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2013 51 Yupanqui Alberto Caldas Zuleta Regulación de los transportadores de fosfato mediante receptores nucleares LXR y FXR Departamento Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Sorribas Alejaldre, Víctor Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Yupanqui Alberto Caldas Zuleta REGULACIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO MEDIANTE RECEPTORES NUCLEARES LXR Y FXR Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Sorribas Alejaldre, Víctor Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA TESIS%DOCTORAL% % REGULACIÓN+DE+LOS+TRANSPORTADORES+DE+FOSFATO+ MEDIANTE+RECEPTORES+NUCLEARES+LXR+Y+FXR% % YUPANQUI+ALBERTO+CALDAS+ZULETA% DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA, MEDICINA LEGAL Y FORENSE Y TOXICOLOGÍA TESIS DOCTORAL REGULACIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO MEDIANTE RECEPTORES NUCLEARES LXR Y FXR Memoria presentada por Yupanqui Alberto Caldas Zuleta, Licenciado en Química, para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, bajo la dirección de Víctor Sorribas Alejaldre, Catedrático de Toxicología de la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, Marzo de 2013 Este trabajo ha sido realizado con la subvención de una beca predoctoral del NIH (National Institue of Health) de los Estados Unidos (referencia 3R01 AG026529) y una beca de movilidad para la investigación de la Diputación General de Aragón (Referencia FMI37/10) AGRADECIMIENTOS Gracias a todos aquellos que me han sido parte de este logro: A la Universidad de Zaragoza y a Víctor por su apoyo dentro y fuera del laboratorio. Al profesor Moshe Levi y a la Universidad de Colorado Denver por la posibilidad de desarrollar parte del proyecto de investigación en Denver. A mis amigos del laboratorio con los que he compartido grandes experiencias: Héctor, Eduardo, Ana, Cecilia, María Jesús y Michael. A mi familia por su soporte. Finally, thank you to my lovely wife who has supported me all the way through. GBUA. 2 La homeostasis del fosfato inorgánico (Pi) se controla mediante una serie de mecanismos neuroendocrinos, que actúan sobre el intestino, hueso y riñón. Estos mecanismos se alteran en situaciones patológicas como la enfermedad renal crónica, durante la cual puede generarse hiperfosfatemia. Ésta, junto a las dislipidemias, son factores asociados al desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La nefropatía diabética combina todos estos factores, ya que la acumulación de lípidos en el riñón acelera la insuficiencia renal. El estudio de estas patologías ha permitido el descubrimiento de los receptores nucleares LXR (Liver X Receptor) y FXR (Farnesoid X Receptor), y el establecimiento de nuevas estrategias farmacológicas basadas en sus activaciones. Hemos demostrado que LXR y FXR parecen regular la expresión de los transportadores de fosfato en intestino y riñón, y así como la fosfatemia. Con respecto a los transportadores de fosfato NaPi2b y PiT1 y su importancia en la absorción intestinal de Pi, hemos demostrado que: 1) NaPi2b y PiT1 se expresan en la membrana apical de enterocitos; 2) la expresión es mayor en duodeno y yeyuno, al igual que lo es el transporte de Pi; y 3) durante la adaptación crónica a dieta baja en fosfato, la expresión NaPi2b se incrementa solamente en yeyuno, mientras que esa expresión es también máxima en la adaptación aguda a dieta alta en fosfato. Los transportadores de Pi son regulados también por FXR y LXR en células renales OK (Opossum Kidney) y en íleon de ratón, concluyendo que: 1) los agonistas de LXR reducen la expresión de NaPi2b en intestino, y de NaPi2a, NaPi2c, y PiT2 en riñón; 2) estos agonistas disminuyen la concentración de Pi en sangre e incrementan la excreción de Pi en la orina; y 3) los resultados observados en ratón, son reproducibles en el modelo celular renal, células OK, y en éstas se observa una menor expresión de NaPi4. Finalmente, hemos establecido el primer modelo celular para el estudio de los transportadores de Pi: 1) las células CaCo-2BBE expresan el transportador de fosfato NaPi2b; 2) el transporte de Pi es sodio dependiente, en condiciones fisiológicas (1 mM Pi en medio de cultivo); 3) hay un incremento de hasta 5 veces en el transporte de fosfato sodio independiente, como respuesta a medios con altas concentraciones de Pi (4 mM Pi); 4) estudios de inhibición y cinéticas de Michaelis-Menten evidencian la presencia de un nuevo transportador de Pi, sin identificar. 3 II. OBJETIVOS 4 Nuestro objetivo principal ha sido la caracterización de los efectos de los agonistas de los receptores nucleares FXR y LXR en los transportadores renales e intestinales de fosfato, y para ello hemos establecido los siguientes objetivos parciales: 1) Identificar los diferentes transportadores de fosfato expresados en el intestino delgado. - Caracterizar la abundancia en proteína y ARN de los diferentes transportadores de fosfato en los tres segmentos del intestino delgado de rata. - Evaluar la respuesta de los transportadores de fosfato a dietas con concentraciones alta y baja de fosfato, en los tres diferentes segmentos del intestino delgado. 2) Determinar los efectos de los agonistas del FXR y LXR en modelos celulares (in vitro). - Determinar las concentraciones citotóxicas de los agonistas del FXR y LXR en cultivo celular. - Determinar las concentraciones farmacológicas para la activación de los genes diana de los agonistas de LXR y FXR. - Determinar los efectos en el transporte de fosfato a las concentraciones farmacológicas. 3) Evaluar los efectos de los agonistas de los receptores nucleares FXR y LXR en ratón (in vivo). - Analizar cambios en la expresión de los transportadores de fosfato en riñón e intestino. - Medir los cambios en las concentraciones de fosfato en sangre y orina, y las concentraciones de las hormonas más importantes en la regulación del fosfato. 5 4) Establecer un modelo celular para el estudio de la regulación de los transportadores de fosfato en intestino, y mejorar el existente para el riñón. 6 III. INTRODUCCIÓN 7 El fosfato inorgánico (Pi) es el anión más abundante en el cuerpo humano y es un componente esencial de diferentes procesos biológicos: metabolismo de ATP, síntesis de fosfolípidos y otros componentes de la membrana celular, de ácidos nucleicos, constituyente de hueso, transducción intracelular de señales, control del pH, etc. En el hueso se encuentra el mayor porcentaje de Pi (80% a 85% del total del organismo), aunque también está presente en los fluidos extracelulares (alrededor del 1%) en forma de ion libre. En esta tesis doctoral nos hemos ocupado de este último, es decir, de la regulación de la concentración de Pi en los fluidos extracelulares por parte de los transportadores de fosfato [1, 2] . El control de la homeostasis del Pi se lleva a cabo mediante una serie de mecanismos neuroendocrinos, que actúan sincronizadamente sobre el intestino, hueso y riñón (Figura 1 ). En estos tejidos se expresan principalmente los transportadores de Pi de tipo II, los cuales son, en últimas, los efectores responsables de mantener dicha homeostasis. ! Figura 1. Órganos involucrados en la regulación del fosfato inorgánico. También se indican las cantidades aproximadas de fosfato metabolizado en estos órganos, en condiciones fisiológicas. Modificado de Amir S. Nature Reviews Nephrology 6, 657-665, 2010. 8 La homeostasis del fosfato es el resultado neto de tres mecanismos: 1) La absorción del fosfato proveniente de los alimentos (aproximadamente entre 800 y 1200 mg al día en humano adulto), de los cuales el 70% es absorbido y el remanente excretado en la materia fecal. 2) De la liberación de los huesos 3) De la cantidad excretada/reabsorbida en el riñón, órgano que hasta ahora se había considerado el principal órgano en la regulación de la homeostasis del Pi. En condiciones fisiológicas en el hombre, la concentración de Pi libre en el plasma sanguíneo está en un rango fisiológico de entre 0.9 y 1.4 mM. Sin embargo, esta concentración puede verse alterada como suele ocurrir, por ejemplo, en insuficiencia renal crónica. En este caso tiene lugar una hiperfosfatemia, que está asociada a un gran número de complicaciones vasculares y renales, como la aterosclerosis o calcificación vascular medial [3, 4]. Por todo ello, el estudio de la regulación de los transportadores de Pi es de gran interés científico y relevancia clínica. 1. EL RIÑÓN COMO ÓRGANO FUNDAMENTAL EN LA HOMEOSTASIS DEL FOSFATO. El riñón es considerado el órgano más importante en la regulación de la homeostasis del fosfato en condiciones normales. Por él se ultrafiltra el fosfato de la sangre, pero que en condiciones normales un 70% aproximadamente de ese fosfato es reabsorbido en el túbulo proximal, y el resto es excretado con la orina. Esa cantidad excretada es similar a la cantidad absorbida por el intestino en condiciones normales, lo cual proporciona un equilibrio entre ingestión y excreción que, sin embargo, puede verse afectado por muchos factores. La unidad funcional fundamental del riñón es la nefrona [1]. En cada riñón humano hay entre 0.6 x 106 y 1.4 x 106 nefronas, mientras que el de 9 ratón cuenta con unas 30.000 [5]. Los componentes fundamentales de la nefrona son el corpúsculo de Malpighi (constituido por el glomérulo y la cápsula de Bowman), el túbulo proximal (porción contorneada y recta), el asa de Henle, el túbulo distal (contorneado y recto) y el túbulo colector, todos de origen metanéfrico. El túbulo colector, que incluye, el túbulo colector cortical, el túbulo colector de la médula externa y el túbulo colector de la médula interna, no es considerado parte de la nefrona porque embriológicamente no deriva del blastema metanéfrico. Sin embargo, todos los componentes de la nefrona y el túbulo colector están relacionados funcionalmente (Figura 2). En el riñón, la reabsorción del Pi y su regulación se lleva a cabo principalmente en el túbulo proximal. Por él se reabsorbe el 60-70 % del fosfato total reabsorbido por el riñón, mientras que el resto se reabsorbería en los segmentos distales de la nefrona![6]. El proceso de reabsorción de Pi en el túbulo proximal es mediado por los transportadores que allí se expresan. Figura 2. Esquema de la nefrona humana. Modificado de Prie, D. N Engl J Med 2010. 10 1.1. Transportadores de fosfato renales En la membrana apical en borde en cepillo de las células del túbulo proximal se expresan los transportadores de fosfato (cotransportadores sodio/fosfato, NaPi), proteínas encargadas de la reabsorción del fosfato del fluido tubular. Estos transportadores usan la energía libre del gradiente electroquímico del Na+ para transportar fosfato al interior de la célula. Diferentes factores dietéticos, hormonales y metabólicos afectan a la expresión, tráfico y función de los transportadores de fosfato, y por ende a la regulación de la homeostasis del fosfato. Tres familias diferentes de transportadores NaPi han sido identificadas en el riñón: tipo I (NaPi-1; Npt1; SLC17), tipo II (NaPi2a o NaPi-IIa, Npt2a, SLC34A1; NaPi2c o NaPi-IIc, Npt2c, SLC34A3), y tipo III (PiT-1, SLC20A1; PiT-2, SLC20A2)[7]. Los transportadores involucrados en la reabsorción de fosfato en el túbulo proximal son, al menos, NaPi2a, NaPi2c y PiT2, y la expresión de todos ellos en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo proximal ha sido descrita recientemente [8, 9] (Figura 3). En los dos ! Figura 3. Expresión de los transportadores de fosfato en las células del túbulo proximal. Modificado de Prie, D. N Engl J Med 2010;362:2399-409. 11 primeros, principalmente el NaPi2a, se ha enfocado el estudio de la regulación del transporte de fosfato. ! 1.2. NaPi2a. NaPi2a pertenece a la familia de los SLC34, del inglés Solute Carrier Family 34, también conocidos como transportadores de Pi de tipo II, que son similares entre muchas especies incluido humanos![10,! 11]. El NaPi2a es la isoforma predominante en el túbulo proximal del riñón, y se expresa predominantemente en los segmentos S1 y S2 del túbulo proximal. Varios estudios del ratón carente de NaPi2a (NaPi2a K.O.) muestran su importancia fisiológica, ya que es responsable de casi el 70% de la reabsorción del Pi de la orina primaria[12]. Sin embargo, este porcentaje puede ser aún mayor, ya que otros transportadores pueden suplir en el ratón la ausencia de NaPi2a. Por eso, más recientemente se ha estimado que en condiciones normales, NaPi2a puede encargarse de más del 90 % de la reabsorción [13]. Figura 4. Localización de los transportadores de fosfato en el túbulo proximal del riñón. Modificado de Alizadeh Naderi, A. S. & Reilly, R. F. Nat. Rev. Nephrol. 2010 18 Los efectos generados por dietas de alto o bajo Pi tanto en el intestino como en el riñón, se explican por cambios en la abundancia de los transportadores en la BBM, tanto en el tejido intestinal como en el riñón. Estos cambios se han determinado experimentalmente mediante inmunoadsorción (Western blot) e inmunohistoquímica en intestino delgado, túbulos renales y en líneas celulares. También se han confirmado con pruebas in vitro de transporte de Pi radioactivo (32P) en tejido animal (para el caso del intestino), o en vesículas membranosas aisladas de BBM de mucosa intestinal o túbulo proximal de riñón. Así por ejemplo, se ha descrito un incremento de NaPi2a, NaPi2c, y PiT2 en la membrana de borde en cepillo en respuesta a dietas de bajo Pi [13, 27, 28], y un incremento de NaPi2b en el intestino delgado. Además, trabajos en nuestro grupo han determinado que diferentes segmentos del intestino delgado de rata responden de modo diferente a dietas de alta y baja concentración de fosfato. Dichas adaptaciones, como en el caso del duodeno de rata, en donde cambios agudos de la concentración de Pi (de baja a alta) inducen un mayor transporte y una mayor expresión del transportador NaPi2b, se han podido corroborar en un nuevo modelo intestinal de transporte de fosfato. Todo esto forma parte de los estudios realizados en esta tesis doctoral. (Giral-Caldas AJP renal 2009) 3.2. FGF23. La hormona conocida como FGF23, factor 23 de crecimiento de fibroblastos (del inglés Fibroblast Growth Factor 23) es el miembro mas destacado de las llamadas fosfatoninas, las cuales son un grupo de factores humorales en el plasma sanguíneo con efecto fosfatúrico, es decir, incrementan la excreción de Pi por la orina. El término “fosfatonina” fue introducido en 1994 por Cai y cols. a partir de estudios de osteomalacia inducida por tumor [29, 30]. El FGF23 fue descubierto en estudios que buscaban determinar la causa de la osteomalacia inducida por tumor asociada a hipofosfatemia [31]. Estos investigadores demostraron que el FGF23 es una hormona producida por los osteocitos, con capacidad de regular la homeostasis del fosfato, 19 manteniendo una conexión directa entre el hueso y el riñón. Cambios en la formación de hueso y en la concentración de Pi en sangre, estimulan la secreción de esta hormona por los osteocitos, ya que estas células tienen la capacidad modular el depósito de Pi en los huesos. Cuando la concentración de Pi en sangre se incrementa, bien sea por una dieta rica en Pi o por liberación desde el hueso, el FGF23 es expresado por los osteocitos y actúa sobre el túbulo proximal del riñón limitando la reabsorción, con el consecuente incremento en la excreción de Pi en la orina. Aunque el mecanismo exacto de acción del FGF23 en el riñón no se ha estudiado tanto como los efectos del PTH, se sabe que el FGF23 provoca una reducción en la expresión de NaPi2a y NaPi2c en el túbulo proximal. Este efecto está mediado por el receptor del FGF23 (FGFR1) y el co-receptor de la proteína Klotho, que inducen una cadena de señales entre las cuales las que destacan la fosforilación de la quinasa reguladora de señal extracelular, ERK (del ingles extracelular signalregulated kinase), y del factor de transcripción Erg-1 (early growth response-1 gene). La fosforilación de estas proteínas es requerida para inducir la degradación del NaPi2a de las BBM. FGF23 también inhibe la expresión de vitamina D, e incrementa su catabolismo al inducir la expresión de la enzima 24-OH hidroxilasa. 