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Abstract
Se requieren niveles óptimos de fluidez de membrana para una fisiología celular adecuada. Nuestro objetivo fue estudiar los efectos del ejercicio agudo y del entrenamiento regular sobre la fluidez de las membranas celulares y mitocondriales, la peroxidación lipídica y la oxidación proteica en los músculos esquelético y cardiaco, hígado y cerebro. 50 ratas macho Sprague-Dawley fueron distribuidas en 5 grupos (n=10) en función del protocolo de ejercicio: control o sedentarias (G1), ejercicio agudo (G2) y entrenamiento de 1, 4 y 12 semanas (G3, G4 y G5, respectivamente). G2-5 fueron sometidos a una prueba aguda progresiva hasta la extenuación en un tapiz rodante. Las cargas de trabajo se determinaron para los grupos de entrenamiento, teniendo en cuenta la velocidad máxima alcanzada. Las sesiones de entrenamiento fueron interválicas, alternando el 80% y el 35% de la carga máxima de trabajo, durante 1 h/día, 4 días/semana. Las membranas celulares y mitocondriales se aislaron a partir de los tejidos por centrifugación diferencial. Se determinó la fluidez por espectroscopía de fluorescencia, utilizando TMA-DPH como marcador fluorescente, y se expresó como el inverso de la polarización medida (1/P). La concentración de malonildialdehído y 4-hidroxialquenales (MDA + 4-HDA) y el contenido carbonilo proteico fueron determinados en los homogeneizados de los tejidos para valorar la peroxidación lipídica y la oxidación proteica, respectivamente. Nuestros resultados muestran que tanto el ejercicio agudo exhaustivo como el entrenamiento regular indujeron rigidez en las membranas celulares y mitocondriales aisladas a partir de los músculos esquelético y cardiaco, y en los sinaptosomas. La fluidez de las membranas mitocondriales hepáticas disminuyó tras el ejercicio agudo, aunque se preservaron los niveles de fluidez en las membranas de los hepatocitos. El ejercicio agudo aumentó los niveles de MDA + 4-HDA, especialmente en músculo esquelético, hígado y cerebro. Además, los niveles de carbonilos proteicos fueron mayores después del ejercicio agudo en el músculo esquelético, el corazón y el hígado. El entrenamiento corto de 1 semana también aumentó estos índices de estrés oxidativo. Sin embargo, el entrenamiento regular de larga duración de 4 ó 12 semanas no afectó ni a la peroxidación lipídica ni al contenido carbonilo proteico. Estos resultados son consistentes con la idea de que el ejercicio exacerba el daño oxidativo, lo que puede contribuir, al menos parcialmente, a explicar la rigidez en las membranas a causa del ejercicio. Piedrafita Trigo, Eduardo; García García, José Joaquín; López Pingarrón, Laura
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2013 30 Eduardo Piedrafita Trigo Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales: su relación con el estrés oxidativo Departamento Director/es Farmacología y Fisiología García García, José Joaquín López Pingarrón, Laura Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es Eduardo Piedrafita Trigo EFECTOS DEL EJERCICIO FÍSICO EN LA FLUIDEZ DE MEMBRANAS CELULARES Y MITOCONDRIALES: SU RELACIÓN CON EL ESTRÉS OXIDATIVO Director/es Farmacología y Fisiología García García, José Joaquín López Pingarrón, Laura Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Universidad de Zaragoza EFECTOS DEL EJERCICIO FÍSICO EN LA FLUIDEZ DE MEMBRANAS CELULARES Y MITOCONDRIALES. SU RELACIÓN CON EL ESTRÉS OXIDATIVO. TESISDOCTORALPRESENTADAPOR D.EduardoPiedrafitaTrigo PARAOPTARALGRADODEDOCTOREUROPEO Zaragoza,2013
JOSÉJOAQUÍNGARCÍAGARCÍA,CatedráticodelÁreadeFisiologíadelDepartamentode FarmacologíayFisiologíadelaUniversidaddeZaragoza,y LAURALÓPEZPINGARRÓN,ProfesoraAsociadadelDepartamentodeMedicina,Psiquiatríay DermatologíadelaUniversidaddeZaragoza, CERTIFICAN: Queeltrabajodeinvestigacióntitulado“Efectosdelejerciciofísicoenlafluidezde membranascelularesymitocondriales.Surelaciónconelestrésoxidativo”,realizadoporD. EduardoPiedrafitaTrigoenelDepartamentodeFarmacologíayFisiologíadelaFacultadde MedicinadelaUniversidaddeZaragozabajonuestradirección,respondeperfectamenteal ProyectodeTesispresentadoconelmismotítuloenelDepartamentodeFarmacologíay Fisiología.Portanto,valoramoselinformedeestaTesiscomoFAVORABLE,alreunirtodoslos requisitosnecesariosparasupresentaciónydefensabajolamodalidaddeMencióndeDoctor Europeo. Zaragoza,a19deDiciembrede2012 JoséJoaquínGarcíaGarcíaLauraLópezPingarrón
Estetrabajosehafinanciadograciasalossiguientesproyectosdeinvestigación: “RedTemáticadeInvestigaciónCooperativaen EnvejecimientoyFragilidad(RETICEF)”(RD06/0013/1017). SubdirecciónGeneraldeRedesyCentrosdeInvestigación Cooperativa.MinisteriodeCienciaeInnovación. “Fisiologíadelenvejecimientoydelestrésoxidativo”(B40). GrupodeInvestigaciónConsolidadodelGobiernodeAragón. Ylassiguientesbecasdeinvestigación: “Becadeformaciónycontratacióndepersonal investigador”paraEduardoPiedrafitaTrigo(B091/2009). GobiernodeAragón. “ProgramaEuropaXXIdeEstanciasdeInvestigación” (853.941798/98600016‐2).Convocatorias2010y2012.Caja deAhorrosdelaInmaculadayGobiernodeAragón.
“Lasideasnoduranmucho.Hayquehaceralgoconellas.” SantiagoRamónyCajal “Eldeportenoforjaelcarácter.Loponedemanifiesto.” HeywoodHaleBroun “Nopuedesmedirtuéxitosinuncahasfallado.” SteffiGraff “Nosefracasahastaquenosedejadeintentar.” FlorenceGriffith “Nadietepuedeobligarahacermásdeloquepuedes.Perosipuedes,dalomejordeti.” Mispadres
ABREVIATURAS
4‐HDA:4‐hidroxialquenales ADN:ácidodesoxirribonucleico ADP:adenosíndifosfato AP‐1:proteínaactivadora1 ATP:adenosíntrifosfato BSA:albúminaséricabovina Ca2+:ioncalcio Cat:catalasa CO2:dióxidodecarbono ●CO3–:radicalcarbonato Cu,ZnSOD:superóxidodismutasadecobre yzinc DNPH:2,4‐dinitrofenilhidrazina e‐:electrón ecSOD:superóxidodismutasaextracelular eNOS:óxidonítricosintasaendotelial ERNs:especiesreactivasdependientesdel nitrógeno EROs:especiesreactivasdependientesdel oxígeno FADH2:flavínadenín‐dinucleótido FC:frecuenciacardiaca GPx:glutatiónperoxidasa GR:glutatiónreductasa GSH:glutatiónreducido GSSG:glutatiónoxidado H+:hidrogenión Hb:hemoglobina HCl:ácidoclorhídrico HClO:ácidohipocloroso HEPES:ácido4‐(2‐hidroxietil)‐piperazina‐1‐ etanosulfónico H2O:agua H2O2:peróxidodehidrógeno HO2●:radicalperhidroxilo HONOO:ácidoperoxinitroso iNOS:óxidonítricosintasainducible KCl:cloruropotásico LH:lípidointacto lpm:latidosporminuto LPO:peroxidaciónlipídica MDA:malonildialdehído MnSOD:superóxidodismutasade manganeso mtNOS:óxidonítricosintasamitocondrial NaCl:clorurosódico NAD+:nicotinamidaadenín‐dinucleótido oxidada NADH:nicotinamidaadenín‐dinucleótido reducida NADP+:nicotinamidaadenín‐dinucleótido fosfatooxidada NADPH:nicotinamidaadenín‐dinucleótido fosfatoreducida NF‐κB:factornuclearκB nNOS:óxidonítricosintasaneuronal ●NO:radicalóxidonítrico NO2:dióxidodenitrógeno ●NO2:radicaldióxidodenitrógeno NOS:óxidonítricosintasa O2:oxígenomolecular 1O2:oxígenosinglete ●O2‐:radicalsuperóxido OH‐:aniónhidroxilo ●OH:radicalhidroxilo ONOO‐:aniónperoxinitrito ONOOCO2‐:ionnitrosoperoxicarbonato P:polarización PA:presiónarterial
PCO2:presiónparcialdedióxidode carbono PO2:presiónparcialdeoxígeno prot.:proteína Q:gastocardiaco R●:radicalalquilo RO●:radicalalcoxilo ROO●:radicalperoxilo ROOH:peróxidolipídico RS●:radicallibreaparrdeátomosde azufre SOD:superóxidodismutasa TBARS:sustanciasreactivasdelácido tiobarbitúrico TCA:ácidotricloroacético THF:tetrahidrofurano TMA‐DPH:1‐(4‐trimetilamoniofenil)‐6‐ fenil‐1,3,5‐hexatrieno‐p‐toluenosulfonato TRIS:tris(hidroximetil)aminometano UV:ultravioleta vF:velocidadfinal VO2:consumodeoxígeno VO2max:consumomáximodeoxígeno Vs:volumensistólico
1 ÍNDICE
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 2
Índice 3 Pág. RESUMEN……..…………………………………………………………………………………………………….................9 ABSTRACT…………………………………………………………………………………………………………................13 1.INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………........17 1.1.Radicaleslibres………………………………………………………………………………………………………19 1.1.1.Concepto…………………………………………………………………………………………………………19 1.1.2.Tipos……………………………………………………………………………………………………………….20 1.1.2.1.Especiesreactivasderivadasdeloxígeno………………………………………………….20 1.1.2.2.Especiesreactivasdependientesdelnitrógeno………………………………………….23 1.1.2.3.Radicalesdeátomosderivadosdelcarbono………………………………………………25 1.1.2.4.Radicalesdeátomosderivadosdelazufre…………………………………………………25 1.1.3.Formaciónenlosseresvivos……………………………………………………………………………25 1.1.3.1.Fuentesendógenasderadicaleslibres……………………………………………………..25 1.1.3.2.Fuentesexógenasderadicaleslibres……………………………………………………….29 1.1.4.Mecanismosdeprotección……………………………………………………………………………..29 1.1.4.1.Antioxidantes………………………………………………………………………………………..30 1.1.4.2.Sistemasreparadores…………………………………………………………………………….31 1.1.5.Estrésydañooxidativo………………………………………………………………………………..…32 1.1.5.1.Peroxidaciónlipídica………………………………………………………………………………32 1.1.5.2.Dañooxidativoalasproteínas…………………………………………………………………34 1.1.5.3.DañooxidativoalADN……………………………………………………………………………35 1.1.5.4.Dañooxidativoalosglúcidos…………………………………………………………………..36 1.1.5.5.Efectodelosradicaleslibresenlasmembranas…………………………………………37 1.2.Ejerciciofísico…………………………………………………………………………………………………………40 1.2.1.Actividadfísicaysalud…………………………………………………………………………………….40 1.2.2.Fisiologíadelejercicio……………………………………………………………………………………..41 1.2.2.1.Clasificacióndelosejercicios…………………………………………………………………..41 1.2.2.2.Fasesdelejercicio………………………………………………………………………………….42 1.2.2.3.Adaptacionesalejercicio………………………………………………………………………..44
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 4 1.2.3.Actividadfísica,radicaleslibresyantioxidantes………………………………………………49 1.2.3.1.Fuentesderadicaleslibresduranteelejerciciofísico………………………………….50 1.2.3.2.Funcionesdelosradicaleslibresenelejercicio………………………………………….54 2.JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………………………………….57 3.OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………………….61 3.AIMS……………………………………………………………………………………………………………………………..65 4.MATERIALYMÉTODOS…………………………………………………………………………………………69 4.1.Animales…………………………………………………………………………………………………………………71 4.2.Materiales………………………………………………………………………………………………………………72 4.2.1.Materialdelaboratorio…………………………………………………………………………………..72 4.2.2.Reactivosquímicos………………………………………………………………………………………….73 4.3.Diseñoexperimental…………………………………………………………………………………………….75 4.3.1.Gruposdeestudio……………………………………………………………………………………………75 4.3.2.Equipoergométrico…………………………………………………………………………………………75 4.3.3.Pruebadeesfuerzomáximo(Protocoloergométricodeejercicioagudo)…………77 4.3.4.Programasdeentrenamiento…………………………………………………………………………78 4.3.5.Procesamientodemuestras……………………………………………………………………………80 4.4.Métodosanalíticos……………………………………………………………………………………………….81 4.4.1.Aislamientodemembranas…………………………………………………………………………….81 4.4.1.1.Tejidomuscularehígado………………………………………………………………………..81 4.4.1.2.Tejidonervioso……………………………………………………………………………………..83 4.4.2.Valoracióndelafluidezdemembrana…………………………………………………………….85 4.4.3.CuantificacióndelMDA+4‐HDA…………………………………………………………………….87 4.4.4.Valoracióndelacarbonilaciónproteica………………………………………………………….89 4.4.5.Determinacióndelaconcentracióndeproteínas…………………………………………….91 4.5.Tratamientoestadístico……………………………………………………………………………………….93 5.RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………………..95 5.1.Estudiosergométricos………………………………………………………………………………………….97 5.1.1.Pruebasdeesfuerzomáximo…………………………………………………………………………..97 5.1.2.Programadeentrenamiento…………………………………………………………………………..98
Resumen 11 Serequierennivelesóptimosdefluidezdemembranaparaunafisiologíacelular adecuada.Nuestroobjetivofueestudiarlosefectosdelejercicioagudoydelentrenamiento regularsobrelafluidezdelasmembranascelularesymitocondriales,laperoxidaciónlipídicay laoxidaciónproteicaenlosmúsculosesqueléticoycardiaco,hígadoycerebro. 50ratasmachoSprague‐Dawleyfuerondistribuidasen5grupos(n=10)enfuncióndel protocolodeejercicio:controlosedentarias(G1),ejercicioagudo(G2)yentrenamientode1,4 y12semanas(G3,G4yG5,respectivamente).G2‐5fueronsometidosaunapruebaaguda progresivahastalaextenuaciónenuntapizrodante.Lascargasdetrabajosedeterminaron paralosgruposdeentrenamiento,teniendoencuentalavelocidadmáximaalcanzada.Las sesionesdeentrenamientofueroninterválicas,alternandoel80%yel35%delacargamáxima detrabajo,durante1h/día,4días/semana.Lasmembranascelularesymitocondrialesse aislaronapartirdelostejidosporcentrifugacióndiferencial.Sedeterminólafluidezpor espectroscopíadefluorescencia,utilizandoTMA‐DPHcomomarcadorfluorescente,yse expresócomoelinversodelapolarizaciónmedida(1/P).Laconcentracióndemalonildialdehído y4‐hidroxialquenales(MDA+4‐HDA)yelcontenidocarboniloproteicofuerondeterminadosen loshomogeneizadosdelostejidosparavalorarlaperoxidaciónlipídicaylaoxidaciónproteica, respectivamente. Nuestrosresultadosmuestranquetantoelejercicioagudoexhaustivocomoel entrenamientoregularindujeronrigidezenlasmembranascelularesymitocondrialesaisladas apartirdelosmúsculosesqueléticoycardiaco,yenlossinaptosomas.Lafluidezdelas membranasmitocondrialeshepáticasdisminuyótraselejercicioagudo,aunquesepreservaron losnivelesdefluidezenlasmembranasdeloshepatocitos.Elejercicioagudoaumentólos nivelesdeMDA+4‐HDA,especialmenteenmúsculoesquelético,hígadoycerebro.Además,los nivelesdecarbonilosproteicosfueronmayoresdespuésdelejercicioagudoenelmúsculo esquelético,elcorazónyelhígado.Elentrenamientocortode1semanatambiénaumentó estosíndicesdeestrésoxidativo.Sinembargo,elentrenamientoregulardelargaduraciónde4 ó12semanasnoafectónialaperoxidaciónlipídicanialcontenidocarboniloproteico.Estos resultadossonconsistentesconlaideadequeelejercicioexacerbaeldañooxidativo,loque puedecontribuir,almenosparcialmente,aexplicarlarigidezenlasmembranasacausadel ejercicio.
