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2013 79 Ana Martín Pardillos Estudios sobre la calcificación vascular medial: efecto del envejecimiento, arsénico y fluor Departamento Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Sorribas Alejaldre, Víctor Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Ana Martín Pardillos ESTUDIOS SOBRE LA CALCIFICACIÓN VASCULAR MEDIAL: EFECTO DEL ENVEJECIMIENTO, ARSÉNICO Y FLUOR Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Sorribas Alejaldre, Víctor Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA, MEDICINA LEGAL Y FORENSE Y TOXICOLOGÍA TESIS DOCTORAL ESTUDIOS SOBRE LA CALCIFICACIÓN VASCULAR MEDIAL: EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, ARSÉNICO Y FLÚOR Memoria presentada por Ana Martín Pardillos, Licenciada en Veterinaria, para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza, bajo la dirección de Víctor Sorribas Alejaldre, Catedrático de Toxicología de la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, Febrero de 2013 ! ! ! VÍCTOR SORRIBAS ALEJALDRE, con DNI n⁰ 25136445K, y Catedrático de Toxicología de la Universidad de Zaragoza, HACE CONSTAR: Que la memoria de Tesis Doctoral presentada por Doña Ana Martín Pardillos, con el título "Estudios sobre la calcificación vascular medial: Efectos del envejecimiento, arsénico y flúor", para optar al grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza, ha sido realizada bajo mi dirección, cumple los requisitos necesarios por la legislación vigente, se enmarca dentro de las líneas de investigación seguidas por el candidato durante sus estudios de Tercer Ciclo, coincide con el proyecto de Tesis presentado originalmente, y posee la calidad científica necesaria para la obtención de dicho título. Y para que así conste, firmo el presente en Zaragoza a 18 de Febrero de 2013 Fdo. Víctor Sorribas Alejaldre Dpto. Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense, y Toxicología Unidad de Toxicología Miguel Servet, 177 E-50.013 Zaragoza (Spain) Teléfono: 976 761 631-Fax: 976 761 612-Email: [email protected] ÍNDICE GENERAL ! Índice general I ÍNDICE GENERAL I. INTRODUCCIÓN 1 1. CÉLULAS DEL MÚSCULO LISO VASCULAR DE LA AORTA (VSMCs) 3 1. 1. Anatomía y fisiología de la aorta 3 1. 2. Origen de las células del músculo liso vascular (VSMCs) 4 1. 3. Patrón de expresión génica de VSMCs 5 2. INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA Y SU RELACIÓN CON LA CALCIFICACIÓN VASCULAR 7 2. 1. Anatomía y fisiología renal 7 2. 2. Insuficiencia renal crónica (IRC) 12 2. 2. 1. Epidemiología 12 2. 2. 2. Definición 12 2. 2. 3. Estadios evolutivos de la enfermedad 12 2. 2. 4. Causas de insuficiencia renal crónica (IRC) 14 2. 2. 5. Fisiopatogenia de la insuficiencia renal crónica 14 2. 2. 6. Relación entre insuficiencia renal crónica (IRC) y calcificación vascular 15 3. ENVEJECIMIENTO Y SENESCENCIA 19 3. 1. Definición de envejecimiento y senescencia 19 3. 2. Senescencia celular 21 3. 2. 1. Antecedentes históricos 21 3. 2. 2. Comportamiento de las células en cultivo 22 3. 2. 3. Mecanismos de inducción del proceso de senescencia 24 3. 2. 4. Bioindicadores de senescencia 28 3. 3. Relación entre envejecimiento, senescencia celular y patologías 31 3. 4. Envejecimiento y senescencia celular de la aorta 32 Índice general  II 3. 4. 1. Envejecimiento y senescencia de las células del musculo liso de la aorta 32 3. 4. 2. Relación entre envejecimiento in vivo y calcificación vascular 35 3. 4. 3. Relación entre senescencia celular y calcificación vascular 37 4. CALCIFICACIÓN DE LA TÚNICA MEDIA DE LA AORTA (ESCLEROSIS DE MÖNCKEBERG) 39 4. 1. Introducción 39 4. 2. Caracterización de las calcificaciones 40 4. 2. 1. Fase inorgánica 40 4. 2. 2. Matriz calcificante 42 4. 3. Implicación de la transdiferenciación de VSMCs en la calcificación medial 43 4. 4. Consecuencias patológicas de la calcificación medial 51 5. ARSÉNICO 51 5. 1. Definición 51 5. 2. Fuentes de exposición 51 5. 3. Toxicocinética 53 5. 4. Toxicidad 54 6. FLÚOR 55 6. 1. Definición 55 6. 2. Toxicocinética 55 6. 3. Toxicidad 56 6. 4. Relación con la calcificación 57 6. 4. 1. Calcificaciones fisiológicas 57 6. 4. 2. Calcificaciones vasculares 57 II. OBJETIVOS 59 PARTE I. Envejecimiento de las VSMCs 61 Índice general III PARTE II. Influencia del arsénico en la calcificación vascular y senescencia de VSMCs 62 PARTE III. Efecto del flúor sobre la calcificación vascular 64 III. MATERIAL Y MÉTODOS 65 1. REACTIVOS 67 2. APARATOS 67 3. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 71 3. 1. Generalidades 71 3. 2. Tratamientos 71 3. 2. 1. Estudios de senescencia inducida por arsénico 71 3. 2. 2. Estudios sobre calcificación 72 4. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS DE MUSCULATURA LISA VASCULAR DE AORTA 76 4. 1. Materiales, reactivos y aparatos 77 4. 2. Procedimiento 77 4. 2. 1. Preparación de la colagenasa 77 4. 2. 2. Procedimiento quirúrgico 77 4. 2. 3. Limpieza de la aorta y extracción de células 78 5. TÉCNICAS BÁSICAS DE CULTIVO CÉLULAR 79 5. 1. Materiales, reactivos y aparatos 79 5. 2. Procedimientos 80 5. 2. 1. Mantenimiento en cultivo 80 5. 2. 2. Tripsinización: pasaje y conservación 80 5. 2. 3. Cálculo de la densidad celular 81 5. 2. 4. Selección del tipo de suero fetal bovino (SFB) usado para el mantenimiento de cultivos celulares 82 Índice general  IV 6. DISEÑO EXPERIMENTAL: TRATAMIENTOS “IN VITRO” 82 6. 1. Determinación de la citotoxicidad 83 6. 1. 1. Citotoxicidad asociada a las diferentes especies de arsénico 83 6. 1. 2. Citotoxicidad asociada a las diferentes concentraciones de flúor 83 6. 2. Determinación de la actividad -galactosidasa 83 6. 3. Inmunofluorescencia 84 6. 4. Tratamientos para extracción de proteína y RNA 84 6. 5. Tratamientos empleados en técnicas de ELISA 85 6. 6. Estudios sobre calcificación 85 7. DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD 86 7. 1. Materiales, reactivos y aparatos 87 7. 2. Procedimiento 87 8. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ß-GALACTOSIDASA 88 8. 1. Materiales, reactivos y aparatos 89 8. 2. Procedimiento 89 9. INMUNOFLUORESCENCIA 90 9. 1. Materiales, reactivos y aparatos 90 9. 2. Inmunocitología 91 9. 3. Inmunohistología 92 9. 4. Detección de apoptosis – Técnica de TUNEL 93 9. 5. Determinación de la viabilidad celular con bromuro de etidio y naranja de acridina 94 9. 6. Determinación del estrés oxidativo 95 10. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 95 10. 1. Método de BCA 95 10. 1. 1. Materiales, reactivos y aparatos 96 10. 1. 2. Procedimiento 96 Índice general V 10. 2. Método de Bradford 97 10. 2. 1. Materiales, reactivos y aparatos 97 10. 2. 2. Procedimiento 98 11. WESTERN-BLOT: ANÁLISIS INMUNOADSORBENTE 98 11. 1. Materiales, reactivos y aparatos 98 11. 2. Procedimientos 100 11. 2. 1. Extracción de muestras de proteína 100 11. 2. 2. Electroforesis 100 11. 2. 3. Transferencia 100 11. 2. 4. Bloqueo de la membrana 100 11. 2. 5. Inmunodetección 100 11. 2. 6. Tinciones asociadas a la técnica de Western-blot 102 12. ELISA (ANÁLISIS INMUNOADSORBENTE UNIDO A ENZIMA) 102 12. 1. Materiales, reactivos y aparatos 103 12. 2. ELISA sándwich: cuantificación de interleukina 1ß 103 12. 3. ELISA directo: cuantificación de proteínas oxidadas (estrés oxidativo) 104 13. PURIFICACIÓN DE RNA 104 13. 1. Método de filtrado con columnas 105 13. 1. 1. Materiales, reactivos y aparatos 105 13. 1. 2. Procedimiento 105 13. 2. Método de bolas magnéticas 106 13. 2. 1. Materiales, reactivos y aparatos 106 13. 2. 2. Procedimiento 106 14. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN Y CALIDAD DEL RNA EXTRAÍDO 107 14. 1. Cuantificación de RNA 107 14. 2. Determinación de la calidad del RNA 107 15. RETROTRANSCRIPCIÓN DEL RNA EXTRAÍDO 107 Índice general  VI 15. 1. Procedimiento 108 16. CUANTIFICACIÓN DEL cDNA MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL 108 16. 1. Procedimiento 109 17. CUANTIFICACICIÓN DE LA CALCIFICACIÓN 110 18. TINCIONES ASOCIADAS A CALCIFICACIÓN 111 18. 1. Tinción de von Kossa 111 18. 1. 1. Materiales, reactivos y aparatos 111 18. 1. 2. Procedimiento 112 18. 2. Tinción de rojo de alizarina 112 18. 2. 1. Materiales, reactivos y aparatos 112 18. 2. 2. Procedimiento 112 19. ANÁLISIS CRISTALOGRÁFICO 113 20. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 113 IV. RESULTADOS 115 PARTE I. Envejecimiento de las VSMCs 117 I. A. Envejecimiento celular y desdiferenciación de VSMCs 117 1. Evolución de los cultivos primarios 117 2. Indicadores de envejecimiento de las células en cultivo 118 3. Cambios en la expresión de indicadores de células de musculatura lisa vascular 123 4. Expresión de indicadores de envejecimiento en función de la edad del animal 127 5. Expresión de indicadores de musculatura lisa vascular en función de la edad del animal 131 I. B. Factores implicados en la senescencia de VSMCs 135 Índice general VII I. C. Relación entre senescencia y calcificación vascular 136 1. Expresión de indicadores de calcificación 136 2. Efecto de la senescencia sobre la calcificación vascular 138 PARTE II. Influencia del arsénico en la calcificación vascular y senescencia de VSMCs 140 II. A. Citotoxicidad de las especies de arsénico 140 II. B. Efecto del arsénico en la calcificación “in vitro” 141 II. C. Efecto del arsénico en la calcificación “in vivo” 144 II. D. Exclusión de mecanismos de toxicidad “in vitro” por arsénico 148 1. Apoptosis 148 2. Estrés oxidativo 148 3. Activación de inflamasoma 150 II. E. Senescencia prematura inducida por estrés (SIPS) “in vitro” e “in vivo” por arsénico 150 II. F. Arsénico induce desdiferenciación de VSMCs 156 PARTE III. Efecto del flúor sobre la calcificación vascular 159 III. A. Elección de las dosis de tratamiento con flúor 159 III. B. Determinación de la citotoxicidad en el tratamiento “in vitro” con flúor 159 III. C. Efecto del flúor en la calcificación “in vitro” 160 III. D. Determinación del mecanismo implicado en la inhibición de la calcificación “in vitro” por flúor 163 III. E. Expresión “in vitro” de genes osteoblásticos en VSMCs tratadas con flúor en presencia de medio calcificante 165 III. F. Análisis de los depósitos cálcicos “in vitro” por microscopía electrónica de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) 166 1. Estudio comparativo de los depósitos entre VSMCs vivas y muertas 166 2. Estudio comparativo de los depósitos en VSMCs muertas en función del tiempo (días) de incubación con medio calcificante (Pi 2 mM) / calcificación 173 III. G. Efecto del flúor en la calcificación “in vivo” 178 Índice general  VIII V. DISCUSIÓN 183 PARTE I. Envejecimiento de las VSMCs 185 I. A. Envejecimiento celular y desdiferenciación de VSMCs 185 1. Evolución de los cultivos primarios 185 2. Indicadores de envejecimiento de las células en cultivo 188 3. Cambios en la expresión de indicadores de células de musculatura lisa vascular 190 4. Expresión de indicadores de envejecimiento en función de la edad del animal 191 5. Expresión de indicadores de musculatura lisa vascular en función de la edad del animal 192 I. B. Factores implicados en la senescencia de VSMCs 194 I. C. Relación entre senescencia y calcificación vascular 195 1. Expresión de indicadores de calcificación 195 2. Efecto de la senescencia sobre la calcificación vascular 197 PARTE II. Influencia del arsénico en la calcificación vascular y senescencia de VSMCs 198 II. A. Citotoxicidad de las especies de arsénico 198 II. B. Efecto del arsénico en la calcificación 199 II. C. Exclusión de mecanismos de toxicidad “in vitro” por arsénico 202 II. D. Senescencia prematura inducida por estrés (SIPS) “in vitro” e “in vivo” por arsénico 202 II. E. Arsénico induce desdiferenciación de VSMCs 203 PARTE III. Efecto del flúor sobre la calcificación vascular 206 III. A. Elección de las dosis de tratamiento con flúor 206 III. B. Determinación de la citotoxicidad en el tratamiento “in vitro” con flúor 206 III. C. Efecto del flúor en la calcificación “in vitro” 207 III. D. Determinación del mecanismo implicado en la inhibición de la calcificación “in vitro” por flúor 208 III. E. Expresión “in vitro” de genes osteoblásticos en VSMCs tratadas con flúor Introducción  5 Los precursores mesenquimales además de dar lugar a SMC, tanto vasculares (VSMCs) como viscerales, se diferencian en adipocitos, mioblastos, condrocitos y osteoblastos (Iyemere y cols., 2006). Esto es de gran importancia, ya que este origen celular tiene consecuencias patológicas porque, como se ha demostrado, las VSMCs son capaces de sufrir cambios fenotípicos y adquirir un diverso rango de características de otras líneas mesenquimales (Shanahan y cols., 1999; Tintut y cols., 2003; Tyson y cols., 2003; Davies y cols., 2005). Diversos factores locales presentes en ambientes patológicos pueden conducir a una inadecuada diferenciación o incluso transdiferenciación (King y cols., 2003), pudiendo estos fenotipos contribuir al desarrollo de patologías como la calcificación (transdiferenciación osteogénica), alteración de la producción de la matriz (transdiferenciación condrogénica) y acumulación de lípidos en ateroesclerosis (transdiferenciación adipogénica) (Shanahan y cols., 1999; Iyemere y cols., 2006). 1. 3. PATRÓN DE EXPRESIÓN GÉNICA DE VSMCs La expresión de bioindicadores génicos de músculo liso está sobrerregulada en VSMCs quiescentes y diferenciadas (fenotipo contráctil), mientras es sub-regulada en VSMCs en proliferación (fenotipo sintético). Esta variabilidad fenotípica se conoce como fenotipo cambiante (Owens y cols., 2004). Existen evidencias sobre la heterogeneidad de fenotipos de las VSMCs en roedores y humanos, aunque los fenotipos contráctil y sintético inicialmente descritos en cultivo probablemente representen los extremos de un espectro continuo de fenotipos de VSMCs que pueden existir in vivo (Shanahan y cols., 1998). Estos fenotipos deben ser determinados por sus diferentes programas de expresión génica. Las VSMCs localizadas en la íntima están asociadas con enfermedades vasculares, y son fenotípicamente distintas a las de la túnica media (Campbell y cols., 1985; Mosse y cols., 1985). Las células intimales permanecen indiferenciadas, con baja expresión de proteínas contráctiles, pocos miofilamentos y un elevado número de proteínas que contribuyen al desarrollo de la lesión o su estabilidad (Schwartz y cols., 1986, 1995). Hay dos teorías diferentes sobre el origen de los fenotipos inmaduro y diferenciado. Una primera teoría propone que estos fenotipos son reflejo de los dos orígenes embriológicos, mesenquimal y cresta neural (Topouzis y cols., 1996), lo cual está demostrado por la monoclonalidad de las VSMCs intimales en ateroesclerosis (Benditt y cols., 1973; Murry y cols., 1997) y la identificación de clones estables fenotípicamente in vitro (Bochaton-Piallat y cols., 1993). La segunda teoría, que no excluye a la primera, Introducción   6 propone que las VSMCs intimales (fenotipo sintético) derivan de VSMCs maduras mediales (fenotipo contráctil), las cuales sufren modulación fenotípica y migran a la capa íntima con el fin de reparar lesiones en la misma (Weissberg y cols., 1996). Esta teoría se ve apoyada por estudios en los cuales se ha visto que en cultivo las VSMCs pueden sufrir cambios fenotípicos. Pueden exhibirse distintos fenotipos en cultivo según los estímulos a los que estén expuestas (Figura I3), o por ejemplo en función del origen o edad del donante (Bochaton-Piallet y cols., 1996; Chamley-Campbell y cols., 1979; Neuville y cols., 1997). Otro de los cambios fenotípicos, como ya se ha comentado anteriormente, es la transdiferenciación hacia fenotipos relacionados con patologías y que son consecuencia de un mismo origen mesenquimal. Figura I3. Modulación fenotípica de VSMCs en función de los estímulos a los que se encuentran sometidas (modificado de Owens y cols., 2003). Algunos de los indicadores mejor caracterizados para SMC con fenotipo contráctil incluyen α-actina, γ-actina, SM-MHC (cadenas pesadas de miosina), calponina, hcaldesmonina, α-tropomiosina, β-tropomiosina, SM22α, smoothelina, metavinculina, α1integrina, acuaporina-1, ubicuitina, osteoglicina y MGP. En el fenotipo sintético estos indicadores se encuentran sub-regulados o ausentes. En el caso de la caldesmonina, en el fenotipo contráctil aparece la forma h-caldesmonina y en el desdiferenciado la forma lcaldesmonina. (Shanahan y cols., 1998; Sobue y cols., 1999; Halayko y cols., 2001; Kumar y cols., 2003; Owens y cols., 2003; Yoshida y cols., 2005). Introducción  7 Existe una relación directa entre calcificación vascular e insuficiencia renal crónica y envejecimiento, por lo que es importante realizar una breve introducción sobre la fisiología y patología renal, envejecimiento y posteriormente sobre el tema principal de esta tesis, la calcificación vascular, así como el resto de aspectos tratados, arsénico y flúor. 2. INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA Y SU RELACIÓN CON LA CALCIFICACIÓN VASCULAR 2. 1. ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA RENAL Los riñones son órganos pares, situados en posición retroperitoneal en la parte posterior de la cavidad abdominal, a cada lado de la columna vertebral contra el musculo psoas mayor, en todas las especies de animales domésticos y en el hombre (Figura I4). Cada riñón se sitúa dentro de un repliegue de fascia sublumbar, el cual también contiene una cantidad considerable de grasa, que en ocasiones lo cubre completamente (cápsula adiposa) (Schrier, R. W. y Gottschalk, C. W., 1997; Dyce y cols., 2012). Figura I4. Órganos urinarios de la perra y vasos sanguíneos adyacentes in situ (Dyce y cols., 2012). Introducción   8 El margen lateral del riñón es convexo y el margen medial es cóncavo, éste último tiene una escotadura denominada hilio renal. A través del hilio pasan los elementos que constituyen el pedículo renal, los cuales son las ramas de la arteria y vena renal, nervios, vasos linfáticos y la pelvis renal, parte dilatada proximal del uréter. El hilio renal conduce a un espacio aplanado en el interior del riñón, llamado seno renal. En este espacio las ramas de la pelvis renal convergen en los cálices mayor y menor. El corte longitudinal del riñón revela dos regiones claramente diferenciadas, el córtex y la médula. Las pirámides medulares se encuentran rodeadas por el córtex. El riñón humano es multilobular, cada lóbulo está formado por una pirámide medular y el parénquima cortical asociado; mientras que en la rata es unilobular (Figura I5 A). El córtex contiene el 75 % de los glomérulos, los túbulos proximales y distales. El vértice de cada pirámide medular (llamada también papila) se extiende en el seno renal hasta desembocar en el cáliz menor. Las pirámides presentan un aspecto estriado ya que están formadas por segmentos paralelos rectos de túbulos renales (Figura I5 B). El cáliz menor recibe la orina que es liberada desde el sistema colector (Schrier, R. W. y Gottschalk, C. W., 1997). Figura I5. A. Riñón humano (multilobular) y riñón de roedor (unilobular) (Giraud, S. y cols., 2011). B. Anatomía del riñón. A B Los riñones desempeñan diversas tareas por medio de una gran variedad de tipos celulares, dotados cada uno de ellos de diferentes funciones. Estas células se disponen Introducción  9 formando la unidad funcional del riñón, la nefrona, la cual está formada por el corpúsculo renal, constituido por el glomérulo y el aparato yuxtaglomerular (lugar donde se filtra la sangre), y por una porción tubular compleja, donde se produce la reabsorción de sustancias filtradas y el drenaje hasta un sistema tubular unificado. En la corteza renal, las nefronas conectan con el sistema colector, que recorre el riñón y finaliza en el túbulo colector medular interno, donde tienen lugar las últimas modificaciones del líquido para formar la orina (Cunningham, 2005; Schrier, R. W. y Gottschalk, C. W., 1997). Los túbulos renales se dividen en varias regiones. Presentan dos porciones de trayecto tortuoso (túbulos renales contorneados proximal y distal) y una porción rectilínea denominada asa de Henle (túbulos renales rectos). El aparato yuxtaglomerular, situado en el polo vascular de cada glomérulo consta de células yuxtaglomerulares, células del mesangio, y la mácula densa (Climent y cols., 2005). El riñón es un órgano de gran importancia en el mantenimiento de la homeostasis. En los mamíferos los riñones reciben aproximadamente el 25 % del gasto cardíaco y esta sangre es filtrada con el fin de eliminar los desechos metabólicos y recuperar las sustancias esenciales para el organismo, entre las que se encuentran el agua, proteínas de bajo peso molecular y diferentes electrolitos. Este órgano es capaz de detectar situaciones de déficit, exceso de agua y/o electrolitos, y modificar sus índices de reabsorción o excreción para mantener la homeostasis. Otra de las funciones de los riñones es el mantenimiento del equilibrio ácido-base, así como la producción de hormonas implicadas en el control de la presión arterial sistémica (renina), en la producción de glóbulos rojos (eritropoyetina), y la metabolización de la vitamina D3 a su forma activa (Cunningham, 2005). En la eliminación de desechos, el mantenimiento del equilibrio hidroeléctrico y acidobásico y la producción de hormonas intervienen varios mecanismos (Climent y cols., 2005; Eaton y cols., 2006): a) Filtración glomerular, pasiva y dependiente de la integridad de los elementos del glomérulo. Permite el paso de agua y sustancias disueltas, como la glucosa, urea, creatinina e iones (de los que los más importantes son sodio, potasio, cloro e hidrogeno), ácido úrico y uratos, así como proteínas de peso molecular inferior a 68 kDa (sobretodo las de carga positiva o neutra, puesto que las de carga negativa son repelidas por las glicoproteínas con carga negativa que forman parte de la membrana basal del glomérulo). Introducción   10 La filtración alcanza el 10 % del volumen de sangre que pasa por el riñón. En el caso del fosfato, aproximadamente un 5-10 % del fosfato plasmático está unido a proteínas, siendo la cantidad restante, 90-95 %, filtrada por el corpúsculo renal. b) Reabsorción tubular, por la que el organismo recupera sustancias. Puede ser pasiva (agua en el túbulo proximal, obligada por la reabsorción activa de sustancias disueltas) o activa, ligada a la actividad celular y que comprende, sodio, potasio, calcio, fosfato, glucosa, proteínas, y parte de la urea y del ácido úrico, así como el agua controlada por la hipófisis. En el túbulo proximal se reabsorbe el 65 % del filtrado glomerular, en el asa de Henle se reabsorbe un 15 % y en el túbulo distal un 10 %. Del 1 % restante, un 9 % se reabsorbe en el tubo colector, que sólo es permeable al agua en presencia de vasopresina. En condiciones normales cerca del 75 % del fosfato filtrado se reabsorbe de manera activa, casi por completo en el túbulo proximal, en simporte con sodio, por los transportadores de tipo II, especialmente el NaPiIIa (Forster y cols., 2012), la fracción no reabsorbida se elimina por orina. El tubo distal y el tubo colector cortical son impermeables a la urea, de forma que toda la que llega a ellos se elimina. Además son los principales reguladores de potasio extracelular, pues reabsorben sodio y eliminan potasio bajo el control de la aldosterona de la corteza suprarrenal. Por el contrario los tubos colectores medulares segregan activamente iones hidrógeno y son los principales responsables de la acidificación de la orina. c) Secreción tubular activa de ciertas sustancias sintetizadas por las células tubulares o tomadas de la sangre. El aparato yuxtaglomerular regula la filtración glomerular y la mantiene dentro de estrechos límites aun con amplias variaciones de la presión arterial. En el aparato yuxtaglomerular las células yuxtaglomerulares segregan renina bajo diferentes estímulos. Las células del mesangio se encargan de la secreción de eritropoyetina cuando disminuye el oxígeno arterial, y la mácula densa estimula la producción de renina en las células yuxtaglomerulares cuando disminuye la concentración de sodio, la cual mediante la activación de la angiotensina II estimula la producción de aldosterona y, en consecuencia, la retención de sodio y eliminación de potasio, lo que finalmente da lugar a la retención de agua. En la figura I6 se observan, de forma esquematizada, las funciones de los segmentos de la nefrona y de los túbulos. Introducción  11 Figura I6. Resumen de las funciones de los segmentos de la nefrona y los túbulos. Los segmentos se numeran en orden secuencial de modificación de la orina, comenzando en el glomérulo (Cunningham, 2005). Introducción   12 2. 2. INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA (IRC) 2. 2. 1. Epidemiología La insuficiencia renal crónica (IRC) constituye un importante problema de salud pública. Con el progreso de la IRC, cuando se alcanza el grado terminal, se hace necesario un tratamiento sustitutivo de la función renal mediante diálisis o trasplante renal, sólo posible en la especie humana. La IRC presenta una incidencia y prevalencia crecientes en el hombre en las últimas décadas (Hernando Avendaño, 2008). 2. 2. 2. Definición En el año 2002 la National Kidney Foundation estadounidense publicó una serie de guías de práctica clínica (K/DOQI) sobre evaluación, clasificación y estratificación de la IRC. Independientemente de la patología específica que ocasione la lesión, en estas guías la insuficiencia renal crónica en el adulto se define como la presencia de una alteración estructural o funcional (en el sedimento, en pruebas de imagen, o mediante histología) que persiste más de 3 meses, con o sin deterioro de la función renal, o un filtrado glomerular menor de 60 ml/min/1,73 m2 sin otros signos de lesión renal (por ejemplo, National Kidney Foundation, 2002). En este contexto, la hipertensión arterial y la proteinuria destacan como los predictores más potentes de progresión de la enfermedad y, a su vez, factores de riesgo modificables (Lorenzo, 2011). 2. 2. 3. Estadios evolutivos de la enfermedad En las guías K/DOQI, así como en las de la Sociedad Española de Nefrología, se fijan cinco estados evolutivos de la IRC (Tabla I1). En el estadio 1 la lesión renal da lugar a un filtrado glomerular normal o aumentado (90 ml/min/1,73m2). La enfermedad renal queda establecida por la presencia de alteraciones histológicas en la biopsia renal o mediante bioindicadores indirectos (proteinuria, alteraciones en el sedimento urinario o en imagen). En el estadio 2 la alteración renal se acompaña de una reducción ligera del filtrado glomerular (60-89 ml/min/1,73 m2). En el estadio 3 hay una disminución moderada de la filtración glomerular (30-59 ml/min/1,73 m2), presentándose un mayor riesgo de progresión de la enfermedad y de complicaciones cardiovasculares, así como la aparición de complicaciones clásicas de la insuficiencia renal, como la anemia y las alteraciones del metabolismo calcio- Introducción  13 fósforo. En el estadio 4 hay una gran disminución de la filtración glomerular (15-29 ml/min/1,73 m2), debiéndose valorar la preparación de tratamiento renal sustitutivo. En el estadio 5 la filtración glomerular es menor de 15 ml/min/1,73 m2 y es el momento de iniciar el tratamiento renal sustitutivo (National Kidney Foundation, 2002; Alcazar y cols., 2008). El cálculo del filtrado glomerular se puede realizar mediante diferentes fórmulas (Tabla I2). Tabla I1. Estadios de gravedad de la insuficiencia renal crónica (Andrés, 2004; Alcazar y cols., 2008). Fase Descripción Filtrado glomerular (FG) (ml/min/1,73 m2) Actuación 1 Daño renal con FG normal o aumentado ≥ 90 Diagnóstico y tratamiento. Tratamiento de la comorbilidad. Ralentizar la progresión. Reducir el riesgo cardiovascular. 2 Daño renal, ligero descenso de FG 60-89 Estimar la progresión 3 Descenso moderado de FG 30-59 Evaluar y tratar complicaciones 4 Descenso grave de FG 15-29 Preparación para el tratamiento sustitutivo 5 Insuficiencia o fallo renal <15 Tratamiento sustitutivo (si uremia) Tabla I2. Fórmulas más comunes para calcular el filtrado glomerular* (Andrés, 2004). 1. Aclaramiento de creatinina endógena (con recolección de orina de 24 horas): FG = Volumen orina (ml/min) x (Creatinina orina / Creatinina sérica) El resultado se debe estandarizar a la superficie corporal (SC), multiplicando por 1,73/SC 2. Fórmula de Cockcroft-Gault: FG = (140-edad) x peso (Kg) / 72 x Creatinina sérica (mg/dl) o bien (si el resultado de la creatinina se expresa en UI): FG = (140-edad) x peso (Kg) / 0,81 x Creatinina sérica (mmol/l) En las mujeres multiplicar el resultado por 0,85 3. Fórmula MDRD (Modification of Diet in Renal Disease study): FG = 170 x (Creatinina s x 0,0113)-0,999 x (edad)-0,176 x 0,762 (si mujer) x 1,18 (si raza negra) X (Urea s x 2,8)-0,17 x (Albúminas)0,318 Introducción   14 *Cuando el filtrado glomerular es bajo (<30 ml/min), el aclaramiento de creatinina o la fórmula de Cockcroft-Gault lo sobrestiman. Se aconseja entonces utilizar la fórmula MDRD, o bien la media aritmética del aclaramiento de creatinina y el de urea con recogida de orina de 24 horas; aplicando la misma fórmula 2. 2. 4. Causas de insuficiencia renal crónica (IRC) Las causas potenciales de IRC presentan notables diferencias geográficas y cronológicas. Sin embargo, existe un acuerdo general en el que la nefropatía diabética de la diabetes mellitus tipo II, envejecimiento de la población y las enfermedades vasculares renales constituyen hoy en día las causas más frecuentes de IRC. Dentro de las enfermedades vasculares renales, la mayor parte de los casos corresponde a procesos nefroangioescleróticos, tradicionalmente relacionados con hipertensión arterial, pero hoy en día está más estrechamente ligado a la arterioesclerosis generalizada y al envejecimiento (Hernando Avendaño, 2008). 2. 2. 5. Fisiopatogenia de la insuficiencia renal crónica La IRC tiende a progresar hasta uremia terminal aunque no persista la causa de la nefropatía inicial. Existen dos mecanismos básicos responsables de esta tendencia: i) las lesiones estructurales residuales producidas por la enfermedad causal; ii) numerosos datos de modelos experimentales y clínico-epidemiológicos abogan por una fisiopatología común (teoría de la hiperfiltración), independiente de la causa primaria. La reducción de la masa nefrónica desencadena en una serie de cambios adaptativos en las nefronas restantes. En el glomérulo se produce vasodilatación de la arteriola aferente, aumento de la presión intraglomerular y de la fracción de filtración. Todo ello, aunque inicialmente es un mecanismo de compensación, va seguido de proteinuria, hipertensión e insuficiencia renal progresiva. La traducción histológica es el desarrollo de glomerulosclerosis y fibrosis tubulointersticial. Los fenómenos de glomerulosclerosis y fibrosis tubulointersticial están inducidos por la angiotensina II, que activa diferentes factores de crecimiento. El más importante es el factor de crecimiento transformante (TGF-β), que inhibe la degradación de la matriz extracelular glomerular y facilita la síntesis de proteínas profibróticas. A su vez activa el Introducción  21 3. 2. SENESCENCIA CELULAR 3. 2. 1. Antecedentes históricos El biólogo alemán August Weismann realizó una crucial distinción entre la línea germinal y las células somáticas. En 1881 especuló que las células somáticas de animales superiores tenían un potencial limitado de duplicación. Weismann afirmó que “la muerte tiene lugar porque un tejido “agotado” no puede renovarse eternamente, y ello implica que la división de las células es finita”, aunque para realizar esta afirmación no aportó ninguna evidencia experimental (Weismann, 1891). Desde el punto de vista de la gerontología la Historia del cultivo celular puede dividirse en dos fases (Holliday, 1995; Arking, 1998). La primera fase comenzó en 1919 con el trabajo pionero de Ross Harrison, el cual demostró que los tejidos de vertebrados pueden mantenerse fuera del cuerpo y sus células pueden continuar creciendo y diferenciándose in vitro si se mantienen en un baño con fluidos biológicos (Harrison, 1910). Los siguientes resultados dentro de este tema fueron los presentados por Carrel y posteriormente por Ebeling, los cuales fueron capaces de mantener en cultivo células procedentes de corazón de pollo durante meses (Carrel, 1912; Ebeling, 1913), finalmente Carrel prolongó estos cultivos durante más de 30 años, lo que supera la esperanza de vida del animal donante (pollo) y llevó a concluir que las células extraídas del animal y mantenidas en cultivo bajo adecuadas condiciones eran inmortales. Un apoyo para los resultados de Carrel fue el descubrimiento de varias líneas celulares que podían crecer continuamente en cultivo sin cesar su proliferación. Las primeras de estas células fueron las L, a partir de un tumor tímico inducido en ratón (Earle, 1943), y las segundas las células HeLa, a partir de un tumor cérvicouterino de una mujer afroamericana donadora involuntaria y sin su conocimiento de células de su tumor canceroso, a partir de las cuales se estableció un cultivo (Gey y cols., 1952). Sin embargo la diferencia entre las células utilizadas por Carrel y estas células tumorales es que estas últimas son células transformadas, por lo que las teorías sobre envejecimiento no son aplicables en ellas (Holliday, 1995; Arking, 1998). Estos resultados hicieron creer, durante muchos años, que la teoría de Weismann era incorrecta. Sin embargo actualmente se sabe que los experimentos de Carrell no se llevaron a cabo de la forma que él afirmaba, sino que los procedimientos de cultivo permitían la adición Introducción   22 de nuevas células al cultivo (Hayflick, 1982), y que, en realidad, las células de pollo se dividen únicamente 30-40 veces (Gey y cols., 1974). La segunda fase de la citogerontología comenzó con los resultados experimentales de Hayflick y Moorhead (1961), los cuales demostraron que los fibroblastos humanos en cultivo se dividen un número finito de veces para cesar finalmente su crecimiento, sin ser ello consecuencia de las condiciones de cultivo (Holliday, 1995; Arking, 1998) 3. 2. 2. Comportamiento de las células en cultivo Hayflick y Moorhead (1961) dividieron los estadios del cultivo celular en tres fases (Figura I7). La primera fase supone el establecimiento del cultivo primario desde el tejido de origen. En la segunda fase las células se dividen en cultivo, siendo necesarios subcultivos. Esta fase llega hasta el momento en el que comienzan a dividirse más lentamente, lo cual marca el comienzo de la tercera fase, en la que la división se ralentiza y cesa la multiplicación, sin alcanzar la confluencia, fenómeno al que se denomina senescencia replicativa o límite de Hayflick. Estas células senescentes permanecen activas metabólicamente durante un tiempo, sin embargo no se dividen, aun en presencia de los factores de crecimiento adecuados. En el caso de las células inmortales (transformadas), éstas nunca evolucionan hasta la fase III permaneciendo indefinidamente en la fase II, manteniendo su tasa de crecimiento (Holliday, 1995; Arking, 1998) Figura I7. Fases del cultivo celular. Ejemplo de las fases de un supuesto cultivo celular, a partir de células extraídas de un determinado tejido (modificado de Arking, 1998). Introducción  23 El límite de Hayflick se ha demostrado en diferentes tipos celulares como se puede ver en la tabla I3. Tabla I3. Máximas divisiones acumuladas en cultivo para diferentes tipos celulares humanos (excepto cuando se indica otra especie) (Holliday, 1995). Tipo celular Número de divisiones máximas acumuladas (límite de Hayflick) Referencias Fibroblastos 50-100 Hayflick y Moorhead (1961 y posteriores publicaciones) Células gliales 20-30 Ponten y MacIntyre (1968) Linfocitos T 60-170 McCarron y cols. (1987) Células de músculo liso 14 Bierman (1978) Células endoteliales (humanas/bovinas) 25-35 / 18 Mueller, Rosen y Levine (1980) Queratinocitos 35-40 Rockwell, Johnson y Sibatani (1987) Células adrenocorticales 55-65 Hornsby y Gill (1978); Hornsby, Simonian y Gill (1979) Células del epitelio bronquial 35 Lechner y cols. (1981) Se ha demostrado que hay una relación directa entre el número de divisiones en cultivo y la longevidad de la especie, de modo que a mayor número de divisiones durante la vida del animal, más divisiones en cultivo (Figura I8 B) (Hayflick, 1965; Martin y cols., 1970; Rohme, 1981). Hayflick y cols. (1965) demostraron la existencia de una relación inversa entre las divisiones en cultivo y la edad del donante. Como las células obtenidas a partir de donantes de mayor edad se habrían dividido un mayor número de veces in vivo, el número de divisiones que todavía serían capaces de soportar sería menor que en el caso de un animal joven, en el que las células se habrían dividido un menor número de veces (Figura I8 A). Cabe destacar que estas diferencias se observan entre células de donantes muy jóvenes y muy ancianos, no a edades intermedias. Por ejemplo, en el caso de fibroblastos se observan diferencias entre individuos menores de 10 años e individuos a partir de 70 años, lo que dio lugar a la “hipótesis de Hayflick”, según la cual las células estarían programadas para alcanzar la senescencia (cuando han realizado un determinado número de replicaciones, Introducción   24 surgiendo el concepto de replicrómetro, en lugar de reloj biológico). Estas observaciones se han visto apoyadas por estudios posteriores (Hayflick y cols., 1965, y 1977; Goldstein y cols., 1969; Le Guilly, 1973; Goldstein, 1974; Stanley y cols., 1975; Schneider y cols., 1976; Bierman, 1978; Martin, 1979 y 1981; ). Entre ellos destaca el de Martin y cols. (1970), en el cual además de cultivar fibroblastos de diferentes edades de individuos sanos, cultivaron fibroblastos de personas con el síndrome de Werner, patología caracterizada por un envejecimiento acelerado, observándose como los fibroblastos de los individuos con esta patología alcanzan menos divisiones que los de individuos sanos (Figura I8 A) (Holliday, 1995; Arking, 1998). Figura I8. A. Relación entre el número de divisiones acumuladas y la edad del donante (Martin y cols., 1970). B. Relación entre el número de divisiones acumuladas y la longevidad de la especie, expresados como logaritmos (Rohme, 1981). 