3.3. Hormona paratiroidea (PTH). Esta hormona, secretada por las glándulas paratiroideas, esta constituida por 84 aminoácidos en su forma madura. Su síntesis y secreción está finamente regulada por la concentración extracelular de calcio iónico, y es secretada al torrente sanguíneo cuando la concentración plasmática de calcio disminuye, lo cual la convierte en uno de los reguladores más importantes de la homeostasis del calcio. Su acción se ejerce principalmente sobre el riñón y el hueso, cuyas células expresan el receptor de PTH de tipo 1 (PTH1R)[32]. La PTH estimula directamente la reabsorción tubular de calcio en el riñón, mientras que en el hueso induce la liberación de calcio de la matriz. Además de las acciones reguladoras sobre la homeostasis del calcio a cargo de la PTH, hay que añadir su función en el mantenimiento de las concentraciones 20 sanguíneas de fosfato por medio de la inhibición de la reabsorción en los túbulos proximal y distal del riñón. Aún así, hay que hacer notar que otros factores son más importantes que la PTH en la regulación de la homeostasis del fosfato, particularmente la concentración de Pi de la dieta. La regulación proximal sobre el transporte de fosfato mediada por PTH, ha sido un mecanismo muy estudiado en los últimos veinte años. Esta hormona inhibe la actividad de los cotransportadores Na/Pi de la membrana de borde en cepillo del túbulo renal, induciendo fosfaturia. Este efecto se relaciona, una vez más, con una disminución en el número de transportadores en la membrana apical, en especial de NaPi2a, aunque también se ha descrito su efecto sobre NaPi2c (Traebert et al. 2000; Traebert et al. 2000). Los efectos prolongados de la PTH conducen también a un descenso en el contenido de ARNm de NaPi2a (Kempson et al. 1995). De nuevo, la caracterización de los mecanismos celulares implicados en la acción de la PTH se han realizado tanto en modelos animales como en líneas celulares renales. En este último caso, se ha usado principalmente la línea OK (opossum kidney), debido a que es la única línea celular renal identificada que muestra precisamente ese control del transporte de Pi por la PTH (Teitelbaum et al. 1984; Malmstrom et al. 1986). De hecho, fue el receptor PTH1R de la línea celular OK uno de los primeros en ser clonado y caracterizado (Juppner et al. 1991). El PTH1R pertenece a la superfamilia de receptores asociados a proteínas G (GPCR), y debido a sus características estructurales se engloba dentro de la clase II o familia B, junto a los receptores de secretina, calcitonina, glucagón y otras hormonas peptídicas. Por lo tanto la acción del transportador esta asociada a la actividad de proteínas G heterotriméricas: en el caso de PTH, Gs, que induce la vía de PKA a través de la activación de la enzima adenilato ciclasa y la producción de AMPc, y Gq que activa la vía de PKC a través de la activación de la fosfolipasa C (PLC) (Lederer et al. 1998; Pfister et al. 1999; Traebert et al. 2000). En estudios experimentales se han utilizado diferentes péptidos 21 correspondientes a secuencias parciales de la PTH. Los péptidos utilizados con más frecuencia son PTH(1-34) y PTH(3-34), ya que se ha comprobado que la porción final de la hormona de 84 aminoácidos no se requiere para que sea funcionalmente activa. Pero además se ha demostrado que la eliminación de los primeros aminoácidos del péptido, como en el caso de PTH(3-34), es suficiente para eliminar la activación de la ruta del AMPc, y tan sólo se conserva la respuesta a través de la PLC y la PKC. Ambos péptidos 1-34 y 334 son capaces de inhibir el transporte de fosfato en células OK, pero el PTH(3-34) lo reduce en menor grado (Pfister et al. 1999). Posteriormente, se ha demostrado que la activación de la vía de PKC tan sólo ocurre en la zona luminal o membrana apical, mientras que la ruta del AMPc y PKA se activa en la región luminal y en la basolateral (Traebert et al. 2000). Además de provocar la activación de las rutas clásicas de PKA y PKC, el receptor de PTH también induce la activación de la cascada de señalización de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK), a través de la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) (Quamme et al. 1994; Cole 1999; Bacic et al. 2003). La activación de ERK también participa en la regulación del transporte de fosfato renal. No se conoce en detalle su mecanismo de acción, pero la activación de ERK está asociada a la de tirosina quinasas, PI-3K y proteína quinasa C (Lederer et al. 2000). 3.4. Interacciones con las proteínas de dominios PDZ. Es un grupo de proteínas que poseen dominios de interacción conocidos como “PDZ”, llamados así por las siglas de las tres primeras proteínas en que se identificaron (PSD95 –Postsynaptic density protein 95-, Dlg–Drosophilla discs large protein-, ZO-1 –zonula ocludens protein 1-). Este tipo de proteínas se encarga del transporte, localización y andamiaje de proteínas de membrana, así como de la formación de grupos de proteínas de distinta función en la membrana (por ejemplo, receptores, quinasas y transportadores) para la transducción de señales. Algunas proteínas PDZ cumplen una función muy importante en el transporte, localización y ensamblaje de complejos de señalización supramoleculares, y parecen actuar en vivo organizando estos 22 complejos, así como en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular. Para que una célula se comunique de manera eficaz con sus vecinas, los receptores y efectores de las mismas deben estar localizados y organizados en las regiones apropiadas de las células. Esta organización es particularmente crítica en aquellas células más especializadas del organismo. Además, durante los últimos años ha emergido la idea de que las proteínas PDZ son componentes cruciales en la polarización ápico-basal de las células epiteliales, y en la expresión asimétrica de proteínas en los dos dominios de membrana. Para ello, es necesario que exista una correcta expresión de las proteínas de membrana en las células epiteliales polarizadas, proceso que consta de numerosos pasos: 1) Distribución desde la red trans-Golgi (“transGolgi network”, TGN) al dominio de membrana correcto (apical o basolateral), 2) anclaje y/o retención en la membrana plasmática, 3) endocitosis seguida, bien de reciclaje a la membrana plasmática o de marcaje para degradación en lisosomas, o de reparto al dominio de membrana opuesto (por ejemplo transcitosis). Las proteínas PDZ han estado implicadas en uno o más de estos pasos, tanto de proteínas de membrana apical como basolateral. Se han identificado varias proteínas PDZ (NHERFs, Shank2, PIST, y Ezrin) que interactúan con los transportadores de fosfato, particularmente con los transportadores tipo II (NaPi2a, NaPi2b, y NaPi2c). La interacción ocurre gracias a la existencia de secuencias especificas en el extremo C-terminal de estos transportadores conocidas como sitios de unión a dominios PDZ. Las interacciones de NaPi2a y NaPi2c con proteínas de la familia NHERF han sido muy estudiadas. Son cuatro los miembros de esta familia: NHERF1 (EBP50), NHERF2 (E3KARP), NHERF3 (PDZK1), y NHERF4 (PDZK2). De éstas, las interacciones con NHERF1 y PDZK1 han sido las más caracterizadas, ya que parecen ser las más importantes en el trafico de los transportadores de fosfato a la membrana apical. Nuestro grupo ha descubierto que NaPi2a y NaPi2c interactúan de modo diferente con NHERF1 y PDZK1. Por ejemplo, en ratones transgénicos carentes de PDZK1 (PDZK1-KO), NaPi2c pierde la capacidad de adaptarse (al no expresarse en la BBM renal) cuando estos animales se alimentan con una dieta baja en fosfato [33]; NaPi2a y NaPi2b no se ven 23 afectados, sin embargo. En cambio, en el NHERF1 KO, la regulación de NaPI2a es la preferentemente afectada, ya que su presencia en la BBM se ve reducida. Recientes estudios de nuestro grupo demuestran que en las interacciones entre los transportadores de fosfato renales de tipo II con las proteínas PDZ, NaPi2a presenta una mayor afinidad por NHERF1, y que a la vez NaPi2c interactúa principalmente con PDZK1 en células adaptadas a bajo Pi. La afinidad de NaPi2c por PDZK1 es demostrada en un modelo de ratones transgénicos (PDZK1-/-) en el cual NaPi2c no responde a adaptaciones a bajo fosfato. Finalmente, estudios que aún no hemos publicado muestran que NHERF1 también es importante para la regulación del transportador intestinal NaPi2b. 3.5. Función de los lípidos en la regulación de los transportadores de Pi. La membrana plasmática consiste en un ensamble dinámico y organizado de lípidos, y proteínas. Presenta pequeños dominios o microdominios, llamados también balsas lipídicas o lipid rafts, que permiten que grupos de proteínas con afinidad lipídica similar, se encuentren e interactúen. Estos microdominios tienen en común una concentración elevada de colesterol y esfingolípidos, lo cual genera zonas en la membrana más gruesas y menos fluidas [34-44] (Figura 7) Los lipid rafts pueden incorporar o excluir proteínas de un modo selectivo, y así generar un espacio en la membrana para que proteínas afines puedan interactuar entre sí o bien con lípidos. Estos dominios regulan, además, diferentes funciones celulares y transducciones de señales, como por ejemplo PDGF, EGF, receptores endoteliales, adenilatociclasa, MAP quinasa, ERK y PKC [45-53]. 24 Muchas de estas proteínas son importantes para la regulación de los transportadores de fosfato y en la modulación de la transducción de señales, o incluso en la regulación de éstas por parte de los microdominios, lo cual, puede causar a su vez, alteraciones en la regulación de los transportadores de fosfato [54-58]. Los lípidos participan en el trafico de proteínas, concretamente en procesos de endocitosis y exocitosis, de modo que las perturbaciones en el contenido de colesterol u otros lípidos consiguen alterar los mecanismos de endocitosis dependiente o no de clatrinas. [59-67] En el laboratorio del Dr. Levi, se ha mostrado que los transportadores de fosfato renales se encuentran presentes en estos microdominios, y que cambios en la concentración de colesterol en modelos celulares y en vesículas aisladas de riñón de rata, cambian la expresión y actividad de los transportadores de fosfato. 3.6. Vitamina D La vitamina D es esencial para la vida, ya que es un factor determinante en la regulación de la homeostasis del calcio. También es un factor importante en el metabolismo de fosfato, aunque todavía hay muchas dudas con respecto a los mecanismos de regulación de los transportadores de fosfato. La Figura 7. La modulación de la expresión de los transportadores NaPi en la membrana celular por parte del cambio del perfil lipídico. 25 capacidad de regular la homeostasis de calcio y fosfato hace de esta vitamina un centro de enfoque de investigación, no sólo sobre los mecanismos fisiológicos que regulan el metabolismo óseo, sino también sobre una amplia gama de efectos biológicos, tales como la modulación del sistema inmunitario y el control de otras hormonas como la PTH. La vitamina D misma es en sí una pro-hormona que ha de ser convertida al metabolito activo 1,25-dihidroxi-vitamina D [1,25(OH)2D] o calcitriol. Éste actúa principal, aunque no únicamente, mediante su receptor nuclear (VDR, del inglés Vitamin D Receptor) el cual será descrito mas adelante. Este receptor altera la transcripción de genes específicos responsables de las respuestas biológicas que provoca, principalmente la absorción intestinal de calcio y Pi, y la osificación. La activación de la vitamina D por conversión de 25-hidroxi-vitamina D (calcidiol o colecalciferol) a 1,25(OH)2D (calcitriol), ocurre principalmente en los túbulos renales proximales, y depende de la captación endocítica del complejo calcidiol ligado a una proteína extracelular (DBP, Vitamin D Binding Protein), de su procesamiento en los lisosomas, y del tránsito de calcidiol, ligado a una proteína intracelular (principalmente la IDBP3, Intracelular Vitamin D Binding Protein 3), a la mitocondria. En esta organela el calcidiol es metabolizado por la 1-alfa hidroxilasa, una enzima que también se encuentra en muchas otras células en las que el calcitriol tiene un papel auto o para-crino, controlando la diferenciación y proliferación celulares. Por lo tanto, la producción local de 1,25(OH)2D3 depende de la disponibilidad de su precursor, por lo que no sorprende la asociación de deficiencias de vitamina D con cánceres y enfermedades autoinmunes. La producción neta de calcitriol también depende de su tasa de degradación por la 24-beta hidroxilasa mitocondrial a 1,24,25trihidroxivitamina D. La expresión de la 1-alfa-hidroxilasa se ve estimulada por la hormona paratiroidea, y por bajos niveles circulantes de Pi, calcio y calcitriol, mientras la 24-beta hidroxilasa es inhibida por estos factores [68, 69]. El aumento del transporte intestinal de fosfato por parte de la vitamina D se conoce desde la década de los 60s, cuando Harrison y Harrison [70], mostraron que inyecciones de vitamina D en pollos aumentaban la absorción intestinal de fosfato. Dichos estudios fueron confirmados 20 años mas tarde 26 por Fuchs y Peterlik, utilizando vesículas de BBM intestinales de pollos [71, 72]. Posteriormente, Hattenhauer y cols. mostraron que dicho efecto era debido al aumento de la expresión de NaPi2b en el intestino delgado de ratones, efecto confirmado por varios investigadores en la rata [73, 74]. La mayor expresión de NaPi2b provocada por la vitamina D se explicaría parcialmente por una mayor transcripción del gen Npt2b en ratas jóvenes. En ratas adultas, sin embargo, aunque hay una mayor expresión de la proteína NaPi2b no se observan cambios en el ARNm. La regulación de los transportadores de fosfato renales por parte de la vitamina D es aún menos clara, ya que estudios en animales transgénicos muestran un relación indirecta. Experimentos en ratones KO del receptor de la vitamina D (VDR-/-) presentan una expresión disminuida de los tres transportadores renales de Pi, NaPi2a, NaPi2c, y PiT2, así como un menor transporte de Pi en vesículas de BBM renales. Tanto la expresión de transporte como las de los tres transportadores consiguen recuperarse en ratones de (VDR-/-) cuando los animales son alimentados con dietas de rescate (alto contenido de Ca y Pi). Además, otros modelos, como el (FGF23-/- ), presentan hiperfosfatemia y concentraciones elevadas de vitamina D en sangre, así como una expresión elevada del transportador de fosfato renal NaPi2a. Sitara y cols. han hipotetizado con que la hiperfosfatemia en estos ratones es debida a la elevada concentración de vitamina D. Esto lo demuestran al estudiar ratones doble KO de FGF23-/- y 1αOHasa-/-, en el que consiguen el bloqueo del paso final en la síntesis del calcitriol en el riñón, y como consecuencia, una disminución en la concentración de la vitamina D en estos ratones, y por ende, la disminución de la concentración de Pi en plasma[75] 4. PÉRDIDA DE LA HOMEOSTASIS DEL FOSFATO Muchos factores pueden conducir a la pérdida de la homeostasis del fosfato, desde una sobrecarga exógena de fósforo, hasta infecciones, traumatismos y patologías, que pueden afectar la función renal. En general los desórdenes o enfermedades con más relevancia que pueden inducir una pérdida de la regulación del fosfato, bien hacia la hipofosfatemia o 27 hiperfosfatemia, se pueden clasificar en dos grupos, desórdenes genéticos y la enfermedad renal crónica. 4.1. Desórdenes genéticos Existe un grupo de enfermedades hereditarias, afortunadamente poco frecuentes, que tienen en común la generación de un raquitismo asociado a hipofosfatemia. De ellas destaca el XLH (X-Linked Hypophosphatemic Rickets), ya que es el raquitismo hereditario mas común, con una incidencia de 1 persona por cada 20000. La causa de este raquitismo XLH es una mutación en el gen PHEX (Phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome). Las otras hipofosfatemias hereditarias son el ADHR (Autosomal Dominant Hypophosphatemic Rickets) que se genera por una mutación en el gen de FGF23, y el ARHR (Autosomal Recessive Hypophosphatemic Rickets), que indirectamente afecta la expresión de FGF23 por una mutación en el gen DMP1 (Dentin Matrix Acidic Phosphoprotein 1). El segundo grupo de raquitismos hipofosfatémicos hereditarios son los que dependen de mutaciones directas sobre los transportadores de fosfato renales, como las que afectan al gen de NaPi2c generando HHRH (Hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria) [12], o al gen de NaPi2a, que provoca ARFS (Autosomal Recessive Fanconi Syndrome) [15]. 