Repositorio Institucional de Documentos

2013 109 Patricia Lalueza Valero Materiales inorgánicos nanoestructurados basados en plata: aplicaciones bactericidas Departamento Director/es Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Santamaría Ramiro, Jesús Arruebo Gordo, Manuel Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Patricia Lalueza Valero MATERIALES INORGÁNICOS NANOESTRUCTURADOS BASADOS EN PLATA: APLICACIONES BACTERICIDAS Director/es Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Santamaría Ramiro, Jesús Arruebo Gordo, Manuel Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA ÁREA DE INGENIERÍA QUÍMICA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y TECNOLOGÍAS DEL MEDIO AMBIENTE “Materiales inorgánicos nanoestructurados basados en plata. Aplicaciones bactericidas” Memoria para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza presentada por: Dña. Patricia Lalueza Valero 27 Septiembre 2013 Los Doctores D. Jesús Santamaría Ramiro, y D. Manuel Arruebo Gordo, ambos del departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza, CERTIFICAN Que la presente memoria titulada: “Materiales inorgánicos nanoestructurados basados en plata. Aplicaciones bactericidas” se ha realizado bajo su dirección, en los laboratorios del Instituto de Investigación en Nanociencia de Aragón, por Dña. Patricia Lalueza Valero, autorizando su presentación. Y para que así conste, firmamos este certificado en Zaragoza a 27 de Septiembre de 2013. Fdo. Prof. Dr. Jesús Santamaría Fdo. Dr. Manuel Arruebo ABREVIATURAS NH 4 -ZSM5. ZSM5 en forma amónica H-ZSM5. ZSM5 calcinada en su forma protónica Ag-ZSM5. ZSM5 intercambiada con iones de plata PAA. Ácido peroxiacético H-ZSM5-PAA. ZSM5 en su forma con ácido peroxiacético adsorbido Ag-ZSM5-PAA. ZSM5 intercambiada con iones de plata y con ácido peroxiacético adsorbido AgNPs. Nanopartículas de plata AgNPS-ZSM5. ZSM5 con nanopartículas de plata AgNPS-ZSM5-PAA. ZSM5 con nanopartículas de plata y con ácido peroxiacético adsorbido APTES. (3-Aminopropilo) trietoxisilano SBA15-APTES. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano SBA15-APTES-PAA. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano y con ácido peroxiacético adsorbido SBA15-APTES-Ag-A. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano con elevada concentración de nanopartículas de plata SBA15-APTES-Ag-B. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano con baja concentración de nanopartículas de plata SBA15-APTES-Ag-A-PAA. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano con elevada concentración de nanopartículas de plata y con ácido peroxiacético adsorbido SBA15-APTES-Ag-B-PAA. SBA15 funcionalizada con (3-Aminopropilo) trietoxisilano con baja concentración de nanopartículas de plata y con ácido peroxiacético adsorbido MagNPs. Nanopartículas magnéticas MCM41-MagNPs. MCM41 con nanopartículas magnéticas MCM41-MagNPsAgNPs. MCM41 con nanopartículas magnéticas y con nanopartículas de plata MCM41-MagNPs-PAA. MCM41 con nanopartículas magnéticas y con ácido peroxiacético adsorbido MCM41-MagNPsAgNPs-PAA. MCM41 con nanopartículas magnéticas, con nanopartículas de plata y con ácido peroxiacético adsorbido ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1 Generalidades. Problemas asociados al desarrollo de enfermedades bacterianas. Biocidas 2 1.1.1 Infecciones bacterianas y microorganismos. Tipos y distribución mundial 2 1.1.2 Enfermedades nosocomiales. Cepas y patogenicidad (biofilm y resistencias) 7 1.1.3 Bactericidas y Bacteriostáticos. Antibióticos 10 1.1.4 Otros bactericidas y bacteriostáticos 12 1.2 Materiales 19 1.2.1 Biomateriales 19 1.2.2 Nanociencia, Nanotecnología y Nanobiociencia 20 1.2.3 Silicio y sus características para la nanobiociencia 22 1.2.4. Nanomateriales de sílice porosa: Zeolitas y Mesoporosos 23 1.3 La plata como bactericida 28 1.3.1 Evolución histórica de la utilización de la plata 28 1.3.2 Mecanismo de acción de la plata 29 1.3.3 Resistencia bacteriana a la plata 32 1.3.4 Legislación y enfermedades asociadas con la exposición a plata 34 1.3.5 Ventajas de la plata respecto a otros materiales 37 1.3.6 Plata en materiales nanoestructurados 38 1.3.7 Sinergia de la plata con otros compuestos 40 1.4 Aplicaciones actuales de la plata 40 1.4.1 Aplicación de la liberación de plata iónica 41 1.4.2 Aplicación de la liberación de plata metálica (AgNPs) 45 1.4.3 Apliación de la liberación de plata iónica vía oxidación acelerada mediante combinación con otros productos o acciones 48 1.5 Resumen y objetivo 49 2. EXPERIMENTAL 51 2.1. Modelo de bacterias. Cepas 52 2.2 Cultivos bacterianos: Características. Preparación de medios y tampones 53 2.2.1 Tampón fosfato salino (PBS) 53 2.2.2 Medios de cultivo 53 2.3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y de la concentración mínima bactericida (MBC) 55 2.4 Estudios de formación de biofilm 56 2.5 Estudios bactericidas 56 2.6 Estudios bactericidas utilizando campo eléctrico para acelerar la oxidación de la plata metálica 58 2.7 Estudios de detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) por peroxidación lipídica. Malonil dialdehído (MDA) 59 2.8 Preparación de muestras biológicas para el microscopio electrónico de barrido (SEM) 61 2.9 Preparación de muestras biológicas para el microscopio óptico invertido de fluorescencia 62 2.10 Síntesis hidrotermal de los nanohilos de plata 63 3. PLATA IÓNICA 65 3.1 Zeolitas 66 3.1.1 Zeolitas: ZSM5 intercambiada con plata 66 3.1.2 Pastillas de ZSM5 66 3.1.3 Zeolitas comerciales con plata 67 3.1.4 Caracterización de las zeolitas con plata 67 3.1.5 Ensayos biológicos 80 3.2 Óxido de plata 85 3.2.1 Procedencia del óxido de plata 85 3.2.2 Caracterización 85 3.2.3 Ensayos biológicos 87 Resumen del poder bactericida de los materiales con plata iónica usados 88 4. PLATA METÁLICA 91 4.1 SBA15 fibrosa 92 4.1.1 Síntesis 92 4.1.2 Funcionalización con APTES 92 4.1.3 Pastillas de SBA 15 93 4.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata in situ 93 4.1.5 Caracterización 94 4.1.6 Ensayos bactericidas 97 4.2 MCM-41 102 4.2.1 Síntesis 102 4.2.2 Pastillas de MCM 41 102 4.2.3 Síntesis de nanopartículas de plata in situ sobre la MCM 41 con nanopartículas magnéticas 103 4.2.4 Caracterización 103 4.2.5 Ensayos biológicos 105 4.3 ZSM5 107 4.3.1 Síntesis: Obtención de Ag-ZSM5 107 4.3.2 Síntesis de AgNPs in situ 107 4.3.3 Caracterización 108 4.3.4 Ensayos biológicos 109 4.4 Nanopartículas de plata comerciales 110 4.4.1 Procedencia 110 4.4.2 Caracterización 110 4.4.3 Ensayos bactericidas 112 4.5 Nanohilos de plata 113 4.5.1 Síntesis hidrotermal de los nanohilos de plata 114 4.5.2 Caracterización 115 4.5.3 Ensayos bactericidas 119 Capítulo 1. Introducción 5 Los microbios no patógenos no producen ningún perjuicio en el individuo que habitan, incluso en algunos casos se producen beneficios, dando lugar a una asociación denominada simbiosis. Muchos microorganismos tienen la capacidad de sintetizar una gran variedad de compuestos bioactivos que pueden ser utilizados como defensas por los hospedadores [8], o metabolizar sustancias que los metazoos o metafitas no pueden. En plantas, por ejemplo, la interacción entre las raíces de las leguminosas y las bacterias gram-negativas del suelo del género Rhizobium, dan lugar a unos órganos diferenciados llamados nódulos, donde las bacterias habitan beneficiándose de los nutrientes generados por las leguminosas, mientras que la planta, que no tiene enzimas para fijar el nitrógeno atmosférico, utiliza este nitrógeno fijado por la bacteria [9]. También en el caso de los vertebrados, sus tractos digestivos contienen una amplia variedad de microorganismos. Por ejemplo, la bacteria Bacteroidetes thetaiotamicron induce la vascularización del intestino grueso, mientras que ella se beneficia de los restos alimenticios que por allí circulan [8]. De hecho, el número de microorganismos en el tracto gastrointestinal humano es de aproximadamente 10 14 individuos, realizando funciones tan importantes como la síntesis de vitamina K o aportan resistencia a otros microorganismos patógenos [10]. Asimismo, en la piel también encontramos microbios formando parte de la flora normal como estafilococos coagulasa-negativos, varias especies bacterianas Gram-negativas, y Candida albicans, etc. [11]. Sin embargo, los microorganismos más estudiados son los denominados patógenos, ya que son los que afectan a la salud, y son capaces de producir una colonización, infección y producir una situación de enfermedad. Las enfermedades infecciosas son la mayor causa de muerte en el mundo de los niños y adultos jóvenes [12]. Representan más de 13 millones de muertes al año, son causantes de una de cada dos muertes en los países en vías de desarrollo. Cada hora mueren 1500 personas por enfermedad infecciosa más de la mitad niños menores de cinco años y el resto adultos en edad laboral. La mayoría de las muertes por enfermedades infecciosas se producen en los países en vías de desarrollo [13], tal y como se muestra en la Figura 1.2. Figura 1.2. Porcentaje de fallecimiento por tipo de enfermedades y tipo de países. (Fuente: OMS) 77% Lesiones Enfermedades infecciosas Enfermedades no infecciosas Países desarrollados Países en desarrollo 3 7% 55 % 8 % 15 % 9 % 77 % Capítulo 1. Introducción 6 Comúnmente se utilizan tres términos para clasificar los impactos de las enfermedades infecciosas epidémicas:  Endémica. Está presente en todo momento en un lugar determinado pero con una baja frecuencia.  Epidemia. Es un brote repentino e intenso de una enfermedad en un lugar determinado.  Pandemia. Es una epidemia que se extiende y afecta a toda una región, continente o mundo. Los temores de una pandemia han aumentado en los últimos años debido a la globalización de la economía, y al aumento del número de viajes internacionales y su alcance [4]. Para estudiar la prevalencia y afección de las enfermedades infecciosas normalmente se utilizan tres términos estadísticos:  Morbilidad. Tasa de enfermos. Es la proporción de enfermos durante un periodo determinado de tiempo según el número de habitantes del país en el mismo período de tiempo. Se expresa con la siguiente relación: Morbilidad = (número de personas enfermas/población) x 10.000  Mortalidad. Tasa de mortalidad. Es el número de fallecidos por una determinada enfermedad según el número de habitantes. Mortalidad = (número de personas fallecidas/población) x 100.000  Letalidad. Tasa de letalidad. Se utiliza para estimar la gravedad de la infección y la eficacia del tratamiento. Es el porcentaje de fallecidos debida a una determinada enfermedad infecciosa [14]. Letalidad = (número de personas fallecidas/número de personas enfermas) x 100 Las once principales enfermedades infecciosas que más muertes han producido según la OMS a nivel mundial, se muestran en la siguiente Tabla 1.3: Tabla 1.3. Enfermedades infecciosas que producen más fallecimientos (Fuente: OMS) Causa de muerte Muertes aproximadas en el año 2002 Porcentaje respecto a las muertes que representa. Infecciones respiratorias tracto bajo 3.900.000 6.9% SIDA 2.800.000 4.9% Enfermedades diarreicas 1.800.000 3.2% Tuberculosis 1.600.000 2.7% Malaria 1.300.000 2.2% Sarampión 600.000 1.1% Tos ferina 290.000 0.5% Tétanos 210.000 0.4% Continuación página siguiente Capítulo 1. Introducción 7 Causa de muerte Muertes aproximadas en el año 2002 Porcentaje respecto a las muertes que representa. Meningitis 170.000 0.3% Sífilis 160.000 0.3% Hepatitis B 100.000 0.2% Sin embargo, en los países desarrollados, concretamente en Europa las tasas de infección han disminuido o se han mantenido estables a lo largo de los últimos 15 años, y debido a esto la mayoría de las muertes en los países de la Unión Europea son causadas por enfermedades no infecciosas como el cáncer (21%) y enfermedades cardiovasculares (43%) [15], tal y como se muestra en la Figura 1.3. Esto se debe principalmente a la inversión en salud y al acceso a antibióticos. Figura 1.3. Principales causas de muerte en Europa 2011. (Fuente: OMS) Pero, por otro lado no se puede subestimar la presencia de enfermedades infecciosas. Cada año, las enfermedades infecciosas causan decenas de miles de muertos en los países de la Unión Europea, así como millones de días de pérdida de trabajo. Por otro lado los microorganismos tienen gran versatilidad para adaptarse y cambiar, por lo que pueden emerger nuevas enfermedades, como ya se comprobó con el SIDA en la década de los ochenta, la variante de la enfermedad Creutzfeldt-Jakob en los noventa y el SARS en el 2003 [15]. 1.1.2 Enfermedades nosocomiales. Cepas y patogenicidad (biofilm y resistencias) El principal peligro infeccioso en Europa, se produce a partir de los microorganismos que se han vuelto resistentes a los antibióticos y que crecen rápidamente en los hospitales [15], dando lugar a las enfermedades nosocomiales, que según la OMS son aquellas infecciones contraídas por los pacientes ingresados en un recinto hospitalario Enfermedades del sistema respiratorio Lesiones y envenenamientos Otras causas Enfermedades coronarias Infarto Otras enfermedades cardiovasculares Diferentes tipos de cáncer 8% 12 % 15 % 2 1 % 11 % 11 % 21 % Capítulo 1. Introducción 8 y que estos, no habían manifestado, ni estaban en periodo de incubación antes del ingreso [16]. Las infecciones nosocomiales contribuyen de manera significativa a la morbilidad y mortalidad, y producen un aumento del gasto hospitalario [17, 18]. Desde la década de los setenta se producen 80.000 muertes al año y es la onceava causa de muerte en los hospitales de Estados Unidos [19, 20]. Un gran número de microorganismos patógenos pueden causar infecciones nosocomiales. Estos patógenos varían en diferentes poblaciones de pacientes, diversos centros de atención de salud, distintas instalaciones y diferentes países. Hoy en día, casi todas las infecciones nosocomiales son causadas por microorganismos comunes en la población general. La población general es inmune o padece una enfermedad menos grave que la causada a los pacientes hospitalizados (generalmente bacterias del género Staphylococcus, Estafilococos coagulasa negativos, Enterococos y Enterobacteriaceae). [21]. En la mayoría de los estudios los microorganismos nosocomiales más representativos son Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa [22, 23]. Dentro de la especies nosocomiales una de las más destacadas es la bacteria Staphylococcus aureus. Una bacteria, es un organismo unicelular procariota, es decir, que su material genético está disperso en el citoplasma. Este organismo es Grampositivo, es decir, con pared celular gruesa, y tiene forma de coco. Es un patógeno oportunista ubicuo que comúnmente coloniza la nasofaringe anterior de los seres humanos [24], formando parte de la flora natural. Figura 1.4. Fotografía de S.aureus en microscopio electrónico de barrido Dentro de esta especie bacteriana se encuentran gran variedad de cepas. Una cepa, es un subtipo de una especie bacteriana que difiere de otras bacterias de la misma especie por alguna diferencia menor pero identificable. Las cepas descienden de un solo organismo o cultivo puro aislado [25]. Las cepas más relevantes de la forma médica en S.aureus son aquellas que tienen que ver con la resistencia a antibióticos y con la formación de biofilm:  Cuando se introdujeron las penicilinas en 1940, todas las cepas de S.aureus fueron sensibles. En 1944 aparecieron los primeros informes de resistencia a estos Capítulo 1. Introducción 9 antibióticos, hasta hoy en día, que casi todas las cepas de esta bacteria son resistentes a las penicilinas naturales y aminopenicilinas [26, 27]. La resistencia a estos fármacos se produce por la adquisición de genes que codifican enzimas (βlactamasas) que inactivan estos fármacos. Al principio los resistentes aparecieron a nivel hospitalario extendiéndose después al resto de la comunidad [26] . Se sintetizó la meticilina y otras penicilinas para tratar infecciones causadas por S.aureus resistentes a la penicilina, sin embargo, comenzaron a aparecer las primeras cepas de S.aureus resistentes a la meticilinas (MRSA methicillin-resistant S.aureus), siendo la primera en 1968 en Estados Unidos [28] y a propagarse llegando a ser uno de los principales patógenos nosocomiales [29]. Hoy en día, en Estados Unidos, se producen aproximadamente 94.000 infecciones cada año por MRSA y se asocia con aproximadamente 19.000 muertes [30].  Hay otras cepas que además tienen la capacidad de formar biofilm, que esencialmente es una capa de exopolisacárido que segrega la bacteria y que se convierte en una barrera para el sistema inmunitario y para los antibióticos [31]. El crecimiento en biofilms representa la forma habitual de crecimiento de las bacterias en la naturaleza (superficie de piedras en ríos y pantanos) [32]. La formación de biofilm ya aparece en el registro fósil (aproximadamente 3,25 mil millones de años), siendo común en muchos organismos Archeae y Bacteria, por lo tanto, es una característica antigua e integral en el ciclo de la vida de los procariotas. Este biofilm protege a las células en su crecimiento y permite que estas sobrevivan en ambientes hostiles, así como dispersarse y colonizar nuevos nichos ecológicos[33]. Debido a esto muchas bacterias patógenas utilizan esta característica de formación de biofilm, a menudo en prótesis, colonizando y dañando el tejido de alrededor [34, 35], los fármacos no pueden actuar ya que la difusión de estos a través del biofilm es muy baja. La combinación de estos dos fenómenos, formación de biofilm y resistencia a la meticilina, dan lugar a graves problemas de salud, principalmente en las intervenciones quirúrgicas de ortopedia. Según la FDA (USA Food and Drug Administration), un implante es un dispositivo que se coloca en una cavidad formada de manera natural o quirúrgicamente del cuerpo humano y está destinado a permanecer allí durante un tiempo indefinido, con el fin de proteger la salud reemplazando una estructura biológica que falta, suplantando a una estructura biológica dañada, o mejorando una estructura biológica existente, mientras que una prótesis es una extensión artificial que reemplaza una parte del cuerpo que falta por diversas razones [36]. Así pues, la colonización y formación de biofilm de los implantes y prótesis causan graves infecciones en huesos, articulaciones y tejido circundante denominada osteomielitis, difícil de erradicar. En muchos casos, se requiere la retirada del implante, con el consiguiente riesgo para la salud del individuo y el aumento en el gasto económico [37]. De hecho, se estima que del 1% al 2% de los implantes en rodilla y cadera se infectan [38]. En general, los tratamientos con fármacos fracasan debido a que la erradicación de la infección es incompleta y por lo tanto, la infección se cronifica [37]. La formación del biofilm, en las superficies de implantes, es la principal causa de este fracaso porque las bacterias inmersas en el biofilm tienen muy baja sensibilidad a los antibióticos administrados [39]. Por otro lado, algunas de las bacterias bentónicas se desprenden del biofilm y sirven como un nuevo nido de infección. Así, los biofilms se pueden formar de nuevo, de una manera Capítulo 1. Introducción 10 rápida en la superficie de los implantes y son difíciles de erradicar por completo [40]. La formación de biofilm se realiza siguiendo los cinco pasos a que a continuación se describen, tal y como se muestra en la Figura 1.5:  Las bacterias se unen reversiblemente a un soporte sólido.  La unión de las bacterias al soporte se vuelve irreversible, y se agregan para formar la matriz.  Fase de maduración: las células se van combinando en capas y comienza el quorum sensing. El quorum sensing es la comunicación entre las bacterias de una población produciendo moléculas, denominadas autoinductores, que funcionan como moléculas de señalización química. La concentración de estas señales aumentan en función del número de células en una colonia. Con la utilización de esta señalización química, las bacterias se adaptan a la situación y las condiciones de crecimiento, y al igual que un organismo multicelular sincronizan su comportamiento. Y así, las bacterias empiezan a formar el biofilm produciendo la matriz polimérica extracelular [41].  Las agrupaciones llegan a un espesor máximo.  Se produce la fuga de las bacterias para dispersar el biofilm [42]. Figura 1.5. Cinco pasos en la formación del biofilm [42] 1.1.3 Bactericidas y Bacteriostáticos. Antibióticos Para la eliminación de las infecciones bacterianas se han utilizado dos estrategias clásicas o la combinación de ambas. Se han administrado agentes bacteriostáticos que es aquel que no ocasiona la muerte a una bacteria, pero si impide su reproducción, es decir, la bacteria no se divide ya que este agente puede interferir en la producción de proteínas, en la replicación del DNA o en otros aspectos del metabolismo bacteriano. Los agentes bactericidas, si que provocan la muerte de la bacteria [43]. Sin embargo, estas categorías no son absolutas, ya que el efecto letal de una molécula varía según el método y la especie ensayada. Puede ser que algunos agentes sean bactericidas contra un grupo de organismos y bacteriostático contra otro. El antibiótico vancomicina, por Capítulo 1. Introducción 11 ejemplo, es bactericida contra S.aureus y los Neumococos, pero bacteriostático frente a los Enterococos [44]. Dentro de estos dos grupos de compuestos, están los antibióticos, muy utilizados en medicina humana. Un antibiótico es una sustancia química producida por un ser vivo o sintética que mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos sensibles, generalmente bacterias. Los antibióticos según su mecanismo de acción se pueden clasificar como se muestra en la Figura 1.6. Figura 1.6. Mecanismo de acción de los antibióticos [45] Por otro lado, como se ha comentado anteriormente la formación de biofilm es una característica bacteriana [33], por lo que se puede formar en superficies donde se manipulen sustancias que se han de utilizar posteriormente para el consumo humano. Las superficies de materiales de acero inoxidable, vidrio, caucho y polipropileno por ejemplo, pueden ser colonizadas y contaminadas por bacterias patógenas. Bajo ciertas condiciones, se adhieren iniciando el crecimiento celular que conduce a la formación de biofilm [46]. El principal problema, es que muchas bacterias, algunas patógenas, son capaces de adherirse a las superficies de, por ejemplo, la cocina donde se manipulan alimentos, como tablas de corte y encimeras, formando biofilm. De esta manera se pone en peligro la seguridad alimentaria. Estas bacterias son difíciles de eliminar por limpieza normal y tienen mayor tolerancia a los antibióticos [40, 43]. De hecho, la manipulación inadecuada de alimentos en las cocinas de los hogares, y las prácticas antihigiénicas son un factor importante en los casos esporádicos de enfermedades transmitidas por alimentos. Se estima que hasta un 87% de los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos que se han producido en el Reino Unido, Europa, Australia, Nueva Zelanda, Estados Unidos y Canadá se originó en los alimentos preparados o consumidos en el hogar [47]. Para impedir su formación o producir su Célula bacteriana Daño en la membrana celular: Anfotericina β Inhibición de la síntesis de proteínas Actuación en Actuación en subunidad ribosomal subunidad 30s ribosomal 50 s Tetraciclina Cloramfenicol Aminoglucósidos Eritromicina Linezolid Metabolismo antagónico: Sulfonamidas, ácido paraamino-salicílico Actuación sobre la función del ADN: Noboviocina, 4Quinolonas Impedir la formación de la pared celular: Penicilina, cefalosporinas, vancomicina. Capítulo 1. Introducción 12 eliminación se utilizan otros tipos de agentes químicos diferentes a los antibióticos. Los antibióticos son selectivos a bacterias, ya que actúan sobre estructuras o moléculas propias y exclusivas de estos organismos [45] tal y como se ha mostrado en la Figura 1.6, pero no actúan sobre células eucariotas a diferencia de otros agentes químicos que eliminan tanto eucariotas como procariotas, ya que su mecanismo de acción lo realizan sobre estructuras comunes a todas las células. Dentro de este grupo encontramos, por ejemplo, los detergentes que producen la disrupción de la membrana plasmática [48] presente en todas las células. 