3. 2. 3. Mecanismos de inducción del proceso de senescencia La detención del ciclo celular está provocada por diversos mecanismos, destacando el acortamiento de los telómeros, inducción por estrés, y la activación de reguladores negativos del ciclo celular y de oncogenes (Figura I9) (Serrano y cols., 1997; Bodnar y cols., 1998; Rai y cols., 2009; Mackenzie y cols., 2011). El único de estos factores relacionado con la edad Introducción  25 replicativa es el acortamiento de los telómeros, dando por ello lugar a senescencia replicativa, el resto de factores pueden inducir senescencia independientemente de la edad replicativa y de la longitud de los telómeros (Serrano y cols., 2001; Minamino y cols., 2004). Figura I9. Inducción de la senescencia (modificado de Mackenzie y cols., 2011). Los telómeros han sido postulados como un reloj mitótico universal responsable de la detención del ciclo celular (Olovnikov, 1971). Los telómeros se acortan de forma paralela al envejecimiento de las células. Son estructuras localizadas en el extremo de los cromosomas, constituidos por secuencias repetidas de nucleótidos (TTAGGG en humanos) conservadas evolutivamente (Blackburn y cols., 1978; Moyzis y cols., 1988; Meyne y cols., 1989) y unidos a proteínas (shelterinas), formando un complejo que protege a los cromosomas de erosiones y fusiones entre ellos (de Lange, 2005). En contraste con la similitud de secuencia, la longitud de los telómeros varía entre especies, así como dentro de una misma especie, de un mismo organismo y entre cromosomas (Takubo y cols., 2002). Debido a la incapacidad de la DNA polimerasa de elongar estos extremos, progresivamente se van acortando con los ciclos replicativos. Cuando los telómeros llegan a una longitud crítica, la célula no es capaz de llevar a cabo más divisiones y se convierte en una célula senescente, o por otro lado Introducción   26   disfuncional. Así, una importante hipótesis sobre envejecimiento es que el acortamiento de los telómeros favorece la aparición de patologías (Oeseburg y cols., 2010). A diferencia de la DNA polimerasa existe una enzima capaz de elongar los telómeros y en ausencia de la cual los telómeros se acortan en cada duplicación: la telomerasa (Greider y cols., 1985; Blasco y cols., 1997) (Figura I10), durante un tiempo se postuló que esta enzima estaba ausente en células somáticas, pero actualmente se sabe que hay células que presentan esta enzima activa, aunque su actividad desciende progresivamente con el envejecimiento (Wright y cols., 1996). Figura I10. Replicación en presencia y en ausencia de telomerasa (modificado de Haber, 1995). También cabe destacar la existencia de estudios que contradicen la implicación directa de la longitud de los telómeros en el proceso de senescencia, recayendo en este caso la importancia de la inducción o no de la senescencia en la ausencia o presencia de la enzima telomerasa. En estos estudios se indujo senescencia por acortamiento de los telómeros mediante la inhibición de la enzima telomerasa. Sin embargo, estas mismas células se inmortalizaron aun cuando sus telómeros habían alcanzado la longitud crítica, cuando se   Introducción  27 reexpresó la enzima telomerasa, por lo que en estos estudios se concluyó que la longitud de los telómeros no actúa como un reloj mitótico, sino que es la telomerasa el factor crucial en el mantenimiento de la capacidad de multiplicación (Yang y cols., 1999; Zhu y cols., 1999; Blackburn, 2000). El acortamiento de los telómeros también da lugar a la inducción de las vías de p53 y pRb que desembocan en la inducción de senescencia (Matthews y cols., 2006; Minamino y cols., 2004). Un caso particular de senescencia es la inducida por estrés (SIPS; stress-induced premature senescence), que es consecuencia de la exposición de las células a ciertos tipos de estrés repetidos o crónicos, a dosis no letales. Ello conllevaría la acumulación de células senescentes. Estas células, a su vez, podrían ser eliminadas por las células del sistema inmune o mediante apoptosis, lo que a su vez formaría parte del envejecimiento del tejido a través de la modificación del ambiente extracelular, creando un estado micro-inflamatorio o activando a las células vecinas. En este mecanismo estaría implicada la proteína p16, la cual activaría a pRb, provocando la detención del ciclo celular; otra vía implicada es la sobreexpresión de p53, la cual tendría el mismo efecto (Brack, 2000). Otra causa de activación de senescencia, como ya se ha indicado, es la expresión de formas activadas de oncogenes, los mismos que inducen el desarrollo de tumores. Los oncogenes producen la activación de p53, así como también pueden activar p16 para activar finalmente pRb y por ambas rutas detener la progresión del ciclo celular (Minamino y cols., 2004; Abulaiti y cols., 2006; Frame y cols., 2006). Las vías de producción de senescencia son las mismas en todos los casos explicados, es decir, aunque la causa de senescencia sea diferente, las vías que la generan son las mismas para todos los casos. Siendo estas rutas las de las proteínas p16-pRb y p53-p21. Estos estímulos pueden activar a la proteína p16, la cual es un inhibidor de la kinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4). Esta kinasa, en su forma activa, se une a la proteína pRb permitiendo la fosforilación de ésta y por tanto su inactivación, continuando así el ciclo celular. La proteína p16, por medio de la inactivación de la kinasa, permite la forma hipofosforilada de pRb y su activación. En su forma activa, pRb secuestra al factor E2F (promotor del ciclo) impidiendo el desarrollo del ciclo celular. Introducción   28 Los estímulos explicados anteriormente además de activar a p16 pueden activar la proteína p53. El regulador de p53 es Mdm2, el cual activa la degradación de p53 por ubicuitinación. Bajo las señales anteriormente comentadas Mdm2 es secuestrada por p14, activándose en consecuencia p53. La proteína p53 también puede ser activada por PML (proteína de la leucemia promielocítica). p53 activa la transcripción de la proteína p21, la cual inhibe las ciclinas y a PCNA (al unirse p21 a PCNA impide la activación de la polimerasa), inhibiendo el ciclo celular. p21 también puede actuar por medio de la activación de pRb, mediante la inhibición indirecta de E2F, así como por unión a la ciclina D-CDK4/6, inhibiendo la fosforilación de pRb y, como consecuencia de ello, se detiene el ciclo celular (Alarcon-Vargas y cols., 2002; Roninson, 2002; Minamino y cols., 2004; Matthews, 2006; Cazzalini y cols., 2010; Yung y cols., 2010). Entre otros estímulos inductores de estrés se encuentran la acumulación de proteínas defectuosas. Éstas pueden ser eliminadas por proteasas, pero cuando se pierde el equilibrio entre formación y degradación de estas proteínas alteradas, tiene lugar su acumulación progresiva, hasta provocar el proceso de senescencia. Otra hipótesis sería el fallo en la replicación, como consecuencia de un bloqueo de la iniciación de la síntesis de DNA, como consecuencia de la presencia de inhibidores endógenos o por la insensibilización de las células a factores de crecimiento (Holliday, 1995). Se ha observado como la alteración de las mitocondrias puede desembocar en senescencia. Por ejemplo, las especies reactivas de oxígeno (ROS) procedentes de la cadena de transporte electrónico mitocondrial, particularmente el anión superóxido, peróxido de hidrogeno y radicales hidroxilo, pueden producir una gran variedad de daños en el DNA, incluyendo la rotura de las hebras y la modificación mutagénica de las bases. Las ROS pueden acelerar la pérdida de los telómeros durante la replicación, así como inducir senescencia prematura independientemente del acortamiento de los telómeros (en este caso senescencia prematura inducida por estrés; Chen y cols., 2001). También se ha propuesto que diversos factores epigenéticos se vean involucrados en el proceso de envejecimiento (Gravina y cols., 2009). 3. 2. 4. Bioindicadores de senescencia El fenotipo de las células senescentes está definido por una serie de características, llamadas bioindicadores (Campisi, 1999). Introducción  29 Conforme las células envejecen su potencial proliferativo disminuye progresivamente, y esto se evidencia por la disminución del número de células presentes en cada pase (Phipps y cols., 2007), así como por la disminución de la expresión de Ki67, un indicador de proliferación celular (Burton y cols., 2009). Este descenso se va produciendo hasta alcanzar la senescencia total, momento en el que las células no alcanzan la confluencia, detienen el crecimiento en fase G1, y no llegan a fase S. El freno en el ciclo es irreversible y no puede volver a estimularse con factores de crecimiento (Cristofalo y cols., 1993), aunque las células senescentes no mueren, permanecen metabólicamente activas y resistentes a la apoptosis durante largos periodos de tiempo (Goldstein, 1990; Nakano-Kurimoto y cols., 2009; Burton y cols., 2009). Mientras el daño al DNA y los cambios en la regulación del ciclo celular tienen una gran relevancia, la formación de heterocromatina asociada al proceso de senescencia (SAHF) tiene una importancia fundamental (Hornsby, 2010). Las células normales presentan una tinción con DAPI difusa, lo que se asocia con la eucromatina, en el caso de las células senescentes se observan focos puntiformes que se corresponden con la heterocromatina (Figura I11) (Rai y cols., 2012; Schotta G., 2012). Las formas activas, no fosforiladas, de la proteína Rb inducen la formación de SAHF (Park y cols., 2004; Schulz y cols., 2005; Collado y cols., 2006). Las proteínas p53, p21 y p16 son efectores importantes en la senescencia por detección del ciclo celular, de modo que se ha observado un aumento significativo de la expresión de p53, p21 y p16 en células senescentes en comparación con las jóvenes (Blackburn, 2001; Nakano-Kurimoto, 2009). En el caso de usar como bioindicadores de senescencencia estas proteínas, se debe tener en cuenta que aunque p53 y p21 son activadas inmediatamente como respuesta al daño celular, las células que han sido senescentes durante Figura I11. Tinción nuclear con DAPI, heterocromatina y eucromatina (Schotta G., 2012). Introducción   30 largos períodos pueden mostrar una expresión de p21 normal o baja, y en su lugar encontrarse incrementada la de p16 (Alcorta y cols., 1996; Robles y cols., 1998). En las células en división las proteínas nucleares Lámina A y C se ven incrementadas conforme las células acumulan divisiones (Ragnauth y cols., 2010). También se ha observado una relación entre la longitud de los telómeros y el envejecimiento. Los telómeros se van acortando progresivamente con los sucesivos ciclos de división en la mayoría de los tipos celulares (Cherif y cols., 2002; Meyne y cols., 1989), debido a la ausencia de telomerasa, o a bajos niveles de ésta (d´Adda di Fagagna y cols., 2003; Harley y cols., 1990). Las células normales son diploides, pero en cada subcultivo aumenta el porcentaje de células poliploides (Matsumura, 1980; Ravid y cols., 2004), así como las mutaciones en el DNA mitocondrial, aunque a niveles más bajos (Tanhauser y cols., 1995). Otro indicador de senescencia es la morfología. Las células senescentes son de mayor tamaño y presentan una morfología más variable que las que acumulan pocas divisiones. De hecho, un cultivo confluente de células senescentes tiene una densidad menor que un cultivo confluente de células jóvenes. A ello contribuye el hecho de que las células senescentes sean más sensibles a la inhibición por contacto célula-célula (Absher y cols., 1988; Bayreuther y cols., 1988; Cristofalo y cols., 1993), quizás como resultado de cambios en las interacciones con la matriz extracelular, o por la expresión de proteínas secretoras (Cristofalo, 1988; Cristofalo y cols., 2004). Aunque la síntesis de macromoléculas disminuye con la edad, el contenido intracelular de RNA y proteínas se incrementa. Estos incrementos podrían contribuir al incremento del tamaño celular, junto con el aumento del tamaño del núcleo y de la mayor presencia de cuerpos de inclusión, todo ello podría ser debido a una reducción de la degradación proteica en las vías mediadas por el proteasoma, disminuyendo el recambio de RNA y desacoplando el crecimiento de la división celular (y aparentemente bloqueando el ciclo en la fase G1) (Phipps y cols., 2007). Además del incremento del tamaño celular y del núcleo, se observa un incremento del tamaño de los nucleolos, aumenta la presencia de células multinucleadas, aparecen alteraciones en la cromatina, el aparato de Golgi también aumenta de tamaño, se incrementa el número de vacuolas en retículo endoplásmico y citoplasma, así como el número de microfilamentos y de lisosomas (Robbins y cols., 1970; Brunk y cols., 1973; Cristofalo y cols., 1993). Introducción  37 Se ha observado que la calcificación medial se incrementa con el envejecimiento. En un estudio realizado por Elliot y cols., se cuantificó la acumulación de calcio en la túnica media de aortas humanas, dividiendo esta capa en tres partes, túnica media interna, medial y externa. En todas las capas se observó un incremento de los depósitos cálcicos con la edad, siendo mayor en la parte medial, parte de la túnica media más rica en elastina. Los depósitos de calcio fueron aproximadamente 35 veces mayores en individuos de 90 años que en individuos de 20 años (Elliot y cols., 1994). Del mismo modo se ha observado que la incubación de aortas in vitro, con suero de individuos envejecidos, promueve la calcificación (Martin y cols., 1963). 3. 4. 3. Relación entre senescencia celular y calcificación vascular Las VSMCs senescentes adoptan un fenotipo desdiferenciado y se transdiferencian hasta llegar a un fenotipo osteogénico, provocando una reducción de la elasticidad y adaptabilidad de las arterias (Burton y cols., 2009). En vasos calcificados espontáneamente, de individuos envejecidos, se ha observado un descenso en la expresión de MGP (anticalcificante) y un incremento de la expresión de fosfatasa alcalina (ALP, procalcificante, promueve la calcificación por ruptura del pirofosfato, el cual inhibe la calcificación) (Shanahan y cols., 1999). En el caso de vasos calcificados mediante la inducción de senescencia (knock-out para Klotho, gen característico de células jóvenes) se ha observado un incremento en la expresión del factor de transcripción CBFA1 (procalcificante), lo que indica la importancia de la transición osteoblástica de VSMCs senescentes en la calcificación vascular (Nakano-Kurimoto, 2009). Se ha planteado la hipótesis de que en los vasos sanos la calcificación esté inhibida por inhibidores proteicos, y ésta comience cuando se pierde la inhibición o el equilibrio entre inhibición y calcificación se altera (Shanahan y cols., 1994; Shanahan y cols., 2000). In vitro, la calcificación ocurre cuando las VSMCs son cultivadas con un medio enriquecido en fosfato (medio calcificante). Cuando se incuba con el medio calcificante las células senescentes desarrollan calcificación con mayor rapidez que las células jóvenes. Aunque la apoptosis contribuye a la progresión de la calcificación in vitro, el número de células apoptóticas no muestra grandes diferencias entre células senescentes y células jóvenes cultivadas con un medio calcificante. Por ello se piensa que otros factores causan el aumento Introducción   38 de la calcificación en células senescentes como podría ser la transición osteoblástica (Nakano-Kurimoto y cols., 2009; Burton y cols., 2010). Genes altamente expresados en osteoblastos, tales como ALP y colágeno de tipo I, están sobreexpresados significativamente en VSMCs senescentes, sugiriendo su transición osteoblástica durante la senescencia. Se han realizado knock-down de ALP y colágeno tipo I y se ha observado una reducción significativa de la calcificación en células senescentes (Nakano-Kurimoto y cols., 2009). CBFA1, el factor de transcripción que inicia la transición osteoblástica, también se ve sobreexpresado en VSMCs senescentes, y su knock-down reduce la expresión de ALP y la calcificación en VSMCs senescentes, incrementándose a su vez la expresión de MGP (Nakano-Kurimoto, 2009). Otros factores de transcripción implicados en la transición osteoblástica son Msx2 y Osterix, los cuales no se ven incrementados en células senescentes, lo que lleva a concluir que la transición osteoblástica de VSMCs en la senescencia probablemente sea distinta de la diferenciación osteoblástica fisiológica, aunque compartan ciertos mecanismos (NakanoKurimoto y cols., 2009). La expresión de MGP, una proteína anticalcificante, se encuentra reducida significativamente en VSMCs senescentes en comparación con células jóvenes (Proudfoot y cols., 2006; Burton y cols., 2009; Nakano-Kurimoto, 2009). Algunos autores indican que la expresión del mRNA de MGP se ve reducida en la calcificación medial asociada a senescencia (Nakano-Kurimoto, 2009). Entre otros factores anticalcificantes se encuentran también las proteínas decorina y osteoprotegerina, las cuales se encuentran también inhibidas en VSMCs senescentes (Burton y cols., 2009). En relación a BMP-2, la proteína de matriz ósea de tipo 2, potente factor de diferenciación osteoblástica, algunos autores afirman que no hay diferencias en la expresión entre células senescentes y jóvenes (Nakano-Kurimoto, 2009), pero otros indican que su expresión está incrementada en células senescentes (Proudfoot y cols., 2006; Burton y cols., 2009). A pesar de las contradicciones entre estos estudios, el análisis de MGP, inhibidor de BMP2, en todos ellos reveló la represión de MGP en células senescentes, sugiriendo que si Introducción  39 BMP2 se encuentra sobreexpresado es como consecuencia de la pérdida de inhibición por MGP (Burton y cols., 2010). Algunas citoquinas y factores de crecimiento son importantes en la diferenciación osteoblástica, jugando un importante papel en la iniciación del fenotipo osteoblástico en VSMCs senescentes. La interleuquina 1-β (IL1β) se encuentra sobreexpresada en células senescentes (Minamino y cols., 2003; Burton y cols., 2009; Coppé y cols., 2010). Este incremento de IL1β podría estimular la expresión de BMP2 en VSMCs, ya que tanto IL1β como TNFα incrementan la expresión de BMP2 en condrocitos (Fukui y cols., 2003; Burton y cols., 2010). En este caso el incremento de IL1β daría lugar a la sobreexpresión de BMP2 y esto último induciría la expresión de CBFA1 (Burton y cols., 2010). 4. CALCIFICACIÓN DE LA TÚNICA MEDIA DE LA AORTA (ESCLEROSIS DE MÖNCKEBERG) 4. 