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2013 137 Ainoha García Claver Identificación de marcadores moleculares y dianas terapéuticas relacionadas con la respuesta a inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT en gliomas Departamento Director/es Farmacología y Fisiología Meléndez Asensio, Bárbara Alcalde Herrero, Ana Isabel Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Ainoha García Claver IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES Y DIANAS TERAPÉUTICAS RELACIONADAS CON LA RESPUESTA A INHIBIDORES DE LA RUTA EGFR/PI3K/AKT EN GLIOMAS Director/es Farmacología y Fisiología Meléndez Asensio, Bárbara Alcalde Herrero, Ana Isabel Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento de Farmacología y Fisiología IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES Y DIANAS TERAPÉUTICAS RELACIONADAS CON LA RESPUESTA A INHIBIDORES DE LA RUTA EGFR/PI3K/AKT EN GLIOMAS TESIS DOCTORAL Memoria presentada por la Licenciada en Bioquímica, Doña AINOHA GARCÍA CLAVER para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza. Dirigida por: Dra. Bárbara Meléndez Asensio Investigadora en la Unidad de Investigación de Patología Molecular Hospital Virgen de la Salud de Toledo Dra. Ana Isabel Alcalde Herrero Catedrática de la Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria. Departamento de Farmacología y Fisiología Zaragoza 2013 Índice Introducción ................................................................................. 1 1. Gliomas. Definición, clasificación e incidencia. ...................................1 1.1. Clasificación de los gliomas según la OMS .................................. 1 2. Alteraciones moleculares de los gliomas ............................................3 2.1. Alteraciones en la dosis génica y mutaciones en GBM ...............5 2.2. Identificación de subtipos moleculares de GBM .......................................... 7 3. Ruta del EGFR ...................................................................................8 3.1. Activación y funcionamiento .......................................................... 8 3.2. Desregulación de la ruta EGFR/PI3K .......................................... 11 3.2.1 EGFR ............................................................................... 11 3.2.2 PTEN ............................................................................... 13 3.2.3 PI3K ................................................................................. 13 4. Tratamiento de los GBM ................................................................... 14 4.1. Erlotinib ........................................................................................ 16 4.2. Gefitinib ........................................................................................ 17 4.3. Otros inhibidores .......................................................................... 18 4.4. Tratamientos combinados ........................................................... 19 4.5. Uso de microarrays para predicción de respuesta a TKIs .......... 21 Objetivos .................................................................................... 23 Material y Métodos ..................................................................... 27 1. Cultivos celulares e inhibidores ......................................................... 29 2. Viabilidad celular ............................................................................... 30 3. Extracción de DNA y RNA ................................................................ 31 4. PCR y secuenciación ........................................................................ 32 5. Detección de EGFRvIII por RT-PCR ................................................. 33 6. Hibridación genómica comparada .................................................... 34 7. MLPA ................................................................................................ 36 8. Análisis de expresión con microarrays .............................................. 39 8.1. Muestras para los análisis de expresión génica .......................... 39 8.2. Microarrays de expresión y análisis de datos ............................. 39 9. PCR cuantitativa (qRT-PCR) ............................................................ 41 10. Citometría de flujo ........................................................................... 41 10.1. Ciclo celular ............................................................................... 42 10.2. Apoptosis ................................................................................... 43 11. Análisis de proteínas ....................................................................... 44 Índice 11.1. Inmunohistoquímica................................................................... 44 11.2. Western Blot .............................................................................. 45 11.3. In cell western ............................................................................ 45 12. Análisis estadístico ......................................................................... 47 Resultados.................................................................................. 49 1. Caracterización molecular de líneas celulares de gliomas ................ 51 1.1. Alteraciones en la dosis génica ................................................... 51 1.1.1 Deleciones .................................................................... 53 1.1.2 Ganancias ..................................................................... 60 1.2. Análisis de moléculas relevantes en GBM .................................. 64 1.2.1 PTEN ............................................................................ 64 1.2.2 EGFR ............................................................................ 66 1.2.3 TP53 ............................................................................. 67 1.3. Resumen de alteraciones moleculares en gliomas ..................... 68 2. Estudio del efecto de los inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT en las líneas celulares derivadas de gliomas ........................................ 71 Erlotinib ................................................................................... 71 2.1. Viabilidad celular .......................................................................... 71 2.2. Tratamiento combinado con TEMS ............................................. 73 2.3. Ciclo celular ................................................................................. 78 2.4. Señalización intracelular .............................................................. 79 2.5. Perfil de expresión génica en sensibles y resistentes ................. 82 2.6. Estudio del efecto del erlotinib sobre la expresión génica .......... 89 Gefitinib ................................................................................... 96 2.7. Viabilidad celular .......................................................................... 96 2.8. Ciclo celular ................................................................................. 97 2.9. Apoptosis ..................................................................................... 98 2.10. Señalización intracelular ............................................................ 99 LY294002 ............................................................................. 104 2.11. Viabilidad celular..................................................................... 104 Discusión .................................................................................. 107 Conclusiones ........................................................................... 125 Bibliografía ............................................................................... 129 Publicaciones ........................................................................... 143 Introducción 1 1. GLIOMAS. DEFINICIÓN, CLASIFICACIÓN E INCIDENCIA Los tumores del sistema nervioso central (SNC) suponen el 2% de todas las neoplasias y la segunda causa de muerte por causas neurológicas por detrás de los accidentes cerebrovasculares. Constituyen uno de los tipos de cáncer con peor pronóstico, por su difícil tratamiento y su alta tasa de recidivas. Los gliomas son tumores de origen neuroepitelial que derivan de células cerebrales llamadas células gliales y representan más del 50% de todos los tumores del SNC. En España se calcula una incidencia de tumores cerebrales malignos de 8,73 por 100.000 habitantes/año según los datos de la Asociación Española Contra el Cáncer. La organización mundial de la salud (OMS) actualmente clasifica los gliomas en base a criterios histopatológicos en: astrocitomas, oligodendrogliomas, oligoastrocitomas y ependimomas (Figura 1) (Louis et al., 2007). 