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13 ABSTRACT
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 14
Abstract 15 Optimallevelsofmembranefluidityareessentialforanadequatecellphysiology.Our aimwastostudytheeffectsofacuteexerciseandregulartrainingoncellularand mitochondrialmembranesfluidity,lipidperoxidationandproteinoxidationinskeletaland cardiacmuscles,liverandbrain. 50maleSprague‐Dawleyratswerearrangedin5groups(n=10)accordingtoexercise protocol:controlornon‐exercise(G1),acuteexercise(G2)andtrainingof1,4and12weeks (G3,G4andG5,respectively).G2‐5weresubjectedtoaprogressiveacutetestuntilexhaustion inatreadmill.Workloadsweredeterminedfortraininggroups,attendingatthemaximum speedachieved.Trainingsessionswereintervallic,alternating80%and35%ofmaximal workload,for1h/day,and4days/week.Cellularandmitochondrialmembraneswereisolated fromtissuesbydifferentialcentrifugation.Fluiditywasdeterminedbyfluorescence spectroscopy,usingTMA‐DPHasfluorescentprobe,anditwasexpressedastheinverseof polarizationmeasured(1/P).Malondialdehydeand4‐hydroxyalkenals(MDA+4‐HDA)and proteincarbonylcontentweredeterminedinthetissueshomogenatestoassesslipid peroxidationandproteinoxidation,respectively. Ourresultsshowthatboth,exhaustiveacuteexerciseandregulartraining,induced rigidityinthecellularandmitochondrialmembranesisolatedfromtheskeletalandcardiac muscles,andinthesynaptosomes.Hepaticmitochondrialmembranesfluiditydecreasedafter acuteexercise,althoughfluiditylevelswerepreservedinthehepatocytesmembranes.Acute exerciseincreasedMDA+4‐HDAlevels,especiallyinskeletalmuscle,liverandbrain.Also, proteincarbonyllevelswerehigherafteracuteexerciseintheskeletalmuscle,heart,andliver. Short‐trainingfor1weekalsoincreasedtheseindexesofoxidativestress.However,4or12 weeksofregularlong‐termtrainingdidnotaffectneitherlipidperoxidationnorprotein carbonylcontent.Thesefindingsareconsistentwiththeideathatexerciseexaggerates oxidativedamage,whichmaycontribute,atleastpartially,toexplaintherigidityinthe membranesduetoexercise.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 16
17 1. INTRODUCCIÓN
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 18
Introducción 19 1.1. RADICALES LIBRES 1.1.1. Concepto Losátomosestáncompuestosporunnúcleo,formadoporprotonesyneutrones,yuna corteza,deelectrones,quesemuevenalrededordelnúcleoyqueestándispuestosen orbitales.Éstossonlaszonasdelespaciodondelaprobabilidaddeencontrarunelectrónes mayor.Loselectronestienendistintosnivelesenergéticosy,dependiendodeellos,se distribuyenenuntipodeorbitaluotro.Encadaorbitalpuedehaberhastadoselectrones girandosobresupropioeje,debidoaqueéstaeslaconfiguraciónenergéticamásestable,lo quegeneradeestaformaenergíamagnética,quevienedeterminadaporelcuartonúmero cuánticoodespinquepuederepresentarsepor+1/2ó–1/2,segúnelsentidodegirohorarioo antihorario,respectivamente.Sienunorbitalseencuentrandoselectronesapareados,sus sentidosdegirosonopuestos,anulándosedeestamaneralaenergíamagnéticageneradapor cadaunodeellosalgirar(elspin+1/2seanularíaconelspin–1/2),pasandoallamarseéste átomodiamagnético.Loselectronestiendenaasociarseconotroelectrón,deformaque apareansussentidosderotaciónenunsistemadebajaenergía. Unradicallibreesunaespeciequímica,bienseaátomo,moléculaopartedeésta,con existenciaindependiente,yqueposeeunoovarioselectronesdesapareadosensuorbitalmás externo(Halliwell,1991).Elelectróndesapareadotieneunmomentomagnético descompensado,locualhacequelamoléculaposeacargamagnética,llamándose paramagnética.Unradicallibrepuedeserpositiva,negativaonotenercarga.Elradicallibre tiendearecuperarlaestabilidadcediendounelectrón(agentereductor)ocaptandoun electrón(agenteoxidante).Deestaforma,seestabilizaelectrónicamente,aunqueaexpensas dedesestabilizarlamoléculaalaquehadonadoosustraídounelectrón,porloqueéstase convierteenunnuevoradicallibre(Halliwell,1993).Lavidamediadelosradicaleslibreses muycortaydependedeltiempoquetardanenreaccionarconotroátomoomoléculapara conseguircaptarocedersuelectróndesapareadoyasícompensarelspindesuorbitalmás externo.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 20 1.1.2. Tipos Existeunagranvariedadderadicaleslibres,quepuedenserderivadosdeloxígeno,el nitrógeno,elcarbonooelazufre. 1.1.2.1. Especies reactivas derivadas del oxígeno Sedenominanespeciesreactivasdependientesdeloxígeno(EROs)tantoalosradicales librespropiamentedichoscomoasusmoléculasprecursorasyalosderivadosdeéstos. Algunassonverdaderosradicaleslibres,comoelradicalhidroxilo(●OH).Otrassimplemente sonfuentederadicaleslibres,comoelperóxidodehidrógeno(H2O2),sinllegaraser consideradoscomoradicaleslibres,altenersuselectronesapareados(Fig.1). O 2 Oxígenomolecular σ1s σ2s σ*1s σ*2s σ2p π2p π*2p σ*2p 1 O 2 Oxígenosinglete ●O 2‐ Radicalsuperóxido H 2 O 2 Peróxidodehidrógeno Fig. 1: Configuración electrónica de varias especies reactivas dependientes del oxígeno. 1.1.2.1.1. Oxígeno molecular Enlanaturaleza,eloxígeno(O2)apareceenformamolecularodiatómica.Éste contiene16electrones,distribuidosenorbitalesmoleculares.Eloxígenomolecularesun radicallibrecondoselectronesdesapareadosensusorbitalesmásexternos(Fig.1).Ambos
Introducción 27 1.1.3.1.2. Citocromo P450 ElcitocromoP450esunafamiliadehemoproteínaspresentesennumerosasespecies, desdebacteriashastamamíferos,delasquesehanidentificadomásde2000isoformas,cada unadeellasconespecificidaddesustratodiferente.Enlossereshumanos,seencuentran ampliamentedistribuidasportodoelorganismo,especialmenteenlascélulasdelhígadoydel intestino,yprincipalmenteenelretículoendoplasmáticoylasmitocondrias.Salvo excepciones,elcitocromoP450catalizareaccionesdemonooxigenaciónquerequierenoxígeno molecularynicotinamidaadenín‐dinucleótidofosfatoreducida(NADPH)paraoxidarel sustrato,perosólounodelosátomosdeoxígenoesincorporadoenlamoléculadelsustrato, mientrasqueelotroesreducidoaagua.Desempeñaunpapelmuyimportanteenel metabolismodetóxicosy/ofármacos,catalizandoreaccionesquefacilitensumetabolismoy excreción(Hodgson,2004).Sehapropuestolaformaciónde●O2‐porelcitocromoP450cuando seproducelareduccióndirectadeloxígenomolecular(Koop,1992;Goeptarycols.,1995). 1.1.3.1.3. Reacciones de Fenton y Haber-Weiss ElH2O2esunamolécularelativamenteestableenausenciadecatalizadoresque promuevansudescomposición.Sinembargo,enpresenciadeionesdemetalesdetransición, dalugaralaformaciónde●OHyOH‐.Enesteproceso,elmetalactúaúnicamentecomo catalizador. LanecesidaddemetalesdetransiciónenlareaccióndeFentonconviertealhierroyal cobre,muyabundantesenlossistemasbiológicos,enagentesquepuedenagravareldaño oxidativo.Así,losprocesosdecaptaciónydistribucióndelhierro,engeneral,estánmuybien regulados,ylosmamíferosdisponendeproteínasdeuniónaestosmetalescomolaferritina, transferrinayceruloplasmina,queactúancomoalmacenesytransportadoresdeestosmetales eimpidenqueéstosparticipenenreaccionesredox(Halliwell,1991).Enlossistemas biológicos,elhierrolibreestáenconcentracionesmuypequeñasy,generalmente,enforma férricaparaevitarquedesencadeneestareacción. H2O2+Fe2+ ∙OH+OH‐+Fe3+ ∙O2‐+Fe3+ O2+Fe2+ ∙O2‐+H2O2∙OH+OH‐+O2 Fe2+oCu+
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 28 1.1.3.1.4. Oxidasas LasoxidasasmásconocidassonlaNADPHylaxantinaoxidasa.Laprimeraselocaliza principalmenteenlamembranaplasmáticadelosfagocitosactivados(neutrófilos,monocitos‐ macrófagosyeosinófilos).Alencontrarseconunagenteinfeccioso,losfagocitosaumentansu consumodeoxígeno,unfenómenoconocidocomoel“estallidorespiratorio”,quesucedeenla membranaplasmáticadondeseencuentraelcomplejoNADPHoxidasa.Estesistemaacepta electronesdelNADHdelamembranaplasmáticaypuedereducirsustanciasaceptorasde electrones,talescomolostiolesproteicos,aunqueelmayoraceptorfisiológicoeselO2,cuya reducciónconllevalaformaciónde●O2‐(DeGrey,2003;MoldovanyMoldovan,2004).El●O2‐ puedereducirseporlaSODhastaH2O2.Finalmente,lamieloperoxidasaincrementa notablementelaactividadmicrobicidadelH2O2,dadoqueenpresenciadecloruroseoxida paraformarácidohipocloroso(HClO).●OHyHClOseformanenlosfagocitosactivadoscomo mecanismofrenteamicroorganismos(Babior,1978).Losfagocitosdebencontrolardeforma exquisitaestemecanismodefensivo,yaquesisesobreactivapuedecontribuirala etiopatogeniadealgunasenfermedadesconbaseinmunológica,comolaartritisreumatoide (Babior,1978;Moslen,1994). Laxantinaoxidasaseformaporlaconversióndelaxantinadeshidrogenasaen situacionesdehipoxia,isquemiauotrassituacionesdedéficitenergético.Laxantina deshidrogenasaesunaenzimaqueparticipaenelmetabolismodelaspurinas,oxidandola hipoxantinaaxantinayésta,posteriormente,formaácidoúrico,utilizandoelNAD+como aceptordeelectrones(Kinnulaycols.,1995).Ensuformaoxidasa,empleaO2comoaceptorde electrones,loqueproduceradicaleslibres(Radiycols.,1992).Enhipoxia,lahipoxantinaseva acumulandosinpoderseroxidadahastaqueseproducelareoxigenación.Entonces,laxantina oxidasacatalizalaoxidacióndehipoxantinaformandograndescantidadesde●O2‐yH2O2 (Grangerycols.,1981;Saugstad,1990). 1.1.3.1.5. Óxido nítrico sintasa Laóxidonítricosintasaesunafamiliadetresisoenzimasquecatalizanlaformaciónde óxidonítrico:laneuronalylaendotelial,ambasexpresadasconstitutivamenteycuyaactividad estáreguladaporlaconcentraciónintracelulardecalcio(Bredtycols.,1991;Lamasycols., 1992);ylainducible,quelaexpresanlosmacrófagoscuandosonestimuladosporcitoquinas, lipopolisacáridosuotrosantígenos,siendosuexpresiónreguladatantoaniveltranscripcional comopostranscripcional,enlaqueparticipanfactoresdetranscripciónsensiblesalestado
Introducción 29 redox,comoelfactornuclearκB(NF‐κB)olasquinasasactivadaspormitógenos(MAPK) (MoncadayHiggs,1991;Yuiycols.,1991;LowensteinySnyder,1992;MacMickingycols., 1997;Boscaycols.,2005). 1.1.3.1.6. β-oxidación de ácidos grasos Losmicrosomas,tambiéndenominadosperoxisomas,realizanlametabolizaciónoβ‐ oxidacióndelosácidosgrasosconunalongituddecadenade24omásátomosdecarbono,así comoladefenoles,formaldehídosyalcoholes,requiriendolapresenciadeO2ygenerando grandescantidadesdeH2O2(Boverisycols.,1972;BeckmanyAmes,1998). 1.1.3.1.7. Otras enzimas Lalipooxigenasaylaciclooxigenasasonenzimasasociadasalamembranaplasmática queparticipanenelmetabolismodelácidoaraquidónico,generandoradicaleslibresdurante sucatálisis(Frei,1994). 1.1.3.2. Fuentes exógenas de radicales libres Muchosagentesantineoplásicos,talescomolaadriamicinaylableomicina,ytambién algunosantibióticos,sonfuentesderadicaleslibres.Algunosdelosefectosdeestosfármacos sehanatribuidoasucapacidadparareduciroxígenoa●O2‐,H2O2y●OH.Tambiéngeneran radicaleslibreslasradiaciones(rayosXoγ)opartículasradiadas(electrones,protones, neutrones,deuteronesypartículasαyβ),yfactoresambientales,comocontaminantes aéreos,hiperoxia,pesticidas,humosdeltabaco,solventes,anestésicosohidrocarburos aromáticos.Estosagentes,obiencontienenensímismosradicaleslibres(comoelhumodel tabaco),obienseconviertenenellosdebidoasumetabolismo,enelqueactúanenzimas comolasmonooxigenasas(porejemplo,elcitocromoP450olaflavínmonooxigenasa),diversas oxidasas(alcoholdeshidrogenasa,aldehídodeshidrogenasa,aminooxidasas),laepóxido hidrolasa,etc.(Philpot,1991;HalliwellyGutteridge,2007). 1.1.4. Mecanismos de protección Laatmósferadenuestroplanetafueanaeróbicahastalaaparicióndeloxígenohace unos2500millonesdeaños,comoresultadodelaroturadelaguaenelprocesofotosintético delasprimerascianobacterias.ElO2,vitalparalaexistenciadeorganismosaerobios,esala
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 30 vezuntóxico,dadasucapacidaddeformaciónderadicaleslibres.Parasobrevivireneste ambienteaerobioprimitivopocofavorable,losorganismosdesarrollaronunavariedadde mecanismosdedefensaantioxidante. 1.1.4.1. Antioxidantes En1995,Halliwelldefinióunantioxidantecomo“cualquiersustanciaque,abajas concentracionescomparadoconelsustratooxidable,disminuyesignificativamenteoinhibela oxidacióndeestesustrato”(Halliwellycols.,1995).Losantioxidantes,desdelaperspectiva bioquímica,puedenclasificarseenenzimáticosynoenzimáticos.Losprimerossonproteínas depesomolecularelevado,queminimizaneldañooxidativocatalizandoreaccionesquímicas. Losantioxidantesnoenzimáticos,engeneral,sonmoléculaspequeñasquereaccionan directamenteconlosradicaleslibres,evitandoqueejerzansuaccióntóxicasobrelípidos, proteínasyácidosnucleicos.Algunascaracterísticasdelasprincipalesmoléculasantioxidantes presentesenelservivoencondicionesfisiológicasseresumenenlasTablasIyII,enfunción desuactividadenzimáticaono. Tabla I: Resumen de los principales antioxidantes enzimáticos biológicos. GSSG: Glutatión oxidado; GSH: Glutatión reducido; NADP+: Nicotinamida adenín-dinucleótido fosfato oxidada. AntioxidanteLocalizaciónAcción Superóxido dismutasas (SOD) Cu/ZnSODCitosoly lisosomas ●O2‐+●O2‐+2H+O2+H2O2 MnSODMitocondria Extracelular SODPlasma CatalasaPeroxisomasy citosol2H2O22H2O+O2 Glutatiónperoxidasa(GPx)IntracelularH2O2+2GSH2H2O+GSSG Glutatiónreductasa(GR)IntracelularGSSG+NADPH+H+2GSH+NADP+