1.1.4 Otros bactericidas y bacteriostáticos Para la eliminación de biofilms o bacterias planctónicas en superficies, recipientes, maquinaria, sistemas de distribución de aguas, alimentos o disoluciones, no se usan antibióticos, sino que se usan otros productos. Para ello se han de distinguir dos conceptos. Por un lado la esterilización, que es la destrucción de todas las formas de vida microbianas, mediante cualquier método físico (presión de vapor, calor seco) o químico (oxido de etileno gas, plasma, productos químicos líquidos) [49]. Los procesos de esterilización se dan principalmente en el mundo sanitario y en la industria alimentaria. Por otro lado, está la desinfección, que es el proceso por el que se eliminan muchos o todos los microorganismos patógenos (a excepción de las esporas) de los seres y objetos. La eficacia de la desinfección, está determinada por un gran número de factores como son, la limpieza anterior del objeto, su carga orgánica, el nivel de contaminación microbiana, el tiempo de exposición al desinfectante y la temperatura o pH del proceso de desinfección. De la misma manera que en la esterilización, se utilizan procesos físicos (pasteurización) o químicos [49]. Los procesos de desinfección se producen más a menudo que los de esterilización, ya que a menudo, se desinfectan superficies y utensilios de baños y cocinas de hogares, hostelería, comercio… Existen un gran número de agentes químicos esterilizantes y desinfectantes. Los más destacados serían:  CLORO (Cl 2 ) Se considera un desinfectante de alto nivel [49], para la potabilización del agua de boca y de piscinas públicas. Es de tres a seis veces más potente contra E.coli que los compuestos formados por otros halógenos [50]. El cloro actúa rompiendo los enlaces químicos de las biomoléculas presentes en las bacterias y virus. De esta manera, el cloro se intercambia con el hidrógeno de las enzimas y proteínas, y así, la biomolécula pierde su función y estructura y por tanto el microorganismo muere. Su principal problema es que el cloro gas es casi imposible de almacenar y además de ser tóxico en su estado gaseoso, reacciona con la materia orgánica dando lugar a subproductos halogenados de desinfección (DBPs, halogenated disinfection byproducts) que son también tóxicos para los humanos [51]. Los trihalometanos (Trihalomethanes (THMs)) y los ácidos haloacéticos (haloacetic acids (HAAs)) son los Capítulo 1. Introducción 13 compuestos que más DBPs producen y su uso ha sido limitado por la EPA (USA Environmental Protection Agency) desde el 2006 [52]. Además, el efecto del cloro es inmediato, no hay efecto residual utilizable a largo plazo. En respuesta a estas normas, se han buscado e investigado otros desinfectantes clorados alternativos como son las cloramina y el dióxido de cloro, ya que su uso da lugar a una menor concentración de DBPs [51].  HIPOCLORITO SÓDICO (NaClO) El cloro reacciona con el hidróxido de sodio para dar lugar al hipoclorito de sodio (NaClO), comúnmente conocido como lejía y que es muy buen desinfectante. Tiene un amplio espectro de actividad antimicrobiana y es de acción rápida y barata. Tiene el mismo inconveniente que el cloro al tener baja estabilidad [49]. Cuando se disuelve en agua se forma Na + y ClO - , este último es un fuerte oxidante y reacciona con los grupos SH y NH 2 , modificando enzimas y proteínas bacterianas, además de producir peroxidación lipídica [53]. Es utilizado como desinfectante en plantas potabilizadoras, torres de refrigeración y piscinas. También se ha empleado para blanquear papel o fibras textiles. En los hospitales se utiliza poco debido a su corrosividad [49]. De hecho, a pH bajos es extremadamente corrosivo, por eso las limpiezas y desinfecciones, para evitar el daño en las superficies, se realizan a pH elevados, en intervalos de 10-11 [54]. Las lejías comerciales para uso doméstico tienen una concentración de hipoclorito sódico igual o inferior al 5% en peso.  CLORAMINAS Las cloraminas son derivados del amoniaco en los que se sustituyen uno, dos o los tres átomos de hidrógenos, por cloro [55]. Estos compuestos como el hipoclorito sódico son muy oxidantes debido a su elevado potencial de óxido-reducción [56]. Son desinfectantes secundarios que se usan para mantener un efecto residual del cloro a lo largo de todo el sistema de distribución (piscinas, torres de refrigeración…) [57], ya que retienen el cloro por más tiempo y por tanto tienen un efecto bactericida más prolongado [49]. Las cloraminas sólo forman trazas de HAAs y THMs [51], por lo que sería un desinfectante más eficaz que el cloro. Sin embargo, se forman otros productos tóxicos halogenados en dosis significativas, pero siempre en menor concentración que con el cloro [58].  DIÓXIDO DE CLORO (ClO 2 ) Este compuesto, como indica la fórmula, es un óxido de cloro, también usado en la desinfección de instalaciones que tienen que ver con el agua. Su modo de acción también es por su alto poder oxidante. De hecho, este poder es mayor que el del cloro, ya que a diferencia de este, no reacciona con las moléculas de agua, de esta manera se facilita el contacto con los microorganismos [59]. Capítulo 1. Introducción 14 Tiene la ventaja de que se necesitan dosis más bajas y menor tiempo de reacción para producir el mismo efecto de desinfección que el cloro.  OZONO (O 3 ) El ozono es un potente oxidante y desinfectante que se descompone rápidamente en el agua [51]. Este potencial hace que actúe oxidando enzimas, proteínas y lípidos produciendo una desestabilización de la estructura bacteriana. La principal desventaja, es que debido a su inestabilidad, este compuesto no produce un efecto residual y persistente en los sistemas de distribución donde se aplica [60]. Por lo tanto el tratamiento que se realiza en sistemas relacionados con el agua, ha de estar combinado con cloro o cloraminas. Sin embargo, se ha observado que una ozonización previa al tratamiento con compuestos clorados produce una disminución de la THMs y HAAs en las aguas naturales [61-65].  PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (H 2 O 2 ) El peróxido de hidrógeno está formado por una molécula de agua con un átomo de oxígeno adicional gracias a un enlace peroxídico. Esta reacción ocurre de forma natural y en los seres vivos. En las plantas, está implicado en muchas reacciones de señalización celular, crecimiento y desarrollo y respuesta defensiva [66]. En los humanos, los monocitos y otros macrófagos son capaces de producir esta molécula [67], por lo tanto, su producción esta relacionada con acciones defensivas. Desde 1923, se sabe que algunas bacterias son capaces de producir H 2 O 2 [68] como parte de su metabolismo. Sin embargo, al ser un peróxido, es un agente oxidante potente que destruye las biomoléculas. Para resolver este problema, los humanos tenemos la enzima catalasa que descompone esta molécula e impide el daño celular por medio de la siguiente reacción: 2H 2 O 2 - > 2H 2 O + O 2 Por otro lado, hay bacterias que también poseen esta enzima como E.coli [69] y se denominan catalasa positiva, mientras que, por ejemplo, en el metabolismo de muchas cepas de S.aureus no existe esta enzima, por lo tanto se denominan catalasa negativa [70]. Este compuesto es utilizado en concentraciones de entre 6 % en peso y 25 % en peso para desinfectar [71] ya que es cuando tiene mejor acción antimicrobiana. Así, el peróxido de hidrógeno se ha convertido en uno de los compuestos químicos más utilizado en los procesos de desinfección en la industria alimentaria [72] y a nivel hospitalario. También se aprovecha su acción como desinfectante tópico y bucal. Además es barato y fácil de producir. Sin embargo ha de aplicarse a altas concentraciones y por si solo no puede eliminar bacterias, sino que necesita de la acción de otro agente químico (por ejemplo ácido perácetico) para producir una respuesta sinérgica [71]. Capítulo 1. Introducción 21 materiales, equipos y sistemas funcionales para la fabricación de dispositivos, de tal forma que alguna de sus dimensiones características sea inferior a 100 nm. De esta manera se crean e investigan materiales con nuevas propiedades y funciones [121] que resultan de la reducción dimensional por debajo de un valor determinado (100 nm o menos), umbral arbitrario, ya que pueden darse propiedades de nanoescala en dimensiones mayores. Figura 1.7. Escala nanométrica representando biomoléculas, organismos y objetos. (Adapatado de la fuente: Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos (National Cancer Institute)) La Nanociencia se define como la ciencia que permite la medición, manipulación y caracterización de materiales y sistemas a escala nanométrica. De esta manera se puede llegar a comprender mejor la estructura y funcionamiento a nivel macroscópico [120]. La nanociencia es un campo multidisciplinar en el que se encuentran la química, física, biología, ingeniería y la ciencia de materiales. Dentro de la Nanobiociencia se investiga la posibilidad de ordenar, manipular y estudiar los componentes y procesos biológicos a nivel nanométrico [122]. La relación entre biología y nanotecnología está creciendo, ya que se observa un rápido aumento en la nanofabricación de dispositivos en dos o tres dimensiones con aplicaciones biológicas o utilizando biomoléculas [122]. De hecho la nanobiociencia, ya se puede dividir en diversos campos que se muestran en la Figura 1.8: Agua Glucosa Anticuerpo Virus Ba cteria Célula cancerígena Semilla Pelota de tenis Nanómetros Nanodispositivos: Nanoporos, dendrímeros, nanotubos, Quantum dots, Nanoshells. NANOBIOCIENCIA Diagnóstico Terapia Regeneración celular Transfección Liberación de fármacos Hipertermia Liberación de bactericidas Figura 1.8 . Campos de la Nanobiociencia Capítulo 1. Introducción 22 El Consorcio de Bioingeniería de los Institutos Nacionales de la Salud Norteamericanos fijó como campos prioritarios en Nanociencia en 2002 [123]:  Ingeniería de tejidos.  Técnicas de imagen.  Investigación en marcadores celulares.  Bioprocesadores implantables.  Materiales biocompatibles.  Agentes para liberación de fármacos.  Tecnología de sensores. Para poder llevar acabo estos proyectos y desarrollar investigaciones en nanotecnología, en 2004, se asignaron en Estados Unidos más de 849 millones de dólares [124]. La Comisión Europea, asignó 1300 millones de euros para investigación en nanotecnología en el periodo 2003-2006 [125]. Estos datos nos dan información de la importancia económica de la investigación y desarrollo en nanotecnología y nanobiomedicina. Hay muchos ejemplos en los que se manifiesta el uso de la Nanociencia con aplicaciones biológicas: con la nanotopografía se está estudiando la transducción celular [126], la utilización de bionanosensores para la detección de virus [127] o la síntesis de nanopartículas como vectores de transfección génica [128]. Los materiales nanoestructurados que pueden clasificarse según sus dimensiones fuera del rango nanométrico como 0-D (por ejemplo fullerenos, nanopartículas o clústeres) en los que todas las dimensiones son nanométricas, 1-D (por ejemplo nanofibras, nanohilos, nantubos) donde una dimensión puede ser mayor de 100 nm, 2D (por ejemplo materiales como el grafeno y películas delgadas) [129]. Estos materiales se aplican en nanomedicina y representan una gran oportunidad de mejora de las técnicas de diagnóstico y terapia existentes. Algunos ejemplos, serían la liberación de fármacos [130, 131] con uso bactericida [75, 132] utilizando la estructura interna de los poros que facilitan la biodisponibilidad y la liberación controlada en el tiempo. La introducción de materiales nanoestructurados en el campo de la medicina supone una gran ventaja para la innovación en este campo y la mejora de terapias. En concreto, el uso de materiales basados en silicio con nanoporos y mesoporos supone una gran ventaja para, sobre todo, almacenar y facilitar la liberación de fármacos. Por ello, en el siguiente apartado se explica las características y ventajas de estos materiales. 1.2.3 Silicio y sus características para la nanobiociencia El silicio es el segundo elemento químico más abundante en la corteza terrestre (27,7% en peso) después del oxígeno (47,7%). El silicio se encuentra en la naturaleza normalmente en forma de sílice (dióxido de silicio SiO 2 ), dando lugar a minerales como el cuarzo. También se puede hallar como silicatos ([(SiO 3 ) 2- ] n ) y aluminosilicatos. Todas Capítulo 1. Introducción 23 estas formas son prácticamente insolubles. El ácido silícico (Si(OH) 4 ) [133] es el compuesto de silicio más soluble. Este elemento es muy abundante desde un punto de vista geológico, pero en los organismos está en una proporción escasa. Alguna de sus funciones en los seres vivos serían las siguientes:  Es esencial para el crecimiento de las plantas como los cereales [133].  En humanos es un oligoelemento (0,02%) esencial y participa en la síntesis de tejidos conectivos, huesos y cartílago. También es esencial en otros vertebrados, ya que Carlisle en 1972 demostró un crecimiento significativamente retrasado en pollos que fueron alimentados con dietas con ausencia de silicio [134].  Las diatomeas, algas pardas eucariotas, aprovechan y concentran el ácido silícico y forman exoesqueletos de formas diversas. Cuando la diatomea muere, su exoesqueleto silícico permanece en el fondo oceánico, formando rocas sedimentarias (tierra de diatomeas). También pueden ser arrastrados hasta las costas formando playas cuya arena es la sílice procedente de estas diatomeas. Figura 1.9. Exoesqueleto en diatomeas. (Fuente: Alfred Wegener Institute, Alemania) Por otro lado, el silicio es un elemento químico que es biocompatible y, por lo tanto, puede ser un buen componente para ser usado en biomedicina [135]. Las principales características de este elemento son las siguientes:  Biocompatibilidad: Relativamente inerte cuando se une a tejidos. Es utilizado para fabricación y recubrimiento de implantes.  Biodegradabilidad: Cuando el silicio nanoestructurado se degrada la toxicidad es baja para el organismo vivo.  Estabilidad cristalina: Forma estructuras resistentes.  Micromecanizabilidad: Se puede utilizar en procesos de microfabricación de microsensores.  Luminiscencia: Las partículas nanoestructuradas de silicio emiten fluorescencia.  Semiconductividad: Aplicable en microelectrónica. 1.2.4. Nanomateriales de sílice porosa: Zeolitas y Mesoporosos De acuerdo con la definición de la IUPAC, los materiales porosos se dividen en tres clases de acuerdo con el tamaño de sus poros [136]: Capítulo 1. Introducción 24  Microporosos. Tamaño de poro inferior a 2 nm. Dentro de este grupo estarían las zeolitas (Ejemplo: ZSM-5).  Mesoporosos. Tamaño de por entre 2 nm y 50 nm. Serían estructuras como la MCM-41 y la SBA-15.  Macroporosos. Tamaño de poro superior a 50 nm. Estos materiales tienen una relación superficie volumen muy elevada, con una alta área superficial debido a su gran porosidad y bajo tamaño de poro. A menudo, la estructura de estos poros es uniforme y ordenada. Las propiedades y la elevada área superficial, se han utilizado para diferentes aplicaciones en campos muy diversos como cromatografía, catálisis, separación, detección, almacenamiento de sustancias, bioingeniería, medicina, microelectrónica...[137]. En general, se caracterizan por su baja toxicidad, inercia y estabilidad [138]. Los principales usos que se han dado a estos materiales son los siguientes:  Separación en el campo medioambiental. Las restricciones sobre las emisiones de contaminantes son cada vez más importantes, por ello las industrias han de separar y retener las sustancias contaminantes como SO 2 [139], NO x [140] y VOCs [141]. Para ello han utilizado la adsorción en la superficie de los materiales nanoporosos [138].  Almacenamiento. Debido a la existencia de poros son buenos materiales para almacenar moléculas en el interior de estos, como por ejemplo, con fines bactericidas [142] o para liberar fármacos [130].  Catálisis. Los materiales nanoporosos ofrecen gran superficie para distribuir el catalizador y así, aumentar el área de contacto con los reactivos. [138].  Sensores. Las nanopartículas y los materiales nanoporosos poseen una elevada superficie específica, y por tanto, puede usarse para obtener una alta sensibilidad a pequeños cambios en el entorno de humedad, temperatura y concentración de alguna sustancia [138, 143, 144]. La capacidad de tamizado molecular de las zeolitas las hace ideales para discriminar entre distintas moléculas de acuerdo con sus dimensiones.  Aplicaciones biológicas. Estos materiales son de gran utilidad en nanobiotecnología, ya que se puede utilizar su superficie y poros para el almacenamiento, transporte y liberación de fármacos [75, 130] o de plásmidos utilizados en transfección [145].  MATERIALES MICROPOROSOS (ZEOLITAS) Entre la familia de los materiales con microporos, los miembros más conocidos son las zeolitas, que tienen una distribución estrecha y uniforme de sus microporos, debido a un sistema de poros definido cristalográficamente [146]. La introducción de las zeolitas sintéticas en 1950, produjo un cambio de paradigma en el mundo de materiales porosos y de la catálisis [137]. Hoy un día existen más de 200 estructuras diferentes de zeolitas [147, 148]. Estos materiales son una clase única de aluminosilicatos cristalinos ya que poseen un área superficial muy elevada, debido al bajo tamaño de los poros (entre 0,25 y 1 nm) [137], ofreciendo infinidad de posibilidades para adaptar estos materiales a un gran número de reacciones químicas catalíticas y de almacenamiento de moléculas en estos Capítulo 1. Introducción 25 poros. Asimismo, tienen cationes intercambiables que les permite la introducción de otros cationes con diferentes propiedades como las catalíticas. En la Figura 1.10, se muestran diferentes estructuras de zeolitas clasificadas según la estructura y tamaño de su poro [149]. Figura 1.10. Estructuras de cuatro zeolitas seleccionadas (de arriba a abajo: faujasita o zeolitas X, Y; zeolita ZSM-12; zeolita ZSM-5 o silicalita-1; zeolita Theta-1 o ZSM-22) y sus sistemas de microporos y dimensiones [149] Otro de los aspectos importantes es el tamaño y forma de cristal que forma la zeolita. Las zeolitas sintetizadas convencionalmente tienen un tamaño de cristal de orden de decenas o cientos de micras, como es el caso de la silicalita-1 (estructura tipo MFI) de la Figura 1.11. Sin embargo, se está trabajando en la reducción del tamaño de partícula a escala nanométrica, cambiando las propiedades tradicionales de los materiales utilizados principalmente en catálisis y separación. De este modo, al reducir el tamaño de cristal aumenta y adquiere mayor importancia la superficie externa [150]. Figura 1.11. Cristales de ZSM-5. Diferentes tamaños Estructura MFI Capítulo 1. Introducción 26 La estructura MFI característica de los isomorfos silicalita-1 y ZSM-5, es una de las zeolitas más estudiadas por su fácil preparación y su estabilidad térmica y química. Tal y como se observa en la Figura 1.10 presenta un sistema tridimensional con dos tipos de canales, unos canales rectos (0.53 nm x 0,56 nm) y otros canales sinusoides (0,51 nm x 0,55 nm) [147]. Las zeolitas se sintetizan utilizando un agente estructurante que dirige la polimerización del precursor silíceo de una manera ordenada para formar los poros y que es finalmente eliminado generalmente mediante calcinación o mediante extracción [151]. La ZSM-5 (Figura 1.12) es una de las zeolitas más utilizadas. Su fórmula química es Na n Al n Si 96-n O 192 · 16H 2 O (0 <n <27) y fue patentada por Mobil Oil Company en 1975. Tiene una baja proporción de aluminio, es decir, un elevada relación Si/Al [111]. Asimismo, dependiendo del catión de compensación, la ZSM-5, al igual que muchas otras zeolitas, puede presentarse en diversas formas: protónica (H-ZSM5), amónica (NH 4 -ZSM5) sódica (Na-ZSM5)… que poseen una gran versatilidad, ya que puede intercambiarse con metales como cobre [152] o plata [111] y ser utilizada como agente bactericida [111, 153] o como catalizador [154]. Figura 1.12. Cristales de ZSM-5. Forma del cristal y detalle de los poros Sin embargo, las zeolitas presentan limitaciones debidas principalmente al tamaño de poro. Las zeolitas no pueden participar en aquellas reacciones o sistemas en los que se necesita moléculas de gran tamaño molecular, ya que aunque pueden adsorberse en su superficie, no pueden almacenarse en el interior de los microporos [146]. Para ello, se está investigando en el desarrollo de zeolitas con estructuras porosas jerárquicas proporcionando un sistema de mesoporos adicional a los microporos, [155, 156]. Por otra parte existen los denominados zeotipos o materiales semejantes a las zeolitas. Tienen estructuras muy similares a las zeolitas pero con otros elementos distintos al silicio, aluminio y oxígeno. Por ejemplo, se han realizado sustituciones isoelectrónicas de dos átomos de silicio, por uno de aluminio y otro de fósforo, la cual ha llevado al descubrimiento de una amplia gama de fosfatos de aluminio [157, 158]. Se han sintetizado de igual manera tetraedros con la fila siguiente de la tabla periódica al silicio y aluminio, es decir, con galio y germanio [159, 160]. Los zeotipos más característicos son los AlPOs (fosfatos de aluminio) o SAPOs (silicoaluminofosfatos de aluminio). Así, en los microporosos de AlPO 4 (AlPOs), la estructura de su red consiste en una secuencia estrictamente alternante Al-O-P (Al 3+ y P 5+ unidos por 4 átomos de O, Capítulo 1. Introducción 27 con dos cargas negativas pertenecientes a dos tetraedros), dando lugar a una red neutra, como en el caso de las zeolitas. Dependiendo de la combinación de cationes metálicos en la red, son, en principio, posibles estructuras con cargas positivas o negativas. Por otra parte, sobre las redes de los materiales zeolíticos se pueden depositar metales o complejos metálicos [161]. Del mismo modo que las zeolitas, los zeotipos son útiles en un gran número de aplicaciones, como catalizadores y soporte de estos, para realización de intercambio iónico y para la adsorción [162].  