1.1 CLASIFICACIÓN DE LOS GLIOMAS SEGÚN LA OMS Figura 1. Clasificación de Gliomas según la OMS GLIOMAS ASTROCITOMAS OLIGODENDROGLIOMAS OLIGOASTROCITOMAS EPENDIMOMAS Difuso (Grado II) Pilocítico(Grado I) Anaplásico (Grado III) Glioblastoma (Grado IV) Grado II Anaplásico (Grado III) Grado II Anaplásico (Grado III) Grado II Anaplásico (Grado III) Grado I Introducción 2 Además del tipo de tumor, la OMS establece unos criterios para la gradación de las lesiones tumorales, que correlacionan con el pronóstico de la enfermedad. Esta gradación, aplicada a los astrocitomas, separaría principalmente está entidad en dos grandes grupos: los de bajo grado de malignidad, que corresponden a astrocitomas de grado I (astrocitoma pilocítico, no infiltrante, sin tendencia a recurrir y que afecta sobre todo a población infantil) y grado II (astrocitoma difuso, infiltrante y con tendencia a recurrir) y los de alto grado, que comprenden los astrocitomas de grado III (astrocitoma anaplásico) y grado IV (glioblastoma) (Louis et al., 2007). Los astrocitomas de alto grado, que son infiltrantes, y presentan altas tasas de proliferación, tienen tendencia a recurrir y suponen el 76% del total de gliomas según el registro de tumores del sistema nervioso central de Estados Unidos (CBTRUS, 2011). La predicción en cuanto a supervivencia y respuesta al tratamiento está basada en la gradación tumoral, la edad del paciente, el estado neurológico, la localización y el comportamiento radiológico del tumor, los índices de proliferación y las alteraciones genéticas. Para cada entidad tumoral, las combinaciones de estos parámetros contribuyen a la estimación global del pronóstico. Sin embargo, a pesar de estas variables, en general, los pacientes con tumores de grado II sobreviven más de 5 años, mientras que aquéllos con tumores de grado III tienen una esperanza de vida de 2-3 años. La forma más agresiva de los gliomas es el glioblastoma (GBM) que supone más del 50% de los tumores cerebrales primarios. Tiene una baja tasa de supervivencia, con una esperanza de vida de un año para el 33% de los pacientes y sólo el 5% de los pacientes llegan a vivir más de 5 años tras el diagnóstico (CBTRUS 2011; Louis et al., 2007). Atendiendo a las características clínicas, los GBM se han dividido tradicionalmente en GBM primarios y GBM secundarios. Los GBM primarios, que representan la mayoría de los GBM, aparecen de novo, en pacientes con una edad media de unos 60 años, sin que existan lesiones previas. La historia clínica del paciente suele ser corta, debido a la gran malignidad y rápido crecimiento del tumor. Los GBM secundarios, que representan menos del 10% de los GBM, surgen como progresión de astrocitomas de más bajo grado (astrocitoma difuso o astrocitoma anaplásico) y Introducción 3 afectan a pacientes más jóvenes. La evolución clínica es más lenta y los pacientes tienen una supervivencia media significativamente superior, tanto por la menor edad del paciente como por el crecimiento tumoral más lento (Ohgaki y Kleihues, 2007). 2. ALTERACIONES MOLECULARES DE LOS GLIOMAS A pesar de que clásicamente la clasificación histopatológica ha sido determinante para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de los tumores, ésta no siempre es sencilla, especialmente en el caso de los gliomas. Es por ello que se han dirigido numerosos esfuerzos hacia el descubrimiento de marcadores moleculares que apoyen los hallazgos histológicos. Centrándonos en los GBM, las características moleculares que se asocian a los dos grupos serían las siguientes: los GBM primarios se caracterizan por presentar amplificación de EGFR, pérdida de 10q (y/o mutación de PTEN), pérdida de CDKN2A/B/p14ARF y amplificación de PDGFRA, mientras que los GBM secundarios presentan mutaciones en TP53 más frecuentemente (Louis et al., 2007). Sin embargo, ninguna de estas alteraciones parece suficiente para discriminar correctamente estas dos entidades. Una de las alteraciones recientemente descritas es la mutación en el dominio de unión al sustrato de la enzima isocitrato deshidrogenasa NADPHdependiente (IDH) que participa en el ciclo del ácido cítrico (Parsons et al., 2008). Se conocen varias isoenzimas para esta proteínas, de las que IDH1 e IDH2 son las que están implicadas en gliomagénesis. Estas mutaciones provocan alteraciones bioquímicas en la glucólisis y en la lipogénesis e inhiben la metilación de histonas y del DNA, alterando la regulación epigenética y aumentando la expresión de genes que controlan la diferenciación y proliferación celular (Dunn et al., 2013; Yang et al., 2012). Los estudios en gliomas muestran que estas mutaciones son frecuentes en gliomas de grado II y III y en GBM secundarios, mientras que están ausentes en los astrocitomas pilocíticos (grado I), GBM primarios y ependimomas (Parsons et al., 2008; Riemenschneider et al., 2010). El descubrimiento de la mutación de IDH en etapas precoces de la gliomagénesis ha hecho cambiar la idea sobre el origen Introducción 4 de los glioblastomas primarios y secundarios. De este modo, la adquisión de esta mutación por parte de la célula precursora, parece ser clave en la progresión tumoral (Figura 2). Por otra parte, la presencia de mutaciones en IDH se ha establecido como un factor pronóstico, ya que se han asociado con una mayor supervivencia (Parsons et al., 2008). Parsons y colaboradores proponen que la presencia de mutaciones en IDH1 por si sóla constituye un mejor factor pronóstico que los que se usaban anteriormente, como eran la edad del paciente y la mutación en TP53. Estudios recientes demuestran que aquellos pacientes con tumores portadores de mutaciones en IDH1 ó IDH2 tienen una mayor supervivencia que pacientes sin mutación, sugiriendo la necesidad de aplicar una terapia más agresiva para este grupo de pacientes (Ohno et al., 2013). Figura 2. Alteraciones moleculares en gliomas difusos (adaptado de Ohgaki y Klehues, 2007 y Riemenschneider et al., 2010). EGFR MDM2 p16 deleción (~31%) LOH10q (70%) PTEN mutación (25-40%) TP53 mutación (<25%) CÉLULA PRECURSORA GLIOBLASTOMA PRIMARIO GLIOBLASTOMA SECUNDARIO ASTROCITOMA DIFUSO (Grado II) ASTROCITOMA ANAPLÁSICO (Grado III) Grado IV Ampl (~ 40%) Sobreexp (~60%) Mutación de TP53 (>65%) PDGFRA ampl (~ 16%) Ganancia de 7q Ampl (<10%) Sobreexp (~50%) Pérdida 1p/19q CÉLULA PRECURSORA Mutación de IDH1/2 OLIGOASTROCITOMA (Grado II) OLIGODENDROGLIOMA (Grado II) OLIGOASTROCITOMA ANAPLÁSICO (Grado II) OLIGODENDROGLIOMA (Grado II) Introducción 11 señalización a través AKT, también existen indicios de que puede inhibir la señalización a través de MAPK (Yart et al., 2001). 3.2 DESREGULACIÓN DE LA RUTA EGFR/PI3K Como se ha mencionado, una de las principales rutas celulares cuya alteración está directamente relacionada con la génesis de los gliomas, es la ruta del EGFR/PI3K. A continuación se detallan, los principales puntos en los que se ve afectada esta ruta de señalización en los gliomas. 