1. INTRODUCCIÓN Las calcificaciones patológicas se caracterizan por el depósito de estructuras ricas en fosfatos de calcio en regiones donde estas estructuras normalmente no están presentes, y en este caso aparecen como consecuencia de reacciones inesperadas. Pueden clasificarse en función del estímulo iniciador: trauma, tumor, trastornos del metabolismo mineral, inflamación o causas idiopáticas. Varios componentes celulares se han visto involucrados en estas calcificaciones y hay evidencias que sugieren que las osificaciones y mineralizaciones patológicas son procesos regulados. En términos de estructura y análisis elemental no hay diferencias significativas entre mineralización patológica y formación del hueso (Epple & Bäuerlein, 2007). La calcificación puede denominarse como “metastática” o “distrófica”. La primera indica que la calcificación tiene lugar en tejidos normales cuando aparecen altas concentraciones de calcio y fósforo, la segunda hace referencia a la calcificación que tiene lugar en tejidos dañados con concentraciones normales de calcio y fósforo (Eisenstein y cols., 1960; Reif y cols., 1972). La calcificación vascular se considera como metastática cuando se asocia a hipercalcemia y/o hiperfosfatemia, como es el caso de la esclerosis de Mönckeberg; Introducción   40 y distrófica cuando se asocia a ateroesclerosis o cuando tiene lugar en vasos que presentan cambios degenerativos asociados al envejecimiento (Boström y cols., 2000; Shioi y cols., 2000; Boström, 2001; Demer y cols., 2003; Bonucci, 2007). La calcificación vascular puede ocurrir tanto en la túnica íntima como en la túnica media. La esclerosis de Mönckeberg es un proceso degenerativo, el cual tiene lugar en la túnica media de arterias y aparentemente no está directamente relacionado con la enfermedad inflamatoria, aunque en algunos estudios se les ha relacionado (Moe y cols., 2005). La calcificación medial arterial no se acompaña del depósito de lípidos o colesterol como en la ateroesclerosis, ni se produce la obstrucción del vaso. Preferentemente ocurre en la población envejecida, en individuos con diabetes o insuficiencia renal crónica/uremia (Trion y cols., 2004; Epple & Bäuerlein, 2007; Nakano-Kurimoto y cols., 2009). Se han descrito dos procesos patológicos diferentes involucrados en la esclerosis de Mönckeberg, asociados a los depósitos minerales. Por un lado, un proceso degenerativo que daría lugar a apoptosis o necrosis de las VSMCs de la túnica media, y por otro, un proceso de transdiferenciación de las VSMCs, las cuales expresarían un fenotipo osteogénico (Epple & Bäuerlein, 2007). 4. 2. CARACTERIZACIÓN DE LAS CALCIFICACIONES 4. 2. 1. Fase inorgánica La naturaleza y composición de los depósitos inorgánicos encontrados en la aorta parecen no diferir en gran medida de los depósitos inorgánicos en tejidos óseos. Los depósitos encontrados tienen una estructura igual a la hidroxiapatita (Ca5(PO4)3OH) o muy similar (Bonucci, 2007) (Figura I13). Por ejemplo, la hidroxiapatita es el mineral predominante en calcificación medial asociada a diabetes, pero en determinadas situaciones como intoxicación por vitamina D, la whitlockita es el más abundante (Verberckmoes y cols., 2007). Generalmente se ha asumido que las modificaciones en la estructura de la hidroxiapatita suelen ser consecuencia de la presencia de iones impuros o defectos en su formación, en algunos casos dando lugar a compuestos más solubles y con un grado variable de cristalización dependiente del tiempo (Fitzpatrick y cols., 1994; Tomazic, 2001; Bonucci, 2007). Pueden existir varios precursores de la biomineralización, uno de ellos es el fosfato de octacalcio (fosfato de calcio ácido), Ca8H2(PO4)6*5H2O. Otro de sus precursores es el fosfato Introducción  41 Figura I14. Cristales de fosfato de octacalcio en forma de placas, observados mediante microscopía electrónica (Mats y cols., 1992). de di-calcio di-hidratado (brusita), CaHPO*2H20. Ambos fosfatos precipitan en primer lugar para ser, posteriormente, hidrolizados in situ y transformados en un producto intermedio entre ambas formas e hidroxiapatita, siendo muy lenta la maduración hasta hidroxiapatita (Brown y cols., 1987; Mats y cols., 1992). Figura I13. Proyección, eje c, de la estructura de la hidroxiapatita. Se muestran seis unidades celulares. Los átomos sombreados definen la región de estructura similar entre hidroxiapatita y fosfato de octacalcio (Brown y cols., 1987). En las calcificaciones vasculares pueden encontrarse varios tipos de cristales. Cristales en forma de agujas, como los presentes en hueso y cartílago, se han encontrado en aortas de conejos tratados con vitamina D (Eisenstein y cols., 1964) y en arterias arterioscleróticas (Daoud y cols., 1985; Tanimura y cols., 1986). En arterias humanas estos cristales forman placas redondeadas (Figura I14) o con forma de plaqueta, agregados de forma similar a los nódulos presentes en calcificaciones de hueso y cartílago, teniendo estos cristales un tamaño máximo de 8 x 80 x 200 μm (Paegle, 1969; Mats y cols., 1992). (Bonucci, E., 2007). Introducción   42 4. 2. 2. Matriz calcificante Las fibras elásticas arteriales son consideradas como las primeras estructuras donde se produce el depósito de las sustancias inorgánicas (Seifert y cols., 1966). Existe una estrecha relación entre las estructuras cristalinas inorgánicas y los filamentos de elastina (Bonucci y cols., 1975), aunque la calcificación está relacionada, más bien, con el material que recubre las láminas elásticas que directamente con ellas (Martin y cols., 1963; Gardner y cols., 1968). En algunos de los casos en los que aparecen calcificadas las fibras elásticas, la sustancia inorgánica se ha relacionado con polianiones resistentes a la hialuronidasa (MartinezHernandez y cols., 1974). (Bonucci, 2007). Existen varios estudios en los que se han eliminado selectivamente varios compuestos de la aorta mediante el uso de enzimas proteolíticas. De estos estudios se ha concluido que la presencia de elastina es un requisito para el inicio de la mineralización, a diferencia del colágeno, el cual parece no estar implicado en el proceso de iniciación, sino en un proceso secundario (Martin y cols., 1963). La degradación de la elastina tiene lugar en muchos procesos que cursan con calcificación medial, liberando metabolitos que pueden activar, incluso nuclear, el depósito de calcio (Price y cols., 1998; Dao y cols., 2005; Essalihi y cols., 2005; Bailey y cols., 2004; Lomashvili y cols., 2004; O´Neill, 2007). La matriz de elastina intacta estabiliza el fenotipo de las VSMCs, de modo que su degradación está asociada a patologías. Paralelamente a la degradación de elastina se ha observado el incremento de la expresión de osteogenes, contribuyendo así a la calcificación, y la activación de la metaloproteinasa-9, una elastasa que continuaría con la degradación de la propia elastina (Lee y cols., 2006; Qin y cols., 2006). Aunque se ha demostrado que las fibras elásticas participan en la calcificación (Meyer y cols., 1967; Paule y cols., 1992) se sospecha también que el resto de estructuras de la capa media, eventualmente, también pueden estar implicadas en la progresión de la calcificación (Eisenstein y cols., 1964). (Bonucci, 2007). Finalmente, las propias VSMCs, incluso la población de células madre relacionadas con la aorta (Campbell y cols., 2000) y los pericitos (Collet y cols., 2005), podrían contribuir a la calcificación gracias a la transdiferención y expresión de un fenotipo osteogénico (Shanahan y cols., 1999; Tintut y cols., 2003; Tyson y cols., 2003; Davies y cols., 2005), Introducción  43 modificación de la matriz, e iniciación de los depósitos hasta dar lugar a la estructura final de hidroxiapatita (Bonucci, 2007; Villa-Bellosta y cols., 2011b). 4. 3. IMPLICACIÓN DE LA TRANSDIFERENCIACIÓN DE VSMCs EN LA CALCIFICACIÓN MEDIAL La calcificación vascular es un proceso complejo, razón por la cual todavía existen dos teorías diferentes que buscan dar explicación a su origen (Epple & Bäuerlein, 2007): - Sólo osteoblastos, odontoblastos y condrocitos hipertróficos tendrían la capacidad de producir factores que inducirían la mineralización de la matriz extracelular. Según esta teoría, la mineralización de la aorta estaría inducida activamente como consecuencia de la transdiferenciación osteoblástica, bajo determinadas circunstancias. - Sólo las células no esqueléticas, como es el caso de las VSMCs, producirían factores que evitarían la mineralización de la matriz extracelular. Según esta teoría, la mineralización patológica es activamente inhibida por la presencia de dichos inhibidores, mientras la mineralización fisiológica es explicada por la ausencia de inhibidores, del mismo modo que ocurre en la calcificación vascular. En relación con estas dos teorías, se han encontrado factores de regulación ósea en los vasos sanguíneos, particularmente en lugares de calcificación medial, así como inhibidores de la calcificación en vasos sanos (Shanahan y cols., 1999; Tyson y cols., 2003; Bostrom, y cols., 1993). La expresión de los bioindicadores de VSMC, como SM22α y α-actina, se ve intensamente reducida durante la mineralización, mientras que se incrementa la de genes normalmente restringidos a la mineralización de tejidos como hueso y diente, como son BMP2, Msx2, CBFA1, fosfatasa alcalina y osteocalcina. Además, también se ve alterada la presencia de inhibidores de la calcificación, como serían la osteopontina, osteoprotegerina, pirofosfato inorgánico, MGP y fetuina. En general, estos cambios indicarían la pérdida del fenotipo contráctil de VSMCs, para transdiferenciarse y obtener un fenotipo osteo/condrogénico. La osteoprotegerina (OPG) es una glicoproteína soluble, miembro de la superfamilia TNF, que inhibe la calcificación por medio del eje OPG/RANKL/RANK (Bucay y cols., Introducción   44 1998; Papadopouli y cols., 2008). OPG es una proteína homóloga al Receptor Activador del factor Nuclear κβ (RANK), proteína transmembranosa, la cual por tanto puede unirse a su ligando, la proteína soluble RANKL, bloqueando la unión entre RANK y RANKL, resultando en la inhibición de la diferenciación osteoblástica. Además de a RANKL, OPG se une a TRAIL, neutralizando a este factor pro-apoptótico (Lacey y cols., 1998). La osteopontina (OPN) constituye otro de los anticalcificantes implicados en la inhibición del proceso, es una fosfoproteína, la cual no está expresada en vasos sanguíneos normales, mientras sí se encuentra sobrerregulada en lugares de calcificación arterial, como se ha observado en pacientes urémicos, con fallo renal o diabetes (Ahmed y cols., 2001; Moe y cols., 2002). A partir de estudios in vivo e in vitro se ha concluido que OPN no sólo inhibe el crecimiento del cristal por unión directa al calcio de la superficie del mismo, sino que también promueve activamente su disolución al favorecer la acidificación del medio extracelular tras inducir la expresión de la anhidrasa carbónica II (Steitz y cols., 2002; Speer y cols., 2002). Para llevar a cabo la inhibición de la calcificación es necesario que la OPN se encuentre fosforilada en residuos serina y treonina (Jono y cols., 2000). Por tanto, factores que impiden su correcta fosforilación, como la ALP, inhiben su acción anticalcificante (Essalihi y cols., 2004; Lomashvili y cols., 2004). Se ha observado que la deficiencia de OPN en ratones no produce calcificación vascular por sí sola, pero acelera la calcificación si se encuentra ausente en ratones deficientes en MGP (Speer y cols., 2002). A partir de estos resultados se sugiere que OPN no es un inhibidor endógeno de la calcificación en vasos normales, sino que quizás su acción se centra en la modulación de la calcificación en un estado más avanzado, ya que solamente está presente en vasos calcificados, no en vasos sanos. Otro hecho que apoya esta teoría es la ausencia de calcificación por su sola inhibición, requiriéndose conjuntamente la deficiencia de MGP para desarrollarse calcificación (Lomashvili y cols., 2004). El pirofosfato inorgánico (PPi), es una pequeña molécula constituida por dos iones fosfato unidos por un enlace éster, el cual inhibe la calcificación a través de su propia acumulación en las regiones a calcificar, se une a los cristales de hidroxiapatita por sus grupos fosfato con afinidad por calcio y previene la incorporación de iones fósforo en estos cristales (Fleisch y cols., 1962; Price, 1989; Terkeltaub, 2001; Murshed y cols., 2005; Proudfoot y cols., 2006). También se ha demostrado que la ausencia de calcificación en condiciones normofosfatémicas es consecuencia de la presencia de PPi y otros factores Introducción  45 anticalcificantes (Villa-Bellosta y cols., 2011b). La ausencia de la enzima responsable de la síntesis de PPi, la ectonucleótido pirofosfato/fosfodiesterasa-1, NPP1, y del transportador de pirofosfato, la proteína ANK, produce calcificación medial severa al impedir su liberación desde la célula al medio extracelular (Rutsch y cols., 2001; Johnson y cols., 2005). Por ello, la presencia de pirofosfatasas, como la fosfatasa alcalina (ALP), promovería la calcificación por hidrolisis del pirofosfato (Lomashvili y cols., 2004, 2005 y 2008). La proteína de matriz Gla (MGP) es un inhibidor de la calcificación dependiente de la vitamina K, y para encontrarse activa debe ser γ-carboxilada, en una reacción mediada por esta vitamina (Hao y cols., 1995). De hecho, ratas tratadas con warfarina, un antagonista de la vitamina K, desarrollan calcificación vascular medial (Price y cols., 1998 y 2006), tanto por falta de carboxilación como por inhibición directa de la síntesis de MGP, como se ha demostrado en un reciente estudio (Lomashvili y cols., 2011). Además, ratones que presentan delección del gen de MGP presentan una calcificación severa (Luo y cols., 1997). Humanos con una mutación que altera la formación de MGP (síndrome de Keutel) también desarrollan calcificación vascular medial, pero en menor grado que por delección (Hao y cols., 1995; Meier y cols., 2001). En el caso de aortas calcificadas algunos autores indican que se observa un descenso de MGP inversamente correlacionado con el grado de calcificación, mientras otros indican que esta proteína aparece sobrerregulada en vasos calcificados (Shioi y cols., 1995; Mori y cols., 1998; Tintut y cols., 1998; Steitz y cols., 2001; Moe y cols., 2004). En caso de ser anticalcificante, lo esperable habría sido la ausencia de MGP en los vasos calcificados, sin embargo los vasos urémicos no sólo no son deficientes en MGP, sino que se encuentra sobrerregulada, particularmente en los lugares de calcificación (Lomashvili y cols., 2006). Una posible explicación sería que no se llevase a cabo la γ-carboxilación, sin embargo recientemente se ha comprobado que ésta si se lleva a cabo, y que es posible determinar la presencia tanto de la forma carboxilada, GlaMGP (MGP con residuos Gla, ácido carboxiglutámico), como GluMGP, no siendo por tanto la ausencia de carboxilación la causa primaria de la calcificación en este caso (Lomashvili y cols., 2011). El mecanismo por el que MGP inhibe la calcificación no está claro, aunque parece ser por unión a la hidroxiapatita (Roy y cols., 2002), lo que se corroboraría por la presencia de MGP en aortas calcificadas, siendo su contenido proporcional al contenido de hidroxiapatita (Price y cols., 2000) y por la alta concentración de MGP alrededor de los depósitos de hidroxiapatita (Shanahan y cols., 1999; Spronk y cols., 2001). Introducción   46 Otro mecanismo de acción que se ha propuesto para MGP es la inactivación de BMP2, por unión a él (Wallin y cols., 2000; Boström y cols., 2001). BMP2 es un potente inductor de la diferenciación osteoblástica de los precursores mesenquimales de las células a través de la activación de CBFA1 y Msx2 (Lee y cols., 2000; Hruska y cols., 2005). El resultado de la inactivación de BMP2 por MGP ha sido propuesto a partir de estudios in vitro (Boström y cols., 2001; Zebboudj y cols., 2003). Sin embargo los resultados en vasos sanos no apoyan esta teoría, ya que los tratamientos con warfarina y la consiguiente inactivación de MGP, no tienen efecto sobre la transcripción de CBFA1 (Romberg y cols., 1986). La discrepancia entre los resultados in vitro e in vivo apoya la teoría de que MGP previene la calcificación medial por unión directa a la hidroxiapatita, inhibiendo su formación, lo que también es apoyado por el incremento del contenido de MGP en aortas calcificadas (Romberg y cols., 1986). Los resultados en cultivo sugieren que la deficiencia de PPi, pero no de MGP, es suficiente para producir calcificación, y que la deficiencia de PPi es necesaria para que se produzca la calcificación en ausencia de MGP (Loshmavili y cols., 2011), aunque la importancia relativa de PPi y MGP no están claras in vivo (Luo y cols., 1997; Price y cols., 1998; Rutsch y cols., 2001; Johnson y cols., 2005). En contraste con OPN, OPG, PPi y MGP, que ejercen su acción en la pared de los vasos, la fetuina, también conocida como glicoproteína α2-Heremans-Schmid (Ahsg), es un inhibidor de la calcificación circulante. In vitro, la fetuina inhibe la formación de novo de los cristales de hidroxiapatita, pero no afecta a los ya formados. In vivo se ha demostrado como los ratones deficientes en fetuina desarrollan una intensa calcificación de los tejidos blandos (Heiss y cols., 2003; Ketteler y cols., 2003 y 2005; Johnson y cols., 2006). El complejo MGP-fetuina en suero parece que evita la propagación del fosfato de calcio precipitado (Price y cols., 2002), aunque la función de MGP en este complejo no está clara. En los vasos sanguíneos, algunos estímulos promueven la transferenciación osteogénica de las VSMCs (Reynolds y cols., 2004; Chen y cols., 2006; Byon y cols., 2008). La familia de proteínas BMP (proteínas morfogenéticas del hueso) está constituida por conocidos inductores de calcificación ectópica (Wang y cols., 1990). Las BMPs son una gran subclase de la superfamilia de factores de crecimiento β, TGFβ, conocida como Introducción  53 5. 3. TOXICOCINÉTICA Las formas inorgánicas de arsénico son absorbidas (80-90 %) en el tracto gastrointestinal y distribuidas a través del organismo. Los compuestos de arsénico de baja solubilidad, como por ejemplo el trióxido de arsénico, son absorbidos menos eficientemente tras la exposición oral. Los compuestos de arsénico también se pueden absorber vía dérmica, dando lugar a toxicidad sistémica. La absorción vía respiratoria depende del tamaño de la partícula y de su forma química. La excreción urinaria es la forma principal de eliminación de estos compuestos, y su determinación sirve para el diagnóstico de intoxicación reciente, mientras que para detectar intoxicaciones lejanas en el tiempo la muestra de elección es pelo o uñas, ya que es el lugar de acumulación en humanos (Casarett y Doull’s, 2008). La metilación de las formas inorgánicas se ha considerado durante mucho tiempo un proceso de detoxificación, pero en este momento ya no es así, ya que se ha identificado una alta toxicidad de las formas arsenicales metiladas. El arseniato (AsV) rápidamente es reducido a arsenito (AsIII) por la arseniato reductasa. AsIII es secuencialmente metilado a metilarseniato (MMAV) y ácido dimetilarsénico (DMAV) por la enzima arsénico metiltransferasa o arsenito metiltransferasa, usando como cofactor el donador de grupos metilo S-adenosilmetionina (SAM). En el metabolismo de estos compuestos se forman MMAIII y DMAIII de alta toxicidad (Figura I18) (Aposhian y cols., 2006; Thomas y cols., 2007; Casarett y Doull’s, 2008). Figura I18. Metabolismo del arsénico. GSH, glutatión reducida; GSTO1, glutatión Stransferasa ω1; SAM, S-adenosilmetionina; SAH, S-adenosilhomocisteina; AS3MT, arsénico metiltransferasa (Cyt19); TMAO, oxido trimetilarsénico (Casarett y Doull’s, 2008). Introducción   54 5. 