MATERIALES MESOPOROSOS Debido a los inconvenientes anteriormente citados de las zeolitas para el procesado de moléculas grandes, se investigó sobre el aumento de tamaño de poro hasta que en 1992 la compañía Mobil Oil Corporation descubrió un material silíceo con nuevas características [146]. Este fue el MCM-41 que mostró una matriz ordenada y poros hexagonales unidimensionales con mayor tamaño de poro que las zeolitas pero también con una distribución estrecha [163]. A partir de este descubrimiento, fueron apareciendo otros sólidos mesoporosos y se adquirió experiencia sobre diferentes aspectos de su síntesis, modificación superficial, aplicación en otros materiales y catálisis [146, 164]. Las propiedades fundamentales que definen cualquier material mesoporoso son la estructura de poro y su tamaño, tal y como se muestra en la Tabla 1.9. Tabla 1.9. Características estructurales de algunos materiales mesoporosos [164] Sólido mesoporoso Diámetro de poro (nm) Estructura MCM-41 2-5 Canales hexagonales 1-D MCM-48 2-5 Cúbica 3-D SBA-15 5-10 Canales hexagonales 1-D SBA-16 Mínimo 1-6; Máximo 4-9 Ordenamiento de los poros centrado en el cuerpo. SBA-1 2-4 Cúbica 3-D SBA-3 2-4 Hexagonal 2-D MSU 2-5 Hexagonal 2-D HMS 2-5 Hexagonal Para la síntesis de los nanomateriales mesoporosos, se necesita la participación de un surfactante en disolución acuosa, que actúa como agente director de la estructura que dirige la polimerización de las especies silíceas que provienen del precursor, normalmente ácido ortosilícico, tal y como se muestra en la Figura 1.13 [165, 166]. Dependiendo de las condiciones de síntesis, la fuente de sílice o el tipo de surfactante, aparecen diferentes tipos de materiales mesoporosos, como se muestra en la Tabla 1.9 [146]. Capítulo 1. Introducción 28 Figura 1.13. Síntesis y formación de MCM-41 [166] Atendiendo a la forma de los poros, en primer lugar, se encuentran las estructuras que contienen poros unidireccionales, como MCM-41 o SBA-15 (Tabla 1.9). Ambas poseen un empaquetamiento hexagonal de poros longitudinales, cuya sección transversal se asemeja más a un hexágono. No obstante, difieren en que SBA-15 puede contener además un sistema secundario de microporos (poros cuyo diámetro es menor que 2 nm) que conectan entre si los canales grandes, y cuya presencia depende en gran medida de la temperatura de síntesis del material [166]. Figura 1.14. Esquema ilustrativo del sistema poroso en SBA-15 [166] Y en segundo lugar, destacan las estructuras que poseen sistemas de poros tridireccionales, formados por la intersección de poros longitudinales a lo largo de las tres direcciones del espacio, como sería la MCM-48 (Tabla 1.9). 1.3 LA PLATA COMO BACTERICIDA 1.3.1 Evolución histórica de la utilización de la plata Los efectos bactericidas de la plata se conocen desde la antigüedad. Ya en la Antigua Grecia y Roma se usaban monedas de plata para preservar el agua libre de microbios en recipientes [167, 168], y así, aparece escrito por el filósofo griego Herodoto. También, se menciona el uso de la plata en el Antiguo Egipto, y es conocido el uso que se hacía de palillos de plata para comer en el Imperio Chino [169]. Capítulo 1. Introducción 29 Durante la Edad Media, también se aprovecharon las propiedades bactericidas de este material, ya que se continuó utilizando para la desinfección de los suministros de agua y para proteger los alimentos que se almacenaban durante mucho tiempo. La clase social adinerada, comía con cubiertos de plata para evitar a los gérmenes, y fue a raíz de entonces, y antes de que llegaran los antimicrobianos modernos, cuando empezó a fabricarse los utensilios para comer y beber de plata para evitar contaminaciones bacterianas [169]. En el Siglo XVIII, el nitrato de plata ya se emplea para el tratamiento de las infecciones microbianas diferentes, tales como las enfermedades venéreas, fístulas de las glándulas salivales, huesos y abscesos perianales [170, 171]. Además, a partir de 1800, se empezó a aplicar el nitrato de plata líquido o en apósitos para evitar infecciones, como la fiebre tifoidea e infecciones posparto, y facilitar la epitelización de las heridas, y fue reconocido como una buena herramienta para el tratamiento de quemaduras [170, 172]. Durante el Siglo XIX, los marineros descubrieron que la colocación de monedas de plata en los barriles de agua, vino y productos perecederos que llevaban en sus barcos ayudaban a mantener estos productos libres de contaminación. Esto, lo aprendieron de los primeros colonos de Estados Unidos que añadían dólares de plata a los recipientes de leche fresca para su conservación [168, 169]. En la Primera Guerra Mundial, se utilizaron hojas de plata para tratar las infecciones de las heridas que habían sufrido las tropas durante el combate. De hecho, el uso de la plata se extendió tanto y su eficacia fue tan evidente, que en 1920 la FDA en Estados Unidos aprobó las disoluciones de plata como agente antibacteriano seguro, incluso en alimentos. Así de esta manera, la plata coloidal (partículas de plata en agua) fue usada de manera generalizada en hospitales [169]. Sin embargo, durante la Segunda Guerra Mundial apareció la penicilina para eliminar las infecciones de las heridas de los soldados y debido a esto, los tratamientos basados en plata, poco a poco, fueron sustituidos por los antibióticos [173, 174]. Sin embargo, debido a la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y aun mayor control del uso de estos [175], la plata, de nuevo, ha vuelto a cobrar importancia como agente antimicrobiano de amplio espectro. 1.3.2 Mecanismo de acción de la plata Se han estudiado los diferentes mecanismos de acción de la plata sobre las biomoléculas y el metabolismo bacteriano, y se ha observado que la acción depende del estado químico en que se encuentre la plata. Sin embargo, muchos de los mecanismos moleculares de la plata, están aún por investigar [176] y no está, ni muchos menos, exento de controversia su modo reacción. A continuación se resume algunos de los resultados publicados con plata con distintos materiales que contienen plata:  PLATA METÁLICA (Ag 0 )  La plata metálica interacciona con los grupos tiol de las enzimas que participan en la cadena respiratoria de las bacterias. Además, se une a la pared y membrana celular [170]. Las bacterias realizan la respiración celular gracias a unas proteínas y enzimas Capítulo 1. Introducción 30 transmembranas, por lo que estos efectos hacen que el proceso de respiración quede inhibido.  Se ha investigado en algunas bacteria como E.coli, que este metal inhibe el sistema de absorción y liberación de fosfatos, manitol, succinato, prolina, glutamina, todas ellas moléculas esenciales en muchas bacterias [177-181].  Dentro de la plata metálica, adquiere una gran relevancia el estudio de las AgNPs.  Las nanopartículas tienen una relación área superficial por unidad de volumen más elevada que otras formas de plata (por ejemplo micropartículas de plata), lo que proporciona un mejor contacto con los microorganismos y aumenta su capacidad de liberar iones plata al medio circundante.  Estas AgNPs se unen a la membrana y pared celular de los microorganismos o penetran en el interior de estas, cuya toxicidad se explica en el siguiente apartado.  Estos compuestos interaccionan con el azufre de las proteínas y el fósforo del ADN. Además son capaces de liberar iones plata, y así aumentan su efecto bactericida.  Cuando las AgNPs entran en la bacteria, la bacteria agrupa la plata en unos compuestos de bajo peso molecular para evitar que se liberen iones plata y ataquen al ADN [182-184].  PLATA IÓNICA (Ag + ) Y NITRATO DE PLATA (AgNO 3 )  Cuando los iones plata entran en el citoplasma de las bacterias, se unen a los fosfatos que forman parte de la estructura del ADN y este se condensa [182]. El ADN se encuentra en forma condensada cuando no está realizando ninguna función, y esta en conformación laxa cuando se replica y cuando se transcribe a ARN mensajero, que dará lugar a proteínas. Por lo tanto, la unión de la plata, provoca la inhibición de la multiplicación bacteriana, la inhibición de la síntesis de proteínas y finalmente la muerte celular.  Como otros iones de metales pesados, la plata iónica se une a los grupos tiol de las proteínas y enzimas, produciendo así su inactivación [185].  ZEOLITAS CON PLATA  El efecto bactericida es debido a los iones plata que están en la zeolita como cationes de compensación y se intercambian con otros cationes existentes en el medio y no a la plata metálica [111, 186]. Así que, sus mecanismos de acción son muy similares a los explicados con la plata iónica.  Además, se ha demostrado, que la plata en esta forma química genera ROS que inhiben la respiración celular [176]. En resumen, la plata actúa a tres niveles esenciales en el metabolismo bacteriano, tal y como se indica en la Figura 1.15, y la plata en todos sus estados químicos contribuyen a la toxicidad bacteriana: Capítulo 1. Introducción 37 Los nanomateriales, debido a sus propiedades, aportan grandes ventajas aunque es necesario estudiar sus riesgos ya que pueden llegar a atravesar membranas y barreras tan selectivas, como la barrera hematoencefálica. En resumen, mientras que en la normativa respecto a la plata y otros metales se han determinado unos valores claros y definidos cuando estos se presentan de forman convencional, en nanopartículas y nanomateriales, se está empezando a legislar debido a lo novedoso y reciente de su uso, y en la mayoría de los casos, se esta aún en proceso de recogida de datos, registro y observación de posibles efectos adversos. Se trata de un área en rápida evolución ya que por ejemplo, la concentración de plata encontrada en las costas europeas es muy baja (pg/L), y ha disminuido por el auge de la fotografía digital respecto a la analógica que utilizaba la plata para revelar las fotografías, pero sin embargo, está aumentado la concentración de plata en forma de AgNPs por el aumento del uso de la plata en esta forma [217]. 1.3.5 Ventajas de la plata respecto a otros materiales Como se ha señalado, la resistencia bacteriana a los antibióticos se está convirtiendo en un reto importante, principalmente en el ámbito médico y hospitalario. Esto, se ha debido a un uso generalizado de antibióticos que ha aumentado el número de organismos aislados resistentes a antibióticos [218]. Como consecuencia, y para contener a los microbios resistentes, se han adoptado varias recomendaciones para limitar y controlar el uso de antibióticos [219]. Por otro lado, el conocimiento de la plata como microbiano desde la antigüedad ha asegurado su uso como agente antimicrobiano [168], a pesar de lo cual, las resistencias bacterianas encontradas son limitadas como ya se ha comentado. Por ello, la plata tiene una serie de ventajas respecto a los antibióticos:  Tiene un gran espectro de actuación tanto contra gram-positivas y gram-negativas, con un mínimo desarrollo de resistencias [220] en un grupo controlado [202].  Los efectos secundarios son muy limitados [221].  Previene infecciones en piel, heridas e internas por el uso de catéteres cuando están recubiertos de plata [222].  Compatibilidad con la piel. En contrapartida, si que existen antibióticos de amplio espectro que actúan contra un gran número de bacterias como sería la tetraciclina y el cloranfenicol, que actúan inhibiendo la síntesis bacteriana [223]. Sin embargo, la mayoría de los antibióticos, actúan sobre unos grupos determinados de bacterias, siendo necesario identificar el tipo de organismo antes de seleccionar el antibiótico. Por ejemplo, la vancomicina que actúan sólo sobre los Gram positivos, inhibiendo la síntesis de la pared celular [224]. Tal y como se ha comentado anteriormente, si que existen resistencias a la plata, pero son mínimas y en un grupo muy reducido [202]. Sin embargo existen numerosas cepas bacterianas que se han hecho resistentes a un gran número de antibióticos. De hecho, existe un gran número de bacterias aisladas de cultivos de sangre que presentan indicadores de resistencia a múltiples antibióticos [225] como son: S.aureus resistente a la meticilina (MRSA), S.aureus resistente a la vancomicina (VRSA), Enterococcus resistentes a la vancomicina (VRE), Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina (PRSP), Enterobacteriaceae resistentes a cefalosporinas de tercera generación [226]. Capítulo 1. Introducción 38 Los antibióticos pueden producir un gran número de efectos secundarios. Uno de los más característicos es la diarrea [227] debido a la destrucción de la flora bacteriana intestinal. El cloranfenicol es uno de los antibióticos más utilizados en oftalmología y está aumentando su uso en los países en desarrollo. Actúa a nivel ribosomal y de síntesis de proteínas bacterianas. Debido al origen endosimbiótico de las mitocondrias, siendo el orgánulo energético de la célula, también se convierten en diana de este antibiótico, produciendo graves efectos secundarios como la miopatía [228]. Sin embargo la plata usada a nivel hospitalario, como por ejemplo en recubrimientos de prótesis, no ha producido efectos secundarios tóxicos ni en la sangre, ni en el hígado, ni el riñón [229], aunque en algunos casos producía inflamación [230]. Asimismo, son muy poco comunes los efectos secundarios ocasionados por la sulfodiazina de plata, que aún no están completamente explicados [231]. Aunque los apósitos utilizados para quemaduras en algunos casos si que han producido inflamación [232], los efectos son mucho menores que los causados por antibióticos. En resumen, la plata se ha convertido en una buena alternativa a los antibióticos, principalmente en tratamiento de quemaduras, heridas y en prótesis. Sin embargo, debido a su todavía poco extendida aplicación, no son tan conocidos sus efectos como en los antibióticos. 1.3.6 Plata en materiales nanoestructurados Debido a las propiedades bactericidas de la plata, se han empezado a utilizar en nanobiotecnología, en compuestos basados en este metal [233], como se muestra a continuación.  AgNPs Las nanopartículas de plata son muy útiles en ámbitos como la fotografía, la catálisis, el marcaje biológico, la fotónica, la optoelectrónica, la detección SERS, y con gran importancia en microbiología [234]. Se ha observado la propiedad bactericida de las AgNPs en numerosos estudios. Tal y como se muestra en la Figura 1.17, se observó una disminución de la carga bacteriana in vitro de E.coli en función de la concentración de AgNPs [235], en S.aureus rompiendo la pared celular [236], e incluso inhibiendo la formación de biofilm en P.aeruginosa y S.epidermidis [237]. Figura 1.17. Disminución del número de colonias de E.coli en presencia de AgNPs [235] Capítulo 1. Introducción 39  AgNPs VEHICULIZADAS También, se ha observado este efecto bactericida cuando las AgNPs van asociadas a algún tipo de material transportador. Se ha demostrado que AgNPs sintetizadas in situ mediante la reducción del AgNO 3 con borohidruro de sodio en hidroxisilicatos como la Montmorillonita, y aplicado este material en frutas y verduras, alarga la vida útil de estos alimentos reduciendo su carga microbiana [238]. Asimismo, las AgNPs soportadas en zeolitas demostraron ser eficaces contra E.coli y Salmonella typhi en medios de cultivo, incluso a tiempos muy cortos de 5 minutos con un 4 % en peso de contenido en plata en la montmorillonita [239]. También se han sintetizado in situ AgNPs en micropartículas de sílice de 180 µm a 500 µm [240] y en materiales mesoporosos silíceos como la SBA-15 [142] para la eliminación de bacterias. Figura 1.18. Síntesis in situ de AgNPs en microesferas de sílice [240]. AgNPs sobre SBA15 [142] En este mismo ámbito, también se ha estudiado la presencia de AgNPs en nanocomposites. Así por ejemplo, los nanocomposites con nanopartículas de plata sintetizadas in situ reduciendo la plata iónica con maltosa, muestran un significativo poder bactericida y fungicida contra diferentes especies de microorganismos típicamente caracterizados en enfermedades nosocomiales, por lo que se considera un buen material para las aplicaciones médicas de desinfección [241]. Además para evitar el problema médico asociado a la colonización y contaminación microbiana de los dispositivos médicos (prótesis, catéteres…) se ha investigado la disposición de AgNPs en láminas de chitosan/polivinilpirrolidona (PVP) mediante dip coating, obteniendo resultados muy satisfactorios eliminando el 100% de la carga bacteriana rápidamente y manteniendo esta propiedad bacteriana en el tiempo [242].  PLATA IÓNICA INTERCAMBIADA EN MATERIALES NANOESTRUCTURADOS Se ha aprovechado las propiedades de intercambio iónico que proporcionan las zeolitas, para incorporar el ión plata y por tanto dar una nueva característica como antimicrobianos a estos materiales. Los estudios realizados con zeolita A intercambiada con baja cantidad de plata (0,4 % en peso) [243] y con otras zeolitas [189], demuestran una elevada eliminación de bacterias, hongos y levaduras. Incluso, se han incorporado zeolitas intercambiadas con plata en apósitos y tejidos comerciales Capítulo 1. Introducción 40 [244], gomas y poliuretano [245] y se ha observado una efecto bactericida en varias enfermedades nosocomiales [244]. En resumen, se puede observar el gran potencial de la plata como bactericida en todas sus formas, y su alto potencial de uso en el ámbito hospitalario como profilaxis o como bactericida. 1.3.7 Sinergia de la plata con otros compuestos La sinergia se define como la acción de dos o más causas o compuestos cuyo efecto conjunto es superior a la suma de los efectos individuales [246]. Con este propósito se han realizado combinaciones de varios antibióticos [247-250] para potenciar y acelerar la eliminación de microorganismos, incluso la combinación de antibióticos con diferentes productos naturales, como extractos de hojas de té, de plantas del género Thymus, otros compuestos típicos de plantas [250, 251] y extractos de granada [252]. Existen también estudios sobre efectos sinérgicos entre plata y antibióticos. Así, por ejemplo, en varias especies del grupo Enterobacteráceas, se ha estudiado la sinergia entre AgNPs y AgNO 3 con péptidos antimicrobianos cuya función es permeabilizar la membrana [253], también entre AgNPs y antibióticos como eritromicina, meticilina, cloranfenicol y ciprofloxacina contra varias especies bacterianas como S.aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella enterica y Enterococcus faecalis [254], y entre AgNPs y antibióticos β-lactámicos en E.coli [255]. Asimismo se ha investigado la sinergia entre la plata y otros metales pesados. De esta manera, con la plata y el cobre se observó efecto sinérgico contra Legionella pneumophila y se postuló su posible uso en zonas hospitalarias para desinfectar el sistema de distribución de agua [256]. También se ha visto un aumento del poder bactericida de nanopartículas de zinc cuando estas están rodeadas con plata contra varias especies de Gram-negativa [257]. Sin embargo, no existen muchas investigaciones sobre la sinergia entre plata y compuestos típicamente usados en desinfección de superficies, aguas y sistema de distribución (cloro, H 2 O 2 , PAA…) y es difícil encontrar estudios sobre estos compuestos usados conjuntamente. No obstante, se ha observado sinergia entre plata y H 2 O 2 [258] en E.coli K-12 con una reducción de hasta tres unidades logarítmicas en el número de unidades formadoras de colonia por mililitro [259] y entre plata, cobre y cloro para eliminar amebas en agua [260]. Por ello, en esta memoria se presenta un estudio de la sinergia entre la plata y el ácido peroxiacético almacenado en los poros de materiales nanoestructurados, con excelentes resultados en eliminación de población bacteriana, eliminación del biofilm e impedimento en la formación de este biofilm como se mostrará en el apartado 6 [75, 142]. 1.4 APLICACIONES ACTUALES DE LA PLATA Debido a sus numerosas aplicaciones se prevé que el mercado asociado a la industria de la nanotecnología aumente de manera significativa llegando hasta los 3 billones de dólares en 2015 [261]. Entre todos los productos, destacan las nanopartículas, y Capítulo 1. Introducción 41 principalmente, las AgNPs. Se estima que del total de las nanopartículas en productos de consumo, las AgNPs tienen el más alto grado de comercialización [262]. El poder bactericida de amplio espectro de la plata y al gran desarrollo en nanotecnología, han permitido la aparición de nuevos y mejores productos desinfectantes. 1.4.1 Aplicación de la liberación de plata iónica El uso del nitrato de plata y por tanto de la plata iónica, es conocido desde hace tiempo. Por ello hay una gran variedad de productos con poder bactericida utilizados en diversos ámbitos que aprovechan las propiedades de este ión.  PRODUCTOS A NIVEL MÉDICO Y HOSPITALARIO Los iones plata se han utilizado en gran variedad de utensilios y material hospitalario para evitar infecciones y colonizaciones que podrían desembocar en enfermedades nosocomiales y además evitar infecciones en heridas y quemaduras.  Elastoplast® Silver Healing™ son unos apósitos que poseen una almohadilla de plata que libera iones durante el proceso de curación de las heridas para prevenir infecciones. Elimina, según sus fabricantes, más de 150 gérmenes nocivos y reduce riesgos de inflamación e infección a la vez que favorece la cicatrización [263]. Asimismo los apósitos de Curad® [264] y de Actisorb® silver (Johnson & Johnson New Brunswick, N.J.) siguen la misma estrategia. Atrauman® Ag (Unitex-Hartmann) es un apósito estéril de malla impregnado con una pomada hidrófila compuesta fundamentalmente por triglicéridos. Contiene iones de plata, que se liberan a concentraciones adecuadas, limitando su efecto a la superficie de la herida. Al entrar en contacto con la herida, se inicia el efecto antiséptico y los gérmenes son destruidos, a través del mecanismo conocido como “Touch and kill” [265]. Figura 1.19. Apósitos Elastoplast® Silver Healing™ [263]  AGC Flat Glass Europe ha desarrollado un cristal con propiedades antimicrobianas. Los iones de plata incorporados en el vidrio son responsables de la actividad antimicrobiana. La empresa demostró que el 99,9 % de las bacterias que entran en contacto con la superficie del vidrio son eliminadas. El vidrio fue elaborado para Capítulo 1. Introducción 42 ayudar a prevenir la propagación de agentes patógenos en el medio hospitalario [266].  AgION® es una empresa que se basa en el uso de zeolitas con plata como intercambiadores iónicos. Estas zeolitas se distribuyen formando una capa sobre fibras, polímeros u otros recubrimientos. En condiciones de humedad, cuando se desarrolla el crecimiento bacteriano, tiene lugar el intercambio iónico, los iones positivos (Na + . K + …) presentes en el ambiente, se intercambian con los cationes de plata contenidos en la zeolita, liberando esta la plata (Figura 1.20). Esta empresa desarrolla su tecnología en varios campos: salud (instrumentos médicos, recubrimientos de superficies…), industria alimentaria e industria textil [267]. Figura 1.20. Funcionamiento del intercambio iónico de la zeolita AgION® [267]  La sulfadiazina de plata ha sido utilizada como principio activo en Flammazine ® Silvadene ® ; y junto a otros compuestos como la clorhexidina en Silverex ® Motiff Laboratories Pvt. Ltd. Kare Health specialties, Verna, Goa y nitrato de cerio en Flammacerium ® , Solvay, Brussels, Belgium. Se presenta en forma de pomada para aplicar sobre la piel. Su formulación se produce a partir del nitrato de plata y la sulfadiazina de sodio mediante la sustitución de un átomo un átomo de sodio por uno de plata en la sulfadizaina. Este compuesto es el compuesto con azufre y plata más eficaz [268]. Otros ejemplos de investigaciones que se siguen realizando para mejorar la acción y la eficacia de estos productos son los siguientes:  La zeolita A intercambiada con plata, ha demostrado ser un buen agente bactericida contra S. mutans, S. mitis, C. albicans, S. aureus y P. aeruginosa in vitro [189], la zeolita ZSM-5 contra S. aureus [111] y la faujista intercambiada con plata contra las bacterias E. coli y B. subtilis y las levaduras S. cerevisiae y C. albicans [269].  Se han producido vidrios bioactivos con la presencia de iones plata en su superficie con posibles usos en industria y salud [270], utilizando nitrato de plata en la síntesis y fabricación de vidrio. El poder fungicida contra C. albicans depende de la concentración de nitrato de plata en el medio de intercambio iónico pero no del tamaño de la partícula de vidrio utilizada en la síntesis [271].  