590-01-2), 1Ensayos de migración LE-GC-O-MS Determinación de concentración inicial LE-GC-MS 12 laminados formados con los adhesivos : •VAE_04 •T_01 •Alm_01 •PVA_01 •AC_03 Capítulo 5  259   butanol (71-36-3), 2-propenoato de butilo (141-32-2), estireno (100-42-5), p-isopropiltolueno (99-87-6), 2-octanona (111-13-6), hexanol (111-27-3), acetato de 2-etilhexil (103-09-3), nonanal (124-19-6), ciclohexanol (108-930), 2-etil-1-hexanol (104-76-7), alcanfor (76-22-2), ácido propanoico (7909-4), benzaldehido (100-52-7), octanol (111-87-5), ácido butírico (107-926), benzoato de metilo (93-58-3), naftaleno (91-20-3), benzoato de 2propenilo (583-04-0), 4-tert-butilfenol (98-54-4) suministrados por Aldrich Química S.A (Madrid, España). Diclorometano, acetona y ácido acético (6419-4) suministrados por Chemie S.A (Sentmenat, España). Todos los disolventes fueron de grado de HPLC. Se utilizó:  Disolución A de 4-tert-butilfenol a 1000 µg/g en diclorometano utilizada como estándar interno.  Disolución B de 4-tert-butilfenol a 1000 µg/g en acetona utilizada también como estándar interno. Tenax TA 80/100 suministrado por Supelco (Bellefonde, Estados Unidos) 2.1.2. LAMINADOS Y ADHESIVOS De los laminados [sustrato-adhesivo-sustrato] suministrados por las distintas compañías Europeas en el PROYECTO MIGRESIVES, cuyos ensayos previos se han descrito en el capítulo 2, se escogieron los doce laminados que estuvieran formados con los adhesivos que se habían estudiado en el capítulo anterior es decir; VAE_04, T_01, Alm_01, PVA_01 y AC_03. En este capítulo se estudiará la migración de los compuestos Capítulo 5  266   Se obtuvieron buenos resultados en términos de linealidad, límites de detección y límites de cuantificación y de RSD. Los límites de detección, estaban comprendidos entre 0,01 µg/dm2 (tolueno) y 25,7 µg/dm2 (ácido acético). Y los valores de RSD estuvieron en todos los casos por debajo de 9.74 %. La mayoría de compuestos odorantes identificados en el capítulo anterior eran de clase 1 según las reglas de Cramer (Tabla 5.4 y 5.5). Tres compuestos presentaban clase II de toxicidad como el ciclohexanol, benzoato de alilo y calameneno y tres compuestos presentaban toxicidad de clase III (alta); 2,4,6-trimetil-1,3,5-trioxano, alcanfor y naftaleno. Las Tablas 5.4 y 5.5 muestran las concentraciones de los compuestos odorantes en los laminados fabricados con los adhesivos VAE_04, T_01 y Alm (Tabla 5.4) y PVA y AC (Tabla 5.5). Estas se expresan en µg de compuesto por dm2 de laminado. Debido a la dificultad de encontrar los estándares de longifoleno (M+ 161) y calameneno (M+ 159) estos se cuantificaron con naftaleno como estándar. Capítulo 5  267   Tabla 5.4: Compuestos odorantes en el adhesivo VAE_04, con sus toxicidades (T), Cp0 en los laminados y valores de migración expresados µg/dm2 laminado y sus MF (%). Mig (µg/dm2) MF (%) Lam_10 0,02±0,002 0,1±0,009 <LOD <LOD (22%) <LOD 0,7±0,08 (51%) <LOD (37%) 0,6±0,04 (35%) <LOD <LOD (38%) <LOD Lam_09 0,02±0,002 <LOQ <LOD <LOD <LOD <LOQ (31%) <LOD (23%) 0,5±0,04 (35%) <LOD <LOD (26%) <LOD Lam_08 0,02±0,002 <LOQ <LOD <LOD <LOD <LOD (24%) <LOD (32%) 0,5±0,03 (28%) <LOD <LOD (24%) <LOD Cp0 (µg/dm2) VAE_04 0,09±0,01 0,1±0,02 <LOD 2,6±0,2 <LOD 1,9±0,3 200±18 2,5±0,2 <LOD 0,6±0,07 <LOD Olor Pintura, humedad Dulce Medicina Resina, verde Fresco, verde Alcanfor Vinagre, agrio Azucar quemado Rancio Aromático, dulce Queso Compuestos (T) Tolueno (I) P-dimetilbenceno (I) 1-butanol (I) 1-hexanol (I) Nonanal (I) Ciclohexanol (II) Ácido acético (I) Benzaldehido (I) Ácido butírico (I) Benzoato de metilo (I) Butirato de metilo (I) Capítulo 5  268   Tabla 5.5: Compuestos odorantes en los adhesivos T_01 y Alm_01, sus toxicidades (T), Cp0 en los laminados y valores de migración expresados µg/dm2 laminado y