4.2. Enfermedad renal crónica Hay un sinnúmero de factores no hereditarios que pueden generar cambios patológicos en la concentración plasmática de fosfato, como por ejemplo la edad, el alcoholismo, los trasplantes, el síndrome de inmunodeficiencia (SIDA), la diabetes mellitus, y por supuesto la enfermedad renal crónica. Todas estas condiciones afectan principalmente a la reabsorción de Pi en el túbulo proximal. La enfermedad renal crónica es un problema de salud universal, ya que estudios recientes estiman que la prevalencia de Enfermedad Renal Crónica (ERC nivel 1-4) en el mundo es del 13% [76]. En los Estados Unidos el número de pacientes que reciben asistencia por ERC pasó de 10.000 en 1973 a 547.982 en el 2008, con un coste total de $39.460 34 Mucho del conocimiento que se tiene del papel que cumple la vitamina D en la homeostasis del fosfato, y principalmente el transporte de fosfato intestinal, se ha obtenido por medio de modelos animales en los que se ha eliminado la expresión de VDR, lo que en parte refleja la importancia de este receptor. Estudios in vitro han demostrado la presencia de secuencias consenso en el promotor de NaPi2b en roedores, que explicarían el aumento de la expresión de NaPi2b tras tratamientos de vitamina D en ratas, aunque el análisis del gen de NaPi2b humano no muestra resultados similares[74]. 6. MODELOS CELULARES PARA EL ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO Los modelos celulares son una herramienta fundamental en el desarrollo de las ciencias biomédicas, ya que en ellos podemos estudiar con gran detalle los mecanismos celulares que forman parte de los diferentes procesos fisiológicos. Estos modelos pueden ser bien sean cultivos celulares primarios o líneas permanentes, pero su comportamiento se debe aproximar a los procesos fisiológicos reales. En el estudio de la función renal se han utilizado numerosas líneas celulares continuas, derivadas de los distintos tipos celulares que componen la nefrona. Entre las líneas renales más utilizadas podemos citar: MDCK (MadinDarby Canine Kidney) de túbulo distal, MCT (Mouse Cortical Tubule), HEK (Human Embryonic Kidney), A6 de túbulo conector, LLC-PK1 (Porcine Kidney 1) y OK (Opossum Kidney) de túbulo proximal, y líneas de podocitos, entre otras. 35 Figura 10. Morfología de las células OK. Aquí se muestran dos de los diferentes clones de las células OK (OKL y OKH) que forman monocapas y presentan microvellosidades [95] Aunque para el estudio de la función de transportadores renales del túbulo proximal se han utilizado varias líneas celulares, las células OK (Opossum Kidney), que se aislaron a partir de un riñón completo de zarigüeya (Koyama et al. 1978), se considera el modelo celular más aproximado y el mejor establecido durante más de 30 años. La línea celular permanente OK se obtuvo a partir de tejido renal completo de una hembra de zarigüeya norteamericana (Didelphis virginiana). No se realizó una selección clonal (Koyama et al. 1978), lo cual resultó en una mezcla heterogénea de células procedentes de distintas porciones de la nefrona. En su origen, estas células se aislaron para facilitar los estudios de caracterización del cromosoma X, debido al pequeño tamaño de los cromosomas X en esta especie, que permitía distinguirlos más fácilmente de los autosomas y, por tanto, aislarlos para su estudio. Rápidamente se observó que esta línea celular mostraba características epiteliales, polaridad con presencia de microvellosidades, formación de monocapa, y a veces la formación de domos cuando se encuentran hiperconfluentes) (Figura 10). Además de determinó que podía ser utilizada como modelo para el estudio de la fisiología renal, en especial en la caracterización de varios transportadores de túbulo proximal y sus regulaciones, lo que dio origen a varios subclones. Hubo un cambio radical en el campo de aplicación de la línea OK, y eso se debió fundamentalmente al 36 descubrimiento de una de las propiedades más significativas que muestra esta línea celular: su respuesta al tratamiento con hormona paratiroidea (PTH) y por ende la reducción de la expresión del NaPi2a (NaPi4). Esto dio origen al subclón OKP, que ha sido el utilizado en esta tesis doctoral. La capacidad de responder a la hormona PTH atribuye a las células OK una cualidad única frente a otras líneas celulares del túbulo proximal, como las LLC-PK1 o JTC-12.P3, que no poseen dicha característica (Malmstrom et al. 1986), lo cual convirtió a las células OKP en un referente en el estudio del transporte de fosfato dependiente de Na+, y su regulación por PTH y otros factores hormonales o dietéticos (concentración de Pi) [96]. Recientemente, nuestro grupo ha podido determinar que las células OKP expresan los diferentes transportadores de Pi renales, que se encontró tanto en el hombre como en rata y ratón, haciendo este modelo celular aún más relevante. 37 IV. MATERIALES Y MÉTODOS 38 1. REACTIVOS Los reactivos utilizados durante el proyecto han sido de calidad para análisis o para biología molecular. Con excepción de los agonistas que se describen a continuación, los reactivos se obtuvieron principalmente de las marcas Sigma, Invitrogen, Bio-Rad y Fischer Scientific. Las polimerasas empleadas en las clonaciones fueron de alta fidelidad para evitar la introducción de mutaciones en la secuencia clonada (Invitrogen). Las ligasas provinieron de Invitrogen, y las enzimas de restricción de Promega o de New England Biolabs. 1.1. Agonistas de FXR y LXR Para estudiar la activación y el efecto de LXR y FXR se cuenta con un gran número de agonistas: 6-ECDCA (Int-747) de la compañía farmacéutica Intercep de Italia, es un esteroide derivado del ligando natural del FXR, usado ya en ensayos clínicos. El ácido quenodesoxicólico (CDCA) y el ligando sintético GW4064 fueron adquiridos de Sigma. En el caso del LXR, se cuenta también con agonistas esteroideos como el DMHCA proporcionado por la compañía farmacéutica Wyeth Research, y sintéticos comerciales como el TO901317 y GW3965, ambos de Sigma. 39 Figura 11. Estructura de los agonistas del FXR y LXR. Nótese la estructura esteroidal de DMHCA y 6-ECDCA. 2. INSTRUMENTACIÓN • Las Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCRs) así como las Transcripción Reversa (RTs) se realizaron en un termociclador tipo Mastercycler gradient de Eppendorf. (Figura 12) Figura 12. Termociclador. 40 • Las PCR cuantitativas o de tiempo real se realizaron en un termociclador de la marca Bio-Rad, modelo MyiQ Single Color Real Time PCR Detection System. Figura 13. Sistema de detección para PCR tiempo real. • La visualización de los geles de agarosa y la quimioluminiscencia de las membranas de nitrocelulosa se realizaron con un sistema de imagen Biospectrum 500 y una cámara refrigerada de 6 megapixel BioChemi 500. (Figura 14) Figura 14. Sistema de imagen y densitometría. • También se utilizó un sistema de visualización digital de fluorescencia, el Odyssey Infrared Imaging System de la compañía Li-COR para membranas de nitrocelulosa incubadas con anticuerpos secundarios fluorescentes. 41 Figura 15. Sistema de imagen y densitometría Li-COR • El trabajo con cultivos celulares se realizó en una campana de flujo laminar de la marca Forma Scientific. Las incubaciones de las células se llevaron a cabo en un ambiente de CO2 al 5% para células renales y 10% para células intestinales, y a 37 °C mantenidos en una estufa de CO2 de la marca Forma Scientific. • Para la microscopía de fluorescencia y microscopía confocal se usó un microscopio invertido de Zeiss, LSM 510 con un detector NLO-META. Figura 16. Microscopio confocal Zeiss. 3. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Para la primera parte, la determinación de los transportadores de fosfato intestinales se usaron ratas de laboratorio (Rattus norvegicus) albinas de raza ! ! 42 Wistar, obtenidos de Jackson Laboratories (Bar Harbour, ME). Las ratas utilizadas eran machos de 2-3 meses de edad, y un peso de 200-250 gramos. De ellas se purificaron membranas epiteliales del borde en cepillo de los diferentes segmentos del intestino y del riñón. También se han utilizado ratones de laboratorio (Mus musculus) variedad domesticus, que fueron obtenidos de Jackson Laboratories (Bar Harbour, ME). Los ratones utilizados eran machos de la estirpe C57BL/6, de unas 9-12 semanas de edad. Los animales empleados tuvieron acceso libre a las dietas durante los experimentos, con excepción de las adaptaciones agudas a dietas de alto o bajo fosfato, en los que los animales se mantuvieron en ayunas por 20 horas, con periodos alternos de alimentación de 4 horas. Todas las dietas se obtuvieron de Harland Teklad. La dieta normal (2019 chow diet) contiene 0.9% de Ca y 0.7% Pi. Las dietas en alto fosfato contienen un 1.2% de Pi, y las de bajo fosfato un 0.1% de Pi. Los diferentes agonistas fueron suministrados en la dieta: se molieron los cristales del agonista en un mortero y se mezcló con la dieta normal. Los diferentes compuestos se usaron en las siguientes dosis: Tipo de agonista Nombre Dosis diaria Duración FXR 6-ECDCA 35 mg/Kg 4 días FXR Int 767 35 mg/Kg 4 días LXR DMHCA 80 mg/Kg 4 y 15 días LXR TO901317 30 mg/Kg 15 días Tabla 1. Dosis de los diferentes agonistas en dietas de ratón. Este protocolo (39890912) establece específicamente el manejo correcto de estos ratones, y ha sido previamente aprobado por el comité de uso y cuidado animal de la Universidad de Colorado (ACUC, Animal Care and Use Committee) y de la Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza. 43 4. AISLAMIENTO DE MEMBRANAS DE BORDE DE CEPILLO (BBM) Las vesículas en borde en cepillo de rata o de ratón consisten en preparaciones microesféricas de la membrana apical de las células epiteliales polarizadas, bien del túbulo proximal de la nefrona o de los enterocitos. 4.1. Materiales, reactivos y aparatos Una rata macho de aproximadamente 200 gramos de peso. Solución fisiológica salina (NaCl 0.9%). Tampón de aislamiento: Solución de DL-Manitol 300 mM y EGTA 5 mM. tamponada a pH 7.5 con HEPES-Tris 16 mM. Inhibidores de proteasas: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0.5 mM. Tampón de resuspensión: Solución de Manitol 300 mM tamponada a pH 7.4 con HEPES-Tris 16 mM. Cloruro de Magnesio (MgCl2) 1 M. Homogenizador ULTRA-TURRAX T25 previamente enfriado. Supercentrífuga refrigerada a 4º C. Todas las soluciones, material de vidrio, tubos de centrífuga, rotores, y equipamiento en general debe estar previamente enfriado entre 0º C y 4º C. 4.2. Procedimiento para las BBM de riñón. El método seguido es una adaptación del indicado por Biber y cols. en 1981: Brevemente, la rata es narcotizada con inyección intraperitoneal de pentotal, y su muerte es confirmada por decapitación. Una vez extraídos los riñones, se descapsulan y se elimina la porción medular de los mismos. La corteza renal es troceada y triturada en el tampón de aislamiento con EGTA 5 mM. Mediante una precipitación con MgCl2 20 mM (dejando incubar 20 minutos en hielo) y centrifugación diferencial (una centrifugación primera a 2.800 g durante 15 minutos y una segunda del sobrenadante obtenido a 30.000 g durante 40 minutos) se purifican las vesículas en borde en cepillo. Todos los pasos de este proceso se realizan en hielo para evitar la acción de las proteasas y la degradación consecuente de las proteínas. 50 9. TRANSCRIPCIÓN REVERSA Esta técnica nos permite obtener el ADNc (ADN monocatenario) complementario al ARNm que se desea analizar. Antes de iniciar este proceso, se realizó un proceso de digestión del ADN genómico residual con DNAsas (Invitrogen), para luego sintetizar el ADNc utilizando el kit de Bio-Rad iScriptTM como se explicara en el apartado 11.1. 10. WESTERN-BLOTS (SDS-PAGE) Para confirmar los cambios de expresión de las proteínas en distintas condiciones, la técnica de western-blot o inmunoadsorción es la más utilizada en nuestro campo. 10.1. Procedimiento Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.- El SDS (dodecil sulfato sódico) es un detergente desnaturalizante que permite que nuestras proteínas se desplacen mejor a lo largo del gel de poliacrilamida, y además confiere una densidad de carga negativa uniforme a las proteínas proporcional a su tamaño, de modo que éstas migran en función de su masa. En nuestro caso hemos empleado geles con una concentración de 10 % de poliacrilamida. Las muestras utilizadas se diluyeron previamente en un tampón de carga con bromofenol (50mM TrisCl pH 6,8, 30 % glicerol, 1 % SDS, 0,25 % bromofenol) añadiendo un agente reductor como el DTT (Ditiotreitol) al 1 %, que sirve para romper las uniones disulfuro entre las proteínas. Además, hervimos las muestras durante 3-5 minutos para provocar mayor desnaturalización y destrucción de proteasas. Se utilizaron 20-50 µg de proteínas, en función del anticuerpo a utilizar. Los geles separador y stacker se prepararon en el laboratorio añadiendo APS (persulfato de amonio) y TEMED (tetrametiletilenamida) para polimerizar la acrilamida. 51 Uno de los pocillos del gel se reserva para introducir un indicador de masa molecular. En nuestro caso se empleó Benchmark Pre-Stained Protein Ladder (INVITROGEN). El tampón utilizado para que migren las muestras presenta la siguiente composición: 0,3 % Tris Base, 1,5 % Glicina, 0,1 % SDS). Este tampón permite crear un exceso de carga negativa para que las proteínas migren en función de su masa hacia el cátodo. La electroforesis se llevó a cabo a un voltaje constante de 100V durante 2 horas. Una vez obtenida la separación de proteínas, es necesario transferirlas a una membrana de nitrocelulosa. En este caso, la transferencia se realiza a amperaje constante de 200 mA durante 2 horas. Las membranas se bloquearon con PBS, 0,1% Tween-20, 3% leche desnatada, durante 1 hora. Posteriormente se procedió a incubar con el anticuerpo primario al 0,01% de NaN3 (evitar contaminación bacteriana) durante toda la noche en agitación. Al día siguiente se realizaron 2-3 lavados de 10 minutos en PBS-T para eliminar el anticuerpo primario y seguidamente procedimos a incubar con el anticuerpo secundario, bien sea el que contiene HRP (enzima peroxidasa) durante 1 hora, o el conjugado fluorescente de LiCor. Hicimos otros 3 lavados para eliminar el anticuerpo secundario. Por último se reveló la membrana añadiendo el reactivo de quimioluminiscencia (Inmobilon western de Millipore) incubándolo durante 5 minutos. Esta fase se produce la oxidación del luminol, emitiendo luz que es detectable con películas fotográficas, o por el sistema de imagen LiCor o Biospectrum 500, que no requieren revelado. 10.2. Anticuerpos primarios utilizados Anti-SGLT-1 de conejo (CHEMICON) dilución 1/2000 Anti-ß-actina de ratón 1/25000 (SIGMA) Anti-NaPi2a de conejo 1/3000. Secuencia de péptido MMSYSERLGGPAV Anti-NaPi2b de conejo 1/2000. Secuencia de Péptido. CKNLEEEEKEQDVPVKAS 52 Anti-NaPi2c de gallina 1/2000. Secuencia de Péptido. AHCYENPQVIASQQL Anti-Pit-1 de conejo 1/2000 Secuencia de Péptido. SLVAKGQEGIKWSELIK Anti-Pit-2 de conejo 1/1000 Secuencia de Péptido. HCKVGSVVAVGWIRSKA 10.3. Anticuerpos secundarios utilizados HRPAnticonejo IgG HRPAntiratón IgG HRPAntigallina IgG LiCor 600Anticonejo IgG LiCor 800Antigallina IgG 11. SÍNTESIS DE ADNc Y PCR CUANTITATIVAS 11.1. Síntesis de ADN complementario desde ARN total o transcripción reversa Para la síntesis de ADN complementario desde ARN total se utilizó el kit de Bio-Rad iScriptTM ADNc Synthesis kit, según las instrucciones del fabricante. La transcriptasa reversa utilizada en este kit -iScript Reverse Transcriptasederiva del virus MMLV (Moloney Murine Leucemia Virus). Esta enzima posee actividad ARNasa H+, de modo que degrada específicamente el ARN ya utilizado en la transcripción reversa, y que está unido al ADN complementario tras la síntesis. En cambio, no degrada el ARN libre que aún no ha sido utilizado. 11.2. Procedimiento En cada reacción se empleó 1 μg de ARN total (obtenido como se especifica en el apartado 5 de la sección de Materiales y Métodos) diluido con agua libre de ARNasas hasta un volumen de 20 μL, y se siguió el siguiente 53 protocolo de tiempos y temperaturas en un termociclador: 1. 5 minutos a 25° C 2. 30 minutos a 42° C 3. 