Introducción 31 Tabla II: Principales antioxidantes no enzimáticos. GPx: Glutatión peroxidasa; GSH: Glutatión reducido; AP-1: Proteína activadora 1; Nf-κB: Factor nuclear Kappa B. AntioxidanteLocalizaciónAcción GlutatiónIntracelular,alveolos, etc. SustratodelaGPx,reaccionacon●OH,●O2‐y radicaleslibresorgánicos,regeneralavitaminaC VitaminaEMembranaslipídicasy lipoproteínas Depura●1O2,●O2‐,●OH,●NOyRO●,detienela peroxidaciónlipídica VitaminaCMedioscelulares hidrofílicos Depura●O2‐,H2O2,●OH,1O2y●NO,formando radicalsemidehidroascorbatoycontribuyeala regeneracióndelavitaminaE ActúacomoprooxidantecuandoreduceFe3+a Fe2+yéstecatalizalareaccióndeFenton VitaminaAMembranaslipídicasDepura●O2‐,ROO●y1O2 ÁcidoúricoAmpliadistribuciónDepura●OH,1O2,HClOyROO● QuelantesEndógenosyexógenosUnenmetalesdetransición BilirrubinaSangre,tejidosReaccionaconROO●y1O2 CoenzimaQCadenadetransporte electrónicomitocondrial Protegefrentealaperoxidaciónlipídica, regeneravitaminaE FlavonoidesExógenosReaccionanconROO●,●OHyel●O2‐ GlucosaAmpliadistribuciónDepura●OH CisteínaAmpliadistribuciónReducecompuestosorgánicosdonando electronesdelsulfhidrilo Melatonina Citosol,núcleo, mitocondria, membranas Depura●OH,●O2‐,H2O2,NO●,HClO,ONOO‐, activaenzimasantioxidanteseinhibeenzimas productorasderadicaleslibres 1.1.4.2. Sistemas reparadores Hayunaseriedeenzimasque,aunqueensentidoestrictonodebenserconsideradas comoantioxidantesyaquenoeliminanradicaleslibres,síqueparticipanenlosprocesosde reparacióndelasbiomoléculasquehansidodañadasporellos.Porunlado,sehademostrado quelaperoxidaciónlipídicaestimulalafosfolipasaA2y,porotro,quelasformasperoxidadas delosfosfolípidossonelsustratopreferidodelafosfolipasaA2(HalliwellyGutteridge,1990b);
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 32 porlotanto,lafosfolipasaA2degradalosfosfolípidosoxidadosdelamembrana(Dempley Halbrook,1983;SevanianyKim,1985;Dizdaroglu,1993).Tambiénpodemosdestacarlas enzimasreparadorasdeADN,lametioninasulfóxidoreductasaylasenzimasproteolíticas intracelulares,queactúandegradandoproteínasoxidativamentedañadas,evitandosu acumulación(Daviesycols.,1986;GiuliviyDavies,1990). 1.1.5. Estrés y daño oxidativo Encondicionesfisiológicas,lageneraciónderadicaleslibresestárelativamentebien contrarrestadaconlossistemasdedefensaantioxidante.Perocuandoserompeelequilibrioa favordelaformaciónderadicaleslibres,segeneraelfenómenoconocidocomoestrés oxidativo.Éstesedefinecomoundesequilibrioentrelasespeciesprooxidantesylas antioxidantes,afavordelasprimeras(SiesyMehlhorn,1986).Asípues,puedeoriginarsepor unexcesodeelementosprooxidantes(exposiciónaradiaciónionizante,radiaciónUVintensa, toxinas,estréspsicológicoofísico,yciertaspatologías),porunadeficienciadeagentes antioxidantes,oporambosfactoresalavez.Laaccióndelosradicaleslibressobrelos constituyentesestructuralescelularesproduceunaagresióninternacontinuada,queamenaza laintegridadfuncionaldetodaslasbiomoléculas.Lasconsecuenciaspatológicasdependerán entoncesdeltipodeconstituyentecelularquesedañe. 1.1.5.1. Peroxidación lipídica Loslípidos,elcomponenteestructuralmásabundantedelasmembranasbiológicas, sonlasmoléculasmássusceptiblesdeseratacadasporradicaleslibres,especialmenteaquéllos queposeenmayornúmerodedoblesenlaces,esdecir,losformadosporácidosgrasos poliinsaturados(CheesemanySlater,1993;Gutteridge,1995).Losradicaleslibresquepueden iniciarestareacciónson:●OH,1O2,ozono,RO●yROO●(Kannerycols.,1987;Halliwell,1990). Elprocesodeataqueoxidativoaloslípidossedenominaperoxidaciónlipídica(LPO). Lareaccióncomienzacuandounradicallibreatacaauncarbonodelacadenaalifática deunácidograsoyleextraeunátomodehidrógeno.Estareacciónseproduceprincipalmente enloscarbonoscontiguosadoblesenlacesdeácidosgrasospoliinsaturados.Esteradical centradoenunátomodecarbonoreaccionaconelO2yformaunROO●yotrasmoléculas comoendoperóxidos,hidroperóxidosycicloperóxidos(Curtisycols.,1984).ElnuevoROO● formadoescapaz,asuvez,deextraerotroátomodehidrógenodeunfosfolípidoadyacente,
Introducción 33 formandounradicalalquilo(R●)yunperóxidolipídico(ROOH),propagandoasíunareacción encadenaqueseextiendeportodalamembrana(Kannerycols.,1987;Huntycols.,1988).La reacciónsóloterminacuandolosradicaleslibresinteraccionanconmoléculasantioxidanteso bienmediantelafragmentacióndelosácidosgrasosenungrannúmerodeproductoshasta queseagotaelsustrato,loqueimplicalamuertecelular.Deformaesquemática,lareacción delaperoxidaciónlipídicasedivideencuatropasos:iniciación,propagación,ramificacióny terminación(Fig.3).Además,laoxidacióndelosácidosgrasospoliinsaturadosproducela formacióndeunionescruzadasbienentrefosfolípidosobienentrefosfolípidos,yproteínas (BruchyThayer,1983;Curtisycols.,1984).Estasalteracionesestructuralessonlasprincipales responsablesdelaapariciónderigidezenlasmembranasbiológicascuandoéstasson expuestasaradicaleslibresy,portanto,determinansupérdidafuncional(Dobretsovycols., 1977;BruchyThayer,1983;Schroeder,1984;Garzettiycols.,1993;ChenyYu,1994). Entrelosproductosformadosdestacanelmalonildialdehído(MDA)ylos4‐ hidroxialquenales(4‐HDA),cuantificadosenestetrabajocomoindicadoresdelgradodeLPO. Estosproductostambiénpuedensermoléculasmuytóxicascapacesdeprovocargraves alteracionesenlamembrana,comomodificacionesenlasproteínasquelaintegran (Esterbauerycols.,1991;Subramaniamycols.,1997;Refsgaardycols.,2000;Zarkovic,2003), einclusolarupturadelamembrana(Halliwell,1990).
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 34 Fig. 3: Reacciones principales de la peroxidación lipídica. ●RL: radical libre, LH: lípido intacto, MDA: malonildialdehído, 4-HDA: 4-hidroxialquenales. 1.1.5.2. Daño oxidativo a las proteínas Lasproteínasconstituyenaproximadamenteun68%delpesosecodelascélulas (Davies,2003),porloquesonunblancoimportanteparalosradicaleslibres.Todoslos aminoácidospresentesenlasproteínastienenresiduossusceptiblesdesufrirdañooxidativo. Estaoxidaciónpuededarlugaraunaalteracióndelaestructuracausandocambios conformacionalesdelaproteínay,porlotanto,unadisminuciónopérdidacompletadesu función.Dentrodelosaminoácidos,latirosina,lafenilalanina,eltriptófano,lahistidina,la metioninaylacisteínasonlosquepresentanmayorpredisposiciónaseroxidados(Daviesy Goldberg,1987). Lasalteracionesbioquímicasqueproducenlosradicaleslibresenlasproteínasincluyen oxidacionesdelascadenaslaterales,fragmentacióndelacadenapeptídica,formaciónde enlacescruzadosentreproteínas,modificacióndelospuentesdisulfuroylosenlacesno covalentes(comolosdehidrógeno),cambiosdeconformación,alteracióndelahidrofobicidad,
Introducción 35 yadquisicióndeotrosgruposreactivos(como,porejemplo,la3,4‐dihidroxifenilalanina,los hidroperóxidosyloscarbonilos)(DaviesyGoldberg,1987;Deanycols.,1997;Stadtman,2001; Davies,2003).UncasoadestacarescuandoelH2O2ylasformasreducidasdelhierroycobre interaccionanenlossitiosdeunióndeestosmetalesalasproteínas,produciendoradicales libresqueoxidaninmediatamentealosresiduosdeaminoácidosvecinos.Enmuchasenzimas, estesitiodeunióndemetalespuedeserelcentroactivo,porloqueelataquederadicales libresanularíasufuncionalidad(Stadtman,1993). Aunquelareaccióndelasproteínasconlosradicaleslibresnosepuedeconsiderar comounareacciónencadenaperse,tambiénseproduceunaseriedereaccionessucesivas (Fig.4)(HeadlamyDavies,2003): Fig. 4: Reacciones de los radicales libres con las proteínas. Enlosprocesosdedañooxidativoaproteínas,algunosaminoácidos,talescomola lisina,prolinayargininaseoxidan,proporcionandogruposcarbonilo,demodoqueel contenidoencarbonilosdelasproteínassepuedeemplearcomounindicadordedaño oxidativoalasmismas(Stadtmanycols.,1992).Enestetrabajo,sehacuantificadolaaparición deestosrestoscomoindicadorbioquímicodelaoxidacióndelasproteínas. 1.1.5.3. Daño oxidativo al ADN ElADNtambiénesmuysusceptiblealdañooxidativo.Eloxígenoescapazde combinarseconlasbasesolosglúcidosdelADN.Cuandounradicallibreatacaauna desoxirribosadelADN,generalmenteseproduceunarupturadelacadena.Sinembargo,la cadenacomplementaria,quepermaneceintacta,puedemantenerjuntoslosdosextremosde lacadenadañadahastaqueactúenlasenzimasreparadoras.Deestemodo,estetipodedaño habitualmentenoescríticoparalacélula,salvoquelaroturaseencuentrecercanaalasdos
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 36 cadenas(BreenyMurphy,1995).LaadicióndelosradicaleslibresalasbasesdelADNesmás habitual,ydalugaraunagranvariedaddeproductosderivados,siendounodelosmás importantesla8‐hidroxi‐deoxiguanosina.TambiénsepuedenformarpuentescruzadosADN‐ proteína.Lacantidaddelnucleótido8‐hidroxi‐deoxiguanosinatisularoenorinasepuede utilizarcomoíndicedeldañooxidativoalADNinvivo(Fragaycols.,1990). CuandolareplicacióndelADNdañadotienelugarantesdelareparación,ocuandoel ADNalteradosereparademaneraincorrecta,tienelugarunamutación(Halliwell,1991;Breen yMurphy,1995).LaslesionesoxidativasalADNylamutagénesissoncausasimportantesdel cáncer(Amesycols.,1993).Secreeque,almenos,enelcasodelADNnuclear,elhierro desempeñaunpapelimportanteeneldañooxidativo.SielH2O2llegaalnúcleo,enpresencia dehierroferrosogenera●OH,queatacaalazúcaroalabase,produciendoroturasdehebray modificacionesenlasbases(Imlayycols.,1988). EldañooxidativoalADNmitocondrialesunas15vecessuperioraldelADNnuclear (Richterycols.,1988).Lamitocondriaeslaprincipalfuentederadicaleslibresenreposo,los cualesactuaríansobreloslípidosdelamembranamitocondrial,lasproteínasdesussistemas enzimáticosy,fundamentalmente,sobreelADNmitocondrial.Además,ésteesmuy susceptiblealdañooxidativodebidoaque,alcontrarioqueelADNnuclear,carecedelos mecanismosdereparaciónadecuadosynotienelaprotecciónquesuponenlashistonasy poliaminas(SchapirayCooper,1992).Estohallevadoapensarqueeldañooxidativosobre estructurasmitocondrialesdesarrolleunpapeldeterminanteenlosprocesosde envejecimiento:ladenominada“teoríamitocondrialdelenvejecimiento”,inicialmente propuestaporHarmanen1972ydesarrolladaporMiquelen1980(Harman,1972;Miquely cols.,1980). 1.1.5.4. Daño oxidativo a los glúcidos Losmonosacáridosydisacáridosresistenlaaccióndelosradicaleslibresdeoxígeno.La glucosa,lamanosayelmanitolsondepuradoresdel●O2‐;alretenerloeimpedirsuacción sobreotrasmoléculas,actúancomoagentesprotectorescelulares(Albertiniycols.,1996).El dañooxidativoalosglúcidosrevistegranimportanciacuandosetratadepolisacáridosde funciónestructural,yaquelospolisacáridossondespolimerizados(MonboisseyBorel,1992). Uncasoespecialeseldelácidohialurónico,cuyafunciónestructuralescontribuirala viscosidaddelfluidosinovial.Laexposiciónaagentesoxidantes,sobretodoal●O2‐,provocasu fragmentación,loqueconducealadesestabilizacióndeltejidoconectivoyalapérdidade
Introducción 43 Fig. 8: Fases de consumo de oxígeno durante el ejercicio. Modificada de Wilmore y Costill, 2004. 1.2.2.2.2. Fase de estabilización Tambiénllamadoestadoestableosteadystate.Enestafase,elVO2yelgastocardiaco alcanzanunameseta,yaqueapareceunequilibrioentredemandaydisponibilidaddeoxígeno ylossustratosenergéticosenlostejidosactivos,principalmentelosmúsculos(Fig.8). 1.2.2.2.3. Fase de fatiga Seproducedebidoaquelademandadeenergíaesmayorquesuproducción.Esto,a suvez,puededeberseadiferentesfactores:deplecióndelossustratosenergéticos, insuficienciadeoxígenoenlascélulas,pocaeficienciadelasenzimasquecatalizanestas reacciones,problemasderivadosdeldesgastemecánicodelasfibras,etc.Aparecesóloenlos ejerciciosmáximos,yaquecuandoessubmáximoelejerciciofinalizaantesdequesealcance estafase. 1.2.2.2.4. Fase de recuperación Comienzaunavezqueelesfuerzofísicohaconcluido.Seproduceundescensodela captacióndeO2,delaFC,delapresiónarterial(PA),etc.,acercándoseestosvalores progresivamentealosnivelesdereposo.Sedesarrollaendossubfases:unarápida,quedura aproximadamenteunminuto,yotralenta,demayorduración,enlaquesellegahastael estadodereposo(Fig.8).