sus MF (%). Mig (µg/dm2) MF(%) Lam_22 <LOQ <LOQ <LOD (22%) <LOD <LOD  <LOD <LOD (20%) <LOD (22%) <LOD (20%) 1,12±0,07 ( 43% ) <LOD 0,030,008 ( 21% ) <LOQ Lam_21 <LOQ <LOQ <LOD(28%) <LOD <LOD  <LOD <LOD(22%) <LOD(33%) <LOD(22%) 1,3±0,09 ( 45% ) <LOD 0,01±0,008 ( 20% ) <LOQ Cp 0 (µg/dm2 ) Alm_01 <LOQ <LOQ <LOD <LOD <LOD  <LOD <LOD <LOD <LOQ 2,5±02 <LOD 0,2±0,01 1,5±0,1 Mig (µg/dm2) MF(%) Lam_30 <LOD 2,7±0,2 0,6±0,08 (39%) <LOD <LOD <LOD <LOD <LOQ 0,2±0,02 ( 20% ) Lam_29 0,2±0,03 7,3±1,0 (31%) 0,8±0,1 (41%) <LOD 0,1±0,02 ( 22% ) <LOD <LOD 0,2±0,03 ( 28% ) 0,4±0,06 ( 22% ) Cp0 (µg/dm2) T_01 0,2±0,04 7,9±1,2 0,8±0,1 <LOD 0,4±0,06 <LOD <LOQ 0,4±0,05 0,4±0,07 Olor Pintura, humedad Hierba, grasa Punzante, desagradable Medicina Punzante, frutal Gasolina Fresco, verde Vinagre, agrio Rancio Madera , pino Rancio Aromático, dulce Queso Bolas de polillas dulce, floral Picante, herbal Compuestos (T) Tolueno (I) Hexanal (I) 2,4,6-trimetil-1,3,5trioxano(III) 1-butanol (I) Acrilato de butilo(I) P-cimeno (I) Nonanal (I) Ácido acético (I) Ácido propanoico(I) Longifoleno (I) Ácido butirico (I) Benzoato de metilo(I) Butirato de metilo(I) Naftaleno(III) Benzoato de alilo (II) Calameneno (II) Capítulo 5  269   Tabla 5.6: Compuestos en PVA_01 y AC_03, (T), Cp0 y migración (µg/dm2) y sus MF (%). Mig (µg/dm2) MF(%) Lam_34  4,0±0,4  <LOD <LOD 1,1±0,1 ( 31% ) <LOD   2,5±0,3 ( 23% )  <LOD 6,5±0,5 (51%) <LOD <LOD <LOD Lam_33  4,5±0,5  <LOD <LOD 1,1±0,1 ( 31% ) <LOD(20%)   8,5±0,7 ( 52% ) <LOD 25±2,2 (73%) <LOD(21%) <LOD <LOD Cp0 µg/dm2 AC_03  8,7±0,8  0,2±0,02 1,2±0,1 1,2±0,1 0,07±0,06   11±1,4 <LOD 82±7,4 <LOD 1,0±0,08 <LOD Mig (µg/dm2) MF(%) Lam_14 72±6,5 1,2±0,1 44±3,5 ( 23% ) 0,2±0,01 ( 33% ) <LOD <LOD(31%) <LOQ(39%) <LOD Lam_13 65±5,8 1,2±0,1 56±5,1 ( 27% ) 0,2±0,01 ( 34% ) <LOD <LOD(32%) <LOQ(39%) <LOD Lam_12 56±3,9 0,8±0,07 41±3,7 ( 22% ) 0,1±0,01 ( 33% ) <LOD <LOD(27%) <LOQ(33%) <LOD Cp0 µg/dm2 PVA_01 470±42 1,2±0,1 57±6,8 0,3±0,03 9,7±1,2 4,0±0,36 8500±680 <LOD Olor Frutal, dulce Frutal Hierba, grasa Tierra, dulce Medicina Punzante, frutal Gasolina Hierba, resina Verde Punzante Alcanfor Vinagre Verde Alcanfor Musgo Rancio Compuestos (T) Acetato de etilo (I) 2-metil-2-propenoato de metilo ( I ) Hexanal (I) Propanoato de butilo ( I ) 1-butanol (I) Acrilato de butilo ( I ) Estireno (I) 2-octanona (I) 1-hexanol (I) Acetato de 2etilhexil ( I ) Ciclohexanol (II) Ácido acético (I) 2-etil-1-hexanol (I) Alcanfor (III) 1-octanol (I) Ácido butírico (I) Capítulo 5  270   Para el adhesivo VAE_04, el compuesto con mayor concentración encontrado fue el ácido acético con 200±18 µg/dm2. Este ácido se utiliza habitualmente en la fabricación de esta clase de adhesivos, ya que para la producción del monómero, acetato de vinilo, se le añade ácido acético al etileno (Petrie, 2000a). Cuatro compuestos encontrados en el trabajo inicial del Capítulo 4 (Vera, et al., 2012) de identificación en los adhesivos, estuvieron por debajo de sus límites de detección en el laminado lam_08 (1butanol, nonanal, ácido butírico y butirato de metilo). Para el adhesivo T_01 en el lam_29 el compuesto más abundante fue el p-cimeno cuya concentración correspondía a 7,9±1,2 µg/dm2. Este compuesto es un constituyente de los aceites esenciales que provienen de la resina utilizada en la constitución de este adhesivo (Jeong-Ho, et al., 2008; Vera, et al., 2011). Igual que ocurría en el adhesivo VAE_04, tres compuestos encontrados en el trabajo inicial del capítulo, no aparecieron en el laminado (ácido acético, ácido butírico y butirato de metilo) ya que sus concentraciones estuvieron por debajo de los LOD o LOQ. Para el adhesivo de almidón Alm_01 en el laminado lam_21, sólo se cuantificaron tres compuestos (benzoato de metilo, naftaleno y benzoato de alilo) ya que para el