5 minutos a 85° C 4. Mantenimiento a 4° C (opcional) Tras la incubación, el ADN complementario obtenido se guarda a -20ºC, o bien se procede a su amplificación inmediata mediante reacción en cadena de la polimerasa normal (PCR), o en tiempo real/cuantitativa (RT-PCR /QPCR). 11.3. Amplificación del ADN complementario de interés con cebadores específicos mediante PCR La amplificación de los ADN complementarios de interés se realizó mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) o mediante PCR en tiempo real. Estas técnicas permiten amplificar de forma exponencial el número de copias de ADN limitados por los extremos con una pareja de cebadores específicos durante una serie de ciclos de temperatura. Los ciclos de temperatura (35 para PCR y 45 para tiempo real) permiten la desnaturalización del ADN (a 95° C de temperatura), la hibridación de los cebadores (cada pareja tiene su temperatura específica) y la creación de nuevas copias mediante una ADN polimerasa. En esta Tesis se ha empleado la iProof de BioRad. Esta polimerasa es considerada de alta fidelidad, esto es, el índice de errores que comete – inserciones/deleciones/sustituciones de bases en la cadena amplificada - es significativamente bajo - 1 error por cada 2.2 x 106 bases, comparado con una polimerasa normal cuyo índice de error es 1 por cada 0.4 x 106 bases. Finalmente, para verificar que las PCRs convencionales han funcionado, una alícuota del producto es analizado por electroforesis en un gel de agarosa, y se comprueba que su tamaño y masa son los esperados. Para 54 ello, se corre en paralelo un indicador de pesos moleculares (New England Biolabs) y un indicador de masa de ADN amplificado (Invitrogen). 12. TRANSPORTE DE VESÍCULAS Las vesículas fueron preparadas mediante la doble precipitación en cloruro de magnesio. El enriquecimiento de las membranas fue determinado mediante western-blots de los cotransportadores NaPi2b para intestino y NaPi2a para riñón, comparando las vesículas finales con el homogenizado inicial. Las vesículas mostraron un enriquecimiento de al menos 10-12 veces respecto al homogenizado. El transporte de 32P fue determinado mediante la técnicas de filtración rápida, con la incubación de 10 µL de vesículas en 40 µL de medio de transporte isotónico (0,05 mM H3PO4, 100 mM NaCl, 10 mM Hepes-tris pH 7.4, 40 mM D-manitol, 10 µCi/ml 32P), durante 30 segundos a 37 ºC en baño maría. A continuación se lavaron con 20 ml de solución stop (100mM manitol, 100mM NaCl, 10mM Tris), y se filtraron por filtros de acetato de celulosa, con un tamaño de poro de 0,45 µM. La fuerza iónica de la disolución stop provoca que las vesículas queden retenidas en el filtro. Posteriormente se midió la radiactividad de los filtros mediante un contador de centelleo. Los valores de transporte fueron expresados en pmol Pi/mg de proteína vesicular. 13. TRANSPORTE DE PI EN CÉLULAS. El procedimiento general utilizado consistió en crecer células OKP o CaCo-2BBE en placas de 24 pocillos (NUNC) hasta 48 horas post-confluencia para las células OKP, o dos semanas para las células CaCo-2BBE. Las células se sometieron a diferentes condiciones antes de realizar el protocolo de transporte, que se describe a continuación. Se elimina el medio de las células por aspiración, y se realizan dos lavados con 500 µl de solución de transporte con colina (cloruro de colina 137 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 2.8 mM, MgSO4 1.2 mM, HEPES 10 mM, ajustar pH a 7.4 con Tris base) a temperatura ambiente. Se añaden 200 µl de solución de transporte (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 2.8 mM, MgSO4 1.2 mM, HEPES 10 mM, ajustar pH a 7.4 con Tris base) complementada con fosfato potásico 55 “frío” - 0.05 mM en la mayoría de los experimentosy fosfato marcado 32Pi, en un rango comprendido entre 0.5 y 4 µCi/ml. Se incuban las células con el medio de transporte habitualmente durante 4 o 6 minutos para células OKP, o 20-30 min para células CaCo-2BBE. Transcurrido este tiempo se elimina el medio y se detiene el transporte mediante 4 lavados con 2 ml de solución de parada (cloruro de colina 137 mM, Tris/HCl pH=7.4) enfriada en hielo. Todos estos pasos se repetían para cada pocillo individual a intervalos de 1 minuto, de forma que todos los puntos se incuban exactamente el mismo tiempo. Por último se elimina la solución de parada y se añaden 200 µl de solución de lisis (Triton X-100 0.5% en agua). Parte del sobrenadante final obtenido se utiliza para cuantificar proteínas por el método de BCA, y el resto se emplea para la medida de fosfato incorporado con la ayuda de un contador de centelleo, realizando las lecturas sin líquido de centelleo, lo que se denomina cuentas Cherenkov. En todos los experimentos también se realizó la medida de las soluciones estándar (soluciones de transporte marcadas con 32Pi utilizadas durante la incubación) como referencia en los cálculos, eliminando parte de la variabilidad entre diferentes experimentos. 14. RACE EN CÉLULAS OK La secuenciación del genoma de la especie Didelphis virginiana, de la cual provienen las células OK, no se ha realizado, y por ende para estudiar los diferentes transportadores de fosfato nos hemos visto en la tarea de clonarlos directamente utilizando la metodología de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) o amplificación rápida de los extremos del ADNc. Con esta técnica somos capaces de obtener tanto la región codificante (CDS) como los extremos no traducidos (5 ! y 3 ! UTR) de la secuencia génica. Se trata de una técnica extensamente utilizada, surgiendo distintas variantes basadas en principios similares. Nosotros hemos utilizado el protocolo GeneRacer Kit – Full length RNA ligase-mediated rapid amplification of 5´and 3´cDNA ends (RLM-RACE)- de Invitrogen. 56 Esta técnica se realiza en varios pasos: - Extracción de ARN total de células OK - Obtención de secuencias parciales de células OK, utilizando como patrón las secuencias genómicas de una especie parecida, en este caso Monodelphis domestica, para diseñar los cebadores iniciales. - Diseño de los cebadores específicos del gen (Gene Specific Primers, GSP) - Amplificación de los extremos 5 ! de los transcritos. - Amplificación de los extremos 3 ! de los transcritos - Clonación en un vector de secuenciación. - Secuenciación y ensamblaje de las secuencias 14.1. Extracción de ARN total de células OK Una placa de 100 mm con células OK se cultivó hasta confluencia (aproximadamente 2 x 107 células) y se mantuvo 48 horas más en medio completo. Las células se lisaron y se procedió al aislamiento del ARN mediante Total RNA Purification System (Sigma). Este sencillo sistema es similar al método de extracción de ADN plasmídico conocido como miniprep, y al igual que éste, utiliza una columna con membrana de silicio donde se queda adherido el ARN que posteriormente es eluido con agua libre de ADNsas y ARNsas. El ARN obtenido se cuantificó por medición de su absorbancia a 260 nm, y se analizó su calidad según el cociente de absorbancias a 260/280 nm, y por comprobación de las intensidades de las bandas de 28S y 18S en un gel desnaturalizante (formaldehído) de agarosa para ARN. Una parte del ARN se trata con DNAse I Amplification grade (INVITROGEN), para eliminar el ADN contaminante, como paso previo a la reacción de retrotranscripción o RT-PCR, y el resto se conserva a -80 ºC para la obtención de los extremos 3´ y 5´. 14.2. Obtención de secuencias parciales de células OK A partir del ARN total de células OK tratado con ADNasa I, se preparó 57 ADNc siguiendo el protocolo del SuperScript First-Strand synthesis system for RT-PCR (INVITROGEN). De este ADNc se realizaron PCRs para amplificar segmentos de ADN (400-1000 pares de bases, pb) de los genes a clonar, usando para ello cebadores diseñados con base a homologías con el correspondiente ADNc de Monodelphis domestica. Ésta es una especie de marsupial evolutivamente cercana a Didelphis virginiana. Los cebadores se muestran en el anexo I (Tabla A1). Los productos de PCR que funcionaron se enviaron a secuenciar para obtener secuencias parciales de los transcritos de células OK. A partir de estos fragmentos se diseñaron los cebadores específicos del gen de interés, GSP1 y GSP2, que se utilizaron para obtener las secuencias completas mediante la técnica de RACE. Los cebadores GSP1 y GSP2 se diseñaron cumpliendo las características que indicaba el protocolo de RACE: una longitud entre 23-28 nucleótidos, un contenido de GC entre 5070% y una temperatura de fusión (Tm) superior a 65ºC (preferiblemente superior a 70ºC). Estos cebadores se encuentran recogidos en el anexo I (Tabla A1). 14.3. Amplificación de los extremos 5 ! y 3 ! de los transcritos de OK Por medio de la técnica de RACE se obtiene cada extremo de la secuencia en reacciones distintas. Previo a las amplificaciones específicas por PCR de cada gen, se sintetizaron dos ADNc distintos a partir del ARN modificado de OKP, al cual se le ha ligado el adaptador GeneRacer RNA Oligo en el extremo 5´, y luego con cebadores específicos que reconocen el adaptador insertado, se sintetiza el ADNc (Figura 17). La obtención 3 ! ADNc o 3 !RACE es más sencilla, haciendo uso del sistema convencional de retrotranscripción (RT-PCR) con un cebador poli-dT especial, con dos posiciones degeneradas (NN) previamente al poli-T que favorecen la homogeneidad del ADNc obtenido (Figura 17 y 18). Las reacciones de PCR se realizaron con una polimerasa de alta fidelidad (Platinum High Fidelity Taq de Invitrogen) que consiste en una combinación de polimerasa Taq DNA recombinante y una pequeña cantidad de otra polimerasa con actividad correctora (Pyrococcus species GB-D). Las 58 reacciones se realizaron con un programa “touchdown PCR”, reduciendo la temperatura de anillamiento gradualmente cada varios ciclos. 14.4. Secuenciación y ensamblaje de las secuencias Una vez amplificados los fragmentos de cada transcrito; los productos de PCR o bien se purificaron y se mandaron a secuenciar directamente, o se clonaron dentro del plásmido pPCR-Script, utilizando un sistema de clonación por extremos romos denominado pPCR-Script Amp Cloning kit (Stratagene) (ver esquema inferior). Figura 17. Esquemas de las amplificaciones 5 ! RACE realizadas con el kit de GeneRacer de invitrogen. 59 Figura 18. Esquemas de las amplificaciones 3 ! RACE realizadas con el kit de GeneRacer de invitrogen. En la reacción 3 !RACE se utiliza un cebador poli-T con dos posiciones degeneradas (NV) en su extremo 3 !, para favorecer la formación de un ADNc más homogéneo en esta zona. Los fragmentos obtenidos se analizaron por secuenciación de cadena simple (Sistemas Genómicos, Paterna, España). Cada una de estas secuenciaciones comprendía como máximo entre 600-1000 bp, con lo que fue necesario realizar varias para completar las secuencias. Los cebadores de secuenciación diseñados para ir ampliando la secuencia también se muestran en el anexo I (Tabla A1). Los fragmentos secuenciados se analizaron mediante BLAST, se ensamblaron con ayuda del programa ContigExpress (Vector NTI Suite, INVITROGEN), y se compararon con las secuencias de Monodelphis domestica y de otras especies con el programa AlignX (Vector NTI Suite), para confirmar que la secuencia obtenida era correcta. 15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Todos los datos muestran la media y el error estándar. Los gráficos y el análisis estadístico de los mismos se realizaron con el programa Prism 4 (de la 66 masa de anticuerpo:péptido de 1:10 (Figura 19). El anticuerpo anti-NaPi2b de rata, diseñado frente a un péptido del extremo carboxilo, nos proporcionó dos bandas, de 85 y 110 KDa en condiciones normales, y una tercera de 130KDa que se presenta condiciones de adaptación crónica de bajo fosfato. Se cree que esta banda superior podría estar asociada a diferentes grados de glicosilacion [97, 98] (Figura 20) El anticuerpo anti-PiT1 de rata fue diseñado para reconocer un epítopo del bucle extracelular entre los dominios transmenbranosos cuarto y quinto. Este anticuerpo reconoce una banda de 120 KDa que es bloqueada por el péptido. (Figura 20) Figura 20. Determinación de la especificidad de los AB de NaPi2b y PiT1 por medio de WB. Luego de establecer que la expresión de NaPi2b y PiT1 se encuentra principalmente en duodeno y yeyuno de rata, quisimos determinar si estos transportadores se localizaban en la BBM, para lo cual se realizó un estudio de inmunohistoquímica de los dos diferentes segmentos del intestino delgado. 67 Figura 21. La expresión de los transportadores de fosfato NaPi2b y PiT1 se determinó en BBM de intestino delgado de rata por inmunofluorescencia. Como se observa en la figura 21-A, NaPi2b (en rojo) co-localiza con la actina (verde), la cual es un marcador de BBM. Sin embargo, al igual que en el WB, no se observan diferencias significativas en la expresión de PiT1 (en verde, Figure 21-B) entre el duodeno y yeyuno. La expresión de PiT-1 se observa tanto en BBM (al colocalizar con la actina, en rojo) como en el interior de la vellosidad, lo cual podría deberse a la expresión de PiT1 en las células de la musculatura lisa de los capilares. 4.2. Adaptaciones crónicas a alto y bajo fosfato Por medio del transporte in vitro de 32P en BBM aisladas de duodeno y yeyuno, se determinó los cambios en el transporte intestinal de fosfato, como 68 consecuencia de la adaptación crónica a dietas ricas o pobres en fosfato, y en comparación al transporte en condiciones normales (dietas de 0.6 % Pi) (Figura 22). Se observó que el yeyuno adaptado a dieta baja en fosfato presentaba un mayor transporte de Pi por miligramo de proteína, y aunque hay una reducción aparente en duodeno, ésta no es estadísticamente significativa. Estos resultados se compararon con el transporte de Pi en BBM aisladas del riñón de las mismas ratas, lo cual confirmó la respuesta esperada por parte del riñón a estas condiciones experimentales, y por lo tanto, el correcto diseño experimental. Figura 22. Efecto de las dietas de alto, normal y bajo fosfato, en el transporte de fosfato de duodeno y yeyuno de rata. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. La adaptación del transporte de Pi intestinal en duodeno y yeyuno se debió a un incremento en el transporte sodio dependiente a 100 µM de Pi (Figura 23) Figura 23. Comparación del transporte de fosfato sodio dependiente y sodio independiente, en los dos segmentos del intestino delgado de rata adaptada a dieta alta y baja en fosfato. 69 Para determinar si alguno de los transportadores de fosfato expresados se regulaba de un modo paralelo al transporte en BBM bajo estas adaptaciones crónicas, se analizó la expresión de los dos transportadores NaPi por medio de WB. Se determinó un incremento significativo en la expresión de NaPi2b en el yeyuno de rata (Figura 24A) en respuesta a la dieta baja en fosfato. Este incremento se observa levemente en el duodeno, aunque no es estadísticamente significativo (Figura 24B). No se observó ningún cambio significativo en la expresión de PiT1, tanto en duodeno como en yeyuno. En cambio en el riñón se observó un incremento de los tres transportadores de fosfato NaPi2a, NaPi2c y PiT2 en respuesta la dieta baja en Pi (Figura 24C). Figura 24. Medida del efecto en la expresión de los transportadores intestinales NaPi2b y PiT1 en BBM, por parte de las diferentes concentraciones de Pi en la dieta, en A) duodeno, B) yeyuno y C) riñón. *** P<0.001 frente a la dieta de 1.2% de Pi. 70 Para confirmar el efecto de la dieta deficiente en Pi sobre la expresión de NaPi2b, se midió la abundancia de ARNm en los dos segmentos. Se observó un incremento en la expresión de NaPi2b en el yeyuno, pero no así en el ARNm de PiT1, como se esperaba (Figura 25) Figura 25. Medida de los cambios de expresión del ARNm de los transportadores de fosfato intestinales NaPi2b y PiT1 en duodeno y yeyuno, como respuesta a dietas de alto y bajo fosfato. * P<0.05, frente a la dieta de alto fosfato 1.2% Pi. Luego de observar un incremento en la expresión de NaPi2b en ratas alimentadas con dietas de bajo fosfato, quisimos determinar la expresión de NaPi2b en BBM mediante inmunofluorescencia, bajo estas condiciones y en los diferentes segmentos del intestino delgado. Con ello se confirmó la mayor expresión en yeyuno, representado como el segmento de intestino comprendido entre 20 y 50 cm a partir del píloro (Figura 26), con una expresión leve en el duodeno, y no existente en el íleon. 