3.2.1 EGFR Entre las variantes mutacionales que puede tener este receptor, la más frecuente en GBM primarios es EGFRvIII, que surge a partir de la deleción de los exones 2 al 7. EGFRvIII se encuentra hasta en un tercio de GBM primarios y hasta en el 50-60% de los GBM con amplificación del gen EGFR (Louis et al., 2007; Ohgaki & Kleihues, 2007). A consecuencia de la deleción, se genera una forma aberrante del EGFR carente del dominio extracelular de unión a ligando y que está constitutivamente activo, es decir, que no necesita de su ligando para activarse (Gan et al., 2009) (Figura 4). Figura 4. Esquema de la estructura del receptor nativo (wtEGFR) y del receptor mutante (EGFRvIII) (adaptado de Nicholas et al., 2006), 1 621 644 1186 Región Transmembrana Región Extracelular Región Intracelular wtEGFR EGFRvIII 50-60% Δ6-273 Introducción 12 Hay estudios in vitro que han demostrado que EGFRvIII es más tumorigénico que el receptor nativo (wtEGFR) y que la sobreexpresión del mutante puede influir en varios aspectos de la biología tumoral, incluyendo supervivencia, proliferación celular, motilidad e invasividad y resistencia a los tratamientos. Además de tener una activación constitutiva, hay estudios que indican que el EGFRvIII permanece durante más tiempo en la membrana celular, mientras que el wtEGFR es rápidamente internalizado por endocitosis (Hatanpaa et al., 2010). Por otro lado, también se ha demostrado, que ante un cierto número de copias del receptor, las tres rutas activadas por EGFR (PI3K, MAPK y Jak2/STAT3) se activan equitativamente, pero ante el incremento de los niveles del EGFRvIII, se favorece más la ruta de PI3K (Huang et al., 2007). La activación diferencial de la ruta según tenga el wtEGFR o EGFRvIII sugiere que los tratamientos deben ser distintos según la variante que presente el tumor a tratar. Así en el caso de wtEGFR podría ser conveniente usar inhibidores de EGFR en combinación con inhibidores de MEK (Huang et al., 2007). Aunque algunos estudios muestran que los pacientes portadores del receptor mutante EGFRvIII presentan una peor supervivencia y una recurrencia del tumor más rápida que los no portadores (Halastch et al., 2006), hay otros que concluyen que la presencia del receptor mutante no está relacionada con la supervivencia (Aldape et al., 2004; Gan et al., 2009). Además, también se ha publicado que la amplificación y/o sobreexpresión de EGFR tampoco tiene relación con la supervivencia de los pacientes de manera general, y esta asociación sólo se ve cuando el análisis se hace en grupos de población por edades. Mientras que la amplificación de EGFR en pacientes jóvenes (<35 años) augura un peor pronóstico, el pronóstico de los pacientes de edades más avanzadas (>65 años) portadores de EGFRvIII es más favorable (Hatanpaa et al., 2010). En otros tipos de cáncer, como en el cancer de pulmón, se han descrito mutaciones activadoras en el dominio intracitoplasmástico del EGFR (L858R y deleción del exon 19) que están asociadas a una mejor respuesta a inhibidores de tirosina kinasas (TKIs) (Costa et al., 2007; Gong et al., 2007). Sin embargo, Introducción 13 ni estas mutaciones, ni las relacionadas con resistencia, se suelen dar en gliomas (Marie et al., 2005; Omuro et al., 2007; Toth et al., 2009). 3.2.2 PTEN Como se ha mencionado anteriormente, una de las alteraciones comunes en GBM, sobre todo en los primarios, es la pérdida de la actividad de PTEN, que produce un exceso de activación de la ruta EGFR. De este modo, la pérdida de PTEN favorece la proliferación e inhibe la apoptosis. Diversos estudios, recogidos en la revisión de Knobbe y colaboradores, demuestran que la re-expresión de PTEN en líneas celulares de GBM con deleción del gen, causa detención del ciclo celular por parada en la fase G1, evita la migración, favorece la apoptosis y regula la angiogénesis (Knobbe et al., 2002). La pérdida de actividad de PTEN puede ocurrir por varios mecanismos. Uno de ellos es la pérdida del gen en homocigosis, que según estudios de análisis génico masivo puede darse en alrededor de un 10% de casos (Rao et al., 2010). Sin embargo, el mecanismo más común, es la pérdida de una de las copias del gen detectada mediante pérdida de heterocigosidad (LOH) en 10q (que ocurre hasta en el 70% de los GBM) y la mutación de la copia restante (Ohgaki et al., 2007; Riemenschneider et al., 2010). Las mutaciones son frecuentes en el caso de GBM primarios, donde pueden llegar al 40% de los casos. Aunque estudios en gliomas han identificado mutaciones somáticas localizadas a lo largo de todo el gen PTEN, la mayor incidencia se da en el exón 5 y en el principio del exón 6 que es donde se localiza el dominio catalítico de la proteína (Knobbe et al., 2002). 3.2.3 PI3K Además de por la inactivación de PTEN, la ruta PI3K se puede desregular en cáncer por mutación puntual o amplificación génica de la PI3K. Esta proteína está formada por dos subunidades: la subunidad catalítica p110α, codificada por el gen PI3KCA, y la subunidad reguladora p85α, codificada por el gen PIK3R1. La mayoría de las alteraciones descritas en PI3K se localizan en el gen PI3KCA. Estas alteraciones pueden ser por la Introducción 14 amplificación de PIK3CA o por mutaciones puntuales que causan sobreactivación de la ruta PI3K (Karakas et al., 2006; Kita et al., 2007; Vogt et al., 2006). Según el TCGA, se encuentran amplificaciones de PI3KCA en el 2% de los GBM y en el caso de mutaciones activadoras en PI3KCA, los porcentajes varían desde el 5 al 25% de los casos según distintos estudios (Broderick et al., 2004; Parsons et al., 2008; Samuels et al., 2004). Por otra parte, el trabajo del TCGA también evidenció la presencia de mutaciones en PIK3R1, que se encuentran raramente en otros tipos de cáncer. Se encontraron mutaciones en PIK3R1 en el 10% (9/91) de los GBM analizados, coincidiendo con los que no tenían alteraciones en PI3KCA (Chin et al., 2008). Además, se ha observado que las mutaciones en PI3KCA y PTEN son mutuamente excluyentes, lo que sugiere que la señalización aberrante de la ruta PI3K en cáncer, puede ocurrir por cualquiera de los dos mecanismos (Karakas et al., 2006; Kita et al., 2007; Samuels et al., 2005). 4. TRATAMIENTO DE LOS GLIOBLASTOMAS El tratamiento principal de los GBM, y también de los astrocitomas anaplásicos, consiste en la resección quirúrgica del tumor siempre que sea posible, seguido por radioterapia y un tratamiento adjuvante de quimioterapia, que usa principalmente compuestos intercalantes como la carmustina (BCNU) o la temozolomida (TMZ) (NCCN, 2010 ; Stupp et al., 2007). Cabe mencionar en este punto, un marcador molecular de respuesta a terapia con agentes alquilantes, como es la metilación del promotor del gen MGMT. El gen MGMT codifica la enzima O6-metilguanina-ADN metiltransferasa responsable de la reparación del DNA, que elimina grupos alquilo de la posición O6 de la guanina, como los que introducen los agentes alquilantes. Si el promotor no está metilado, la MGMT se expresa normalmente y puede eliminar los grupos alquilos introducidos por los agentes alquilantes, por tanto la terapia con estos agentes no tendría efecto. En cambio, cuando su promotor está metilado no Introducción 15 hay expresión de la enzima, por tanto no hay reparación del DNA, por lo que la terapia con agentes alquilantes se verá favorecida (Esteller et al., 2000). Además, la presencia del promotor de MGMT metilado, indica un buen pronóstico y una mejor supervivencia en pacientes en tratamiento con radioterapia y/o quimioterapia (Esteller et al., 2000). Sin embargo, también existen otras líneas secundarias de tratamiento en investigación (Karpel-Massler et al., 2009; Krakstad et al., 2010): tratamiento con inhibidores de angiogénesis: como el bevacizumab (Avastin®), que es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido frente al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) secretado por los tumores para la formación de nuevos vasos sanguíneos. Avastin atrapa el ligando VEGF impidiendo las formación de nuevos vasos y evitando así la progresión del tumor (Beal et al., 2011). Fue aprobado en 2009 para el tratamiento de GBM recurrentes previamente tratados, basados en tres estudios de fase II (Friedman et al., 2009; Vredenburgh et al., 2007; Kreisl et al., 2009). anticuerpos contra el receptor EGFR: impiden la unión externa del ligando al receptor, evitando su activación. Aunque en otros tumores, como el cáncer de colon, su uso está ya incluido en guías clínicas, el caso de los tumores del SNC es especial, debido a que se trata de macromoléculas que es complicado que atraviesen la barrera hematoencefálica y por tanto, su eficacia es limitada. Existen algunos ensayos clínicos en gliomas de alto grado que utilizan los siguientes anticuerpos: cetuximab (Erbitux®) (Combs et al., 2006) y nimotuzumab (Theraloc®) (Ramos et al., 2006). inhibidores de tirosina quinasa (TKIs): pequeñas moléculas que se intercalan en el dominio tirosina quinasa intracelular del receptor EGFR impidiendo su fosforilación y, por tanto, evitando su activación (KarpelMassler et al., 2009). Este tipo de inhibidores son los más ampliamente estudiados para el tratamiento de gliomas. En la Tabla 3 se recogen algunos de los TKIs utilizados actualmente en ensayos clínicos (KarpelMassler et al., 2009). Introducción 16 FÁRMACO NOMBRE COMERCIAL DIANA COMPAÑÍA Gefitinib Iressa EGFR AstraZeneca Pharm. Erlotinib Tarceva