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2013 61 Andrés Buffoni Perazzo Efecto de los implantes de melatonina sobre los rendimientos en la obtención de embriones in vivo, la calidad seminal y la actividad reproductiva de ovinos en la región patagónica argentina Departamento Director/es Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Abecia Martínez, José Alfonso Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Andrés Buffoni Perazzo EFECTO DE LOS IMPLANTES DE MELATONINA SOBRE LOS RENDIMIENTOS EN LA OBTENCIÓN DE EMBRIONES IN VIVO, LA CALIDAD SEMINAL Y LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA DE OVINOS EN LA REGIÓN PATAGÓNICA ARGENTINA Director/es Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Abecia Martínez, José Alfonso Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria TESIS DOCTORAL EFECTO DE LOS IMPLANTES DE MELATONINA SOBRE LOS RENDIMIENTOS EN LA OBTENCION DE EMBRIONES in vivo, LA CALIDAD SEMINAL Y LA ACTIVIDAD REPRODUCTIVA DE OVINOS EN LA REGION PATAGONICA ARGENTINA Memoria presentada por el médico veterinario Andrés Buffoni para optar al grado de Doctor en Veterinaria Zaragoza, 2013 Melatonina en ovinos patagónicos 2  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  3  El presente trabajo de tesis se presenta como requisito para la obtención del título de Doctor en Veterinaria. El autor ha disfrutado de una beca doctoral del programa de postgrado del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria con Resolución Nº: 903/07  Melatonina en ovinos patagónicos 4     José Buf f SO B CA LI RE G requ i Doc t 201 0 Zar a Alfonso A f oni que ll e B RE LOS R L IDAD SE M G ION PAT A i sitos neces t or en Vet e 0 . a goza, a 27 A becia Ma r e va por tít u R ENDIMIE N M INAL Y L A GONICA A arios para q e rinaria. El de abril de F Tesis Do c r tínez, dir e u lo “ EFE C N TOS EN L L A ACTI V A RGENTI NA q ue pueda s proyecto d 2013 F do: .José A Di r ctoral Andr é 5 e ctor del t r C TO DE L L A OBTE N V IDAD RE P N A ”, consid s er presenta d d e tesis fue A lfonso Ab e r ector de Te é s Buffoni r abajo de T L OS IMPL A N CION DE E P RODUCT I e ra que di c d o con el o b aprobado c e cia Martín e Te sis T esis Doct o A NTES D E E MBRION E I VA DE O c ho trabajo b jetivo de o c on fecha 1 e z oral de A n E MELAT O E S IN VIV O O VINOS E N cumple c o o ptar al Gr a 1 0 de febr e n drés ON INA O , LA N LA o n los a do de e ro de Melatonina en ovinos patagónicos 6  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  13  Está demostrado el efecto de la melatonina exógena sobre el desarrollo folicular y la tasa de ovulación, ya que dicha hormona aumenta el número de folículos ovulatorios debido a una disminución del proceso de atresia de los folículos pequeños y medianos presentes en la onda folicular previa a la ovulación. Por tal motivo se consideró que bajo esta premisa, un tratamiento de superovulación para la producción de embriones in vivo en ovejas con implantes de melatonina exógena posibilitaría una mayor producción de embriones viables, mejorando la tasa de ovulación. La primera experiencia del experimento 1 se realizó en estación reproductiva utilizando 22 ovejas adultas de raza Dohne Merino, llevándose a cabo entre los meses de febrero y abril de 2010. La segunda experiencia fue durante el anestro reproductivo, utilizando 12 ovejas raza Dohne Merino, entre los meses de septiembre a noviembre. Los animales fueron divididos en 2 lotes homogéneos, el lote M (melatonina) recibió un implante subcutáneo de melatonina de 18 mg (Melovine Ceva Salud Animal, Barcelona, España) por oveja y el lote C (control) no recibió ningún implante. Ambos lotes recibieron un tratamiento de sincronización de celo con esponjas con progestágeno y un tratamiento de superovulacion con 8 dosis decrecientes de FSH ovina con un total de 256 mg equivalentes a 12,8 ml por animal. Al día 7 de la extracción de esponjas se realizó la recuperación embrionaria sin detectar diferencias significativas entre tratamientos ni durante la estación reproductiva ni durante el anestro estacional entre los parámetros estudiados. Únicamente se observó, durante la estación reproductiva, un efecto significativo (p<0,05) del tratamiento sobre el momento de manifestación de los celos en relación a la retirada de la esponja, siendo dicho momento posterior en las ovejas que recibieron el tratamiento con implantes de melatonina. Esta diferencia no se evidenció en el ensayo en anestro estacional, siendo los promedios de hora de manifestación de celos similares para ambos grupos. Se pudo observar durante el ensayo en anestro estacional, diferencias significativas (p<0,05) a favor del tratamiento con melatonina en lo que a la obtención de embriones degenerados o muertos se refiere. Nuestros resultados indican que el uso de la melatonina durante el anestro estacional tiene un efecto positivo en corto plazo en la viabilidad de los embriones, lo que resulta en un aumento de las tasas de viabilidad a causa de una disminución significativa en el número los embriones no viables (degenerados y retardados).En conclusión, y aunque los resultados de nuestro estudio indican que la melatonina exógena puede mejorar la viabilidad de los embriones recolectados en ovejas Dohne Merino después de la superovulación en el periodo de anestro estacional, el tratamiento con melatonina no Melatonina en ovinos patagónicos 14  mostró beneficios en términos de mejora de tasa de ovulación y de producción de embriones para hembras raza Dohne Merino en la región Patagónica Argentina. Como en el caso de la hembras, la utilización de implantes de melatonina en machos disminuye el grado de anestro estacional que, aunque en éstos es poco marcado, se refleja en un déficit de las aptitudes reproductivas. No hay información del efecto de los implantes de melatonina en latitudes superiores a 40º en el hemisferio sur, ni en la raza Dohne Merino. Por tal motivo, se realizó una experiencia para evaluar el efecto de la melatonina exógena sobre los parámetros de calidad seminal en muestras de semen fresco y descongelado en moruecos raza Dohne Merino. Se realizaron dos experiencias durante dos años seguidos en anestro estacional con un lote de 20 y 12 moruecos respectivamente, de raza Dohne Merino, divididos en 2 grupos homogéneos: uno de los lotes fue tratado el 1 de septiembre con 3 implantes de melatonina por macho (lote M), siendo el resto el lote no tratado, control (lote C). A partir de la colocación del implante se realizó, en forma quincenal, la toma de datos de peso vivo (PV), condición corporal (CC), circunferencia escrotal y muestra de suero sanguíneo para determinación de testosterona, y a partir de los 30 días de colocado el implante se tomaron muestras semanales de semen para evaluación de calidad seminal. Entre los 60 y los 70 días de colocado el implante se realizó la congelación del semen de cada animal que respondió a la extracción del material, para evaluar la calidad del mismo al descongelado. No se advirtieron diferencias significativas para los parámetros de motilidad masal, concentración espermática y porcentaje de espermatozoides vivos y muertos. El tratamiento no influyó sobre el PV y la CC. La circunferencia escrotal se incrementó de manera significativa (p<0,05) a favor del grupo de animales con implantes de melatonina en ambos años. Tras la colocación de los implantes se apreció un rápido aumento, durante los primeros 15 días, de los niveles de testosterona en el primer ensayo, en ambos grupos, sin generar diferencias estadísticas significativas, para posteriormente mostrar un patrón irregular de ascenso y descenso sin diferencias significativas entre tratamientos. No se observaron diferencias significativas entre tratamientos en motilidad rectilínea progresiva, vigor, porcentajes de espermatozoides vivos y muertos y test de permeabilidad de membrana (Test de Hos) sobre el semen descongelado. Sí se observan diferencias significativas en la evaluación de motilidad espermática total en el primer experimento a favor del grupo control sobre el grupo melatonina de las muestras de semen descongelado, no evidenciándose esta diferencia en los muestreos de semen descongelado del segundo año en estudio. Tampoco se Tesis Doctoral Andrés Buffoni  15  evidenciaron diferencias significativas en los resultados en la prueba de funcionalidad mitocondrial con rhodamina y clortetraciclina para ambos experimentos. En conclusión, el uso de implantes de melatonina en anestro estacional sobre moruecos raza Dohne Merino en la región Patagónica Argentina logra modificar en forma significativa la circunferencia escrotal sin modificar los parámetros de calidad seminal tanto en muestreos de semen fresco como en semen descongelado. Por último y de acuerdo a lo observado por algunos autores que el tratamiento con melatonina se asocia con una disminución significativa de la proporción de ovejas no cíclicas que responden al efecto macho durante el anestro estacional, y una mejora sustancial de los resultados reproductivos, y sin datos de este tipo de experiencias en Argentina, se plantea evaluar los efectos de la melatonina exógena sobre los índices reproductivos de hembras en anestro estacional bajo un manejo netamente extensivo. Se utilizaron 120 ovejas Merino adultas, divididas en dos grupos homogéneos en lo referente a PV, CC y edad. El grupo M, implantado, estuvo conformado por 60 ovejas a las cuales se les colocó un implante subcutáneo de melatonina de 18 mg el 2 de septiembre de 2010, un mes antes del momento de mayor anestro estacional (octubre). El grupo C, control, estuvo conformado por 60 ovejas y no recibió ningún tipo de tratamiento hormonal. Los primeros días de octubre se introdujeron 15 moruecos adultos raza Dohne Merino para realizar las cubriciones durante 45 días. Llamativamente no hemos tenido resultados para su análisis estadístico durante la elaboración de este experimento. No se detectó ciclicidad ovárica, traducido en falta permanente de celos en ambos lotes en estudio y ausencia total de gestaciones. Es importante destacar que si bien los anímales, por la situación de sequía que atraviesa la zona Patagónica desde hace ya varios años, se encontraban en una baja CC y PV, se cree que este factor no es responsable de los resultados obtenidos, observando una mejora del estado nutricional a los 50 días de colocado el implante. En conclusión, los implantes de melatonina en hembras Merino manejadas a campo en forma ultraextensiva en la región Patagónica Argentina no manifestaron respuesta favorable a la presentación de celo complementadas con el tratamiento de efecto macho. Consideramos que hacen falta más estudios, que nos permitan conocer las posibilidades de uso de los implantes de melatonina en un sistema ultra extensivo como el de la región Patagónica Argentina. Melatonina en ovinos patagónicos 16   Tesis Doctoral Andrés Buffoni  17  SUMMARY  Melatonina en ovinos patagónicos 18  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  19  It has been demonstrated that exogenous melatonin has a direct effect on follicular development and ovulation rate, since this hormone increases the number of ovulatory follicles decreasing the process of atresia of small and medium follicles present in the pre-follicular wave ovulation. Under this premise, superovulation treatment for in vivo sheep embryo production with exogenous melatonin implants would allow an increase of the production of viable embryos, improving ovulation rate. The first experience of Experiment 1 was conducted during the breeding season using 22 adult Dohne Merino sheep, between February and April 2010. The second experience was carried out during the reproductive anestrus, using 12 Dohne Merino sheep between September and November 2011. The animals were separated into two homogeneous groups: group M (melatonin) received a subcutaneous implant of 18 mg melatonin and Group C (control) received no implant. Both groups were oestrous synchronized with progestagen sponges and superovulated with 8 oFSH decreasing doses with a total of 256 mg equivalent to 12.8 ml per animal. Seven days after pessary withdrawal, an embryo recovery was performed, with no significant differences between treatments either during the breeding season or during seasonal anestrus for all the parameters studied. We only observed during the breeding season a significant effect (p<0.05) of treatment on the time of manifestation of oestrus in relation to the extraction of the sponge, being later in the treated group. This difference was not evident in the seasonal anestrus experiment, with an average expression of oestrus similar for both groups. Significant differences (p<0.05) for the number of degenerated or dead embryos was observed between groups during the experience in seasonal anestrus. Our results indicate that the use of melatonin during the seasonal anestrus has a short-term effect on embryo viability, resulting in increased viability rates due to a significant decrease in the number of unviable embryos (degenerate and delayed). In conclusion, although the results of our study indicate that exogenous melatonin can improve the viability of embryos collected in Dohne Merino sheep after superovulation in the seasonal anestrus period, treatment with melatonin did not show benefits in terms of ovulation rate and embryo production for Dohne Merino ewes in the Patagonia zone in Argentina. As in the case of ewes, the use of melatonin implants in rams decreases the effect of the seasonal anestrus, and although this effect is not very marked, it is reflected in a lack of reproductive ability. No information on the effect of melatonin implants at latitudes greater than 40° in the Southern hemisphere, or in Dohne Merino breed, is available. Therefore, an experiment was conducted to evaluate the effect of exogenous melatonin Melatonina en ovinos patagónicos 20  on semen quality parameters in fresh semen and thawed samples in Dohne Merino rams. Two experiments were conducted for two consecutive years during seasonal anestrus with a group of 20 and 12 rams, respectively, of the Dohne Merino breed. They were divided into two homogeneous groups: one group was treated with 3 melatonin implants (group M) on 1 September, with the remainder group considered as untreated controls (group C). After implant placement was performed, data records of live weight (LW), body condition (BC) and scrotal circumference (SC) were performed every fortnight; serum samples were collected to determinate testosterone levels, and after 30 days of implanting, semen samples for semen quality assessment were taken weekly. Between 60 and 70 days after melatonin insertion, semen of each animal that responded to the extraction of semen was frozen to assess its quality after thawing. No significant differences were found for mass motility parameters, sperm concentration and percentage of live and dead sperm. The treatment had no effect on LW and BC. Scrotal circumference increased significantly (p<0.05) in favor of the implanted animals in both years. A fast increase of testosterone levels in the first trial was observed during the first 15 days after implantation, in both groups, without significant differences. After that, an irregular pattern of rise and fall of the hormone was observed, without differences between treatments. No significant differences were found between treatments for rectilinear progressive motility, vigor, percentage of live and dead sperm, membrane permeability test (Hos Test) on thawed semen. No significant differences were observed after the test with rhodamine and chlortetracycline on mitochondrial functionality. In conclusion, the use of melatonin implants during seasonal anestrus in Dohne Merino rams in the Patagonia zone of Argentina significantly modified scrotal circumference with no changes on semen quality parameters in both samples of fresh and thawed semen. According to some authors, who observed that the treatment with melatonin is associated with a significant decrease in the proportion of non-cyclic sheep responding to the ram effect during seasonal anestrus, and a substantial improvement in reproductive performances outcomes, and with no evidence of such experiences in Argentina, we proposed to evaluate the effects of exogenous melatonin on the reproductive parameters of ewes during seasonal anestrus under an ultra-extensive farming system. Merino sheep were used (n=120), separated into two homogeneous group regarding BW, BC and age. Group M (n=60) were implanted with melatonin on 2 September 2010, a month before the peak of seasonal anestrus at this latitude (October). Tesis Doctoral Andrés Buffoni  21  Group C, control, (n=60) received no hormonal treatment. On early October, 15 Dohne Merino adult rams were introduced to perform the mating for 45 days. Interestingly, we have no results for statistical analysis during the development of this experiment. Ovarian cyclicity was not detected, resulting in a permanent lack of oestrus in both groups under study, and an absence of pregnancies. It is importantly to note that the drought impact for several years in Patagonia, generating low BW and BC, is not responsible for these results, giving rise to an improvement of nutritional status 50 days after placing the implant. In conclusion, melatonin implants in Merino sheep managed under ultra-extensive conditions in the Patagonia region of Argentina showed no favorable response to the presentation of oestrus supplemented with the ram effect. More studies are necessary to provide more evidence of the possibilities of using melatonin implants in this region of Argentina.  