Los nanocomposites intercambiados con plata, también han sido ampliamente utilizados como bactericidas. Por ejemplo, con películas de nanocomposites basados en hidroxiapatita y titanio con iones plata sobre superficies de titanio se ha Zeolita (portador) Iones de plata Iones de sodio (presentes en la humedad) Mecanismo de acción: intercambio iónico. Liberación de iones plata Capítulo 1. Introducción 43 constatado una reducción del 98 % en S. aureus y más del 99 % en E. coli después de 24 horas de incubación [272].  PRODUCTOS ALIMENTICIOS La liberación de iones plata directa desde el nitrato de plata o a partir de diversas matrices, también ha sido aprovechada por la industria alimentaria y en operaciones de procesado, almacenamiento y mantenimiento de los alimentos.  Se ha investigado el uso de AlphaSan ® (Milliken, Gent, Belgium) para recubrir la parte interna de frigoríficos fabricados por Bosch & Siemens Hausgeräte GmbH (Glengen, Germany). Es una resina cerámica basada en fosfato que se ha intercambiado iónicamente con plata. De este modo, se obtiene una liberación controlada de los iones plata que produce un efecto antimicrobiano contra los géneros Staphylococcus, Lactobacillus y Pseudomonas, con una reducción de hasta 5,9 unidades logarítmicas [273]. Figura 1.21. Intercambio iónico de la plata del polímero con la superficie [273]  Ice-O-Matic® es una empresa que fabrica contenedores y máquinas de fabricación de hielo. Para evitar la contaminación de estas por hongos y bacterias, las superficies de los contenedores y máquinas se han recubierto con iones de plata con la tecnología de AgION® [274].  Sherwin-Williams® una empresa de pinturas [116] incorpora plata en un tipo de superficie denominada FasTop S®, que se utiliza en plantas de tratamiento de alimentos y cocinas [116]. Esta combinación ha incorporado los iones plata a través de la tecnología AgION® para tratar superficies y dotarles de propiedades bactericidas [116].  La empresa Samsung® ha desarrollado lavadoras que liberan iones de plata que se incorporan a los tejidos y crean una capa de protección microbiana. También ha creado frigoríficos con superficies recubiertas con AgNPs que cuando entran en contacto con microorganismos liberan iones plata, favoreciendo la conservación de los alimentos [275]. Han extendido estos desarrollos a otros instrumentos como teclados de ordenadores, superficies, etc. Capítulo 1. Introducción 44  Se ha patentado la utilización de sepiolita intercambiada con plata para la esterilización de alimentos a altas temperaturas (140ºC) y tiempos cortos (1 s) [276]. Otros materiales estudiados son los composites basados en plata, con los que se ha observado una liberación de iones plata continua y prolongada, demostrando que aquellos composites con mayor cantidad de peso (4% y 8% en peso) aumenta la liberación de iones plata a partir del sexto día en compartimentos de almacenamiento de líquidos [277].  Se ha mostrado el efecto bactericida en tablas de cortar alimentos conteniendo zeolita intercambiada con plata en condiciones de humedad contra S.aureus, pero los compuestos orgánicos neutralizaron la acción de la plata [278].  OTROS USOS La plata como desinfectante se ha aprovechado en numerosas industrias:  Kohler® es una empresa dedicada a la fabricación de inodoros, y ha producido asientos de WC mezclando en su síntesis iones de plata para eliminar gérmenes, principalmente aquellas bacterias, hongos y mohos causantes del mal olor [279].  Odin wear® fabrica ropa que libera iones plata para el control del olor, y para proteger la piel de posibles gérmenes. Para ello utiliza la tecnología de Silverplus® empresa que fabrica tintes y recubrimientos con iones plata. La tecnología Silverplus® se basa en nanopartículas de dióxido de titanio recubiertas de cloruro de plata que en contacto con la humedad liberan iones plata [280]. De hecho, uno de los campos novedosos de investigación esta relacionado con fibras que liberan iones plata a partir de AgNPs que recubren sus superficies, encontrando un buen poder antimicrobiano con E. coli, S. aureus, C. albicans [281]. Figura 1.22. Mecanismo de acción de la tecnología Silverplus® (Fuente: Silverplus®) Nanopartícula s de dióxido de titanio Cloruro de plata Ión plata Ión cloruro Humedad Capítulo 1. Introducción 45  National Furniture® es una empresa que fabrica muebles utilizando la tecnología de AgION®. En sus líneas de muebles las superficies son capaces de liberar iones plata para inhibir el crecimiento de moho, hongos y bacterias que pueden causar malos olores y manchas [282]. También se ha evaluado con éxito la capacidad bactericida de una suspensión coloidal de plata, sobre microorganismos encontrados en los muebles de museos y archivos que son los responsables del deterioro de las piezas encontradas en estos lugares [283]. Figura 1.23. Mecanismo de liberación de iones plata en muebles [282] 1.4.2 Aplicación de la liberación de plata metálica (AgNPs) Debido al auge de la nanociencia el uso de las AgNPs con uso bactericida, se está convirtiendo en un importante campo de investigación con el desarrollo de una gran variedad de productos.  PRODUCTOS A NIVEL MÉDICO Y HOSPITALARIO En medicina nos encontramos varios tipos de vendas y apósitos que incorporan AgNPs, principalmente, usados a nivel tópico para prevenir o curar infecciones en heridas y quemaduras.  La FDA aprobó el uso de tubos endotraqueales de respiración con una fina capa antimicrobiana de plata después de que varios estudios demostraran que podían reducir el riesgo de neumonía en pacientes con ventiladores mecánicos [36].  Acticoat™ 7 con SILCRYST™ (Smith and Nephew Healthcare, UK) [284] son apósitos que contienen plata nanocristalina recubiertas por mallas de polietileno (Figura 1.24) para favorecer la curación y la eliminación de bacterias. Esta empresa también ofrece otros tipos de apósitos húmedos que favorecen a su vez la epitelización. Microorganismos Chapa de madera Madera con AgION ® que libera iones de plata Capítulo 1. Introducción 46 Figura 1.24. Apósito Acticoat™ 7 con SILCRYST™ [284]  La empresa NanoComposix (San Diego, California, EE.UU) desarrolla nanopartículas de plata para incorporarlas en apósitos y utensilios clínicos [285]. Silverlon®, es una empresa que suministra un gran número de utensilios médicos como catéteres, apósitos y guantes recubiertos con plata [286].  Se han desarrollado nuevos geles y pomadas de uso tópico con AgNPs, que han demostrado eficacia contra varias especies nosocomiales de bacterias y hongos [287].  Se investiga el uso de AgNPs incorporadas en quitosan para recubrir telas de poliéster en tratamiento de heridas para, además de favorecer la epitelización de heridas evitar su infección [288]. También se han añadido AgNPs a polietilenglicol [289], a nanofibras de sílice [290] o a fibras de algodón [291], todos ellos como posibles y novedosos agentes en apósitos. Figura 1.25. AgNPs sobre nanofibras de sílice [290]  PRODUCTOS ALIMENTICIOS La utilización de AgNPs ha sido aplicada a un gran número de materiales, productos y nuevas investigaciones para la conservación y mantenimiento de los alimentos, durante su tratamiento, almacenaje y manipulación.  Existen resultados satisfactorios, con una reducción de tres unidades logarítmicas de E.coli, en el almacenamiento y manipulación de rodajas de melón utilizando materiales de celulosa con AgNPs sintetizadas in situ [292]. También se ha observado una buena acción antimicrobiana en hidrogeles sintetizados con alcohol Malla de polietileno cubierta de plata nanocristalina Capítulo 2. Experimental 53 Un 40 % de la población humana es portadora de esta bacteria, sin que cause ninguna enfermedad. Es un microorganismo con un gran número de cepas, como la cepa S. aureus 9213 que es capaz de agregarse y formar biofilm [319]. También se ha demostrado que dicha cepa es resistente a antibióticos cuando forma el citado biofilm. Es la causa de una amplia variedad de enfermedades infecciosas en seres humanos, convirtiéndose en un grave problema de salud en la sociedad. Uno de los principales daños que ocasiona esta cepa, es la osteomielitis. Este biofilm presente en la prótesis, llega a conquistar el hueso y el tejido de alrededor, produciendo una infección que se cronifica, debido al bajo o nulo efecto de los antibióticos sobre las bacterias resistentes a este biofilm [320]. 2.2 CULTIVOS BACTERIANOS: CARACTERÍSTICAS PREPARACIÓN DE MEDIOS Y TAMPONES 2.2.1 Tampón fosfato salino (PBS) Las diluciones que se han realizado en todos los protocolos que se describen más adelante se realizan en PBS (Phosphate Buffer Saline) que tiene la siguiente composición: En 800 mL de agua se añaden las siguientes cantidades:  8 g Cloruro sódico (Panreac®)  0,2 g Cloruro potásico (Riedel de Haën®)  1,44 g Disodio hidrógeno fosfato (Panreac®)  0,24 g Potasio dihidrógeno fosfato (Panreac®) Seguidamente se ajusta el pH a 7,4 (+0,02), con ácido clorhídrico 37% (Panreac®) con el pHmetro (Eutech Instruments), y finalmente se afora la disolución con agua destilada hasta llegar a 1 L. 2.2.2 Medios de cultivo Para realizar los cultivos líquidos en los ensayos bactericidas se han utilizado los siguientes medios de cultivo:  Tryptone Soy Broth (TSB, Cultimed®, Panreac®). Es un medio líquido artificial no selectivo utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos exigentes y no exigentes. El medio tiene la composición que se detalla en la Tabla 2.1. Su preparación viene indicada por el fabricante: 30 g del medio deshidratado en 1L de agua destilada. Se calienta ligeramente hasta total disolución y se esteriliza en autoclave (Trade Raypa® Steam Sterilizer) a 121ºC durante 20 minutos [321]. Capítulo 2. Experimental 54 Tabla 2.1. Composición del medio nutritivo TSB Sustancia Cantidad (g/L) Peptona de Soja 3,0 D(+)-Glucosa 2,5 Peptona de Caseína 17,0 di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,5 Cloruro de sodio 5,0 pH 7,3 + 0,2 Los digeridos enzimáticos de soja proporcionan aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas complejas. La glucosa es una fuente de energía, el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico y el fosfato potásico dibásico actúa como tampón para controlar el pH. Este medio ha sido utilizado para la obtención de lo cultivos estacionarios y para hacer las diluciones para la obtención de cultivos en fase exponencial.  Mueller-Hinton (M-H, Scharlau®). Es un medio general no selectivo para bacterias. Su preparación también viene indicada por el fabricante. El caldo Mueller-Hinton es el más utilizado en la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y Bactericida (MIC y MBC, respectivamente) por diluciones seriadas. Su principal característica es que las concentraciones de timina, timidina y ácido 4-aminobenzoico, son lo suficientemente bajas para no inhibir la actividad antibacteriana de antibióticos y sulfamidas que se ensayan [321]. Su composición se indica en la tabla siguiente: Tabla 2.2. Composición del medio nutritivo MH Sustancia Cantidad (g/L) Almidón 1,5 Infusión de carne 2 Digerido pancreático de caseína 17,5 pH 7,4 + 0,2 Para realizar los ensayos de liberación de plata procedentes de los materiales se han utilizado dos tipos de medios de cultivo, uno para bacterias y otro para levaduras.  Tryptone Soy Broth (TSB). Anteriormente Descrito.  Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids (YNB, Difco™, Dickinson and Company). Se disuelven 6,7 g de YNB en 100 mL de agua destilada para obtener una solución 10x. Seguidamente, se le añade L-Leucina (fuente no animal, SigmaAldrich®), L-Histidina (fuente no animal, Sigma-Aldrich®) y D-Glucosa anhidra (Panreac®). Finalmente, se esteriliza y se diluye con agua destilada estéril hasta 500 mL para conseguir una concentración 2X. La composición se detalla en la tabla siguiente: Capítulo 2. Experimental 55 Tabla 2.3. Composición del medio nutritivo YNB 10x Sustancia Cantidad (g/L) D(+)-Glucosa 5,4 Vitaminas esenciales No indicada Sales No indicada L-Leucina 0,65 L-Histidina 0,14 pH 6,5-7 Para realizar el recuento en placa, se han usado placas Petri estériles (Deltalab®Eurotubo) con el siguiente medio de cultivo agar:  Tryptone Soy Agar (TSA, Cultimed®). Por el contenido de peptona de soja y peptona de caseína resulta una aportación nutritiva que permite el desarrollo óptimo de un gran número de microorganismos. Se prepara tal y como indica el fabricante, resuspendiendo 40 g del medio deshidratado en 1 L de agua destilada y calentando ligeramente hasta disolución total [321]. Se esteriliza a 121 ºC durante 20 minutos. Tabla 2.4. Composición del medio nutritivo TSA Sustancia Cantidad (g/L) Digerido pancreático de soja 5 Digerido pancreático de caseína 15 Cloruro sódico 5 Agar 15 pH 7,3 + 0,2 2.3 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) Y CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA (MBC) MIC y MBC son los principales parámetros farmacocinéticos para determinar la actividad de un determinado agente antimicrobiano frente a un determinado patógeno. MIC se define como la concentración de agente antimicrobiano menor que inhibe in vitro el crecimiento de un determinado organismo infeccioso y la MBC se define como la menor concentración de agente antimicrobiano que se necesita in vitro para eliminar el 99,99% del inóculo inicial del organismo. Para ello se eligieron dos antibióticos comúnmente usados a nivel hospitalario como son la Cefazolina® y la Cefuroxima®, ambas del grupo de las cefalosporinas de primera y segunda generación respectivamente, y otro de nueva generación como es la oxazolidinona Linezolid®. El mecanismo de actuación de estos antibióticos se describe en el Apéndice. Capítulo 2. Experimental 56 Loa ensayos realizados están basados en las recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) usando el método de microdiluciones o también llamado método de las diluciones decimales. El protocolo se realiza en placas microtiter de 96 pocillos (8 filas x 12 columnas). Se hacen 12 diluciones 1:2 de los antibióticos desde 512 µg antibiótico/mL hasta 0,25 µg antibiótico/mL. Las diluciones se llevan a cabo en 100 µL de medio cultivo MuellerHinton. Se realizan dos réplicas de cada antibiótico (2 filas) y dos controles (agua destilada). Una vez realizadas estas diluciones se añade a cada pocillo 100 µL de una concentración de S.aureus de 5x10 5 CFU/mL. La placa microtiter se deja en la estufa (JP Selecta®) a 37ºC en incubación toda la noche. El día siguiente el primer pocillo correspondiente a la menor concentración de cada antibiótico que esté claro (sin turbidez que indique crecimiento) corresponderá a la concentración MIC. Para determinar la MBC se siembra una gota de 50 µL en placas de TSA de todos los pocillos que no están turbios y por tanto no ha habido crecimiento y se dejar toda la noche en incubación a 37ºC. La MBC corresponderá a la placa procedente del pocillo de menor concentración de cada antibiótico en el que no ha habido crecimiento. 2.4 ESTUDIOS DE FORMACIÓN DE BIOFILM Para estudiar la formación de biofilm sobre distintos materiales se ha llevado a cabo el siguiente protocolo [320]: En tubos previamente esterilizados se añaden 2mL de medio de cultivo TSB y 50 µL de un cultivo estacionario de 18-20h de S.aureus con una concentración 10 9 UFC/mL. Estos tubos contienen las piezas o materiales que se desean probar para comprobar si se forma biofilm en su superficie. Estos materiales han sido previamente esterilizados, bien en autoclave o bien con vapores de etanol si estos materiales contienen algún elemento sensible a la temperatura y humedad como se ha mencionado anteriormente. Se hacen dos o tres réplicas por tiempo y por material. La formación de biofilm se ha estudiado a 1, 2, 12, 24 y 48 horas a 37ºC. Cada 12 horas para los estudios de 24 y 48 horas se renueva el medio de cultivo. A los tiempos indicados los materiales estudiados se recuperan en condiciones de esterilidad y se lavan con PBS para eliminar aquellas bacterias que no se han unido y por tanto no forman parte del biofilm. Seguidamente, los materiales se sumergen en 2 mL de PBS y se les aplica ultrasonidos en un baño (JP Selecta) a 40 Hz durante 15 minutos para los tiempos de 1, 2 y 12 horas, y durante 30 minutos para los estudios de 24 y 48 horas. De esta manera se consigue la disgregación del biofilm de los soportes estudiados para después realizar el recuento en placa. Para ello se realizan siete diluciones 1:10 en PBS y se siembran tres gotas de 25 µL en placas de TSA, que posteriormente se dejan incubando toda la noche a 37ºC. 2.5 ESTUDIOS BACTERICIDAS Para comprobar las propiedades bactericidas de los materiales se ha llevado a cabo el siguiente protocolo [37]: Capítulo 2. Experimental 57 En tubos previamente esterilizados, se añaden aquellos materiales en los que se quieren ensayar sus propiedades bactericidas. Normalmente se evaluaron 60 mg de material en 2 mL de medio de cultivo bacteriano, pero hubo materiales en los que fue necesario analizar otras concentraciones. Estos materiales, al igual que en el apartado anterior, se esterilizan o en autoclave o con vapores de etanol si los materiales que se desean analizar son sensibles a la temperatura o a la humedad. Seguidamente se añaden 2 mL de un cultivo estacionario de S.aureus con una concentración aproximada de 10 9 UFC/mL. Se realizan estudios a 4, 6 y 24 horas, haciendo dos o tres réplicas por material, según la cantidad de que se dispusiera de los diferentes materiales, y por tiempo. A los tiempos determinados se disgregan los materiales y los organismos mediante ultrasonidos a 40 Hz durante 15 minutos para los estudios de 4 y 6 horas, y durante 30 minutos para los estudios de 24 horas. Posteriormente, se realizan siete diluciones 1:10 en PBS y se siembran tres gotas de 25 µL en placas de TSA y se dejan incubando durante toda la noche a 37ºC. Se eligió está concentración de cultivo estacionario porque es en la que mayor concentración de microorganismos viables hay. Por otro lado al ser una cepa formadora de biofilm, es esta fase en la que el biofilm es más estable [322] . Además, en esta fase el metabolismo cambia respecto a la fase exponencial y se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios, que en muchos casos, les sirven de protección. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio, o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. Finalmente se eligió trabajar con la fase estacionaria porque tiene gran importancia, ya que probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales [323]. Figura 2.2. Cinética de crecimiento bacteriano [324] TIEMPO (h) N ú mero logar í tmico de bacter ias Fase Lag Fase Log o de crecimiento exponencial Fase estacionaria Fase de muerte o de decline logar í tmico Capítulo 2. Experimental 58 Como desventaja se podría decir que en ella no se incrementa el número de bacterias, ni la masa ni otros parámetros del cultivo. Por ello se decidió hacer también algunos estudios con una concentración bacteriana de 10 5 CFU/mL, es decir, en fase exponencial donde las bacterias se están multiplicando rápidamente. 2.6 ESTUDIOS BACTERICIDAS UTILIZANDO CAMPO ELÉCTRICO PARA ACELERAR LA OXIDACIÓN DE LA PLATA METÁLICA El proceso que tiene lugar en estos experimentos, es el de reducción-oxidación no espontáneo, sino inducido por una corriente eléctrica continua que favorece y facilita la consecución de aquellas reacciones de potencial inferior a cero, y por tanto no espontáneas. En este proceso se basan también, las celdas voltaicas y algunos equipos comerciales como las lavadoras Samsung® [275] y otros equipos que utilizan corriente eléctrica para liberar plata iónica como se ha descrito en la introducción. Una reacción redox es aquella en la que uno de los compuestos se reduce y el otro se oxida. El reactivo que se oxida está perdiendo electrones que capta el que se reduce. En este trabajo la oxidación se consigue mediante la aplicación de un potencial eléctrico. Los electrodos, atraen a los iones de carga opuesta y se produce la transferencia electrónica entre ambos. La oxidación y la reducción tienen lugar en el ánodo y en el cátodo respectivamente. Figura 2.3. Esquema de la reducción-oxidación. La colación de los nanohilos se realiza lo más cercana posible a los electrodos para facilitar el paso de la corriente eléctrica. Como se explicará en el capítulo 4, los nanohilos pueden estar autosoportados en filtros de celulosa, inmersos en espuma de carbón vítreo o incorporados directamente al cultivo bacteriano El objetivo en este trabajo era determinar las propiedades bactericidas de los nanohilos de plata en presencia y ausencia de campo eléctrico. Cuando se lleva a cabo el proceso bajo campo eléctrico se favorece la oxidación de los nanohilos de plata Nanohilos de plata Cultivo bacteriano Capítulo 2. Experimental 59 metálica, que en otras condiciones es muy lento. De esta forma, se produce la oxidación de la plata en el ánodo. Además, el ión cloruro, aun en muy pequeñas concentraciones (ppm) del agua destilada, ya es capaz de producir un enlace iónico con la Ag + formando un precipitado de AgCl [308]. Por otro lado, en el cátodo tiene lugar la reducción del hidrógeno. Las reacciones que se dan son las siguientes: Reducción: H 2 O + e -  ½ H 2 + OH - E = -0,82 v. Oxidación: Ag + Cl -  AgCl + e - E = 0,222 v. Ag  Ag + + e - E = -0,79 v. El sistema experimental en el que se realizó la electrólisis está formado por dos electrodos inertes de grafito. Los electrodos están situados en un vaso de precipitados e inmersos en cultivo estacionario realizado en medio de cultivo líquido (TSB), que es una solución conductora iónica (ver composición en el apartado 2.2.2). Además de las reacciones mencionadas anteriormente el proceso de electrólisis en un cultivo estacionario desarrollado en medio de cultivo líquido (TSB) también tiene como resultado la formación de cloro e hidrógeno en el cátodo y en el ánodo respectivamente. Las reacciones que se llevan a cabo son las siguientes: Reducción: H 2 O + e -  ½ H 2 + OH - E = -0,82 v. Oxidación: 2Cl -  Cl 2 + 2e - E = 1,40 v. Los electrodos de grafito estaban conectados a una fuente de corriente continua (HQ Power®, Alimentador Multitensión modelo 2A). Además, estaban inmersos en 5 mL de un cultivo estacionario de la bacteria modelo con los materiales a evaluar. Todo ello, al igual que en los estudios realizados anteriormente, se llevó a cabo en condiciones de esterilidad. En primer lugar, se evaluaron las condiciones bajo las cuales la propia corriente eléctrica no producía efecto biocida alguno. Para ello, se probaron 3 voltajes 6 V, 9 V y 12 V, durante 10, 20 y 30 minutos, y durante 30 minutos dejando actuar sin voltaje durante 24 horas a 37ºC. Se hicieron dos réplicas por tiempo, voltaje y material. A continuación, se pasaron por ultrasonidos aquellas muestras que estuvieron 24 horas incubando para disgregar el posible biofilm formado. Seguidamente, se realizaron siete diluciones 1:10 en PBS y se sembraron 3 gotas de 25 µL en placas de TSA y se dejaron incubar toda la noche a 37ºC, para al día siguiente contar las unidades formadoras de colonias que habían crecido. 