EGFR, EGFRvIII Genentech Inc Lapatinib Tykerb EGFR, HER2 GlaxoSmithKline ZD6474 Zactima EGFR,VEGFR AstraZeneca Pharm. AEE78 EGFR, HER2, VEGFR Novartis Ph.Corp. EKB569 EGFR Wyeth Pharm. Tabla 3. Inhibidores de tirosin-quinasa aplicados en ensayos clínicos para el tratamiento de gliomas de alto grado (adaptado de Karpel-Massler et al., 2009) 4.1 ERLOTINIB Erlotinib (Tarceva®, Genentech Inc, www.tarceva.com) es un pequeña molécula del grupo de TKIs (Figura 5) que se une al dominio intracelular del EGFR. De este modo, compite con el ATP e impide la autofosforilación y la activación del receptor (Figura 6). Además, también es capaz de actuar en el receptor mutante EGFRvIII. Su uso está aprobado para el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) avanzado y para el cáncer de pancreas avanzado. Entre los efectos atribuidos a ERL se encuentran los siguientes: induce apoptosis; inhibe el ciclo celular; disminuye la expresión de EGFR y EGFRvIII, por disminución de su mRNA; inhibe genes que codifican para proteínas de invasividad tumoral (Krakstad et al., 2010; Minitti et al., 2009; Raizer et al., 2005; Ramis et al., 2012). En la actualidad se están llevando a cabo diversos ensayos clínicos con ERL tanto en monoterapia como asociado a otros tratamientos (Krastad et al., 2010; www.clinicaltrials.gov). Salvando las diferencias entre estudios, la conclusión común que se obtiene es que la eficacia de ERL como agente terapéutico único es limitada en pacientes con GBM progresivo o recurrente. En general, se obtienen peores respuestas que en pacientes tratados con TMZ o BCNU (Raizer et al., 2010; Van den Bent et al., 2009; Yung et al., 2010) y sólo algunos grupos de pacientes muestran beneficios con esta terapia (Preusseur et al., 2008). De aquí se sugiere que, para aumentar el beneficio Introducción 17 proporcionado por ERL, no se debe aplicar de forma general a todos los pacientes, sino que se deben seleccionar previamente aquellos individuos que previsiblemente vayan a responder mejor. En cuanto al uso de ERL en combinación con TMZ y radioterapia en tratamiento de primera línea también existen controversias. Mientras que algunos trabajos encuentran que los pacientes tratados con ERL, TMZ y radioterapia presentan una mejor supervivencia media que los pacientes tratados sólo con la terapia convencional (19.3 meses vs 14.1 meses) (Prados MD et al., 2009), otros demuestran que la adición de ERL a esa terapia, no sólo no reporta beneficio (Brown et al., 2008), sino que además supone un aumento intolerable en la toxicidad (Peerboom et al., 2010). En cuanto a la predicción de la respuesta al tratamiento con ERL también existen controversias. Mientras que unos investigadores concluyen que la mejor respuesta al tratamiento se da en pacientes que coexpresan PTEN y EGFRvIII (Friedman et al., 2005; Mellingohf et al., 2005, 2007; Preusseur et al., 2008), otros no corroboran estos resultados e indican que no existe relación entre la amplificación de EGFR y una respuesta más favorable al ERL (Brown et al., 2008; Raizer et al., al 2010; Yung et al., 2010; Van der Bent et al; 2009). 4.2 GEFITINIB Gefitinib (GEF; Iressa®, Astrazeneca Pharmaceuticals) es un pequeña molécula del grupo TKIs (Figura 5) que actúa de la misma manera que el ERL, pero en este caso, sólo es activo frente a wtEGFR y no frente al EGFRvIII (Figura 6). Se ha aprobado su uso como tratamiento de primera línea para pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) avanzado y metastático, que sea portador de mutaciones activadoras en dominio tirosina quinasa, donde se han encontrado mejores resultados con GEF que usando quimioterapia con carboxiplatino/paclitaxel (www.iressa.com; www.gefitinib.org). Ha resultado menos efectivo que el ERL para el tratamiento de GBM, pudiendo deberse a que los gliomas carecen de las mutaciones en los exones 19 y 21 del dominio tirosina quinasa típicas del cáncer de pulmon que favorecen la respuesta a GEF en el cáncer de pulmón (Marie et al., 2005). Introducción 18 Como agente antitumoral, gefitinib detiene el ciclo celular, causa apoptosis, inhibe la angiogénesis, produce la sensibilización in vitro de células de GBM a radioterapia, induce estabilización del tumor pero no regresión (Costa et al., 2007; Gong et al., 2007; Guillamo et al., 2009; Ono et al., 2006). Los resultados de los ensayos clínicos en cuanto al uso de GEF en el tratamiento GBM no son notables, no encontrándose mejor supervivencia ni mejor supervivencia libre de progresión (Hegi et al., 2011; Rich et al., 2004; Uhm et al., 2011). Curiosamente, en el trabajo de Uhm y colaboradores, sí que se observó que el grupo de pacientes que presentaba los efectos secundarios típicos del GEF (urticaria y diarrea) tenían una mejor supervencia. 4.3 OTROS INHIBIDORES LY294002 (LY) es un potente inhibidor reversible y específico de la PI3K, que compite con el ATP en su unión a la proteína, no afectando ni al EGFR, ni a la ruta MAPK (Figura 5,6). En líneas celulares de gliomas, LY causa apoptosis, inhibe la proliferación celular, mediante la represión de la ruta Wnt/βcatenina y favorece el efecto citotóxico de la temozolomida por inhibición de la ruta PI3K/AKT (Chen et al., 2012; Guillard et al., 2009; Han et al., 2010). Temsirolimus (TEMS) es un inhibidor de mTOR, aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales (TORISEL, Pfizer Inc©, www.torisel.com). Este fármaco inhibe la proliferación celular e impide la formación de nuevos vasos sanguíneos (Figura 5, 6). Aunque hasta ahora los resultados del uso de TEMS en monoterapia para el tratamiento de GBM mostraban resultados muy limitados (ciertas mejoras radiográficas y un aumento del tiempo libre de progresión) (Chang et al., 2005; Cloughesy et al., 2008; Galanis et al., 2005), existen evidencias de beneficio en combinación con otros inhibidores de EGFR (Minitti et al., 2009; Reardon et al., 2006; Reardon et al., 2010; Thaker et al., 2009). Por otro lado, se ha visto que TEMS disminuye la invasividad celular in vitro independientemente del estado de PTEN (Weiler et al., 2013), reduciendo el efecto proinvasivo de la radioterapia. Como inconveniente, se ha descrito que el uso de TEMS en combinación con quimioterapia y radiación en GBM aumenta el riesgo de infecciones graves, por Introducción 19 lo que se necesita realizar un tratamiento antibioterápico profiláctico (Sarkaria et al., 2010). Figura 5 Estructuras moleculares de los inhibidores: erlotinib, gefitinib, LY294002, temsirolimus 4.4 TRATAMIENTOS COMBINADOS Ante la baja eficacia en general de los TKIs en la terapia de GBM, se están diseñando nuevos estudios en los que estos inhibidores del EGFR se usen en combinación con otros agentes que potencien sus efectos. En la actualidad, existen diversos ensayos clínicos que analizan los efectos de la combinación de TKIs con otros inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT, como el inhibidor de mTOR, sirolimus. En estos trabajos, los GBM recurrentes eran tratados con una combinación de sirolimus y ERL (ensayo en fase II, Reardon et al., 2010) o GEF (ensayo en fase I, Reardon et al., 2006). Ambos estudios han demostrado una buena tolerancia (baja toxicidad) en los pacientes y unos mejores resultados de la terapia combinada frente a la terapia única, debido a Introducción 20 un efecto sinérgico de ambos agentes. Sin embargo, los resultados globales han sido poco notables, tal vez debido a que se trataba de pacientes con GBM recurrentes, con una historia clínica avanzada y un tratamiento previo agresivo. Estos resultados no concluyentes conducen a la búsqueda de mejores marcadores moleculares que permitan predecir la respuesta y seleccionar aquellos grupos de pacientes, que por las características de sus tumores, puedan beneficiarse de esta terapia. La expresión de EGFRvIII, la amplificación de EGFR y la pérdida de PTEN, parecen tener gran importancia en la respuesta a TKIs, pero no de manera exclusiva, y resulta evidente que existen otros mecanismos genéticos que determinan esta respuesta. Por ello, resulta esencial por un lado, conocer bien cuáles son los mecanismos de acción de estos inhibidores y por otra parte, entender bien los complejos perfiles de los tumores que determinan las variaciones individuales de respuesta a los TKIs. Figura 6. Ruta del EGFR y lugares de actuación de los inhibidores EGF EGFR PP PIP2 PIP3 PTEN PI3K P85 