Melatonina en ovinos patagónicos 22  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  29  INDICE DE FIGURAS Nº 1: Representación esquemática de los mecanismos que controlan la síntesis de Melatonina ……………………………………………………………………...43 Nº 2: Representación esquemática del crecimiento del oocito, capacitación y maduración durante la foliculogénesis ………………………………………... 48 Nº 3: Componentes de los sistemas utilizados en la evaluación computarizada de la motilidad espermática (CASA)……………………………………………60 Nº 4: Prueba de endósmosis ………………………………………………………….. 64 Nº5: Morueco raza Dohne Merino ……………………………………………………71 Nº 6: Esquema del protocolo aplicado para la superovulación de ovejas Dohne Merino…………………………………………………………………....80 Nº 7: Aplicación de anestésico…………………………………………………………81 Nº 8: Incisión para lavado de útero………………………………………………….....81 Nº 9: Observación de tasa de ovulación……………………………………………….82 Nº 10: Búsqueda de embriones………………………………………………………...82 Nº 11: Momento de extracción de semen……………………………………………...86 Nº 12: Tubo colector para determinación de volumen de eyaculado………………….86 Nº13: Cuadricula de recuento de espermatozoides en cámara de Neubauer…………..88 Nº 14: Tinción de eosina/nigrosina para ver permeabilidad de membrana………..…..89 Nº 15: Espermatozoides sometidos a la prueba HOS………………………………….93 Nº 16: Espermatozoides sometidos a la reacción de Rh 123…………………………..95 Nº 17: Espermatozoides de carnero congelados/descongelados expuestos a la Prueba de CTC…………………………………………………………..…97 Nº 18: Colocación de implante de melatonina………………………………………... 99 Nº 19: Manejo Extensivo ……………………………………………………………...99 Nº 20: Evolución de la circunferencia escrotal en ambos experimentos (Año 1; Año2) a partir de los 30 días de la colocación de implantes (día 1) en el grupo melatonina y el grupo control………………………….…..106 Melatonina en ovinos patagónicos 30  Nº 21.: Evolución de las medias de concentración espermática de animales Implantados con Melatonina y Control durante los dos experimentos (Año1;Año 2) en anestro reproductivo……………………………………….108 Nº 22: Evolución de las medias de porcentajes de espermatozoides vivos a través de tinción de eosina-nigrosina de animales implantados con melatonina y control durante los dos experimentos (Año1;Año 2) en anestro reproductivo………………………………………………………109 Nº 23: Evolución de las medias de Volumen de eyaculado (ml) de animales implantados con melatonina y control durante los dos experimentos (Año1;Año2) en anestro reproductivo………………………………………..110 Nº 24: Evolución de los niveles de testosterona sobre animales con implantes de melatonina (Melatonina) y en el grupo de animales control (Control) a partir de los 30 días de aplicación del implante durante los dos experimentos en anestro reproductivo…………………………………..……112 Tesis Doctoral Andrés Buffoni  31  INDICE DE TABLAS Nº 1: Efecto del tratamiento repetido con FSH ovina sobre la respuesta ovárica y la producción de embriones en ovejas rasa ……………………………………….55 Nº 2: Comparación de la respuesta ovulatoria y la producción de embriones (medias ± ES) en ovejas de raza Dohne Merino tratadas o no con melatonina, en estación reproductiva y en anestro estacional…………………………..…104 Nº 3: Resultados de parámetros fenotípicos y reproductivos de calidad seminal (media± ES) de dos años consecutivos sobre animales con 3 implantes subcutáneos de melatonina (melatonina) y no implantados (control)…………107 Nº 4: Resultado de valores de testosterona en sangre expresados como (medias ±ES), valores mínimos y máximo detectables (ng/ml) y coeficiente de variación intra e interensayos para ambos grupos en estudio (melatonina; control) durante los dos experimentos en anestro reproductivo ……………………………………….111 Nº 5: Resultados de evaluaciones de parámetros de funcionalidad espermática (media± ES) de ambos ensayos (año 1;año 2) sobre animales con 3 implantes subcutáneos de melatonina (melatonina) y no implantados (control)………..114 Melatonina en ovinos patagónicos 32                Tesis Doctoral Andrés Buffoni  33    REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA  Melatonina en ovinos patagónicos 34   Tesis Doctoral Andrés Buffoni  35  INTRODUCCIÓN La disponibilidad de recursos forrajeros para el ganado fluctúa durante el año, condicionando la reproducción en forma estacional en la mayoría de las especies. El objetivo natural es asegurar el nacimiento de las crías en el momento de mayor supervivencia, que es cuando hay mayor aporte de alimento y las temperaturas no son tan bajas. El factor ambiental que permite conocer con antelación el momento favorable para los nacimientos es la variación estacional de la duración del periodo de iluminación diaria, también conocido como fotoperiodo. Dicha variación determina que los ovinos ubicados en zonas templadas del planeta alternen periodos de actividad reproductiva máxima con otros de actividad sexual mínima. La productividad de las explotaciones ovinas está limitada en gran medida por esta estacionalidad sexual, al contrario que en otras especies donde casi no existe (bovina, porcina). Dado que la duración de la gestación en ovinos es de 5 meses, la estación reproductiva se inicia tras el solsticio de verano y se extiende de agosto a enero aproximadamente en el hemisferio norte y de enero a agosto en el hemisferio sur, mientras que la estación no reproductiva o anestro estacionario se puede iniciar a partirdel solsticio de invierno, dependiendo de la latitud. De esta manera, los nacimientos tienen lugar en los momentos óptimos de recursos forrajeros. 1. EFECTOS DEL FOTOPERIODO EN LA ESTACIONALIDAD REPRODUCTIVA EN OVINOS 1.1 Aspectos generales La duración de la iluminación natural es un factor repetible año a año, por lo que se cree que el fotoperiodo es el factor principal que determina el inicio y el final de la época reproductiva (Karsch et al., 1984). La estacionalidad sexual es un factor común en todas las razas ovinas ubicadas en las zonas templadas, fuera de los trópicos, que además aumenta con la latitud (Pelletier et al., 1987). Es por ello que se considera que la oveja tiene un ritmo endógeno de reproducción, de manera que el papel de las variaciones anuales del fotoperiodo es la sincronización del citado ritmo a un espacio temporal de un año (Malpaux et al., 1989), alternando a lo largo del mismo periodo de actividad reproductiva y de anestro. Melatonina en ovinos patagónicos 36  Los ovinos presentan anualmente dos etapas fisiológicas bien definidas (Barrell et al., 1992). Una fase de anestro estacional (días largos), con ausencia de ciclos estrales regulares, receptividad sexual y ovulación, que en el macho se representa por el cese de la espermatogénesis y la libido. La otra etapa fisiológica, conocida como época reproductiva, se caracteriza por la ocurrencia de ciclicidad ovárica y estral, caracterizada por la sucesión a intervalos regulares de 17 días de duración aproximadamente, conducta de celo y ovulación en la hembra; en el macho, se restablece la espermatogénesis y el deseo sexual (Hafez et al., 1952; Malpaux et al., 1997) de manera que los nacimientos ocurren en la época más favorable del año, con abundancia de pastos y temperatura ambiental confortable. Como se mencionó anteriormente, el fotoperiodo es el factor ambiental primario que regula estos eventos, por lo que la actividad reproductiva se puede modular alternando periodos de días largos, de 16 horas de luz y 8 de oscuridad o días cortos de 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad constantes, de manera que la exposición a los días cortos induce el inicio de la actividad ovulatoria 40-50 días después del comienzo de la estimulación, mientras que los días largos provocan una inhibición de la misma, que cesa 20-30 días después del comienzo del tratamiento (Karsch et al., 1984). Aunque también se ha demostrado que el efecto estimulante de los días cortos no es permanente, pues si los animales son expuestos durante largos periodos de tiempo a un régimen fotoperiódico de días cortos cesan su actividad reproductiva, y esto es debido a que se hacen refractarios a los mismos, cesando la actividad ovulatoria a los 120-150 días de exposición (Thimonier, 1989).De igual forma, animales expuestos a días largos de forma constante también acaban volviéndose refractarios a ellos, y son capaces de iniciar su actividad reproductiva a los 6 meses de exposición (Thimonier, 1989). La misión de los días decrecientes pero largos que tienen lugar desde el solsticio de verano al equinoccio de otoño no es iniciar la estación reproductiva, sino conseguir que ésta tenga una duración normal, demostrando que la distinta función que ejercen las distintas fracciones fotoperiódicas de año natural. Finalmente, los días cortos que van del equinoccio de otoño al solsticio de invierno tienen como objetivo romper la fotorrefractariedad a los días largos y conseguir que la oveja responda al efecto inhibidor de los mismos en la primavera siguiente. La intensidad del papel regulador del fotoperiodo es variable con la latitud, siendo mayor conforme ésta aumenta, con lo que se establecen unas importantes diferencias interraciales que no desaparecen totalmente cuando los genotipos se explotan bajo las Tesis Doctoral Andrés Buffoni  37  mismas condiciones fotoperiódicas (Poulton y Robinson, 1987). Por tanto y a pesar de que las condiciones fotoperiódicas sean similares, el ritmo endógeno que es propio del animal se expresa independientemente del fotoperiodo prevalente, si bien, su expresión (intensidad de la estacionalidad) es modulada por este último. 1.2 Mecanismo de acción del fotoperiodo La oveja posee un sistema neurofisiológico capaz de transformar la señal luminosa en una señal hormonal a través de la síntesis de melatonina y de esta manera detecta las variaciones anuales en la duración del fotoperiodo (Williams y Helliwell, 1993).La melatonina, que fue descubierta en 1958 en la Universidad de Yale, Estados Unidos, por A.E.Lerner, es una sustancia natural presente en el organismo de todos los mamíferos y sintetizada en la glándula pineal a partir del triptófano y la serotonina, proceso en el que intervienen enzimas cuya actividad está regulada por la percepción día/noche. Los niveles plasmáticos de melatonina en la oveja son basales durante el día, de manera que inmediatamente, pasado unos 10 minutos del inicio de la oscuridad, se elevan hasta alcanzar concentraciones entre 100-500 pg/ml. Además, es rápidamente metabolizada en 6-hidroxi-melatonina por el hígado, siendo excretada vía orina en forma sulfatada; por tanto, sus niveles vuelven a ser basales al alba. Los niveles nocturnos son variables entre animales, si bien dentro de un mismo animal se trata de un carácter bastante repetible; dicha variabilidad se basa en diferencias en su síntesis, en general en función del tamaño de la pineal, pero no en su metabolismo (Zarazaga et al., 1998). Estas características determinan que el perfil de secreción de melatonina en periodos de 24 horas sea largo en invierno y corto en verano, de manera que la evolución de la duración del mismo a lo largo del año informa a la oveja del fotoperiodo prevalente. Durante la estación sexual, la secreción hipotalámica de GnRH y la consecutiva de LH por parte de la hipófisis determinan los acontecimientos del ciclo sexual. La secreción de LH se encuentra inhibida durante la fase luteal por los elevados niveles de progesterona producida por el cuerpo lúteo (Karsch et al., 1987). Tras la luteolisis, la caída brusca de los niveles plasmáticos de progesterona induce un aumento de la pulsatilidad de GnRH y de LH (Clarke et al., 1987), estimulando la secreción de estradiol en la fase folicular que inicia el pico preovulatorio de GnRH y LH, desencadenándose así la ovulación (Clarke, 1988; Moenter et al., 1991). Melatonina en ovinos patagónicos 38  El anestro estacionario se produce como consecuencia de un descenso en la actividad del eje hipotálamo-hipofisario, por el cual queda considerablemente reducida la frecuencia de pulsos de GnRH y en consecuencia la secreción de las hormonas hipofisarias (Karsch et al., 1984). La baja frecuencia de pulsos de GnRH-LH, que llega a ser de 1 pulso/12 horas (Barrell et al., 1992), no se debe a una alteración en la capacidad neurosecretora, dado que la ovariectomía conlleva un claro incremento en la pulsatilidad de GnRH durante el periodo de inactividad sexual (Karsch et al., 1987). La presencia de concentraciones basales de estradiol como las de la fase luteal suprimen la secreción pulsátil de GnRH en anestro estacionario y no en estación sexual (Moenter et al., 1990; Barrell et al., 1992, Karsch et al., 1993), confirmando el hecho de que la variación estacional de la frecuencia de pulsos es consecuencia de un cambio de la respuesta hipotalámica a la retroacción negativa del estradiol en función del fotoperiodo prevalente (Karsch et al., 1980; Webster y Haresign, 1983). 