resto, sus composiciones estuvieron por debajo de sus LOD o LOQ. El benzoato de metilo se encontró en una concentración de 2,5±0,2 µg/dm2 y el benzoato de alilo de 1,5±0,1 µg/dm2. Los ésteres de benzoatos son comúnmente utilizados como plastificantes (Petrie, 2000a). Para el adhesivo PVA_01, el compuesto más abundante fue el ácido acético, con una concentración de 8500±680 µg/dm2. Como ya se ha comentado anteriormente, este se utiliza para la fabricación del monómero de acetato de vinilo. Otro compuesto identificado fue el acetato de etilo con una concentración de 470±42 µg/dm2. Este es un éster muy volátil, con una Capítulo 5  271   amplia aplicación como disolvente para los plásticos protectores y adhesivos basados en acetato de polivinilo, etil celulosa, acetato butirato de celulosa y propionato de baja viscosidad de acetato de celulosa, polimetilmetacrilato, cauchos de polivinilo-butiral, poliestireno y sintéticos (Petrie, 2000a). El 1butanol también se utiliza como disolvente y presentó una concentración de 57±6,8 µg/dm2. Para el adhesivo acrílico, el compuesto más abundante en el laminado lam_33 fue el 2-etil-1-hexanol (82±7,4 µg/dm2). Este, junto con el acetato de 2-etilhexil (11±1,4 µg/dm2) son impurezas del metacrilato de metilo utilizado para la fabricación de este tipo de adhesivos (Canellas, et al., 2010; Nerin, et al., 2009a). 3.2. ENSAYOS DE MIGRACIÓN Los ensayos de migración se realizaron con Tenax® como simulante alimentario. La Tabla 5.4 muestra las concentraciones de la migración para los laminados fabricados con los adhesivos VAE_04, la Tabla 5.5 los valores de migración para T_01 y Alm_01, y la Tabla 5.6 muestra la migración para los adhesivos PVA_01 y AC_03. Los valores de migración se expresaron en µg de compuesto por dm2 de laminado utilizado para cada experimento y sólo se mostraron las MF (%) mayores de 20%. El 66% de los compuestos detectados en los adhesivos, migraron a Tenax®. Capítulo 5  272   Para el adhesivo VAE_04 (Tabla 5.4), sólo 4 compuestos migraron al Tenax® (tolueno, p-dimetilbenceno, ciclohexanol y benzaldehido) y los valores de migración fueron muy similares entre los laminados, siendo un poco mayores para el laminado lam_10. Este hecho se puede explicar por las características del cartón, ya que cuanto menor es el gramaje o el espesor, como es el caso de los sustrato de cartón que forman este laminado (Tabla 5.1), la difusión se incrementará y por tanto la migración (Dole, et al., 2006; Fieldson and Barbari, 1995; Escobal, et al., 1999; Limam, et al., 2005). Tanto el ciclohexanol como el benzaldehído se detectaron por los catadores con un rango de MF entre 24 y 51 % (Tabla 5.4). Al contrario, algunos compuestos no se detectaron en los ensayos de migración ya que sus valores estaban por debajo de sus LOD o LOQ.Sin embargo, estos se detectaron por los catadores en un rango entre 24% y 38 % (Tabla 5.4) como el ácido acético y benzoato de metilo con olores de vinagre y dulce. Para el adhesivo T_01 (Tabla 5.5), los compuestos que más migraron en ambos laminados (lam_29 and lam_30) fueron el p-cimeno y nonanal. Estos compuestos también se detectaron con una MF (%) de 31 al 41 % respectivamente por los catadores. Los valores de migración de todos los compuestos fueron mayores en el lam_29 que en el lam_30. Este hecho se puede explicar, ya que la migración es un fenómeno de transferencia de materia que está muy relacionado con los coeficientes de partición y de difusión, como se ha demostrado en el Capítulo 1. A su vez los coeficientes de partición entre el adhesivo y los sustratos C y CPP están muy relacionados con la solubilidad de ambos compuestos en ambos medios. Esta solubilidad se conoce como solubilidad de Hildebrand (δ), explicada ampliamente en el Capítulo 1 (AIC, 1984; Durkee, 2004a; Tehrany and Capítulo 5  273   Desobry, 2004). Los compuestos con solubilidad parecida al polímero EVA permanecerán más unidos a este y por tanto la migración disminuirá en el lam_29. Por el contrario, los compuestos con solubilidad parecida al polímero PP tenderán a unirse a este y por tanto la migración se incrementará en el lam_30. La solubilidad de los compuestos encontrados presentará (Barton, 1990b; Barton, 1991) unos valores más cercanos al adhesivo EVA que al PP por tanto sus coeficientes de partición serán más bajos en el lam_29 que en el lam_30. Este hecho podría explicar que la migración sea mayor en el lam_29 que en el lam_30. Además la presencia de PP en el cartón reduce la porosidad del sustrato y por tanto su difusión, con lo cual reduce su migración (Dole, et al., 2006; Fieldson and Barbari, 1995; Escobal, et al., 1999; Limam, et al., 2005). Para el adhesivo de almidón Alm_01 (Tabla 5.5) de los compuestos encontrados en el laminado (benzoato de metilo, naftaleno y benzoato de alilo) este último no migró al Tenax®. El compuesto que presentó una mayor migración fue el benzoato de metilo, con un valor de 1,3±0,09 µg/dm2 en el lam_21 y MF(%) 45%. Algunos compuestos no detectados en el ensayo de migración, se detectaron con un rango de MF (%) comprendido entre 20 y 33 % por los catadores. Por ejemplo, el 2,4,6-trimetil-1,3,5trioxano, ácido propanoico, acético, butírico, con olor a punzante, rancio, vinagre y queso respectivamente. En los laminados que contienen el adhesivo PVA_01 (Tabla 5.6), los compuestos con mayor valor de migración fueron acetato de etilo y 1butanol, ambos compuestos con una alta concentración inicial en el laminado. Aunque el ácido acético tenía una alta concentración en el laminado sus valores de migración, estuvieron por debajo de su LOQ (85,6 µg/dm2, Tabla 5.3) pero tanto este compuesto, como el ciclohexanol se Capítulo 5  274   detectaron por los catadores con unas MF(%) entre 27 y 39%. Sin embargo el acetato de etilo presentó un valor alto de migración, aunque los catadores no fueron capaces de detectarlo, ya que salía al mismo tiempo de retención que el disolvente. De los laminados formados con el adhesivo AC_03 (lam_33 y lam_34), migraron cinco compuestos de los ocho encontrados en el laminado. El compuesto con mayor valor de migración fue 2-etil-1-hexanol con un valor de 25±2,2 µg/dm2 para el lam_33 y 6,5±0,5 µg/dm2 para el lam_34. También en estos casos, los catadores proporcionaron los valores más altos de MF (%) 73 y 52% respectivamente. Aunque el alcanfor no migró, este se detectó por los catadores con 21% de MF(%). Una vez calculadas las MF(%) y las concentraciones de migración en µg de compuesto por dm2 de laminado, para estudiar los posibles riesgos asociados a dichos compuestos , primero se convirtieron los datos en mg de compuesto por Kg de alimento (dividiendo por el factor de dilución de la Tabla 5.1 y asumiendo una densidad del alimento de 1 kg/dm3) y se compararon con los límites de migración específicos SML. Únicamente el tolueno y 2-etil-1-hexanol tienen SML y corresponde a 1,2 mg/Kg (según Real Decreto 847/2011) y 30 mg/Kg (según Reglamento 10/2011/EU) respectivamente. Para los laminados lam_08, 09 y 10, los valores de migración fueron 0,02±0,002 µg/dm2, que corresponden a 3.13 E-7 mg/Kg, 5.87 E-7 mg/Kg and 2.86 E-7 mg/kg respectivamente (para dF de 63,9, 34,1 y 70,1 dm3/dm2 respectivamente) y para 2-etil-1-hexanol en los laminados lam_33 y lam_34 fueron 25±2,2 y 6,5±0,5 µg/dm2 respectivamente, que corresponden a 6,7 E4 mg/Kg and 1,76 E-4 mg/Kg (para dF de 37 dm3/dm2 en ambos laminados). Todos estos valores de migración estuvieron por debajo de sus SML. Capítulo 5  275   Para el resto de compuestos se calculó la ingesta diaria estimada (EDI), según la Ecuación 2.2 y se comparó con los valores recomendados por Cramer de ingesta diaria según su toxicidad, resultando que ningún compuesto superó estos valores. 