2.7 ESTUDIOS DE DETECCIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS) POR PEROXIDACIÓN LIPÍDICA. MALONIL DIALDEHIDO (MDA) Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas extremadamente reactivas, y que se forman durante el consumo y metabolismo del oxígeno. El ión hidroxilo, y el superóxido serían dos ejemplos de ROS. Los ROS son peligrosos porque pueden afectar a la estructura y función de las macromoléculas como las proteínas, ADN o lípidos. Si estos componentes son alterados de manera prolongada en el tiempo, se produce la muerte celular. Muchos microorganismos, en condiciones normales, son capaces de Capítulo 2. Experimental 60 eliminar la reactividad de estas moléculas mediante enzimas como la Superóxido Dismutasa (SOD) [325]. El aumento en la producción de ROS en el interior de las células, está relacionada con la adición externa de tóxicos o agentes oxidantes [326]. Los materiales evaluados en este trabajo, tenían una potencial toxicidad y se decidió comprobar si se producía un aumento de ROS. En condiciones ambientales óptimas, los seres vivos generan una concentración constitutiva y basal de ROS, aunque los antioxidantes naturales presentes en las células son capaces de eliminarlos. Sin embargo, algunas condiciones ambientales adversas al organismo, causan un exceso de ROS, ya que conducen al desequilibrio entre producción y degradación de ROS. Este proceso se conoce como estrés oxidativo [327]. Una de las reacciones más destacadas que producen los ROS, es la peroxidación de lípidos de la membrana [325], dando lugar al malonil dialdehido (MDA) que es un producto secundario final proveniente de la oxidación de los ácidos grasos polinsaturados y se considera un índice característico indicador de la peroxidación lipídica. El MDA actúa como mutágeno endógeno y se forma a través de la autooxidación y degradación enzimática de los ácidos grasos polinsaturados en las células. Sinnhuber en 1958 [328]; Heath y Packer en 1968 [329]; Pelle en 1990 [330]; Du y Bramlage en 1992 [331] y DeLong y Steffen en 1997 [332] ya utilizaron la reacción del MDA con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) como medida de la peroxidación lipídica y por tanto, la presencia de ROS en las células. La reacción de MDA con TBA produce un cromógeno rojizo con una absorbancia máxima a 532 nm [333] y por tanto medible y cuantificable con un espectrofotómetro. Las siguientes disoluciones son necesarias para llevar a cabo la determinación espectrofotométrica del MDA [333]: 1) Disolución de TBA + , la cual se almacena en condiciones de oscuridad a 4ºC y en agitación. Está constituida por 20 g de ácido tricloroacético (Sigma-Aldrich®), 0,01 g de hidroxitolueno butilado (SAFC®) y 0,65 g de ácido tiobarbitúrico (Sigma-Aldrich®). Todo ello aforado a 100 mL con agua MilliQ®. Esta disolución se denominó “Disolución TBA + ” por contener ácido tiobarbitúrico. 2) Disolución de TBA - , la cual se almacena en frío. Se prepara con 20 g de ácido tricloroacético y 0,01 g de hidroxitolueno butilado y se afora a 100 mL con agua MilliQ®. Esta disolución se denominó “Disolución TBA - ” por no contener ácido tiobarbitúrico. 3) Además es necesario utilizar Etanol al 80 % (v/v). 4) A continuación se ponen en contacto 300 mg de los materiales que se desean evaluar con 10 mL de un cultivo estacionario de S.aureus y se deja incubar una noche. 5) Al día siguiente, se centrifugan a 10000 rpm durante 10 minutos en la centrífuga (Jouan® B4i), eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet obtenido en 1 mL de Etanol 80 %. Para hacer la extracción se someten las muestras a sonicación en frío con un dedo sonicador (Branson® Sonifier Digital 250) en dos ciclos de 30 segundos y 15 segundos con un intervalo de vórtex de 1 minuto. También se realiza una homogenización antes y después de sonicar. Se realizan tres extracciones de esta misma manera. 6) Seguidamente, se prepara el blanco, utilizando Etanol 80 % y las muestras para ser medidas en el espectrofotómetro (Agilent® 8453) a 440 nm, 530 nm y 600 nm. Para el blanco se necesitan 2 mL de Etanol 80 % y 2 mL de TBA + y TBA - , y para las muestras 1 Capítulo 2. Experimental 61 mL del resultado obtenido de las tres extracciones (extracto) y 1 mL de TBA + y TBA - , de tal forma que se utiliza un blanco de TBA + y otro de TBA - , y de cada muestra, una con TBA + y otra con TBA - -. 7) A continuación, se incuban las muestras tapadas durante 25 minutos a 95ºC en la estufa (Memmert®) y después se dejan enfriar en la cámara fría durante 10 minutos. 8) Terminado el proceso de extracción y obtenidas las rectas de calibración correspondientes las muestras fueron analizadas mediante espectrofotometría. La determinación de los equivalentes de Malonil Dialdehido en nmol/mL, se llevó a cabo utilizando las siguientes ecuaciones: A= [(Absorbancia 532 TBA + ) - (Absorbancia 600 TBA + ) - (Absorbancia 532 TBA - ) – (Absorbancia 600 TBA - )] B= [(Absorbancia 440 TBA + ) – (Absorbancia TBA + ) x 0,0571] Equivalentes MDA (nmol/L)= (A – B / 157000) x 10 6 2.8 PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM) Para poder visualizar muestras en el SEM es necesario fijar y deshidratar las muestras biológicas sin perder su morfología estructural, ya que al hacerse vacío en el interior del microscopio las muestras colapsarían por pérdida del agua contenida en ellas y no sería posible la observación de su morfología. Se han visualizado tanto muestras de bacterias en suspensión que estaban en contacto con los materiales de interés como muestras fijadas como biofilm en la superficie de estos mismos materiales. El protocolo de fijación seguido para las muestras en suspensión y para el material biológico soportado sobre el material inorgánico se ha llevado a cabo en viales de 1,5 mL. Para muestras que son piezas o que son fácilmente manipulables con pinzas se ha realizado en placas microtiter de 12 pocillos. En el caso de las muestras tratadas en viales de 1,5 mL, la eliminación de los componentes, es decir, el medio de cultivo y el metanol y el tampón de glutaraldehido utilizados en la fijación y deshidratación de la muestra, se realiza por centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos. Para las muestras sólidas, la eliminación de los componentes nombrados anteriormente, se lleva a cabo cambiando la pieza de un pocillo a otro mediante pinzas previamente esterilizadas en autoclave. Lo primero que se ha de realizar en este protocolo es fijar la muestra con tampón de cacodilato de sodio con 2.5 % en peso de glutaraldehido 50 % en peso en agua y 0,1 M en sacarosa. Se añade 1 mL de este tampón a un pocillo de la placa microtiter donde están las muestras sólidas ó/y 1 mL al pellet de bacterias o bacterias-material polvo, en las que se ha desechado el sobrenadante. Se deja 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Para preparar el tampón se disuelven 320 mg de Cacodilato de sodio trihidratado (Sigma-Aldrich®) en 20 mL de agua destilada. Seguidamente a 19 mL de esta disolución se añade 1 mL de glutaraldehido 50% en peso en agua (Sigma-Aldrich®), y 60 mg de Sacarosa (Sigma-Aldrich®). Capítulo 2. Experimental 62 Posteriormente es necesario hacer gradientes de deshidratación a temperatura ambiente de la siguiente manera:  Metanol (Sigma-Aldrich®) 30% (v/v) 5 minutos (2 veces)  Metanol 50% (v/v) 5 minutos (2 veces)  Metanol 70% (v/v) 5 minutos (2 veces)  Metanol 100% (v/v) 10 minutos (2 veces)  Metanol (Sigma-Aldrich®) 100% anhidro (v/v) 5 minutos (2 veces) Finalmente las muestras se guardan en la nevera hasta su visualización al microscopio electrónico. Con esta deshidratación progresiva se trata de preservar la morfología de las células para que se aproxime en mayor medida a su estructura real en condiciones fisiológicas. 2.9 PREPARACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA EL MICROSCOPIO ÓPTICO INVERTIDO DE FLUORESCENCIA El microscopio de fluorescencia nos ha permitido visualizar el comportamiento del exopolisacárido que forma el biofilm en presencia y ausencia del ácido peroxiacético 36-40 % en peso estabilizado en ácido acético (PAA) (Sigma-Aldrich®). Para ello se llevaron a cabo dos tipos de pruebas. La primera para ver como el PAA inhibió la formación del biofilm en un portaobjetos, y la segunda para determinar como el PAA elimina el biofilm formado sobre otro portaobjetos. Se eligió como soporte un portaobjetos de vidrio por diferentes motivos: Entre ellos, es una superficie lisa y fácilmente manipulable. Esta demostrado que esta cepa es capaz de formar biofilm sobre vidrio [320, 334]. Y por último, la muestra ha de ser vista en un microscopio, por lo que se facilita el manejo de la muestra trabajando directamente sobre dicho portaobjetos. La primera prueba se llevó a cabo de la siguiente manera: Se obtuvo un cultivo estacionario de 20 horas al cual se añadieron 40 mL a un recipiente Pirex® de 100 mL previamente esterilizado, con un portaobjetos estéril en su interior y 40 mL a otro recipiente Pirex® de 100 mL que también contenía otro portaobjetos estéril. A un recipiente Pirex® se le añadió 90 µL de PBS y al otro 90 µL de PAA. Estos 90 µL de PAA corresponden a la proporción de PAA que está contenido en la zeolita (medido mediante termogravimetría) que se añade a los 2 mL de cultivo estacionario para hacer los ensayos bactericidas. Pasadas 3 horas se sacaron los portaobjetos de ambos recipientes Pirex® y se lavaron con 1 mL de PBS, para eliminar aquellas bacterias no adheridas y por tanto que no formaban parte del biofilm. Seguidamente se añadió el reactivo para la visualización posterior del biofilm, que es 1 mL de Calcofluor White Stain (Sigma-Aldrich®) y 1 mL de KOH, (Panreac®) 10%. Se dejó actuar durante un minuto y se retiró el exceso de reactivo con papel. A continuación se guardó en oscuridad para seguidamente ver las muestras al microscopio. Es importante recalcar, que tanto la muestra control (con PBS) como la muestra problema (con PAA) fueron tratadas de la misma manera y con los mismos tiempos. La segunda prueba consistió en inocular una colonia en dos recipientes Pirex® de 100 mL con 40 mL de TSB, ambos con un portaobjetos estéril dentro. Los dos recipientes se Capítulo 3. Plata iónica 69 Figura 3.4. A) y B) Microfotografías de TEM. Se pueden observar los cristales de la zeolita comercial NH 4 -ZSM5. En la microfotografía B, se muestra la geometría del cristal e incluso, se puede observar los poros de este material Seguidamente en la Figura 3.5, se muestra la Ag-ZSM5. En ella se puede observar agrupamientos de nanopartículas de plata metálica depositada en la superficie de los cristales (círculos discontinuos en rojo). Figura 3.5. A) y B) Microfotografías de TEM mostrando los cristales de la zeolita intercambiada Ag-ZSM5. En ellas se han redondeado los depósitos de plata metálica de diferente tamaño formados durante el intercambio con AgNO 3 También, mediante esta técnica se han podido constatar diferencias significativas entre las zeolitas comerciales intercambiadas con plata, así como las diferencias con la Ag-ZSM5 preparada en el laboratorio mediante intercambio iónico. La principal diferencia es la cantidad de plata presente en la superficie de los cristales zeolíticos. Dicha plata puede estar constituida por pequeños agrupamientos atómicos o por aglomerados de nanopartículas de plata. En las dos zeolitas comerciales se pueden observar numerosos agrupamientos de plata metálica depositada, mientras que en la Ag-ZSM5, en la figura anterior, son muy poco abundantes, debido a la baja B A B A B Capítulo 3. Plata iónica 70 concentración de plata utilizada durante el intercambio (cercana 0,2 % en peso, ver Tabla 3.7). Figura 3.6. Imágenes de TEM de A) Zeolita comercial granular B) Zeolita comercial en forma de pellet. Los agrupamientos más oscuros corresponden a la plata metálica. Si comparamos estas fotografías con las de la Figura 3.5 en las que aparece la Ag-ZSM5, se puede constatar la mayor presencia de agrupamientos de plata en estas zeolitas comerciales  DIFRACCIÓN DE RAYOS X Mediante esta técnica se pudo demostrar la cristalinidad de la zeolita comercial NH 4 - ZSM5, antes y después de la calcinación, y tras el intercambio iónico con plata. Las muestras se han comparado con un patrón de la ZSM5 y en todos los casos se observó la aparición de todos los picos característicos de este material. No se observaron picos característicos de difracciones causadas por plata metálica o por nitrato de plata. Figura 3.7. Resultados de la difracción de rayos X de NH 4 -ZSM5, H-ZSM5 y Ag-ZSM5. En esta figura se puede observar como todos los materiales mantienen los picos característicos del patrón del ZSM5 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Intensidad (u.a) 2 θ NH4-ZSM5 H+-ZSM5 Ag-ZSM5 Patrón ZSM5 Capítulo 3. Plata iónica 71 Además se pudo demostrar que aunque los cristales que aparecían en las fotografías obtenidas por microscopía electrónica de barrido tenían las aristas redondeadas y en algunos casos parecían carentes de forma cristalina regular, la difracción de rayos X demostró que estos cristales mantenían su estructura cristalina intacta después de todos los tratamientos realizados. El análisis del tamaño de la celda unidad aplicando la ecuación de Scherrer permitió demostrar que el tamaño de la celda se expandió de 20,5 nm en H + -ZSM5, a 23 nm en la zeolita Ag-ZSM5 después del intercambio. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3.7, no se observaron picos de difracción que potencialmente podrían haber producido agrupamientos de plata metálica o el nitrato de plata.  ESPECTROSCOPÍA DE FOTOELECTRONES EMITIDOS POR RAYOS X Con la ayuda de esta técnica, se logró obtener el porcentaje en peso de plata que posee la zeolita intercambiada con plata, Ag-ZSM5. A continuación en la siguiente tabla, se muestran los valores obtenidos para algunos de los diferentes lotes de AgZSM5 obtenidos durante el desarrollo de este trabajo: Tabla 3.1. Resultado de XPS de diferentes muestras de Ag-ZSM5 Material % de plata en peso AgZSM5_A 0,21% AgZSM5_B 0,22% AgZSM5_C 0,15% AgZSM5_D 0,11% MEDIA 0,17% Pese a ser una técnica superficial, se investigó si dicha composición se mantenía constante a lo largo de todo el espesor de la muestra. Mediante el análisis de la descomposición de perfiles obtenidos utilizando la técnica de eliminación de capas sucesivas del material mediante el bombardeo iónico (depth profiling) desde el exterior hacia el interior de la muestra se obtuvieron valores similares en todo el material analizado. Es decir, la composición superficial y la composición en el interior del cristal analizado se mantenía constante.  ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Por medio de esta técnica, se han podido determinar diferentes variables: 1. Cantidad de plata total intercambiada en la zeolita:  Mediante digestión del material con agua regia. La mezcla de ácido nítrico y ácido clorhídrico fue capaz de disolver la estructura de la zeolita quedando en disolución la plata, la cual se pudo medir mediante esta técnica.  Mediante intercambio con nitrato de sodio. La Ag-ZSM5 se intercambió con nitrato de sodio. De esta manera, el catión sodio desplazó el catión plata de la estructura de la ZSM5 quedando como Na-ZSM5, y la plata volvía a la disolución. Se midió la Capítulo 3. Plata iónica 72 concentración de plata que contenía dicha disolución y por tanto, se conseguía conocer la plata que formaba la Ag-ZSM5.  Mediante la medición de la plata que queda después del intercambio. La H-ZSM5 se intercambió con una solución que contenía una concentración conocida de nitrato de plata para obtener Ag-ZSM5. Seguidamente, se analizó la cantidad de plata que quedaba en esta solución de nitrato de plata, y por tanto, se pudo averiguar la cantidad que se había intercambiado y daba lugar a Ag-ZSM5. Los tres procedimientos anteriores proporcionaron valores comparables de la carga total de plata en la zeolita. 2. Cantidad de plata que se liberó al medio de cultivo (TSB):  Plata total en el sobrenadante con tamaño superior a 5 nm. Con bacterias y sin bacterias. Se realizó la centrifugación para eliminar los restos del material estudiado y/o bacterias mediante el uso de tubos Falcon® de centrífuga convencionales, es decir, sin filtro. Se evitó la presencia de partículas macroscópicas en la dispersión a analizar.  Plata total en el sobrenadante con tamaño inferior a 5 nm. En la centrifugación para obtener la muestra sin restos de material para ser analizados, fueron utilizados tubos de centrífuga con unos filtros incorporados (Amicon Ultra centrifugal filter units, Millipore®). Estos filtros evitaron la presencia de partículas superiores a 5 nm. 1. Cantidad de plata que se intercambió en la zeolita Para saber la cantidad de plata que contenía el material, se hizo una digestión de éste con agua regia. Concretamente, se pusieron en contacto 50 mg del material en 40 mL de agua regia en digestores de teflón aptos para el reactor de microondas (Milestone, Ethos plus) y se mantuvo una potencia máxima de 800 W con una temperatura de 200ºC durante 30 minutos. Seguidamente, las muestras obtenidas se dejaron enfriar y se aforaron hasta 50 mL. Estas muestras fueron medidas mediante espectroscopia de absorción atómica obteniéndose el contenido en plata (mg/L) que hay en la solución. Los resultados obtenidos mediante esta técnica fueron muy similares a los obtenidos mediante XPS: Tabla 3.2. Resultados de AAS de la digestión de diferentes Ag-ZSM5 Material % de plata en peso AgZSM5_A 0,19% AgZSM5_B 0,19% AgZSM5_C 0,20% AgZSM5_D 0,23% MEDIA 0,2% Otra manera de poder conocer la cantidad de plata que hay en la zeolita intercambiada con este metal fue haciendo un intercambio con nitrato de sodio en ausencia de luz, renovando el medio cada 8 y 24 horas con el objeto de reemplazar toda la plata iónica intercambiada por el catión sodio y analizar en disolución la Capítulo 3. Plata iónica 73 cantidad de plata iónica liberada al medio (isoterma de intercambio). A los tiempos determinados, se centrifugó el material con la solución de nitrato de sodio a 10000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se analizó mediante espectroscopía de absorción atómica y el precipitado resultante de la centrifugación se resuspendió con una solución fresca de nitrato de sodio de concentración conocida para seguir intercambiando la plata. El proceso se repitió a los tiempos determinados. Para ello se hicieron diferentes experimentos con distintas concentraciones de nitrato de sodio. Primero se usó una concentración de 8,7 mM de nitrato de sodio, y 0,037 g de AgZSM5. Se guardaron las muestras renovando el medio a 8, 24, 32, 48 y 72 horas. En la Tabla 3.3 se muestran los datos obtenidos en (mg/L o ppm) y el tanto por ciento en peso de plata correspondiente a esta Ag-ZSM5 calculado a partir de los datos obtenidos en absorción atómica. Tabla 3.3. Resultados de AAS y % en peso de plata tras intercambio con 8,7 mM de NaNO 3 y 0,037g de Ag-ZSM5 Renovación Tiempos (h) mg/L de plata 1 0-8 5,547 2 8-24 1,665 3 24-32 0,907 4 32-48 0,847 5 48-72 0,864 % en peso de plata 0,16% También usando la misma concentración de nitrato de sodio de 8,7 mM, se pusieron 0,185 g de Ag-ZSM5 y se añadió un tiempo de renovación del medio, es decir, una renovación intermedia a las 56 horas entre los tiempos de 48 horas y 72 horas. En la Tabla 3.4, se muestran los resultados obtenidos de la misma manera que se han explicado anteriormente. Tabla 3.4. Resultados de AAS y % en peso de plata tras intercambio con 8,7 mM de NaNO 3 y 0,185 g de Ag-ZSM5 Renovación Tiempos (h) mg/L de plata 1 0-8 5,116 2 8-24 1,236 3 24-32 0,689 4 32-48 0,608 5 48-56 0,604 6 56-72 0,648 % en peso de plata 0,15% En conclusión, se pudo observar que los resultados eran comparables, con un 0,16 % en peso de plata en el primer experimento y un 0,15 % en peso de plata en el segundo experimento. Capítulo 3. Plata iónica 74 Otro método para determinar la cantidad de plata que hay en la Ag-ZSM5, fue medir por espectroscopía de absorción atómica, la concentración de la disolución de nitrato de plata que queda tras el intercambio con H-ZSM5. De esta manera se pudo calcular el tanto por ciento en peso de plata que hay en la Ag-ZSM5 ya que se conocía la cantidad de H-ZSM5 que se puso, de 3 g, y la cantidad de nitrato de plata solución estándar para absorción atómica 1% en peso (HNO 3 ) de 100 ppm (Sigma-Aldrich), de 12 mL. Tabla 3.5. Resultados de % en peso de plata de 2 lotes diferentes de Ag-ZSM5, midiendo la cantidad que queda de plata tras el intercambio Material % en peso de plata AgZSM5_A 0,19% AgZSM5_B 0,21% MEDIA 0,2% Por lo tanto, se pudo observar que la cantidad de plata en la zeolita intercambiada, resulto muy similar entre los diferentes métodos usados. En la siguiente tabla se resumen todos los valores y métodos usados, así como un valor medio calculado de tanto por ciento en peso de plata: Tabla 3.6. Resultados de % en peso de plata de Ag-ZSM5, obtenida por diferentes métodos y medida por AAS Método % en peso de plata Digestión Microondas-Agua regia 0,2% Intercambio 8,7mM NaNO 3 -0,037g Ag-ZSM5 0,16% Intercambio 8,7mM NaNO 3 -0,185g Ag-ZSM5 0,15% Resto del intercambio 0,2% MEDIA 0,18% Finalmente, en la Tabla 3.7 se resume el porcentaje en peso de plata que hay en la AgZSM5 medida por espectroscopía de fotoelectrones emitidos por Rayos X y por espectroscopía de absorción atómica. Tabla 3.7. Resultados de % en peso de plata de Ag-ZSM5, obtenida por dos técnicas: XPS y AAS Método % en peso de plata XPS 0,17% AAS 0,18% MEDIA 0,175 % En conclusión, tres técnicas analíticas independientes (XPS, AAS y realización de la isoterma de intercambio) condujeron a resultados similares para cuantificar la cantidad de plata iónica intercambiada en la red zeolítica. Capítulo 3. Plata iónica 75 Apuntar, que para el caso de las zeolitas comerciales intercambiadas con plata en forma granular y de pellet, no se llevaron a cabo ninguno de estos análisis para determinar la cantidad de plata contenida ya que este dato venía suministrado por el fabricante, tal y como se ha explicado en el apartado 3.1.3. 