1.3 Influencia de la raza Es bien conocido que las razas que se desenvuelven en latitudes elevadas tienen un anestro más largo y además más profundo. En estos animales, las grandes diferencias de la duración del día entre el verano y el invierno hacen que el fotoperiodo tenga un fuerte protagonismo en la regulación de la estacionalidad, mientras que los factores de manejo (nutrición) o las relaciones sociales (presencia de machos) apenas modifican la misma; al contrario sucede en las razas ubicadas en latitudes medias o bajas. En general, el inicio y el final de la estación reproductiva así como la duración de la misma, son caracteres heredables, con lo que pueden ser utilizados para selección genética, aunque el componente ambiental es también importante, y la estacionalidad de una raza puede modificarse cuando los animales cambian de latitud. El origen de la raza determina el comportamiento reproductivo estacional; por lo tanto, las razas originarias de latitudes altas, por encima de 35º presentan una marcada estacionalidad reproductiva (Hafez, 1952; Karsch et al., 1984; Robinson et al., 1985; Malpaux et al., 1987) y los ovinos de origen mediterráneo o ecuatorial, expresan estacionalidad reproductiva reducida o inexistente, respectivamente (Forcada et al., 1992; Porras, 1999; Valencia et al., 2006; Arroyo et al., 2007). Tesis Doctoral Andrés Buffoni  45  Palacín et al. (2011) recopilaron la información publicada en lo que al efecto de los implantes de melatonina sobre los parámetros reproductivos se refiere, en forma de meta-análisis, herramienta estadística que permite comparar trabajos publicados en distintas fuentes pero que han utilizado la misma metodología. Se han analizado los resultados de 139 experiencias publicadas en 56 publicaciones o comunicaciones. Para la fertilidad, la melatonina incrementó de manera significativa las posibilidades de parto un 29%. Para la prolificidad, se concluyó que los grupos tratados incrementaron su prolificidad 0,08 corderos/parto. El tratamiento con melatonina aumentó de manera significativa la fecundidad, con 0,25 corderos extra producidos/oveja tratada. 2.4 Vía de aplicación del implante con melatonina La vía de aplicación finalmente adoptada a nivel comercial ha sido la de los implantes (2x4 mm) subcutáneos aplicados en la base de la oreja, que en España, autorizados en el año 2000, reciben el nombre comercial de Melovine® (CEVA, Salud Animal S.A., Barcelona). En otros países como en Gran Bretaña, Australia, Nueva Zelanda y Grecia, reciben el nombre de Regulin®. Estos implantes contienen 18 mg de melatonina, que se libera de forma lenta y continua, elevando los niveles basales en plasma pero sin eliminar la secreción endógena normal de la misma por la glándula pineal, dado que la magnitud de la diferencia entre valores nocturnos y diurnos es muy similar entre animales implantados y no implantados (Forcada et al., 1995). La melatonina administrada de esta forma proporciona una información fotoperiódica que la oveja interpreta como días cortos (Malpaux et al., 1997). Haresign (1990) observaron en razas inglesas que la colocación de un solo implante en la hembra era igual de efectivo que utilizando dos implantes. En cambio, en el macho se recomienda el uso de tres implantes por animal. Un periodo de administración excesivamente corto puede resultar ineficaz a la hora de obtener una respuesta satisfactoria. Así, Bittman et al. (1985), señalaron que cuando las ovejas están experimentando días crecientes la exposición a la melatonina induce una estimulación de la secreción pulsátil de LH a los 40-60 días del inicio del tratamiento. De este modo, utilizando implantes subcutáneos de melatonina, se requieren al menos 36 días para inducir una mayor ciclicidad en el lote tratado, obteniéndose un mejor resultado con 93 días de exposición al implante. Melatonina en ovinos patagónicos 46  Dado que los implantes subcutáneos de melatonina causan una respuesta de días cortos sin eliminar el ritmo endógeno de secreción propio del animal (O´Callaghan et al., 1991; Malpaux et al., 1997), a los 40-60 días de su colocación se observa un incremento en la frecuencia de los pulsos de LH y GnRH en ovejas sometidas a días largos (Viguié et al., 1997). Según Chemineau et al. (1996), la duración habitual de los niveles elevados de melatonina en plasma tras un tratamiento en forma de implantes subcutáneos, es de 70 días. Forcada et al. (2002a) observaron cómo animales implantados mantenían niveles elevados de melatonina tras 100 días de tratamiento, y esos niveles parecían decaer a los 120 días de la colocación de los implantes, si bien había ovejas que todavía mantenían una cierta respuesta a los mismos. 2.5 Efecto de los implantes de melatonina en moruecos La utilización de fotoperiodos artificiales ha demostrado que también los machos poseen un ritmo endógeno de reproducción que está regulado por los ciclos luzoscuridad (Lincoln y Davidson, 1977). El cambio brusco de fotoperiodo de días largos a uno corto incrementó las concentraciones de FSH, LH y testosterona, además de un incremento en el crecimiento testicular. Ha sido ampliamente demostrada la capacidad de la melatonina para revertir los efectos de la estacionalidad en la reproducción tanto en machos como hembras (Fitzgerald y Stellflug, 1991; Chemineau et al. 1992; Abecia et al., 2008). Aunque la variación estacional de los parámetros reproductivos es menos marcada en el macho que en las hembras, en estación no reproductiva se observa una disminución del volumen y del diámetro testicular, deterioro en la calidad del semen, así como también una alteración del perfil hormonal (Schanbacher y Lunstra, 1976), afectando el desempeño reproductivo de los carneros. Otros estudios han demostrado que el tratamiento con melatonina mejora la motilidad de espermatozoides progresivos (Kayaetal., 2000) y la actividad acrosómica. El uso de implantes de melatonina en el morueco durante la estación no reproductiva se ha asociado con mejoras en parámetros reproductivos como el diámetro escrotal, fertilidad y prolificidad (Palacín et al., 2008), aunque el mecanismo de acción por el cual la melatonina ejerce su acción no es del todo conocido. Aunque esta hormona parece ejercer su acción principalmente en el eje hipotálamo-hipofisario (Webster et al., Tesis Doctoral Andrés Buffoni  47  1991), recientes estudios de nuestro grupo han demostrado su presencia y su variación estacional, junto con la testosterona, en el plasma seminal (Casao et al., 2010a), lo que, además de su acción directa sobre la célula espermática (Casao et al., 2010b), sugiere también una acción relevante a nivel testicular y de las glándulas accesorias. Al igual que en las hembras, en los moruecos la melatonina presenta un ritmo de secreción circadiano, con concentraciones plasmáticas elevadas durante la noche y disminuidas con la aparición de la luz del día (Lincoln et al., 1982). Se ha demostrado asimismo en los machos el carácter pulsátil de su liberación (Sheikheldin et al., 1992). Los tratamientos con melatonina en moruecos en fotoperiodo de días largos han demostrado tener un efecto estimulador de la funcionalidad sexual de forma similar al efecto de la exposición a días cortos (Lincoln y Ebling, 1985). También se han encontrado diferencias en el peso testicular tras el tratamiento con melatonina, a favor del lote tratado (Tekpetey y Amann, 1988). Fitzgerald et al. (1991) observaron una mayor fecundidad en las ovejas cubiertas en primavera por machos tratados con melatonina. A nivel comercial se aconseja la colocación de 2-3 implantes en el macho. Así Rosa et al. (2000) obtuvieron un incremento en las concentraciones plasmáticas de testosterona y un aumento de la líbido en moruecos tratados. De forma parecida, Kokolis et al. (2000) encontraron un aumento de las concentraciones medias y del número de picos de testosterona, demostrando también un importante efecto del tratamiento con melatonina sobre la calidad espermática. Beltrán de Heredia (1995) llevó a cabo un ensayo en machos ovinos de raza Lacha implantando en abril, y obtuvo una clara mejoría del volumen del eyaculado y de la concentración espermática a partir de la novena semana de tratamiento, logrando de ese modo un mayor número de dosis seminales por eyaculado. Bravo (2003), con moruecos de raza Merino, obtuvieron un mayor número de espermatozoides por eyaculado en tratamientos de febrero y marzo, observándose por otro lado un menor tiempo de cortejo en los machos tratados. García Pastor et al. (2004), obtuvieron al inicio de anestro diferencias significativas en el perímetro escrotal de moruecos de raza Rasa Aragonesa tratados con melatonina frente a los no tratados.  3. D E 3.1 D La f pasa n ovul a tant o Este nace r cue n Esto s por o atres De f recl u inhi b (For t estr u folíc u E SARRO L D esarrollo f f oliculogén e n do por di a ción o b i e o de las cél u proceso s e r , la corde r n ta con una r s conforma n o veja (Scar a ia. Fig . 2. Rep r ma d f orma cont i u tamiento i n b itorios qu e t une, 2002 ) u ctural en l a u los prima r L LO FOLI C f olicular e sis es el p ferentes et a e n la atresi a u las somáti c e inicia te m r a, al igual r eserva o po n los folíc u a muzzi et a r esentació n d uración d u i nua y ya n icial de l e los man t ) . A medi d a s células d r ios. Es im p Melatonina C ULAR Y p roceso me a pas de cr e a , relaciona d c as del folíc m pranamen t que la ma y o ol de ooci t u los primor d a l., 1993). S n esquemát i u rante la f o desde ante os folícul o t enían está t d a que pr o d e la gran u p ortante se ñ en ovinos p 48 PRODUC diante el c e cimiento y d a con la m c ulo como d t e durante y oría de la s t os que han d iales, cuy o S e t r ata de e i ca del cre c liculo g éne s e s de la a p o s primord i t icos en s u o gresan en u losa y se f ñ alar que u n p atagónico s CIÓN DE c ual se for m y desarroll o m uerte celu d el propio o o la vida e m s hembras d detenido s u o número o s e structuras imiento de l s is (Mermi l arición de i ales cuan d u activida d su desarr o f orma la te n a vez que e s E MBRIO N m an los fo l o , hasta q u l ar progra m o cito. m brionaria, d d e las esp e u crecimien t s cila entre 4 sin red cap i l oocito, ca p ll od et al. , 1 la puberta d d o algunos d dejan de o llo se ge n ca interna p e l folículo a N ES l ículos ov á u e se prod u m ada o apo p d e modo q e cies domé s t o. 4 0.000 y 30 p ilar y sin a p p acitación y 1 999) d, se gene r de los fa c estar pre s n e r a un c a para pasar a bandona e l á ricos, u ce l a p tosis q ue al s ticas, 0 .000 p enas y r a un c tores s entes a mbio a ser l pool Tesis Doctoral Andrés Buffoni  49  primordial e inicia su crecimiento, no vuelve a retornar al estadio quiescente, de manera que o bien alcanza las fases finales de desarrollo o bien se atresia. En la fase de reclutamiento tiene lugar un aumento del tamaño del oocito y una proliferación de las células de la granulosa, que se disponen en capas concéntricas a su alrededor (Hirshfield, 1991). Estos folículos tienen un diámetro entre 0,03 y 0,1 mm. Son folículos preantrales por no haberse conformado el antro, de manera que en esta etapa la foliculogénesis es independiente de las gonadotrofinas y su estimulo depende de otros factores (Fortune, 2002). A medida que van progresando en su desarrollo, los folículos se van haciendo sensibles a las gonadotrofinas, de manera que se adquieren receptores para LH y FSH en células de la teca y la granulosa respectivamente; en consecuencia tienen capacidad para sintetizar progesterona y andrógenos, aunque las cantidades de estradiol no son detectables hasta que el folículo no alcanza los 0,5 mm de diámetro. También se forma el antro y el folículo sigue creciendo hasta alcanzar 1-2,5 mm de diámetro. Esta etapa de desarrollo folicular dependiente de las gonadotrofinas tiene lugar de forma cíclica y organizada en forma de ondas foliculares (Montgomery et al., 2001). En conjunto, una oveja viene a tener unos 25 folículos con respuesta a las gonadotrofinas. Se trata de estructuras que para superar los 2,5 mm de diámetro dependen tanto de la FSH (necesaria para la aromatización o producción de estrógenos) como de la LH (implicada en la producción de andrógenos, sustrato para la síntesis de estrógenos). Por tanto, son muy eficientes en la producción de estradiol, especialmente conforme progresan en su desarrollo y aumentan el número de receptores a ambas gonadotrofinas, sobre todo a la LH en las células de la granulosa (Scaramuzzi et al., 1993). Su número está entre 1 y 8 por ovario, y se trata de folículos cuyo destino (ovulación o atresia) está íntimamente ligado a la evolución de las gonadotrofinas a lo largo del ciclo sexual. Los folículos ovulatorios requieren unas concentraciones de FSH reducidas como consecuencia de su alta producción de estradiol e inhibina (Scaramuzzi et al., 1993). Tales concentraciones impiden el desarrollo de los folículos dependientes de gondotrofinas que vienen por detrás, con lo que el folículo que va a ovular ejerce un efecto de dominancia que puede alterar la respuesta a los tratamientos de superovulación (González de Bulnes et al., 2004). En la Fig. 2 se representan las diferentes fases del crecimiento, capacitación y maduración durante la foliculogénesis del ovocito (adaptado de Mermillod et al., 1999). Melatonina en ovinos patagónicos 50  3.2 Ondas de desarrollo folicular. En las ovejas se han descrito entre 2 y 4 ondas foliculares durante un ciclo sexual (Evans et al., 2000), de manera que cada onda está constituida por tres etapas: - Reclutamiento: Es el inicio de la onda folicular. En esta etapa un grupo de folículos antrales (de 2 mm de diámetro) responden a los incrementos de FSH (Driancourt et al., 1993).El folículo cuenta con receptores LH en las células de la teca y receptores FSH en las células de la granulosa y ambos grupos de células generan estrógenos, que junto a la FSH aumentan la producción de líquido folicular en la medida que el antro va creciendo. - Selección: El folículo dominante crece de forma acelerada asumiendo que este folículo es seleccionado para ovular y los demás folículos subordinados crecen pero a menor velocidad hasta detener su desarrollo e iniciar la atresia. El folículo seleccionado tiene la mayor cantidad de receptores de LH (en teca y granulosa) y FSH, por lo que posee los mayores niveles intrafoliculares de estradiol, sobre todo al alcanzar 4 mm de diámetro (Driamcourt, 2001), de manera que los demás folículos del grupo completan su regresión hasta la atresia. - Dominancia: El mecanismo principal que regula la dominancia folicular es una reducción notable de los niveles de FSH debido a la acción combinada de la inhibina y el estradiol producidos por el futuro folículo dominante que actúan por retroalimentación negativa sobre la hipófisis (Gibbons et al., 1997). La aparición de receptores de LH en la células de la granulosa permite superar las consecuencias de la supresión de FSH provocada por la secreción de estradiol por lo que el número de dichos receptores aumenta a la par que los niveles de estradiol de forma tal que esta producción acelerada actúa a nivel central para estimular el pico de LH. El folículo dominante finalmente se atresia u ovula dependiendo de la existencia o no de cuerpo lúteo. De existir cuerpo lúteo, la progesterona actúa inhibiendo los pulsos de LH, de modo que los folículos dominantes no terminan su maduración y sufren atresia. Tesis Doctoral Andrés Buffoni  51  La magnitud de la dominancia se mide por la diferencia de tamaño entre el folículo dominante y el folículo subordinado más grande, que en general es de únicamente 2 a 3 mm de diámetro en la oveja, con lo que en esta especie la dominancia no sería excesiva (Driancourt, 2001).Tras la luteolisis al ir aumentando la secreción de LH, la dominancia se hace más evidente (González-Bulnes et al., 2004). Como consecuencia de la ovulación cesa la síntesis de estradiol, posteriormente a esto tiene lugar un pico secundario de FSH, el cual estimula la emergencia de una nueva onda folicular (Simonetti et al, 2008). La LH se mantiene basal durante casi todo el ciclo, alcanzando niveles altos en el momento del pico preovulatorio. La FSH es producida en ondas en concordancia con las ondas foliculares y su nivel más alto se produce junto al pico preovulatorio de LH. El estradiol presenta elevaciones periódicas que coinciden con el crecimiento del folículo mayor de cada onda y su nivel máximo ocurre en la onda ovulatoria. La progesterona se mantiene basal durante todo el desarrollo folicular, aumentando en la fase luteal y cayendo en forma abrupta en la luteolisis. 