71 Figura 26. Expresión de NaPI2b a lo largo del intestino delgado de rata. En aquellos segmentos en los que se observó una mayor expresión de NaPi2b, se comparó la abundancia de esta proteína en tejidos de ratas tratadas con dietas de alto y bajo fosfato (Figura 27). En los animales tratados con dietas deficientes en Pi se observó un incremento en la expresión de NaPi2b en la BBM, demostrando la importancia de este transportador en el transporte de fosfato intestinal. 72 Figura 27. Cambios en la expresión de NaPi2b en diferentes segmentos del yeyuno rata, como resultado de las dietas de alto y bajo fosfato. Los resultados de la expresión de los transportadores de fosfato tanto intestinales como renales son congruentes con la concentración de Pi en sangre que presentaron las ratas adaptadas crónicamente a dietas de bajo Pi (Figura 28). Se observa una disminución de la concentración de fosfato en sangre de un 46% (P<0.001) luego de que las ratas fueron alimentadas con una dieta baja en fosfato (0.1%). Figura 28. Concentración de fosfato en sangre de rata. *** P<0.001. 73 4.3. Adaptaciones agudas de bajo a alto fosfato. Los experimentos de adaptaciones agudas se llevan a cabo alimentando los animales durante unas pocas horas, y ello implica que éstos deben estar hambrientos. Para conseguirlo, las ratas son alimentadas durante cuatro horas cada día a lo largo de una semana con la dieta deseada. El día del experimento, las ratas objeto de adaptación aguda son alimentadas con la dieta deseada durante ese mismo tiempo. En el presente experimento, las ratas fueron alimentadas durante una semana con una dieta baja en fosfato durante cuatro horas cada día en la mañana (7-11 am) y en el momento del experimento se les alimentó con la dieta de alto fosfato durante cuatro horas. El grupo control se mantuvo con la dieta baja en fosfato. Previo al sacrificio, se obtiene sangre para analizar su concentración de Pi (Figura 29). Estos valores fueron comparados con los obtenidos de las ratas alimentadas crónicamente con dietas bajas en fosfato. Figura 29. Concentración de Pi en sangre de ratas adaptadas agudamente a dietas de alto fosfato. ** P<0.01, *** P<0.001. Estos resultados muestran un incremento de hasta tres veces en la concentración de Pi en sangre cuando se cambia las dietas de bajo a alto. Además, este incremento ya se observa a las dos horas de la ingesta. Este incremento del Pi en sangre puede ser explicado por una mayor absorción de 74 Pi en el duodeno y yeyuno, ya que al analizar el transporte de 32P en BBM aisladas de estos tejidos se observa un incremento (Figura 30). Los resultados del transporte de Pi en BBM claramente muestra un incremento de casi cinco veces en duodeno, provocado por el cambio de la dieta de baja a alta concentración de fosfato. Como se esperaba, este efecto es inverso al observado en BBM aisladas de riñón, las cuales presentan una reducción en el transporte de Pi de casi un 50%. Sin embargo el incremento en la absorción de fosfato como respuesta a la adaptación aguda de bajo a alto contenido en Pi no se observa en yeyuno. Figura 30. Transporte de Pi en BBM de duodeno, yeyuno y riñón de rata, luego de ser adaptadas agudamente a dietas de alto Pi. ** P<0.01, *** P<0.001. Para determinar qué transportadores están involucrados con este incremento en transporte de Pi en el intestino, se analizó por WB la expresión de los dos transportadores de Pi NaPi2b y PiT1 en BBM aisladas de duodeno e íleon (Figura 31A & B). Esto se realizó igualmente en experimentos paralelos con las BBM de riñón de rata adaptadas agudamente a dieta alta en fosfato (Figura 31C). Se observó un claro incremento en la expresión de NaPi2b en duodeno de ratas adaptadas a dieta alta en Pi durante cuatro horas, con un cambio nimio en yeyuno, que no fue significativo, y sin cambios de expresión de PiT1 en ninguno de los segmentos. Llama la atención, y por ello queda sin plena justificación, que un incremento en la expresión de NaPI2b exclusivamente de, un 70%, sea el responsable del incremento en el transporte de Pi de, aproximadamente, 500%. También se observó una reducción significativa en la expresión de NaPi2a tras el cambio de la dieta de baja a alta concentración de Pi en un 75 periodo de cuatro horas, en ausencia de cambios adicionales en los otros transportadores de fosfato renales. De igual forma se evidencian las diferentes respuestas a estímulos exógenos que presentan los transportadores de fosfato renales, tanto como los intestinales. Figura 31. Análisis de la expresión de los transportadores de Pi en A) duodeno, B) yeyuno y C) riñón, como resultado de adaptaciones agudas a alto Pi. * P<0.05, *** P<0.001. Los cambios en la expresión de NaPi2b en BBM aisladas de duodeno como consecuencia de la adaptación de baja a alta concentración de Pi en la dieta, no se acompañaron de cambios similares en las abundancias de ARNm. Igualmente, tampoco se apreciaron cambios en los niveles de ARNm de PiT1 mediante qPCR (Figura 32). 82 OK-PiT2: Secuencia de ADN completa. GCTACCCNNC GCGATTCGCC CTTGGAACTG ACATGGACTG AAGGAGTAGA AAAGATCGGA CCACGTGCGC AGTGGGCTCC CTGGCGTTAG GCTGGAAAGG TTGACAGCTG CCGCGGCCCT GGCCCTTTCC TCGAGGGTCA TGCTATATCC AGGCTCTGGA AGTCTTGCCT ATGATGATTA AAAAGATACA CAGCTTTTAC CCGAAGAGGA ATGATTCAAG AGTAATTCCC TGCGCCAAAA GAAGCTCATA ATCAAGCAGG TCCAAAGTTT GGATGTTTTA ACAGCCTCAT AAGACAGACA CTTGCAAGAG GGGATATCAC AGCGTTTCCA GTCTCAGAGA AAAATATGGA ATGTGTTTTA CTGCTGACTG AACACAACCA AACAAACTGT ACAGACAATA GTTTGAGAAC CAGCAGTTAG CAGTTTGCTC AGGCTCTTAC ACTCTCCAGC ACTTTCCAGA GCAAAATCTC TGTTTACAAG AACTCTACCT TACAAGGTTT TTACAAAACC TCAAGCGTGG TTTATTTAAG TATTTCTACA AAAGGAAAAC TCCTGCAGTC CACTTGCAAA AATGGCTATG GATGATTACT TGTGGATGGT CATTCTGGGC TTTATCATAG CCTTTATCTT GGCATTTTCT GTTGGTGCAA ATGATGTGGC CAATTCCTTT GGCACAGCTG TGGGCTCTGG CGTGGTGACC CTGAGGCAAG CCTGCATTTT GGCATCCATA TTTGAAACCA CCGGCTCAGT ATTGTTAGGA GCGAAAGTGG GAGAGACTAT TCGAAAAGGT ATCATTGACG TGAACCTATA CAAGGAGACA GTGGAGACGC TGATGGCCGG GGAAGTTAGC GCCATGGTTG GTTCTGCTGT TTGGCAGCTG ATAGCATCAT TCTTGAGACT TCCTATCTCA GGAACTCATT GCATTGTGGG TTCTACCATA GGATTTTCAC TTGTTGCAAT TGGTACAAAA GGTGTACAGT GGATGGAGCT TGTCAAGATT GTTGCTTCTT GGTTTATATC TCCACTGTTG TCTGGTTTCA TGTCTGGCGT GCTGTTTGTG CTGATCAGAA TTTTCATCCT AAAAAAGGAG GACCCAGTCC CCAATGGTCT CCGTGCACTT CCACTGTTCT ATGCTGCTAC CATAGCAATT AATGTCTTTT CCATCATGTA CACAGGGGCA CCAGTATTAG GTTTGACTCT TCCAATGTGG GCTATAGCTC TCATTTCATT TGGCGTTGCT ATTGTATTTG CTGTTTTTGT GTGGTTGGTC GTCTGTCCAT GGATGAAGAG GAAAATAGCA GGCAAATTAA AGAAAGAGGG TGCCCTATCA AGAATATCTA ATGAAAGTCT CCATAAAATC CAAGAAACCG AGTCCCCCGT ATTTAAGGAG CTCCCCGGCG CCAAGGTGAA TGATGACACC ACCGTTCCCC TCACCAGCTC AGCCCCCGAA GCCCCCGGAG TGTCAGAGAG CACAGTGAAT GGAAGCCACT CACGTGTCCC CTATGGCAGG GCCCTCTCCA TGACGCACGG CTCCGGGAGG TCGCCCGTGT CCAACGGCAC GTTCGGCTTT GACGGCCAGC TGCGCAGCGA CGGCCACGTC TACCACACGG TGCACAAGGA CTCGGGCCTC TACAAGGACC TGCTGCACAA AATCCATCTG GACCGGGGGC CGGACGAGAA GCCCTCGCAG GAGCCCAGCT ACAAGCTGCT CCGCCGCAAC AACAGCTACA CGTGCTACAC GGCGGCCATC TGCGGCATGC CCGTGCACTC GGCCTTCAAG GCGGCCGACG TGTCCTCGGC GCCCGAGGAC AGCGAGAAGC TGGTCAGCGA CACCGTGTCC TACTCCAAGA AGAGGCTCCG CTACGACAGC TACTCCAGCT ACTGCAACGC CGTGGCCGAG GCCGAGATCG AGGCCGAGGA AGGCGGCGTG GAGATGAGGC TGGCCTCGGA GCTCACCGAC TCCGGCCAGC CCATGGACGA CCCCGGGGAG GAGGAGAAGG AGGAGAAGGA CACGGCCGAG GTGCACCTCC TCTTCCACTT CCTGCAAGTC CTCACCGCCT GCTTCGGCTC CTTTGCGCAT GGCGGCAACG ATGTCAGTAA TGCCATTGGC CCTTTGGTAG CTTTGTGGCT TATTTACCAA CACAAAGGAG TGATGCAGGA AGCAGCTACT CCTGTCTGGC TGCTGTTTTA TGGAGGAGTC GGTATTTGTG CGGGTCTCTG GGTTTGGGGG AGAAGAGTGA TCCAGACGAT GGGGAAAGAC CTCACACCTA TCACGCCGTC CAGTGGATTC ACTATTGAAT TGGCTTCGGC GTTCACAGTT GTGATAGCTT CCAATGTTGG ACTTCCTGTC AGTACTACAC CCTGCAAGGT TGGCTCAGTG GTAGCAGTGG GCTGGATCCG CTCCCGAAAG GCAGTCGACT GGCATTTTTT CCGGAACATT TTCGTGGCCT GGTTCGTGAC CGTCCCGGTG GCCGGCTTGT TCAGCGCCGC TGTGATGGCC GTCCTGATGT ACGGCATCCT GCCGTACGTG TGATGTGGCT CCAGAGATCA ATAGATTTAT CAATAAAGGG AGAGTTTGAT GGTCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ! Secuencia de amino ácidos. MAMDDYLWMVILGFIIAFILAFSVGANDVANSFGTAVGSGVVTLRQACILASIF ETTGSVLLGAKVGETIRKGIIDVNLYKETVETLMAGEVSAMVGSAVWQLIASFL RLPISGTHCIVGSTIGFSLVAIGTKGVQWMELVKIVASWFISPLLSGFMSGVLF VLIRIFILKKEDPVPNGLRALPLFYAATIAINVFSIMYTGAPVLGLTLPMWAIALIS FGVAIVFAVFVWLVVCPWMKRKIAGKLKKEGALSRISNESLHKIQETESPVFKE LPGAKVNDDTTVPLTSSAPEAPGVSESTVNGSHSRVPYGRALSMTHGSGRS PVSNGTFGFDGQLRSDGHVYHTVHKDSGLYKDLLHKIHLDRGPDEKPSQEPS YKLLRRNNSYTCYTAAICGMPVHSAFKAADVSSAPEDSEKLVSDTVSYSKKRL RYDSYSSYCNAVAEAEIEAEEGGVEMRLASELTDSGQPMDDPGEEEKEEKD TAEVHLLFHFLQVLTACFGSFAHGGNDVSNAIGPLVALWLIYQHKGVMQEAAT PVWLLFYGGVGICAGLWVWGRRVIQTMGKDLTPITPSSGFTIELASAFTVVIAS NVGLPVSTTPCKVGSVVAVGWIRSRKAVDWHFFRNIFVAWFVTVPVAGLFSA AVMAVLMYGILPYVstop 83 OK-PiT1: Secuencia de ADN truncada en 5’. CTTCTCGTGG GGGCCACGAC GTGGCCAACT CCTTCGGCAC GGCCGTGGGC TCCGGGGTCG TGACCCTGCG CCAAGCCTGC ATCCTGGCCA GCATCTTCGA GACGGTGGGC TCCGTGCTGC TGGGGGCCAA GGTGAGCGAG ACCATCCGCG AGGGCCTCAT CGACGTGACC AGGTACAACG CCACCGAGCT CATGGCCGGC TCGGTCAGTG CCATGTTCGG CTCCGCCGTG TGGCAGCTGG CCGCCTCCTT CCTGAAGCTT CCCATTTCCG GGACCCACTG CATTGTCGGG GCGACCATCG GCTTCTCCCT GGTGGCCACC GGGCAGGAAG GGGTCAAATG GTCCGAGCTG CTGAAGATTG TGTTATCGTG GTTCATCTCC CCGCTTCTGT CTGGCATCAT GTCTGCCATC CTCTTCTTCT TAGTTCGCTC CTTCATCCTC CGCAAGAGTG ATCCAGTTCC CAATGGTTTG CGAGCCCTGC CGGTTTTCTA TGCCTGCACA ATTGGAATTA ACCTCTTCTC CATCATGTAC ACTGGAGCAC CCATGCTGGG CTTTGACAAA CTTCCTCTGT GGGGTACCAT CCTCATCTCG GTGGGATGTG CTGTTTTCTC TGCCCTTATC GTCTGGTTCC TTGTCTGTCC CAGGATGAAG AGAAAAATTG AACGAGAAAT CAAATCCAGT CCTTCTGAGA GTCCCTTGAT GGAGAAAAAG AGTAGCTTGA AAGAAGACCA CGAGGAAGCC AAGCTCTCCC TTGGTGATGG GGAGAACAGG CACTGTGCCT CTGAAGTGGG GGCCGCTTCT GTGCCCCTGT GAGCGGCAGT GGAAGAGAGA ACCGTTTCAT TCAAGCTGGG AGACTTGGAG GAAGCCCCGG AGCGGGAGAG GCTTCCTAGT GTAGACATGA AAGAAACAAA TATTGACCAT GCGATGAACG GCGCCGTGCA GTTGCCCAAT GGGAACCTGG TCCAGTTCAA TCAAACAGTC AGCAACCAGA TGAATTCCAG CGGCCACTAT CAGTACCACA CCGTGCACAA GGACTCTGGC TTGTACAAGG AGTTACTTCA TAAGCTGCAC CTCGCCAAGG TGGGGGACTG CATGGGGGAC TCCAGCGACA AACCCCTGAG GCGGAACAAC AGCTACACGT CCTATACCAT GGCCATCTGC GGCATGCCTT TGGATTCATT TCGTGCCAAA GAAGGAGAGC CGAAAGGCGA GGAGATGGAG AAGCTGACCG GGCCCGCCTT GGACTCCAAG AAGAGGGTCC GAATGGACAG CTACACCAGT TACTGCAACG CCGTGTCCGA CATCCACTCG GTGTCTGACG TGGACGTGAG CGTCCAGGTG GAGCGAGGCC TCGGGGAGCG CAAGGGCAGC GGGGACTCCC TGGAAGAGTG GCAGGACCAG GACAAGCCCC AGATCTCCCT GCTCTTCCAG TTCCTGCAGA TCCTCACGGC CTGCTTCGGC TCCTTCGCCC ACGGTGGGAA CGACGTCAGC AATGCCATCG GACCTCTGGT CGCTCTGTAT TTGGTCTATC AAACTAAAGA TGTTGCTTCC AAAGCAACAA CCCCAATCTG GCTTCTGTTG TACGGTGGCG TTGGTATCTG TATTGGTCTC TGGGTCTGGG GAAGGAGAGT TATTCAAACC ATGGGGAAGG ATCTCACGCC GATCACGCCC TCTAGCGGCT TCAGTATTGA ACTGGCATCA GCTCTCACCG TAGTCATTGC ATCAAACGTT GGCCTTCCCA TCAGCACCAC TCACTGTAAG GTGGGCTCAG TTGTGTCTGT TGGCTGGCTT CGCTCTAAGA AAGCTGTGGA CTGGAGGCTC TCCGAAACAT CTTCATGGCC TGG OK-NaPi2c: Secuencia de ADN truncada en 5’. ACGANTCGCC CTTGGANCTG ACATGGACTG AAGGAGTAGA AATCCTATTC ACTGCTCAGA GGGTGCCTTG GGGCCAAGAG GCTGCTCAGC CAGCCTGGGA CCTGGCCCTG CACTGACCCC TGACCCATGC CTCACTTCCA ACCTGGCCCC AGGGCCCCTA CCACAGTCAA TATCACTCTT GAAGGTCAAA GAACTGAAGA TGCAGGTATG GAAGAATTCA GGACTCAGGT CCCCAGCTGG TCTCCAGACC AGGAGGAAGA GGGGGAAGCA GATCCTTGGG CCCTCCCACA GCTGAAAACA TCTGGCCAAT CATGGAAAGA GTTAAGCCGG GGCAGGTCGG ATACGCCACG TGGTCATTGG TGTCTTAAAG GGCTTTGCCC TTCTTGGCCT TCTCTACCTC TTCATTTGTT CCCTGGACAT TCTCAGTTCT GCCTTCCAGC TGCTGAGCAG TAAAGTGACT GGGGACATCT TTAAGGACAA TGTCGTTCTG TCCAACCCCG TGGCTGGGCT GGTCATTGGT GTCCTGGTCA CTGTACTGGT ACAGAGTTCT AGTACCTCAT CCTCCATTGT GGTCAGCATG GTCTCCTCAA AGTTGTTGAC TGTCAGAGCC TCAGTACCCA TCATCATGGG AGTCAACGTG GGCACATCTA TCACCAGCAC CTTAGTCTCC ATGGCCCAGT CAGGTGCCAG AGATGAATTC CGGAGAGCCT TTGGTGGCTC TGCTGTCCAT GGCATTTTTA ACTGGCTGAC AGTACTGGTG ATGCTGCCCC TGGAGATTGC AGCCAGAGCT CTGGAAAAAC TCAGTGGTCT GGTGGTGGGA GCCTTTACTC TCAACCCTGG GGAACGAGCA CCTGACATCC TGAAAGTACT CACACAGCCC CTCACCCATC TCATTGTGCA GCTAGACTCA AAAGCTATCT CAGAAAGCGC CACAGGCAAC ATGACCAAAA GCATCATTAA GCAGTGGTGT GTCACCCGGG AAGAGATGAC TGTGGAAACG GTGCCTGTGA AGAACGTCAG TGAATGCAGT ATTCAATACT GCTACCCCTG CGGGACCATG TTTTGCCAAG AGAAGAATGT CACAACCACA GTCAATGTGG AACTTTGTCA CCACATTTTT GTGAATTCCA CCCTTACTGA CCTGGCCATC GGCTTCATCC TCCTGGCTGG CTCTCTGCTC GCCCTCTGCT CTGGCCTGGT CCTCATCGTC CGCCTACTCA ACTCCGTCCT TCATGGCCAG ATTGCCCAGG TCGTGCGGAA GGTCATCAAC GCTGAATTCC CCTTTCCCTT TGGATGGCTC AGTGGCTATT TGGCCATTGT GGTTGGTGCT ATTATGACCT TCGTGGTCCA GAGCAGCAGC GTATTCACTG CCGCCATTGT TCCCCTGATA GGCTAGAACT CCCTATCTTG TCCAGACTAG AAGTACAGTG GCCACTTCTG GATCTGGTTC TCAATACTGA TCAGCATAGA AGCTTAAACT TGTTCATTTT TTCCCATTAA ACCTCCTTCC CAGAGGGAGA CAATTTGGAT TGCATAACTT CGGAAAACTT ATGTGGAAAT TTGTTATCAC ATGTAATTGA TAAAAATAAA ATCCATTTAC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAACACTG TCATGCCGTT ACGTAGCGAA GGGCGAATTC GTTTAAACCT GCAGGACTAG TCCCTTTAGT GAGGGTTAAT TCTGAGCTTG GCGTAATCAT GGCCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGNT ATCCGCTCAC AATTTCTCAC AACATATAAT CCGGAAACAT AAAGT 84 5.2. La células OK pueden ser usadas como modelo de estudio de la regulación de los transportadores renales NaPi, por medio de los receptores nucleares FXR y LXR. Para determinar los efectos de la activación de estos receptores nucleares en la regulación de los transportadores de fosfato renales, inicialmente se determinó las concentraciones ideales de los diferentes agonistas. Para ello, se realizó un estudio toxicológico para determinar el rango de concentraciones adecuadas de los diferentes agonistas. Para esto, se utilizó el método de cuantificación de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) intracelular liberada al medio de cultivo, estableciendo parámetros clásicos como concentraciones letales medias LC50 (Figura 33 y 34). Igualmente se correlacionaron estos datos, con conteo celular y morfología por microscopia. 2.2.1 Resultados de concentración letal por LDH intracelular: Para los diferentes agonistas del FXR se obtuvieron las siguientes constantes de toxicidad: ! ! ! ! ! Figura 33. Cálculo de la concentración letal 50 para los agonistas de FXR 85 En el caso de los agonistas del LXR las dosis letales para las células OK son: Figura 34. Cálculo de la concentración letal media para los agonistas de LXR A partir de los resultados de dosis letales, se concluyó que las concentraciones para estudios en condiciones agudas se realizarían a 5µM, con excepción del CDCA, que se utilizaría a 30 µM. 2.2.2 Determinación de la activación de los receptores nucleares. La activación de los receptores nucleares se determinó por microscopía inmunofluorescente (IF). Tras una incubación de 24 h con cada agonista, las células fueron fijadas con paraformaldehído, para luego teñir los filamentos de actina en verde mediante faloidina conjugada con Alexa 488, el núcleo en azul con DAPI, y los receptores nucleares en ambos casos, teñidos en rojo con los anticuerpos correspondientes conjugados con Alexa 568. Como muestran las figuras, existe un claro incremento de la señal roja correspondiente a los receptores nucleares dentro del núcleo, en las células que han sido tratadas con los agonistas, lo cual indica activación y traslocación de FXR y LXR (Figuras 35 y 36). Para observar cambios de intensidad, la exposición de las células con receptores activados fue fijada a la exposición obtenida automáticamente de las células control. Fig 9. Cálculo de la concentración letal 50 para los agonistas de LXR TO901317! TO901317! LD50=!16.75!uM LD50=!10.5!uM Log [con] Log [con] LD50=!~!20!uM % of control Log [con] TO901317 GW3965 DMHCA 86 Inmunofluorescencia (IF); determinando por microscopia confocal la traslocación de los receptores al núcleo. Activación de LXR: Activación de FXR: 2.2.3 El uso de agonistas de FXR y LXR induce cambios en el contenido lipídico en células OK. Dada la gran importancia de estos receptores nucleares en el metabolismo de lípidos, quisimos determinar la presencia de cambios en la ! ! Figura 36. Activación y translocación de LXR (rojo) al núcleo (azul). Membrana (verde) Figura 35. Activación y translocación de LXR (rojo) al núcleo (azul). Membrana (verde). Notece los altos niveles de expresión de LXR luego de la activacion con TO901317. 