4. TOXICIDAD El arsénico tiene una gran cantidad de efectos tóxicos, destacando su vasculotoxicidad (Balakumar y cols., 2009; States y cols., 2009). Algunos de los mecanismos descritos de toxicidad vascular por arsénico incluyen la inhibición de la producción de oxido nítrico a través del bloqueo de la oxido nítrico sintetasa, lo que afecta a la vasodilatación de las células endoteliales (Kumagai y cols., 2004). El arsenito también incrementa la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) tras la activación de la NADPH oxidasa, y este aumento indirectamente incrementa la permeabilidad endotelial mediante la inducción de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Bao y cols., 2010). Además de estos efectos, el arsénico exacerba las lesiones ateroscleróticas por medio del incremento de la proliferación de VSMC, la generación de estrés oxidativo, y la inducción de la expresión de factores de crecimiento (TGF-), citoquinas proinflamatorias (TNF-, IL-6, IL-8), proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), etc. (Simeonova y cols., 2004; Balakumar y cols., 2009). La hipertensión y la vasoconstricción son otros indicadores de la exposición al arsénico, varias especies y metabolitos han demostrado inducir estas condiciones (Lee y cols., 2005; Park y col., 2005; Lim y cols., 2011). La apoptosis de VSMC también se ha implicado en la vasculotoxicidad del trióxido del arsénico, con un aumento concomitante de ROS y de calcio intracelular, in vitro (Li y cols., 2010). De manera similar, se ha observado la inducción del estrés de retículo endoplásmico en varios tipos de células expuestas a arsénico (Yen y cols., 2012), observándose esta alteración también en otros trastornos vasculares (Duan y cols., 2009). En resumen, los diversos mecanismos que se han observado durante la vasculotoxicidad del arsénico incluyen apoptosis, estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico, mediadores de la inflamación, etc. Estos fenómenos se han observado también en trastornos vasculares degenerativos, como la calcificación vascular medial (Ketteler y cols., 2011). Introducción  55 6. FLÚOR 6. 1. DEFINICIÓN El flúor es un elemento no metal halogenado. Los fluoruros son compuestos tanto orgánicos como inorgánicos, los cuales contienen en su composición este elemento. El ion flúor es un componente esencial para la normal mineralización de huesos y esmalte dental, por lo que ha sido ampliamente usado para reducir la prevalencia y severidad de la caries dental, sobretodo en zonas de alta prevalencia de consumo de azúcar. Este compuesto, con el fin de prevenir la caries, puede ingerirse en distintas presentaciones farmacéuticas, o aplicarse localmente en forma de geles, enjuagues y pastas dentales. En algunos países, tanto ácido fluorosílico como fluorosilicato de sodio, han sido usados en la fluoración de las aguas desde 1940 para mejorar la salud dental (Casarett y Doull’s, 2008). La Organización mundial de la Salud (OMS) fija como límite máximo en aguas fluoradas 1,5 mg F-/l. Por lo general la concentración de flúor en aguas fluoradas se encuentra en un rango entre 0,5 (mínima concentración que da lugar a efectos beneficiosos) y 1 mg/l (WHO, 2008). La ingestión adecuada de flúor es de 0,05 mg/kg/día en adultos, siendo esta dosis menor en niños (Ziegler y cols., 1996; ATSDR, 2003). La presencia de flúor en el agua no es únicamente consecuencia de su adición intencionada para fluorizarla, también puede estar presente en las aguas a partir de fuentes naturales. Junto con la ingestión de flúor en el agua, éste es ingerido a partir de los alimentos, todos ellos contienen al menos trazas de flúor, una fuente importante son los vegetales que captan este elemento de suelo y agua (WHO, 2008). 6. 2. TOXICOCINÉTICA Los fluoruros son absorbidos en el tracto gastrointestinal con un porcentaje entre 75 y 90 %. Una vez absorbidos son rápidamente distribuidos a través del organismo. La concentración de flúor en tejidos y fluidos corporales está directamente relacionado con la ingesta y no con la regulación homeostática (Casarett y Doull’s, 2008; Palmer y cols., 2012), y constituye un bioindicador de exposición aguda, mientras que el pelo, las uñas y el esmalte dental son indicadores de la respuesta a largo plazo (ATSDR, 2003). Introducción   56 Aproximadamente el 99 % del flúor en el organismo se localiza en huesos y dientes. El ion fluoruro es incorporado en el hueso por reemplazamiento del ion hidroxilo de la hidroxiapatita para formar hidroxifluoropatita (Figura I19). El ion flúor puede ser eliminado lentamente del hueso como resultado del proceso de remodelación ósea, especialmente en niños. Su excreción es principalmente vía urinaria, se filtra libremente en el glomérulo, y el grado de reabsorción tubular está inversamente relacionada con el pH del fluido tubular. Aproximadamente el 50 % del flúor ingerido es eliminado, y el otro 50 % es retenido en tejidos calcificados. En el caso de los niños el porcentaje retenido es mayor, pudiendo ascender hasta el 80 %, debido a que fisiológicamente sus huesos y dientes se encuentran en desarrollo, por el contrario, en individuos de mayor edad la excreción puede ser superior al 50 % (Casarett y Doull’s, 2008; Palmer y cols., 2012). Figura I19. Estructura tridimensional de la fluoroapatita. Eje c, mostrando un tetraedro iónico de grupos fosfato, iones calcio y flúor. Los grupos hidroxilo de la hidroxiapatita son sustituidos por flúor. El paralelogramo muestra una unidad celular (Wopenka y cols., 2005). 6. 3. TOXICIDAD Las concentraciones de flúor que se utilizan para fluorar las aguas dan lugar a efectos beneficiosos, sin embargo concentraciones elevadas (superiores a 3-6 mg/l en la especie humana) durante largos periodos de tiempo, pueden dar lugar a efectos adversos, desarrollándose tanto fluorosis esquelética como dental (WHO, 2008). En relación con la calcificación, esta patología produce debilidad de los dientes y, en el caso del hueso, en una primera fase puede aparecer aumento de la masa ósea, aunque en fases posteriores se asocia con osteoporosis, debilidad ósea, fracturas, osteoesclerosis de la pelvis renal, calcificación de ligamentos, articulaciones, etc. (Kaminsky y cols., 1990; Casarett y Doull’s, 2008). Introducción  57 6. 4. RELACIÓN CON LA CALCIFICACIÓN 6. 4. 1. Calcificaciones fisiológicas Se ha demostrado que una dosis adecuada de flúor tiene un efecto positivo en el tejido óseo, ya que estimula la proliferación de los osteoblastos e incrementa el depósito de nuevo mineral en el hueso. Estos efectos beneficiosos parecen ser consecuencia de la incorporación del ion flúor en los cristales óseos, lo que incrementaría el tamaño de los mismos y reduciría la solubilidad de los cristales de apatita. Los cristales de mayor tamaño son más resistentes a la acción de los osteoclastos. Cabe destacar que las concentraciones utilizadas para fluorar el agua, aunque sí son adecuadas para la protección dental, no son suficientes para producir estos efectos beneficiosos en el tejido óseo, requiriéndose concentraciones mayores (Palmer y cols., 2012). En el diente el flúor incrementa la mineralización y remineralización, disminuye y revierte la desmineralización, e inhibe el metabolismo de las bacterias productoras de ácido, responsables de la caries dental (Wynn, 2002). El ion flúor se incorpora al esmalte en el diente en desarrollo antes de su erupción, dando lugar a una estructura más resistente a la caries. También se ha encontrado este efecto positivo sobre dientes post-erupcionados, aunque en este caso debido a la aplicación tópica (CDC, 2001, Singh y cols., 2004). Tras la erupción del diente el mecanismo de acción del flúor ingerido vía sistémica es diferente, éste es secretado por la saliva y contribuye a la protección tópica frente a la caries, al reducir la secreción de ácido por parte de las bacterias, y al aumento de la remineralización de lesiones tempranas (Gleen, 2002; Singh y cols., 2004). 6. 4. 2. Calcificaciones vasculares Existen estudios en los que se ha observado que el tratamiento de ratas con flúor reduce el grado de calcificación vascular (Zipkin y cols., 1969; Luoma y cols., 1975), aunque estos estudios no representan el efecto real de las aguas fluoradas sobre la calcificación vascular, ya que se utilizaron concentraciones elevadas, las cuales podrían llegar a desarrollar los efectos secundarios del tratamiento con este elemento, siendo por tanto la reducción de la calcificación consecuencia de ellos. Es decir, sería necesario valorar el impacto del flúor en la calcificación vascular utilizando dosis no tóxicas, principalmente las presentes en aguas fluoradas. Introducción   58 II. OBJETIVOS ! Objetivos  61 Esta tesis doctoral consta de tres partes en torno a la calcificación vascular medial. Por ello, los objetivos han sido también divididos en sendas secciones: PARTE I. ENVEJECIMIENTO DE LAS VSMCs Muchos de los resultados sobre el comportamiento de las células en cultivo, que aparecen en la bibliografía consultada, hacen referencia a tipos celulares diferentes de células vasculares de músculo liso (VSMCs). En el caso de VSMCs, los resultados obtenidos hasta el momento por otros grupos se han centrado principalmente en la senescencia en función del número de divisiones celulares o envejecimiento replicativo a lo largo del cultivo, en lugar de estudiarla en función de la edad del donante. El objetivo fundamental de esta primera parte es estudiar las diferencias entre células de donantes (ratas macho) de diferente edad (dos, doce y veinticuatro meses), y compararlas con las observadas a lo largo del cultivo, por medio del estudio de la relación entre envejecimiento y calcificación vascular, y entre envejecimiento y transdiferenciación celular. Para este estudio se ha marcado una serie de objetivos parciales: 1. Extracción de células del músculo liso de la aorta (VSMCs) de ratas Wistar macho de dos, doce y veinticuatro meses de edad. 2. Cultivo seriado de VSMCs hasta alcanzar la senescencia, y en distintos momentos de su vida replicativa realización de los siguientes estudios: a. Análisis de la expresión de bioindicadores de músculo liso (α-actina y SM22α) mediante PCR en tiempo real, análisis inmunoadsorbente (Western-blot), y microscopía inmunofluorescente. b. Determinación del grado de senescencia en cultivo, mediante la tinción de la actividad β-galactosidasa, por expresión de lámina A/C y p21, mediante Western-blot y microscopía inmunofluorescente. c. Evaluación del estrés oxidativo mediante expresión de p38 fosforilada mediante Western-blot. 3. Conocer el efecto de la senescencia sobre la calcificación de VSMCs por expresión de bioindicadores osteogénicos mediante PCR en tiempo real y cuantificación de los depósitos de calcio en condiciones calcificantes. Objetivos   62 PARTE II. INFLUENCIA DEL ARSÉNICO EN LA CALCIFICACIÓN VASCULAR Y SENESCENCIA DE VSMCs La senescencia celular puede ocurrir por distintos mecanismos, de manera cronológica (como consecuencia de la edad) y como senescencia prematura inducida por el estrés (SIPS). Este estudio se realizó en una primera fase in vitro. El objetivo fundamental de esta segunda parte es determinar si los diferentes compuestos de arsénico (AsIII, AsV, MMA, DMA) son capaces de inducir senescencia y calcificación vascular, y a qué concentración producen SIPS sin desencadenar otros efectos citotóxicos. Para ello se fijó una serie de objetivos parciales: ESTUDIO “IN VITRO”: 1. Determinación de la concentraciones de los diferentes compuestos a las que no producen efectos tóxicos, mediante evaluación de la actividad de la lactato deshidrogenasa intracelular (LDH) liberada al medio de cultivo. El resto de estudios se llevará a cabo con concentraciones no citotóxicas determinadas en estos estudios. 2. Análisis del efecto del arsénico sobre la producción de SIPS en VSMCs, mediante: a. Tinción de -galactosidasa asociada al envejecimiento. b. Determinación de la expresión de proteínas asociadas al proceso de senescencia como Lámina A/C y p21, tanto por Western-blot como mediante inmunofluorescencia. c. La senescencia está asociada a desdiferenciación celular, por lo que se estudiará el efecto del arsénico sobre bioindicadores de músculo liso de aorta, como -actina, SM22 y calponina, por Western-blot, PCR en tiempo real e inmunofluorescencia. d. Se conocen los efectos del resveratrol como agente anti-envejecimiento, por lo que en el caso de que el arsénico produjera SIPS se estudiaría la reversión del proceso con resveratrol. 3. Entre los factores relacionados con la calcificación vascular se encuentra el envejecimiento, por lo que se determinará el efecto del arsénico sobre la calcificación de VSMCs, como consecuencia de la inducción de senescencia, mediante: a. Cuantificación de la expresión de genes relacionados con el proceso de calcificación. Material y Métodos ! 69! • Para las determinaciones espectrofotométricas se utilizaron dos modelos de espectrofotómetro. Un espectrofotómetro de la marca Bio-Rad (Hercules, EE.UU) tipo SmartSpec 3000 para cuantificar RNA, usando cubetas de cuarzo de 10,00 mm, y un espectrofotómetro para microplacas de la marca Beckman Coulter (Brea, EE.UU), modelo DTX 880, con el que se cuantificaron el resto de muestras, mediante el programa Multimode Detection software de Beckman Coulter versión 2.0.0.10 del año 2004. • Se emplearon dos tipos de centrifugas. Una minicentrífuga de marca Eppendorf (Nueva York, EE.UU.) modelo 5415R con selección de temperatura, y otra de marca Selecta, modelo Mixtasel, para la centrifugación de células vasculares de la aorta en el proceso de extracción. • Las transcripciones reversas y tratamientos con DNasa se realizaron en un termociclador tipo MJ Mini de Bio-Rad. • Las electroforesis de RNA se realizaron con geles de agarosa en cubetas horizontales, modelo Mini Sub DNA Cell de Bio-Rad y Hoeffer HE33 Mini Horizontal Submarina Unir de Amersham Biosciences. • La agarosa utilizada para los geles se disolvió en un horno microondas Fagor. • Las fuentes de alimentación para electroforesis fueron de la firma Bio-Rad modelo Power/Pac 300 y Power/Pac 1000, y de la firma Pharmacia Biotech, modelo EPS 300. • Para la electroforesis de proteínas se utilizó una cubeta Mini Protean Tetra Cell de BioRad. Para la transferencia a membrana durante un primer periodo se usó una cubeta Mini Trans Blot-Mini Protean II, también de Bio-Rad, procedimiento de transferencia húmeda. Posteriormente se cambió a un nuevo sistema de transferencia semi-seca Trans-Blot Turbo, de Bio-Rad. • La visualización del RNA en geles de agarosa se consiguió mediante la tinción con bromuro de etidio y excitación con luz ultravioleta mediante el sistema GelDoc 1000 de Bio-Rad y el programa informático Quantity One, versión 4.6.9, de Bio-Rad. • La detección de la quimioluminiscencia emitida en los western blots se realizó mediante el sistema VersaDoc 400 MP de Bio-Rad, la captura se realizó con el programa Quantity One, versión 4.6.9 y el análisis con el programa Image Lab, versión 2.0.1, ambos de BioRad. • La PCR en tipo tiempo real se llevó a cabo en un LightCycler 1.5 de Roche (Basilea, Suiza). El análisis de datos se realizó con el programa LightCycler Software versión 4.05, también de Roche. Material y Métodos ! 70! • El trabajo en cultivos celulares se realizó en un laboratorio exclusivo para ese uso. Las manipulaciones de las células se realizaron en una campana de flujo laminar vertical marca Telstar modelo bio-II-A (Tarrasa, España). Las incubaciones de las células se llevaron a cabo en un ambiente de CO2 al 5 % y a 37 ºC mantenidas en una estufa de CO2 de la marca Barnstead/Labline. Las balas de CO2 fueron proporcionadas por Air Liquide S. A. (Zaragoza, España). Para el mantenimiento de células congeladas se utilizó nitrógeno líquido (adquirido al Servicio de líquidos criogénicos de la Universidad de Zaragoza) en un tanque Statebourne Borack 2400 (Washington, EE.UU), previa congelación a -80 ºC en un contenedor de congelación 5100 Cryo 1°C Mr. Frosty de Nalgene (Rochester, USA). La observación de las células se realizó con un microscopio invertido de Lan Optics (Esparza de Galar, España). El conteo de las células se llevó a cabo con una cámara de Neubauer marca Marienfeld (Lauda-Königshofen, Alemania). • Para la limpieza de las aortas se usaron lupas marca Zeiss (Oberkochen, Alemania), modelo StemiDV4. • La toma de imágenes se realizó con un microscopio electrónico Zeiss Axiovert 200M acoplado a una lámpara de fluorescencia FluoArc, cámaras AxioCam HRC y MRm y a un sistema de Apotome, todos ellos de Zeiss. El programa de tratamiento de imágenes fue AxioVision 4.1 de Zeiss. Los reactivos, kits y disoluciones se guardaron a temperatura ambiente o refrigerados a 4 ºC según su conveniencia. Los kits de RNA se almacenaron a -20 ºC. Las muestras se conservaron a -20 ºC, excepto las de RNA que se guardaron a -80 ºC, todo ello en frigoríficos/congeladores de las marcas Fagor y Liebherr (Bulle, Suiza), congeladores de -20 ºC de marca Beko (Estambul, Turquía) y Whirlpool (Benton Harbor, EE.UU.) y un congelador de -80 ºC de Thermo Scientifc (Waltham, EE.UU), modelo Revco Value Plus. Para manejar pequeños volúmenes se emplearon pipetas mecánicas marca Eppendorf de 2,5, 10, 20, 100, 200, 1000 y 5000 µl. También se usó una pipeta multicanal de Eppendorf de 100 µl. Material y Métodos ! 71! 3. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 3. 1. GENERALIDADES En esta tesis se ha utilizado como especie animal la rata de laboratorio (Rattus norvergicus). Las ratas utilizadas fueron siempre machos de la estirpe Wistar, obtenidas de Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle, Francia), mantenidas con libre acceso al agua de bebida y pienso en todos los experimentos realizados. Las edades de los animales se fijó en función del estudio. Para los estudios de envejecimiento se usaron animales de tres edades diferentes: dos, doce y veinticuatro meses, únicamente se utilizaron para extraer VSMCs, no fueron sometidas a ningún tratamiento. Para los estudios sobre arsénico y flúor la edad de las ratas fue de dos meses. En este último caso se usaron tanto ratas normales, para estudios sobre senescencia (en el caso del arsénico), como ratas sometidas a nefrectomía 5/6 para estudios de calcificación vascular (en ambos). Todo lo referente al manejo, instalaciones y eutanasia de los animales se realizó de acuerdo a la legislación vigente en materia de protección de los animales utilizados para experimentación (Real Decreto 1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, publicado en el Boletín Oficial del Estado nº 252 del 21 de Octubre de 2005, páginas 34367 a 34391). A lo largo de mi tesis doctoral también obtuve el título de categoría B. La eutanasia de los animales de experimentación animal se ha realizado según las recomendaciones de FELASA (Federación de Asociaciones Europeas de las Ciencias del Animal de Laboratorio). 