3.3 Producción de embriones in vivo Las técnicas en las que se basa la producción de embriones in vivo en los pequeños rumiantes se conocen desde hace tiempo, y lo cierto es que han evolucionado poco en los últimos años, en particular en relación a su eficacia y a su aplicación práctica. La producción de un número de embriones suficientemente elevado supone la estimulación hormonal externa de los acontecimientos endocrinos que regulan el ciclo sexual de la oveja, con la finalidad de inducir el celo y estimular el crecimiento y la ovulación de la población de folículos en un momento determinado. Todo ello supone un tratamiento de sincronización-ovulación y otro de sobre estimulación ovárica. 3.3.1 Tratamiento de sincronización de celo  La sincronización se basa principalmente en la manipulación de la fase luteal del ciclo. La estrategias de sincronización pueden ser empleadas bien para inducir o para prolongar esta fase mediante la administración de progesterona exógena, o bien para acortarla prematuramente induciendo la luteolisis y subsiguiente fase folicular utilizando las prostaglandinas (Wildeus, 2000). Melatonina en ovinos patagónicos 52  3.3.2 Progestágenos El fundamento de este método es producir en los animales un efecto similar al ejercido en el ciclo sexual por la progesterona, es decir, una inducción o prolongación de la fase luteal y una inhibición de la acción de las gonadotrofinas y por lo tanto de las etapas finales de maduración de los folículos. Al ser retirada la fuente de progestágeno se anula dicha inhibición. En consecuencia, en la práctica las ovejas se sincronizan en un estado similar de su ciclo estral, entrando la mayoría de las ellas en celo (Raso et al., 2004). El tratamiento tradicional de sincronización en pequeños rumiantes tanto en estación sexual como durante el anestro estacional ha supuesto la aplicación de esponjas de poliuretano impregnadas con progestágenos. Los niveles de progestágenos, aunque bajos, son de igual eficacia que la progesterona natural. Actualmente existen dos tipos de esponjas, las impregnadas de acetato de fluorogestona (FGA) y las que contienen acetato de medroxiprogesterona (MAP) (Wildeus, 2000). La colocación de la esponja por vía intravaginal tiene por objetivo simular la acción del cuerpo lúteo en la regulación del ciclo estral. La esponja permanece durante 12 a 14 días en el tracto reproductivo (tiempo equivalente a la fase luteal natural), de manera que los niveles elevados del progestágeno liberado actúan a nivel del eje hipotálamo hipofisario inhibiendo la secreción pulsátil del GnRH y por tanto suprimiendo la secreción de gonadotrofinas e inhibiendo el crecimiento folicular y la ovulación. Al retirar la esponja se produce una disminución brusca de los niveles plasmáticos de progesterona eliminando el bloqueo sobre el eje hipotálamo hipofisario favoreciendo la reanudación de los acontecimientos endocrinos que inducen el celo y la ovulación (Cognie, 1992). Un aspecto a destacar de la sincronización con esponjas vaginales es que en el momento de su colocación se desconoce el momento del ciclo estral en el que se encuentra la oveja. Además, los niveles de progestágenos, altos tras la aplicación de la esponja, se reducen notablemente conforme pasan los días, con lo que en la fase final del tratamiento son demasiado bajos como para inhibir la liberación de LH, produciendo un inadecuado desarrollo folicular con persistencia de folículos envejecidos (Viñoles et al., 1999) cuya ovulación ha sido asociada en ocasiones con una menor fertilidad (Ungerfeld y Rubianes, 1999; Viñoles et al., 2001). Si bien es cierto que la actual normativa comunitaria ha promovido el desarrollo de esponjas vaginales que tienen un liberación más constante del progestágeno (FGA), también lo es que la aplicación de un Tesis Doctoral Andrés Buffoni  53  segundo dispositivo a los 7 días de la inserción del primero puede reducir los problemas anteriores (Thompson et al., 1990), con lo que en los protocolos de superovulación actuales se sustituye la esponja vaginal en la mitad del tratamiento de sincronización, asegurando de este modo unos niveles de progestágenos altos y relativamente constantes (González-Bulnes et al., 2004). 3.3.3 Estimulación ovárica El tratamiento de superovulación consiste en inducir una tasa ovulatoria por encima de la normal estimulando los ovarios mediante la aplicación de gonadotrofinas exógenas. Los principios de la superovulación en ovino y caprino son iguales que en bovino y consisten en la administración de una gonadotrofina folículo estimulante al final de la fase luteal del ciclo (días 11 a 13) o alrededor del día 1 o 2 antes del final de los tratamientos de sincronización (Ishwar y Memon, 1996). Esto consigue el reclutamiento de folículos pequeños, de manera que se acelera el desarrollo folicular y paralelamente también disminuye el tamaño de los folículos preovulatorios (Driancourt, 1987, 2001). La fase preovulatoria del ciclo estral en ovejas es caracterizada por la selección de uno u varios folículos dominantes y la atresia de los folículos subordinados por acción de la inhibina y del estradiol secretados por el folículo dominante actuando sobre el eje hipotálamo hipofisario disminuyendo así la concentración plasmática de FSH (Driancourt et al., 1985). Por ello, para llevar a cabo un tratamiento de superovulación, hay que vencer los mecanismos inhibidores establecidos por el/los folículos dominantes aportando altas cantidades de FSH exógena. Durante la fase folicular temprana se ha observado que el crecimiento de los pequeños folículos antrales está directamente correlacionado con las concentraciones altas de FSH en el plasma periférico (Cahill et al., 1985; McNatty et al., 1985). Además, la administración de preparaciones de gonadotrofinas exógenas que contienen extractos hipofisarios con actividad similar a la FSH durante el periodo de concentraciones bajas de FSH endógeno, puede vencer los mecanismos inhibidores ejercidos por el folículo dominante e inducir el crecimiento de múltiples folículos preovulatorios (Rubianes et al., 1997). La superovulación en ovinos ha sido realizada mediante la utilización de varias fuentes hormonales. Entre las hormonas más comúnmente empleadas se hallan la eCG Melatonina en ovinos patagónicos 54  (Gonadotrofina Coriónica Equina, también denominada PMSG) y la FSH (Hormona Folículo Estimulante). Es importante que la dosis de las hormonas utilizadas sea la adecuada, pues si es excesiva el número de folículos ovulados se reduce notablemente tanto con eCG (Mutiga y Baker, 1982; Gonzalez-Reyna et al., 1999) como con FSH (Smith, 1984; D'Alessandro et al., 1996), además de que los riesgos de regresión prematura de los cuerpos lúteos formados aumentan (Ryan et al., 1991; D'Alessandro et al., 1996). 3.3.4 La hormona folículo estimulante (FSH) Es una hormona glicoproteíca producida en las células gonadotrofas de la adenohipofisis. Actualmente las preparaciones comercializadas de FSH son de origen ovino o porcino y en realidad se tratan de los extractos hipofisarios parcialmente purificados con una elevada actividad FSH y con una cantidad variable de LH. Por lo que al contenido de LH en los extractos hipofisarios que se han comercializado con los años se refiere, el Pluset (FSH porcina) posee cantidades iguales de FSH y LH, mientras que en el Folltropin-V (FSH porcina) se ha extraído el 80% de la LH, con lo que su relación FSH:LH queda en 49:1 (Henderson et al., 1990). Finalmente, el Ovagen (FSH ovina) parece ser el producto más purificado, con poca contaminación LH y una relación FSH:LH de 1090:1. En general, parece claro que un alto contenido de LH se asocia con una reducción de la respuesta ovulatoria (Chupin et al., 1987; Torrès et al., 1987), con lo que la tendencia en el tiempo ha sido utilizar productos cada vez más purificados. En virtud de los problemas encontrados al emplear la eCG, la alternativa de superovular empleando la FSH ha sido una opción utilizada durante décadas en los programas MOET. La utilización de la FSH se asocia con una menor variabilidad en la tasa de recuperación y una menor cantidad de folículos anovulatorios (Chagas e Silva et al., 2003). Además, su aplicación repetida en sucesivos tratamientos superovulatorios anuales (Bari et al., 2001) o incluso cada 2 meses sobre la misma hembra (Forcada et al., 2000) (Tabla 1), no parece reducir significativamente el rendimiento en la producción de embriones de los programas MOET. Dado que la FSH tiene una vida media corta de únicamente 3 a 5 horas (Laster, 1972; Demoustier et al., 1988), requiere que sea administrada de manera repetida para mantener altos sus niveles en plasma y por tanto para asegurar su eficacia en los programas MOET. Así, se inyecta cada 12 horas en protocolos de 6 a 8 inyecciones, Tesis Doctoral Andrés Buffoni  61  que afectan estar claramente adaptados a la especie y a las condiciones del procedimiento; debiendo corresponderse con las características particulares de los espermatozoides, su concentración, velocidad, tamaño y la temperatura (Verstegen et al., 2002). Las desventajas de estos sistemas están, en resumen, relacionadas con los costes del equipo, la necesidad extrema de validación, el control de calidad y de la estandarización de las mediciones realizadas (Verstegen et al., 2002). La aplicación del CASA para evaluación de rutina en los laboratorios de reproducción animal sigue limitada por sus costes (Johnson et al., 1996). Se reconoce que los sistemas CASA proporcionan datos fiables solo en un rango óptimo de concentración espermática, dado que en presencia de pocos espermatozoides el análisis es logísticamente impracticable mientras que, en presencia de demasiados surgen errores en la estimación de la concentración y de los movimientos, debido al cruzamiento de trayectorias de los espermatozoides (Irvine, 1995). Las muestras de semen fresco deben ser diluidas antes del análisis computerizado a fin de reducir la concentración de espermatozoides y así, permitir el análisis de las trayectorias individuales, de modo que el diluyente utilizado para reducir la concentración debe estar libre de partículas de tamaño semejante al tamaño de la cabeza del espermatozoide, para evitar su clasificación como espermatozoide inmóvil (Malmgren, 1997). El número de campos a analizar depende del número de espermatozoides por campo (Budworth et al., 1988), pero se considera de un modo general que aumentando el número de campos y de células analizadas incrementará la precisión de los resultados (Malmgren, 1997). Aumentando el número de campos se observa una disminución en el error estándar de parámetros como el porcentaje de espermatozoides móviles y de la velocidad lineal, pero parece no existir ventaja en analizar más de 200 espermatozoides por muestra (Budworth et al., 1988). Además, el técnico debe controlar la temperatura del equipo, del diluyente y del porta y eliminar o minimizar las potenciales fuentes de error comola presencia de detritus (Budworth et al., 1988). Estos equipos también pueden proporcionar la determinación de la concentración, proceso rápido y fiable (Anzar et al., 1991) que presenta una elevada correlación con la espectrofotometría (Farrel et al., 1998) y de la morfología (Coetzee et al., 1999). Se recomienda una adecuada dilución del semen para el cálculo de la concentración y así, evitarla presencia simultánea de 2 o más espermatozoides en el mismo punto (Anzar et al., 1991). Melatonina en ovinos patagónicos 62  Algunos autores han observado cierta sobrestimación en el cálculo de la concentración que puede ser debida a las colisiones, ya que la evaluación correcta se obtuvo realizando los cálculos tras matar los espermatozoides con una solución hipertónica de NaCl al 9% (Verstegen et al., 2002). Al evaluar la concentración es necesario tener en cuenta determinados factores, ya que tanto el diluyente utilizado (su densidad y su previa ultrafiltración) como los valores del programa afectan significativamente a dicha estimación. También el ligero movimiento de fondo causado por el movimiento de las células y el movimiento de la solución puede conducir al recuento de falsos espermatozoides móviles; esto puede evitarse diluyendo las muestras a la ratio más apropiada y utilizando una gota del volumen adecuado (Anzar et al., 1991). La cuestión de si las determinaciones computerizadas de la motilidad espermática pueden predecir el potencial fertilizante de una muestra mejor que los métodos convencionales necesita ser más investigado (Malmgren, 1997). La motilidad y la velocidad espermática (rectilínea y lineal, respectivamente) evaluadas por estos sistemas mostraron correlación con la fertilidad (índice de fertilidad competitiva, una medida de la fertilidad relativa) en el espermatozoide descongelado de toro (Budworth et al., 1988). En conclusión, la evaluación computerizada de la motilidad puede ser muy útil y con el perfeccionamiento en la detección de la imagen y en el análisis debe mejorar la medición de los atributos de la motilidad espermática. 