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 44 1.2.2.3. Adaptaciones al ejercicio Duranteelejercicioseproducenunaseriedecambiosenvariosaparatosysistemas.A continuaciónreseñamoslosmásimportantes: 1.2.2.3.1. Sistema cardiovascular y hematológico Elsistemacardiovascularesuncircuito,formadoporunabomba(corazón)quemueve unfluido(sangre)atravésdeunoscanales(vasossanguíneos).Alaumentarlasnecesidades metabólicasduranteelejercicio,estesistemadetransportedebeadaptarsealosnuevos requerimientos. LaFCconstituyeunodelosindicadoresmássencilloseinformativossobrela adaptacióncardiacaalniveldeesfuerzorealizado.Enreposo,paraunindividuodeedad media,laFCnormalsesitúaentre60y80latidosporminuto(lpm).Alcomenzarunacargade trabajofísico,sobretodosiesderesistencia,laFCaumentaprogresivamenteenproporcióna laintensidaddelejerciciohastaalcanzarunameseta.Sielesfuerzofísicoaumenta nuevamente,laFClohacedemaneraanálogahastaestabilizardenuevounameseta.Cuando elejercicioseprolongamuchoosilaintensidadalcanzadaesmáxima,laFCaumentaráhasta llegaraunlímitequenosepuedesobrepasar,alquellamaremosFCmáxima.Enejerciciosde fuerzaesteaumentoesmenorqueenlosderesistencia,yaquehaymenostiempoparaquese produzcalaadaptación.LaFCmáximaesunvalorquesemantieneconstanteduranteunlargo periododetiempoysufrepocoscambiosconlaedadoelentrenamiento;portanto,tomar estevalorcomoreferenciaesútilalahoradedefinirlaintensidaddeunejercicio(Wilmorey Costill,2004). Enloreferentealentrenamiento,laFCenreposodesciende.Además,enpersonas entrenadasquerealizanejerciciosdetiposubmáximo,seregistranFCmenoresfrenteaun mismoniveldeintensidaddeesfuerzo,mientrasquelaFCmáximatiendeasermásestable, aunquepuededisminuirlevementeparaoptimizarelgastocardiaco.Otradelasadaptaciones eslaquesuponeaminorareltiempoderecuperacióntraselesfuerzo.Dehecho,este parámetropuedeutilizarseparadeterminarelgradodemejoraenelrendimientodeunsujeto querealizaunprogramadeentrenamiento. Otramedidaquedefinelaefectividaddelcorazóneselvolumensanguíneoquese eyectaencadalatido,denominadocomovolumensistólicodeeyección(Vs).Alcomenzarel ejercicio,elVsseelevarápidamentehastaalcanzarelniveldel40‐60%desucapacidad
Introducción 45 máxima,apartirdelcualsemantienecasiestable.Enreposo,elVsdeeyecciónparauna personanoentrenadaesdeunos70‐80mL,mientrasque,medianteunentrenamientode resistencia,estevolumenpuedellegarhastalos80‐110mLenreposo(WilmoreyCostill, 2004).ElaumentodelretornovenosoesunodelosfactoresqueinfluyeenelVs,yaqueal llegarmássangrealcorazónydistendersemáslaparedventricular,seprovocaunaumentoen lafuerzadeeyeccióndelasangre,efectoconocidocomoel“mecanismodeFrank‐Starling”. LosincrementoscombinadosdelaFCydelVsduranteelejerciciofísicoagudoimplicanuna elevacióndelgastocardiaco,queesproporcionalalniveldelesfuerzodesarrollado(Fig.9).Así, esteparámetro,queenreposoesdeunos5‐6L,duranteunesfuerzomáximopuedeaumentar hastalos20‐35L. Fig. 9: Relación entre gasto cardiaco (Q), volumen sistólico de eyección (Vs) (—) y frecuencia cardiaca (FC) (- -) en latidos por minuto (lpm). Adaptada de Guyton y Hall, 2006. Comoconsecuenciadelaumentodelgastocardiaco,laPAseeleva.Enejerciciosde resistencia,laPAsistólicaaumentaenproporcióndirectaalaintensidaddelejercicio,siendo posiblescifrasde240–250mmHgenpersonasjóvenes(Berneycols.,2009).Estaadaptación ayudaalasangreacircularmásrápidamenteporlasarteriasy,portanto,aumentaelflujoque llegaaloscapilares,loquemejoralairrigacióndelostejidosactivos,alavezqueincrementael hematocritoporhemoconcentración.Estapolicitemiarelativa,producidaduranteelejercicio físicoagudo,mejoraelrendimientodelsistemadetransportedeoxígenoenunmomentoen elqueelorganismodemandamayoresrequerimientosdebidoalaltoconsumomuscular.Por elcontrario,laPAdiastólicaapenassufrecambiosenejerciciosderesistencia.Enejerciciosde fuerzaambaspresiones,sistólicaydiastólica,aumentandeformaconsiderable.Enestetipode ejercicios,laPApuedealcanzarinclusovaloresquesuperenlos350‐480mmHgdesistólicaal
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 46 acompañarsedelamaniobradeValsalva(MacDougallycols.,1985).Despuésdeunprograma deentrenamiento,laspersonashipertensasexperimentanundescensoenlosnivelesbasales dePA,especialmenteenlasistólica(WilmoreyCostill,2004). Ellechovasculartambiénseadaptaredistribuyendolasangrehacialostejidosque másnecesidadestienen,hechoqueseproducegraciasaunavasoconstricciónesplácnicay renal,circulacionesconapenasactividadduranteelejerciciofísico,yunavasodilataciónanivel muscular.Porotraparte,algunosórganos,comoelcerebro,debenmantenerunairrigación constante.Elaumentodelmetabolismomuscularduranteelejercicioconllevaefectoslocales, comounincrementodelaacidosis,delaconcentracióndeCO2ydelatemperatura,asícomo undescensodelapresiónparcialdeO2(PO2).Estocontribuyealaregulacióndelflujo sanguíneomuscular.Graciasaestaacidosisehipertermia,lacurvadesaturacióndela hemoglobina(Hb)sedesplazaaladerecha,esdecir,sefacilitalaliberacióndeloxígenoyaque éstesedisociadelaHbconmásfacilidad(GuytonyHall,2006)(Fig.10).Encambio,el aumentodelavelocidaddelacirculaciónsanguíneadurantelaactividadfísica,combinadocon laaccióndelosradicaleslibresgenerados,produceunahemólisis,loquereducelacantidadde glóbulosrojosdisponiblesparaeltransportedeoxígenoydeterminaladenominadaanemia deldeportista(WilmoreyCostill,2004). AB Fig. 10: Efecto del pH (A) y de la temperatura (B) en la curva de saturación de la hemoglobina. Adaptada de Wilmore y Costill, 2004. Elentrenamientotambiénproduceunaelevacióndelvolumenplasmático, posiblementeacausadelaaccióndehormonas,comolaaldosterona,oalaumentodelas proteínasplasmáticas,principalmentelaalbúmina(Yangycols.,1998).Esto,unidoala disminucióndelaagregaciónplaquetariaqueproduceelentrenamiento,reducelaviscosidad
Introducción 47 sanguíneay,así,facilitalacirculación(LippiyMaffulli,2009).Lahemodiluciónprovocadapor elentrenamientoconllevaarequerirmenoresnecesidadescardiocirculatoriasduranteel reposo,conlaconsecuentedisminucióndeltrabajocardiacoydelasresistenciasperiféricas. Finalmente,trasunentrenamientoderesistencia,elcorazónaumentasuvolumen, pesoygrosordelaparedventricular.Estosedebeaqueelmiocardiosehipertrofia,aligual quepuedesucederconelmúsculoesquelético.Estaadaptaciónseconocecomocorazóndel deportista(WilmoreyCostill,2004). 1.2.2.3.2. Aparato respiratorio Duranteelejercicioagudolaventilaciónaumenta,reduciéndoseladuracióndela inspiraciónyaumentandosuprofundidad.Paraello,lapresiónintratorácicasenegativiza rápidamentegraciasalaaccióndelosmúsculosinspiratoriosprincipalesyaccesorios.Lafase deespiracióntambiénseacorta.Éstadejadeserunfenómenopasivodebidoaloselementos elásticospulmonares,comosucededuranteelreposo,yaqueentranenacciónlosmúsculos espiratorios.Lafrecuenciarespiratoriaaumentade12ventilacionesporminuto(ciclos/min)en reposohasta45‐50ciclos/min.Graciasaello,elvolumendeairemovilizadoduranteun esfuerzofísicoagudopuedealcanzarlos120‐200L/minenpersonasentrenadas(Wilmorey Costill,2004).Enreposo,laventilaciónsemantienesimilartantoensujetossedentarioscomo entrenados. Duranteelejercicio,losgradientesalveolo‐capilaresdelosgasesrespiratorios aumentan,loquefacilitaladifusióndelosgasesrespiratorios.Aestosesumaunaumentoen elflujosanguíneopulmonar,enespecialenlosvértices,laszonaspeorperfundidasenreposo. Comoconsecuencia,haymássangreenloscapilaresperialveolaresparacaptarelO2(Wilmore yCostill,2004). Unparámetrodecapitalimportanciaenlavaloraciónfuncionaldeldeportistaesel VO2,quevienedeterminadoporlaventilaciónydifusiónpulmonar,eltransportedeO2,yla captacióndeésteporlascélulas.Enreposo,seproduceunligeroaumentodelVO2en deportistasmuyentrenados,debidoalaelevacióndesumetabolismobasal,ydurantelos ejerciciossubmáximosapenasseapreciaalgunavariación.ElVO2máximo(VO2max)esel mayorniveldeVO2alcanzablealrealizaresfuerzosfísicosdegranintensidad.Cuantomayor seaelesfuerzorealizado,elVO2aumentarámás,hastaalcanzarunlímiteapartirdelcual, aunqueseproduzcaunincrementodelacargadetrabajo,elVO2seestabilizaráoinclusose reducirámuyligeramente.Estefenómeno,conocidocomomesetadelVO2,mejoraconel
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 48 entrenamientoderesistencia(Pollock,1973),aunqueseconsideraquesufactordeterminante eselgenético. 1.2.2.3.3. Adaptaciones metabólicas Lasfibrasmuscularesesqueléticas,aligualquelamayoríadelascélulasdelorganismo, puedenobtenerlaenergíanecesariaparasucontracciónapartirdevariasfuentesenergéticas. Tantolacantidaddeenergíaquenecesite,comolarapidezenlademanda,definiránquévía metabólicautilizaelmúsculopreferentementeparaconseguirelATP.Deestamanera,la energíanecesariaparadesempeñarejerciciosdeintensidadleveomoderada,odelarga duración,provienefundamentalmentedelavíaaeróbica;esdecir,delmetabolismodelos hidratosdecarbonoylasgrasasconlaparticipacióndeloxígeno.Engeneral,sepuedeafirmar quelaenergíanecesariapararealizaractividadesfísicasdelargaduraciónprocede principalmentedelaoxidacióndeglucosaenlasmitocondrias,conunapequeñaaportaciónde lasreaccionesanaeróbicasquetienenlugarenelcitosol.Anteunademandasúbitadeenergía, eslavíaanaeróbicalaqueesutilizadarápidamente.Suprincipallimitacióneselbajo rendimiento,yaqueproporcionamuchamenosenergía,ygeneraproductosdedesechoque alteranlafisiologíamuscular,comoelácidolácticoosubaseconjugada,ellactato,concuya mediciónpodemosestimarelusodeestavíametabólica. Conseguirlaenergíaexclusivamenteapartirdeunsistemaenergéticoesmuydifícil debidoalsolapamientodetodaslasvías,aunquesiemprepredominaunasobrelaotra(López ChicharroyAznarLaín,2004).Segúnunplanteamientoclásico,elsistemaanaeróbico glucolíticopredominabasobreelaeróbicohastalos120segundosdeejecucióndelejercicio, momentoenelqueseproducíalatransiciónafavordelaeróbico.Estosedebeaquela activacióndelavíaaeróbicanoesinmediata,sinoquetardaesetiempoenalcanzarseelnivel delasexigenciasenergéticas.Enlosúltimosaños,esteplanteamientosehacuestionado,ya queesapartirdelos60segundosdeejerciciocuandolavíaaeróbicacobraunmayor protagonismoquelavíaanaeróbicaglucolítica(YamamotoyKanehisa,1995). Enejerciciosdebajaintensidad,eldéficitdeoxígenoesmuypequeño,ylaenergía necesariaseobtieneprincipalmentedelaoxidacióndeácidosgrasosehidratosdecarbono desdeelprincipio.Amedidaqueseincrementalaintensidady,portanto,lanecesidadde energía,lavíaanaeróbicavaadquiriendomayorrelevancia,loqueconllevaalaelevacióndel lactatoenlasangre.Sicontinúacreciendolaintensidaddelejercicio,llegaráunmomentoenel quenosepuedaconsumirmásoxígeno,esdecir,sehabráalcanzadoelVO2max.El denominadoumbralanaeróbicoreflejalaincapacidaddeaportarelsuficienteoxígenoalas
Introducción 49 célulasactivasparamantenerlavíaaeróbica(Hillycols.,1924).Laintensidaddelejercicio podráseguiraumentandohastaquelavíametabólicaanaeróbicaseagote,momentoenel quesealcanzalaintensidadmáximadetrabajo. GraciasalaumentodelaconcentracióndeácidolácticodisminuyeelpHlocal,loque provocavasodilatación,permiteunamejordisociacióndelO2delaHby,portanto,puede aprovecharsemejoreloxígenotransportadoporloshematíes.Perosilaacidosisesmuy marcadapodríaafectaralaactividaddelasenzimasquecatalizanlasreaccionesde produccióndeenergía.Paracontrarrestarla,poseemossistemasamortiguadorescomoeldel bicarbonato,unamortiguadorbiológicomuyrelacionadoconlaventilaciónpulmonar.El aparatorespiratorio,acortoplazo,yelriñón,alargoplazo,sonlosprincipalesórganos reguladoresdelpHsanguíneo(GuytonyHall,2006). Conelentrenamientoseproduceunaumentodelacapacidadaeróbica,loque permiteconsumirmásoxígenoduranteelejercicio,aumentandoasílaintensidaddetrabajo máximoquesepuederealizar(GetchellyMoore,1975;Orlanderycols.,1977;Hicksonycols., 1982).Enestesentido,elentrenamientopuedemejorarelVO2maxentornoaun15‐20% (Pollock,1973). 1.2.3. Actividad física, radicales libres y antioxidantes Fueenlosaños70cuando,porprimeravez,sepropusoqueelejercicioproducíaun incrementodelestrésoxidativoaldemostrarseaumentosdelaLPO,tantoenhumanos, midiendoelpentanoespiradodespuésderealizarunacicloergometría(Dillardycols.,1978), comoenratastrasnadarhastalaextenuación,analizandoelaumentodesustanciasreactivas deácidotiobarbitúrico(TBARS)(Bradyycols.,1979).Enlos80,Daviesycols.(1982a) describieronqueenelmúsculoteníalugarunasobreproduccióndeEROsresponsablesde estrésoxidativodurantelaactividadfísica.Estasituaciónconfirmólahipótesispreviamente planteadadequelaprácticadelejerciciofísicoerapotencialmentedañinaparalosmúsculos (BoverisyChance,1973).Posteriormente,elobjetivodelainvestigaciónsobreelestrés oxidativodurantelaactividadfísicasecentróenconocerquésustanciaspodíanprotegernos deestedaño,porloquecomenzóaestudiarseelpapeldelosantioxidantesenlaprotección delasorganelascelulares(Daviesycols.,1982a;Quintanilhaycols.,1982).Así,Jacksonycols. (1983)comprobaronlosbeneficiosdelavitaminaEenlareduccióndeldañomuscularcausado porelejerciciofísico,yqueladeplecióndeéstaaumentabalalesióndelamembranamuscular (Jacksonycols.,1985).EstoshallazgosobtenidosconvitaminaEimpulsaronotrosestudios