3. 2. TRATAMIENTOS 3. 2. 1. Estudios de senescencia inducida por arsénico Para estudiar la relación entre arsénico y senescencia in vivo se utilizaron ratas machos Wistar de 2 meses de edad. El grupo control durante el mes de tratamiento bebió agua embotellada de composición conocida y libre de arsénico. El grupo tratado con arsénico bebió esta misma agua, a la que se añadió AsV hasta alcanzar una concentración final de 50 ppm. Material y Métodos ! 72! 3. 2. 2. Estudios sobre calcificación Se realizaron dos estudios diferentes sobre calcificación, en ambos casos el modelo animal consistió en ratas sometidas a nefrectomía 5/6. En primer lugar se estudio el efecto del arsénico sobre la calcificación vascular. En este caso los animales fueron adquiridos con dos meses de edad ya sometidos a esta intervención quirúrgica. Para realizar este estudio se hicieron tres grupos de animales. Un primer grupo control negativo, en el cual los animales no habían sido sometidos a nefrectomía 5/6, un segundo grupo control positivo con animales nefrectomizados y un tercer grupo de ratas nefrectomizadas y tratadas 50 ppm AsV en el agua de bebida. Todos los grupos ingirieron una dieta con alta concentración de fosfato (Pi al 1,2 %) para inducir el proceso de calcificación vascular, a la vez que fueron tratados tres veces por semana con una concentración de 80 ng/kg de vitamina D3 (calcitriol) (Sigma, Ref. D1530) para acelerar este proceso. En el momento del sacrificio se recogieron muestras de sangre (con jeringas heparinizadas) y orina. La sangre se centrifugó a 1.500 g durante 10 minutos a 4 ºC para extraer el plasma. Todas las determinaciones de plasma y orina las realizó Balagué Center (Barcelona). El segundo estudio en el que se utilizó este modelo se realizó para analizar el efecto del flúor sobre la calcificación vascular, en este caso se adquirieron ratas sanas de 1,5 meses de edad y se sometieron en nuestras instalaciones a la intervención mencionada, extremando las medidas higiénicas y de asepsia para evitar infecciones derivadas de esta manipulación. El material requerido fue el siguiente: • Anestésicos: Ketamina adquirida a Merial (nombre comercial Imalgene 500, Ref. 9760) (Barcelona, España) y Medetomidina adquirida a Laboratorios Calier S. A. (nombre comercial Sedin, Ref. CN572768) (León, España). • Analgésico: Buprenorfina adquirida a Braun (Vetergesic, Ref. 30049000) (Barcelona, España). • Antibiótico: Amoxicilina adquirida a Pfizer (Clamoxyl LA, Ref. 8814) (Madrid, España). • Lágrimas artificiales: Suero fisiológico monodosis adquirido a Aposan (Ref. 0459). • Almohadilla térmica de marca Ufesa (Pamplona, España), modelo AL5523. Material y Métodos ! 73! • Afeitadora eléctrica. • Bolsas de plástico (campo quirúrgico). • Gasas estériles. • Etanol al 75 % adquirido a Paricio (Zuera, España), clorhexidina (HIBIPlus, adquirido a Mölnlycke HealthCare, Ref. 690-DES) y povidona yodada (Betadine, adquirido a Meda, Ref. 997437.4). • Sutura reabsorbible: Monofast Poliglecaprone 3/0 adquirida a Kruuse (Ref. 153224). • Pinzas mosquito y pinzas de campo (Backhaus). • Tijeras de punta roma y de punta aguda. • Bisturí (nº 4) y hojas de bisturí. • Separadores. • Portaagujas. • Pinzas de disección (diente de ratón y punta redonda). Pinzas hemostáticas. A continuación se detalla el procedimiento anestésico, quirúrgico y cuidados de los animales: Los animales fueron anestesiados utilizando anestesia combinada, ketamina a una dosis de 75 mg/kg vía intraperitoneal y medetomidina a dosis 0,5 mg/kg vía intraperitoneal. Cuando el animal entró en fase anestésica se le inyectó antibiótico, ampicilina a una dosis de 15 mg/kg vía subcutánea y se afeitó el área dorsal. Se colocó sobre una almohadilla eléctrica, para evitar pérdidas de temperatura durante el procedimiento, seguidamente se desinfectó la piel con clorhexidina y se colocó un campo quirúrgico estéril. Se instilaron lágrimas artificiales en los ojos del animal, así como se colocó una gasa humedecida con suero fisiológico sobre los mismos, para proteger de la desecación, ya que con esta anestesia se mantienen los ojos abiertos (Figura M1 A). Tras la palpación externa del riñón se realizó una incisión cráneo-caudal a la izquierda de la línea dorsal (aproximadamente de 2 cm de longitud) inmediatamente por detrás de la última costilla (Figura M1 B) y por palpación interna se localizó el riñón izquierdo del animal y se expuso. A continuación se liberó delicadamente del tejido que lo rodeaba (Figura M1 C). Una vez liberado se colocó una sutura reabsorbible (3/0) alrededor de cada polo del riñón, junto al pedículo renal, dejando el riñón dividido en tres partes iguales, con cuidado de no ligar el uréter (Figura M1 D). Las ligaduras colocadas alrededor de los polos se fueron apretando lentamente para conseguir el corte de los polos sin utilización de bisturí ni posterior uso de técnicas para lograr la Material y Métodos ! 74! hemostasia. Una vez finalizada la escisión (Figura M1 E) se comprobó la ausencia de sangrado y se reintrodujo el riñón en la cavidad abdominal. La capa muscular se suturó mediante la sutura de Reverdin (o festoneada), y subcutáneo y piel conjuntamente con sutura subcutánea o subcuticular continua. Una vez finalizada la sutura se limpió el campo con una gasa para retirar posibles restos de sangre y se aplicó povidona yodada (Figura M1 F). ! Figura M1. Nefrectomía 2/3 del riñón izquierdo. A. Preparación del campo quirúrgico. B. Incisión. C. Riñón extraído de la cavidad abdominal y libre de tejidos circundantes. D. Ligaduras alrededor de los polos renales. E. Riñón tras la escisión de los polos. F. Sutura de la incisión y limpieza del campo quirúrgico. ! Material y Métodos ! 75! Una semana tras la primera intervención se procedió a la resección del riñón derecho. La preparación del animal fue la misma que en el caso de la escisión de los polos del riñón izquierdo. Se realizó una incisión cráneo-caudal a la derecha de la línea dorsal, inmediatamente tras la última costilla. Se extrajo el riñón derecho y se liberó del tejido circundante. Se colocó una pinza hemostática en el pedículo (lo más próximo posible al riñón) (Figura M2 A) y se realizaron tres ligaduras por debajo de la pinza (Figura M2 B), para liberar el riñón completo mediante el corte del pedículo por encima de las ligaduras (Figura M2 C). Se suturó la incisión como en la intervención anterior. Tras cada intervención se colocó al animal en una caja con cama limpia, protegiéndole los ojos con una gasa húmeda y manteniéndolo tapado para evitar la pérdida de calor. Cuando recuperó el reflejo podal se le administró la primera dosis de analgésico, buprenorfina a dosis de 0,1 mg/kg vía subcutánea, a las 6 horas se inyectó de nuevo este anestésico a la mitad de la primera dosis administrada. Al cabo de una semana de recuperación los animales se dividieron en seis grupos. Se fijaron tres grupos diferentes como control negativo. Dos grupos control negativo en los que ! Figura M2. Nefrectomía completa del riñón derecho. A. Clampaje del pedículo renal. B. Realización de ligaduras del pedículo renal. C. Corte del pedículo renal. ! Material y Métodos ! 76! los animales no fueron sometidos a nefrectomía y a los que se les administró pienso con concentraciones normales (Pi al 0,6 %) o altas (Pi al 1,2 %) de fosfato; y un tercer grupo control negativo, en el que los animales consumieron pienso con Pi al 0,6 % y habían sido sometidos a nefrectomía. El grupo control positivo se compuso de animales nefrectomizados, los cuales ingirieron una dieta con alta concentración de fosfato (Pi al 1,2 %). El quinto y sexto grupo estuvieron formados por animales nefrectomizados, que consumieron una dieta con Pi al 1,2 % y agua fluorada, un grupo a concentración 1,5 mg F-/l y el otro grupo a concentración de 15 mg F-/l. Este tratamiento a diferencia del anterior se prolongó 4,5 meses, debido a que no se usó vitamina D3, para evitar el exceso de calcificación derivado de su administración, y observado en el estudio del arsénico (Ver Discusión: Figura DII-1). En el momento del sacrificio se recogieron muestras de sangre (con jeringas heparinizadas) y orina. La sangre se centrifugó a 1.500 g durante 10 minutos a 4 ºC, para extraer el plasma. Las determinaciones de plasma y orina de este estudio se realizaron con kits colorimétricos adquiridos a BioAssay Systems (Hayward, EE.UU.): creatinina (DICT500), fosfato (DIPI-500), urea (DIUR-500) y calcio (DICA-500). 4. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS DE MUSCULATURA LISA VASCULAR DE AORTA Para todos los estudios realizados en este trabajo se utilizaron cultivos primarios de células del músculo liso de la aorta (VSMCs), obtenidas de aortas de ratas, con el procedimiento que se detalla a continuación. Las extracciones de VSMCs se realizaron a partir de grupos de ocho ratas macho Wistar, para cada una de las tres edades utilizadas en los estudios. De este modo se obtuvieron tres cultivos o líneas, a partir de ratas de 2 meses, de 12 meses, y de 24 meses. En los tres casos se siguió el mismo procedimiento, únicamente modificando el número de digestiones necesarias para extraer todas las células en función de las necesidades específicas de cada edad. Material y Métodos ! 77! 4. 1. MATERIALES, REACTIVOS Y APARATOS • Ocho ratas macho Wistar por cada extracción de VSMCs. • Afeitadora. • Etanol al 75 % adquirido a Paricio (Zuera, España) para la esterilización del material y campo quirúrgico. • Material quirúrgico: agujas, jeringas, pinzas, tijeras y bisturí. • Pentobarbital adquirido a Vétoquinol (Nombre comercial Dolethal) (Lure Cedex, Francia), inyectado a concentración de 40-50 mg/kg pv vía intraperitoneal. • Colagenasa de Clostridium histolyticum, adquirida a Sigma-Aldrich (Ref. C2674), con una actividad específica de 223,8 U/mg. La actividad colagenasa final para llevar a cabo las digestiones fue de 600 U/ml. • Medio de cultivo MEM, con y sin suero fetal bovino (SFB). • Una placa de 56,7 cm2 y un tubo Falcon de 50 ml estériles. • PBS 1 X, conteniendo penicilina+estreptomicina+glutamina a concentración final 1X. • Filtro de 0,22 µm de poro. • Lupa. • Estufa de CO2 de cultivo celular. • Agitador a 38 ºC. • Centrifuga. 4. 2. PROCEDIMIENTO 4. 2. 1. Preparación de la colagenasa La colagenasa se disolvió en medio MEM (sin SFB) a concentración de 600 U/ml. La disolución se filtró posteriormente en campana de flujo laminar con un filtro de 0,22 µm para proceder a su esterilización. A continuación se añadieron 10 ml de la disolución de colagenasa a una placa de cultivo celular de 56,7 cm2 y 9 ml a un tubo Falcon de 50 ml. 4. 2. 2. Procedimiento quirúrgico La limpieza del instrumental quirúrgico se realizó con alcohol al 75 %. Los animales fueron anestesiados con pentobarbital y una vez alcanzaron un plano Material y Métodos ! 78! anestésico profundo se procedió a la preparación del campo quirúrgico para la extracción de las aortas. Se rasuró el pelo de la región ventral de la rata y la superficie del animal se limpió con alcohol al 75 %. Se realizó un corte de la piel en el abdomen, y a continuación en la musculatura abdominal y peritoneo. Se prolongó la apertura cranealmente hasta abrir la cavidad torácica. Posteriormente se retiraron todos los órganos abdominales hacia el lado derecho del animal para visualizar la aorta, anexa a la columna vertebral. Una vez se localizó la aorta, se pinzó y se procedió a su separación de la columna vertebral mediante un corte cuidadoso entre aorta y columna, sosteniéndola en todo momento con pinzas, hasta liberarla totalmente de la unión con la columna. Finalmente, la aorta se cortó en su inserción al corazón. A continuación se realizó el lavado de la aorta en PBS frío, y se mantuvo en PBS en hielo hasta su limpieza. 4. 2. 3. Limpieza de la aorta y extracción de células Manteniendo la aorta en hielo se eliminó la capa muscular que rodeaba a la aorta, utilizando para ello pinzas sin dientes y pinzas de punta fina para evitar dañarla. Una vez limpias, las ocho aortas se incubaron durante 1 hora a 38 ºC en estufa de cultivos, sin agitación, en una placa de 56,7 cm2 con 10 ml de colagenasa. Transcurrida la hora de incubación se eliminaron los restos de la adventicia de las aortas, siendo necesario el uso de una lupa. Una vez eliminada toda la adventicia se procedió al corte transversal de la misma con bisturí, en fragmentos de aproximadamente 2-3 mm. Estos fragmentos se añadieron a un tubo Falcon de 50 ml que contenía 9 ml de la disolución de colagenasa, el cual había sido previamente incubado durante 15 minutos en la estufa de CO2 para conseguir la captación de CO2 por el medio. Una vez adicionados los fragmentos, se llevaron a un agitador atemperado a 38 ºC, y se mantuvieron en agitación suave durante 1 hora y 45 minutos. Terminado el proceso de digestión, se centrifugó el tubo con colagenasa con los Material y Métodos ! 85! (Pi 2 mM) las VSMCs se sembraron también en placas. Se mantuvieron con medio completo hasta alcanzar la confluencia, momento en el que este medio se sustituyó por medio de quiescencia, con el que se incubaron durante 24 horas para comenzar seguidamente el tratamiento con diferentes concentraciones de flúor, 0, 5 y 10 µM, en presencia de Pi 2 mM. Como control negativo paralelamente se cultivaron células en ausencia de flúor y en presencia de Pi 1 mM. Las muestras se recogieron tras 5 días de tratamiento. 6. 5. TRATAMIENTOS EMPLEADOS EN TÉCNICAS DE ELISA Estos análisis únicamente se llevaron a cabo en los estudios sobre arsénico. En el caso de ELISA sándwich (cuantificación de interleukina 1ß) la muestra utilizada fue el sobrenadante del medio de cultivo, para ELISA directo (cuantificación de proteínas oxidadasestrés oxidativo) la muestra requerida fue proteína. El tratamiento llevado a cabo fue en ambos casos el mismo que para la recolección de proteína y RNA. 6. 6. ESTUDIOS SOBRE CALCIFICACIÓN Para evaluar la relación entre calcificación y envejecimiento, tras alcanzar la confluencia las células de diferentes divisiones y edad del donante se incubaron con medio calcificante (Pi 2 mM) durante 5 días, tras los cuales se recogió la correspondiente muestra (como se explica en el apartado referente a la cuantificación de la calcificación). En el estudio sobre arsénico se realizaron varios estudios relacionados con la calcificación. Para determinar si el arsénico es capaz de inducir calcificación en condiciones normales o basales, las VSMCs tras alcanzar la confluencia fueron incubadas durante 5 días en medio MEM sin adicionarle fosfato (Pi 1 mM), con AsIII a concentraciones crecientes 0, 1, 2,5 y 5 µM. Paralelamente para evaluar el efecto del arsénico en condiciones hiperfosfatémicas se incubaron, con estas mismas concentraciones de AsIII, en presencia de Pi 2,5 mM. Este ensayo se realizó tanto en células vivas como en células muertas (como modelo de calcificación pasiva). Con el fin de relacionar la senescencia inducida por AsIII y la calcificación, se llevaron a cabo un tercer y cuarto estudio. En primer lugar las células tras alcanzar la confluencia se incubaron durante 5 días con AsIII a concentraciones crecientes 0, 2,5, 5 y 10 µM en medio MEM sin adicionarle fosfato (Pi 1 mM) para inducir senescencia y tras este tratamiento el medio de cultivo se sustituyó por un medio libre de AsIII y con una concentración final de Pi de 2,5 mM. En segundo lugar se valoró la reversión de la Material y Métodos ! 86! calcificación con resveratrol, en este caso se incubaron las VSMCs bajo condiciones calcificantes durante 5 días, con las siguientes concentraciones de AsIII: 0, 1, 2,5 y 5 µM, en presencia y ausencia de resveratrol 10 µM. El estudio de la relación entre flúor y calcificación se llevó a cabo incubando las VSMCs tras alcanzar la confluencia, durante 5 días, en medio MEM sin adicionarle fosfato (Pi 1 mM), con Fa concentraciones crecientes 0, 2,5, 5 y 10 µM. Paralelamente para evaluar el efecto del flúor en condiciones hiperfosfatémicas se incubaron las VSMCs, con estas mismas concentraciones de F-, en presencia de Pi 2 mM. Este ensayo se realizó tanto en células vivas como en células muertas (como modelo de calcificación pasiva). En el caso de las células muertas se realizó un segundo estudio con las mismas concentraciones indicadas anteriormente en condiciones hiperfosfatémicas, pero en este caso en lugar de recoger muestras únicamente a los 5 días de tratamiento, las muestras se recogieron a día 2, 3 y 5. En el caso de las células vivas, tras este estudio previo se estudió el efecto inhibitorio del flúor en el proceso de calcificación vascular, para ello se realizó una curva dosis-respuesta con concentraciones crecientes de un inhibidor de la calcificación: pirofosfato (0, 0,1, 0,2, 0,4, 1, 2, 10, 100 µM) o ácido fosfonofórmico (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 100 y 1000 µM), bajo condiciones calcificantes, en presencia o ausencia de 5 µM F-. 7. DETERMINACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD Las células en cultivo fueron sometidas a diferentes tratamientos (detallados en el apartado “Diseño experimental”) siendo necesaria la determinación de la existencia de citotoxicidad en los mismos. Para ello se usó un análisis colorimétrico basado en la aparición de actividad lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo, como consecuencia de la liberación de LDH intracelular por ruptura de la membrana celular. Para ello se usó un kit de Roche, Citotoxicity Detection Kit (Ref. 11 644 793 001). El mecanismo bioquímico del análisis es el siguiente. En primer lugar NAD+ es reducido a NADH/H+ por oxidación de lactato a piruvato en una reacción catalizada por la LDH. En un segundo paso un catalizador, la diaforasa, transfiere H/H+ desde el NADH/H+ a la sal 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-cloruro de feniltetrazolio (INT) de color amarillo, la Material y Métodos ! 87! cual se reduce a formazán, pasando a tener color rojo (Figura M4). Un incremento en la cantidad de muerte celular o daño a la membrana resulta en un incremento de la actividad LDH en el sobrenadante. Este incremento se correlaciona directamente con la cantidad de formazán generado, siendo éste proporcional a la cantidad de células lisadas. El formazán acumulado es hidrosoluble, y presenta un máximo de absorbancia a alrededor de 500 nm, mientras la sal INT de tetrazolio no presenta una absorción significativa a esa longitud de onda. Figura M4. Mecanismo bioquímico del análisis de citotoxicidad por LDH (Roche Applied Science, 2005). 