4.5 Integridad de membrana La integridad de la membrana espermática es un pre-requisito fundamental para el apropiado metabolismo y funciones espermáticas como la unión a la zona pelúcida, penetración y la fusión con el oolemma durante la fecundación (Rodríguez-Martínez, 1998).La importancia del mantenimiento de esta característica del espermatozoide se justifica por la incapacidad de la célula espermática para sellar o restaurar la integridad de la membrana cuando sufre daños (Den Daas, 1992). La integridad de esta membrana es el requerimiento mínimo para que el espermatozoide sea móvil (De Leeuw et al., 1991). El espermatozoide con la membrana plasmática afectada no es capaz de mantener las concentraciones citoplasmáticas de iones y de co-factores esenciales como el nucleótido adenina, imprescindible para el movimiento flagelar. Es posible que algunas células inmóviles puedan aparentemente Tesis Doctoral Andrés Buffoni  63  mantener algún grado de integridad de la membrana por lo cual, son todavía capaces de excluir los marcadores que indican la muerte celular pese a que otras alteraciones hacen que esté inmóvil (De Leeuw et al., 1991). Por estos motivos, cuando la célula está fluorescente (marcada) puede ser calificada con toda seguridad como célula muerta; sin embargo, cuando la célula no adquiere fluorescencia se califica como célula viva, aunque esto no es tan seguro (De Leeuw et al., 1991). La evaluación de la integridad de la membrana plasmática proporciona una valiosa información sobre los métodos de procesamiento del semen y la identificación de los puntos del proceso que más contribuyen a las alteraciones en la membrana del espermatozoide (Johnson et al., 1996). El grado de lesión de las membranas plasmática y acrosomal está relacionado con la fertilidad de la muestra procesada, pero solamente en los casos en que el daño sea extenso (Rodríguez-Martínez, 1998). Una de las técnicas de valoración de la integridad de la membrana plasmática es la ausencia de inclusión de colorantes, porque la membrana esté íntegra; estas técnicas son conocidas como recuentos de vivos y muertos y para ellas se necesitan combinaciones de colorantes como eosina/nigrosina, eosina/nigrosina/Giemsa, Hoescht® 33258, carboxifluoresceína / yoduro de propidio, y SYBR-14/yoduro de propidio(Smith y Murray, 1997). En las 3 últimas técnicas de tinción mencionadas es necesario recurrir a la microscopía de fluorescencia. La presencia de glicerol en una muestra, en porcentajes que excedan el 4%, puede interferir con las tinciones vivos/muertos, haciendo disminuir los porcentajes de espermatozoides viables probablemente porque el glicerol induzca un aumento de la permeabilidad de la célula al colorante (Mixner y Saroff, 1954). 4.6. Funcionalidad de la membrana plasmática La funcionalidad de la membrana puede ser evaluada por medio de la incubación delos espermatozoides en un medio hipo-osmótico, mediante el test de endósmosis. El influjo del agua al interior del espermatozoide provoca la hinchazón y el enrollamiento de la cola, indicativo de que el transporte del agua a través de la membrana se produce con normalidad, es decir, que la membrana está intacta y presenta una actividad funcional normal. El hinchamiento de la membrana es observado de modo especial en la membrana de la cola del espermatozoide, pues ésta es más distensible y está menos unida a las estructuras de soporte que la membrana de los otros compartimentos. La  resp u pene m hi p en l a  4.7. P Exis t obje t las m Entr e fosf o espe r utili z com o b om b may o cant i 200 8 u esta a est a trar los ov o Fi g . 4. P r m or f oló g ic o p oosmótico. a cola del fl  P ruebas d e t en prueba s t ivo de est a m itocondria s e las func i o rilación o x r mática (S i z an sondas o la JC 1. E b eadas acti v o r potenci a i dad de col o 8 ). a prueba e s o citos. r ueba de e n o s re g istra d A) endós m fl a g elo que s e funcional i s para dete r a s pruebas c s espermáti c i ones de l a x idativa, y i lva y Ga d fluorescent e E stas sond a v amente d e a l de me m o rante den t Melatonina s tá correla c dósmosis: R d os en el es p m osis ne g at i s e corresp o Je y e n i dad mitoc o r minar la f u c onsiste en c as. a mitocond r a que el A d ella, 2006 ) e s como la a s determin a e ntro de la m m brana mit o t ro de su m en ovinos p 64 c ionada co n R epresent a p ermatozoi d i va, B-G) d i o nden con u n dran et al. , ondrial u ncionalida d evaluar la r ia se dest A TP se c o ) . Para det e rodamina 1 a n el pote n m itocondri a o condrial ( m m itocondria p atagónico s n la capaci d a ción esque m d e human o i stintas tip o u na endós m 1984) d mitocon d c apacidad y aca la pro d o nsidera n e e rminar es t 1 23 y recie n n cial de me m a . Los esp e m itocondri a (Gillan et a s d ad del es p m ática de l o o tras some t o de cambi o m osis positi v d rial del es p y el ritmo d d ucción d e e cesario p a t a función n temente o t m brana mi t rmatozoide a activa), b a l., 2005; M p ermatozoi d o s cambios t erlo a estr é o s mor f oló g v a (Adapta d  p ermatozoi d d e respiraci ó e ATP me d a ra la mot i mitocondr i t ro tipo de s t ocondrial, e s que pose e b ombean m M océ y Gr a d e de é s g icos d a de d e. El ó n de d iante i lidad i al se s onda al ser e n un m ayor a ham, Tesis Doctoral Andrés Buffoni  65  A pesar de que estos test evalúan estructuras y funciones en la fisiología espermática, existen otra serie de procesos importantes ocurridos in vivo que este tipo de pruebas no pueden evaluar, y que actualmente son evaluados por pruebas de interacción entre gametos 4.8 Reacción acrosómica Finalizada la capacitación espermática, tiene lugar la reacción acrosómica (RA), la cual está considerada como un proceso de exocitosis del acrosoma del espermatozoide, consecuencia de la fusión de la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa. Este proceso es indispensable para que el espermatozoide pueda atravesar la zona pelúcida. El tiempo requerido para su desarrollo varía en función de la especie y de las condiciones físicas y bioquímicas. Se conoce que un aumento del calcio intracelular desencadena el proceso de exocitosis de la RA (Breitbart et al., 1997). La RA in vivo sucede cuando el espermatozoide interactúa con la zona pelúcida. En condiciones in vitro, la RA puede ser inducida artificialmente por la incubación de los espermatozoides en un medio definido o por la exposición a inductores de la RA. Se conocen numerosos inductores de la RA entre los que se incluyen la progesterona, el fluido folicular, las secreciones de las células del cumulus, el sulfato de esterol, los glicosaminoglicanos y el ionóforo de calcio (Gordon, 2003). Este último por sus características hidrofóbicas, es capaz de transportar iones Ca++ del medio externo a través de las membranas celulares e inducir un flujo de calcio hacia el interior del espermatozoide, y por consiguiente aumentar el calcio libre dentro de la célula, e inducir directamente la RA (Pereira et al., 2000). 4.9 Integridad del acrosoma El espermatozoide eyaculado y fresco no puede experimentar la reacción acrosómica verdadera cuando es expuesto a inductores biológicos de la misma, debiendo primeramente sufrir el proceso de capacitación (Cross y Meizel, 1989). La capacitación espermática implica algunas alteraciones fisiológicas previas a la reacción acrosómica en la membrana del espermatozoide y es por tanto un pre-requisito para ella. La reacción acrosómica consiste en la fusión de la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática, resultando en la liberación del contenido acrosomal (Way et al., 1995). La capacidad para sufrir la reacción acrosómica resulta in vivo del contacto del Melatonina en ovinos patagónicos 66  espermatozoide con la zona pelúcida (Harrison, 1998); pudiendo esta capacidad del espermatozoide para responder a los inductores de la reacción acrosómica ser utilizada como marcador de este estado fisiológico de capacitación (Cross y Meizel, 1989). En el proceso de dilución, refrigeración y congelación queda particularmente afectada la membrana plasmática de la cabeza del espermatozoide, pero también la membrana de las mitocondrias, del acrosoma y el flagelo (Hammerstedt et al., 1990). Estos datos son significativos, teniendo en cuenta que el acrosoma contiene enzimas que desarrollan un papel crucial en la penetración de la zona pelúcida y en sus mecanismos celulares (Bedford, 1970). La desintegración del acrosoma derivada de la refrigeración y de la congelación es probablemente capaz de afectar a la habilidad fecundante del espermatozoide (Watson, 1975). La reacción acrosómica se produce tras la exposición a las condiciones ambientales del lugar de fecundación o tras la unión específica del espermatozoide a la zona pelúcida (Den Daas, 1992); así que el porcentaje de células que poseen un acrosoma intacto y que son aptas para exhibir reacción acrosómica, tras la debida estimulación, es una importante característica seminal (De Leeuw et al., 1991). Por tanto, es necesario evaluar correctamente el status acrosomal. Entre otras tinciones utilizadas en la evaluación del acrosoma destacan el método Giemsa (Watson, 1975), la eosina/nigrosina, la eosina/nigrosina/Giemsa, el Hoescht® 33258 y las lectinas como el Pisum sativum (PSA) asociado a la fluoresceína FITC (isotiocianato de fluoresceína), de las cuales las 2 últimas exigen el uso de la microscopía de fluorescencia. De Leeuw et al. (1991) sugieren una técnica de tinción que incluye el marcador deviabilidad celular fluorescente, Hoechst® bisbenzimida 33258, recurriendo para su visualización a la microscopía de fluorescencia, asociada al microscopio de contraste de fases para observación del acrosoma, permitiendo así la diferenciación entre reacción acrosómica verdadera de la pérdida degenerativa de las membranas acrosomales postmortem. La mayor ventaja de esta técnica es, según los autores, que puede ser utilizada en muestras congeladas/ descongeladas sin utilizar las técnicas habitualmente utilizadas en la evaluación del status acrosomal que, frecuentemente, exigen centrifugación para remover el diluyente o el colorante y por otra parte, no se realiza la tinción en portas que puede provocar, debido a las sucesivas inmersiones, una mayor pérdida en espermatozoides vivos. Tesis Doctoral Andrés Buffoni  67  Un asunto de considerable interés es saber si es suficiente una única prueba laboratorial o si es necesaria la combinación de varios análisis para la evaluación de una muestra, dado que el examen de la integridad acrosomal exige equipamiento adecuado y es más lento que la evaluación de la motilidad (Berndtson et al., 1981). En los trabajos de Kjaestad et al. (1993) no se verificó correlación entre motilidad e integridad acrosomal, ni entre este último parámetro y la fertilidad in vivo. Los trabajos de Berndtson et al. (1981), igualmente en semen congelado y descongelado, también constataron que la motilidad y la integridad acrosomal representan características distintas de la integridad del espermatozoide que varían de manera independiente. De este modo, ninguna de las pruebas puede ser utilizada en sustitución de otra. Saacke (1983) observó que los daños en la integridad acrosomal experimentados por los espermatozoides durante la congelación y la descongelación podrían estar latentes en el momento de la descongelación, evidenciándose el rápido deterioro del acrosoma entre 2 y 4 h de incubación a 37ºC, a diferencia de la motilidad que sufrió antes de las 2-4 h una dramática disminución. Este autor recomienda el uso combinado de pruebas, que denomina de “características irreversibles”, como son la observación de la integridad de la membrana y del acrosoma conjuntamente con la motilidad, a fin de evitar errores de apreciación de los métodos de preservación. Por su parte, Harrison y Vickers (1990) evidenciaron que el status acrosomal en el espermatozoide de cerdo y morueco no refleja el estado de la membrana plasmática, existiendo más células con membrana plasmática intacta que con acrosomas intactos. En el espermatozoide de morueco la integridad de la membrana se correlacionó más con la motilidad visual, lo que no ocurrió en el cerdo. 5. DIÁMETRO TESTICULAR  El diámetro testicular del carnero sufre variaciones estacionales determinadas, tanto por modificaciones del fotoperiodo cuanto de la temperatura media, oscilación térmica diaria y humedad relativa. El momento del aumento y disminución en el diámetro testicular en carneros, en función de la estación del año, varía entre razas, demostrando también una interacción entre raza y estación para la producción espermática. El tamaño de los testículos ha demostrado ser un buen indicador de la capacidad espermatogénica de un semental, como lo atestiguan numerosos trabajos realizados en diferentes especies, principalmente la bovina (Blockey, 1989), a punto tal que en esta Melatonina en ovinos patagónicos 68  especie se tiene en cuenta como criterio de selección y constituye ya una práctica corriente (De la Vega, 1998). La medida más práctica para evaluar el tamaño de los testículos es la circunferencia escrotal (CE), la cual tiene una alta correlación con el peso y el volumen testicular (Glauber, 1990). A su vez, el peso testicular está en función directa con la cantidad de tejido parenquimático productor de esperma y, por lo tanto, con el volumen y la concentración espermática del eyaculado (Barbosa et al., 1991). Así una selección por mayor CE se traducirá en una producción seminal más rica en espermatozoides. 6. ANALISIS DE TESTOSTERONA El radioinmunoensayo (RIA) permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones muy bajas como ng/ml o incluso pg/ml. El RIA es una técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson que se basa en una reacción antígeno anticuerpo donde uno debe producir un anticuerpo especifico contra la sustancia que queremos determinar y tener gran afinidad. Ese antígeno es la hormona que queremos determinar, a este también se lo llama Antígeno Frío (Hormona Natural); además a la muestra se le añadirá otro antígeno con una cantidad constante y conocida, a este se lo conoce como Antígeno Caliente (Hormona Radioactiva). Se toma una pequeña cantidad de este anticuerpo, que se mezcla con cierta cantidad de líquido extraído del animal y en el que existe la hormona objeto de la medición (suero, plasma, orina, saliva), luego se mezcla simultáneamente con una cantidad adecuada de la hormona patrón purificada que se ha marcado con un isotopo radioactivo. Estos competirán en igualdad de condiciones para unirse con el anticuerpo altamente específico a la hormona. La cantidad de hormona que se una al anticuerpo será proporcional a su concentración en el líquido evaluado. Cuando la unión ha alcanzado el equilibrio, se separa el complejo anticuerpo-hormona del resto de la solución, y la cantidad de hormona marcada que se ha unido al complejo se mide por medio de un contador de centelleo. Si la cantidad de hormona radioactiva ligada al anticuerpo es elevada significa que solo existía una pequeña cantidad de hormona natural para competir con la radioactiva, pero si solo se une una pequeña cantidad de hormona radioactiva, la cantidad de hormona natural es elevada. Para cuantificar se realiza soluciones patrones de distintas concentraciones de la hormona sin marcar, para Tesis Doctoral Andrés Buffoni  69  posteriormente trazar una curva patrón, en la cual se extrapolan los valores obtenidos de la muestra. 