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 50 acercadelefectodelasuplementaciónantioxidanteconresultadossimilares(Kumarycols., 1992;Kanterycols.,1993;Goldfarbycols.,1994). Hastaesemomentoseutilizaronúnicamentetécnicasparavalorarlosproductosdela peroxidaciónlipídica(Dillardycols.,1978;Bradyycols.,1979),aunqueDavies,Jacksonysus respectivoscolaboradoresemplearontambiénlaespectroscopíaderesonanciadelspin (Daviesycols.,1982a;Jacksonycols.,1985).Deestaforma,demostraronlaliberaciónde●O2‐ porelmúsculoencontracción(Reidycols.,1992ayby1993),lageneraciónde●NOporel músculoesquelético(BalonyNadler,1994;Kobzikycols.,1994)ysedetectólaformaciónde ●OHenelmúsculoactivo(Diazycols.,1994;O'Neillycols.,1996). LaSODesunaenzimafundamentalenlaregulacióndelestadoredoxdelacélula.El efectodelejercicioensuactividadfueinvestigadoenladécadadelos80(Jenkinsycols.,1984; Higuchiycols.,1985;Kanterycols.,1985;AlessioyGoldfarb,1988).Sucapacidadde adaptaciónalejercicio,tantoagudocomocrónico,sobretodoenlasfasesinicialesdela recuperación,sehadescritoaniveldelcorazón,aparatorespiratorioymúsculoesquelético(Ji ycols.,1988;Hammerenycols.,1992;Jiycols.,1992;Criswellycols.,1993;Ji,1993;Powersy cols.,1993,1994ayb;Tianycols.,2010). Tambiénsehaestudiadolafunciónantioxidantedelglutatiónduranteelejercicio.Sus nivelessemodificarondurantelaactividadfísica,loquecambióelestadoredoxdelacélula trasunentrenamientoderesistencia(Senycols.,1992y1994).Además,sehaobservadoque lasuplementaciónconantioxidantesprevienelaoxidacióndelglutatiónsanguíneo(Sastrey cols.,1992). MásrecientementesehavaloradolafuncióndelasEROsproducidasenlacontracción muscularycómoelestadoredoxdelacélulaescapazdemodularlosprocesosdeseñalización celular(Sen,2001).Graciasaestasaportaciones,sehaabiertounprometedorcampode investigaciónquetieneporobjetocomprobarloscambiosenlosmarcadoresdeestrés oxidativoysuprevención,ademásdeentenderelfuncionamientoredoxdelacélulamuscular duranteelejercicio. 1.2.3.1. Fuentes de radicales libres durante el ejercicio físico Trasexponerlasprincipalesfuentesderadicaleslibres,enunasituaciónenlaquese producencambiostanimportantes,comoeselcasodelejerciciofísico,cabereseñarlos procesosquemásinfluyenenlageneracióndeespeciesreactivas.Yaenunprimerestudio
Introducción 51 realizadoporDillardycols.(1978)seasumióqueelmúsculoeselprincipalorigenderadicales libresduranteelejerciciofísico,aunqueotrostejidoscomoelcardiaco,elpulmonaroincluso losleucocitosqueinfiltraneltejidomusculardañadoporelesfuerzotambiénpueden contribuirsignificativamentealaproduccióndeEROs. Variasinvestigacionesrealizadassehancentradoenelanálisisdelosmarcadoresde oxidaciónensangreperiférica,sintenerencuentaeltipodeejerciciorealizado,obteniéndose, portanto,resultadoscontradictoriosdifícilesdeexplicar.SehandescritoaumentosdelaLPO (Daviesycols.,1982a;JiyFu,1992;Liycols.,1999;Alessioycols.,2000;Childsycols.,2001; Bakerycols.,2004),delacarbonilaciónproteica(Lamprechtycols.,2008),dañoalADN (Selmanycols.,2002)odelarigidezenlamembranascelulares(Brzeszczynskaycols.,2008, Berzosaycols.,2011a).Algunosautorestambiénsugierenqueestosincrementosenla produccióndeEROssondebidosaloscambiosmetabólicoscomunesentodoslosprogramas deejercicio,comoporejemplo,laliberacióndecatecolaminasysuautooxidación(Coopery cols.,2002).Otraposibilidadplanteadaesqueelprocesoinflamatorioquesufrelafibra musculartraselejercicio,coninvasiónpormacrófagosyotrascélulasfagocíticas,seael responsabledelasobreproducciónderadicaleslibres.Esteprocesoesesencialparala regeneraciónmuscularyconllevaunaliberacióndeEROsporpartedeestascélulas,que inclusopuededañareltejidomuscularnolesionadoinicialmenteporelejercicio(Zerbaycols., 1990;Butterfieldycols.,2006). Losmecanismosdeproducciónendógenaderadicaleslibresenelmúsculoselocalizan envarioslugares,siendolasEROsprimariasel●O2‐yel●NO(Jackson,2005).Sinduda,unade lafuenteseslamitocondria(Fig.11),quegeneraprincipalmente●O2‐enlacadenade transportedeelectrones.Alcontrariodelacorrientedepensamientotradicional, recientementesehapropuestoqueéstanoeslaprincipalfuentederadicaleslibresduranteel ejercicio.Lamitocondriaenestadobasaloestado4transformaentreun2%yun5%del oxígenoqueconsumeen●O2‐,mientrasqueensuestadomásactivo(estado3),estimulado porlacantidaddeADP,transformaenradicalsuperóxidosóloun0,1%(St‐Pierreycols.,2002). Estoesimportanteporque,duranteelejercicio,lasmitocondriasdelosmúsculosactivosse encuentranenesteúltimoestado,loquelimitaconsiderablementesuproduccióndeEROs.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 52 Mitocondria Membranacelular Citosol Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Procesos PLA 2 ‐dependientes NADPH‐oxidasa NADPH‐ oxidasa ●O 2 ‐ Cadena transporte electrónico ONOO ‐ NOeNOS ●O 2 ‐ ●O 2 ‐ NO ONOO ‐ Endotelio ●O 2 ‐ nNOS NO Medioextracelular eNOS ONOO ‐ Xantina oxidasa H 2 O 2 H 2 O MnSOD GPx H 2 O 2 H 2 O Cu,ZnSOD GPx H 2 O 2 Cat ecSOD ●OH Fe 2+ ●OH Fe 2+ ●OH Fe 2+ ●OH ●OH ●OH ROO● ROO● ROO● ROO● ROO● ROO● Fibramuscular Fig. 11: Principales fuentes de radicales libres y producción de EROs durante el ejercicio. Laproducciónderadicaleslibresdependetambiéndeltipodefibramuscular.Las fibrasdecontracciónlenta,odetipoI,producendedosatresvecesmenosH2O2quelasde contracciónrápida,odetipoII,sindiferenciasentrelasactividadesdelaGPxmitocondrial (AndersonyNeufer,2006). Ademásdelamitocondria,segeneranEROsenotraslocalizacionesdelafibra musculardonde.Enelretículosarcoplasmáticoyenlostúbulostransversos,éstosseproducen mediantelavíaenzimáticadelaNADPHoxidasa(Xiaycols.,2003).Suactividadseve incrementadaconeliniciodeladespolarizaciónenelprocesodelacoplamientodeexcitación‐ contracción(Espinosaycols.,2006;Hidalgoycols.,2006).El●O2‐generadoinfluyeenla liberacióndeCa2+(Cherednichenkoycols.,2004),loquepuedeinfluirenlacontracción muscular.LareaccióncatalizadaporlaNADPHoxidasatambiénsedaenlamembrana plasmáticadelascélulasmusculares,queposeensistemasredoxdeintercambiode electrones,loquerepercuteenlaliberaciónderadicaleslibresalespacioextracelular (Javesghaniycols.,2002). OtraoxidasainvolucradaenlageneracióndelasEROsenelejercicioeslaxantina oxidasa.Enlosperiodosdehipoxia,isquemiauotrassituacionesdedéficitenergético,
Justificación 59 Esbiensabidoqueelejerciciofísicoregularconstituyeunaactividadpreventivay saludablealreducirelriesgodeaparicióndeladiabetes,elcáncerylasenfermedades cardiovasculares,entreotros(Blairycols.,2001).Noobstante,enlasúltimasdécadas, numerosostrabajosdeinvestigaciónhandemostradoquelarealizacióndelejerciciofísico puedeexacerbarelestrésoxidativo(PowersyJackson,2008).Paralaejecucióndeuna actividadfísicaserequierelacontraccióndelosmúsculosesqueléticosimplicados,conel consiguienteaumentodelVO2respectoalreposo,hechoqueconllevaindefectiblementeauna sobreproducciónderadicaleslibres.Portanto,cabeesperarqueelejerciciointensoy prolongadodañeloscomponentescelularesporoxidación(Daviesycols.,1982a;Duthiey cols.,1990;Radákycols.,2001). Laestructuradelamembranacelular,constituidaporproteínasylípidosdispuestosen formadebicapa,esdinámica,yaquesusmoléculassemuevenenlasdosdireccionesdesu superficie.Graciasaestapropiedadsemodulannumerosasfuncionesesencialesparala homeostasiscelular(SingeryNicolson,1972;StubbsySmith,1984;Baenzigerycols.,2000). Pequeñasmodificacionesenlacomposiciónlipídicadelabicapaalteransusnivelesdefluidez. Porestemotivo,lamedicióndelafluidezdelamembranaesunindicadordelestadodesu función(Liycols.,1999). Cuandoseproduceestrésoxidativo,losradicaleslibres,alreaccionarconlos fosfolípidosyproteínasdelamembrana,puedenproduciralteracionescomo desestructuración,inhibicióndeloscanalesiónicosydisfuncióndelosreceptoresde membrana.Aestasituaciónoxidativaalaquetodoorganismoaeróbicoseencuentra expuesto,enmayoromenorgradodeformairremediable,seleañadelaqueinducela actividadfísica,produciendounaumentoenelconsumodeloxígenoenlamitocondria.Esta organeladesempeñaunpapelclaveenelmetabolismocelular,yesconsideradacomola principalfuentederadicaleslibresdurantelarespiraciónaeróbica.Unaalteraciónensu funcionamientopuedederivarenlaformacióndeEROs,loquepuedeagravareldaño oxidativoproducidoduranteelejerciciofísico(Matsugoycols.,2000). Teniendoencuentaestoshechos,espresumiblequelasdiferenciasdelalesión oxidativageneradadependan,porunlado,delascaracterísticasdelejerciciofísico desarrolladoperse,esdecir,desutipo,intensidadyduración;y,porotrolado,deltejidoo muestrabiológicasobreelqueserealizaelestudio(Nikolaidisycols.,2008).Esllamativoel escasonúmerodetrabajoscientíficosqueanalizanlosefectosdelejerciciofísicoenlafluidez delasmembranasbiológicas.Porotraparte,susresultadossoncontradictorioscuando estudianlafluidez,asícomootrosindicadoresdelesiónoxidativacelular.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 60 Enconsecuencia,sedecidiódiseñarunestudioqueenglobaralosprincipales parámetrosempleadosparalavaloracióndeldañomediadoporradicaleslibres,utilizandouna pruebaprogresivadeesfuerzoagudohastalaextenuaciónyunprotocolodeentrenamiento submáximocontresperiodosdeduración:1,4y12semanas.Paraestefin,seutilizócomo ergómetrountapizrodantemotorizadoconintensidadcontrolada,porseréstela instrumentaciónmásempleadaenestetipodeestudiosy,además,porhaberseobtenidolos efectosdelentrenamientomásconsistentes(Wisløffycols.,2001). Enestetrabajoseanalizaronmembranasaisladasyhomogeneizadosobtenidosa partirdemúsculoesqueléticoycardiaco,hígadoycerebroderatasSprague‐Dawley.Los músculosesqueléticoycardiaco,enelcontextodelejerciciofísico,desempeñanunpapel fundamental,yaquesusmitocondriassonlafuentepredominanteenlageneracióndeEROs (PowersyJackson,2008).Elhígadoesunodelosórganosprincipalesenelmetabolismodelos glúcidos,lípidosyproteínas,asícomounreservoriodevitaminasymetales(GuytonyHall, 2006).Finalmente,elcerebro,porsuextremavulnerabilidadalasEROs,puestoqueconsume el20%delO2totalenelorganismo,contienealtasconcentracionesdeácidosgrasos poliinsaturadossusceptiblesalaLPOy,encomparaciónconotrostejidos,tieneunaactividad enzimáticaantioxidantedeficiente(Andréycols.,2006;Halliwell,2006).Encadaunodeestos tejidosrealizaremostresdeterminacionesanalíticas:fluidezdemembrana,cuantificaciónde malonildialdehídoy4‐hidroxialquenales(MDA+4‐HDA)yvaloracióndelosrestoscarbonilos proteicos.
61 3. OBJETIVOS
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Objetivos 63 Primero: Describirlosefectosdelejerciciofísico,tantoagudocomodeentrenamiento,sobre lafluidezdelasmembranascelularesymitocondrialesaisladasapartirdemúsculo esquelético,cardiaco,hígadoycerebrodelarata,distribuidasenlosgrupos control,ejercicioagudoyentrenamientode1,4y12semanasdeduración. Segundo: Analizarenlostejidosmencionadosenelobjetivoanteriorlasconcentracionesde malonildialdehídoy4‐hidroxialquenales,comoindicadoresdelalesiónoxidativa producidaenloslípidos,enlosgruposcitados. Tercero: Determinarelgradodecarbonilaciónproteica,unindicadordelesiónoxidativa mediadaporradicaleslibresenlasproteínastisulares,entodoslostejidosygrupos deejercicioestudiados. Cuarto: Analizarlainfluenciadelalesiónoxidativaalípidosyproteínassobrelosdañosque seoriginenenlafluidezdelasmembranascelularesymitocondriales,entodoslos tejidosestudiadosdelosgruposdereposoyejercicio. Quinto: Compararlasdiferenciasexistentesencuantoalosresultadosdefluidezydedaño oxidativolipídicoyproteico,enfuncióndeltipodeprotocoloergométrico realizado:ejercicioagudoyentrenamientosdediferenteduración.
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65 3. AIMS
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Aims 67 First: Todescribephysicalexerciseeffects,asacuteastraining,oncellandmitochondrial membranefluidity,isolatedfromtissues:skeletalandcardiacmuscles,liverand brain,incontrol,acuteexercise,and1,4and12weekstraininggroups. Second: Toanalyzeonfirstaimtissuesthemalondialdehydeand4‐hydroxyalkenals concentrations,aslipidperoxidationindex,intheexperimentalgroupsabove mentioned. Third: Todeterminetheproteincarbonylationlevel,afreeradical‐mediatedoxidativeinjury markeronproteins,inalltissuesandexercisegroups. Fourth: Toanalyzelipidandproteinoxidativeinjuryinfluenceoncellandmitochondrial membranesfluidityineverytissuesofeachgroup. Fifth: Tocomparetheexistingdifferencesasregardsfluidityandlipidandproteinoxidative damageresults,accordingtothekindoftheergometricprotocol:acuteexerciseand trainingsofdifferentduration.
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Material y métodos 75 4.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 4.3.1. Grupos de estudio Seestablecieroncincogruposdetrabajo(n=10ratas/grupo):control(grupo1), ejercicioagudo(grupo2)ytresgruposdeentrenamiento,de1,4y12semanas(grupos3,4y 5,respectivamente),siendoaleatorialadistribucióndelosanimalesenlos5grupos. Todaslasratas,exceptuandolasdelgrupocontrol,realizaronunaergometríadetipo máximo.Elobjetivodeestapruebafuedoble:porunaparte,constituireltestergométricode esfuerzofísicoagudorealizadoporelgrupo2;yporotra,permitirvalorarlacapacidadfísicaen losgruposdeentrenamiento(3‐5),enlosqueúnicamentevarióladuracióndelmismo(1,4ó 12semanas).Elcálculodelacapacidadfísicadeestosanimalesfueunrequisitoesencialpara poderprecisarlacargadetrabajoquedesarrollaríacadaanimalenlassesionesde entrenamiento. 4.3.2. Equipo ergométrico Paralosestudiosdeesfuerzoagudo,seutilizóuntapizrodantepararatadeunasola calle(Panlab),conunarejillaelectrificadaensuparteposterior.Ésteestáadaptadopara poderrealizarmedicionesmetabólicasmedianteelOxyletsystem(Panlab),elcualconstade: unaunidaddecontroldelflujoaéreo(LE400‐4FL,Panlab),paragarantizarunflujoconstante deairedentrodelacámarametabólica;unanalizadordegases(LE405,Panlab);yun ordenadortipoPC,conelcual,medianteelpaqueteinformáticoMetabolism2.0(Panlab),se pudocalcularelVO2,produccióndeanhídridocarbónicoyelcocienterespiratorio(Fig.14).Los entrenamientosserealizaronenuntapizrodantepararatadecincocalles(Panlab)(Fig.15).
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 76 A BC DE Fig. 14: El equipo instrumental ergométrico utilizado en las pruebas de esfuerzo agudo consta de: A, tapiz rodante para rata de 1 calle adaptado con cámara metabólica; B, unidad de control del flujo aéreo (LE 400-4FL); C, analizador de gases (LE 405); D, ordenador PC. E, imagen tomada del software Metabolism 2.0 durante una ergometría.