7. 1. MATERIALES, REACTIVOS Y APARATOS • Citotoxicity Detection Kit de Roche. • Placas de 96 pocillos. • Espectrofotómetro para microplacas. • Tritón X-100 al 2 %. 7. 2. PROCEDIMIENTO Se procedió a la toma de muestras del sobrenadante de las células en cultivo, 50 Material y Métodos ! 88! µl/condición por duplicado, el día de inicio del tratamiento (día 0), el día 1, 3 y 5. También se tomaron muestras del control negativo (mismo medio de tratamiento en ausencia de células para determinar la señal de fondo) y del control positivo (células lisadas con el medio de tratamiento conteniendo adicionalmente Tritón X-100 al 2 %). Las muestras se mantuvieron refrigeradas hasta el análisis de las mismas. Se adicionaron 50 µl del reactivo (preparado según las indicaciones del fabricante) a cada uno de los pocillos de la microplaca con la muestra recogida, se mezcló en un orbital y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Finalizada la incubación se midió la absorbancia (A) a una longitud de onda de 450 nm. El cálculo de la citotoxicidad se realizó con la siguiente fórmula: 8. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD β-GALACTOSIDASA Se ha demostrado que la enzima β-galactosidasa tiene un comportamiento anormal asociado con las células senescentes. Esta enzima es una hidrolasa lisosomal, normalmente activa a pH 4, pero en células senescentes también se mantiene activa a pH 6, debido a que las células senescentes muestran una expresión de la β-galactosidasa de cinco a diez veces mayor que las jóvenes. Los lisosomas incrementan su número y tamaño en las células senescentes (Brunk y cols., 1973; Robbins y cols., 1970), y la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia parece ser el resultado del incremento de la actividad lisosomal a pH sub-óptimo (pH 6), el cual es detectable en células senescentes debido a un incremento del contenido lisosomal (Kurz y cols., 2000). Se ha visto que la tinción no es positiva en células quiescentes o en aquellas diferenciadas y no senescentes, así como tampoco lo es en células inmortales (Dimri y cols., 1995). Esta tinción fue desarrollada originalmente por Dimri y cols., en 1995. Amuestra −Acontrol − ( ) Acontrol + ( ) −Acontrol − ( ) x100 Material y Métodos ! 89! 8. 1. MATERIALES, REACTIVOS Y APARATOS • PBS 1 X: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, a pH 7,4. • Solución de fijación: paraformaldehído al 4 % en PBS 1 X. • Reactivo X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido de Sigma (Ref. B4252), disuelto en dimetilformamida. • Solución de tinción/control positivo: la diferencia entre control positivo y solución de tinción fue el pH del tampón, en el caso del control positivo era pH 4 y para la solución de tinción pH 6. La composición fue X-gal 1 mg/ml, ferricianuro potásico 5 mM, ferrocianuro potásico 5 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM y ácido cítrico/tampón fosfato de sodio 40 mM pH 4 ó 6. • Incubadora a 37 ºC de aire normal. 8. 2. PROCEDIMIENTO El procedimiento fue ligeramente diferente en el estudio sobre senescencia y sobre arsénico. En el caso de senescencia se sembraron 6.000 células/cm2 por pocillo y se cultivaron durante 3 días. Al tercer día se lavaron con PBS dos veces y se fijaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. La fijación se realizó para impedir la autolisis y mantener la morfología y localización de los constituyentes celulares en forma lo más próxima posible a la existente durante la vida celular. Una vez fijadas se lavaron dos veces con PBS y se añadió la solución de tinción (200 µl/pocillo), con la que se incubaron durante 12 horas a 37 ºC. En el estudio sobre arsénico las células fueron tratadas durante 5 días y una vez finalizado el tratamiento se llevó a cabo la tinción. En el caso de las aortas completas se extrajo la aorta del mismo modo que para obtener VSMCs, pero en este caso la aorta no fue sometida a ninguna digestión posterior, sino que una vez extraída se lavó con PBS y se fijó en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 4 horas. Tras la fijación se procedió a la inmersión de la aorta completa en la solución de tinción durante 16-18 horas. La tinción se realizó tanto a pH 4 (control positivo) como a pH 6 en todos los casos. Material y Métodos ! 90! 9. INMUNOFLUORESCENCIA Las técnicas inmunofluorescentes para la detección de proteínas citoplásmicas y nucleares se realizaron tanto en cultivo celular (inmunocitología) como en tejido (inmunohistoquímica), en este caso aorta, variando el procedimiento entre ellos. Otras técnicas de microscopía fluorescente utilizadas se dirigieron a la determinación de la viabilidad celular (TUNEL y naranja de acridina/bromuro de etidio) y del estado de estrés oxidativo. 9. 1. MATERIALES, REACTIVOS Y APARATOS • Cubreobjetos, placas de cultivo para microscopía de BD (Ref. 314508) para inmunocitología o porta-objetos HistoBond de StatLab (McKinney, EE.UU.) tratados con silano para inmunohistoquímica. • Criostato atemperado a -30 ºC. • PBS 1 X frío: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4*H2O 7,75 mM, KH2PO4 1,5 mM, CaCl2*H2O 0,88 mM, MgCl2*6H2O 0,5 mM a pH 7.4. Esterilizado. • Solución de fijación: • Inmunocitoquímica: Paraformaldehído al 4 % en PBS 1 X. • Inmunohistología: paraformaldehído al 1,5 % + glutaraldehído al 0,1 % + sacarosa al 20 % en PBS 1 X. • Glicina 20 mM en PBS. • Saponina al 0,1 % en PBS. • Tween 20 al 1 % en PBS. • Suero anti-cabra (Sigma, Ref. G9023) o albúmina sérica bovina (Sigma, Ref. A6003). • Anticuerpos primarios y secundarios, características detalladas en la tabla M1. • Protector de la fluorescencia (anti-fading), con y sin DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) adquirido a Invitrogen-Molecular Probes (Ref. P36930). • Microscopio de fluorescencia. Material y Métodos ! 91! Tabla M1. Características de los anticuerpos usados para inmunofluorescencia Proteína Concentración anticuerpo primario Casa comercial anticuerpo 1ario (referencia) Anticuerpo secundario Alexa: Comprado a Invitrogen-Molecular Probes (referencia) α-Actina 1:400 Sigma (A5228) 1:400 Cabra anti-ratón 488 (A11029) SM22α 1:50 Santacruz (sc-18513) 1:400 Burro anti-cabra 568 (A11057) Calponina 1:50 Santacruz (sc-16604-R) 1:400 Cabra anti-conejo 568 (A11036) Lámina A/C 1:250 Santacruz (sc-6215) 1:400 Burro anti-cabra 568 (A11057) p21 1:50 Santacruz (sc-6246) 1:400 Cabra anti-ratón 488 (A11029) p21 1:50 Sigma (P1484) 1:400 Cabra anti-ratón 488 (A11029) Faloidina FITC 1:50 Sigma (P5282) No es necesario 9. 2. INMUNOCITOLOGÍA Las células se sembraron en placas de microscopía pre-tratadas con poli-L-lisina para favorecer la adhesión de las células al vidrio. Al alcanzar la confluencia, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar todos los restos del medio de cultivo y se procedió a la fijación de las mismas para impedir la autolisis y mantener la morfología y localización de los constituyentes celulares. La fijación se realizó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras la fijación se realizaron tres lavados con PBS para eliminar el paraformaldehído sobrante. El paraformaldehído actúa entrelazando grupos amino mediante enlaces covalentes, por ello tras los lavados con PBS las células se incubaron durante 10 minutos con glicina, para inactivar las trazas de paraformaldehído activo, evitando que alterara los anticuerpos utilizados en las incubaciones posteriores. Se procedió a lavar de nuevo con PBS, tres veces, y seguidamente, para permitir que los anticuerpos penetraran en el interior de las células, éstas fueron permeabilizadas con saponina durante 30 minutos. A partir de este paso, todas las incubaciones y lavados se llevaron a cabo en presencia del detergente suave saponina. Material y Métodos ! 92! Conjuntamente con la permeabilización se procedió al bloqueo para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos, con suero anti-cabra al 10 % o BSA al 3 %, en función del anticuerpo usado. El bloqueo ideal se realiza con suero de la misma especie que el anticuerpo secundario a usar, y si no es posible, puede usarse BSA. Seguidamente se realizaron tres lavados con PBS y la incubación de las células con el anticuerpo primario (a la concentración indicada en la Tabla M1) en PBS con saponina y suero anti-cabra al 1,5 % o BSA al 3 %, durante 1 hora en atmósfera húmeda para evitar la evaporación del medio y concentración del anticuerpo. Transcurrida la hora de incubación se procedió al lavado de las células con PBS, tres veces, y a la incubación con el anticuerpo secundario frente a la especie en la que fue obtenido el primario, conjugado con las moléculas fluorescentes Alexa 488 (verde) o Alexa 568 (rojo) (a la concentración indicada en la Tabla M1), en atmosfera húmeda y oscuridad para evitar la pérdida de fluorescencia. Una vez finalizada la incubación con el anticuerpo secundario se lavaron las células dos veces con PBS con saponina y el último lavado sin saponina, y se añadió la solución con antifading para proteger la fluorescencia, en presencia o ausencia de DAPI, reactivo con fluorescencia de color azul que marca el DNA intercalándose entre los pares de bases de éste, y por tanto hace visibles los núcleos bajo luz de 358 nm (Figura M5). Seguidamente se colocó un cubre sobre las células, sellándolo por todos sus extremos. La preparación se mantuvo durante un día a temperatura ambiente en oscuridad antes de la observación con el microscopio de fluorescencia, para que el antifading ejerciera su máxima actividad protectora. Las muestras una vez observadas se conservaron a -20 ºC. 9. 3. INMUNOHISTOLOGÍA Se extrajo la aorta (por el método explicado anteriormente) y se fijó con paraformaldehído al 1,5 % + glutaraldehído al 0,1 % + sacarosa al 20 % en PBS a 4 ºC durante 2 horas. Tras la fijación se lavó con PBS y seguidamente se crioprotegió con sacarosa Figura M5. DAPI en color azul intercalado en la hebra de DNA (Wheeler, 2007). Material y Métodos ! 93! al 20 % en PBS a 4 ºC durante 1 hora. Finalizada la incubación con sacarosa se lavó en PBS, se secó por contacto con papel de filtro húmedo, se embebió en OCT y se congeló. Los cortes se realizaron a 7 µm con un criostato a -30 ºC. El protocolo de tinción presentó ligeras diferencias con el de inmunocitología. En el caso de la aorta, tras la adhesión de los cortes al cubreobjetos tratado con silano, se incubaron con glicina durante 20 minutos. Se lavaron con PBS 2 veces y se procedió al bloqueo y permeabilización simultánea de los cortes de aorta con suero anti-cabra al 15 % o BSA al 10 % en PBS con Tween 20 al 1 % durante 20 minutos. A partir de este punto todos los lavados e incubaciones se realizan con PBS+Tween 20 al 1 %. Tras la incubación se lavaron los cortes dos veces con PBS, incubando durante 3 minutos en cada lavado. Una vez realizados los lavados se incubaron los cortes con el anticuerpo primario en PBS con suero anti-cabra o BSA al 3 %, durante toda la noche a 4 ºC en atmósfera saturada de humedad para evitar el secado de las muestras. Finalizada la incubación se lavó dos veces con PBS y se procedió a la incubación durante 2 horas con el anticuerpo secundario frente a la especie en la que fue obtenido el primario, conjugado con las moléculas fluorescentes Alexa 488 (verde) o Alexa 568 (rojo) (a la concentración indicada en la Tabla M1), en atmosfera húmeda y oscuridad para evitar la pérdida de fluorescencia. Tras esta incubación se lavaron los cortes tres veces, el último lavado sin Tween 20 y se realizó el montaje con antifading. 9. 4. DETECCIÓN DE APOPTOSIS – TÉCNICA DE TUNEL Para determinar el grado de apoptosis de las células en cultivo se usó la técnica de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) (Gavrieli y cols., 1992) sobre células crecidas en placas de microscopía. Para ello se usó el kit Click-iT TUNEL Alexa Fluor Imaging Assay de Invitrogen (Ref. C10245) En el proceso de apoptosis el DNA se fragmenta o degrada (nicks) dejando extremos libres. El ensayo de TUNEL se basa en la incorporación por la enzima desoxinucleótido terminal transferasa (TdT) de dUTPs modificados por adición de un grupo alquino, al extremo 3´-OH de los fragmentos de DNA hidrolizados por la enzima endonucleasa de las células apoptóticas. La detección está basada en una reacción “click”, en la que un ión cobre (I) cataliza una reacción entre el grupo alquino y azida marcada con el fluoróforo Alexa, sustituyéndose el alquino por el grupo azida marcado, lo que dará fluorescencia al observarlo Material y Métodos ! 94! por microscopía fluorescente (Figura M6). En la cromatina de células normales no hay prácticamente tinción ya que cada cadena de cromatina tiene sólo un extremo libre. Figura M6. Mecanismo bioquímico del análisis de apoptosis, técnica de TUNEL (Invitrogen - Molecular Probes, 2003). Se realizó un control positivo de la reacción mediante incubación con DNasa I, como especifica el propio kit. Esta enzima genera roturas en la cadena de DNA, simulando el efecto de las endonucleasas durante la apoptosis. 9. 5. DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR CON BROMURO DE ETIDIO Y NARANJA DE ACRIDINA Este método emplea la fluorescencia diferencial del DNA por unión a naranja de acridina y bromuro de etidio. El naranja de acridina se intercala en el DNA dando fluorescencia verde al núcleo y se une al RNA pero no se intercala, dando una leve coloración naranja, en forma de punteado, al citoplasma. Así las células viables presentan el núcleo de color verde y el citoplasma verde con punteado anaranjado (Robbins, 1963). El bromuro de etidio es únicamente captado por células no viables, en ellas se intercala en el DNA dando fluorescencia naranja/roja al núcleo, de mayor intensidad que la del naranja de acridina (verde) (Waring, 1965). Una vez finalizados los tratamientos en placa, las células fueron lavadas con PBS y se adicionaron 100 µl por pocillo de la mezcla de naranja de acridina y bromuro de etidio, Material y Métodos ! 101! noche, en agitación suave y con azida de sodio al 0,01 %, la concentración del mismo se indica en la tabla M2. Una vez finalizada la incubación se lavó la membrana y se incubó con el anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), durante 1 hora en agitación, disuelto en PBS-T, la concentración se indica en la tabla M2. La inmunodetección se realizó mediante la técnica de la peroxidasa. La detección quimioluminiscente usa una enzima, la peroxidasa, la cual está unida al anticuerpo secundario y cataliza la oxidación de luminol, aportado por el Kit Immobilon Western, siendo este compuesto oxidado el que emite luz (Figura M8). La señal luminosa fue captada por Versadoc 400 MP. Figura M8. Detección quimioluminiscente con HRP y luminol en Western-blot (Jan, 2005). Tabla M2. Anticuerpos usados en la técnica de Western-blot. Proteína µg proteína Concentración anticuerpo primario Casa comercial anticuerpo 1ario / referencia Anticuerpo secundario HRP: Concentración, Casa comercial (referencia) α-Actina 5 1:20.000 Sigma (A5228) Anti-ratón 1:40.000, Amersham GE Healthcare (NA931) SM22α 5 1:10.000 Santacruz (sc-18513) Anti-cabra 1:25.000, Invitrogen (811620) α-Tubulina 5 1:5.000 Sigma (T5168) Anti-ratón 1:15.000, Amersham GE Healthcare (NA931) Lámina A/C 10 1:10.000 Santacruz (sc-6215) Anti-cabra 1:40.000, Invitrogen (811620) Material y Métodos ! 102! Phospho P38 10 1:1.000 Sigma (P1491) Anti-conejo 1:10.000, Sigma (A0545) β-Actina 5 1:20.000 Sigma (A1978) Anti-ratón 1:40.000, Amersham GE Healthcare (NA931) p21 10 1:500 Sigma (P1484) Anti-ratón 1:10.000, Amersham GE Healthcare (NA931) 11. 2. 6. Tinciones asociadas a la técnica de Western-blot PONCEAU-S: esta tinción se usó en membranas de PVDF para comprobar que la transferencia había sido correcta y/o para cortar la membrana para poder incubar una parte con el anticuerpo frente a la proteína de estudio y otra frente al house-keeping (proteínas que se expresan de manera constitutiva y sirven para normalizar la carga de proteína). La solución de tinción se preparó disolviendo 0,5 g de Ponceau-S en 1 ml de ácido acético, para llevarlo a 100 ml de agua. Se tiñó la membrana durante 5 minutos y se destiñó para ver únicamente las bandas de proteína, lavándola durante 2 minutos con agua. Una vez cortada se lavó durante 10 minutos con agua para eliminar totalmente la tinción (es una tinción reversible que no inutiliza la membrana). A continuación se incubó con la solución de bloqueo. COOMASSIE: esta tinción se usó tanto en geles (para comprobar que la transferencia había sido completa) como en la membrana de PVDF (para verificar cualitativamente la carga de proteína equitativa entre pocillos). Se tiñeron membranas y/o geles con 0,1 % de Coomassie azul brillante R en 50 % de metanol durante 5 minutos. La destinción para visualizar únicamente las bandas de proteína se realizó mediante dos lavados con una disolución de 50 % metanol y 10 % ácido acético durante 5 minutos. Se trata de una tinción irreversible por lo que se realizó una vez se había dado uso a gel o membrana y ya podían ser desechados. 12. ELISA (ANÁLISIS INMUNOADSORBENTE UNIDO A ENZIMA) La técnica de ELISA permite la cuantificación de un determinado antígeno (proteína de interés) en una muestra, a través de una reacción colorimétrica por la unión del antígeno a un anticuerpo primario y la unión de este último a un anticuerpo secundario conjugado con una enzima que cataliza una reacción, dando como resultado un producto final coloreado, Material y Métodos ! 103! cuya intensidad se determinará por colorimetría, siendo su señal proporcional a la concentración de la proteína. En estos estudios se utilizó la técnica de ELISA sándwich para la cuantificación de interleukina 1ß y la técnica de ELISA directa para estudiar el estrés oxidativo. 12. 1. MATERIALES, REACTIVOS Y APARATOS • Rat IL-1ß kit de Invitrogen (Ref. KRC0011). • OxyELISA Oxidized Protein Quantitation Kit de Millipore (Ref. S7250). • Espectrofotómetro. 12. 2. ELISA SANDWICH: CUANTIFICACIÓN DE INTERLEUKINA 1ß La interleukina 1ß (IL-1ß) es un mediador de la respuesta inflamatoria. La cuantificación de IL-1ß se realizó en el sobrenadante de las células en tratamiento. Se usó el kit de Invitrogen Rat IL-1ß (Ref. KRC0011). Esta técnica de ELISA sándwich partió de un anticuerpo antiinterleukina 1ß inmovilizado (unido al pocillo), sobre el que se añadió la muestra, uniéndose de este modo la IL-1ß al anticuerpo inmovilizado. A continuación se añadió un segundo anticuerpo anti-IL-1ß unido a biotina, la cual presenta afinidad por la estreptavidina. En un siguiente paso se adicionó una enzima peroxidasa (HRP) unida a estreptavidina, uniéndose ésta a la biotina. En el paso final se añadió un cromóforo, el cual reaccionó con la enzima inmovilizada, dando una coloración proporcional a la presencia de IL-1 ß (Figura M9). Figura M9. Proceso de detección de Interleukina 1ß mediante ELISA indirecto (Invitrogen, 2010). ! Material y Métodos ! 104! 12. 