2. Cantidad de plata que se liberó al medio de cultivo (TSB) A continuación se muestra la cantidad de plata liberada al medio de cultivo bacteriano (TSB) procedente de diferentes lotes de Ag-ZSM5, y de zeolitas comerciales (forma de pellets y forma de granular), a 4, 6 y24 horas, sin renovación del medio. Para realizar este experimento, se pusieron en contacto 300 mg de los diferentes materiales con 10 mL de TSB en tubos Falcon® estériles. Para cada tiempo se utilizó un tubo de ensayo (o dos en los casos que se hicieron réplicas), por lo que no hubo renovación del medio. Los tubos se colocaron en un agitador orbital (IKA®, modelo KS130) a 37ºC y en ausencia de luz, con una agitación de 350 rpm. A los tiempos determinados, los tubos se sacaron y se centrifugaron durante 10 minutos a 10000 rpm. Los sobrenadantes se guardaron en frío, oscuridad y en condiciones de esterilidad hasta ser medidos mediante espectroscopia de absorción atómica. Los pellets fueron desechados. En la siguiente Figura 3.8 se muestran los valores de plata en mg/L detectados en los sobrenadantes a 4, 6 y 24 horas. Tanto en las zeolitas comerciales como en la AgZSM5, la cinética de liberación fue similar. En las primeras 4 horas ya se liberó casi toda la plata, aumentando la concentración de plata entre un 8% y un 15% en el tiempo de 24 horas respecto al tiempo de 6 horas analizado. En la liberación de plata procedente de las zeolitas comerciales, cada punto es la media de dos liberaciones diferentes. Se obtuvo una buena reproducibilidad para todos los tiempos, siendo la variación de las medidas efectuadas de + 0,67 g/mL en el caso de la forma de pellets y + 0,71 g/mL para la forma granular. Se observó que son estas zeolitas comerciales las que más cantidad de plata liberan al medio de cultivo y de una manera más reproducible en todos los experimentos, tal y como cabía esperar por su constante y elevada carga inicial de plata. La liberación de plata de los diferentes lotes de Ag-ZSM5 no fue tan reproducible. La media de liberación fue de 24,68 mg/L + 12,83 mg/L a las 24 horas. Sin embargo, hubo tres lotes, que se alejaban de este valor medio, uno era muy elevado (51,26 ppm a 24 horas) y otros dos muy inferiores a esta media (9,785 ppm y 10,797 ppm a 24 horas). Las otras cinco liberaciones variaron entre 22,56 mg/L y 29,41 mg/L a 24 horas con una desviación estándar de + 2,74 mg/L. La variación de liberación de plata procedente de los tres lotes de Ag-ZSM5 fue debida, a pequeñas variaciones en la temperatura ambiental y en el grado de agitación durante el intercambio. Capítulo 3. Plata iónica 76 Tabla 3.8. Valores de plata liberada a las 24 horas por los lotes de Ag-ZSM5 y la media de estos valores. Datos obtenidos por AAS Plata liberada en mg/L por los lotes de Ag-ZSM5 a las 24 horas Media de plata liberada en mg/L de los ocho lotes a las 24 horas 9,785 10,797 22,555 22,950 24,975 25,680 29,414 51,260 24,677 Figura 3.8. Liberación de plata medida por AAS a 4, 6 y 24 horas. Los triángulos en azul corresponden a los pellets. Los rombos en rojo a la forma granular. Los cuadrados en diferentes gamas de verde a los diferentes lotes de Ag-ZSM5 Por otro lado, se comparó la liberación de plata procedente de la Ag-ZSM5 en dos medios de cultivo diferentes. Uno es el medio de cultivo para bacterias usado comúnmente que es el TSB, y otro es un medio de cultivo especialmente dirigido al Pellets Granular Ag - ZSM5 Ag - ZSM5 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 Tiempo (h) mg/L (ppm) Capítulo 3. Plata iónica 77 crecimiento de hongos que es el YNB (ver composición de los medios en el apartado 2.2.2). Se hicieron liberaciones de dos lotes de Ag-ZSM5, y en ambos casos se demostró la importancia de la composición del medio de cultivo, ya que ambos lotes liberados en medios diferentes dieron resultados de hasta 10 veces menos mg/L de plata en YNB. La diferencia puede ser debido a diversas razones, tales como la concentración de cationes en el medio (que afecta a la fuerza impulsora para el intercambio iónico) o la viscosidad del medio (que afecta al coeficiente de transferencia de materia), ya que este último medio (YNB), tiene muchos más compuestos, como mayor concentración de aminoácidos que pudieran forman complejos con la plata liberada y precipitar [189, 200, 335, 336], y por tanto, no pudieron ser detectados en espectroscopía de absorción atómica. Figura 3.9. Liberación de plata medida por AAS a 4, 6 y 24 horas en dos medios de cultivo: TSB y YNB. Lote A de Ag-ZSM5 en TSB (Triángulos rojos vacío). Lote A Ag-ZSM5 en YNB (Triángulos rojos llenos). Lote B Ag-ZSM5 en TSB (Cuadrados verdes vacíos). Lote B Ag-ZSM5 en YNB (Cuadrados verdes llenos) También se estudió la diferencia entre la liberación de plata al medio de cultivo TSB estéril y liberación de plata en cultivo estacionario. Con la AgZSM5 y la zeolita comercial en forma de pellet, la liberación y presencia de plata fue mayor en el medio de cultivo estéril, sin bacterias. En cambio, con la zeolita comercial granular se obtuvo más plata cuando existían bacterias en el medio, indicando que la liberación de plata depende del medio de cultivo y que no se puede generalizar en cuanto a su influencia en la cantidad de plata liberada a dicho medio. De hecho, el efecto de la presencia de bacterias puede variar también dependiendo de la fase en que se encuentra el cultivo, o los metabolitos secretados por éstas. También es importante considerar la concentración de iones cloruro en cada uno de los medios ya que se ha demostrado 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (h) mg/L (ppm) Ag-ZSM5 lote B en TSB Ag-ZSM5 lote B en YNB Ag-ZSM5 lote A en TSB Ag-ZSM5 lote A en YNB Capítulo 3. Plata iónica 78 como a bajas concentraciones de dicho anión la plata precipita pero a mayores concentraciones puede formar compuestos solubles [200] . Figura 3.10. Liberación de plata medida por AAS a 4, 6 y 24 horas con y sin bacterias en el medio: Ag-ZSM5 en TSB (Cuadrados verdes vacíos). Ag-ZSM5 en Cultivo estacionario (CE) (Cuadrados verdes llenos). Pellets en TSB (Triángulos azules vacíos). Pellets en Cultivo estacionario (CE) (Triángulos azules llenos). Granular en TSB (Romos rojo vacíos). Granular en Cultivo estacionario (Rombos rojos llenos) También debe tenerse en cuenta que todas estas medidas se hicieron, como se ha comentado anteriormente, con los sobrenadantes, por lo que se midieron todas aquellas formaciones, nanopartículas, complejos… [337, 338] que pudieron haberse formado entre la plata liberada y los compuestos que forman parte del medio de cultivo, y quedan en el sobrenadante y no en el precipitado de la centrifugación. Para medir solamente la plata liberada como plata iónica o presente como agrupamientos atómicos de reducido tamaño, en el momento de la centrifugación, se usaron unos tubos de centrífuga con unos filtros incorporados (Amicon Ultra® centrifugal filter units, Millipore®) que evitaron que en el sobrenadante hubieran formaciones superiores a 5 nm. 25 30 35 40 45 50 55 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (h) mg/L (ppm) Ag - ZSM5 en TSB Ag - ZSM5 en TSB y CE Pellets en TSB Pellets en TSB y CE Granular en TSB Granular en TSB y CE Figura 3.11. Tubos con filtros incorporados (Amicon Ultra® centrifugal filter units, Millipore®) Capítulo 3. Plata iónica 85 Haciendo la representación de esta manera, podemos observar la clara correlación existente entre la plata liberada al medio por la Ag-ZSM5, la zeolita comercial en forma de pellet y la zeolita comercial granular y las bacterias eliminadas. La Ag-ZSM5 a las 24 horas es el material que más plata libera al medio (6,25 ppm) y por tanto es el material que mayor poder bactericida tiene a ese tiempo (3,07x10 2 UFC/mL). Aquellos puntos de los diferentes materiales y tiempos en los que la plata liberada al medio es muy similar (por ejemplo: zeolita comercial granular a las 24 horas: 5,28 ppm y Ag-ZSM5 a las 6 horas: 5,398ppm) el poder bactericida también es muy similar (por ejemplo: zeolita comercial granular a las 24 horas: 5,21x10 6 UFC/mL y Ag-ZSM5 a las 6 horas: 3,83x10 6 UFC/mL). 3.2 ÓXIDO DE PLATA Se usó este material, porque se quiso probar la influencia de la disponibilidad del ión plata cuando está formando parte de un óxido, su solubilidad al medio de cultivo y su consecuente poder bactericida. 3.2.1 Procedencia del óxido de plata El óxido de plata (I) se adquirió comercialmente (Sigma-Aldrich®). 3.2.2 Caracterización A continuación se muestran diferentes técnicas que se usaron para poder caracterizar el óxido de plata.  MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO Mediante esta técnica se pudo observar la estructura a nivel microscópico de este material comercial. Figura 3.18. Microfotografía de SEM donde se muestra la morfología del material comercial Ag 2 O Capítulo 3. Plata iónica 86 En las fotografías de la Figura 3.18, podemos observar la morfología y agrupación de las partículas de óxido de plata. Se tratan de agrupaciones irregulares con aristas redondeadas de tamaño elevado (5-8 µm). Estas agrupaciones están formadas por gránulos individuales de tamaño variable, desde 1 µm a 3 µm.  ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Con esta técnica se comprobó la liberación de plata al medio de cultivo TSB. Con todos los materiales se ha utilizado una concentración de 30 mg de material por mL de medio de cultivo TSB. Pero con este material, como se ve en la Figura 3.19, a esta concentración se liberaba una gran cantidad de plata, por lo que se decidió usar dos concentraciones más bajas de 3 mg/mL y 1 mg/mL. Se pudo observar que gracias al filtro de tamaño de corte de 5 nm, se redujo la cantidad de plata activa hasta 10 veces al tiempo de 24 horas en la concentración de 30 mg/mL, siendo sin filtro de 1669,5 ppm y con filtro de 180,84 ppm. A 24 horas se liberó más plata al medio (55,51 ppm), que con la zeolita Ag-ZSM5 a concentraciones más altas de 30 mg/mL (24,677 ppm como valor medio). Esto fue debido a que dos terceras partes de la molécula de Ag 2 O es plata correspondiendo a un 93% del peso del material, mientras que la Ag-ZSM5 tiene alrededor de 0,17 % en peso de plata. Figura 3.19. Plata liberada procedente de Ag 2 O a 4, 6 y 24 horas. 1 mg/mL Ag 2 O (Rosa pálido) 3 mg/mL Ag 2 O (Rosa oscuro). 30 mg/mL Ag 2 O (Morado) 30 mg/mL. Ag 2 O con filtro (Morado. Cuadrados llenos y líneas discontinuas) 3 mg/mL 1mg/mL 10 100 1000 10000 0 5 10 15 20 25 Tiempo (h) Ag liberada (mg/L) 30 mg/mL sin filtro 30 mg/mL con filtro Ag liberada (mg/L) Tiempo (h) Capítulo 3. Plata iónica 87 3.2.3 Ensayos biológicos En este apartado se muestran los ensayos realizados con el S.aureus 9213 en combinación con el Ag 2 O a diferentes concentraciones.  CON CULTIVO ESTACIONARIO Y EN FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL (CORRESPONDIENTE A LA DILUCIÓN MENOS CUATRO A PARTIR DE UN CULTIVO ESTACIONARIO) En la Figura 3.20, se muestran los ensayos bactericidas a diferentes concentraciones de Ag 2 O. Se comprobó que a la concentración más elevada de 30 mg/mL, ya se obtuvo la total eliminación de las bacterias. Debido a esto se utilizaron concentraciones más bajas obteniendo a 24 horas con una concentración de 1mg/mL una reducción de dos unidades logarítmicas. También se hicieron ensayos en fase de crecimiento exponencial con una concentración intermedia a las anteriores de 10mg/mL. Los datos no se muestran porque a tiempo de 30 minutos, ya se produjo una eliminación total de las bacterias. Figura 3.20. Ensayos bactericidas con Ag 2 O a 4, 6 y 24 horas. 1 mg/mL Ag 2 O (Rosa pálido) 3 mg/mL Ag 2 O (Rosa oscuro). 30 mg/mL Ag 2 O (Morado) Control (círculos negros)  PODER BACTERICIDA RESPECTO A LA PLATA LIBERADA En este apartado, se relaciona la plata liberada al medio por parte del óxido de plata y el poder bactericida de esta. En este caso, se usaron los valores de plata liberada al medio de cultivo obtenidos sin utilizar los tubos con filtro de tamaño de corte de 5 nm. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 4 9 14 19 24 Tiempo (h) UFC/mL 3 mg/mL 1 mg/mL 30 mg/mL Control Tiempo (h) UFC/mL Capítulo 3. Plata iónica 88 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 10 100 1000 10000 Ag liberada (mg/L) UFC/mL Figura 3.21. Poder bactericida según la plata liberada con Ag 2 O a 4, 6 y 24 horas. 1 mg/mL Ag 2 O (Rosa pálido) 3 mg/mL Ag 2 O (Rosa oscuro). 30 mg/mL Ag 2 O (Morado) Se pudo observar, que concentraciones muy bajas de este compuesto (1mg/mL) liberan gran cantidad de plata al medio (55,51 ppm). También se comprobó, que altas concentraciones de material (30 mg/mL), liberan gran cantidad de plata (1669,5 ppm) al medio de cultivo las cuales consiguen la eliminación total de las bacterias. Gracias a estos experimentos, se ha podido observar la gran biodisponibilidad de la plata en forma de óxido de plata y su gran poder bactericida, ya demostrado por Djokic y Burell [344] haciendo películas de óxido de plata que inhibían totalmente el crecimiento bacteriano. Las mismas películas como plata metálica no producían efecto biocida alguno. RESUMEN DEL PODER BACTERICIDA DE LOS MATERIALES CON PLATA IÓNICA USADOS Cuando se trabaja con materiales que contienen plata, la correlación entre su efecto bactericida y la cantidad total de plata presente en el medio de cultivo puede ser engañosa. Hubo que tener en cuenta diferentes parámetros para dilucidar el efecto bactericida de la plata en los materiales, como es el estado de la plata cuando está en contacto con la bacteria (iones, la combinación de ellos, los grupos, los complejos, sales parcialmente solubles o insolubles, etc), los medios de cultivo, la presencia o ausencia de bacterias, tamaño de partícula, cristalinidad, etc. [153]. En la Figura 3.22, se realiza un resumen del poder bactericida de los diferentes materiales mencionados en este capítulo. Además se han añadido diferentes 4 horas 6 horas 24 horas 4 h oras 6 horas 24 horas 24 horas 4 horas 6 horas UFC/mL Ag liberada (mg/L) Capítulo 3. Plata iónica 89 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control Pellet_30mg/mL AgNPscom30mg/mL Granular_30mg/L AgNO3_0,0015mg/mL AgNO3_0,01mg/mL AgNO3_0,02mg/mL AgNO3_0,06mg/mL AgNO3_0,1mg/mL Ag2O_0,38mg/mL Ag2O_0,6mg/mL Ag2O_1mg/mL Ag2O_3mg/mL Ag2O_30mg/mL AgZSM5_6mg/mL AgZSM5_30mg/mL AgZSM5_90mg/mL AgZSM5_100mg/mL Materiales UFC/mL concentraciones de AgNO 3 , cuyo poder bactericida ha sido muy estudiado debido a la rápida biodisponibilidad del ión plata al disociarse la sal. También se incluye unas nanopartículas de plata de 100 nm (Sigma-Aldrich®) para tener una referencia de plata metálica. También se añadieron tres concentraciones nuevas de Ag-ZSM5: 6 mg/mL, 90 mg/mL y 100 mg/mL, lográndose con esta última a 24 horas la eliminación total de las bacterias. No se mencionaron anteriormente porque no estaban vinculadas con los estudios realizados. Figura 3.22. Poder bactericida de los materiales. 4 horas (verde), 6 horas (rosa) y 24 horas (azul) Para los diferentes materiales a prueba, su efecto bactericida se ordena según la siguiente secuencia: AgNO 3 > Ag 2 O> Ag-ZSM5> zeolita comercial granular> zeolita comercial en forma de pellets> nanopartículas de plata. De esta manera se puede concluir que el material con la mayor biodisponibilidad de plata iónica es el que presenta mayor poder bactericida tiene [153]. Sin embargo, se podría pensar en la baja solubilidad que tiene el Ag 2 O, ampliamente estudiada a lo largo de la bibliografía. Algunos de los primeros datos estudiados fueron de 26,2 mg/L [345], y del orden de 10 -4 M ó 10 -6 M, según hubiera o no KOH en el medio Capítulo 3. Plata iónica 90 respectivamente [346]. En fichas técnicas más recientes nos indican una solubilidad de 0.2 ppm [347]. Desde el punto de vista de su aplicación, esto podría representar una ventaja ya que el sólido actuaría como reservorio desde el cual se irían lentamente liberando iones Ag(OH) 2al medio acuoso [196]. De esta manera, la liberación de plata sería cuasi-continua, y aunque la solubilidad es muy baja, la plata podría reponerse a medida que se elimina del medio de cultivo. Se ha de tener en cuenta que en este material un 93% del peso corresponde a plata, que proporciona una alta capacidad de acción bactericida, a diferencia de los otros materiales zeolíticos ensayados. Capítulo 4 Plata metálica 91 Capítulo 4 Plata metálica 4.1 SBA15 FIBROSA 4.1.1 Síntesis 4.1.2 Funcionalización con APTES 4.1.3 Pastillas de SBA 15 4.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata in situ 4.1.5 Caracterización 4.1.6 Ensayos bactericidas 4.2 MCM-41 4.2.1 Síntesis 4.2.2 Pastillas de MCM 41 4.2.3 Síntesis de nanopartículas de plata in situ sobre la MCM 41 con nanopartículas magnéticas 4.2.4 Caracterización 4.2.5 Ensayos biológicos 4.3 ZSM5 4.3.1 Síntesis: Obtención de Ag-ZSM5 4.3.2 Síntesis de AgNPs in situ 4.3.3 Caracterización 4.3.4 Ensayos biológicos 4.4 NANOPARTÍCULAS DE PLATA COMERCIALES 4.4.1 Procedencia 4.4.2 Caracterización 4.4.3 Ensayos bactericidas 4.5 NANOHILOS DE PLATA 4.5.1 Síntesis hidrotermal de los nanohilos de plata 4.5.2 Caracterización 4.5.3 Ensayos bactericidas Capítulo 4 Plata metálica 92 En este capítulo se muestra la síntesis, caracterización y resultados de los ensayos bactericidas de todos aquellos materiales basados en plata metálica. 4.1 SBA15 FIBROSA 4.1.1 Síntesis La SBA 15, es un material mesoporoso silíceo con un tamaño de poro entre 9 y 10 nm. Su síntesis se llevó a cabo siguiendo el procedimiento experimental descrito por Katiyar, A., y colaboradores [348] y con la colaboración de Daniel Carmona Rioja: Para ello se mezclaron:  4 g de P123, copolímero de bloque basado en Polietilen glicol-polipropilen glicolpolietilen glicol (Sigma-Aldrich®).  104 mL de agua destilada.  20 mL (2 M) de ácido clorhídrico (Panreac®).  8,4 g de TEOS, Tetraetil ortosilicato (Sigma-Aldrich®). Las soluciones se agitaron durante 24 horas a 35ºC o a 60ºC, para ser envejecidas posteriormente a 100ºC ó 120ºC respectivamente durante 3 días. El sólido que se obtuvo se lavó y filtró con agua destilada varias veces y se dejó secar a temperatura ambiente. Para eliminar el agente estructurante fue necesario calcinar el sólido a 550 ºC durante 6 horas, con una velocidad de ascenso de temperatura de 1ºC/minuto. La velocidad de descenso de la temperatura fue de 5ºC/minuto [348]. 4.1.2 Funcionalización con APTES La funcionalización superficial del material se realizó mediante silanización con APTES (3-Aminopropilo) trietoxisilano (Sigma-Aldrich®) con el objetivo de obtener una carga negativa al pH de trabajo, para que posteriormente en la síntesis de nanopartículas de plata in situ, el ión plata procedente del nitrato plata, se uniese electrostáticamente en el material. Para realizarla se introdujo 1 g de SBA 15 en un matraz de 3 bocas, conectado a una columna de reflujo y cerrado con septums. Seguidamente se conectó una corriente de argon para evitar la presencia de humedad que pudiese hidrolizar el APTES. Posteriormente, se añadieron alrededor de 20 mL de tolueno anhidro (Sigma-Aldrich®) y se puso bajo agitación. Mediante un baño de aceite alrededor del matraz se aumentó la temperatura hasta 110ºC, que es la temperatura de ebullición del tolueno. Cuando se empezó a observar el reflujo del disolvente, se añadió el agente funcionalizante APTES a través del septum y se dejó entre 7 u 8 horas en estas condiciones. Pasado este tiempo, se dejó enfriar y se filtró el material. Se lavó tres veces con tolueno y se secó a temperatura ambiente, obteniéndose la SBA 15 funcionalizada con APTES (llamada SBA 15-APTES). 4 PLATA METÁLICA Capítulo 4 Plata metálica 93 4.1.3 Pastillas de SBA15 Al igual que con la zeolita ZSM5, se quiso evaluar si las bacterias formaban biofilm sobre la superficie de la SBA15 de una manera natural. Para ello, se hicieron pastillas de 200 mg de 13 mm de diámetro las cuales llevaban un 12 % en peso del ligante utilizado anteriormente con la ZSM5, el fluoruro de polivinilideno (Sigma-Aldrich) con el objeto de dar consistencia estructural al composite. Se mezclaron 176 mg de SBA15 y 24 mg de fluoruro de polivinilideno en presencia de acetona. Una vez evaporada la acetona a temperatura ambiente, se realizaron las pastillas en una prensa hidráulica con una presión de 10 Ton durante 2 minutos. Como con las pastillas de ZSM5, se observó que la presencia de esta sustancia ligante facilitaba la formación de biofilm. Los estudios previos demostraron que las bacterias tenían una especial afinidad por formar biofilm sobre el ligante. Además al igual que con la ZSM5, se observó mediante microscopía óptica que dicho ligante no quedó uniformemente repartido por la pastilla, por lo que los estudios de formación de biofilm no fueron reproducibles y por lo tanto fueron descartados. 4.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata in situ Para la síntesis de nanopartículas de plata (AgNPs) in situ [349-351], se utilizaron dos concentraciones de plata diferentes:  Nitrato de plata 0,1 M (Panreac® Barcelona, España) en un volumen de disolución de AgNO 3 de 100 mL. (SBA 15-APTES con elevada concentración de AgNPs que se denominará SBA 15APTES-Ag-A)  12 mL de Nitrato de plata solución standard para absorción atómica 1% en peso (HNO 3 ) de 1000 ppm (Sigma-Aldrich®). (SBA 15-APTES con baja concentración de AgNPs que se denominará SBA 15-APTESAg-B) En ambos casos se puso en contacto 1 g de SBA15-APTES con dichas disoluciones durante 24 horas bajo agitación, en ausencia de luz a temperatura ambiente en recipientes cerrados. Pasado este tiempo el material fue filtrado con filtros (de 1-3 micras, Prat Dumas). El material obtenido se dejó secar a temperatura ambiente, en ausencia de luz. Seguidamente, tras la impregnación, se redujo la plata iónica enlazada electrostáticamente a los grupos amino del material mesoporoso para formar las AgNPs. Para ello, fue necesario añadir una solución en agua destilada, de un agente reductor fuerte como es el Borohidruro de Sodio NaBH 4 (Sigma-Aldrich® Saint Louis, MO, USA) con concentración de 0,05 M, a una determinada cantidad de SBA15 APTES intercambiada con AgNO 3 . Las condiciones fueron las siguientes:  Para obtener el material con elevada concentración de AgNPs: Capítulo 4 Plata metálica 94 Tabla 4.1. Obtención de elevada concentración de AgNPs Material Cantidad SBA 15-APTES-Ag-A 0,53 g NaBH 4 0,05 M Volumen H 2 O destilada 100 mL COLOR MARRÓN  Para obtener el material con baja concentración de AgNPs: Tabla 4.2. Obtención de baja concentración de AgNPs Material Cantidad SBA 15-APTES-Ag-B 1 g NaBH 4 0,05 M Volumen H 2 O 200 mL COLOR GRIS Esta dispersión se agitó manualmente hasta que ésta dejara de burbujear, es decir, hasta que se dejara de liberar hidrógeno generado por la hidrólisis del NaBH 4 , y por tanto terminara su capacidad reductora. El material se filtró, y se dejó secar a temperatura ambiente en la oscuridad. Figura 4.1. Fotografía óptica mostrando el aspecto de la SBA15 APTES, con y sin AgNPs. A) SBA 15-APTES-Ag-A B) SBA 15APTES. C) SBA 15-APTES-Ag-B. Se observa como la SBA 15-APTES-Ag-A adquiere un color marrón oscuro debido a la elevada concentración de AgNPs, mientras que en la SBA 15-APTES-Ag-B se aprecia solo un ligero cambio de color a grisáceo respecto a la SBA 15-APTES debido a la baja concentración de AgNPs que posee Finalmente, los materiales obtenidos se guardaron en viales siempre en ausencia de luz. 4.1.5 Caracterización A continuación se muestran diferentes técnicas resultados de caracterización de la SBA 15-APTES con y sin AgNPs a elevada o baja concentración. A B C Capítulo 4 Plata metálica 101 Figura 4.8 y Tabla 4.7. Ensayos de SBA15-APTES-Ag-A y SBA15-APTES-Ag-B a 4 horas (verde), 6 horas (naranja) y 24 horas (azul) Se comprobó, como cabía esperar, que el mayor efecto bactericida fue producido por la SBA 15-APTES que tenía una mayor concentración de AgNPs, la mayor reducción se produjo a las 24 horas, con una disminución de tres unidades logarítmicas respecto del control (obteniéndose valores de 4,87x10 6 UFC/mL). Sin embargo, la reducción no fue tan alta como la que producía la zeolita Ag-ZSM5 a 24 horas, con una disminución de entre cuatro y nueve unidades logarítmicas respecto al control. Esto puede explicarse debido a que el gran efecto bactericida observado en el caso de la zeolita es producido por la plata iónica. En dicho material la biodisponibilidad del ión plata es inmediata, mientras que en el caso de los materiales mesoporosos la plata se encuentra como plata metálica (Ag 0 ), por tanto, dicha biodisponibilidad depende de un fenómeno de disolución difusión por el cual la plata metálica (constituyente de la nanopartícula) se tiene que disolver liberando al medio el ión plata. Es importante mencionar que en el caso de la zeolita incluso teniendo casi 10 veces menos de porcentaje en peso de plata (0,17% en peso de plata en Ag-ZSM5 y 1,98% en peso de plata en SBA 15-APTES-Ag-A) su poder bactericida es mucho mayor. Material SBA15-APTES-Ag-A SBA15-APTES-Ag-B Control Tiempo (h) Media (UFC/mL) SD Media (UFC/mL) SD Media (UFC/mL) 4 2,58x10 8 3482108,06 6,57 x10 8 28912810,6 7,2x10 8 6 3,91x10 7 9553798,29 3,5 x10 8 38556313,4 1,21x10 9 24 4,87x10 6 3482108,06 1,59 x10 8 377123617 3,07x10 9 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control SBA 15-APTES-Ag-A SBA 15-APTES-Ag-B Materiales UFC/mL Capítulo 4 Plata metálica 102 4.2 MCM 41 La MCM41, es un material mesoporoso silíceo con un tamaño de poro entre 3 y 5 nm. En este apartado se trabajó con dos tipos de MCM41. Una sintetizada en nuestro laboratorio y otra facilitada por el grupo del Dr. King Lun Yeung de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, que incorporaba nanopartículas magnéticas en su estructura, lo que facilitaba su retirada tras su utilización en medio líquido con la ayuda de un simple imán permanente. 