4. CONCLUSIONES Se ha desarrollado un método GC-O-MS para determinar la migración de los compuestos odorantes presentes en doce de los laminados, formados por cinco adhesivos de diferentes tipos (VAE, termofusible, almidón, PVA y acrílico) que forman parte del envase alimentario. El método ha resultado una herramienta muy útil, no sólo para calcular la concentración de los migrantes y evaluar los posibles riesgos para la salud de la población, sino al mismo tiempo, para estudiar si esta migración puede producir cambios organolépticos en el alimento envasado. Se ha encontrado un amplio rango de compuestos odorantes en los laminados, de los que previamente se habían identificado en los adhesivos, de los cuales un 66% migraban al Tenax ® empleado como simulante alimentario. Aunque sus concentraciones estaban en todos los casos por debajo de sus SML o de los valores recomendados por Cramer. Algunos de los compuestos se encontraron por debajo de sus LOD o LOQ, sin embargo, estos fueron detectados por los catadores con una alta MF (%), por ejemplo, el ácido acético, butírico o ciclohexanol con olor a vinagre, rancio y alcanfor respectivamente. Conclusiones  282   antes estudiados (VAE, PVA, T, AC y Alm). Dichos adhesivos se han extraído por dos metodologías complementarias de extracción HSSPE y HS-SPME, resultando ser unas herramientas muy útiles para identificar un total de treinta y tres compuestos odorantes, entre los que se encontraban varios ácidos, ésteres, alcoholes, etc., los cuales se caracterizaban por diferentes propiedades organolépticas. También se cuantificaron por HS-SPME-GC-O-MS. VI. Se han realizado ensayos de migración para dichos compuestos odorantes identificados para estos adhesivos, llevando a cabo el ensayo de migración para doce laminados formados con estos adhesivos hasta el Tenax ®. Los extractos de migración se han analizado por LE-GC-O-MS resultando una herramienta muy útil, no sólo para calcular los valores de migración y evaluar los posibles riesgos humanos, sino también, para estudiar si los catadores percibían los compuestos migrantes y por tanto, estos podrían producir cambios organolépticos en el alimento envasado. Este hecho resultó ser una herramienta muy interesante para las empresas de adhesivos que podrían remplazar estos compuestos por otros con la misma función pero que no fueran odorantes. De los resultados obtenidos el 66% de los compuestos identificados migraban al Tenax ® y al igual que ocurría anteriormente, se encontraban por debajo de sus SML y de los valores recomendados por Cramer. Algunos de los compuestos migrantes se encontraban por debajo de sus LOD pero los catadores los detectaron. Por tanto, este estudio recalca la importancia de estudiar la migración no sólo de forma tradicional por GC-MS, sino acoplada a olfatometría.  SECCIÓN V LEGISLACIÓN Y BIBLIOGRAGÍA  Legislación y Bibliografía  285   LEGISLACIÓN A Continuación se muestra la legislación, reglamentos y recomendaciones consultadas para la realización de esta Tesis. 1935/2004/EC Regulation (EC) Nº 1935/2004 of the European Parliament and the Council of 27 October 2004 on materials and articles intended to come into contact with food. 2023/2006/EC. Regulation (EC) Nº 2023/2006 of the Commission of 22 December 2006 on good manufacturing practice for materials and articles intended to come into contact with food  10/2011/EU. Commission Regulation (EU) Nº 10/2011 of 14 January 2011 on plastic materials and article intended to come into contact with food. 847/2011. 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