7. CARACTERISTICAS PRODUCTIVAS DE LA REGIÓN PATAGÓNICA ARGENTINA La Argentina se extiende por más de 33º de latitud entre su extremo norte, la confluencias de los ríos Grande de San Juan y Mojinete, a 46º21’S y el punto más austral del territorio continental argentino, el cabo San Pio, en la isla Grande de Tierra del Fuego, a 55º03' S. A su vez, se extiende de este a oeste por 20º de longitud, desde la localidad de Bernardo de Irigoyen, en la provincia de Misiones, a 53º 35' O y el Cordón Mariano Moreno de los Andes Patagónicos en la provincia de Santa Cruz, a 73º 38' O. Argentina cuenta con dos regímenes pluviales, el Atlántico y el Pacifico. El primero penetra desde el este y el noreste y cubre la mayor parte del norte y centro del país, y al tener mayor penetración en verano, provoca mayores lluvias en esa época. El régimen del Pacifico procede del oeste, y produce precipitaciones en la cordillera y la Patagonia, preferentemente en invierno. Las temperaturas guardan su obvia distribución latitudinal y altitudinal, con medias de alrededor de 23ºen el norte de Formosa y de 5ºC en sur de Tierra del Fuego. La producción ovina es, sin duda, la principal actividad agropecuaria de la región patagónica concentrando más del 60% de las existencias ovinas del país. La zona norte de la región se encuentra dedicada principalmente a la producción de lana fina siendo la producción de carne un complemento que solo en algunas áreas agro ecológicas alcanza a un 40 ó 50% de los ingresos de la empresa. Por su parte en el extremo sur de la Patagonia predominan los sistemas de producción doble propósito carne/lana cruza o cruza fina, con una importante participación de los ingresos por venta de animales. Si se analiza el mercado de carne ovina internacional, se observa que se presentan condiciones favorables para la comercialización de las carnes patagónicas en el mercado, debido a su calidad intrínseca y al status sanitario (libre de aftosa) que posee la región. El mercado externo muestra un escenario de demanda firme de carne ovina para los próximos años. En este contexto la Argentina presenta además un mercado interno con una demanda insatisfecha, ya que en los últimos años la gran mayoría de los excedentes de corderos se exportan, haciendo más difícil aún adquirir corderos en la región. El Melatonina en ovinos patagónicos 70  crecimiento del turismo y la gastronomía, tanto en la región como en otras provincias del país han transformado al cordero en un producto reconocido y valorado. Si bien la dicotomía entre producción de carne y lana fina es un concepto instalado, ejemplos en otros países demuestran que es posible desarrollar razas doble propósito capaces de producir, en determinadas condiciones o ambientes, ambos productos (carne y lana fina). Para abordar este antagonismo Suráfrica desarrolló la raza Dohne Merino. Si bien no presenta la especialización de la raza Merino en la producción de lana, esta raza podría adaptarse para la producción de carne en áreas de mayor potencial forrajero de la Patagonia, permitiendo así incrementar la producción de carne sin afectar significativamente el diámetro de la lana. Esto posibilitaría, en algunos casos, continuar con sistemas de producción de lana fina, que maximizarían beneficios económicos con mayores ingresos por venta de carne 8. RAZA DOHNE MERINO Según Scott (1997), hay una clasificación de las razas ovinas de acuerdo a la duración de su época reproductiva que las denomina como: a) Razas con estación reproductiva larga como la Rambouillet, Merino, Dorset, y razas exóticas que se han desarrollado en regiones ecuatoriales. b) Razas con estación reproductiva corta o restringida; Southdown, Cheviot, Shropshire, y razas de lana larga que se originaron en Inglaterra y Escocia. c) Razas con estación reproductiva intermedia; Suffolk, Hampshire, Columbia, Corriedale, y todos los cruces que involucren ovejas de lana fina. El Dohne Merino (Fig. 5) es una raza doble propósito (lana/carne), con lana fina de buena calidad (menos de 22 micras) y alta producción de cordero, desarrollada por el Departamento de Agricultura de Suráfrica usando ovejas Merino Peppin y carneros Merino alemán de carne. Las progenies se volvieron a cruzar entre ellas y fueron seleccionadas por alta fertilidad, rápidas tasas de crecimiento de los corderos y lana merino fina, en condiciones comerciales de campo natural. El programa de mejora comenzó en 1939 y la Sociedad de Criadores se formó en 1966. La selección, desde 1970, se ha realizado con la ayuda de tests de performance, pruebas de progenie y registros de producción; todos los animales testados son mantenidos en un esquema computarizado de registros. El Dohne es hoy una de las razas laneras líderes en Tesis Doctoral Andrés Buffoni  77  MATERIALES Y METODOS Melatonina en ovinos patagónicos 78  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  79  EXPERIMENTO 1. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EXÓGENA SOBRE LA PRODUCCION DE EMBRIONES IN VIVO EN ESTACION REPRODUCTIVA Y EN EL PERIODO DE ANESTRO ESTACIONAL SOBRE OVEJAS DOHNE MERINO Este experimento se desarrolló en el laboratorio de reproducción animal de la estación experimental de INTA de la ciudad de Trelew, provincia del Chubut (43ºS 65ºO)en el laboratorio de reproducción de INTA habilitada por SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina) en dos años sucesivos y en diferentes periodos de estación sexual. 1.1. Animales La primera experiencia del experimento 1 se realizó en estación reproductiva utilizando 22 ovejas adultas de raza Dohne Merino, llevándose a cabo entre los meses de febrero y abril de 2010. Los animales fueron divididos en 2 lotes homogéneos de 11 ovejas; el lote M (melatonina) recibió un implante subcutáneo de melatonina de 18 mg (Melovine, Ceva Salud Animal, Barcelona, España) por oveja y el lote C (control) no recibió ningún implante. La segunda experiencia del experimento 1 fue realizada en anestro estacional, entre septiembre y noviembre del año 2012, en un lote de 12 ovejas Dohne Merino; 6 de ellas (lote M) recibieron un implantes de melatonina y las otras 6 no recibieron implantes y se utilizaron como control (lote C). 1.2.Tratamiento de superovulación Para ambas experiencias los protocolos de trabajo fueron similares (Fig. 6).Los implantes fueron colocados 48 días antes del inicio del tratamiento superovulatorio. Como tratamiento de sincronización de celo se utilizaron esponjas intravaginales impregnadas de acetato de medroxiprogesterona (60 mg; Progeston, Syntex, Buenos Aires, Argentina), colocadas37días después de la colocación del implante de melatonina. A los 6 días de colocada la esponja se realizó un recambio de la misma y se inyectaron 3,7 mg de cloprostenol (Ciclase,Syntex, Buenos Aires, Argentina). Melatonina en ovinos patagónicos 80  Sesenta y dos horas antes de la retirada de esponja se comenzó con el tratamiento superovulatorio consistente en 8 dosis decrecientes de FSH porcina (Folltropin, Bioniche, Armidale, Australia), con un total de 256 mg equivalentes a 12,8 ml por animal. Las esponjas intravaginales se mantuvieron durante 14 días y el día de la extracción se inyectó 200 UI de eCG (Novormon,Syntex, Buenos Aires, Argentina). Se detectaron los celos con moruecos provistos de mandil cada 6 h a partir de las 12 h de extracción de las esponjas y se realizaron dos inseminaciones intrauterinas (IAIU) por ovejo donante de embriones, a tiempo fijo, con semen descongelado previa evaluación de la calidad seminal. Las inseminaciones se realizaron a las 33 y 48 h de la retirada de las esponjas por vía laparoscópica, previa aplicación de 0,2 ml de xilacina intramuscular para tranquilización y relajación del animal (Fig. 7). A los 58 días de colocado el implante se realizó la recuperación embrionaria. Fig. 6. Esquema del protocolo aplicado para la superovulación de ovejas Dohne Merino. IAIU: Inseminación artificial intrauterina Día Mañana ( 8 am) Tarde (18 pm) -37 Colocación de implantes de melatonina Lote M 0 Colocación de esponjas 6 Recambio de esponja + Cloprostenol 3,7 mg 11 48 mg FSH 12 48 mg FSH 36 mg FSH 13 36 mg FSH 24 mg FSH 14 24 mg FSH+ extracción de esponjas+ 200 UI eCG. 20 mg FSH+ detección de celo 15 20 mg FSH+ detección de celo IAIU 16 IAIU 19 Ayuno 21 Recuperación Embrionaria Tesis Doctoral Andrés Buffoni  81  1.3. Recuperación de embriones La recuperación de embriones se realizó mediante laparotomía, lavando el útero con una solución de lavado comercial (Bovipro, Minitube, Verona, Estados Unidos) a través de una sonda Foley a los 6 días tras la retirada de las esponjas (Fig. 8). Previamente, las ovejas se sedaron con una inyección intramuscular de 0,5 ml de Xilacina al 2% (Rompún, Bayer, Buenos Aires, Argentina), anestesiándose en forma parenteral con una inyección intravenosa de 6 ml de Ketamina (Ketamina 50, Holliday Scott,Buenos Aires, Argentina). Este protocolo permitió mantener la anestesia durante todo el tiempo de la recuperación de embriones. Fig.7 Aplicación de anestésico Fig. 8. Incisión para lavado de útero. El animal se colocó sobre una camilla de sujeción en decúbito dorsal con una inclinación anteroposterior de 30-45°. Se afeitó, se lavó cuidadosamente el campo operatorio y se desinfectó con yodo. Se realizó una incisión de 5-7 cm del abdomen a nivel de la línea blanca por delante de la ubre, para permitir la exteriorización de los ovarios y cuernos uterinos y contar los cuerpos lúteos para contrastar la respuesta ovulatoria (Fig. 8). Melatonina en ovinos patagónicos 82  Fig. 9. Observación de la tasa de ovulación Fig. 10. Búsqueda de embriones El lavado de cada cuerno se realizó separadamente. Se efectuó una punción en la base del cuerno, a nivel del ligamento intercornual, por la cual se introdujo una sonda Foley número 8. Así, la luz uterina se obstruyó por el inflado de la ampolla situada en el extremo del catéter. En el extremo opuesto del cuerno, cerca de la unión útero-tubárica, se realizó una segunda punción para introducir un catéter en la luz uterina por el cual se inyectó el medio de lavado (20 ml a 37°C) que se recuperó en el extremo opuesto del cuerno a través de la sonda Foley en una placa de Petri. Una vez terminado el lavado de los dos cuernos, se reintrodujo el tracto en la cavidad abdominal, y se lavó con una solución fisiológico con heparina al 2,5% para evitar las adherencias, aplicándose antibióticos en la zona para evitar las infecciones. Se suturó el peritoneo y la capa muscular con una sutura reabsorbible, y finalmente se cerró la piel con suturas no absorbibles. A los animales se les inyectó un antibiótico y un antiinflamatorio vía intramuscular así como prostaglandina (1 ml Cloprostenol, Syntex, Buenos Aires, Argentina) vía intramuscular para inducir la regresión de los cuerpos lúteos existentes y evitar la implantación de los embriones no recuperados. Los embriones se identificaron y evaluaron mediante una lupa binocular a 20 y 40 aumentos (Fig. 10), de acuerdo a su estadio de desarrollo y a su morfología (Wintenberger-Torres y Sevellec, 1987), de manera que se consideraron como viables las mórulas compactas y los blastocistos jóvenes, expandidos y eclosionados (Forcada et al., 2006), siempre y cuando no tuvieran imperfecciones y mostraran una forma esférica y simétrica, de acuerdo con los criterios de valoración morfológica de Linder y Wright (1983). Por lo demás, y dado que tanto los blastocistos (Széll y Windsor, 1994; Tesis Doctoral Andrés Buffoni  83  Naitana et al., 1995; 1997) como las mórulas compactas (Martinez y Matkovic, 1998) mantienen una muy buena viabilidad tras la congelación, ambos estadios, excepto los blastocistos totalmente eclosionados, fueron considerados aptos para ser conservados mediante la citada técnica. 1.4. Análisis estadístico  Los parámetros evaluados en este ensayo fueron los siguientes: • Hora de salida en celo tras la retirada de la esponja. • Tasa de ovulación: número de cuerpos lúteos • Número de estructuras recuperadas tras el lavado del útero • Número de embriones • Número de embriones viables: mórulas compactas y blastocistos, incluso los totalmente eclosionados. • Número de embriones congelables: mórulas compactas y blastocistos, excepto los totalmente eclosionados • Tasa de recuperación (% embriones recuperados en relación a tasa de ovulación) • Tasa de fecundación (% de embriones en relación a recuperados) • Tasa de viabilidad (% embriones viables en relación a recuperados) • Tasa de congelabilidad (% embriones congelables en relación a recuperados). Todos los valores anteriores fueron expresados como media ± E.S. para cada grupo, y entre grupos y recuperaciones sucesivas dentro de cada grupo fueron comparados mediante análisis de varianza, siendo los factores comparados el tratamiento o no con melatonina y la estación. Melatonina en ovinos patagónicos 84  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  85  EXPERIMENTO 2. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EXÓGENA A LO LARGO DEL FOTOPERIODO CRECIENTE SOBRE LOS PARÁMETROS DE CALIDAD SEMINAL DE MORUECOS DE RAZA DOHNE MERINO. Este experimento se desarrolló en el laboratorio de reproducción animal de la estación experimental de INTA de la ciudad de Trelew, provincia del Chubut (65º de longitud Oeste y a los 43º de latitud Sur) en el laboratorio de reproducción de INTA habilitada por SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina), entre los meses de septiembre a diciembre de los años 2011 y 2012. 2.1. Animales y tratamientos La primer experiencia se realizó con un lote de 20 moruecos raza Dohne Merino, divididos en 2 grupos homogéneos: uno de los lotes (n=10) fue tratado el 1 de septiembre de 2010 con 3 implantes de melatonina por macho (lote M), siendo el resto (n=10) el lote no tratado, control (lote C).La segunda experiencia fue realizada entre septiembre y diciembre del año 2012, con moruecos entre las razas Merino y Dohne Merino. Estudiando las mismas variables que en la primera experiencia se utilizaron 24 moruecos, 12 raza Dohne Merino a los cuales a 6 se les coloco 3 implantes subcutáneos de melatonina (lote M) y los otros 6 se tomaron como control (lote C) y 12 moruecos raza Merino con similar tratamiento que el anterior. Como se mencionó anteriormente el protocolo de trabajo fue similar en ambos experimentos. 2.2. Protocolo experimental El mismo día del tratamiento se comenzó con la toma de datos de medición del perímetro escrotal, CC y extracción de sangre para determinación de niveles plasmáticos de testosterona. Estas determinaciones se obtuvieron en forma quincenal. Los animales se mantuvieron estabulados con una adecuada dieta de heno de alfalfa, maíz y alimento balanceado, para cubrir sus necesidades de mantenimiento. A partir de los 30 días de la colocación de los implantes y durante 10 semanas los moruecos fueron sometidos en forma semanal a la extracción de semen para evaluación de calidad seminal. Melatonina en ovinos patagónicos 86  2.3. Obtención de semen Para la extracción de semen se utilizó una oveja estrogenizada con 0,25 ml de estradiol (Konig, Buenos aires, Argentina) dos veces por semana para estimular la libido de los moruecos (Fig. 11). Se utilizó una vagina artificial la cual proporciona estimulación térmica y mecánica para provocar la eyaculación. La vagina se cargó con 150 ml de agua a 50 Cº permitiendo una temperatura interior de 38-40ºC. Antes de cada extracción se realizó la limpieza de la zona inguinal y prepuberal del morueco para no contaminar la colecta. La muestra era recogida en un tubo de vidrio de 3 ml graduado y templado para evitar pérdidas de espermatozoides por shock térmico (Fig. 12). Fig.11 Momento de extracción de semen Fig. 12. Tubo colector para determinación de volumen de eyaculado 2.4. Evaluación de calidad seminal 2.4.1 Volumen del eyaculado  La determinación del volumen se efectuó mediante la observación directa de la graduación marcada en el tubo de colecta con una precisión de 0,1 ml.   p o c é f o Lav a Con de l a cita d sigu i P e c o t e r e o sitivas (E S é lulas. • S o rma de láti g Fi g . (mem b a do y acon d el propósit a s pajuelas d as, fue aco n i ente mane r • S e rcoll de 4 5 • S o ntenido d e e mperatura a • S e alizaron la s S PZ con fl S e consider a g o. 15 . Esper m b rana no fu d icionami e o de obten e correspon d n dicionado r a: S e colocaro 5 y 90%, 30 S obre la ca p e la pajuela a mbiente). S e recupera r s correspon d Tesis Do c l agelo enr o a ron negati v m atozoides u ncional) y e nto de los e e r una pobl d iente a ca d por centrif u n en tubo s 0 µl de cad a a superior d y se proce d r on 80 µl d d ientes det e