4.2.1 Síntesis La síntesis de MCM41 que se llevo a cabo en nuestro laboratorio se realizó siguiendo el protocolo descrito por Xinqing Chen, Koon Fung Lam, King y Lun Yeung [354]. Brevemente: A 1 L de NH 4 OH (Panreac®) a una concentración de 1,1 N se añadieron 4 g de CTABr, Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Sigma-Aldrich®) que se agitaron magnéticamente hasta total disolución del agente surfactante. Seguidamente se añadieron 16 mL de TEOS, Tetraetil ortosilicato (Sigma-Aldrich®). El pH de la disolución resultante se ajusto a 11,5 añadiendo NH 4 OH bajo fuerte agitación magnética. De esta manera, a las 2 horas se obtuvo una síntesis de 20 g de sólido. Una vez pasado este tiempo, la solución se filtró y se lavó abundantemente con agua destilada caliente, finalizando con dos lavados con etanol 96% v/v (Panreac®). Así el sólido que se obtuvo, se dejó secar a temperatura ambiente. Cuando este estuvo seco, se eliminó el agente estructurante (CTABr) mediante calcinación a 550ºC durante 8 horas, con una rampa de temperaturas de 1ºC/minuto. Así, finalmente se obtienen unas partículas con estructura tipo MCM-41 de alrededor de 1 micrómetro. 4.2.2 Pastillas de MCM 41 Al igual que con la zeolita ZSM5 y la SBA15, se quiso investigar si las bacterias formaban biofilm sobre la MCM 41 sintetizada en el laboratorio de una manera natural, en pastillas de 13 mm de diámetro. Para ello, se hicieron pastillas de 140 mg las cuales llevaban un 12 % en peso del ligante utilizado anteriormente con la ZSM5 y la SBA 15, el fluoruro de polivinilideno (Sigma-Aldrich®). Se mezclaron 123,2 mg de SBA 15 y 16,8 mg de fluoruro de polivinilideno en presencia de acetona. Una vez evaporada la acetona a temperatura ambiente, se realizaron las pastillas con una presión de 12 Ton durante 1 minuto y 30 segundos. Como con las pastillas de ZSM5 y de SBA15, se observó que la presencia de esta sustancia ligante facilitaba la formación de biofilm. Los mismos problemas de reproducibilidad mostrados anteriormente fueron observados para estas pastillas. Capítulo 4 Plata metálica 103 4.2.3 Síntesis de nanopartículas de plata in situ sobre la MCM 41 con nanopartículas magnéticas Para la síntesis in situ de nanopartículas de plata (AgNPs) en la MCM41 con nanopartículas magnéticas (MCM41-MagNPs), se utilizó el mismo método usado para la síntesis de SBA 15-APTES-Ag-A.  0,1 M de Nitrato de plata (Panreac®) en un volumen de 100 mL. Se impregnó con la disolución de AgNO 3 , 1 g de MCM41-MagNPs durante 24 horas en ausencia de luz, a temperatura ambiente y bajo agitación en un agitador orbital (IKA®, modelo KS130). Después, el material se filtró. El material se dejó secar a temperatura ambiente en ausencia de luz. Seguidamente, para reducir la plata iónica y formar las AgNPs se utilizó el mismo protocolo mencionado anteriormente con la SBA 15-APTES, es decir se utilizó el NaBH 4 como agente reductor. Esta solución se agitó manualmente hasta que dejó de burbujear. A continuación, el material se filtró por gravedad, y se dejó secar a temperatura ambiente en oscuridad. Como se observa en la Figura 4.9 el material se oscurece considerablemente, al igual que pasaba con la SBA 15-APTES con elevada concentración de AgNPs. Figura 4.9. Fotografía óptica mostrando el aspecto de la MCM 41. A) Sintetizada en el laboratorio. B) MCM41-MagNPs. C) MCM41-MagNPs y AgNPs. Se puede observar el color marrón oscuro que adquiere la muestra debido a la presencia de AgNPs. La presencia de nanopartículas magnéticas hace que la muestra adquiera un color anaranjado El material, finalmente, se guardó en un vial y en ausencia de luz hasta su uso posterior. 4.2.4 Caracterización A continuación se muestran los resultados obtenidos con diferentes técnicas que se usaron para poder caracterizar la MCM-41 y la MCM41-MagNPs con y sin AgNPs.  MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO Gracias a esta técnica se pudo observar la morfología de las partículas de MCM41 obtenidas mediante síntesis en el laboratorio y corroborar su forma esférica y su tamaño de alrededor de un micrómetro, tal y como se muestra en la Figura 4.10. También podemos ver en esta Figura 4.10.C, el biofilm tras 48 horas de incubación formado sobre la superficie de la pastilla de MCM41, donde se puede ver una cubierta de bacterias sobre el material, y se corrobora que esta cepa forma un biofilm de forma natural sobre la superficie de la MCM41. A B C Capítulo 4 Plata metálica 104 Figura 4.10. Microfotografías de SEM donde se mostrándose en A) y B) de las partículas de MCM41 sintetizadas. C) Biofilm de 48 horas sobre este material. Se observa como las bacterias cubren todo la muestra del material MCM41 formando un biofilm. La elevada concentración bacteriana hace incluso difícil diferenciar el material existente debajo de este biofilm  MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Mediante esta técnica se ha observado la morfología de las AgNPs sintetizadas en la MCM41-MagNPs. En la Figura 4.11, se han observado partículas con un tamaño medio de 4,9 nm, y valores comprendidos entre 8 nm y 2 nm. También se han observado otras partículas más grandes con un tamaño de alrededor de 20 nm. No se pudo distinguir si eran nanopartículas magnéticas o las de plata. Sin embargo, se comprobó que el material tras ser cargado con nanopartículas de plata seguía siendo atraído por un imán permanente del laboratorio. Figura 4.11. Imágenes de TEM de las partículas de MCM41-Mag-NPs y AgNPs. En ellas se puede observar la variabilidad de tamaño de las nanopartículas y la dificultad para diferenciar las AgNPs de las nanopartículas magnéticas A B C Capítulo 4 Plata metálica 105  DIFRACCIÓN DE RAYOS X A ÁNGULO BAJO A continuación, en la Figura 4.12, se muestra el SAXRD con los picos característicos de la MCM 41 obtenidos de la bibliografía, comparada con la MCM41 sintetizada en el laboratorio. Figura 4.12. SAXRD de MCM41 sintetizada en el laboratorio, comparada con la bibliografía (figura pequeña) [355] Se puede observar que la estructura de los poros y planos del material se mantienen respecto a la que aparece en la bibliografía, ya que aparecen los picos característicos de este material en la MCM41 sintetizada en el laboratorio. 4.2.5 Ensayos biológicos En ese apartado se muestran los resultados de los estudios realizados con S.aureus cepa 9213, con la MCM 41 sintetizada en el laboratorio y la MCM41-MagNPs con y sin AgNPs.  ESTUDIOS DE FORMACIÓN DE BIOFILM SOBRE PASTILLAS DE MCM41 Con este experimento se pretendía conocer la posible formación de biofilm de forma natural, sobre pastillas de MCM41, al igual que se hizo con la zeolita NH 4 -ZSM5 y la SBA15. Se pudo concluir que así era, y que también la presencia del ligante en la pastilla, facilitaba aún más la formación de biofilm como se ha mencionado anteriormente. 0 5 10 0,0 0,5 1,0 Intensidad (u.a) 2 (theta) Capítulo 4 Plata metálica 106 Figura 4.13. Formación de biofilm sobre pastillas de MCM41 sintetizada en el laboratorio con 12% de ligante En la Figura 4.13 se puede observar que el comportamiento de la formación y el crecimiento de biofilm fue muy similar tanto al de la zeolita NH 4 -ZSM5 como al de la SBA15 estudiadas en apartados anteriores. También se puede concluir que esta cepa formadora de biofilm es capaz de colonizar fácilmente superficies silíceas.  ESTUDIOS BACTERICIDAS En este apartado se realizaron los experimentos antimicrobianos con el S.aureus cepa 9213 en fase estacionaria y con las diferentes variantes de la MCM41. Figura 4.14. Estudios bactericidas con las variantes de MCM 41 a 4 horas (verde), 6 horas (naranja) y 24 horas (azul) 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1 hora 2 horas 12 horas 24 horas 48 horas Tiempo (h) UFC/mL 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control MCM41 laboratorio MCM41_MagNPs MCM41_MagNPs_AgNPs Materiales UFC/mL Capítulo 4 Plata metálica 107 La concentración usada en este apartado ha sido de 30 mg de material por cada mililitro de cultivo estacionario. En la Figura 4.14 podemos observar como la MCM41 sintetizada en el laboratorio, por si misma presenta un moderado poder bactericida, probablemente causado por la liberación de ácido silícico al medio de cultivo, con una disminución de alrededor de una unidad logarítmica y media respecto al control, en todos los tiempos. Sin embargo, la MCM 41 MagNPs mostró menos efecto antimicrobiano, de alrededor de media unidad logarítmica. Esto puede ser atribuido a su menor número de grupos hidroxilo superficiales, ya que ha sido tratada térmicamente, lo cual reduce la solubilidad en medios acuosos. Por otro lado, se pudo comprobar que la MCM41 MagNPs con AgNPs a las 24 horas produjo una disminución de cuatro unidades logarítmicas (4,43x10 5 UFC/mL). Aunque los resultados obtenidos son favorables y muestra potencial aplicabilidad como material biocida, no concuerdan con los datos obtenidos con la SBA 15 con la misma concentración de AgNPs a 24 horas que fueron de 1,57x10 8 UFC/mL. Esto puede ser debido a que la combinación de ambas nanopartículas tenga efectos bactericidas sinérgicos como ya ha sido demostrado anteriormente [356], algo que también se ha comprobado cuando la plata se combina con otros metales nobles como el platino atribuido a un aumento de la oxidación de la plata a través de la sustitución galvánica producida por la reacción redox entre la plata y el platino [357]. O también puede ser potencialmente atribuible a la presencia de restos orgánicos procedentes de la síntesis del ferrofluido utilizado en la impregnación de la matriz silícea. 4.3 ZSM5 En este apartado se trabajó de nuevo a partir de la zeolita NH 4 ZSM5, estudiada en el capítulo anterior intercambiada con plata iónica. 4.3.1 Síntesis: Obtención de Ag-ZSM5 Para conseguir el material de partida, es decir, Ag-ZSM5, se siguió el mismo protocolo que se indica en el apartado 3.1.1, intercambiando la zeolita NH 4 ZSM5 calcinada (HZSM5) con AgNO 3 y así obtener la Ag-ZSM5 [111]. 4.3.2 Síntesis de AgNPs in situ Para la síntesis de nanopartículas de plata (AgNPs) in situ en la Ag-ZSM5 se utilizó el mismo método usado para la síntesis de AgNPs a baja concentración en la SBA 15APTES, ya que partíamos de la zeolita ya intercambiada, Ag-ZSM5 con el nitrato de plata solución estándar para absorción atómica 1 % en peso (HNO 3 ) de 1000 ppm. Se siguió el mismo protocolo usado con la MCM41 y la SBA15. Es decir, en resumen, lo que se hizo fue reducir la plata iónica de 1 g de Ag-ZSM5 para formar las AgNPs utilizando NaBH 4 a concentración de 0,05 M en un volumen de 100 mL. Posteriormente, se filtró, secó y guardo en oscuridad. En la Figura 4.15, se puede observar como la reducción de la plata para, formar AgNPsZSM5, produjo un cierto oscurecimiento del material. También se puede observar, el Capítulo 4 Plata metálica 108 color blanco que tiene la Ag-ZSM5, color que se ha mantenido en todos los lotes usados en este trabajo. Figura 4.15. Fotografía óptica mostrando la zeolita ZSM5 en diferentes estados. A) AgZSM5 donde la pata es iónica y no aporta color a la muestra y B) AgNPs-ZSM5 donde ya se han formado AgNPs y, por tanto, la muestra adquiere un color grisáceo 4.3.3 Caracterización Aquí se muestran las diferentes técnicas usadas para caracterizar AgNPs-ZSM5.  MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN A nivel microscópico, como se muestra en la Figura 4.16, se observó una menor concentración de AgNPs que en el caso de la SBA 15-APTES-Ag-B. Se pensó que podría ser debido principalmente a los siguientes factores:  La zeolita ZSM5 no estaba funcionalizada con grupos amino, por lo que la fijación de las nanopartículas al material mediante el enlace nitrógeno-plata no era posible. Este enlace químico se da entre los electrones del nitrógeno presente en los grupos amino y los electrones de la plata [358].  Los poros de la ZSM5 de 0,55 nm, son muchos más pequeños que la SBA 15, de entre 8 nm y 10 nm. Esto hacía que las AgNPs de 6 a 8 nm, nombradas con anterioridad en el apartado 4.1.5, no se pudieran introducir en los poros. Figura 4.16. Microfotografías de TEM mostrándose distintas variaciones de ZSM5. A) AgNPs sueltas procedentes de la AgNPs-ZSM5 debido a la falta de fijación de las AgNPs en este material, B) AgNPs-ZSM5, C) Ag-ZSM5 A B AgNPs sueltas A B C Capítulo 4 Plata metálica 109 Tal y como se muestra en la Figura 4.16, se observó la presencia AgNPs en la AgNPsZSM5 que se corresponden con los agrupamientos más oscuros de la microfotografía de TEM (Figura 4.16.B), aunque no todas permanecieron unidas a la estructura cristalina de la ZSM 5, ya que por diversas causas comentadas con anterioridad, parte de estas AgNPs aparecieron sueltas y no fijadas a los cristales de la zeolita ZSM5 (Figura 4.16.A). En el último caso de la Ag-ZSM5 (Figura 4.16.C), se observó la existencia de pequeños agrupamientos de plata precipitada de mayor tamaño (24 nm) que las AgNPs y que se corresponden con los agrupamientos oscuros de la microfotografía (en este caso aparece uno).  DIFRACCIÓN DE RAYOS X En la Figura 4.17, se puede observar el diagrama XRD de Ag-ZSM5 y AgNP-ZSM5 comparadas con un patrón de la zeolita ZSM5. De la misma manera que en la Ag-ZSM5, en el XRD de la AgNP-ZSM5 no se observaron cambios en la cristalinidad, ni nuevos picos que pudieran provenir de las AgNPs, lo cual demuestra que la estructura microporosa de la zeolita no se ve afectada por la incorporación de nanopartículas de plata, y por otro lado, la concentración y tamaño de las AgNPs no alcanza los valores mínimos para poder ser detectado mediante XRD. Figura 4.17. Diagrama XRD de AgNPs-ZSM5 y Ag-ZSM5 comparadas con el diagrama XRD patrón de la zeolita ZSM5 4.3.4 Ensayos biológicos A continuación se muestran los estudios antimicrobianos realizados con el S.aureus cepa 9213 y la AgNPs-ZSM5. Se hicieron estudios, comparando el poder bactericida de Ag-ZSM5 y AgNP-ZSM5 a 24 horas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 AgNP-ZSM5 Ag-ZSM5 Patrón ZSM5 2 theta (grados) Intensidad (u.a) Capítulo 4 Plata metálica 110 Figura 4.18. Ensayos bactericidas realizados con los materiales AgNPs-ZSM5 y AgZSM5 a tiempo 24 horas Se pudo observar, la gran disminución del poder bactericida cuando la plata pasa de forma iónica (Ag-ZSM5) a forma metálica (AgNPs). De hecho, a la zeolita con AgNPs no se le atribuyó poder bactericida, ya que a las 24 horas se obtuvieron 1,32x10 9 UFC/mL que no representa una diferencia significativa respecto al control (4,14x10 9 UFC/mL). Sin embargo, se volvió a comprobar el elevado efecto bactericida de la Ag-ZSM5 a las 24 horas, con una disminución de seis unidades logarítmicas lo cual corrobora la hipótesis de que el poder bactericida del material basado en plata depende fuertemente de la biodisponibilidad del catión plata. 4.4 NANOPARTÍCULAS DE PLATA COMERCIALES En este apartado se trabajó con unas nanopartículas de plata comerciales. 4.4.1 Procedencia Las nanopartículas utilizadas fueron comerciales con tamaño de partícula inferior a 100 nm (Sigma-Aldrich®). 4.4.2 Caracterización Aquí se muestran las diferentes técnicas usadas para la caracterización de este material. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control AgZSM5 AgNPs-ZSM5 Materiales UFC/mL Materiales UFC/mL Capítulo 4 Plata metálica 117  ESPECTROSCOPÍA POR TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) Se utilizó la técnica FITR para determinar la cantidad de lavados que eran necesarios en la purificación de la síntesis de nanohilos de plata para la eliminación del compuesto orgánico (etilengicol, CH 2 OH-CH 2 OH). La eliminación total del etilenglicol resultaba necesaria, ya que este compuesto es tóxico para las bacterias [363] y alteraría los resultados de los posteriores ensayos bactericidas. Figura 4.26. FTIR Síntesis de nanohilos: A) Sin lavados, B) Con un lavado, C) Con dos lavados y D) Con tres lavados En la Figura 4.26, se observó los resultados de FTIR de la síntesis de nanohilos de plata sin lavar y con varios lavados. De esta manera se comprobó que en el primer lavado se consigue eliminar todo el etilenglicol, ya que con un lavado (y por tanto con dos y tres) desapareció el pico de absorbancia característico del enlace C-H (stretching entre 2750-3000 l/cm) que aparece en la síntesis sin lavar.  ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO Por medio de esta técnica se determinó la masa de nanohilos de plata presentes en una cantidad conocida de dispersión de la muestra, para diferenciarla del PVP presente en la muestra. El método utilizado fue diferente según el solvente usado: A B C D Capítulo 4 Plata metálica 118  Para muestras de nanohilos dispersadas en etanol, se realizó un calentamiento de 25ºC a 50ºC con una rampa de temperatura de 0,1ºC/ minuto y una isoterma de 50ºC durante 30 minutos con un caudal de 20 mL/minuto de aire.  Para dispersiones de nanohilos en agua (o en medio de cultivo), se hizo un calentamiento de 30ºC a 500ºC con una rampa de temperatura de 30ºC/ minuto y una isoterma de 500ºC durante 40 minutos con un caudal de 20 mL/ minuto de aire. De esta manera, se eliminó el solvente y el PVP y se obtuvo la masa de sólido, en este caso, de nanohilos de plata. Mediante esta técnica se determinó la masa de nanohilos de plata utilizada en los análisis microbiológicos. La masa de dichos hilos en sus correspondientes dispersiones se determinó mediante termogravimetría.  Se determinó el efecto bactericida de los nanohilos de plata embebidos en una espuma de carbón vítreo reticulado comercial y evaluar simultáneamente si dicha espuma actuaba como un soporte eficiente para retener los nanohilos de plata depositados sobre ella. Para ello, tras el lavado de la síntesis, se dispersaron los nanohilos de plata en etanol y se añadieron 100 ó 200 µL de una dispersión de concentración conocida a cada espuma de carbón.  Se estudió el poder bactericida de los nanohilos de plata en dispersión en cultivo estacionario desarrollado en medio de cultivo líquido (TSB). Tras la purificación de la síntesis, los nanohilos de plata se dispersaron en el medio de cultivo estacionario y se añadieron 1,5 mL de esta dispersión a 3,5 mL de cultivo estacionario. En este caso, mediante termogravimetría, se conoció la masa de nanohilos de plata. Para el caso de los nanohilos de plata dispersos en etanol, la masa de nanohilos de plata fue de 0,96 mg en 150 µL de volumen de etanol, por tanto si a la espuma de carbón se le añadieron 200 µL de la dispersión, esta espuma contenía 1,28 mg de nanohilos. En otro caso, se obtuvieron 0,707 mg de nanohilos en 150 µL de etanol. En este caso a la espuma de carbón se le añadieron 100 µL de la dispersión y por tanto, tenía 0,471 mg de nanohilos. Finalmente, se midieron 0,426 mg de nanohilos en 150 µL de etanol. También se añadieron 100 µL de la dispersión a las espumas de carbono y por tanto, estas tenían 0,284 mg de nanohilos. Por lo tanto la masa final de nanohilos de plata en la espuma de carbón vítreo reticulado comercial que se utilizó en los análisis microbiológicos fue la suma de los tres valores anteriores, es decir, 2,035 mg. Esta cantidad de nanohilos de plata se pondría posteriormente en 5 mL de cultivo estacionario para hacer los ensayos bactericidas, por lo tanto habría 0,407 mg de plata/mL de cultivo estacionario. Finalmente, no se muestran los datos para otras espumas porque se obtuvieron de la misma forma, pero se obtuvo otro valor de 0,21 mg de plata/mL de cultivo estacionario. A continuación se realizó TGA de la dispersión de nanohilos de plata en cultivo estacionario (datos no mostrados), y se pudo calcular que en los posteriores ensayos bactericidas habría 0,5 mg de nanohilos de plata dispersos/mL de cultivo estacionario. Capítulo 4 Plata metálica 119 4.5.3 Ensayos bactericidas En este apartado se comentan los diferentes ensayos bactericidas realizados con los diferentes nanohilos de plata, por si solos o embebidos en diferentes soportes. Los ensayos bactericidas se hicieron a tiempos de 10, 20 y 30 minutos, y 24 horas a 37ºC.  NANOHILOS DISPERSOS A continuación en la Figura 4.27, aparecen los resultados de los nanohilos dispersos en un cultivo estacionario. Se usaron dos concentraciones 0,21 mg/mL de cultivo estacionario y 0,5 mg/mL de cultivo estacionario. Los tiempos evaluados fueron de 10, 20 y 30 minutos, y de 24 horas. Figura 4.27. Estudios bactericidas nanohilos dispersión. 10 minutos (verde), 20 minutos (naranja), 30 minutos (azul), 24 horas (morado) Se pudo observar, que el único material que tuvo poder bactericida fueron los nanohilos dispersos a una concentración de 0,5 mg/mL de cultivo estacionario al tiempo más largo de incubación (24 horas), con una disminución de cuatro unidades logarítmicas. El poder bactericida, no fue debido a la internalización de los nanohilos per se ya que al ser mayores de 10 micras, no podían entrar en la célula. Dicho poder biocida fue atribuido a la oxidación de los nanohilos y la consecuente liberación de iones plata. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control Dispersión 0,5 mg/mL Dispersión 0,21 mg/mL Materiales UFC/mL Capítulo 4 Plata metálica 120  NANOHILOS Y PLATA DESPOSITADA POR CVD EN ESPUMAS DE CARBÓN VÍTREO RETICULADO En este apartado, se muestran los ensayos bactericidas utilizando como soporte las espumas de carbón. Los ensayos que se realizaron fueron los siguientes:  Cinta de carbono. Los ensayos bactericidas se realizaron en vasos de precipitados, y para que la espuma de carbono no flotara en el cultivo estacionario, se fijo a la base del vaso con cinta de carbono. Se quiso comprobar si esta tenía poder bactericida por si sola.  Cinta de carbono + espuma de carbono (Figura 4.28.A). Se quería comprobar que estas espumas no tenían poder bactericida y por tanto, se podían usar como soporte inerte.  Cinta de carbono+espuma de carbono+plata depositada por CVD (Figura 4.28.B). Se evaporó un precursor de plata con el evaporador BOC Edwards Auto 500 E-beam, en las espumas hasta que hubiera una concentración en el cultivo estacionario de 0,2 mg/mL. Algunas de estas espumas se calcinaron a 300ºC en presencia de oxígeno para examinar el posible cambio de estado de la plata a óxido de plata (II).  Cinta de carbono+espuma de carbono+nanohilos de plata (Figura 4.28.C). El proceso de deposición de los nanohilos de plata fue explicado en el apartado anterior 4.5.2 en el apartado TGA. La concentración ensayada en el cultivo estacionario fue de 0,407 mg/mL. Figura 4.28. A) Espumas de carbón vítreo reticulado sola. B) Plata depositada por CVD en las espumas de carbón vítreo reticulado C) Microfotografía de SEM mostrándose los nanohilos impregnados en una espuma de carbón vítreo reticulado. Los nanohilos corresponden a la zona más clara y brillante de la microfotografía Con los ensayos bactericidas realizados en estas espumas, no se pudo observar ningún efecto antimicrobiano. Solamente con los nanohilos de plata impregnados en las espumas, se observó una ligera disminución de carga bacteriana respecto al control hasta llegar a 6,47x10 8 UFC/mL, tal y como se muestra en la Tabla 4.8, marcado en rojo. Además se demostró, que ni la cinta de carbono ni las espumas de carbón vítreo reticulado eran tóxicas para las bacterias. A B C Capítulo 4 Plata metálica 121 Tabla 4.8. Ensayos bactericidas con espumas de carbón. 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 24 horas NOTA: NH= Nanohilos En esta misma Tabla 4.8, se puede observar que no se evaluó el efecto antimicrobiano para tiempos cortos (10 y 20 minutos) en los ensayos de las espumas de carbón vítreo reticulado con plata tanto depositada por CVD como con plata en forma de nanohilos. Esto fue así debido a que, primero se evaluó el efecto bactericida a tiempos largos y al comprobar su nulo efecto, se decidió no ensayar los tiempos más cortos.  