P110 AKT mTOR APOPTOSIS PROLIFERACIÓNCICLO CELULAR METABOLISMO DE LA GLUCOSA EGFRvIII PP TEMSIROLIMUS LY294002 ERLOTINIB ERLOTINIB GEFITINIB Material y Métodos 29 1. CULTIVOS CELULARES E INHIBIDORES Las 11 líneas celulares derivadas de gliomas humanos utilizadas fueron cedidas por el Dr. G. Velasco (Universidad Complutense de Madrid) y por el Dr. F. Setién (Instituto Catalán de Oncología, Barcelona). Las líneas procedían de astrocitomas anaplásicos: U87MG (U87), SW1783, U118 MG (U118), SW1088, LN18, U373MG (U373) y SF767WL (SF767); de GBM: T98G (T98), A172, LN18; de un neuroglioma: H4 y de un oligoastrocitoma anaplásico: GOS3. Los cultivos se mantuvieron en condiciones estándar (estufa con 5% de CO2 y 37ºC). El medio de cultivo utilizado fue RPMI1640 (Gibco), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,1% de fungizona (Invitrogen) y 1 % de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich). Los cultivos primarios de gliomas fueron obtenidos de biopsias de pacientes del Hospital Virgen de la Salud de Toledo tras su consentimiento informado. Las biopsias fueron disgregadas mecánicamente y sembradas en frascos de 25 cm2, con medio de cultivo y un 20% FBS. Cuando fue posible, se realizaron los cariotipos de los cultivos primarios en el servicio de Genética del mismo hospital, tras dos o tres subcultivos, para asegurar su condición tumoral. Para asegurar la activación de la ruta EGFR/PI3K/AKT en los cultivos se utilizó el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF; Sigma-Aldrich). Se diluyó a una concentración stock de 10 µg/ml, en una disolución de ácido acético 10mM y 0.1% de albúmina bovina sérica (BSA; Sigma-Aldrich). Las concentraciones y tiempos de aplicación del EGF en las distintas técnicas fueron los siguientes: Para western-blot e in-cell western: 50 ng/ml durante 15 minutos previos a la extracción de proteínas. Para apoptosis y ciclo celular: 100 ng/ml durante todo el tratamiento con los inhibidores (48 y 24 horas respectivamente). Para los análisis de expresión: 50 ng/ml durante todo el tratamiento con los inhibidores (24 horas). Material y Métodos 30 Los inhibidores erlotinib (ERL) y temsirolimus (TEMS) fueron cedidos por Genentech, Inc y Wyeth, respectivamente, y diluidos en DMSO (ERL) y etanol (TEMS), a una solución stock de 20mM. Los inhibidores gefitinib y LY294002 (Biaffin Gmbh & Co) fueron diluidos en DMSO a una concentración stock de 30 y 20 mM, respectivamente. 2. VIABILIDAD CELULAR Los ensayos de viabilidad celular se realizaron mediante un ensayo colorimétrico basado en la reducción de Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT; Sigma-Aldrich). Esta técnica se basa en que únicamente las células vivas son capaces de romper el anillo tetrazolio mediante enzimas deshidrogenasas de las mitocondrias, generando unos cristales de formazán insolubles de color azul (Figura 7). La medición de la cantidad de cristales formados permite conocer la cantidad de células vivas, y por tanto del porcentaje de viabilidad celular. SUCCINATODESHIDROGENASA Amarillo (soluble) Azul-violeta (insoluble) Figura 7. Formación de los cristales de formazán a partir del MTT, tras la actividad enzimática de la succinato-deshidrogenasa presente en células viables Material y Métodos 31 El protocolo seguido fue el siguiente. Se sembraron 5.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos con medio con suero (10%), permitiendo su adhesión durante 24 horas. Pasado este tiempo, se retiró el medio de cultivo y se añadieron 100 µl de medio sin suero por pocillo, que contenía las cantidades deseadas de cada inhibidor y una cantidad constante del disolvente orgánico utilizado (DMSO o etanol) para eliminar las alteraciones en la viabilidad debida a toxicidades por el disolvente. En ningún caso se superaron concentraciones de disolvente de 0,2% v/v. El tratamiento se mantuvo durante 72 horas en estufa. Pasado este tiempo, se añadieron 10 µl de la solución de MTT (5 mg/ml) a los 100 µl de cada pocillo, y se incubó en estufa a 37ºC durante cuatro horas. A continuación, los cristales de formazán generados por las células vivas de cada pocillo se disolvieron con una disolución de isopropanolHCl (0,1N). Midiendo la absorbancia de la solución violeta generada en un lector de placas de ELISA (Grifols) a 550 nM, se pudieron determinar los porcentajes de viabilidad para cada condición, considerando la absorbancia del pocillo sin inhibidor (inhibidor 0, sólo solvente orgánico) la viabilidad 100%. Para el cálculo de la IC50, que es la concentración de inhibidor que reduce la viabilidad celular al 50%, se utilizó el programa GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software mediante un análisis de dosis-respuesta, ajustando los datos obtenidos por los ensayos de viabilidad celular con MTT a una curva sigmoidea. Las dosis de inhibidores utilizadas fueron las siguientes: erlotinib: 0, 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 µM gefitinib: 0, 25, 50, 100, 150 y 200 µM LY294002: 0, 10, 25, 75, 150 y 200 µM temsirolimus: 0, 0.01, 0.1, 1, 50 y 100 µM 3. EXTRACCIÓN DE DNA Y RNA Se extrajo el DNA total de los cultivos celulares usando técnicas estándares de extracción de ácidos nucleicos con fenol-cloroformo. El RNA total de las distintas muestra se extrajo con el reactivo TRIzol® (Invitrogen) Material y Métodos 32 según las indicaciones del fabricante. La medida de la concentración y pureza del DNA y el RNA extraídos se realizó con un espectrofotómetro NanoDrop-100 (NanoDrop Technologies). El RNA extraído se separó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio para comprobar su integridad. 4. PCR Y SECUENCIACIÓN A partir del DNA genómico extraído de las líneas celulares se amplificaron los exones 1 al 9 del gen PTEN y 18 al 21 del gen EGFR. Posteriormente, estos productos de amplificación se secuenciaron en un secuenciador ABI PRISM 310 DNA Analyzer (Life technologies) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Los cebadores y las condiciones de PCR utilizadas para la amplificación de EGFR fueron las descritas por Hsieh et al., 2006. Exón Cebador (Directo) 5’-3’ Cebador (reverso) 5’-3’ T (ºC) 18 GCTCTGTAGAGAAGGCGT CACAGGACCACTGATTAC 56 19 GATTCGTGGAGCCCAACA CCAGTGCTGTCTCTAAGG 56 20 TTCACAGCCCTGCGTAAA CAGGCACTGATTTGTGCA 56 21 CAGCAGCGGGTTACATCT TCCTCATTCACTGTCCCA 56 Tabla 4. Cebadores y temperatura de anillamiento para EGFR (40 ciclos) Las condiciones y cebadores para la amplificación de PTEN se recogen en la siguiente tabla. Exón Cebador (Directo) 5’-3’ Cebador (reverso) 5’-3’ T (ºC) 1 TCCTCCTTTTTCTTCAGCCAC GAAAGGTAAAGAGGAGCAGCC 56 2 GCTGCATATTTCAATCAAACTAA ACATCAATATTTGAAATAGAAAATC 54 3 TGTTAATGGTGGCTTTTTG GCAAGCATACAAATAAGAAAAC 56 4 TTCCTAAGTGCAAAAGATAAC TACAGTCTATCGGGTTTAAGT 56 5 TTTTTTTTTCTTATTCTGAGGTTAT GAAGAGGAAAGGAAAAACATC 51 6 AGTGAAATAACTATAATGGAACA GAAGGATGAGAATTTCAAGC 54 7 AATACTGGTATGTATTTAACCAT TCTCCCAATGAAAGTAAAGTA 56 8 TTTTTAGGACAAAATGTTTCAC CCCACAAAATGTTTAATTTAAC 54 9 GTTTTCATTTTAAATTTTCTTTC TGGTGTTTTATCCCTCTTG 54 Tabla 5. Cebadores y temperatura de anillamiento para los 9 exones de PTEN Material y Métodos 33 Posteriormente, los productos de amplificación fueron purificados con el Minielute PCR Purification kit (QUIAGEN) y visualizados en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Para la secuenciación de los productos de amplificación, se utilizaron los mismos cebadores que para la PCR (una reacción con el primer reverso y otra con el directo). En este paso, la cantidad de DNA inicial es limitante, y se incluirá mayor o menor cantidad de este DNA según el tamaño del fragmento a secuenciar (protocolo Applied Biosystem). Para la reacción de secuenciación se utilizó el kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life technologies), según las indicaciones del fabricante. Una vez realizada la reacción de secuenciación, se debe precipitar el producto obtenido con etanol e isopropanol, para eliminar restos de reactivos que interferirán en la lectura. Por último, el producto a secuenciar se disolvió en formamida antes de inyectarlo en el secuenciador. Las secuencias se analizaron con el programa informático Sequencing Analysis 5.1.1 (Life technologies). 