ctoral Andr é 93 o llado = H v os los cas o sometidos ESPZ pos i e spermato z l ación de c é d a tratamie n fu gación a t r s eppendor f a una de el l d e la colu m d ió a su ce n d el sedime n e rminacion e é s Buffoni OS +) co n o s en que el a la prueb a i tivos (mem b z oides con g é lulas espe r n to, luego d r avés de u n f por soto p l as. m na de Perc o n trifugado ( n to de cad a e s . n tando un m flagelo se m a HOS. ES P b rana f un c g elados/de s r máticas vi v d e realizar n gradiente d p osición d o o ll se depos i ( 600g dura n a centrifug a m áximo d e m ostró rect o P Z ne g ativ o c ional, HO S s con g elado s v as, el con t las evalua c d e Percoll ® o s solucion e itaron 200 µ n te 10 min u a do en do n e 200 o o en o s S +). s enido c iones , de la e s de µ l del u tos a n de se Melatonina en ovinos patagónicos 94  Funcionalidad mitocondrial (Fig. 16) Para determinar la actividad mitocondrial de los ESPZ se realizó un test que emplea la coloración de Rhodamina 123 (Rh 123) en combinación con Ioduro de Propidio (IP), adaptado de Grasa et al. (2004). El fundamento de esta prueba consiste en que la Rh 123 (fluorocromo lipofílico y de naturaleza catiónica) se acumula selectivamente en el interior de las mitocondrias activas, atraída por el potencial de membrana mitocondrial, generando fluorescencia verde a nivel de la porción intermedia de los ESPZ (Rh+, mitocondria funcional). Los ESPZ que no emiten fluorescencia a este nivel, se consideran como no reactivos (Rh-). Por otro lado, el IP entra en las células con membranas dañadas, uniéndose al ADN del núcleo y emitiendo una fluorescencia roja (IP + =células no viables). Los ESPZ viables no se tiñen con el IP y sus cabezas emiten una fluorescencia verde de menor intensidad que la porción intermedia. Del resultado de la acción de ambos colorantes se realizó una adaptación de la interpretación descripta por Grasa et al. (2004), identificándose los patrones definidos en el siguiente cuadro: Patronesde viabilidad celular y funcionalidad de mitocondrias. Interpretación Rh 123 IP ESPZ viables con mitocondrias funcionales + - ESPZ viables con mitocondrias no funcionales - - ESPZ no viables con mitocondrias no funcionales - + Esta prueba se realizó en un tubo de vidrio en el cual se colocó 1 ml de solución isotónica, en BM a 37 ºC. Luego se agregaron 250 µl de la muestra del semen diluido en TRIS (1:300), 3 µl de la solución de trabajo Rh 123, esta mezcla se incubó durante 15 minutos. Posteriormente, se agregaron 25 µl de la solución de trabajo IP dejando incubar otros 15 minutos y finalmente se detuvo la reacción mediante el agregado de 10 µl de una solución isotónica formolada (ver Anexo) dejando incubar otros 5 minutos. Luego, las muestras se retiraron del baño maría para ser almacenadas al abrigo de la luz y a temperatura ambiente. La observación se   r e e n e s tr a f u F ig mit o E C u n d i c a D p o r e e alizó en m n tre porta s tableciénd o To d a nscurrido u e superior a ig . 16 . Esp e o condrias fu . stado del lortetracic L n ión de e s i stribución d a pacitación D e este mo d o sible dife r e acción acr o m icroscopio y cubreo b o se los por c d o este pr o desde el fi n a las 3 hora e rmatozoid e u ncionales via acrosom a lina (Fi g . 1 L a prueba d e s te antibió t d el Ca ++ en espermáti c d o, cuando u r enciar el e o sómica. Tesis Do c de epifluo r b jetos, do n c entajes de c o ceso se re a n al de la i n s. e s sometid o B : ESPZ v i b le con mi t a se g ún l o 1 7) e la Clortet r t ico (Clort e la membra n a, los cual e u na muestr a e stado de l ctoral Andr é 95 r escencia a n de se co n c élulas Rh + alizó al re s n cubación h o s a la reac c i able con m t ocondrias n o s diferen t r aciclina ( P e traciclina) na plasmát i e s pueden s a de ESPZ l a capacita c é s Buffoni 400x. Se c n taron un + , Rhy ta m s guardo de h asta la obs c ión de Rh m itocondri a n o f uncion a t es patro n rueba CTC al calcio i ca sufre ca m s er evidenc i es sometid c ión esper m c olocó una mínimo d m bién de los la luz dir e ervación al 123. A: E S a no f uncio n a les n es de la ) se basa e n (C a ++ ) de m bios dura n i ados medi a a a la Prue b m ática del muestra d e d e 200 c é IP+ e IP -. e cta y el ti l microsco p S PZ viable c nal C: ES P Prueba d n la propie d membran a n te el proc e a nte esta p r b a de la C T comienzo e 5 µl é lulas, empo p io no c on P Z no d e la d ad de a . La e so de r ueba. T C es de la Melatonina en ovinos patagónicos 96  El procedimiento empleado para realizar la técnica fue basado en PérezPeet al. (1996) como se describe a continuación: • Se descongeló un buffer-CTC (ver Anexo) • Luego, una solución de CTC (750 µM) se diluyó en 2 ml de la solución CTC-buffer. • La solución CTCbuffer fue filtrada a través de una membrana de acetato de celulosa (Microclar®) de 0,22 µm con el propósito de que no quedaran partículas groseras en la suspensión y mantenida a 4 ºC, hasta el momento de ser utilizada. • En un tubo Eppendorf se colocó una alícuota de 10 µl de la muestra de ESPZ y se le añadieron 20 µl de la solución CTC-buffer. Ambos se homogeneizaron durante 20 segundos, al resguardo de la luz. • La reacción colorimétrica anterior fue detenida mediante la adición de 10 µl de la mezcla de dos soluciones fijadoras: A (Tris-HCL 1 M + 1% (v/v) glutaraldehído EM (25%) + 5 ml de agua bidestilada estéril) y B (Tris 1 M + 1% (v/v) glutaraldehído EM (25%) + 10 ml de agua bidestilada estéril), pH 7,8. • Se colocaron 5 µl de la muestra fijada entre porta y cubreobjetos y se evaluó el estado de capacitación utilizando un microscopio de epifluorescencia (Nikon® Eclipse TE-300 Japón) a 400x. El colorante fue excitado con luz ultravioleta y se utilizó un filtro barrera de amplio rango (LP) (380 nm de excitación y 420 nm de emisión). Se contaron no menos de 200 ESPZ y fueron clasificados de acuerdo a los patrones-CTC descriptos por Fraser et al. (1995): • Patrón F-CTC: ESPZ no capacitados, fluorescencia uniformemente distribuida en toda la cabeza con una banda brillante en la región ecuatorial. • Patrón B-CTC: ESPZ que han iniciado el proceso de capacitación; fluorescencia uniforme aunque menos intensa que la anterior y pérdida de la banda ecuatorial o fluorescencia en la parte anterior de la cabeza sin fluorescencia en la región posacrosomal. • Patrón AR-CTC: ESPZ con reacción acrosómica, no se observa ninguna fluorescencia sobre la cabeza o sólo una delgada banda fluorescente en el segmento ecuatorial.   2.9. M Las m quin c La t e labo r 6-ox i libre etér e ng/d l Se e dete c 2.9. Eval u vagi n reali z SAS Fi g . a la prue b . M edición d m uestras p a c enal a par t e stosterona r atorio del I i maBSA. de la uni d e o del suer o l . La sensib e xpresaran l c table de te s Análisis e s u ación de l n a artificia l z ó a través , en donde l 17 . Esper m b a de la C T F: n d e niveles d a ra la deter m t ir del mom e se determi n I NTA. El a n El trazado r d a al antic u o , purifica d ilidad del k l os coefici e s tosterona p s tadístico as variable s l y de los e de un mo d l as variable Tesis Do c m atozoides T C. Clasi f ic n o capacita d d e testoster o m inación d e e nto de la a n ó mediant e n tisuero fu e es testoste r u erpo por C d o en colu m k it fue de 0, 0 e ntes de v a p ara cada e x s cuali-cua n e yaculados r d elo mixto c s en estudi o ctoral Andr é 97 de carnero c ación de l o acrosom a d o; B: cap a o na en san e testostero n a plicación d e un radioi n e obtenido p r ona tritiad a C arbón:Dex t m na de alú m 0 4 ng/dl. a riación in t x perimento. n titativas d e r econstitui d c omo medi d o fueron las é s Buffoni con g elado s o s patrones - a . a citado y A R g re n a plasmát i e los impla n n munoensa y p or inocula c a (NEN) y l t rán. El RI m ina y tie n t ra e inter e e los eyacu l d os de sem e d as repetid a siguientes: s /descon g e l - CTC se g ú n R : reaccio n i ca fueron t n tes. y o (RIA) d e c ión a cone j l a separaci ó A se reali z n e una sen s e nsayos y e l ados enter o e n congela d a s en el tie m l ados expu e n el estado d n ado t omadas de f esarrollado ej os del co m ó n de la ho r z a en el ex t s ibilidad d e e l valor m í o s obtenid o d o. El estu d m po, a tra v e stos d el f orma en el m plejo mona t racto e 0,04 í nimo o s con d io se v és de Melatonina en ovinos patagónicos 98  • Volumen • Motilidad masal • Porcentaje de espermatozoides vivos • PV • CC • Circunferencia escrotal • Análisis de testosterona en sangre. • Evaluación del semen descongelado El estudio del semen descongelado fue a través de un análisis de varianza donde las variables en estudio para ambos tratamientos fueron: • Movilidad Espermática Total • Movilidad Espermática Rectilínea Progresiva • Espermatozoides con membrana plasmática integra (Eosina/Nigrosina) • Espermatozoides con membrana plasmática funcional (HOS Test +) • Espermatozoides con mitocondrias funcionales • Patrón F-CTC • Patrón B-CTC • Patrón AR-CTC Tesis Doctoral Andrés Buffoni  99  EXPERIMENTO 3: EFECTO DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EXÓGENA A LO LARGO DEL FOTOPERIODO CRECIENTE SOBRE LOS RESULTADOS REPRODUCTIVOS DEOVEJAS RAZA MERINO CON MANEJO NETAMENTE EXTENSIVO. Este experimento se realizó completamente en el campo Experimental de INTA de Rio Mayo que se encuentra en la provincia de Chubut en la Cordillera Patagónica Septentrional (45ºS 70ºO), dependiente de la Estación Experimental de INTA Trelew. 3.1 Animales y diseño experimental Se utilizaron 120 ovejas Merino adultas. Divididas en dos grupo homogéneos en lo referente a PV, CC y edad. El grupo M, implantado, estuvo conformado por60 ovejas a las cuales se les colocó un implante subcutáneo de melatonina de 18 mg el 2 de septiembre de 2010, un mes antes del momento de mayor anestro estacional (octubre). El grupo C, control, estuvo conformado por 60 ovejas y no recibió ningún tipo de tratamiento hormonal (Fig. 18). Fig. 18. Colocación de implante de melatonina Fig. 19 Manejo Extensivo Ambos grupos tuvieron un manejo netamente extensivo (Fig. 19), por lo tanto sin suplementación alimentaria alguna, y fueron sometidas inmediatamente de colocados los implantes a un mes de efecto macho. Los primeros días de octubre se introdujeron15 moruecos adultos raza Dohne Merino para realizar las cubriciones, pintados con una mezcla de ferrite de color rojo con grasa en la zona del pecho para marcar las ovejas que iban mostrando celo y fueran montadas por los machos. Los machos permanecieron en el rebaño durante 45 días. Ambos lotes permanecieron juntos en todo momento. Cada 10 días se hacían los repuntes, que consisten en salir a caballo Melatonina en ovinos patagónicos 100  a observar si había algún morueco lejos del lote de ovejas para juntarlos nuevamente. El día 26 de enero de 2011, se realizó el diagnostico ecográfico de gestación. 3.2. Análisis estadístico Análisis de varianza a través del SAS tomando como variables en estudio para ambos tratamientos: • Porcentaje de ovejas en celo. • Porcentaje de preñez • Porcentaje de ovejas paridas.            Tesis Doctoral Andrés Buffoni  101  RESULTADOS Melatonina en ovinos patagónicos 102  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  109  Fig. 22. Evolución de las medias de porcentajes de espermatozoides vivos a través de tinción de eosina-nigrosina de animales implantados con melatonina y control durante los dos experimentos (Año1;Año 2) en anestro reproductivo. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30 37 44 51 58 65 72 79 86 93 Porcentaje(%)deesperm.Vivos Diasposterioresalacolocaciondeimplantesdemelatonina Control Melatonina 65 70 75 80 85 90 95 30 37 44 51 58 65 72 79 Porcentaje(%)deesper.Vivos Diasposterioresalacolocaciondeimplantesdemelatonina Control Melatonina Año2 Año 1 Melatonina en ovinos patagónicos 110  Fig. 23. Evolución de las medias de volumen de eyaculado (ml) de animales implantados con melatonina y control durante los dos experimentos (Año1; Año 2) en anestro reproductivo.(**) Indican diferencias significativas (p< 0,05) en cada muestreo. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 30 37 44 51 58 65 72 79 Volumen(ml) Diasposterioresalaaplicacióndeimplantesdemelatonina Melatonina Control 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 30 37 44 51 58 65 72 79 86 93 100 Volumen(ml) Diasposterioresalaaplicacióndeimplantesdemelatonina Melatonina Control Año2 Año1 Tesis Doctoral Andrés Buffoni  111  Tras la colocación de los implantes se apreció un rápido aumento, durante los primeros 15 días de los niveles de testosterona en el primer ensayo, en ambos grupos, para posteriormente mostrar un patrón irregular de ascenso y descenso sin diferencias significativas entre tratamientos. El momento de máximo valor encontrado fue a los 45 días de colocado el implante para ambos grupos en estudio y el nivel mínimo detectable fue a los 105 días para el grupo melatonina y a los 60 para el grupo control en el primer ensayo (Fig.24). Los niveles de testosterona durante el segundo ensayo mostraron un aumento paulatino durante todo el periodo en estudio en el grupo de animales implantados con melatonina, siendo más irregular para el grupo control con un valor máximo para ambos grupos a los 120 días de colocado el implante y un valor mínimo a los 75 días en el grupo control y al inicio de las mediciones para el grupo de animales implantados con melatonina. En la Tabla 4 se puede apreciar las medias (±E.S.) para cada experimento, el valor mínimo y máximo detectable en cada ensayo, y su respectivo coeficiente de variación para cada año. Tabla 4. Resultado de valores de testosterona en sangre expresados como medias (± E.S.), valores mínimos y máximo detectables (ng/ml) y coeficiente de variación intra e inter ensayo para ambos grupos en estudio (Melatonina; Control) durante los dos experimentos en anestro reproductivo (Año 1; Año2). Melatonina Control Año 1 Año 2 Año 1 Año 2 Medias 2,66±2,21 4,47±2,37 2,71±2,21 4,08±2,4 Valor mínimo detectable 0,25 0,50 0,23 0,46 Valor Máximo detectable 12 14,30 10,1 10 Coeficiente de Variación 92,87 55,92 81,63 98,78  Fi g me l 3 0 ‐0 , 0 , 0 , 1 , 1 , 2 , 2 , 3 , 3 , 4 , 4 , 5 , Nanogramos 0 , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , Nanogramos g . 24: Evo l l atonina ( M 0 días de ap , 5 , 0 , 5 , 0 , 5 , 0 , 5 , 0 , 5 , 0 , 5 , 0 30 Di a , 0 , 0 , 0 , 0 , 0 , 0 , 0 , 0 30 Dia l ución de l o M elatonina ) licación de 45 a sposteriore s 45 sposteriore s Año1 Año2 Melatonina o s niveles d e ) y en el g r u l implante d anes t 60 s alacolocaci 60 7 alacolocaci o en ovinos p 112 e testoster o u po de ani m d urante lo s t ro reprod u 75 9 0 i ondeimpla n Contr o 7 590 o ndeimplan t Mel p atagónico s o na sobre a m ales contr o s dos exper i u ctivo. 