87 concentración total de lípidos mediante el colorante fluorescente Rojo Nilo, come se muestra en la siguiente figura. Cambios en el contenido lipídico inducido por agonistas de LXR ! Las células fueron incubadas durante 24 horas con dos agonistas diferentes de LXR. Los cambios en el contenido lipídico se pueden determinar por el cambio en el número y forma de las gotas de lípidos en el citoplasma. Se observa claramente un incremento en el número de gotas lipídicas en las células tratadas con los agonistas, lo cual tiene sentido ya que se induciría la síntesis de ácidos grasos a través de la activación de SREBP1c. Cambios en el contenido lipídico inducido por agonistas del FXR ! En el caso del FXR, el cambio en el contenido lipídico es menos evidente en las células tratadas con el agonista GW4064. En el caso del OK##Control#1 OK!+!68ECDCA!5uM!!24h OK!+!GW4064!5uM!!24h Figura 38. Efectos de FXR en el contenido lipídico analizado por rojo de Nilo.! Figura 37. Efectos de LXR en el contenido lipídico analizado por rojo de Nilo.! 88 esteroide 6-ECDCA, vale la pena resaltar el cambio en la morfología de las gotas de lípidos intracelulares, lo cual podría estar relacionado con cambios en la naturaleza de los lípidos. Los cambios observados fueron corroborados por análisis de triglicéridos y colesterol (Figura 39 y 40) por medio de kits bioquímicos comerciales (Wako) para análisis de triglicéridos, y el método publicado por Allain et al. para análisis de colesterol [100]. En esos métodos, tanto triglicéridos como colesterol son hidrolizados a ácidos grasos (con diferentes enzimas para cada caso), para ser después oxidados. En este proceso se libera peróxido de hidrogeno (H2O2) que es convertido en quinoneimina. Dicho compuesto presenta un color rojo y su concentración puede ser medida por espectrofotometría. Para nuestro propósito específico, tras la incubación de las células con los agonistas respectivos a cada grupo, se extrajeron las membranas totales de las células, y los cambios lipídicos se compararon con células no tratadas y con una recta patrón. Figura 39. Concentración de triglicéridos en el extracto crudo de membrana tras la activación de FXR o LXR. * P<0.05, ** P<0.01 con respecto al control Triglicéridos en Membrana Control GW40 6-ECD TO9013 GW39 0 1 2 3 * ** FXR LXR 89 Figura 40. Concentración de colesterol en el extracto crudo de membrana luego de la activación de FXR o LXR. * P<0.05 con respecto al control. Semejante a lo observado con la tinción de lípidos con Rojo de Nilo, el efecto de los agonistas de LXR está de acuerdo con la literatura, ya que cumple la función de inducir la síntesis de triglicéridos al activar SREBP, y reducir el contenido de colesterol. Esto lo consigue gracias a la regulación, por parte de este receptor nuclear de los transportadores de colesterol de tipo ABC, que son requeridos para cumplir las funciones de LXR en el tejido periférico distinto al hepático. Los cambios en el contenido lipídico de las membranas de las células tratadas con los agonistas de FXR no presentan grandes cambios con respecto a los controles. 2.2.4 FXR y LXR modulan el transporte de Pi en células OK y la expresión de NaPi4. Para determinar los efectos de la activación de los receptores nucleares FXR y LXR , las células OK fueron tratadas con los diferentes agonistas de ambos receptores, y el transporte de fosfato fue determinado mediante K2H32PO4, en presencia de sodio. Las células OK fueron incubadas durante 24 horas con diferentes concentraciones de agonistas de FXR y LXR, para determinar su efecto en el transporte de fosfato. En este experimento se observó que varios agonistas producen una disminución del transporte de Pi sodio dependiente, siendo DMHCA a 7.5 µM y CDCA a 30 µM los que tienen Colesterol en Membrana Control GW40 6-ECD TO9013 GW39 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 * * FXR LXR 90 un mayor efecto inhibidor, comparado con el transporte obtenido en las células no tratadas. También se observa que el disolvente DMSO, en el cual están disueltos los agonistas, no presenta ningún efecto en el transporte de Pi a la dilución utilizada de 1:1000. También se determinó el efecto que tienen estos agonistas en la expresión de NaPi4, que es el principal transportador de fosfato en las células OK. Para ello inicialmente se aislaron BBM de células OK tratadas con los diferentes agonistas, y se determinaron los cambios en la expresión de NaPi4 por medio de WB, como se muestra en la siguiente figura: Figura 42. Efecto de los agonistas de FXR y LXR en la expresión del transportador de Pi NaPi4 de las células OK. * P<0.05 con respecto al control. Agonistas!del!LXR! Agonistas!del!FXR! Figura 41. Transporte de Pi en células OK, tras los tratamientos con los diferentes agonistas del LXR y el FXR. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, con respecto al control (NaCl en azul) 91 Se observó una reducción en la expresión de NaPi4 en la BBM principalmente con los agonistas del LXR, y un efecto similar sólo observado con el agonista de FXR 6-ECDCA. La reducción en la expresión de NaPi4 por parte de los agonistas de LXR, fue confirmada con técnicas de microscopía inmunofluorescente que se mostraran en el apartado. 5.3. Efectos de los tratamientos agudos con agonistas de FXR y LXR en los transportadores de fosfato de ratón. Una vez estudiados los efectos de los agonistas de FXR y LXR en el transporte de Pi en las células OK, quisimos determinar si de igual forma la activación de estos receptores nucleares por parte de sus agonistas inducían un cambio en la abundancia o actividad de los transportadores de Pi en tejido de ratón. Dado que estos agonistas son usados habitualmente en diferentes proyectos del laboratorio del Dr. Levi para el estudio de fisiopatologías asociadas a la diabetes, dislipidemia y síndrome metabólico, decidimos usar las mismas dietas, condiciones y dosis ya establecidas en nuestro laboratorio. Los animales fueron tratados durante cuatro días en el alimento, como se indica en la sección de Materiales y Métodos, con los agonistas DMHCA y 6-ECDCA (denominado también Int-747, por su fabricante Intercept Pharmaceuticals). Las BBM fueron entonces aisladas del riñón e intestino de los ratones, y la expresión de los transportadores de Pi fue determinada mediante WB. En el riñón se observó una reducción mínima, aunque significativa, en la expresión de NaPi2a en respuesta al agonista de LXR (Figura 43A). Aún más relevante, vimos un cambio muy significativo en la expresión de los transportadores intestinales de fosfato en las BBM aisladas del íleon de ratón. Los efectos en la reducción del transportador de fosfato intestinal más importante, NaPi2b, fue más pronunciado tras del tratamiento con el agonista de LXR (DMHCA), alcanzando un valor de 83 % (P<0.01) comparado con el agonista del FXR (Int-747), que redujo la expresión de NaPi2b en un 61 % (P<0.05). Este agonista igualmente redujo la expresión del transportador de fosfato tipo III PiT1 en un 30 % (P<0.01) (Figura 43B). 98 Figura 50. Medida de los cambios de ARNm de A) los genes diana de LXR en riñón de ratón, y B) los genes diana de LXR en íleon de ratón, como respuesta a los tratamientos crónicos de los agonistas de LXR. ns= no significativo, * P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001 con respecto al control. De acuerdo a lo descrito en la literatura, se observó un incremento en la expresión de los transportadores de colesterol ABCA1 and ABCG1 tanto en riñón como en el intestino delgado. Éstos, en parte, son los responsables de los efectos positivos en la activación farmacológica del LXR, ya que modulan el proceso de excreción del exceso de colesterol por parte de la célula y son así parte fundamental del transporte reverso del colesterol. Sin embargo, la activación experimental del LXR también esta asociada a la activación del factor de transcripción más importante en la regulación del metabolismo lipídico, el SREBP1c, que es el denominado regulador fundamental de la síntesis de lípidos. La activación de SREBP1c es inducida por el compuesto TO901317, lo cual coincide con la literatura. Ello provocó la síntesis farmacológica de nuevos compuestos como el DMHCA, que presentan una mayor homología estructural con los ligandos naturales del LXR, los oxiesteroles. Como se observa en la figura anterior, los efectos en la activación mRNA!expression!related! to !cyclophilin!A mRNA!expression!related! to !cyclophilin!A ! B mRNA!expression!related! to !cyclophilin!A mRNA!expression!related! to !cyclophilin!A ! A 99 de SREBP1c, y por ende en las proteínas que éste a su vez regula (FAS y SCD1), son mucho menores con el compuesto DMHCA que con el compuesto TO901317. Por ello, últimamente el activador DMHCA se viene utilizando mucho más frecuentemente en el estudio de LXR, al tener la capacidad de inducir el transporte reverso del colesterol sin incrementar lipogénesis. Estos resultados fueron observados tanto para el ARNm como de la proteína, por medio de WB y microscopía fluorescente, en tejido de riñón e intestino delgado (Figura 51). Figura 51. Medida de los cambios de A) proteína de ABCA1 y SCD1 en riñón de ratón por medio de WB, B) expresión de SCD1 en riñón e íleon de ratón por IF, y C) expresión de ABCA1 en riñón e íleon de ratón por IF, como respuesta a los tratamiento crónicos de los agonistas de LXR. ns= no significativo, * P<0.05, ** P<0.01, con respecto al control. Los resultados obtenidos en ratón fueron corroborados a continuación en el modelo celular de OK. Se observó la activación de LXR e inhibición del transporte de Pi, con una disminución paralela en la expresión del transportador de Pi, NaPi4. Se llevó a cabo también un estudio de relación 100 dosis-respuesta (Figura 52), observando un efecto claro de ambos agonistas en estas células sobre el transporte de Pi. Figura 52. Relación dosis-respuesta entre los agonistas del LXR y el efecto en el transporte de Pi en células OK. ns= no significativo, * P<0.05, *** P<0.001, con respecto al control. Como la disminución del transporte de Pi parece estar mediada, en gran parte, por la disminución en la expresión del transportador NaPi4, el efecto sobre este transportador fue estudiado mediante WB y microscopía fluorescente con BBM aisladas de células OK tratadas con ambos agonistas por 24 horas (Figura 53). Para determinar la especificidad de los efectos de los agonistas sobre el transporte de Pi, en ambos tejidos estudiados medimos también la expresión de los transportadores de Na/Glucosa SGLT1 en BBM de íleon, y SGLT2 en BBM de riñón. De esos experimentos concluimos que el compuesto TO901317 es también capaz de modificar la expresión de SGLT2 en riñón (Figura 54), pero no se observa ningún cambio en la expresión del SGLT1 intestinal. ! Pi!!Upatke!(nmol/mgProt*min) 101 Figura 53. Cambios en la expresión de NaPi4 en células OK, medidos por WB en BBM de células OK y confirmado por IF, como respuesta a los tratamiento crónicos de los agonistas de LXR. * P<0.05, ** P<0.01, con respecto al control. Figura 54. Medida de los cambios de A) la proteína del transportador de glucosa SGLT2 expresado en BBM de riñón de ratón, y B) la proteína del transportador de glucosa SGLT1 expresado en BBM de íleon de ratón, como respuesta a los tratamiento crónicos de los agonistas de LXR. ns= no significativo, * P<0.05, con respecto al control. 102 5.5. Publicaciones generadas de este apartado Liver X Receptor-Activating Ligands Modulate Renal and Intestinal Sodium Phosphate Transporters Kidney Int. 2011 Sep;80(5):535-44. Abstract: Cholesterol is pumped out of the cells in different tissues, including the vasculature, intestine, liver, and kidney, by the ATP-binding cassette transporters. Ligands that activate the liver X receptor (LXR) modulate this efflux. Here we determined the effects of LXR agonists on the regulation of phosphate transporters. Phosphate homeostasis is regulated by the coordinated action of the intestinal and renal sodium-phosphate (NaPi) transporters, and the loss of this regulation causes hyperphosphatemia. Mice treated with DMHCA or TO901317, two LXR agonists that prevent atherosclerosis in ApoE or LDLR knockout mice, significantly decreased the activity of intestinal and kidney proximal tubular brush border membrane sodium gradient-dependent phosphate uptake, decreased serum phosphate, and increased urine phosphate excretion. The effects of DMHCA were due to a significant decrease in the abundance of the intestinal and renal NaPi transport proteins. The same effect was also found in opossum kidney cells in culture after treatment with either agonist. There was increased nuclear expression of the endogenous LXR receptor, a reduction in NaPi4 protein abundance (the main type II NaPi transporter in the opossum cells), and a reduction in NaPi cotransport activity. Thus, LXR agonists modulate intestinal and renal NaPi transporters and, in turn, serum phosphate levels. 103 6. MODELO CELULAR PARA EL ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO INTESTINALES. A diferencia del riñón, para el que contamos con la línea celular OK como modelo renal de transporte de Pi, el estudio de la regulación de los transportadores intestinales de Pi se ha visto muy limitado por la falta de un modelo celular que presente características de transporte similares al del intestino: • Membrana epitelial con presencia de BBM. • Expresión de los transportadores de fosfato. • Transporte de Pi in vitro. • Regulación similar. En esta tesis doctoral se ha intentado identificar y caracterizar un modelo celular que presente dichas propiedades, y que además permita estudiar la biología de los transportadores intestinales NaPi, y cómo éstos son regulados por diferentes mecanismos, entre ellos los receptores nucleares. Para lograr esto se probaron diferentes modelos celulares; entre ellos los de intestino de rata IEC-6 (Intestinal Epethilial Cells clone 6) proveniente de duodeno/yeyuno de rata, y IEC-18 proveniente de íleon de rata [102]. También las células CaCo-2 (adenocarcinoma epitelial colorectal) que fueron inicialmente caracterizadas para el transporte de fosfato intestinal por el grupo del profesor Murer [103], y por último la línea CaCo-2BBE. Estas últimas consisten en un subclón de las CaCo-2, obtenidas por el laboratorio del profesor Mooseker en 1992 [104]. Ellos determinaron que estas células forman una monocapa densa, en la cual las células se diferencian completamente y presentan una abundante BBM (Figura 55). Además, se ha demostrado que estas células presentan diversas características de enterocitos [105]. Dadas estas características, y la importancia de poder estudiar las interacciones de los transportadores de fosfato in vivo, se comprobó que, tras la transfección con un plásmido que codificaba el transportador de fosfato 104 NaPi2b-eGFP, las células CaCo-2BBE expresan dicho transportador en la BBM (Figura 56). Figura 55. Micrografía electrónica de barrido, en las que se muestra una densa BBM en las células CaCo-2BBE. [104] Mediante técnicas de inmunofluorescencia se observó que, efectivamente, las células presentan unas densas microvellosidades, aunque la expresión de NaPi2b endógeno principalmente se observa en localización 105 subapical (Figura 57). De igual forma, la expresión del NaPi2b endógeno en estas células se determinó mediante western-blot (Figura 58). Figura 56. A) Imagen confocal de las células CaCo-2BBE en las que se muestra la expresión de NaPi2b-eGFP en la BBM. B) Perfil de los ejes ZX en la que claramente se observan las microvellosidades. Figura 57. Imagen confocal de las células CaCo-2BBE en las que se muestra por inmunofluorescencia la expresión de NaPi2b endógeno (rojo). En verde, actina, y núcleo azul. ! A B 106 Figura 58. Western-blot de NaPi2b endógeno en células CaCo-2BBE Mediante experimentos de transporte de fosfato radioactivo (32P), se pudo determinar que al igual que en las células OK, estas células intestinales presentan un transporte de fosfato sodio-dependiente, y una acumulación de Pi sodio-independiente en condiciones normales (medio de incubación con 1 mM de Pi) (Figura 59). El transporte Na-dependiente no es constante, sino que es de aparición progresiva comenzando a partir de los 20 minutos, lo cual hace sospechar de que se trate de un artefacto experimental. Los experimentos se realizaron en células post-confluentes (14 días) totalmente diferenciadas, constituyendo una monocapa con una alta densidad de domos. Para alcanzar este grado de diferenciación fue requerido el uso de medio DMEM rico en suero fetal bovino (20 %), el cual se cambió cada dos días. Figura 59. Transporte de Pi a 50 µM y en función del tiempo, en células CaCo-2BBE post-confluentes en las que se muestra un incremento progresivo de la acumulación de Pi en presencia de sodio (negro) y en ausencia de sodio (rojo). Aunque se determinó que estas células pueden presentar un componente sodio dependiente en el transporte de Pi, como ya hemos ! "#$%&'(! &)(*$! +,#$! -! $&"(! .