5. RT-PCR PARA DETECCIÓN DE EGFRvIII La técnica de transcripción reversa seguida de PCR (RT-PCR) permite amplificar una cantidad pequeña de RNA diana con gran especificidad mediante transcripción reversa del RNA a cDNA, que es posteriormente amplificado mediante PCR. La transcripción reversa se realizó a partir de 1 µg de RNA para la obtención del cDNA utilizando el kit Superscript System (Gibco), según el siguiente protocolo: Desnaturalización del RNA. Se somete a 65ºC durante 5 minutos una mezcla de reacción que contiene el RNA extraído (1 µg), dNTPs (1 µL de stock de 100 pmoles/µL), agua estéril (hasta un volumen final de 12 µL) y random primers (2 µL de un stock 10 mM) (oligonucleótidos de DNA de cadena sencilla que se unen a secuencias al azar y sirven como cebadores para la elongación del cDNA). Material y Métodos 34 Retrotranscripción y síntesis de cDNA. A la mezcla anterior se añaden el buffer “First Strand” (4 µL de stock 5x), específico para RTPCR, ditiotreitol (DTT; 2 µL de 0.1 M), inhibidor de ribonucleasas (RNAsin; 1 µL de 40 U/ µL) y la polimerasa reversa Super-Script II (1 µL; 200 u). El proceso de síntesis del cDNA se realiza a 42ºC durante 50 minutos y al final se sube la temperatura para inactivar la retrotranscriptasa (10 min a 25ºC; 50 min a 42ºC; 3 min a 99ºC). Posteriormente el cDNA fue amplificado en las siguientes condiciones: activación de la polimerasa (5 min 95ºC); seguida de 35 ciclos que constan de una desnaturalización (94ºC 5s), anillamiento (60ºC 10s), extensión (72ºC 30s) y finalmente una elongación (10 min a 72ºC). Los primers utilizados para la amplificación de EGFR y se muestran en la Figura 8. Los productos de amplificación se resolvieron en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Figura 8. Primers para la detección de EGFR ó EGFRvIII (a) y para la del control interno GAPDH (b) (Lee et al., 2006) 6. HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA (CGH) La técnica de Hibridación Genómica Comparada basada en microarrays (CGH) es un método citogenético molecular que permite detectar anomalías cromosómicas analizando una gran cantidad de fragmentos génicos de una sola vez a partir de DNA genómico de las muestras problema. La técnica se basa en una hibridación competitiva donde el DNA problema se marca con una molécula fluorescente (Cy5) y el DNA de referencia con otra (Cy3). Ambos a) F 5’-CTTCGGGGAGCAGCGATGCGAC-3’ R 5’-ACCAATACCTATTCCGTTACAC-3’ b) F 5’- CGGGAAGCTTGTCATCAATGG -3 R 5’-CATCGTTCACACCCATGAGG-3’ Material y Métodos 35 DNAs marcados se hibridan con los distintos oligonucleótidos fijados en una superficie sólida, el microarray. El escaneado y análisis de las señales fluorescentes de los DNAs marcados que se hayan fijado, permitirá cuantificar la cantidad de cada oligonucleótido y por tanto la dosis génica que tiene la muestra problema en comparación con la de referencia (Figura 9). Figura 9. Esquema representativo de la técnica de hibridación con microarrays. En el caso del análisis de CGH la muestra de partida es DNA genómico y en el caso de los análisis de expresión, se parte de mRNA (adaptado de Barrero, 2005). Se utilizó la técnica de CGH sobre microarrays para analizar el DNA genómico de cada una de las 11 líneas celulares y determinar las alteraciones en el número de copias en más de 40.000 genes. Esta técnica se desarrolló en el Servicio de Análisis de Microarrays del Centro de Investigación Principe Felipe (CIPF). DNA/RNA tumoral DNA/RNA referencia Procesado y marcaje con Cy5 Procesado y marcaje con Cy3 Hibridación competitiva Lavados y escaneo Análisis Integración Cy5 > Cy3 Cy5 < Cy3 Cy5 = Cy3 MicroarrayAgilent Human 4x44k Material y Métodos 36 El protocolo para la obtención de DNA marcado fue el indicado por la casa comercial de los arrays “Agilent Oligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis” Version 4.0 (Agilent Technologies). El marcaje del DNA se realizó mediante el kit “Agilent Genomic DNA labeling kit plus” (Agilent), siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA marcado se hibridó en microarrays de 44 K (Human Genome CGH Microarray 44 K; Agilent). Los microarrays se escanearon en un escáner de microarrays de Agilent (Agilent G2565BA) y el análisis de datos se realizó utilizando el módulo DNA Analytics 4.0 CGH Module (Agilent Technologies). Las alteraciones genómicas se detectaron usando un algoritmo ADM2 con dos filtros distintos: uno menos estricto, que detectaba aquellas alteraciones que afectaban a 3 sondas consecutivas con un ratio superior o inferior a 0.25, el cual se usó para detectar alteraciones de bajo nivel; y el otro más estricto, que detecta 3 sondas consecutivas con un ratio superior o inferior a 1, que se usó para identificar amplificaciones de alto nivel y deleciones homocigotas. 7. MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION El MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) está basado en una reacción de amplificación múltiple por PCR, es decir, amplifica varias secuencias de genes en una misma reacción. Se trata de un método semicuantitativo que puede detectar números de copias anormales (amplificaciones o deleciones de un gen) de hasta 50 secuencias distintas. La reacción de MLPA se basa en la utilización de dos sondas por cada fragmento a amplificar que hibridan en secuencias contiguas del DNA diana. Cada sonda del MLPA contiene una parte en común que servirá para realizar la PCR utilizando el mismo cebador para todas las sondas, otra parte complementaria a la secuencia del DNA a amplificar y un fragmento con distinto número de pares de bases, que permitirá distinguir cada producto de amplificación según la longitud, sabiendo a qué sonda y por tanto a qué fragmento de gen corresponde (Figura 10). Material y Métodos 43 10.2 APOPTOSIS Para el análisis de la apoptosis el marcaje se realizó con PI y AnexinaVFITC (Immunostep), siguiendo las indicaciones del fabricante. Este análisis se basa en la exposición del fosfolípido, fosfatidilserina (PS), de presencia mayoritaria hacia el citosol celular, en la superficie externa de las membranas de aquellas células que están en proceso de apoptosis. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2+ con gran afinidad por la PS. Así las células se marcan con PI (rojo), para detectar el contenido en DNA, y con anexina V, marcada con FITC (verde) para ver la cantidad de células en apoptosis. Cuanto mayor cantidad de señal verde haya, indicará que hay más células con PS expuesta, es decir, más células en apoptosis en relación al total de células marcadas con PI (Figura 13) Figura 13.Esquema del análisis de la apoptosis por citometría de flujo FL1-H/ AnexinaV-FITC FL3-H/ Ioduro de Propidio APOPTOSIS NECROSIS VIVAS Material y Métodos 44 11. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS Se han utilizado tres técnicas para analizar la expresión proteica de algunos marcadores moleculares en las líneas celulares: la inmunohistoquímica (IHC), el western-blot (WB) y el In-cell western (ICW). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: En IHC: anti-EGFR y anti-p53 (Novocastra Laboratories); anti-PTEN y anti-PGFA (DAKO). Este último anticuerpo se utiliza como marcador de células gliales. En WB: anti-phospho-AKT (Ser473) (587F11), anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204) (E10), anti-BIM y anti α-tubulin (Cell Signaling Technology); anti-PTEN (clone 6H2.1; DAKO). En ICW, además de los mismos que para WB: anti-Bad (Cell Signaling Technology) y anti-BIRC5 (R&D Systems Inc). Los anticuerpos secundarios utilizados para WB e ICW fueron IRDye®800CW-labeled goat anti-mousse y anti-rabbit (LI-COR Biosciences), que emiten en verde. Para la normalización en cada pocillo en ICW, se utilizó un colorante vital, DRAQ5™ (BioStatus Limited) que tiñe el DNA en células fijadas y vivas. 