3. ELISA DIRECTO: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS OXIDADAS (ESTRÉS OXIDATIVO) Las proteínas pueden ser modificadas por radicales libres de oxígeno y otras especies reactivas, los cuales son producidos con el metabolismo normal de las células durante el transporte electrónico en la mitocondria, en el sistema redox celular, metabolismo de xenobióticos, y con la respuesta inflamatoria (Dalle-Donne y cols., 2006; Weizman y cols., 1990; Babior y cols. 1990; Camello-Almaraz y cols., 2006). La oxidación de las proteínas modifica las cadenas laterales de metionina, histidina y tirosina, formándose enlaces disulfuro con cisteína (Davies y cols., 1987; Uchida y cols., 1990; Heinecke y cols., 1993; Farber y cols., 1983). La oxidación de proteínas catalizada con metales introduce grupos carbonilos (aldehídos y cetonas) en lisina, arginina, prolina o treonina de manera específica (DalleDonne y cols., 2006; Davies y cols., 1987; Climent y cols., 1989; Levine, 1983; Oliver, 1987). Para la detección de estas proteínas oxidadas a partir de proteínas aisladas de VSMC tras su tratamiento correspondiente, se usó el kit OxyELISA Oxidized Protein Quantitation Kit de Millipore (Ref. S7250). La muestra de proteína se inmovilizó en un pocillo por absorción pasiva. Los grupos carbonilos de las cadenas laterales de la proteína fueron derivatizados a 2,4dinitrofenilhidrazona (DNP-hidrazona) mediante una reacción con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Las proteínas derivatizadas-DNP fueron entonces incubadas con un anticuerpo monoclonal anti-ratón conjugado con HRP específico para la fracción DNP. Seguidamente se procedió a realizar una incubación con la enzima y el sustrato 3,3´,5,5´-Tetrametilbenzidina (TMB) lo que produjo un producto coloreado, el cual fue cuantificado usando un espectrofotómetro a 450 nm. La cantidad de producto formado es una medida de la actividad peroxidasa dependiente del grado de oxidación proteica. 13. PURIFICACIÓN DE RNA Para la extracción de RNA total se usaron dos métodos diferentes, en función de la cantidad de RNA que se pretendió conseguir. Los métodos utilizados se basaron en filtrado Material y Métodos ! 105! con columnas (GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit de Sigma (Ref. RTN10)) y en el uso de bolas magnéticas (ChargeSwitch Total RNA Cell Kit de Invitrogen (Ref. CS14010)). Cuando las células se sembraron en placas de 56,7 cm2 se utilizó el método de filtrado con columnas, mientras cuando se usaron placas de 9,6 cm2 se utilizó el método de bolas magnéticas. Para recoger la muestra se procedió a la tripsinización de la placa y recolección de las células en tripsina. A continuación se lavó la placa dos veces con PBS y se añadió a la muestra recogida en tripsina, para recoger las células que no se habían recolectado con la tripsina y a su vez para diluir a esta última. Seguidamente se centrifugaron los tubos en una microcentriíuga a 4 ºC durante 10 minutos a 200 g. Se eliminó el sobrenadante y se congeló el pellet a -80 ºC hasta su uso. Tras la extracción fue necesario el tratamiento con DNasa para eliminar el DNA, para ello se usó DNasa I recombinante libre de actividad RNasa, adquirida a Roche (Ref. 04 716 728 001). Cuando la muestra procedió de células sometidas a tratamiento calcificante se procedió directamente al rascado de la placa usando el buffer de lisis del kit de bolas magnéticas. El lisado se congeló a -80 ºC hasta su uso. El tratamiento con DNasa está incluido en el proceso de extracción del RNA por lo que no fue necesario el tratamiento postextracción. 13. 1. MÉTODO DE FILTRADO CON COLUMNAS 13. 1. 1. Materiales, reactivos y aparatos • GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit. • Microcentrífuga a 4 ºC. • Etanol al 70 %. • DNasa I. 13. 1. 2. Procedimiento EXTRACCIÓN: Las células fueron lisadas y homogeneizadas en un tampón que contenía isotiocianato de guanidina para asegurar la desnaturalización de macromoléculas e inactivar RNasas. La adición de etanol y la centrifugación de la mezcla causó la unión del Material y Métodos ! 106! RNA a una membrana de sílice, unida al tubo de centrifuga. El lavado eliminó los contaminantes y el RNA fue eluído. ELIMINACIÓN DEL DNA CON DNasa I: La DNasa I recombinante procede de páncreas bovino y es expresada en Pichia pastoris. Esta DNasa es una endonucleasa específica que hidroliza las uniones fosfodiester de doble hebra o DNA monohebra, en presencia de cationes divalentes para obtener su máxima actividad. Para eliminar las trazas de DNA presente en la muestra fue necesario el tratamiento posterior con DNasa I, durante 15 minutos a temperatura ambiente, tras esta incubación se adicionó EDTA (concentración final 2,5 mM) e incubó durante 10 minutos a 75 ºC y se mantuvo a 4 ºC hasta su uso o congelada a -80 ºC para su almacenamiento. En cada reacción se trató 1 µg de RNA. 13. 2. MÉTODO DE BOLAS MAGNÉTICAS 13. 2. 1. Materiales, reactivos y aparatos • ChargeSwitch Total RNA Cell Kit de Invitrogen (Ref. CS14010). • MagnaRack. • Baño de agua a 60-70 ºC. 13. 2. 2. Procedimiento Este método se basa en el uso de una superficie de carga dependiente del pH del tampón. A las células lisadas recogidas en el tampón de lisis se le adicionaron bolas magnéticas y tampón de unión a las mismas en condiciones de bajo pH, lo que da a las bolas magnéticas carga positiva. Ello provoca la unión de los ácidos nucleicos cargados negativamente. Las proteínas u otros contaminantes no se unieron y se lavaron con tampones acuosos. Para eluir los ácidos nucleicos la carga de la superficie fue neutralizada al aumentar el pH por encima de 8,5 usando un tampón de baja concentración salina. Durante el procedimiento se realizó el tratamiento con DNasa para eliminar el DNA. La muestra se mantuvo a 4 ºC hasta su uso o congelada a -80 ºC para su almacenamiento. Material y Métodos ! 107! 14. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN Y CALIDAD DEL RNA EXTRAÍDO La concentración del RNA total fue determinada espectrofotométricamente, la calidad fue determinada espectrofotométricamente y mediante el uso de geles de agarosa. 14. 1. CUANTIFICACIÓN DE RNA El DNA extraído se diluyó 1:20 en agua DEPC y se midió su absorbancia a 260 y 280 nm usando cubetas de cuarzo. Una absorbancia de 1,0 a 260 nm corresponde a aproximadamente 40 µg/ml de RNA. El ratio de absorbancias entre 260 y 280 nm debe encontrarse entre 1,8 y 2,1. 14. 2. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL RNA Se usó un gel de agarosa al 1 %, en presencia de MOPS 1 X y formaldehído al 1,85 %. Las muestras se preparan en MOPS al 0,5 %, formaldehido al 6 % y formamida al 10 %. Se calentaron durante 10 minutos a 65 ºC y posteriormente se añadió el tampón de carga (concentración final 10 %). El tampón de carga se preparó con MOPS a 1 X. La electroforesis se llevó a cabo a 70-100 voltios constantes durante 1 hora y 30 minutos. Tras la electroforesis se realizaron dos lavados de 10 minutos cada uno para eliminar el formaldehído, el cual provoca fluorescencia. A continuación se incubó con bromuro de etidio durante 10 minutos y seguidamente se visualizó con luz ultravioleta con un GelDoc 1000. 15. RETROTRANSCRIPCIÓN DEL RNA EXTRAÍDO El RNA total extraído fue retrotranscrito para obtener cDNA, el cual se cuantificó mediante PCR en tiempo real. Para retrotranscribir el RNA se usó el kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit de Roche (Ref. 04 379 012 001). Material y Métodos ! 108! Se usó el cebador Anchored-oligo(dT)18, el cual es especifico de RNA poli(A)+ y recomendado para el posterior análisis por PCR en tiempo real. 15. 1. PROCEDIMIENTO La mezcla de la reacción consistió en: tampón, inhibidor de RNasas, mezcla de dNTPs, agua para biología molecular, Oligo(dT)18 y RTasa (enzima que lleva a cabo la retrotranscripción). Las concentraciones usadas fueron las indicadas por la casa comercial. Los parámetros a los que fue sometida cada muestra en el termociclador fueron: 30 minutos a 55 ºC, 5 minutos a 85 ºC y mantenimiento a 4 ºC hasta su uso (o congelación a -20 ºC para su almacenamiento). 16. CUANTIFICACIÓN DEL cDNA MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Para cuantificar el cDNA obtenido por retrotranscripción se usó el kit LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I de Roche (Ref. 12 239 264 001). Este kit lleva a cabo una PCR hot start en capilares de 20 µl, la cual mejora la especificidad y sensibilidad de la PCR (Chou y cols., 1992; Kellogg y cols., 1994) minimizando la formación de productos de amplificación no-específicos en el comienzo de la reacción, en el periodo de calentamiento del termociclador, al pasar por la temperatura de anillamiento. En la PCR hot-start la reacción comienza cuando se alcanzan 95 ºC, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que se puede conseguir mediante varias técnicas, en este caso mediante el uso de anticuerpos antipolimerasa. Al alcanzar los 95 ºC los anticuerpos anti-polimerasa se inactivan por desnaturalización y la polimerasa puede actuar. La FastStart Taq DNA polimerasa es una forma modificada químicamente de la Taq DNA polimerasa recombinante termoestable, inactiva a menos de 75 ºC. La enzima es completamente activa a 95 ºC al eliminar los grupos bloqueantes en un paso de preincubación. Material y Métodos ! 109! La señal detectable por el termociclador es la fluorescencia obtenida al intercalarse el SYBR Green I en la doble hélice de DNA. El incremento de la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de doble hebra DNA generada. 16. 1. PROCEDIMIENTO La mezcla de la reacción consistió en: agua para biología molecular, MgCl2 a concentración final 3 mM, cebadores a concentración final 0,5 µM y SYBR Green (conteniendo Taq DNA polimerasa) y 2 µl de cDNA procedente de la retrotranscripción (la cual partía de 1 µg de RNA). Los parámetros utilizados fueron los siguientes: • Pre-incubación: 1 ciclo • 95 ºC, 15 s, 20 ºC/s (Ramp Rate) • Amplificación: 40 ciclos • 95 ºC, 10 s, 20 ºC/s • 55 ºC, 5 s, 20 ºC/s • 72 ºC, 10 s, 20 ºC/s, modo de adquisición single • Curva de fusión (melting curve): 1 ciclo • 95 ºC, 0 s, 20 ºC/s • 65 ºC, 15 s, 20 ºC/s • 95 ºC, 0 s, 20 ºC/s, modo de adquisición continuo • Enfriamiento: 1 ciclo • 40 ºC, 30 s, 20 ºC/s Los cebadores utilizados fueron los siguientes: • ARP: 5´-CACCTTCCCACTGGCTGAA-3´, 5´-CCTCCGACTCTTCCTTTGC-3´ • GADPH: 5´-TCCAGTATGACTCTACCCACG-3´, 5´-CACGACATACTCAGCACCAG-3´ • SM22a: Material y Métodos ! 110! 5´-CAGACTGTTGACCTCTTTGAAG-3´, 5´-TCTTATGGTCCTGGGCTTC-3´ • Calponina: 5´-TCCGCACACTTTAACCGAG-3´ 5´-ATCCATGAAGTTGCTCCCG-3´ • MGP: 5´-AACACCTTTATATCCCCTCAGC-3´, 5´-GCGTTGTACCCGTAGATCAG-3´ • BMP2: 5´-GTTCTGTCCCTACTGATGAG-3´, 5´-ATTCGGTGCTGGAAACTAC-3´ • CBFA1: 5´-GTCCAAGTGTAGGTGTGTTTAC-3´, 5´-AATCAGAAGCAAGTACACCAATC-3´ • Msx2: 5´-TGAACCTTACAGAAACCCAGG-3´, 5´-GTTGATAGGGAAGGGCAGAC-3´ 17. CUANTIFICACIÓN DE LA CALCIFICACIÓN Para cuantificar el grado de calcificación, tanto de VSMCs como de las aortas de las ratas en tratamiento, se usó el kit Calcium Assay Kit de Abnova (Ref. KA1644). Se basó en la tinción con fenolsulfoneptaleína, la cual forma específicamente un complejo muy estable con calcio libre dando color azul. La intensidad del color medida a 612 nm es directamente proporcional a la concentración de calcio en la muestra. La extracción del calcio dependió de la muestra a analizar: • Cultivo celular: las células se lavaron dos veces con PBS y a continuación se adicionaron 150 µl de HCl 0,6 N por pocillo y se incubaron durante 12-16 horas a 4 ºC. Tras esta incubación se recogió la muestra en un tubo eppendorf, por rascado de la placa, y se centrifugó a 12.000 g durante 5 minutos. • Aorta: se extrajo la aorta y se fijó con paraformaldehído al 4 % en PBS a 4 ºC durante 2 horas. Tras la fijación se lavó con PBS y se secó (ligero secado colocándola sobre papel de Resultados 117 PARTE I. ENVEJECIMIENTO DE LAS VSMCs I. A. ENVEJECIMIENTO CELULAR Y DESDIFERENCIACIÓN DE VSMCs 1. Evolución de los cultivos primarios.- En este estudio por el momento todavía no se ha llegado al cese total de la multiplicación de VSMCs para ninguna de las tres líneas. Cabe destacar que no hay ninguna referencia bibliográfica sobre el número de CPDs a las que las VSMCs de rata cesan su multiplicación. Como se observa en la figura RI-1, durante 250 días en cultivo, e independientemente de la edad del animal donante, se alcanzó el mismo número de divisiones acumuladas (CPDs-cumulative population doublings). El número de células totales acumuladas en ese periodo fue menor conforme aumentó la edad del animal donante. Lo mismo ocurrió con el número de divisiones por día y las células/cm2. Figura RI-1. Gráficas de crecimiento de VSMCs durante el cultivo. Resultados  118 2. Indicadores de envejecimiento de las células en cultivo.- Un indicador de senescencia es la morfología. Como se puede observar en la figura RI-2, en el caso de las células de donantes de 2 y 24 meses, a medida que las células acumularon divisiones predominaron las células con apariencia fibroblástica, principalmente a partir de 70 CPDs. En las VSMCs extraídas de donantes de 12 meses a 17 y 30 CPDs la apariencia fue similar a las extraídas de donantes de 2 y 24 meses, sin embargo a 70 CPDs en las VSMCs extraídas de donantes de 12 meses se observaron dos poblaciones celulares claramente diferenciadas, una población de apariencia fibroblástica y otra con cierto parecido a las células endoteliales (morfología de estos tipos celulares en la figura RI-3), no apareciendo estas últimas en las otras líneas, para finalmente desaparecer por completo la población de morfología fibroblástica a 90 CPDs. Figura RI-2. Cambios morfológicos durante el cultivo de VSMCs. Escala 100 μm.  Figura RI-3. A. VSMCs. B. Fibroblastos. (Ross y col., 1980). C. Células endoteliales (Innoprot, 2012). Resultados 119 Otro bioindicador de senescencia es la actividad ß-galactosidasa (ver Material y Métodos). En células extraídas de ratas de 24 meses con 90 CPDs apareció una leve tinción positiva para β-galactosidasa a pH 6, lo cual es indicativo del inicio del proceso de senescencia (Figura RI-4). Figura RI-4. Tinción β-Galactosidasa asociada a la senescencia durante el cultivo de VSMCs. Barra de escala 50 μm. Otra característica de envejecimiento es el incremento de la apoptosis con la edad. Para determinar el grado de apoptosis se utilizó la técnica fluorescente de TUNEL (Figura RI-5). A divisiones tempranas, 17 y 30 CPDs, la apoptosis fue mayor en las células extraídas de animales de 12 y 24 meses frente a las de animales de 2 meses (Figura RI-5), aunque únicamente apareció una diferencia significativa entre células extraídas de animales de 2 y 24 meses (Figura RI-6). En todos los casos, para estas divisiones, el número de células apoptóticas se mantuvo en valores mínimos. A partir de 70 CPDs (Figura RI-5 y 6) las células de animales de 2 meses presentaron mayor apoptosis que las de 12 y 24 meses. En el caso de células extraídas de animales de 12 y 24 meses, sin embargo, se siguió manteniendo el incremento de apoptosis con la edad del donante y las divisiones dentro de su propia línea. Resultados  120  Figura RI-5. Imágenes representativas de apoptosis (técnica de TUNEL) durante el cultivo de VSMCs.Barradeescala100 μm. Figura RI-6. Cuantificación de células apoptóticas (técnica de TUNEL) durante el cultivo de VSMCs. Para determinar el grado de envejecimiento de las células a lo largo del cultivo, además de la tinción de β-galactosidasa, se cuantificó la expresión de otros marcadores de senescencia, como lámina A/C y p21, para los donantes de diferentes edades. Resultados 121 Para todas las VSMCs extraídas de donantes de distintas edades se incrementó la expresión de lámina A/C y p21 de forma significativa, a medida que las células acumularon divisiones. Esto se observó con las dos técnicas utilizadas, western-blot (Figura RI-7) y microscopía inmunofluorescente (Figura RI-8 A y B). Se observaron diferencias significativas prácticamente entre todas las divisiones, en todas las edades de donante estudiadas. Figura RI-7. Expresión de marcadores de senescencia (Lámina A/C y p21) durante el cultivo de VSMCs en función de las divisiones acumuladas. Resultados  122 Figura RI-8A. Inmunofluorescencia de marcadores de senescencia (Lámina A/C y p21)duranteelcultivodeVSMCsde donantes de 2 y 12 meses de edad en función de las divisiones acumuladas. Barra de escala 50 μm. Resultados 123 Figura RI-8B. Inmunofluorescencia de marcadores de senescencia (Lámina A/C y p21) durante el cultivo de VSMCs de donantes de 24 meses de edad en función de las divisiones acumuladas. Barra de escala 50 μm.       3. Cambios en la expresión de indicadores de células de musculatura lisa vascular.- Se ha observado como las VSMCs en cultivo reflejan cambios fenotípicos a lo largo del cultivo (entre otros, Shanahan y cols., 1993 y Nakano-Kurimoto y cols., 2009). En la figura RI-10 se puede observar como, con respecto a la expresión de los marcadores α-actina y SM22α, las VSMCs de donantes de 2, 12 y 24 meses mostraron diferencias significativas entre todas las CPDs. Una excepción fue el donante de 12 meses entre 17 y 30 CPDs para α-actina, y en expresión de RNA de SM22α entre 20 y 40 CPDs de donantes de 12 y 24 meses. En el caso de RNA, esto podría ser debido a que la expresión del RNA específico no se vea disminuida, pero sí la de la proteína, por ejemplo por una traducción reducida o que la proteína tenga una vida media menor. Resultados  124 Estos resultados a su vez se corresponden con lo observado por inmunofluorescencia (Figura RI-9 A y B). Figura RI-9 A. Inmunofluorescencia de marcadores de músculo liso (α-actina y SM22α) durante el cultivo de VSMCs de donantes de 2 meses de edad en función de las divisiones acumuladas. Barra de escala 25 μm. Resultados 125 Figura RI-9 B. Inmunofluorescencia de marcadores de músculo liso (α-actina y SM22α) durante el cultivo de VSMCs de donantes de 12 y 24 meses de edad en función de las divisiones acumuladas. Barra de escala 25 μm. Resultados  126 Figura RI-10. Expresión de marcadores de músculo liso (α-actina y SM22α) durante el cultivo de VSMCs en función de la edad del donante: hay diferencias significativas entre todas las divisiones con excepción de donante de 12 meses entre 17 y 30 CPDs para α-actina y en expresión de RNA de SM22α entre 20 y 40 CPDs de donantes de 12 y 24 meses. Referencias 229 Burton D.G.A., Matsubara H., Ikeda K. (2010). Pathophysiology of vascular calcification: Pivotal role of cellular senescence in vascular smooth muscle cells. Experimental Gerontology. 45: 819–824. Byon, C.H., Javed, A., Dai,Q., Kappes, J.C., Clemens, T.L., Darley-Usmar, V.M.,McDonald, J.M., Chen, Y. (2008). Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription factor RUNX-2 by AKT signaling. J. Biol. Chem. 283(22): 15319–15327. Camello-Almaraz C, Gomez-Pinilla PJ, Pozo MJ, Camello PJ. (2006). Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. 291:1082. 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