#! #%./&'! /0(1*/.(! .&22*(2!+#,!/))!#+!.3(!$(/2*,($('.2!4(!4&))!'((0!.#! 2.*05!!"#$%&'()!&'!(/"3!(67(,&$('./)!8,#*79!  :(!/)2#!'((0!.#!2.*05!/'!/00&.&#'/)!!"*!$&"(!7(,! (67(,&$('./)! /'0! .,(/.$('.! 8,#*7! +#,! &'! ;&;#! 7(,+*2&#'! +&6/.&#'! +#))#4(0! %5! 3&2.#7/.3#)#85! /'0! &$$*'#+)*#,(2"('"(!$&",#2"#75!2.*0&(29!  <3(,(+#,(! /).#8(.3(,! 4(! 4&))! '((0! .#! 2.*05! !"+,% &'()!&'!(/"3!(67(,&$('./)!8,#*79!  -./.%0!.123'34%=/./!4&))!%(!7,(2('.(0!/2!.3(! $(/'!>!?@A9!?./.&2.&"/)!/'/)52&2!+#,!/))!#+!.3(! (67(,&$('./)!7/,/$(.(,2!4&))!%(!7(,+#,$(0!*2&'8! /'/)52&2!#+!;/,&/'"(!BCDEFCG!4&.3!?.*0('.H D(4$/'HI(*)2!.(2.9!   5!%67)('8'(%0'&9:%;)%;'11%<)/)=&'!)%=)>?1./'@!% @8%3)=?&%A'B%'!/)3/'!.1%C.A'%/=.!37@=/%.(/'D'/2B% .!<%C.A'E#F%.!<%A'/E9%7=@/)'!%.!<%&GC0% .F?!<.!()%'!%'!/)3/'!.1%37)('8'(%HIGĮ /=.!3>)!'(%&'()J%%  KL7)='&)!/.1% .77=@.(M4! <3(2(! 2.*0&(2! 4&))! %(! 7(,+#,$(0! &'! 'N! 4&)0! .57(! ;(,2*2! ''N% &'.(2.&'/)! 27("&+&"! FJKLHMNOĮ! .,/'28('&"! $&"(! B&FJKLH MNOĮG9! <3(2(! $&"(! /,(! #'! .3(! PFQRD! 8('(.&"! %/"S8,#*'0! /'0! .3(5! 3/;(! %(('! 8('(,/.(0! /'0! 7,#;&0(0! .#! *2! %5! #*,! "#))/%#,/.#,! C'.#'&#! A#2"3(../! BT#'2#,U&#!A/,&#!D(8,&!?*0V!W./)5G!BXYG9!:3('!.3(!PFQRD!4&)0!.57(!"#'.,#)!/'0!&FJKLHMNOĮ!$&"(!/,(!Z!4((S2! #)0! 4(! 4&))! 2.*05! .3($! (6/".)5! /2! &'! 67)('8'(% 0'&% 90! .#! 0(.(,$&'(! ,(8*)/.&#'! #+! 2(,*$! J&V! &'.(2.&'/)! D/J&! .,/'27#,.!/".&;&.5V!/'0!D/J&H-%!/'0!J&.HK!7,#.(&'!/'0!$ODC!/%*'0/'"(9!  KL7)(/)<% =)3?1/3B% '!/)=7=)/./'@!% @8% /M)% <./.B% 7@/)!/'.1% 7=@F1)&3B% .!<% .1/)=!./'D)% .77=@.(M)34! <3(2(! 2.*0&(2!4&))!0(.(,$&'(!&+!&'.(2.&'/)!27("&+&"!FJKLHMNOĮ!#;(,(67,(22&#'!B"#'2.&.*.&;()5!/".&;(!+#,$!#+!MNOĮG!3/2! /!0&,(".!(++(".!&'!&'3&%&.&'8!&'.(2.&'/)!D/J&!.,/'27#,.!/".&;&.59!?&'"(!.3(2(!$&"(!3/;(!/),(/05!%(('!8('(,/.(0!/'0! /,(!&'!#*,!%,((0&'8!"#)#'5!4(!0#!'#.!(67(".!/'5!7,#%)($2!4&.3!.3(!7,#7#2(0!2.*0&(29![#4(;(,V!&'!#,0(,!.#! 0(.(,$&'(!.3(!0&,(".!(++(".2!#+!MNOĮ!/2!4())!/2!MNOȕV!/'0!/)2#!.#!7(,+#,$!$("3/'&2.&"!2.*0&(2!4(!4&))!7(,+#,$! /00&.&#'/)!"())!"*).*,(!2.*0&(2!&'!67)('8'(%0'&%9O9! ! 5!%67)('8'(%0'&%9O%;)%;'11%<)/)=&'!)%/M)%<'=)(/%)88)(/3%@8%'N%HIGĮ%@=%''N%HIGȕ%.N%.(/'D./'@!%@=%FN% '!M'F'/'@!%@!%=)>?1./'@!%@8%C.A'%/=.!37@=/%.(/'D'/2B%C.A'E#F%7=@/)'!%<2!.&'(3B%.!<%C.A'E#F%/=.88'(P'!>%'!% '!/)3/'!.1%()113%'!%(?1/?=)J% 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 <#!0(.(,$&'(!.3(!(++(".2!#+!MNOĮ!/'0!MNOȕ!#'!D/J&!.,/'27#,.!/".&;&.5!/'0!D/J&H-%!7,#.(&'!(67,(22&#'!4(!4&))! .,/'2+(".!.3(!"())2!4&.3!,("#$%&'/'.!/0('#;&,*2(2!/.!/!$*).&7)&"&.5!#+!&'+(".&#'!BAEWG!#+!-Y!/'0!^Y9!:(!3/;(! 8('(,/.(0! /0('#;&,*2(2! *2&'8! .3(! F&,/J#4(,! C0('#;&,*2! @67,(22&#'! ?52.($! BW';&.,#8('G! .3/.! (67,(22_! 'N! "#'2.&.*.&;()5!/".&;(!+#,$2!BFJKLHMNOĮV!FJKLHMNOȕG!43(,(!.3(!FJKL!/".&;/.&'8!0#$/&'!3/2!%(('!+*2(0!.#!.3(! DH.(,$&'*2!=DC!%&'0&'8!0#$/&'!#+!.3(!MNO!7,#.(&'2`!/'0!''N%0#$&'/'.!'(8/.&;(!+#,$2BMNOĮ!=DV!/'0!MNOȕ! =DG! 43(,(! .3(! =DC! %&'0&'8! 0#$/&'! #+! MNO2! 3/2! %(('! &'/".&;/.(09! TCTEHQQ@ ! 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Ya que en resultados preliminares no se observó adaptación en estas células a concentraciones bajas de Pi, en esta tesis sólo se estudió la adaptación a alto fosfato; así, inicialmente las células se incubaron durante 24 horas a diferentes concentraciones de fosfato: 1 mM (control), 2 mM y 4 mM (Figura 60). Bajo estas condiciones se midió el transporte con 32P en presencia de Na+ (representado en rojo) o ausencia de Na+ (verde), usando NaCl o cloruro de colina a una concentración de 137 mM. Para determinar el componente mediado por transportadores de Pi de tipo II, la incubación se realizó también en presencia ácido fosfonofórmico a 5 µM (PFA, indicado en color azul; Figura 60), pero también en ausencia de Na. Llama la atención que, además de la lógica inhibición del componente Na-dependiente, el PFA también inhibió la toma Na-independiente de Pi. !!!!! Figura 60. Experimento de adaptación de las células CaCo-2BBE a diferentes concentraciones de Pi en medio de cultivo durante 24 horas. El transporte se midió durante 20 minutos en presencia y ausencia de Na, más PFA en ausencia de Na. Los valores obtenidos por inhibición de PFA en presencia de Na no se representan en la figura, al ser similares a los representados en azul. Na vs Cholin PFA 0 10000 20000 30000 1 mM Pi 2 mM Pi 4 mM Pi Colina Na Na Na PFA PFA ColinaColina PFA * ** *** * *** ns 114 1. REGULACIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO INTESTINALES El estudio de los transportadores de fosfato está siendo objeto de una intensa actividad investigadora, dada la importancia del fosfato en muchos procesos biológicos y patológicos. La pérdida de los mecanismos de regulación y control de la homeostasis del fosfato da lugar a una gran variedad de enfermedades de las cuales la enfermedad cardiovascular (ECV) presenta la mayor relevancia. Se considera que la hiperfosfatemia es un factor importante asociado a la causa y al progreso de la ECV, ya que un gran número de estudios muestran una relación directa entre la calcificación vascular y las altas concentraciones de fosfato en sangre, siendo esta hiperfosfatemia, a la vez, una característica de la enfermedad renal crónica. Todos estos factores se encuentran ligados directa o indirectamente con la diabetes, y es allí donde el estudio de los receptores nucleares FXR y LXR ha tomado una gran relevancia, en especial en la nefropatía diabética y la dislipidemia asociada a la diabetes. La activación de estos receptores por medio de ligandos sintéticos ha mostrado resultados positivos en el intento de recuperar la regulación mediada por lípidos, en modelos animales de diabetes. Igualmente, algunos de estos ligandos inducen una reducción de la inflamación y la acumulación ectópica de lípidos en el riñón, y por ello se especula sobre el papel de los lípidos como un factor determinante en el progreso de la nefropatía diabética. Además, la activación de LXR en modelos de arteriosclerosis disminuye la formación de la placa de ateroma, lo cual se explica por la capacidad de estos tratamientos de reducir la concentración de colesterol en sangre, e inhibir la expresión de marcadores pro-inflamatorios. Estos factores asociados a la calcificación vascular son determinantes en la formación y el progreso de la ECV. Todos esto ha llevado a que el objetivo principal de esta tesis doctoral sea el estudio de los efectos de los agonistas de los receptores nucleares FXR y LXR en los transportadores de fosfato, en especial los efectos de éstos en la regulación del transporte de fosfato intestinal, por la relevancia y el interés 115 clínico y farmacológico que esto presenta, dada la posibilidad de tratar la hiperfosfatemia asociada a la enfermedad crónica renal. Por todo ello, se quiso profundizar en el estudio de los mecanismos que regulan el transporte de fosfato intestinal, y a partir de esos resultados, tratar de entender cuál es la función de cada transportador de fosfato, NaPi2b, PiT1 and PiT2, en el intestino delgado, además de los efectos en la actividad y expresión de estos transportadores bajo condiciones de adaptación a alto y bajo fosfato en un modelo animal. Con esto en mente se aislaron las BBM de los tres diferentes segmentos intestinales (duodeno, yeyuno e íleon) de ratas alimentadas con dietas control (Pi al 0.6 %), y se determinó la actividad y la expresión de proteína y de ARNm de los dos transportadores NaPi (NaPi2b y PiT1) en los diferentes segmentos del intestino delgado (Figura 19). De esto se concluyó que la actividad determinada por la absorción de 32P in vitro, era mayor en duodeno, seguida por yeyuno, y prácticamente nula en íleon. También se corroboró que el transporte de Pi presenta un componente sodio dependiente que se determinó comparando el transporte de Pi en presencia y ausencia de Na (sustituido por cloruro de colina). Adicionalmente se determinó, por medio de western-blot e inmunofluorescencia (Figura 21), que la expresión de NaPi2b y PiT1 en BBM se corresponde con lo observado en el transporte de Pi, ya que la expresión de estas proteínas es prácticamente nula en el íleon. Sin embargo, aunque los mayores niveles de expresión de ambas proteínas se observan en yeyuno, el transporte de Pi fue claramente mayor en duodeno en condiciones de dietas con concentración normal de fosfato (Pi al 0.6 %). Dicha expresión en los dos primeros segmentos son congruentes con los niveles de ARNm medidos, pero contrastan con lo observado en íleon, ya que se encontró una elevada abundancia de ARNm de PiT1 en íleon, mientras que la proteína correspondiente no había sido detectada en las BBM. También se confirmó que la expresión de ARNm de PiT2 a lo largo del intestino delgado era casi inapreciable. Se especula que las diferencias observadas entre un mayor transporte de Pi en duodeno, que contrasta con una mayor expresión de los transportadores de fosfato en yeyuno, podría ser explicada por varios factores: 1) la posibilidad de que otros transportadores de 116 Pi, no identificados, se expresen en duodeno pero no en íleon, o por otro lado que presenten diferentes funciones en estos mismos segmentos; o 2) que diferentes modificaciones postrancripcionales en estos dos segmentos del intestino afecten a la actividad de NaPi2b, ya que se han descrito en estudios previos la presencia de sitios susceptibles a glicosilación [98], ubicuitinación [107], y palmitoilación [108] en la secuencia de NaPi2b, y se especula que dichas modificaciones podrían modular la actividad de este transportador. Sin embargo, dichos mecanismos puedan afectar no sólo a la actividad sino también al tráfico de estas proteínas, lo cual necesita ser estudiado con mayor profundidad. Aunque PiT1 se expresa de un modo similar a NaPi2b (con la excepción de la expresión de ARNm en el íleon), la función de NaPi2b en el transporte transcelular en el intestino es todavía enigmático. Antes de la publicación de los resultados obtenidos por parte de nuestro grupo, PiT1 se consideraba un transportador encargado únicamente de mantener un suministro de fosfato para los procesos celulares (housekeeping transporter) [109, 110], expresándose en la membrana basolateral de células de diferentes tejidos. Al igual que PiT2 (otro transportador de fosfato tipo III), el ARNm correspondiente a PIT1 fue detectado en intestino delgado. Nuestros estudios demuestran la expresión de PiT1 en las BBM de enterocitos aislados de duodeno y yeyuno de rata, lo cual indica la posibilidad de que esté implicado en la absorción de Pi en intestino delgado bajo condiciones fisiológicas. Dicho papel se hace mas evidente en estudios del transporte de Pi en BBM de yeyuno de rata en presencia de bajas concentraciones de PFA, los cuales muestran una inhibición parcial del transporte de Pi. Esto es interesante ya que el PFA es un fuerte inhibidor de NaPi2b y un inhibidor débil de PiT1 y PiT2 [111, 112]. Adicionalmente llama la atención que la expresión proteica de PiT1, analizada por western-blot, presenta una tendencia similar a la de NaPi2b en BBM de duodeno y yeyuno. Sin embargo, la importancia relativa de PiT1 en el transporte transcelular de intestino y el papel que éste puede tener en la regulación postranscripcional de ambos transportadores es algo que requerirá un estudio más profundo. 117 Nuestros resultados concuerdan con estudios previos, y claramente muestran que la absorción de Pi en el intestino de ratas esta concentrada en duodeno y yeyuno, y que es prácticamente nula en íleon. Además, ese mayor transporte está correlacionado con una alta expresión de los transportadores de fosfato, principalmente NaPi2b. Gracias a estudios por parte del profesor Sabbagh y cols., los cuales a partir de experimentos de transporte in vitro, usando íleon aislado de NaPi2b -/- inducido, en los que observaron que el transporte activo de fosfato se había reducido en casi un 90 %, se destaca la importancia de NaPi2b en el transporte intestinal de fosfato. Adicionalmente, la administración aguda mediante alimentación forzada de altas concentraciones de Pi a ratones knock-out para NaPi2b da lugar a una reducción del 45 % en la concentración de Pi en sangre al ser comparados con ratones control. Esto se correlaciona con experimentos de inhibición con nicotinamida, un inhibidor del transporte de fosfato sodio dependiente y de la expresión de ARNm de NaPi2b [113]. Los ratones tratados con nicotinamida presentan una reducción semejante en la concentración de Pi en sangre (alrededor del 50 %). Otros estudios en ratas basados en experimentos in vitro muestran la importancia que el íleon puede tener en la absorción neta de fosfato [114]. En estos estudios, Kayne y colaboradores comparan la tasa de absorción de 32Pi en los diferentes segmentos del intestino de ratas vivas, y concluyen que aunque el duodeno presenta una alta tasa de absorción, el efecto en el Pi neto absorbido en el intestino delgado (aproximadamente 1/3) puede ser comparado con la baja tasa de absorción del íleon, ya que el tiempo de transito del Pi en el íleon es mucho mas lento, permitiendo una alta absorción paracelular de Pi. Esto contrasta con los estudios obtenidos por Eto y cols. a través de estudios in vitro usando voltaje-clamp en yeyuno de rata. En ellos comparan la importancia relativa de ambos componentes, paracelular y transcelular, concluyendo que el primero contribuye aproximadamente con el 22 % y el transporte transcelular con el 78 % de la absorción total de Pi en este segmento del intestino delgado (estos resultados están de acuerdo con los de experimentos de inhibición con PFA) [115]. Estas conclusiones son mas congruentes con nuestras observaciones, y se podrían explicar por una alta expresión de NaPi2b, aunque no desestimamos la importancia del transporte paracelular de Pi, o la posibilidad de la existencia de otros transportadores. 