11.1 INMUNOHISTOQUIMICA Las técnicas de IHC permiten detectar antígenos directamente sobre células o tejidos, mediante el uso de anticuerpos específicos marcados. El análisis inmunofenotípico de las líneas celulares se realizó a través de la inmunotinción de los citospin. Estos citospin se obtuvieron a partir de suspensiones en PBS de los cultivos celulares previamente crecidos en flask de 25 cm2 por citocentrifugación directa sobre portaobjetos. El método de detección está basado en biotina-streptavidina marcado con peroxidasa en el sistema automático TechMate 500 (DAKO). Material y Métodos 45 11.2 WESTERN-BLOT Tras los tratamientos correspondientes, los cultivos celulares se recolectaron con tripsina, manteniéndolos siempre en frío hasta la lisis celular para evitar la defosforilación de proteínas. Para la extracción de proteínas se utilizó un tampón de lisis celular (50 mM Tris HCl pH=7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% 2-mercaptoetanol, 1% Tritón X-100, 10 mM Sodiumβ-glycerolfosfato), al que se ha añadido el inhibidor de proteasas Complet Mini (Roche Diagnostics) y los inhibidores de fosfatasas: 0.5 mM ortovanadato sódico, 50 mM fluoruro sódico y 50 nM de ácido ocadaico. Las proteínas extraídas fueron cuantificadas con el kit de análisis de proteínas de Bradford (Bio-Rad). La separación de una fracción de muestra con 50 µg de proteínas, se realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE; 10% de acrilamida (40% acrilamida – biscrilamida; 29:1; AMRESCO®). Las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF; Immobilon-p PVDF membranes) por electrotransferencia húmeda. EL revelado y la captura de imágenes se realizó en un sistema de detección de infrarrojo Odyssey® Infrared Imaging system (LI-COR Biosciences), por lo que se debió realizar el bloqueo de la membrana con su buffer específico, Odyssey® Blocking Buffer. La incubación de la membrana con el anticuerpo primario correspondiente se realizó durante toda la noche a 4ºC con agitación y a las concentraciones indicadas por el fabricante. Tras los lavados de la membrana, la detección se realizó mediante la adición de anticuerpos secundarios marcados con moléculas que emiten en el infrarrojo. 11.3 IN-CELL WESTERN El In-Cell Western™ (ICW) es un ensayo inmunohistoquímico que se realiza directamente sobre cultivos vivos y fijados en microplaca. Esta detección directa de la proteína elimina posibles problemas con la extracción, Material y Métodos 46 como pérdidas o artefactos procedentes de la lisis celular y elimina variabilidad entre ensayos al detectar la proteína directamente en su contexto biológico. Para el marcaje se necesita un anticuerpo primario específico de la proteína (como los que se utilizan en WB o IHC siempre que no den lugar a bandas inespecíficas) y un anticuerpo secundario marcado con una molécula que emita señal en el infrarrojo, para poder detectar y cuantificar la señal (Chen et al., 2005). Para el análisis por ICW, se añadieron 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Tras la adhesión durante 24 horas en medio de cultivo con 10% FCS, se añadieron los siguientes tratamientos diluidos en 100 µl de medio sin suero: a) sólo los disolventes DMSO y etanol en las mismas concentraciones finales que el resto de pocillos, b) 1 µM ERL, c) 10 µM ERL, d) 1 µM ERL+0.01 µM TEMS, e) 10 µM ERL+0.01 µM TEMS. Tras 24 horas con el tratamiento, se siguió el protocolo para la detección por ICW (adaptado del libro In Cell Western™ Protocol) que consta de los siguientes pasos: Fijado de las células al pocillo. Permeabilización de la membrana celular para solubilizar la membrana plasmática y facilitar el paso de los anticuerpos al interior celular. Bloqueo con una solución rica en proteínas. Incubación con el anticuerpo primario frente a la proteína que se desee detectar en todos los pocillos excepto en algunos pocillos que servirán de control (que sólo se marcarán con el anticuerpo secundario y servirán como medida del background o absorción inespecífica). Incubación con el anticuerpo secundario y la solución de normalización para su detección en el sistema de infrarrojo. Escaneo y análisis de la imagen. Material y Métodos 47 12 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos se han expresado como medias ± desviación estándar. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de P < 0,05, indicándose también cuando se cumple que P < 0,01 o P < 0,001. Los datos han sido analizados con el programa SPSS para Windows v17.0. Para el análisis de expresión génica mediante microarrays se consideró que los genes estaban diferencialmente expresados si tenían una FDR < 0.15 (Benjamini et al., 2001). Como se mencionó también en el apartado 8.2, el estudio de rutas diferencialmente expresadas se realizó con el programa GSEA. Este programa genera una lista ordenada de genes, a partir del “gene set” estudiado asignado un índice de probabilidad, el ES (enrichment score) que combina a la vez los valores estadísticos de P y FDR. Resultados 51 1. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LAS LÍNEAS CELULARES DE GLIOMA La caracterización molecular de las líneas celulares de glioma se ha realizado mediante el análisis de las alteraciones en el número de copias de los genes utilizando la técnica de Hibridación Genómica Comparada (CGH) basada en microarrays. El estudio se ha completado y validado en genes relevantes para la biología de los gliomas utilizando otras técnicas como el MLPA, western-blot o la secuenciación directa. Además, en los casos en los que ha sido posible, se han recogido los datos procedentes de las siguientes bases de datos: Proyecto Genoma del Cáncer (CGP) del Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), cuyo objetivo es lograr la máxima caracterización de las líneas celulares más utilizadas en estudios de biología del cáncer y de ensayos con fármacos anti-tumorales, y que recoge datos de CGH, secuenciación directa y pérdida de heterocigosidad (loss of heterozygosity, LOH). COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/; Forbes et al., 2011), que recoge datos de secuenciación directa o detección de puntos calientes en determinados genes (hot spots). 1.1. ALTERACIONES EN LA DOSIS GÉNICA El análisis mediante CGH reveló que las líneas celulares de gliomas presentaban más pérdidas que ganancias de material genético. Mientras que el 22,15% de las sondas analizadas (100.079 de 451.879 sondas) estaban perdidas, solo el 12,5% (55.795 de 451.891) estaban ganadas. Los cromosomas que más frecuentemente presentaban ganancias en estas líneas celulares fueron el 7, 16, 17, 19 y 20. De manera similar, los cromosomas que contenían mayor frecuencia de pérdidas fueron el 4, 6, 10, 13, 14 y el 18. (Figura 14 a y b). Resultados 52 Figura 14. a) Porcentaje relativo de ganancias (negro) y pérdidas (gris) en relación al número de sondas ganadas o perdidas en cada cromosoma, en todas las líneas celulares y normalizado respecto al total de sondas analizadas. b) Representación de las regiones ganadas y perdidas en los cromosomas en todas las líneas celulares. Las líneas rojas a la izquierda del cromosoma representan pérdidas y las verdes a la derecha, ganancias. 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Crom1 Crom2 Crom3 Crom4 Crom5 Crom6 Crom7 Crom8 Crom9 Crom10 Crom11 Crom12 Crom13 Crom14 Crom15 Crom16 Crom17 Crom18 Crom19 Crom20 Crom21 Crom22 Unidades relativas a) b) Resultados 59 Figura 20. Análisis genómico de las líneas A172 y SW1088. (a) Resultados de MLPA para la línea A172 mostrando ganancia de EGFR, deleción homocigota de CDKN2A y deleción homocigota de PTEN excepto en los exones 1 y 2. Se muestran los resultados de CGH para los cromosomas 7, 9 y 10 de las líneas A172 (b) y SW1088 (c). La flecha indica la zona donde se encuentra PTEN en 10q23. Se observa que la línea SW1088 tiene perdida esa región mientras que en A172 no se detecta dicha pérdida. 