Material y métodos 77 AB Fig. 15: Ergómetro para rata de cinco calles utilizado para los entrenamientos de los animales (A). Obsérvese a más detalle las cinco calles ocupadas por las ratas (B) y la rejilla, situada en la parte inferior de la imagen, que suministra una mínima descarga eléctrica controlada, suficiente para evitar que el animal se quede quieto durante el desarrollo de la prueba. 4.3.3. Prueba de esfuerzo máximo (Protocolo ergométrico de ejercicio agudo) Durantelasemanaanterioraestapruebaergométrica,losanimalesfueronsometidos aunprotocolodeadaptaciónaltapizdurante5días,arazónde1h/día.Deestaforma,las ratassedesplazarondentrodeltapizdeentrenamiento,avelocidadconstantesindesarrollar unritmodecarrera(0,10‐0,12m/s).Todaslasergometríasserealizaronentrelas10ylas12h delamañana. Lapruebaergométricadeejercicioagudoseinicióconunavelocidadde0,15m/syuna inclinacióndeltapizde10⁰,ysefueincrementandoen0,03m/scada3minutos(Wisløffy cols.,2001)(Fig.16).Elcriteriodemaximalidadqueseñalóelfinaldelaergometríafuela aparicióndefatigaevidenteenlasratas,atendiendoasuincapacidadparacorrersobreel tapizrodanteapesardelestímuloeléctrico(Caillaudycols.,1999).Paraéste,seutilizó0,2mA comointensidadinicial(lamínimapermitidaporelequipoergométrico)y0,4mAcomo máximaalfinalizarlaprueba.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 78 Tiempo(minutos) 0,15 0,18 0,21 0,24 v Velocidad(m/s) 36912 t Fig. 16: Protocolo de la prueba de esfuerzo máxima, adaptado de Wisløff y cols., 2001. 4.3.4. Programas de entrenamiento Serealizóeneltapizrodantedecincocallesconrejilladeestimulacióneléctricaysin adaptaciónpararealizarmediciónmetabólica.Laduracióndelentrenamientofuede1,4y12 semanas(grupos3‐5),conloquefuenecesariodistribuiralasratasendossubgruposde5 animalesatendiendoauncriteriodesimilituddesucapacidadfísica,calculadapreviamenteen laergometríadetipomáximo,esdecir,unsubgrupoconlascincoratasconmayor rendimientoyotroconlasdemenor. Cadasemana,lasratasrealizaron4sesionesdeejercicio,lunes,martes,juevesy viernes,de60minutosdeduración.Enéstas,elejercicioconsistióenunacarreraeneltapizen laquesealternarondosfasesdediferenteintensidad,duranteseisciclosconsecutivos.Enla primerafase,lavelocidaddeltapizfuedel35%delaalcanzadacuandoelVO2delaratafue máximo,ysuduraciónfuede2minutos.Acontinuación,enlasegunda,lavelocidaddelacinta aumentóhastael80%delamáximaysemantuvodurante8minutos(Fig.18).Lainclinación deltapizdurantetodoelentrenamientofuede10⁰.Todoslosentrenamientosserealizaron entrelas10y14horas.
Material y métodos 79 1 08124 2 3 5 6 7 9 10 11 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 35 80 0 100 60minutos 2 minutos 8 minutos Velocidaddecarrera(%) LMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJVLMJV MES SEMANA Fig. 17: Planificación del entrenamiento para los grupos de ratas 3, 4 y 5 (entrenamiento de 1, 4 y 12 semanas, respectivamente). Se detalla el protocolo de una sesión diaria de entrenamiento de 60 minutos de duración, alternando 6 ciclos de 2 minutos al 35% de la velocidad máxima alcanzada en la ergometría aguda y 8 minutos al 80%. Elgrupo5,queentrenódurante12semanas,realizóunasegundaergometríaagudaa mitaddelperiododeentrenamiento,teniendoencuentaelperiodoprolongadode entrenamientoylaconsecuentehabituacióndelasratas,paramodificarligeramentelas cargasdetrabajoinicialmentecalculadas.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 80 4.3.5. Procesamiento de muestras Paraevitarlaposibleinfluenciadelritmocircadianosobrelarealizacióndelaactividad físicayelestrésoxidativo,todaslasextraccionestisularesserealizaronentrelas10ylas12h delamañana.Lasratasdelgrupoagudosesacrificaroninmediatamentedespuésderealizarla ergometría,mientrasquelasentrenadaseldíasiguientedelúltimoentrenamiento,paraevitar elefectodelejercicioagudodelaúltimasesión.Seutilizóladecapitacióncomométodode sacrificio.Lostejidosextraídosdecadaratafueronmúsculoesquelético,corazón,hígadoy cerebro.Elmúsculoesqueléticoseobtuvodelcuádricepsfemoraldelasextremidades posteriores.CorazónehígadoseextrajerontrastoracotomíaenUylaparotomíamedia, respectivamente.Elcerebroseextrajoporaperturadelacavidadcranealatravésdelacalota. Todaslasmuestrastisularesfueronlavadasconsuerofisiológicoa4⁰C.Lostejidossesecaron enpapeldefiltroparaeliminarelsuerodelavadoyacontinuaciónsealmacenarona‐80⁰C hastaeldíadelanálisis.
Material y métodos 81 4.4. MÉTODOS ANALÍTICOS 4.4.1. Aislamiento de membranas Previamentealadeterminacióndelafluidez,fuenecesarioprocederalaislamientode lasmembranascelularesymitocondriales.Paraello,enmúsculoesqueléticoycardiacoyen tejidohepáticoseutilizólametodologíadescritaporGraham(1997)conligeras modificaciones.Enelcerebro,lasmembranascelularesymitocondrialesseaislaronsegúnel protocolodescritoenMillán‐Planoycols.(2003).Todosestosmétodossefundamentanen centrifugacionessucesivasadistintasvelocidadesytiempos. 4.4.1.1. Tejido muscular e hígado Traspesarlostejidos,éstosfuerontroceadosconunbisturísobreunaplacadePetri situadaenhieloyacontinuaciónseintrodujeronenunhomogeneizadordevidrioconteflón acopladoaunrotorHeidolphRZR2020contampónHEPES0,02M–KCl0,14M(pH7,4)yse homogeneizarona1650rpm.Todoesteprocesoserealizóenfrío. Elhomogeneizadotisularsecentrifugóa1000xgdurante10mina4⁰Cparaeliminar losrestosdetejidosólidosylosnúcleoscelulares.Acontinuación,elsobrenadantese centrifugóa50000xgdurante20mina4⁰C.Elprecipitado,queconteníalasmembranas,se resuspendióenHEPES,sehomogeneizóysevolvióacentrifugara10000xgdurante10mina 4⁰C.Trasestacentrifugación,seprocediódelasiguientemanera:1)elsobrenadanteyelbuffy coatseresuspendieronycentrifugarona50000xgdurante20mina4⁰C,paraobtener membranasplasmáticas;y2)elprecipitadoseresuspendióenHEPESysecentrifugóa10000 xgdurante10mina4⁰C,paraobtenerlasmitocondrias.Ambosprecipitadosfinales, membranascelularesymitocondrias,seresuspendieronenTRIS0,05M(pH7,4),se distribuyeronenalícuotasysealmacenarona‐80⁰Chastalarealizacióndelosensayos.LaFig. 19ilustraesteprocedimiento.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 82 TEJIDOhomogeneizadoen HEPES0,02M– KCl 0,14M(pH7,4) Centrifugación1000xg,10min,4⁰C Centrifugación50000xg,20min,4⁰C Resuspender enHEPES Centrifugación10000xg,10min,4⁰C Centrifugación50000xg,20min,4⁰C Resuspender enTRIS0,05M Alícuotas Congelara‐80⁰C Resuspender enHEPES Centrifugación10000xg,10min,4⁰C Resuspender enTRIS0,05M Fig. 18: Protocolo de aislamiento de membranas a partir de músculo esquelético, cardiaco e hígado.
Material y métodos 83 4.4.1.2. Tejido nervioso Eltejidocerebral(Fig.20)troceadofuehomogeneizadoa4⁰Censacarosa0,32M.El homogeneizadoresultantesecentrifugóa1000xgdurante10mina4⁰Cparaeliminarlos restosdetejidonohomogeneizadosylosnúcleoscelulares.Acontinuación,elsobrenadante secentrifugóa30000xgdurante20mina4⁰C.Elprecipitado,queconteníalasmembranas,se resuspendióenaguaultrapura,sehomogeneizóysevolvióacentrifugara8000xgdurante20 mina4⁰C.Acontinuación:1)serecogieronelsobrenadanteyelbuffycoat,seresuspendieron ysecentrifugarona48000xgdurante20mina4⁰C,paraobtenersinaptosomas;y2)el precipitadoseresuspendióenaguaultrapuraysecentrifugóa8000xgdurante20mina4⁰C, paraobtenerasílasmitocondrias. Losprecipitadosfinales,sinaptosomasymitocondrias,fueronresuspendidosenTRIS 0,05M(pH7,4)ydistribuidosenalícuotasquesealmacenarona‐80⁰Chastaeldíadelensayo.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 84 CEREBROhomogeneizadoen sacarosa0,32M Centrifugación1000xg,10min,4⁰C Centrifugación30000xg,20min,4⁰C Resuspender enaguaultrapura Centrifugación8000xg,20min,4⁰C Centrifugación48000xg,20min,4⁰C ResuspenderenTRIS0,05M Alícuotas Congelara‐80⁰C Resuspender enaguaultrapura Centrifugación8000xg,20min,4⁰C ResuspenderenTRIS0,05M Fig. 19: Protocolo de aislamiento de membranas a partir de cerebro.
Material y métodos 91 4.4.5. Determinación de la concentración de proteínas Todoslosresultadosdelosindicadoresdedañooxidativoobtenidosenestetrabajo (fluidezdelasmembranas,concentracionesdeMDA+4‐HDAypresenciaderestoscarbonilo) estánreferidosalaconcentracióndeproteínasdelasmuestrasanalizadas,paraposibilitarsu comparación. ParacalcularlaseutilizóelmétododeBradford(1976),basadoenlareacciónentreel azuldeCoomassieylosaminoácidosbásicos,principalmentearginina,lisinaehistidina.Esta reacciónproducecambiosdeabsorbanciaa595nmquesondirectamenteproporcionalesala concentracióntotaldeproteínas(Fig.24). Enestemétodo,lacantidaddeproteínastotalesdelamuestraproblemaseobtuvo interpolandosuvalordeabsorbanciaenlacurvapatróndealbúmina.Losvaloresde concentracióndeproteínasseexpresaronenmg/mL.ElprogramautilizadofueAssay4.0 (Biosoft). Protocolo: Dispensar2alícuotasde1µLdelhomogeneizadoparaladeterminacióndeMDA+4‐ HDA,carbonilaciónproteicaodelpurificadodemembranasymitocondrias. AñadirTRIS0,02Mhastacompletar800µL. Dispensar200µLdereactivodeBradforddeBio‐Rad(AzulbrillantedeCoomassieG‐ 250al0,01%,etanolal4,7%,ácidoortofosfóricoal8,5%diluidoenaguadestilada). Agitareincubardurante10minutosatemperaturaambiente. Leerlaabsorbanciaa595nmenelespectrofotómetro.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 92 Cálculoporinterpolaciónconlacurvaestándar (mgproteína/mL) AzuldeCoomassie Absorbanciaλ =595nm Muestra Proteínas Cadenaslateralesbásicas yaromáticas Complejoproteína‐colorante Na+ SOO O‐ NN + SOO O‐ HN O Fig. 23: Protocolo de cuantificación de proteínas.
Material y métodos 93 4.5. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Losresultadosergométricosyanalíticosobtenidosfuerontratadosestadísticamente conelprogramainformáticoStatView5.0.1. Serealizarondosestudiosestadísticos,elprimeroconsistióenladescripcióndecada variablemediantedosparámetros:lamediaaritmética,comomedidadelatendenciacentral, yelerrorestándar,comounamedidadeladispersión.Porello,losresultadosseexpresaron comomediaaritmética±errorestándar;posteriormente,serealizóunestudioinferencialpara comprobarsilasdiferenciasentrelasmediasaritméticasdelasvariableseranono estadísticamentesignificativas,loqueselogróaplicandoeltestdelatdeStudentparadatos nopareados.Elniveldesignificaciónaceptadofuep≤0,05. Elprogramainformáticoutilizadopararepresentargráficamentelosresultadosfue GraphPadPrismversión5.00.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 94
95 5. RESULTADOS
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 96
Resultados 97 5.1. ESTUDIOS ERGOMÉTRICOS 5.1.1. Pruebas de esfuerzo máximo Salvoelgrupocontrol,loscuatrorestantes,grupos2‐5,realizaronunaergometría agudahastalaextenuación.EnlaTablaIIIylaFig.24aparecelavelocidadfinaldelaprueba agudaalcanzadaporcadarata,juntoalcálculodelavelocidadmediadecadagrupo.Huboun aumentosignificativodelrendimientoenelgrupo5entrelaprimeraergometría(A)ylaquese realizóamitaddelperiododeentrenamiento(B),causadoporlaadaptaciónalejercicio. Tabla III: Velocidad final alcanzada por cada rata en la prueba ergométrica máxima, y media calculada en cada grupo de ejercicio. En el grupo 5 se calculó al inicio (A) y a las 6 semanas de entrenamiento (B). a p ≤ 0,05 vs. 5A. GRUPOS2345 AB Velocidadfinal(m/s) n=10/grupo 0,240,300,270,270,24 0,240,330,270,300,33 0,300,330,300,300,36 0,330,360,300,300,39 0,330,360,300,300,42 0,330,360,300,300,45 0,330,390,330,330,45 0,330,390,360,330,45 0,330,390,390,330,48 0,390,420,450,390,66 Media±ES(m/s)0,32±0,01 0,36±0,01 0,33±0,02 0,32±0,010,42±0,03a
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 98 G2 G3 G4 G5A G5B 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Velocidad(m/s) Fig. 24: Velocidades finales individuales en cada grupo. En el grupo 5, A hace referencia a la primera ergometría y B a la segunda. La línea horizontal coloreada indica la media aritmética correspondiente a cada grupo. 5.1.2. Programa de entrenamiento Lascargasdetrabajodelosgruposdeentrenamientosedeterminaronenfunciónde lasvelocidadesfinalesalcanzadasenlapruebaergométricamáxima.Teniendoencuentael númerodecallesdeltapizdeentrenamiento(cinco),seconformarondossubgrupos/grupo: rataslentasyrápidas.Seutilizólamedianadelasvelocidadesfinalesdecadasubgrupocomo referenciaparadeterminarlascargasdeentrenamiento(35y80%delamáxima)(TablaIVy Fig.25).
Resultados 99 Tabla IV: Carga de trabajo de los subgrupos de entrenamiento. En el grupo de 12 semanas, G5, se calculó al inicio (A) y a mitad del entrenamiento (B). En color azul se indican los porcentajes (35% y 80%) de las cargas de entrenamiento, expresadas en m/s. GRUPOS ENTRENAMIENTO34 5 AB SubgruposLentasRápidasLentasRápidasLentasRápidasLentasRápidas vFergometría (m/s) 0,300,360,270,300,270,300,240,45 0,330,390,270,330,300,330,330,45 0,330,390,300,360,300,330,360,45 0,360,390,300,390,300,330,390,48 0,360,420,300,450,300,390,420,66 MedianavF(m/s)0,330,390,300,360,300,330,360,45 Cargas entrenamiento (m/s) 35%0,120,140,110,130,110,120,130,16 80%0,260,310,240,290,240,260,290,36 Lentas Rápidas Lentas Rápidas Lentas Rápidas Lentas Rápidas 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 AB G3 G4 G5 80% 80% 80% 80% 80% 80% 80% 80% 35% 35% 35% 35% 35% 35% 35% 35% Velocidad(m/s) Fig. 25: Cargas de trabajo (35% y 80%) de cada subgrupo de entrenamiento. En el grupo 5, A hace referencia a la primera ergometría y B a la segunda.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 100 5.2. ESTUDIO DE LA FLUIDEZ Y LOS INDICADORES DE LESIÓN OXIDATIVA EN MÚSCULO ESQUELÉTICO 5.2.1. Fluidez en la membrana celular Losefectosdelejerciciosobrelafluidezdelamembranacelulardelmúsculo esqueléticoenratasseilustranenlaFig.26.Existeunclarodescensodelafluidezdela membranaentodoslosgruposdeejercicio,encomparaciónconelcontrol(3,30±0,02), siendosignificativas(p≤0,05)todaslascomparaciones,exceptoconelgrupode entrenamientode1semana(3,24±0,03).Tantoelejerciciointensohastalaextenuación(3,18 ±0,02)comoelentrenamientode4y12semanasdeduración(3,18±0,04y3,18±0,05, respectivamente)provocaronlosmayoresíndicesderigidez. Control Ejercicio 1 4 12 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 aaa Entrenamiento(semanas)Agudo Fluidezdemembrana(1/P) Fig. 26: Fluidez de membrana en el músculo esquelético de 50 ratas macho distribuidas en cinco grupos (n = 10/grupo), en función del protocolo de ejercicio: sedentarias (control), prueba de esfuerzo progresiva hasta la extenuación, y periodos de entrenamiento (1, 4 y 12 semanas). Los datos (media ± ES) están expresados como el inverso de la polarización (1/P). a p ≤ 0,05 vs. control.