118 Como parte del estudio de la regulación de los transportadores de fosfato en rata, también se realizaron estudios de adaptación a concentraciones altas y bajas de fosfato en condiciones agudas y crónicas. Dado el bajo transporte de Pi y la nula expresión de los trasportadores NaPi en el íleon, se enfocó la atención en el duodeno y el yeyuno. Así, ratas adaptadas crónicamente durante 7 días con dietas bajas en Pi (0.1 %), presentaron un incremento de la expresión de la proteína de NaPi2b en BBM aisladas de yeyuno, y en el ARNm específico. Además, se observó también un incremento en el transporte de Pi in vitro en estas BBM, en comparación a los valores obtenidos tanto en BBM de yeyuno de ratas control (dietas con Pi al 0.6 %) como las ratas adaptadas a alto Pi (1.2 %). Al comparar las ratas alimentadas con las diferentes dietas (Figura 22), no se observan en el duodeno cambios estadísticamente significativos en la expresión de NaPi2b, de PiT1, ni en el transporte, y tampoco se observó ninguna adaptación a bajo Pi como se presentó en el yeyuno. Como se esperaba, las adaptaciones a bajo fosfato inducen un incremento de la expresión de los tres transportadores de fosfato renales, NaPi2a, NaPi2c y PiT2, lo cual promueve un aumento significativo de la absorción de Pi en BBM aisladas de riñón. Cabe destacar, que aunque se observa adaptación en intestino y en riñón a las dietas crónicas de bajo Pi, y que el incremento de la expresión de los transportadores de fosfato tiene como objetivo aumentar la absorción en el intestino y la reabsorción en el riñón, este mecanismo de adaptación no es suficiente para mantener una concentración fisiológica normal de Pi en sangre, y que se observa una disminución de 8.2 a 4.9 mg/dL de Pi. En contraste con las adaptaciones crónicas a bajo fosfato que afectan al yeyuno, las adaptaciones agudas a altas concentraciones de Pi afectan principalmente al duodeno. Ratas alimentadas agudamente con dietas con alto contenido en Pi (1.2 %), luego de ser alimentadas durante una semana con dietas con bajo Pi, es decir siendo sometidas primero a una adaptación crónica a bajo fosfato seguida de una adaptación aguda a alto fosfato (adaptación aguda bajo a alto), presentan un incremento de 5 veces en la tasa de 119 transporte de Pi in vitro en BBMs aisladas de duodeno. Este incremento es paralelo al aumento en la expresión proteica de NaPi2b, aunque la expresión de ARNm no fue modificada. Al igual que lo observado en el yeyuno, la expresión de PiT1 no se vio afectada. Los cambios en la absorción de Pi en el duodeno como respuesta a una adaptación aguda de bajo a alto Pi tienen repercusión en la concentración de Pi en sangre, ya que ésta se incrementa aproximadamente tres veces (de 5 a 16 mg/dL), lo cual se puede observar hasta dos horas tras la ingesta. Este efecto postprandial, que induce hiperfosfatemia transitoria, llama mucho la atención y es algo importante a tener en cuenta en estudios clínicos, ya que hasta muy recientemente muchos de los estudios fisiológicos realizados en humanos se enfocaban hacia las determinaciones aleatorias de Pi en sangre tras ayuno. Recientemente, Nishida y cols. estudiaron los efectos postprandiales de dietas con altas concentraciones de fosfato en humanos [116]. Aunque observaron resultados similares a los nuestros ya que hay incrementos en los niveles de Pi en sangre de forma muy temprana (dos horas tras la ingesta), la hiperfosfatemia transitoria inducida en humanos no alcanza la observada en rata: de 3.5 mg/dL a 5 mg/dL. Estos cambios en la concentración de Pi en sangre en humanos están asociados al incremento del riesgo de desarrollar ECV, incluso en sujetos sanos [117]. Este efecto transitorio postprandial puede ser mucho más marcado en pacientes con ERC, ya que presentan un capacidad limitada de excreción de Pi renal y un desajuste hormonal que no les permite mantener la homeostasis de Pi. Además, estos pacientes ingieren dietas restringidas en fosfato, y/o son sometidos a tratamientos con quelantes de Pi, por los que se podría esperar un marcado incremento de la absorción de Pi en duodeno, como se muestra en nuestro estudio. Bajo estas condiciones, NaPi2b se puede considerar una diana farmacológica, con el fin de inhibir su función, para con ello prevenir la hiperfosfatemia en los pacientes con ERC. La disminución en la expresión de NaPi2b sí se ha conseguido, parcialmente, en un modelo animal con el uso de ligandos del LXR, lo cual se muestra en los resultados correspondientes al siguiente apartado y que es tema central de esta tesis doctoral. 120 2. REGULACIÓN DE LOS TRANSPORTADORES DE FOSFATO POR PARTE DE LOS RECEPTORES NUCLEARES FXR Y LXR. ! Resultados previos obtenidos por nuestro grupo muestran que los ligandos que activan los receptores nucleares FXR y LXR pueden aliviar diferentes aspectos asociados con la enfermedad diabética renal, en especial la acumulación ectópica de lípidos en el riñón y la inflamación. También se ha demostrado que la activación de LXR y FXR puede disminuir el progreso de la enfermedad cardiovascular, en especial la formación de la placa de ateroma. Adicionalmente, a partir de estudios previos se observa que la modificación del perfil lipídico de la membrana apical de las células del túbulo proximal altera la actividad de los transportadores de fosfato renales, y en general la reabsorción de fosfato, lo cual se observó también en las células OK. A partir de ello se consideró la posibilidad de que la activación de estos receptores nucleares en riñón y en intestino podrían modificar la actividad de los transportadores de fosfato que se expresan en estos tejidos, dado que estos receptores nucleares pueden modificar el perfil lipídico. Dada la importancia de las células OK en el estudio de los transportadores renales, en primer lugar se determinó la expresión de los transportadores de fosfato diferentes a NaPi2a (NaPi4). Así, utilizando técnicas de clonación por homología y la amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE) se obtuvieron las secuencias de RNA de NaPi2c, PiT2 y PiT1 de esta línea celular (Didelphis virginiana). También se determinó la secuencia de una proteína de tipo PDZ (PIST), involucrada en un mecanismo de reciclaje de NaPi2a en el aparato de Golgi, como se mostró en nuestra reciente publicación [118]. Para determinar si las células OK constituyen un modelo válido para el estudio de los efectos de la activación de los receptores nucleares FXR y LXR en los transportadores renales, se determinaron las concentraciones ideales 121 de uso en estos estudios mediante la determinación de la actividad de la enzima LDH intracelular liberada al medio de cultivo como indicador de citotoxicidad. A partir de los resultados obtenidos se determinó que es posible el uso de tres de los agonistas de FXR, GW4064 y 6-ECDCA en el rango de 2.5 a 10 µM, y CDCA con concentraciones de hasta 30 µM, ya que a esas concentraciones no se observó ningún incremento en muerte celular. Para el caso de los tres agonistas de LXR las concentraciones útiles se encuentran en el rango de 2.5 a 15 µM para el caso del TO901317 y DMHCA, y de 2.5 a 10 µM para GW3965. Por lo tanto, en estos estudios se decidió utilizar todos los agonistas a concentración 5 µM, con excepción de CDCA y DMHCA, los cuales se utilizaron a concentración 30 y 7.5 µM respectivamente. Posteriormente se determinó la activación de estos receptores por microscopía confocal. Tras tratar las células durante 24 horas con el agonista mas potente de cada grupo (TO901317 para el caso de LXR y 6-ECDCA para el caso de FXR), se llevó a cabo el análisis inmunofluorescente, observándose un incremento en la expresión de ambos receptores en el núcleo de las células OK (consecuencia de su translocación), lo cual nos indica que el receptor nuclear (un factor de transcripción activado por ligando) ha sido activado. Esto fue también confirmado mediante la determinación de los cambios en el contenido lipídico en las células OK tras ser tratadas con algunos de estos ligandos. Por medio de la tinción de rojo de Nilo se observó (cualitativamente) un incremento en el número de gotas lipídicas en el citoplasma. Estas gotas están constituidas principalmente por triglicéridos y ácidos grasos esterificados. En el caso de LXR se observó un incremento de gotas lipídicas (Figura 37), ya que al activar LXR con GW3965 y TO901317 se activa, a su vez, la expresión del factor de transcripción SREBP1c, el cual inicia la síntesis de triglicéridos. En el caso de los agonistas de FXR, el efecto esperado es la disminución de las gotas lipídicas en el citoplasma, dado que FXR tiene un efecto inhibidor en la expresión de SREBP1. Este efecto fue más claro cuando se usó el ligando 6-ECDCA, ya que tras tratar las células durante 24h con este compuesto el numero de gotas lipídicas fue prácticamente nulo (Figura 38), sin embargo el efecto de GW4064 es cualitativamente imperceptible. Los cambios 122 observados en la concentración de triglicéridos y colesterol en la membrana de las células OK confirmaron las observaciones obtenidas con la tinción de rojo de Nilo. Tras tratar las células con los diferentes agonistas se aisló un extracto de membrana cruda por centrifugación y se confirmó que, efectivamente, los agonistas de LXR incrementan la concentración de triglicéridos y disminuye la concentración de colesterol en la membrana, sin embargo, los efectos en los triglicéridos debido a la activación de FXR es mínimo. La disminución de la concentración de colesterol es debida a la activación de los transportadores ABC como parte del transporte reverso del colesterol, como ya se mostró en intestino y riñón de ratón (Figura 50 y 51). Dicha capacidad de LXR de disminuir la presencia de colesterol han hecho este receptor nuclear altamente atractivo en el campo farmacéutico como tratamiento de las dislipidemias. Una vez determinada la capacidad de activar de forma efectiva estos receptores nucleares en las células OK, se evaluó el efecto en el transporte de fosfato, y se midió específicamente el transporte de 32P en presencia de sodio (Figura 41). A partir de estos resultados se observó que todos los ligandos de FXR presentaban un efecto inhibidor del transporte de fosfato, siendo CDCA el de mayor efecto (CDCA > GW4964 > 6-ECDCA). Cabe destacar que los tratamientos con CDCA fueron finalmente eliminados este estudio, ya que se percibieron efectos morfológicos negativos en la monocapa de las células OK, desprendiéndose fácilmente. En el caso de LXR el efecto inhibitorio se observó con los ligandos DMHCA > TO901317. Los resultados del efecto inhibitorio del transporte de fosfato se confirmaron al observarse una disminución en la expresión de la proteína NaPi4 encontrados en BBM aisladas de células OK tras ser tratadas con estos agonistas (Figura 42). Con excepción del agonista de FXR, GW4964, todos los demás agonistas indujeron la reducción de NaPi4 en las células OK, y cabe resaltar que dichos efectos fueron más pronunciados con los agonistas de LXR, TO901317 y DMHCA. Una vez determinada la viabilidad de estos agonistas en las células OK y el efecto inhibitorio en el transporte de fosfato, se quiso determinar el efecto en ratón, usando para ello un agonista para cada receptor nuclear. En el caso del FXR se usó el 6-ECDCA (Int-747) a una concentración de 35 mg/Kg, 123 añadido al pienso con un contenido de Pi del 0.6 %. Para LXR se usó el agonista DMHCA, también en el pienso de los animales, pero en este caso a una concentración inicial de 80 mg/Kg. Las dietas se mantuvieron durante 4 días. Tras el tratamiento, los animales fueron sacrificados y se aislaron las BBM del íleon y de riñón. La expresión proteica de los transportadores de fosfato fue determinada mediante western-blot, observándose llamativos resultados, como fueron la disminución en íleon de NaPi2b en un 83 % con DMHCA, y del 61 % con Int-747. De igual forma, se observó una disminución en la expresión de PiT1 del 30 %, pero sólo con el tratamiento de Int-747. En el caso del riñón, únicamente se observó un leve efecto en la expresión de NaPi2a, con una disminución del 14 % con el tratamiento con DMHCA (Figura 43). Estos resultados se compararon con la concentración de Pi en plasma, y se concluyó que Int-747, agonista de FXR, incrementa la fosfatemia en un 34 %, mientras que tras el tratamiento durante 4 días con DMHCA, no se observó ningún cambio en la concentración de Pi en plasma (Figura 44). Como previamente se ha explicado en el apartado correspondiente de Resultados, el estudio de los efectos de los receptores nucleares sobre los transportadores de fosfato se centró en LXR. Esto fue debido principalmente a la ausencia de incremento en la concentración de fosfato en sangre, en contra de lo observado para el FXR. También se tuvieron en cuenta los efectos positivos que ha tenido, sobre todo el compuesto DMHCA, al disminuir la progresión de la aterosclerosis en modelos knock-out de ApoE y LDLR. Esto último es debido a dos procesos: 1) la inducción del transporte reverso del colesterol, sin activar con ello la síntesis de triglicéridos, y 2) la disminución de la expresión de citoquinas pro-inflamatorias. Este último efecto es dado gracias a la capacidad de LXR de inhibir la expresión del factor de transcripción NFkB. Para determinar los efectos de DMHCA sobre los transportadores de fosfato en ratón, se incrementó el tiempo de ingesta de las dietas a dos semanas de tratamiento, y se usó un segundo agonista como control, a una concentración de 30 mg/Kg (TO901317), el cual aunque es mas potente que DMHCA induce lipogénesis. En nuestras condiciones ambos agonistas activaron LXR en intestino y riñón lo cual se determinó por el incremento de la 130 calcio para evitar la precipitación del ácido oxálico, por lo que se comparó con el transporte en ausencia de oxalato y sin calcio. Estos valores contrastan con los observados en células control, en las que se determinó una inhibición aproximada promedio de casi el 50 % del transporte de Pi con todos los compuestos utilizados. De todo esto se puede concluir la participación de un intercambiador similar a los de la familia Slc26, y cuya identificación se está persiguiendo en estos momentos en nuestro laboratorio de Zaragoza. 131 VII. CONCLUSIONES 132 1Se ha demostrado la presencia de los transportadores NaPi2b y PIT1 en la membrana apical de los enterocitos de rata, estando localizados principalmente en duodeno y yeyuno, y siendo prácticamente indetectables en íleon. 2NaPi2b presenta un papel fundamental en las adaptaciones crónicas y agudas del intestino a dietas altas y bajas en fosfato, lo cual contrasta con la respuesta de PiT1, que es mínima. La relevancia y función de este transportador de fosfato tipo III en el intestino queda aún por determinar. 3La adaptación de NaPi2b en duodeno como respuesta a diferentes contenidos de Pi en la dieta difiere de la observada en yeyuno, lo que sugiere la existencia de diferentes mecanismos de regulación de este transportador en estos segmentos del intestino delgado. 4El yeyuno parecer ser la fracción del intestino delgado mas importante en la adaptación a dietas crónicas con bajo fosfato, mientras el duodeno parece ser mas importante en la adaptación aguda a alto fosfato. En duodeno, los cambios en la expresión de NaPi2b no son tan considerables como los observados en yeyuno en respuesta a la adaptación a bajo Pi crónico. Lo opuesto es cierto en el caso del transporte de fosfato en estos dos segmentos, y la expresión de NaPi2b no es suficiente para justificar estos cambios. Lo cual nos indica la presencia de otro mecanismo, u otro transportador, que pueden ayudar a entender el por qué de estas diferencias tan marcadas. 5La hiperfosfatemia postprandial transitoria y la elevada expresión en el NaPi2b como respuesta aguda a dietas ricas en Pi, denotan la relevancia de NaPi2b en el intestino, y que la inhibición farmacológica de éste podría ser una posibilidad terapéutica importante en el tratamiento de la hiperfosfatemia. 133 6La activación de los receptores nucleares FXR y LXR en células OK induce una reducción del transporte de fosfato, y esto, en parte, es debido a la inhibición de la expresión de NaPi4 en BBM. 7El agonista de FXR, Int-747, reduce la expresión de NaPi2b en intestino, y de NaPi2a en riñón de ratón, pero genera un incremento en la concentración de Pi en sangre. 8La activación de LXR, a través de los agonistas DMHCA y TO901317, induce la reducción del transporte de fosfato en íleon y riñón de ratón, así como una disminución de la expresión de los transportadores de fosfato NaPi2b en intestino, y de NaPi2a, NaPi2c, y Pit2 en riñón. Esto genera una disminución de la concentración de Pi en sangre y un incremento de su excreción urinaria. Adicionalmente se observó un aumento en la concentración de FGF23 en sangre. 9Los efectos de los agonistas del LXR pueden tener aplicaciones farmacológicas muy importantes en el tratamiento de la hiperfosfatemia, en especial en pacientes con ERC. 10DMHCA es un agonista que puede presentar aplicaciones farmacológicas en diferentes patologías, ya que se ha demostrado en diferentes estudios la capacidad de estimular el transporte reverso del colesterol sin inducir lipogénesis. Adicionalmente puede reducir la absorción de fosfato en intestino. 11Las células CaCo-2BBE constituyen un modelo parcial para el estudio del transporte de Pi por el intestino. Se trata de un modelo incompleto, ya que sólo muestra un componente Na-independiente de transporte. Sin embargo, las claras características cinéticas de este transporte y su regulación por el propio Pi le constituyen en sí un modelo válido para el estudio del transporte Na-independiente de Pi por el intestino. 134 12El transporte Na-independiente de Pi en las células CaCo-2BBE e inhibido por PFA, DIDS y oxalato, por lo que, probablemente, se trate de un transportador miembro de la familia Slc26, cuya identificación se está llevando a cabo en estos momentos por el grupo de Zaragoza. 135 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 136 1. Alizadeh Naderi, A.S. and R.F. Reilly, Hereditary disorders of renal phosphate wasting. Nat Rev Nephrol, 2010. 6(11): p. 657-65. 2. Farrow, E.G. and K.E. White, Recent advances in renal phosphate handling. Nat Rev Nephrol, 2010. 6(4): p. 207-17. 3. Foley, R.N., et al., Calcium-phosphate levels and cardiovascular disease in community-dwelling adults: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Am Heart J, 2008. 156(3): p. 556-63. 4. 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