NANOHILOS AUTOSOPORTADOS EN FILTROS DE CELULOSA Para obtener estos nanohilos autosoportados se filtraron 3 mL de síntesis de nanohilos de plata, usando unos filtros de celulosa de 25 mm de diámetro y de 200 nm de tamaño de poro (ALBET LabScience). La cantidad de nanohilos autosoportados obtenidos, se obtuvo por diferencia de pesada antes y después de filtrar la síntesis y una vez estos estuvieran secos. La cantidad que se obtuvo fue de 7 mg/mL de cultivo estacionario para la realización de los ensayos bactericidas. Estos filtros con los nanohilos de plata se dispusieron en el cultivo estacionario y se realizaron ensayos bactericidas a 10, 20 y 30 minutos y a 24 horas. En el capítulo siguiente, se estudiará la aplicación de la corriente eléctrica sobre los nanohilos de plata para facilitar y acelerar la obtención de plata iónica [364], que como se ha demostrado en los capítulos previos, es la forma que presenta poder bactericida generándose a partir de la plata metálica que forma los nanohilos de plata. Con estos filtros de celulosa, no se hicieron ensayos bactericidas posteriores con corriente continua por la dificultad de aplicación de la corriente eléctrica sobre estos filtros de celulosa ya que no es conductora eléctricamente, y la dificultad experimental. TIEMPOS 10 minutos 20 minutos 30 minutos 24 horas ENSAYOS Media (UFC/mL) SD Media (UFC/mL) SD Media (UFC/mL) SD Media (UFC/mL) SD Control 1,06x10 9 299302506 1,13x10 9 431589629 1,18x10 9 342390301 1,54x10 9 339836562 Espuma 0,407 mg NH/mL de cultivo estacionario - - - - 1,62x10 9 155563492 6,47x10 8 37712361,7 Espuma 0,2 mg Ag depositada /mL de cultivo estacionario - - - - 1,42x10 9 61282587,7 9,73x10 9 942809042 Espuma 0,2 mg Ag depositada calcinada /mL de cultivo estacionario - - - - 2,49x10 9 1565063009 9,33x10 8 188561808 Cinta de Carbono 1,06x10 9 61282587,7 1,47x10 9 117851130 1,30x10 9 150849447 1,12x10 9 166183216 Cinta de Carbono.Espuma de carbón vitreo reticulado 1,01x10 9 42426406,9 9,45x10 8 162634560 1,12x10 9 153206469 9,73x10 8 175188397 Capítulo 4 Plata metálica 122 Figura 4.29. Ensayos bacteridias con filtros autosoportados de nanohilos. 10 minutos (verde), 20 minutos (naranja) 30 minutos (azul), 24 horas (morado) NOTA: NH=Nanohilos Se observó en la Figura 4.29, una disminución de cuatro unidades logarítmicas a tiempo de 24 horas usando estos nanohilos autosoportados. Por medio de estos experimentos se demostró que los nanohilos de plata, que son plata metálica, no tienen poder bactericida a tiempos cortos. Es conocido que si las nanoestructuras son superiores a 10 nm no tienen poder bactericida [183]. Se ha observado una reducción de cuatro unidades logarítmica con los nanohilos autosoportados con una concentración de 7mg/mL de cultivo a las 24 horas y la misma reducción con los nanohilos dispersos en el medio de cultivo con una concentración de 0,5mg/mL de cultivo. Por lo tanto como la concentración global es menor cuando se usan nanohilos dispersos y la reducción de la carga bacteriana es la misma que la obtenida cuando se usan nanohilos autosoportados, la primera situación sería preferible: Nanohilos dispersos a una concentración de 0,5mg/mL de cultivo a un tiempo de 24 horas. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control Filtro de NH 7mg/mL Materiales UFC/mL Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 123 Capítulo 5 Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 5.1 INTRODUCCIÓN A LA COMBINACIÓN CON CAMPO ELÉCTRICO 5.2 CONDICIONES EXPERIMENTALES PARA REALIZAR LA APLICACIÓN DE CAMPO ELÉCTRICO. CARACTERIZACIÓN 5.2.1 Espectroscopía de Absorción Atómica 5.3 ENSAYOS BACTERICIDAS 5.3.1 Elección del voltaje 5.3.2 Nanohilos dispersos 5.3.3 Nanohilos y plata evaporada en espumas de carbón vítreo 5.3.4 Estudio a 9 V 30 minutos y 24 horas de incubación a 37ºC Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 124 En este apartado se describe la combinación con campo eléctrico de las diferentes estructuras y condiciones que llevan nanohilos de plata. 5.1 INTRODUCCIÓN A LA COMBINACIÓN CON CAMPO ELÉCTRICO El proceso que tiene lugar al combinar los nanohilos con campo eléctrico consiste en una oxidación anódica y una reducción catódica de forma no espontánea. Tal y como se mostró en el apartado 2.6 el sistema experimental esta formado por dos electrodos conectados a una fuente de alimentación eléctrica, e inmersos en una solución conductora, de modo que cada electrodo atrae a los iones de carga opuesta:  El ánodo atrae a los aniones.  El cátodo a los cationes. Es decir, se produce una transferencia de electrones entre los electrodos y los iones:  Los aniones ceden electrones al ánodo. Se produce la REDUCCIÓN.  Los cationes captan los electrones del cátodo. Se produce la OXIDACIÓN. Este proceso únicamente se pudo llevar a cabo mediante corriente eléctrica continua. De esta manera, los iones son llevados en una sola dirección al electrodo correspondiente para que se produzca la transferencia de electrones. En cambio, la corriente alterna con una frecuencia, por ejemplo de 50 Hz, indicaría que cambiaría el sentido del movimiento de los iones 50 veces por segundo. Esto impediría que la mayor parte de los iones alcancen los electrodos para que la transferencia electrónica necesaria tenga lugar, consiguiendo sólo un aumento de la temperatura del electrolito y por ello fue descartado. En este apartado se evaluaron las propiedades bactericidas de los nanohilos de plata en presencia de corriente eléctrica, para poder comparar los resultados con el apartado anterior en el que los nanohilos no se combinaban con corriente eléctrica. La hipótesis de trabajo es que la aplicación de campo eléctrico favorece la oxidación de los nanohilos de plata metálica (un proceso muy lento en otras condiciones) aumentando por tanto su poder biocida. 5.2 CONDICIONES EXPERIMENTALES PARA REALIZAR LA APLICACIÓN DE CAMPO ELÉCTRICO. CARACTERIZACIÓN Para realizar los experimentos como se comenta en el apartado 2.6, se han utilizado unas fuentes de voltaje (HQ Power, Alimentador Multitensión modelo 2A):  Conectadas a electros inertes de grafito. 5. COMBINACIÓN DE LOS NANOHILOS DE PLATA CON CAMPO ELÉCTRICO Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 125  Los electrodos estuvieron inmersos en 5 mL de Cultivo Estacionario Figura 5.1. Sistema experimental. La primera imagen corresponde a una fotografía óptica del sistema experimental. La segunda imagen corresponde a un esquema de éste Se analizaron las siguientes condiciones con el cultivo estacionario:  3 voltajes 6 V, 9 V y 12 V aplicados durante 10, 20 y 30 minutos cada uno.  Con el voltaje de 9 V durante 30 minutos y dejando actuar sin voltaje durante 24 horas a 37ºC. 5.2.1 Espectroscopía de Absorción Atómica Se realizaron estos experimentos para evaluar la cantidad de plata procedente de los nanohilos que se liberaba al medio (agua corriente o TSB), cuando se aplicaba corriente eléctrica en las diferentes condiciones:  10, 20 y 30 minutos a 9 V.  30 minutos a 9 V y seguidamente 24 horas a 37ºC sin corriente eléctrica. Además, los ensayos se realizaron en el mismo volumen en el que se llevan a cabo los ensayos bactericidas, es decir, 5 mL, siendo:  4,7 mL de TSB o de agua.  300 µL de una dispersión de nanohilos 0,5 mg/mL. Las muestras, una vez obtenidas a los tiempos indicados, fueron centrifugadas con tubos que poseen un filtro de tamaño de poro inferior a 5 nm (Amicon® Ultra centrifugal filter units, Millipore®) y fue el sobrenadante lo que se midió en AAS. Cultivo estacionario Electrodos de grafito conectados a fuentes de voltaje Nanohilos evaluados en diferentes Dirección de los electrones Dirección de los electrones Ánodo Cátodo Cultivo estacionario Nanohilos de plata Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 126 Como se señala en la Tabla 5.1, se comprobó que el proceso de aplicación de campo eléctrico fue efectivo para la liberación de iones de plata y que a mayor tiempo de exposición a la corriente se obtendría mayor concentración de iones plata. Además, se observo que si tras la aplicación de corriente eléctrica durante 30 minutos, se producía una incubación a 37ºC durante 24 horas la concentración de plata se duplicaba, demostrando que tras la eliminación de voltaje, la oxidación de los nanohilos de plata continuaba pero de una manera más lenta. Por otro lado, se estudió la posible formación de AgCl en el filtro del tubo de Amicon® tras de 10 minutos de aplicación de campo eléctrico (denominado en la Tabla 5.1 AgCl retenido). Para ello se añadió 5 mL de ácido nítrico a los filtros. Este es capaz de disolver este compuesto pero no de disolver los nanohilos de plata ya que para esto, es necesario agua regia [365]. Tabla 5.1. AAS de la plata procedente de la oxidación de los nanohilos de plata bajo aplicación de campo eléctrico Muestra Tiempo de aplicación de campo eléctrico (minutos) Tiempo de contacto (horas) Concentración Ag + (ppm) TSB Sobrenadante 10 - 1,663 TSB AgCl retenido 10 - 0,746 TSB Sobrenadante 20 - 3,212 TSB Sobrenadante 30 - 4,064 TSB Sobrenadante 30 24 8,864 Agua Sobrenadante 10 - 0,277 Agua AgCl retenido 10 - 0,613 Agua Sobrenadante 20 - 0,537 Agua Sobrenadante 30 - 0,633 Agua Sobrenadante 30 24 0,96 Tal y como aparece en la Tabla 5.1, se demostró que la liberación de plata fue superior en TSB que en agua en todas las condiciones ensayadas. Además se corroboró la formación de AgCl (AgCl retenido) en ambos medios, aunque, proporcionalmente, fue mayor en los ensayos que se realizaron con agua. Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 133 dos efectos, corriente eléctrica a 9 V durante 30 minutos y posterior incubación durante 24 horas a 37ºC. 5.3.4 Estudio a 9 V 30 minutos y 24 horas de incubación a 37ºC Finalmente en la Figura 5.8, se representan todas las variantes de nanohilos (y plata depositada por CVD) en las condiciones que más efecto antimicrobiano se obtuvo, 30 minutos con 9 V y 24 horas de incubación a 37ºC, es decir una combinación de una aceleración inicial de la oxidación de los nanohilos de plata debido a la aplicación de corriente, y una oxidación en el medio por el paso del tiempo. En todos los casos, se comprobó un efecto microbiano elevado con una disminución de entre cuatro y cinco unidades logarítmicas. Figura 5.8. Ensayos bactericidas en las condiciones de 30 minutos con 9 V y 24 horas de incubación a 37ºC Como se observa en la Figura 5.8, la mejor condición, para la eliminación bacteriana, de los nanohilos consistió en utilizar una concentración de 0,5 mg/mL y cuando se encontraban dispersos en el cultivo estacionario. Por un lado vemos que es la mayor concentración de plata aplicada en los ensayos de este apartado, por lo que es lógico pensar que produjera un mayor efecto bactericida. Por otro lado, cuando los nanohilos se dispersan en el cultivo bacteriano, estos quedan distribuidos por los 5 mL de cultivo estacionario y no solo al fondo, por lo que se favorece el paso de la corriente eléctrica por todos los nanohilos y por tanto la oxidación de la plata. Sin embargo, la plata, tanto en forma de nanohilos como depositada por CVD, en las espumas de carbono queda al fondo de cultivo bacteriano, sin que esta plata este bien distribuida por el cultivo bacteriano, por lo que el paso de la corriente por esta no se ve facilitado y 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 1,00E+10 Control 9 V Dispersión 0,5 mg/mL Dispersión 0,21 mg/mL Espuma 0,407 mg/mL NH Espuma 0,2 mg/mL Ag evaporada Materiales UFC/mL Capítulo 5. Combinación de los nanohilos de plata con campo eléctrico 134 habría una menor oxidación y por tanto, menos formación de iones plata para producir una disminución de la población bacteriana. Capítulo 6. Combinación con peróxidos 135 Capítulo 6 Combinación con peróxidos 6.1 ADSORCIÓN CON ÁCIDO PEROXIACÉTICO 6.2 CARACTERIZACIÓN 6.2.1 Microscopía electrónica de transmisión 6.2.2 Análisis termogravimétrico 6.2.3 Adsorción de nitrógeno 6.2.4 Difracción de rayos X 6.2.5 Espectroscopía de absorción atómica 6.3 ENSAYOS BACTERICIDAS 6.3.1. Compuestos individuales 6.3.2. Zeolitas 6.4 MCM41 SINTETIZADA EN EL LABORATORIO Y MCM41-MagNPs 6.4.1. MCM 41 sintetizada en el laboratorio. Conservación en el tiempo del PAA 6.4.2. Ensayos bactericidas de la MCM 41-MagNPs con y sin AgNPs; con y sin PAA 6.5 SBA15-APTES CON AgNPs A ELEVADA Y BAJA CONCENTRACIÓN CON PAA 6.6 EFECTO DEL ÁCIDO PEROXIACÉTICO 6.6.1 Medición de las especies reactivas de oxígeno 6.6.2 Observación del biofilm bacteriano 6.7 COMPARACIÓN DE LOS MATERIALES Capítulo 6. Combinación con peróxidos 136 En este capítulo, se describen las combinaciones de las zeolitas comerciales en forma de pellet y la zeolita ZSM5 sintetizada en nuestro laboratorio, así como de los materiales mesoporosos MCM 41 y SBA 15, con y sin plata, con peróxidos, más concretamente con el ácido peroxiacético (o peracético) (PAA). Se decidió combinar estos materiales con el ácido peracético porque es un buen agente antimicrobiano debido a su alto poder oxidante usado contra un amplio número de microorganismos como se ha mencionado anteriormente. Además tiene diversas aplicaciones industriales, ya que se utiliza en torres de refrigeración, en la industria alimentaria para la desinfección de superficies y en el tratamiento de aguas residuales [74]. Por otro lado, al ser una molécula de pequeño tamaño, puede ser adsorbida en los poros de diferentes materiales nanoestructurados como son las zeolitas y en los materiales mesoporosos. 6.1 ADSORCIÓN CON ÁCIDO PEROXIACÉTICO El ácido peroxiacético que se utilizó, fue una solución comercial con 36-40 % en peso de ácido peroxiacético en ácido acético (Sigma-Aldrich®). Se vende en disolución con ácido acético y peróxido de hidrógeno para así mantener el equilibrio y estabilidad de los compuestos químicos como se ha dicho anteriormente. Las cantidades de materiales y de ácido peracético usadas en el proceso de adsorción se detallan en la Tabla 6.1. Tabla 6.1. Adsorción de PAA. Relación de gramos de material y mililitros de solución de PAA Método Cantidad material (g) PAA (mL) H + -ZSM5 5 20 Ag-ZSM5 3 12 AgNPs-ZSM5 0,3 2,4 Ag-ZSM5 (con NaNO 3 ) 2 8 Zeolita comercial en forma de pellets 3 12 SBA15 0,5 4 SBA15-APTES 0,5 4 SBA15-APTES-Ag-A 0,25 2 SBA15-APTES-Ag-B 0,5 4 MCM41(laboratorio) 3 12 MCM41-MagNPs 0,25 2 MCM41-MagNPs-AgNPs 0,5 4 El procedimiento que se eligió fue añadir la cantidad determinada del material y del ácido peroxiacético y ponerlo bajo agitación magnética (excepto en la MCM41MagNPs y MCM41-MagNPs-AgNPs que se usó agitación en orbital) durante 24 horas. 6. COMBINACIÓN CON PERÓXIDOS Capítulo 6. Combinación con peróxidos 137 La solución estuvo tapada, a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Pasado este tiempo, se filtró por gravedad y se dejó secar en ausencia de luz y tapando el material. Una vez el material estuvo seco, se guardó en viales sellados de forma hermética, para evitar la pérdida del ácido peroxiacético, debido a su elevada presión de vapor (20 mm de Hg a temperatura ambiente [368]). Figura 6.1. Blanqueamiento de los materiales al adsorberse PAA. A) Ag-ZSM5, AgNPsZSM5 y AgNPs-ZSM5-PAA. B) Zeolita comercial en forma de pellets y Zeolita comercial en forma de pellets con PAA. C) MCM 41-MagNPs, MCM41-MagNPs-AgNPs y MCM41MagNPs-AgNPs-PAA. D) SBA 15-APTES, SBA 15-APTES-Ag-B y SBA 15-APTES-Ag-B-PAA. E) SBA 15-APTES-Ag-A y SBA 15-APTES-Ag-A-PAA Además en la Figura 6.1, se puede observar como todos los materiales después de ser expuestos al ácido peroxiacético, recuperan su color blanco anterior al haberles incorporado AgNPs (excepto en el caso de la MCM41-MagNPs, que en su forma inicial era anaranjado por la nanopartículas magnéticas, y por tanto recuperó este color). Esto indicaría una oxidación de las AgNPs, pasando de plata metálica a plata iónica. Mediante microscopia electrónica de transmisión (apartado siguiente) se observó que las AgNPs no se pierden, aunque se reducen de tamaño. Por otro lado, en los materiales H-ZSM5 y Ag-ZSM5 se adsorbió peróxido de hidrógeno para comparar su efecto con el del ácido peroxiacético. En este caso la adsorción se hizo por el método de humedad incipiente, siendo el volumen total de poros aproximado de la zeolita ZSM5 de aproximadamente 1 cm 3 /g (dato obtenido de su isoterma de adsorción de N 2 ). Otras de las modificaciones llevadas a cabo, consistieron en eliminar la plata de la AgZSM5. Para ello, se pusieron 0,3 g de material con una concentración de 50mM de NaNO 3 en un volumen de 50 mL. El medio se renovó a las 8, 24, 32, 48, 56 y 72 horas, para forzar el intercambio entre la plata y el sodio. Una vez el material había perdido la práctica totalidad de los iones plata, se filtró y se secó y se puso en contacto con ácido peroxiacético, con el objeto de comparar el efecto bactericida entre H-ZSM5-PAA y la Ag-ZSM5 a la que se le ha quitado la plata y se le ha adsorbido el ácido peroxiacético. 6.2 CARACTERIZACIÓN A continuación en este capítulo se muestran los resultados de caracterización de los materiales estudiados en este apartado. B A D E C Capítulo 6. Combinación con peróxidos 138 6.2.1 Microscopía electrónica de transmisión  DIFERENCIA ENTRE Ag-ZSM5 Y LA Ag-ZSM5-PAA En la Figura 6.2, podemos observar que en ambos materiales se detectan pequeños agrupamientos de plata metálica que ya observamos anteriormente en la Ag-ZSM5. Estos agrupamientos de plata, no se encuentran uniformemente repartidos y existen en muy poca cantidad debido al bajo contenido en plata de la muestra (0,2% en peso de plata). Sin embargo, se puede observar como el PAA en algunos casos los reduce de aproximadamente 15 nm a tamaños de 5 nm aproximadamente. Por otro lado, en algunas microfotografías de la Ag-ZSM5-PAA no se observó ningún agrupamiento. Figura 6.2. Imágenes de TEM mostrándose la A) Ag-ZSM5 y B) y C) Ag-ZSM5-PAA. Se puede observar como el PAA reduce los pequeños agrupamientos de plata (B), o los elimina (C)  DIFERENCIA ENTRE AgNPs-ZSM5 Y LA AgNPs-ZSM5-PAA Las fotografías de la Figura 6.3, demostraron que la adsorción con ácido peroxiacético disminuye el tamaño y cantidad de las AgNPs. Sin embargo, todavía se siguen observando agrupamientos de plata metálica. En la AgNPs-ZSM5 se observan varios agrupamientos, que corresponden a plata, de un tamaño diverso. Unos agrupamientos entorno a 25-30 nm y otros más pequeños de 1-3 nm. Sin embargo, en la AgNPs-ZSM5PAA, el número de agrupamientos se reduce, y los más grandes tienen un tamaño de 20 nm aproximadamente. Figura 6.3. Imágenes de TEM donde se muestran los diversos agrupamientos de plata metálica en A) AgNPs-ZSM5 y en B) y C) AgNPs-ZSM5-PAA A A B C C B Capítulo 6. Combinación con peróxidos 139  DIFERENCIA ENTRE LA SBA15 APTES CON ELEVADA Y BAJA CONCENTRACIÓN DE AgNPs, CON Y SIN PAA En la Figura 6.4, aparecen fotografías de las diferentes variantes realizadas con la SBA 15 APTES. Figura 6.4. Imágenes de TEM donde aparecen AgNPs en A) SBA 15-APTES-Ag-A, B) SBA 15-APTES-Ag-A-PAA, C) SBA 15-APTES-Ag-B, D) y E) SBA 15-APTES-Ag-B-PAA Se pudo observar en ambos casos, una disminución de la cantidad y del tamaño de las AgNPs y de los grandes acumulamientos de plata tras la adsorción del ácido peroxiacético. Las AgNPs decrecen de un tamaño medio de 7,5 nm antes del ácido peroxiacético, a un tamaño medio de 4,9 nm (valores medios obtenidos tras medir el tamaño de al menos 15 AgNPs de diferentes microfotografías del mismo material). Muchos de los agrupamientos de plata de un tamaño superior a 20 nm disminuyen a un tamaño comprendido entre 10-15 nm.  DIFERENCIA ENTRE LA MCM41-MagNPs-AgNPs Y MCM41-MagNPs-AgNPs-PAA. Las fotografías correspondientes a este material, aparecen en la Figura 6.5. A B C D E SBA 15 - APTES - Ag - A SBA 15-APTES-AgA-PAA SBA 15 - APT ES - Ag - B SBA 15 - APTES - Ag - B - PAA SBA 15 - APTES - Ag - B - PAA Capítulo 6. Combinación con peróxidos 140 Figura 6.5. Imágenes de TEM donde se pueden observar las AgNPs y las MagNPs de: A) MCM 41-MagNPs-AgNPs y B) y C) MCM 41-MagNPs-AgNPs con PAA En este caso, aunque se observó una disminución de las AgNPs, no se pudo ver una disminución significativa de su tamaño, así como, se ha mostrado en el apartado 4.2.3 tampoco se pudo diferenciar entre AgNPs y nanopartículas magnéticas. 6.2.2 Análisis termogravimétrico Gracias a esta técnica, se pudo cuantificar el ácido peroxiacético adsorbido en los poros de los materiales. Las representaciones de los análisis termogravimétricos (TGA) de los diferentes materiales se pueden observar en las Figuras 6.6. B A C 0 100 200 300 400 500 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 Ag-ZSM5-PAA H-ZSM5-PAA Ag-ZSM5 H-ZSM5 % Pérdida de peso Temperatura(ºC) 0 100 200 300 400 500 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 Ag-ZSM5-PAA H-ZSM5-PAA Ag-ZSM5 H-ZSM5 Derivada Pérdida peso Temperatura (ºC) Figura 6.6.A. Diagrama de TGA H-ZSM5 (negro), Ag-ZSM5 (verde), H-ZSM5-PAA (naranja), AgZSM5-PAA (azul) y derivada de la pérdida de peso de los mismos materiales donde se muestran los mínimos uno en torno a 100ºC y el otro a 270-300ºC. La variación de adsorción del 4% de PAA en Ag-ZSM5-PAA se debió al hecho de que unos análisis se realizaron inmediatamente después de su adsorción y otros al cabo de 20 días y mes y medio Capítulo 6. Combinación con peróxidos 141 La Figura 6.6.A nos muestra que adsorbió un 8 % en peso de PAA en la HZSM5 y un 9 % en peso en la Ag-ZSM5 (media de 8,5%). Para calcular la carga de PAA en todas las gráficas de este apartado, se realizó la diferencia entre el porcentaje de la pérdida de peso de un material sin PAA (por ejemplo, H-ZSM5) y su correspondiente con PAA (por ejemplo, H-ZSM-PAA) asumiendo que ambos materiales adsorben la misma cantidad de agua. Según la derivada del porcentaje de pérdida de peso, hay una pérdida de peso alrededor de 100ºC que correspondería al agua en los materiales sin PAA, y en los muestras con PAA a 100ºC que sería una mezcla de agua y PAA y a y 270º-300ºC que sería PAA. Figura 6.6.B. Diagrama de TGA de la zeolita comercial en forma de pellet (negro) y de la zeolita comercial en forma de pellet-PAA (azul) La zeolita comercial en forma de pellet viene representada en la Figura 6.6.B, y presenta una adsorción de 1,2 % en peso de PAA. Las temperaturas a las que se perdió peso fueron muy similares a las de la zeolita ZSM5. La diferencia de carga de PAA entre la zeolita ZSM5 y la zeolita comercial en forma de pellet se atribuyó al empaquetamiento del material. Mientras que en la ZSM5 el material está en forma de polvo disperso, el material comercial se presenta como pellets de 1,6 mm por lo que el acceso del PAA al interior de los poros que estaban en la parte interna de los pellets es menor. 0 100 200 300 400 500 80 85 90 95 100 Zeolita comercia en forma de pellet-PAA Zeolita comercia en forma de pellet % Pérdida peso Temperatura (ºC) Capítulo 6. Combinación con peróxidos 142 Figura 6.6.C. Diagrama de TGA y de la derivada de la pérdida de peso de MCM41 (negro) y MCM41-PAA (azul). Las diferentes curvas correspondientes a MCM-41 provienen de análisis realizados al día siguiente de la adsorción, al mes y a los dos meses Respecto a la MCM41 sintetizada en el laboratorio, se pueden observar los resultados en la Gráfica 6.6.C. Se produjo un 30 % en peso de adsorción de PAA. En la MCM41, se observó a 60ºC un pequeño pico de pérdida de peso según la gráfica de la derivada del porcentaje de pérdida de peso que se atribuiría al agua. Sin embargo, con la MCM41PAA el picó se observó a 80ºC, el cual fue mucho más pronunciado. Cabe destacar, que las gráficas que aparecen de MCM41-PAA corresponden a análisis hechos al día 0 100 200 300 400 500 65 70 75 80 85 90 95 100 105 MCM41-PAA MCM41 % Pérdida peso Temperatura (ºC) 0 100 200 300 400 500 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 MCM41-PAA MCM41 Derivada % Pérdida peso Temperatura (ºC)