Resultados 107 5.3.4. Carbonilación proteica Atendiendoalaconcentracióndelosrestoscarboniloproteicoscomoíndicede oxidaciónproteicaenhomogeneizadoscardiacos,seapreciaunaelevacióndeldañooxidativo proteicoenelgrupodeesfuerzoagudo(8,65±0,38nmol/mgprot.)respectoaloscontroles (5,77±1,17nmol/mgprot.).Enelentrenamientode1semana(8,02±0,56nmol/mgprot.),4 semanas(7,82±0,69nmol/mgprot.)y12semanas(7,88±1,11nmol/mgprot.),comparando lasconcentracionesdecarbonilosconlasdelgrupocontrol,losaumentosnofueron significativos(Fig.33). Control Ejercicio 1 4 12 2.0 4.3 6.5 8.8 11.0 Entrenamiento(semanas)Agudo a Carbonilos(nmol/mgprot.) Fig. 33: Carbonilación proteica en homogeneizados de corazón en ratas sedentarias, que realizaron ejercicio agudo, y varios periodos de entrenamiento (1, 4 y 12 semanas). Los datos (media ± ES) están expresados en nmol/mg prot. a p ≤ 0,05 vs. control.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 108 5.4. NIVELES DE FLUIDEZ DE MEMBRANA E INDICADORES DE LESIÓN OXIDATIVA HEPÁTICOS 5.4.1. Fluidez en la membrana celular Enlafluidezdelamembranacelulardeloshepatocitos(Fig.34),sepuedeobservar queapenasseprodujeroncambiosenlosnivelesdefluidezenningunodelosgruposde ejercicioconrespectoalgrupocontrol(3,20±0,02).Tantotrasunejercicioagudo(3,21±0,03) comodespuésderealizarunentrenamientode1semana(3,18±0,02),4semanas(3,18± 0,02)y12semanas(3,18±0,02),estosnivelessemantuvieronpróximosaloscontroles. Control Ejercicio 1 4 12 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 Fluidezdemembrana(1/P) Entrenamiento(semanas)Agudo Fig. 34: Fluidez de membrana en hepatocitos de 50 ratas distribuidas en cinco grupos: sedentarias (control), ejercicio agudo, y varios periodos de entrenamiento (1, 4 y 12 semanas). Los datos (media ± ES) están expresados como el inverso de la polarización (1/P).
Resultados 109 5.4.2. Fluidez en la mitocondria Alcontrariodeloocurridoenlamembranadeloshepatocitos,enlasmitocondrias hepáticasseproduceunadisminucióndelafluidezenlosgruposdeejerciciorespectoal reposo(3,14±0,03).LaFig.35ilustraestosresultados.Deestaforma,seprodujorigidez despuésderealizarunapruebaaguda(3,06±0,02),asícomoenelentrenamientode4 semanas(3,04±0,03).Tambiénseaprecióunadisminucióndelafluidez,aunquesin significaciónestadística,enlosentrenamientosde1semana(3,08±0,04)ymásaúnde12 semanas(3,06±0,04). Control Ejercicio 1 4 12 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 a Entrenamiento(semanas)Agudo a Fluidezdemembrana(1/P) Fig. 35: Fluidez de membrana en mitocondrias hepáticas: sedentarias (control), tras realizar un test progresivo agudo, y varios periodos de entrenamiento (1, 4 y 12 semanas). Los datos (media ± ES) se expresan como el inverso de la polarización (1/P). a p ≤ 0,05 vs. control.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 110 5.4.3. Peroxidación lipídica EnloconcernientealasconcentracionesdeMDA+4‐HDAeneltejidohepático(Fig. 36)hubounaumentosignificativoencadaunodelosgruposdeejercicioconrespectoalgrupo control(0,20±0,01nmol/mgprot.).Seobservaunaclararelaciónentrelaconcentraciónde MDA+4‐HDAyladuracióndelentrenamiento,obteniéndoseunaumentosignificativoenlos gruposagudo(0,23±0,01nmol/mgprot.)yde1semanadeentrenamiento(0,24±0,01 nmol/mgprot.);siendomáspronunciadoalas4semanas(0,28±0,01nmol/mgprot.)y todavíamásenelde12(0,29±0,01nmol/mgprot.),conunasignificaciónestadísticaen relaciónalgrupocontrol,agudoyentrenamientode1semana. Control Ejercicio 1 4 12 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 aa a,b Entrenamiento(semanas)Agudo a,b,c MDA+4‐HDA(nmol/mgprot.) Fig. 36: El ejercicio agudo y el entrenamiento indujeron peroxidación lipídica en homogeneizados de hígado. Los datos (media ± ES) están expresados en nmol/mg prot. a p ≤ 0,05 vs. control, b vs. agudo, c vs. 1 semana.
Resultados 111 5.4.4. Carbonilación proteica Conrespectoalmarcadordeoxidaciónproteica,lapresenciaderestoscarbonilo, tambiénseaprecióunafuerteelevaciónensuconcentraciónentodoslosgruposdeejercicio, yaseaagudooentrenamiento,encomparaciónconelgrupocontrol(5,49±0,52nmol/mg prot.)(Fig.37).Lamayorconcentracióndelcontenidoenrestoscarbonilosproteicosenlos homogeneizadoshepáticossealcanzóenelgrupodeesfuerzofísicoagudo(8,96±0,52 nmol/mgprot.),convaloressimilaresenlosgruposdeentrenamientode1,4y12semanas (8,73±0,68;8,39±0,76;y8,19±0,77nmol/mgprot.,respectivamente). Control Ejercicio 1 4 12 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0 aaa Entrenamiento(semanas)Agudo a Carbonilos(nmol/mgprot.) Fig. 37: Concentraciones de restos carbonilos en homogeneizados de hígado de 50 ratas macho distribuidas en cinco grupos, en función del protocolo de ejercicio: sedentarias, test de ejercicio agudo, y varios periodos de entrenamiento (1, 4 y 12 semanas). Los datos (media ± ES) se expresan en nmol/mg prot. a p ≤ 0,05 vs. control.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 112 5.5. EFECTOS DEL EJERCICIO EN LA FLUIDEZ Y OXIDACIÓN EN EL TEJIDO NERVIOSO CENTRAL 5.5.1. Fluidez en los sinaptosomas LaFig.38ilustralosefectosdelejerciciosobrelafluidezdelossinaptosomas. Independientementedelamodalidaddelejercicio,entodoslosgruposseprodujouna marcadarigidezenlamembranaencomparaciónconelgrupocontrol(2,84±0,02),siendo significativatantoenelejercicioagudo(2,76±0,01)comoenlosentrenamientosde1,4y12 semanas(2,77±0,02;2,76±0,02;y2,73±0,01,respectivamente).Losnivelesmásbajosde fluidezsealcanzaronenelgrupodeentrenamientodemayorduración. Control Ejercicio 1 4 12 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 aaa a Entrenamiento(semanas)Agudo Fluidezdemembrana(1/P) Fig. 38: El ejercicio indujo rigidez en los sinaptosomas de 50 ratas distribuidas, en función del ejercicio que realizaron: controles, ejercicio agudo, y entrenamiento de 1, 4 y 12 semanas. Los datos (media ± ES) están expresados como el inverso de la polarización (1/P). a p ≤ 0,05 vs. control.
Resultados 113 5.5.2. Fluidez en la membrana mitocondrial Enlasmitocondriasaisladasdeltejidonerviosonoseobservaroncambios,talycomo sedemuestraenlaFig.39.Tomandocomoreferenciaelgrupocontrol(3,39±0,06),hay mínimoscambiosenlafluidezmitocondrialenelejercicioagudo(3,43±0,06),enel entrenamientode1semana(3,47±0,03)yenelentrenamientode4semanas(3,41±0,04),y unadisminuciónmuyleveenelentrenamientode12semanas(3,37±0,06).Enningunade estascomparacionesseobservandiferenciassignificativasconelcontrol. Control Ejercicio 1 4 12 2.8 3.1 3.4 3.7 4.0 Fluidezdemembrana(1/P) Entrenamiento(semanas)Agudo Fig. 39: Fluidez de membranas mitocondriales aisladas a partir del cerebro de ratas sedentarias, que realizaron ejercicio agudo, y tras varios periodos de entrenamiento de 1, 4 y 12 semanas. Los datos (media ± ES) se expresan como el inverso de la polarización (1/P).
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 114 5.5.3. Peroxidación lipídica Seobservó(Fig.40)unincrementosignificativoenlaconcentracióndeMDA+4‐HDA enloshomogeneizadosdecerebrodelgrupodeejercicioagudo(0,59±0,06nmol/mgprot.) encomparaciónconlosdelgrupocontrol(0,44±0,02nmol/mgprot.).Porotraparte,enlos gruposdeentrenamiento,losnivelesdemalonildialdehídosufrieronunapequeña disminución,aunquenosignificativa,respectoalcontrol(0,38±0,03;0,42±0,03;0,38±0,02 nmol/mgprot.;correspondientesa1,4y12semanas,respectivamente);encambio,síhubo diferenciasalcompararéstosconelgrupodeejercicioagudo. Control Ejercicio 1 4 12 0.20 0.35 0.50 0.65 0.80 a bb b Entrenamiento(semanas)Agudo MDA+4‐HDA(nmol/mgprot.) Fig. 40: Peroxidación lipídica en homogeneizados de cerebro de 50 ratas macho distribuidas en cinco grupos (n = 10/grupo), según el protocolo de ejercicio: control, test progresivo agudo, y entrenamientos de 1, 4 y 12 semanas. Los datos (media ± ES) se expresan en nmol/mg prot. a p ≤ 0,05 vs. control, b vs. agudo.
Resultados 115 5.5.4. Carbonilación proteica Losefectosdelejerciciosobreelcontenidodecarbonilosproteicosenlos homogeneizadosdecerebroserecogenenlaFig.41.Aunqueseobservanpequeños incrementosensuconcentraciónenloscuatrogruposdeejercicioencomparaciónconel grupocontrol(10,14±1,01nmol/mgprot.),losresultadossonparecidosentodoslosgrupos, siendomássimilaresenelejercicioagudo(11,44±1,81nmol/mgprot.)yelentrenamientode 4semanas(10,36±1,64nmol/mgprot.),yunpocomáselevadosenelcasodelosgruposde entrenamientode1semana(12,72±1,96nmol/mgprot.),asícomoelde12semanas(12,57± 1,82nmol/mgprot.). Control Ejercicio 1 4 12 0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 Entrenamiento(semanas)Agudo Carbonilos(nmol/mgprot.) Fig. 41: Concentraciones de carbonilos en homogeneizados de tejido nervioso de 50 ratas macho distribuidas en cinco grupos (n = 10/grupo), en función del tipo de ejercicio: sedentarias, ejercicio agudo, y entrenamiento de 1, 4 y 12 semanas. Los datos (media ± ES) se expresan en nmol/mg prot.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 116
Discusión 123 1992);aunquetambiéndisminuyelosnivelesplasmáticosymuscularesdealgunosscavengers, talescomoelácidoascórbico(Kozycols.,1992)ylavitaminaE(Gohilycols.,1987),porloque sehapropuestosuadministraciónparareducirlosdañosoxidativosgeneradoscomo consecuenciadelejercicioagudo(Bradyycols.,1979;Sastreycols.,1992).Dadoquela actividaddemuchasdeestasenzimasantioxidantesestáreguladaporlosnivelesde oxigenacióntisular(GregoryyFridovich,1973;CrapoyTierney,1974),pareceposibleque sesionesdeejercicioaeróbicorepetidaseneltiempopudieranmejorarlacapacidad antioxidantemediadaporestasenzimas,locualinduciríaaunamejorcapacidadenlascélulas pararesistirlasobreproducciónderadicaleslibrescausadaporelejerciciofísico(Sen,1995; Somaniycols.,1997;UrsoyClarkson,2003;Gómez‐Cabreraycols.,2008).Esteincrementode laactividadantioxidantecomorespuestaadaptativaaladuracióndelentrenamientopodría explicarlacaídaenlosindicadoresdelesiónoxidativalipídicayproteicaobservadosen nuestroestudio. Elhechodequelafluidezenlasmembranasymitocondriasdisminuyeraconla duracióndelentrenamiento,alavezqueelestrésoxidativocausadoporelejercicioseiba atenuando,nosllevaapensarenotrosmecanismosposibles,diferentesaldelahipótesis oxidativa,medianteloscualeselejerciciocrónicopuedamodificarlafluidezdelasmembranas biológicasenelmúsculoesquelético.Unaposibilidadesqueelentrenamientoprovoque cambiosenlacomposiciónlipídicaenlasmembranasdelmúsculoesquelético.Enestesentido, Mariniycols.(2011)concluyeronque,trasrealizarentrenamientosde10semanasentapiz rodante,hubocambiossignificativosdelaconcentracióndeácidosgrasostransenmembranas eritrocitarias:descensosenejerciciosal80%deintensidaddelVO2max,yaumentossila intensidadfuedel60%.Tambiénseredujolarigidezenlamembranaeritrocitariadecaballos entrenadosdurantecuatrooseissemanasconunaalimentaciónabasedeunadieta enriquecidaenácidosgrasos(n‐3)(DeMoffartsycols.,2007;Portierycols.,2007). Unodelosórganosqueestásometidoagrandesrequerimientosadaptativosdurante laprácticadelejerciciofísico,especialmentecuandoésteesdetipomáximo,eselcorazón.Su funcióncomobombadelsistemacirculatorioseconsiguegraciasaqueestáconstituido fundamentalmenteporfibrasmuscularesespecializadas,miocardiocitos,lascuales,a diferenciadelafibraesquelética,estáncontroladasporelsistemanerviosovegetativo.Enla determinacióndelafluidezenlamembranacelularymitocondriasdelmúsculocardiacolos resultadosfueronmuysimilaresalosdelmúsculoesquelético:unamarcadarigideztrasel esfuerzoagudoyunadisminucióndelafluidezduranteelentrenamiento,cuyaintensidadfue mayoralaumentarsuduración,especialmenteenlasmitocondrias.Ademásdenuestro
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 124 estudio,enlaliteraturacientífica,solamentesehavaloradolafluidezenlamembranadeeste tejidoenelestudiodePérezycols.(2003),yamencionadopreviamenteparaconsiderarel músculoesquelético.Estosautoresdescribierondescensosenlafluidezdelamembranadelas mitocondrias,traslarealizacióndeesfuerzosagudosdecarácterexhaustivo,hechoque coincideconnuestroestudio,mientrasque,adiferenciadenuestrosresultados,enlosgrupos deentrenamientonoobtuvieroncambiossignificativosconrespectoalreposo. AunqueelejercicioagudoaumentólaLPO,loscambiosnofueronsignificativosanivel cardiaco.Laliteraturacientíficamuestraresultadosdiscrepantesenelestudiodela peroxidaciónlipídicacardiacaporelejerciciofísicoagudo.Coincidiendoconnuestras experiencias,ratassometidasaunprotocoloagudodelargaduración,4horas,nomodificaron susconcentracionesdeMDArespectoalreposo(Vitielloycols.,2011).Sinembargo,otros autoreshanobservadoaumentossignificativosdelasconcentracionesdeMDAenratas sometidasaesfuerzoagudoentapizrodanteotras30minutosdenatación(Turgutycols., 2003;Linycols.,2006;Wondersycols.,2007;Huangycols.,2008). Elentrenamientotampocomodificódeformasignificativaelgradodeperoxidación lipídicacardiaca.Enconcordanciaconnuestrosresultados,nosedescribieroncambiosenratas querealizaron:unprogramadeentrenamientoentapizrodantede12ó14semanas(Morány cols.,2004);carreravoluntariaenruedadesdelos11alos24mesesdeedad(Judgeycols., 2005);ynatacióndurante8semanas,yafueraconosinsuplementosdevitaminaE(Metiny cols.,2002).Aunquetambiénhayestudiosdiscrepantes,comolosqueobtienenaumentosde laLPOtras8semanasdeentrenamientoentapiz(Liuycols.,2000)y4semanasdenatación (Misraycols.,2009),ylosdescensosdelasconcentracionesdeMDA,trasunentrenamiento de8semanascontapiz(HusainyHazelrigg,2002;Husain,2003;Husain,2004). Respectoalacarbonilaciónproteicaenelmúsculocardiaco,obtuvimosaumentos significativosalcompararelejercicioagudoconelreposo,coincidentesconlosdePérezycols. (2003),bajocondicionesexperimentalesequiparablesalasnuestras.Porelcontrario,en nuestroestudio,elentrenamiento,conindependenciadesuduración,nomodificó significativamentelacarbonilaciónproteica,resultadosqueestánenlamismalíneaquelos obtenidosenotrostrabajosquerelacionaroneldañooxidativoalasproteínasyel entrenamiento(Liuycols.,2000;HusainyHazelrigg,2002;Husain,2003;Pérezycols.,2003; Moránycols.,2004;Judgeycols.,2005). Lasdiscrepanciasenlarespuestadelosindicadoresdelesiónoxidativaenlípidosy proteínasentreelmúsculoesqueléticoyelcardiacopodríanrelacionarseconunarespuesta