0 105 n tesdemelat o o l M 105 t esdemelat o atonina s nimales co n o l (Contro l) i mentos (A ñ 120 o nina M elatonina 120 o nina Control n implante s l) a partir de ñ o1; Año2) s de e los en Tesis Doctoral Andrés Buffoni  113  En la Tabla 5 se puede observar los resultados del análisis de distintos parámetros de calidad seminal sobre el semen descongelado de ambos tratamientos en ambos años en estudio. No se observaron diferencias significativas entre tratamientos en motilidad rectilínea progresiva, vigor, porcentajes de espermatozoides vivos y muertos y test de permeabilidad de membrana (Test de Hos). Sí se observan diferencias significativas en la evaluación de motilidad espermática total en el primer experimento a favor del grupo control sobre el grupo melatonina de las muestras de semen descongelado, no evidenciándose esta diferencia en los muestreos de semen descongelado del segundo año en estudio. Tampoco se evidenciaron diferencias significativas en los resultados en la prueba de funcionalidad mitocondrial con rhodamina e ioduro de propidio para ambos experimentos evidenciando valores similares en las medias obtenidas de espermatozoides viables con y sin mitocondrias funcionales y sobre espermatozoides no viables para ambos tratamientos. Los mismos resultados se observaron al realizar la tinción de clortetraciclina (CTC), obteniéndose resultados similares en sobre los espermatozoides capacitados, no capacitados y con reacción acrosomal, sin evidenciar diferencias estadísticas sobre la variables en estudio (Tabla 5). Melatonina en ovinos patagónicos 114  Tabla 5. Resultados de evaluaciones de parámetros de funcionalidad espermática (media± E.S.) de ambos ensayos (Año 1; Año 2) sobre animales con 3 implantes subcutáneos de melatonina (Melatonina) y no implantados (Control). Melatonina Control Año 1 Año 2 Año 1 Año 2 Motilidad Espermática Total 16,25 ± 13,02a 33,33 ± 19,41 32,86 ± 14,96b 31,67 ± 19,41 Motilidad rectilínea progresiva 20 ±20,7 33,33± 25,82 24,29± 22,25 28,33±19,41 Vigor 2,63±1,3 3,17 ±0,98 3,43 ±0,53 3,67±0,52 % espermatozoides vivos 19,81± 9,03 35,37± 8,19 37,75± 10,41 31,47± 12,38 Test hiposmotico positivo 19,7± 11,24 27,68± 15,05 26,27± 15,58 30,25± 18,08 RHODAMINA No viables con mitocondrias funcionales 45,04±5,08 61,97 ±13,94 61,6± 17 73,05 ±15,81 Viables con mitocondrias funcional 47,54± 7,59 35,22±12,62 35,48± 15,65 23,40±14,47 Viables con mitocondrias no funcionales 7,35 ± 3,83 2,82± 3,02 2,96± 3,33 3,55± 2,59 CLORTETRACICLINA (CTC) No capacitados 3,64± 2,02 12,48±5,47 5,37± 2,77 10,93 ±6,00 Capacitados 48,37± 17,77 60,83± 9,75 50,49± 3,97 67,12±10,84 Con reacción Acrosomal 47,97± 18,76 25,02±7,37 43,83± 5,33 21,97± 5,69 Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas (p< 0,05). Tesis Doctoral Andrés Buffoni  115  EXPERIMENTO 3: RESULTADO DE LOS ÍNDICES REPRODUCTIVOS DE HEMBRAS EN ANESTRO ESTACIONAL BAJO UN MANEJO NETAMENTE EXTENSIVO Llamativamente no hemos tenido resultados para su análisis estadístico durante la elaboración de este experimento. No se detectó ciclicidad ovárica, traducido en falta permanente de celos en ambos lotes en estudio. Cada 15 días se realizó las recorridas a caballo del cuadro donde se encontraban las ovejas de ambos lotes en estudio con los moruecos para dar servicio observando que cada vez que se realizaba esta maniobra las ovejas estaban totalmente separadas de los machos, evidenciando una ausencia total de manifestación de celo. Es importante destacar que antes del inicio del ensayo se realizó un diagnóstico de gestación para evitar la elección accidental de animales que pudieran estar gestantes antes del experimento. También es importante destacar que si bien los anímales, por la situación de sequía que atraviesa la zona Patagónica desde hace ya varios años, se encontraban en una baja condición corporal y peso vivo, con un promedio de 37, 51± 3,81 kg de PV y 1,45±0,15 de CC para el grupo control y 38,07± 4,59 kg de PV y 1,47± 0,11 de CC para el grupo melatonina, se cree que este factor no es responsable de los resultados obtenidos, observando una mejora del estado nutricional a los 50 días de colocado el implante con un aumento promedio de PV 4,13±2,92 kg y 0,320±0,24 puntos más de condición corporal el grupo control y 3,76±2,03 kg de aumento de peso vivo y 0,34±0,21 puntos de condición corporal para el grupo con implantes de melatonina. A los 45 días de finalizado el servicio a campo se realizó el diagnostico de gestación ecográfica corroborando la falta de manifestación de celo sin lograr ninguna gestación detectable en ambos grupos. Melatonina en ovinos patagónicos 116  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  117  DISCUSIÓN  Melatonina en ovinos patagónicos 118   Tesis Doctoral Andrés Buffoni  125  aumento del nivel de testosterona a través de un aumento de secreción de GnRH y el LH (Misztal et al., 2002). Aunque este mecanismo de acción esta aún bajo estudio, algunos recientes trabajos han sugerido que la melatonina podría actuar en el eje reproductivo a través de la acción directa sobre la expresión del gen GnRH y la regulación de la proteína G acoplada a receptores de melatonina y serotonina en las neuronas de GnRH del hipotálamo mediante la unión a sus receptores que llevaría a causar un aumento en la secreción de pulsos de GnRH y un aumento inmediato de la secreción pulsátil de LH (Viguie et al., 1995), que también llevaría a un aumento en la testosterona de liberación entre dos y cuatro semanas después del cambio de las condiciones de fotoperíodo (Rosa y Bryant, 342 2003). Sin embargo, estudios recientes en la rata y el hámster que han mostrado la presencia del receptor MT1 de melatonina en las células de Leydig (Frungieri et. al., 2005) y su acción directa en la secreción de andrógenos (Valenti y Giusti, 2002), sugieren una acción más directa de la melatonina sobre la secreción de testosterona en los testículos. La testosterona encontrada en el plasma seminal podría provenir de los fluidos de los túbulos seminíferos, intersticium y la rete testis, donde también se puede medir (Comhaire y Vermeulen, 1976). La testosterona en el testículo es esencial para la espermatogénesis y por lo tanto la fertilidad además, la testosterona podría inhibir la apoptosis celular espermática (Ruwanpura et al., 2010) y por lo tanto aumentarla calidad seminal, aunque por lo anteriormente mencionado los resultados sobre los parámetros de calidad seminal son muy variables. Con respecto a los resultados de la evaluación del semen descongelado de ambos ensayos, solo se encontraron diferencias significativas sobre la motilidad espermática total a favor del grupo control en el primer experimento, el resto de las variables no generaron diferencias estadísticas significativas tal como ocurrió en el trabajo de Wales y White (1963). Casao et al. (2007) demuestran cómo el tratamiento durante el anestro en machos de raza Rasa Aragonesa tratados con implantes de melatonina incrementa el porcentaje de espermatozoides móviles progresivos, aunque otros autores no encontraron diferencias significativas para este parámetro (Kaya et al., 2000). Si bien en estos estudios se utilizaron técnicas subjetivas de valoración de la motilidad, el aumento de motilidad progresiva debería estar relacionado con una mejora de la fertilidad in vivo, ya que sólo los espermatozoides con buena motilidad progresiva pueden atravesar el cuello del útero (Mortimer, 1997, 2000). Melatonina en ovinos patagónicos 126  El resto de las evaluaciones de calidad espermática (funcionalidad mitocondrial y estado de capacitación) se realizaron tras pasar el semen por gradientes de Percoll con el fin de lograr una mayor población de células vivas sin evidenciar diferencias estadísticas entre tratamientos. Para el caso de la evaluación del estado de capacitación con CTC Gillan et al. (1999) indicaron que la dilución, la congelación y la descongelación del semen inducen cambios estructurales que conducen a una capacitación prematura en los espermatozoides. Sin embargo, es posible que las células muertas pierdan su contenido acrosomal, debido a la rotura de membranas, presentando una similitud con los cambios acrosomales producidos durante la capacitación (Martiet al., 2000). Por lo tanto, es necesario evaluar el estado de capacitación sólo en aquellos espermatozoides que sobreviven a la congelación. Watson (1995) sugirió que el frio que sufren los espermatozoides a través del procedimiento de congelación genera una capacitación prematura de los mismos y causa una menor fertilidad detectados en procedimientos in vitro. Tesis Doctoral Andrés Buffoni  127  EXPERIMENTO 3: RESULTADO DE LOS ÍNDICES REPRODUCTIVOS DE HEMBRAS EN ANESTRO ESTACIONAL BAJO UN MANEJO NETAMENTE EXTENSIVO Las bondades del uso de implantes de melatonina en la especie ovina para mejorar los parámetros reproductivos durante el anestro estacional han sido ampliamente contrastadas en el hemisferio norte. Palacín et al. (2011), en un metaanálisis realizado sobre 139 experiencias realizadas en España, demostraron que los implantes de melatonina incrementan de manera significativa la fertilidad en un 29%, la prolificidad en 0,08 corderos/parto, y la fecundidad en 0,25 corderos extra producidos/oveja tratada. Sin embargo, los estudios realizados en el hemisferio sur son más escasos y contradictorios. De hecho, apenas hay información del uso de implantes en Argentina ni en zonas del hemisferio sur tan extremas como el paralelo 45º. Nowers et al. (1994), al sur de África (32ºS) sobre ovejas Dohne Merino observaron que los implantes de melatonina generaban diferencias significativas en la presentación de celos, siendo estos más tempranos y mejorando las performances reproductivas. Gonzalez Morales (1998) en Chile (39ºS) observó sobre ovejas raza Austral que el uso de implantes de melatonina permitía detectar celo a los 37 días post-implante y que el número de hembras en estro iba aumentando a medida que pasaban los días produciéndose un alza de ovejas en estro entre los 57 y 62 días postimplante siendo el promedio de 61 días. Por otro lado Kenawey y Gilmore (1984) en el sur de Australia (34ºS) pudieron observar el papel de la glándula pineal y la melatonina en la pubertad, aplicándole implantes de melatonina a corderas nacidas de ovejas pinealectomizadas, pudiendo observar que la pubertad se demoraba significativamente en las corderas tratadas con melatonina que en las del grupo control. En otras experiencias utilizando animales de distintas razas y bajo diferentes latitudes no se observaron diferencias significativas entre animales tratados y no tratados respecto a la proporción de ovejas cíclicas en el momento de la introducción de machos en mayo (30 vs. 31%; Zuñiga et al., 2002), enero (75 vs. 69%) y marzo (26 vs. 26%; Forcada et al., 2002), Aunque Palacin et al. (2008) pone de manifiesto la posible inducción de la actividad ovárica por la acción de la melatonina. Sin embargo en nuestra experiencia hemos observado una falta total de manifestaciones de celo para ambos tratamientos en estudio, y esto se tradujo con la falta de libido de Melatonina en ovinos patagónicos 128  parte de los moruecos, que, siendo este un manejo ultra extensivo y al ser cuadros tan grandes, se les hacían recorridas a caballo cada 15 días por si algún macho se alejaba de las hembras y pudiera detectar las hembras en celo pero siempre los machos estaban apartados de las hembras. Por supuesto que, en base a los objetivos planteados en este experimento, en el que esperábamos una respuesta de ciclicidad ovárica mayor en los animales tratados con melatonina y al menos un pequeño porcentaje de ovejas del grupo control que por el efecto macho realizado muestren signos de actividad ovárica, pero no la nulidad de respuesta en ambos tratamientos. Gomez Brunet et al. (1995) informó que la melatonina parece no tener efecto sobre la secreción de LH antes o inmediatamente después de la introducción de los machos. Así, tanto ovejas tratadas como no tratadas con melatonina durante el anestro, responden a la introducción de los machos con un incremento en la frecuencia de los pulsos de LH, pero no observó cambios significativos en la amplitud de los pulsos, en los niveles medios de LH, en el intervalo entre la introducción de machos y el pico de LH, ni en la magnitud de dicho pico. Abecia et al. (2005) en ovejas raza Rasa Aragonesa aplicando un implante subcutáneo de melatonina en anestro estacional y con 40 días de efecto macho observó un efecto significativo del tratamiento sobre la ciclicidad temprana luego del efecto macho y en consecuencia en la curva de partos. Si bien la condición corporal de las ovejas al momento de colocar los implantes no era la ideal para ambos grupos en estudio por los años de sequía que viene sufriendo la regio Patagónica Argentina, y teniendo en cuenta lo observado por (Rondon et al.,1994), que indican que la colocación de un solo implante en estación reproductiva permite que ovejas de inferior condición corporal tengan la misma respuesta ovárica que animales con mejor estado corporal, siendo importante destacar que nuestro experimento fue en anestro reproductivo, momento en el cual en un manejo netamente extensivo es la etapa de recuperación de los aporte forrajeros naturales y en donde los animales comienzan a recuperar su estado corporal tras la salida del invierno, por lo que creemos que su condición corporal baja al inicio del experimento no fue la causa de la respuesta obtenida. Tesis Doctoral Andrés Buffoni  129  CONCLUSIONES Melatonina en ovinos patagónicos 130  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  131  En las condiciones en las que se han realizado los experimentos que se presentan en esta memoria de Tesis Doctoral, en lo que especialmente se refiere a situación geográfica y razas empleadas, podemos concluir que: • La melatonina exógena puede mejorar la viabilidad de los embriones recolectados en ovejas Dohne Merino después de la superovulación en el periodo de anestro estacional, sin embargo, este efecto no se ve reflejado durante la estación reproductiva. • El tratamiento con melatonina de ovejas donantes de embriones en anestro estacional no mostro beneficios en términos de mejora de tasa de ovulación y de producción de embriones para hembras raza Dohne Merino en la región Patagónica Argentina • El uso de implantes de melatonina en anestro estacional sobre moruecos raza Dohne Merino en la región Patagónica Argentina logra modificar en forma significativa la circunferencia escrotal sin modificar los parámetros de calidad seminal tanto en muestreos de semen fresco como en semen descongelado. • Los implantes de melatonina en hembras Merino manejadas a campo en forma ultraextensiva en la región Patagónica Argentina no manifestaron respuesta favorable a la presentación de celo complementadas con el tratamiento de efecto macho. • Son necesarios más estudios que nos permitan conocer las posibilidades de uso de los implantes de melatonina en un sistema ultra extensivo como el de la región Patagónica Argentina. Melatonina en ovinos patagónicos 132  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  133  ANEXO Melatonina en ovinos patagónicos 134   Tesis Doctoral Andrés Buffoni  141  BIBLIOGRAFÍA Melatonina en ovinos patagónicos 142  Tesis Doctoral Andrés Buffoni  143  ABECIA, J.A., FORCADA, F., LOZANO, J.M. (1999). A preliminary report on the effect of dietary energy on prostaglandin F2α production in vitro, interferon-tau synthesis by the conceptus, endometrial progesterone concentration on days 9 and 15 of pregnancy and associated rates of embryo wastage in ewe. Theriogenology 52(7), 1203-1213. ABECIA, J.A., FORCADA, F., ZUÑIGA, O. (2002). The effect of melatonin on the secretion of progesterone in sheep and on the development of ovine embryos in vitro. Veterinary Research Communications, 26: 151-158. ABECIA, J.A., PONTES GONZÁLEZ, J.M., PONTES GARCÍA, J.M., MARTÍN, S., FORCADA, F., VALARES, J.A., PALACÍN, I., MARTINO, A. (2005). 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