Discusión 125 diferenteenelsistemadefensivoantioxidante.Así,enanimalessedentariosenreposo,la actividadantioxidanteenelmúsculocardiacodelasenzimasSOD,catalasayGPxcasiduplica ladelesquelético(Husainycols.,1996),loquepodríasuponerunamejorcondiciónparael desarrollodelentrenamientofísicoenelmúsculocardiacorespectodelesquelético.Eneste sentido,nosedescribieroncambiossignificativosenlaactividaddelaMn‐SOD,catalasa,GPxy GRenelcorazóndelaratainducidosporelentrenamiento,adiferenciadeloquesucedeen otrosórganos(Somaniycols.,1995a). Elejerciciofísiconosólorequiereunaadaptaciónfuncionallocaldelasfibras muscularesimplicadaseneldesempeñodelaactividadfísica,sinoque,además,precisadela respuestacoordinadadelacasitotalidaddelossistemasyaparatoscorporales.Elhígadoesun órganodondesedesarrollanmuchosdelosprocesosmetabólicosqueserequierenpara asegurarunadecuadoaporteenergéticodurantelaactividadfísica.Además,supapelenel aclaramientoycatabolismodenumerososproductosdedesechogeneradosdurantela contracciónmuscularesesencialparamantenerlahomeostasis,porloqueconsideramosque constituyeunterritorioóptimoparavalorarlaafectaciónsistémicaqueelejerciciofísico puedeproducirenlasmembranasbiológicasyelestrésoxidativo. Tantoelejercicioagudocomoelentrenamientonomodificaronlafluidezenla membranacelulardeloshepatocitos.Porelcontrario,anivelmitocondrial,principalorganela implicadaenlosprocesosenergéticosymetabólicoscelulares,elejercicioagudoexhaustivo provocórigidez,aligualquedespuésdelentrenamiento,especialmentecuandosuduración fuedecuatrosemanas.Enlaliteraturacientífica,esllamativoelescasonúmerodetrabajos quevaloranlosefectosdelejerciciofísicoenlafluidezdelasmembranashepáticas.Enun estudioquevalorólosefectoscombinadosendosgruposdeedad,9y20meses,ydelejercicio físicoenlafluidezdemembranasmicrosómicasymitocondrialeshepáticasdelarata,se observóque,enrelaciónaanimalessedentarios,éstepresentóunefectofluidificanteen ambas,concretamenteanivelmitocondrialenlasratasde9mesesymicrosómicoenlasde20 mesesdeedad(Kimycols.,1996).Tambiénsehanestudiadolosefectosdelaingestade aceitedeolivaodegirasolenlafluidezdelamembranamitocondrialenratas,trasun entrenamientode8semanasdeduraciónentapizrodante,sinquesehayanobtenidocambios significativoscausadosporelentrenamiento(Quilesycols.,1999). Unhechoimportanteesqueelejerciciofísicoagudoindujounamarcadaperoxidación lipídicaenelhígado,que,además,fueexacerbadaconelentrenamiento,estableciéndoseuna clararelaciónentreladuracióndelaactividadfísicayelgradodeldañooxidativo.Enla literaturacientífica,encasitodoslosmodelosexperimentales,elejercicioagudoindujouna
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 126 marcadaperoxidaciónlipídicahepática(Liuycols.,2000;Turgutycols.,2003;Konycols., 2007;Huangycols.,2008y2009;Koriviycols.,2012),inclusocuandoelesfuerzoagudolo realizabananimalesentrenadosdurante4semanas(ChoiyCho,2007).Laexcepciónseobtuvo alaplicarunprotocolodeesfuerzomáximo,dondenoseregistraroncambiossignificativos respectoaratascontroles(deOliveiraycols.,2003).Aligualqueennuestroestudio,huboun incremento,respectoaanimalessedentarios,enelestrésoxidativocausadoporel entrenamientotrasunprogramadeejerciciodeenduranciade8semanas,tantoenratasde3 comode18meses(Mallikarjunaycols.,2009;Sunycols.,2010),ytrasunaplanificaciónde ejerciciosdenatacióndurante4semanas(Misraycols.,2009).Porelcontrario,otrosautores noobtuvieroncambiossignificativosenlasconcentracionesdeMDAproducidosen determinadosprogramasdeentrenamiento(Liuycols.,2000;Metinycols.,2002;ChoiyCho, 2007;BoverisyNavarro,2008),inclusocuandosemodificóladietadelosanimales, enriqueciéndolacongrasashidrogenadasoconaceitedecacahuete(KaranthyJeevaratnam, 2010);mientrasque,enunprogramade8semanasdenatación,eltratamientoconcomitante condietasricasenaceitedemaízygenisteínaredujolasconcentracionesdeTBARSenratas envejecidas(Eksakulklaycols.,2009). Aligualquesucedíaconlaperoxidaciónlipídica,elejerciciofísicoagudoyel entrenamientotambiénindujeronlesiónoxidativaalasproteínasenloshomogeneizados hepáticos.Mientrasejerciciosdenataciónagudosllevadosalextremodelaextenuación tambiénprodujeronunamarcadacarbonilaciónenhomogeneizadoshepáticosderata(Koriviy cols.,2012),otrosestudiosnohandetectadocarbonilaciónhepática,apesardeseguir protocolosmáximoscomoelnuestro(Liuycols.,2000;deOliveira,2003).Porelcontrario,en programasdeentrenamientode8a24semanas,sehanobtenidodescensosdelcontenidode carbonilosproteicosdehomogeneizadoshepáticos(Liuycols.,2000;BoverisyNavarro,2008; Teodoroycols.,2012),opequeñoscambiosnosignificativos(Wittycols.,1992). Ademásdelhígado,otrotejidodondevaloramoslosefectossistémicosdelejercicio físicoenlafluidezdelasmembranasfueeldelsistemanerviosocentral.Ésteesclavepara valorarlosefectostóxicosdelosradicaleslibres,yaqueesespecialmentevulnerablepor contenerelevadasconcentracionesdeácidosgrasospoliinsaturados,losmássusceptiblesde lesióndurantelareaccióndelaLPO;porposeerunflujosanguíneomuyelevado,yutilizar,por tanto,unaenormecantidaddeoxígenoparaproducirATP;y,finalmente,porsupobrezaen enzimasantioxidantes.Porejemplo,enlarata,encomparaciónconelhígado,laactividadde lacatalasaesdetansólounveinteavo,mientrasquelasdelaSODylaGPxesdeapenasun tercio(Husainycols.,1996).
Discusión 127 Atendiendoanuestrosresultados,elejerciciofísico,yaseaagudohastalaextenuación ounentrenamientodediferentesperiodosdeduración,redujosignificativamentelafluidezen lossinaptosomas.Estamarcadarigidez,quenoseaprecióanivelhepático,puededeberseala mayorsensibilidadquetieneeltejidonerviosoalestrésoxidativoyalaredistribucióndeflujo sanguíneoqueelejercicioprovoca.Lahiperemiamuscular,durantelaactividadfísica,selogra nosóloatravésdeunaumentodelgastocardiacoydelosmecanismosadaptativosdela microcirculaciónmuscular,sinotambiénreduciendoelflujosanguíneoenterritoriostales comolosdependientesdelacirculaciónesplácnica,queincluyelahepática.Encambio,elflujo delacirculacióncerebraltiendeamantenerseconstantedurantelaactividadfísica,hechoque, sinduda,puedecontribuiralimitarelaccesoalhígado,víahemática,demuchasEROSy mantener,oinclusoaumentarligeramente,lasquerecibeeltejidonerviosocentral.Nuestros resultadosdiscrepanconlosdeunestudioprevio,tambiénrealizadoenlarata,quevalorólos efectosdeunapruebaindividualagudahastalaextenuaciónendiversaslocalizaciones encefálicas,medianteespectrometríaderesonanciadelspindeloselectrones.Aexcepcióndel troncoencéfalo,dondeseobtuvounaumentodelafluidez,enelrestodeterritoriosnohubo cambiossignificativosenlossinaptosomas(Hiramatsuycols.,1993).Asimismo,enotro estudiorealizadoenratones,trasnuevesemanasdeentrenamiento,tampocosemodificóla fluidezenlossinaptosomas(Renycols.,2010). Anivelmitocondrial,nuestrasobservacionessonlasúnicasquevaloranlosefectosdel ejerciciofísicoeneltejidonervioso.Aestenivel,yadiferenciadeloquesucedióenelhígado, nielejercicioagudonielentrenamientoprodujeroncambiossignificativos.Ladiferente respuestasistémicaalejercicioentreeltejidonerviosocentralyelhepáticopuede comprendersesisecomparalagranactividadmetabólicaquedesarrollaelhígadodepurando multituddeproductosdedesechogeneradosdurantelacontracciónmusculary,enespecial, elpapelcentraldelamitocondriahepáticaenelcatabolismodeestassustancias,unproceso quepuedellevarasociadalaformacióndeimportantescantidadesderadicaleslibres.Porel contrario,lafuncióndelamitocondriaeneltejidonerviosotansóloselimitaaaseguraralas neuronasunaproduccióndeATPlomásconstanteposible,conindependenciadelgradode actividadfísicadesarrollada. Aligualqueennuestroestudio,elejerciciofísicoagudoaumentóelnivelde peroxidaciónlipídicaenelestriadoderatasquerealizaronunaergometríadetipomáximo (Somaniycols.,1996),onatacióndurante30minutos(Akilycols.,2011);enotrasocasiones, loscambiosqueseprodujeronnofueronestadísticamentesignificativos(Liuycols.,2000;de Oliveiraycols.,2003;Turgutycols.,2003;Aksuycols.,2009).Respectoalentrenamiento,
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 128 variosestudiosenratayratónconcluyeron,aligualquenosotros,queentrenamientosde diferenteduraciónnomuestrancambiossignificativos:12días(Brocardoycols.,2012),6 semanasymedia(Coşkunycols.,2005),2meses(Ogonovszkyycols.,2005;Ozkayaycols., 2007;Aksuycols.,2009;Tuonycols.,2010),9semanas(Radákycols.,2001)ó3meses(Santin ycols.,2011).Enotrostrabajos,elentrenamientoprodujodescensossignificativos:6semanas ymedia(HusainySomani,1998),8(Liuycols.,2000)ó24(BoverisyNavarro,2008).Porotra parte,Misraycols.(2009)observaronqueunentrenamientodenataciónde4semanas provocóunaumentointensodelasconcentracionesdeTBARSenelsistemanervioso. Respectoaldañooxidativoaproteínas,nohemosobservadocambiossignificativos traselejercicioagudomáximoolosperiodosdeentrenamiento.Igualmente,tampocosehan observadocambiosnienhomogeneizadostotalesnienmitocondriascerebralestrasesfuerzo agudooentrenamiento(Liuycols.,2000;Toldyycols.,2005;Lappalainenycols.,2010;Tuony cols.,2010;Brocardoycols.,2012),sibienlosresultadosdelentrenamientodiscrepancon otrosestudios,posiblementeporlagranvariabilidaddeprogramasdeentrenamiento utilizados(Radákycols.,2001;deOliveiraycols.,2003;Ogonovszkyycols.,2005;Boverisy Navarro,2008;Szaboycols.,2010;Santinycols.,2011).Cabereseñarque,mientrasel ejercicioagudotuvoefectosdiversossobrelaactividadantioxidanteenzimáticaeneltejido nervioso,condescensosdelaSODenlacortezacerebral,aumentosdelacatalasaencortezay estriado,yaumentosydescensosdelaGPxenlacortezayestriado,respectivamente(Somani ycols.,1996);elentrenamientoaumentólaactividadenzimáticaantioxidante,y,enespecial, ladelaSODencerebromedioyestriado(Somaniycols.,1995b).Porotraparte,el entrenamientomejorólarelaciónGSH/GSSGenelcerebromedioyenlacortezacerebral,un efectoquesedebefundamentalmentealdescensodelosnivelesdeGSSGconmantenimiento delGSH(Somaniycols.,1995b). Estasrespuestasadaptativasduranteelentrenamiento,enelsistemanerviosocentral, podríancontribuirasusefectosbeneficiosos,quenosotroshemosobservadoenlos homogeneizadosdeltejidonerviosocentral,manteniendounosnivelesdeperoxidación lipídicayoxidaciónproteicasimilareso,incluso,ligeramenteinferioresalosobtenidosenlos controles.
129 7. CONCLUSIONES
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 130
Conclusiones 131 Enlíneasgenerales,elejerciciofísicodisminuyólafluidezdelasmembranascelularesy mitocondrialesaisladasdelostejidosmuscular,hepáticoynerviosocentral,eindujoestrés oxidativoenhomogeneizadosdeestosórganos.Comoconclusiones,establecemoslas siguientes: 1. Elejercicioagudohastalaextenuacióncausóunamarcadarigidezenlamembranacelular ymitocondrialdelosmúsculosesqueléticoycardiaco.Losaumentosdelaoxidación mediadaporradicaleslibresenlípidosyproteínaspuedenserlosresponsables,almenos parcialmente,delarigidezenlasmembranasmusculares. 2. Laactividadmuscularagudacausóoxidacióndelípidosyproteínasenelhígadoy peroxidaciónlipídicaenelsistemanerviosocentral.Anivelhepáticosóloseobservó rigidezsignificativaenlamitocondria.Eneltejidonervioso,sumayorsusceptibilidadala peroxidaciónlipídicafue,enbuenamedida,responsabledelarigidezobservadaenla membranacelular,sinquehubieracambiossignificativosanivelmitocondrial. 3. Elentrenamientoredujolafluidezenlasmembranascelularesymitocondriales muscularesdeformadirectamenteproporcionalasuduración.Losnivelesdeoxidación lipídicayproteica,entérminosgenerales,fueronmenoresquelosalcanzadostrasun ejercicioagudohastalaextenuación. 4. Tantolaperoxidaciónlipídicacomolacarbonilaciónenloshomogeneizadosdelmúsculo esqueléticotuvieronunaclaratendenciaareducirsealaumentarladuracióndel entrenamiento,posiblementeporunamejoradelasdefensasantioxidantes.Estos resultadossugierenquelarigidezenlasmembranasmuscularesasociadaal entrenamientosedebióaotrascausasdiferentesalestrésoxidativo. 5. Elentrenamientoindujorigidezenlasmembranasmitocondrialeshepáticasyenlas celularesdeltejidonervioso.Mientrasqueenelhígadolalesiónoxidativafuealtaen lípidosyproteínas,posiblementecomoconsecuenciadesumayoractividadmetabólica, enelcerebroelentrenamientotuvounmarcadoefectobeneficioso,entérminosde reduccióndelaperoxidaciónlipídica,hechoquepudieradeberseaunincremento adaptativodelasdefensasantioxidantesproducidoporelejercicioaeróbicoregular.
Efectos del ejercicio físico en la fluidez de membranas celulares y mitocondriales Su relación con el estrés oxidativo 132