0 0,5 1 1,5 2 A172 CDKN2A EGFR ERRB2 PTEN P53 a) A172 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 Cromosoma 7 Cromosoma 9 Cromosoma 10 1 0,5 0 -0,5 -1,5 -2,0 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 c) b) Resultados 60 1.1.2 Ganancias Aplicando un filtro estricto en el análisis por CGH, con el que sólo se detectarían las amplificaciones o ganancias de alto nivel, éstas se detectaron en 4q, 10q y 19q en dos de las líneas celulares: SW1783 (4q12) y SF767 (10q21.2-q23.1 y 19p12) (Figura 21, Tabla 7). La amplificación detectada de PDGFRA (4q12) en la línea SW1783 pudo confirmarse mediante MLPA (Tabla 8). Figura 21. Representación de las ganancias de alto nivel detectadas mediante CGH en el cromosoma 4 (a) en la línea SW1783, donde se observa ganancia en 4q12; y (b) en el cromosoma 10 en la línea SF767, observándose la ganancia en 10q21.2-q23.1. La línea representa la media de 5 genes contiguos, donde el dato para cada sonda se obtiene del logaritmo (log2) del ratio de la señal obtenida para la muestra problema con la señal obtenida para la referencia. -1 -0.5 0 0.5 1 a) -1 -0,5 0 0,5 1 b) CROMOSOMA 4 CROMOSOMA 10 Resultados 61 REGIÓN GENES LÍNEA CELULAR 4q12 CHIC2, GSH2, PDGFRA, KIT, KDR, SRD5A2L, TMEM165, CLOCK, PDCL2, NMU, EXOC1, CEP135, AASDH, PPAT, PAICS, SRP72, HOP, SPINK2, REST, OLR2B, IGFBP7 SW1783 (3.57) 10q21.2 - q23.1 COL13A1, H2AFY2, AIFM2, TYSND1, SAR1A, PPA1, NPFFR1, LRRC20, EIF4EBP2, NODAL, PRF1, ADAMTS14, SGPL1, PCBD1, UNC5B, SLC29A3, CDH23, PSAP, CHST3, SPOCK2, ASCC1, DNAJB12, CBARA1, CCDC109A, OIT3, PLA2G12B, P4HA1, NUDT13, ECD, DNAJC9, MRPS16, TTC18, ANXA7, ZMYND17, PPP3CB, USP54, MYOZ1, SYNPO2L, SEC24C, FUT11, NDST2, CAMK2G, PLAU, VCL, AP3M1, ADK, MYST4, DUSP13, SAMD8, VDAC2, KCNMA1, DLG5, NAG13, POLR3A, RPS24, ZMIZ1, PPIF, SFTPD, ANXA11, MAT1A, DYDC1, DYDC2, TSPAN14, NRG3 SF767 (13.37) 19p12 ZNF43,SINE-R ,ZNF208,ZNF257 SF767 (0.28) Tabla 8. Resumen de las ganancias de alto nivel (amplificaciones) detectadas mediante CGH en las líneas celulares de gliomas. El tamaño de la región se indica entre paréntesis (Mb). Respecto a las ganancias de bajo nivel, el cromosoma 7 fue uno de los más ganados, con una ganancia completa o casi completa en SW1088 y GOS3, o con regiones de ganancia relativa en H4, U373, U118 o A172 (Tabla 9). En la Figura 22 se muestran dos líneas representativas que muestran estos resultados. Figura 22. Representación de resultados de CGH para el cromosoma 7. a) Se observa ganancia total del cromosoma 7 para GOS3. b) Se observa ganancia parcial (7p) para H4. -1 -0.5 0 0.5 1 a) -1 -0.5 0 0.5 1 b) Resultados 62 Además del cromosoma 7, otros cromosomas que demostraron ganancias de bajo nivel en estas líneas fueron: el 16, 17, 19 y 20 (Tabla 9). CR. BRAZO p BRAZO q 7 p22.3 - p11.2 p22.3 - p14.3 p22.3 - p22.1 p21.3 - p11.2 p21.2 - p21.1 p21.1 p15.1 p12.3 - p11.2 p11.2 q11.21 - q11.22 q11.21 - q21.11 q11.21 - q22.1 q11.21 - q36.3 q11.22 q11.23 q11.23 - q22.1 q21.11 q21.11 - q21.2 q21.2 - q21.3 q21.3 q21.3 - q22.1 q22.1 q22.1 - q31.33 q22.1 - q36.3 q31.32 - q36.3 q31.33 - q34 q34 - q36.3 q36.1 q36.1 - q36.3 16 p13.3 p13.3 - p11.2 p13.3 - q21 p13.12 - p13.11 p12.1 - p11.2 p12.1 p11.2 p11.1 - q11.2 q11.2 - q12.2 q12.1 - q22.1 q12.2 - q21 q12.2 - q13 q21 q21 - q22.3 q21 - q24.3 q22.1 q22.3 - q24.3 q22.3 q22.3 - q23.1 q23.1 - q24.1 q24.1 - q24.2 q24.2 - q24.3 17 p13.3 - q25.3 p13.3 - p13.1 p13.3 - p12 p12 - q25.3 p12 - p11.2 p11.2 - q21.33 p11.2 q11.2 q12 - q21.31 q21.31 - q21.33 q21.31 - q25.3 q21.33 - q25.3 q22 - q25.3 q25.3 19 p13.3 p13.3 - p13.2 p13.3 - p13.11 p13.2 - p13.12 p13.13 - p13.12 p13.12 - p13.11 p13.11 - p12 p13.11 - q12 p12 p12 - q13.43 q12 - q13.11 q12 - q13.12 q13.11 - q13.12 q13.12 q13.12 - q13.2 q13.2 q13.31 q13.31 - q13.32 q13.31 - q13.33 q13.32 q13.32 - q13.33 q13.33 q13.33 - q13.41 q13.33 - q13.42 q13.41 - q13.43 q13.42 q13.42 - q13.43 q13.43 20 p13 - q13.33 p13 - q11.1 p13 - q13.12 p13 - p12.3 p13 - p11.21 p11.21 - q13.33 q11.21 - q13.33 q13.12 - q13.33 Tabla 9. Resumen de las regiones que con más frecuencia presentaban ganancias de bajo nivel en líneas celulares de gliomas. (CR: Cromosoma) Resultados 63 En general, las ganancias de bajo nivel detectadas afectan a gran cantidad de genes. Sin embargo, algunas de estas ganancias pudieron comprobarse a través del análisis mediante MLPA. En concreto, la ganancia del gen EGFR (localizada en 7p12) fue evaluada por MLPA, demostrando que 8 de las 11 líneas celulares presentaban ganancias de bajo nivel para dicho gen (Tabla 10, Figura 19, 20). La ganancia en otros genes también fue comprobada mediante el análisis de MLPA, PIK3CA, BRAF y BIRC5 (Tabla 10): dos de las líneas celulares presentaban una ganancia en PIK3CA (3q) (A172, SW1783; Figura 23); el oncogén BRAF (7q34) estaba ganado en 6 líneas (U87, U373, SW1088, GOS3, T98, SW1783) y el gen BIRC5 (17q) que codifica para la proteína survivina, estaba ganado en 5 de las líneas celulares (H4, LN18, T98, U373, A172) (Figura 23). La ganancia detectada mediante MLPA del gen BRAF, localizado en el cromosoma 7, es concordante con el resultado obtenido mediante CGH en el que se detectó la ganancia completa o parcial de este cromosoma. CROMOSOMA GEN LÍNEA CELULAR GANANCIA 1p13.2 NRAS U373 1q32 PI3KC2B A172 2q35 IGFBP2 SW1088 3q26.3 PIK3CA A172, SW1783 7p12 EGFR U373, U118, SW1088, GOS3, A172, H4, T98, SF767 7q34 BRAF U87, U373, SW1088, GOS3, T98, SW1783 17p11.2 TOM1L2 LN18 17q25 BIRC5 H4, LN18, T98, U373, A172 21q22.3 RUNX1 H4, A172, T98 A 4q11 PDGFRA SW1783 Tabla 10. Resumen de las ganancias validadas mediante MLPA. (A: amplificación) Mientras que nuestros resultados mediante MLPA muestran que dos de las líneas celulares (A172, SW1783; Tabla 10) presentaban una ganancia en PI3KCA, estudios previos de otros autores realizados mediante PCR cuantitativa demostraron que tres líneas incluidas en nuestro presentaban una ganancia de más de tres copias (LN18, A172 y U373) (Kita et al., 2007). Por lo tanto, teniendo en cuenta nuestros resultados y los de otros autores, 4 de las Resultados 64 11 líneas celulares de gliomas utilizadas en este estudio presentaban ganancia de PIK3CA (LN18, A172, U373 y SW1783). Figura 23. Análisis de ganancias génicas en la línea celular A172 mediante MLPA. Cada barra muestra una de las sondas del kit. En la gráfica se señalan PI3KCA y BIRC5, que muestran ganancias, mientras que BRAF, no muestra ni ganancia ni pérdida. Los genes que se detectan con este kit son (de izquierda a derecha en la gráfica y por colores): NRAS, NTRK1, PIK3C2B, BCL2L11, ERBB4, IGFBP2, IGFBP5, PIK3CA, PDGFRA, SERPINB9, NFKBIE, BRAF, JAK2, NTRK2, FGF4, CYP27B1, IRS2, NTRK3, IGF1R, TOM1L2, IGFBP4, PPM1D, BIRC5, SERPINB7, SERPINB2, RUNX1. 1.2 ANÁLISIS DE MOLÉCULAS RELEVANTES PARA LA BIOLOGÍA TUMORAL DE LOS GLIOMAS 1.2.1. PTEN La proteína codificada por el gen PTEN fue caracterizada en las líneas celulares mediante WB (Figura 24). Cuatro de las once líneas celulares de gliomas estudiadas expresaban la proteína (T98, LN18, GOS3 y SF767), mientras que 7 de ellas no la expresaban, presentando tres de estas últimas una deleción homocigota, en concordancia con los resultados genómicos obtenidos previamente (SW1088, H4, A172) (Tablas 6, 7). 0 0.5 1 1.5 PI3KCA 3q26.3 BIRC5 17q25 BRAF 7q24 Resultados 65 Figura 24. Western-blot donde se muestra la expresión de la proteína PTEN en las líneas celulares de glioma. Cuatro de las once líneas celulares expresan la proteína: LN18, T98, SF767 y GOS3. PM: peso molecular. Se utilizó el marcaje de la tubulina como control de carga de la membrana. En las cuatro líneas restantes que no expresaban la proteína PTEN ni presentaban deleción en homocigosis (U118, U87, U373 y SW1783), se secuenciaron los 9 exones del gen para hallar posibles mutaciones. Se encontró que U118 y U87 presentaban mutaciones de sustitución (G>T) en el sitio de splicing del exón 8 (c.1026+1G>T) y del exón 3 (c.209+1G>T), respectivamente. Se demostró que la línea U373 era portadora de una inserción en homocigosis de dos timinas en el exón 7 que causaban un cambio en el marco de lectura (c.723_724insTT) (Figura 25 a,b). La línea SW1783 contenía una sustitución en el exón 7 (c.691C>T) que generaba un codón stop (CGA>TGA) (Figura 25 c,d). Esta última mutación se confirmó con los resultados recogidos en el CGP. En esta base de datos, aunque no hay datos para U373, sí que se recoge la misma inserción para la línea celular U251 que comparte el mismo origen que U373. Esta mutación, además, se confirma en el trabajo de Kita et al., 2007. Figura 25. Mutaciones puntuales de PTEN. a) Inserción de TT en el exón 7 de U373 b) Misma secuencia no mutada c) Sustitución C>T en exón 7 de SW1783 d) Misma secuencia no mutada. TUBULINA PTEN U373 69 44 GOS3 H4 SW1088 A172 U118SF767SW1783U87T98LN18PM 44 a) b) ins c) d) Resultados 66 1.2.2 EGFR Se utilizó IHC para comprobar la expresión de EGFR. Esta inmunotinción demostró que las once líneas celulares expresaban, en mayor o menor medida, el receptor en la membrana celular (Figura 26). Figura 26. Resultados de IHC para el marcaje con anti-EGFR: a) T98, muestra positividad en la membrana. b) GOS3, muestra positividad en la membrana, pero con menos intensidad que la anterior. Por otro lado, el análisis de la presencia de la forma mutante EGFRvIII se realizó mediante RT-PCR, comprobándose que ninguna de las células de este estudio expresaba dicha forma mutante (Figura 27). Figura 27. Detección de EGFR nativo (wtEGFR) y EGFRvIII mediante RT-PCR. Se muestra también el resultado para el gen GAPDH usado como control de la reacción. Línea 1: GOS3, 2: A172, 3: U118, 4: SF767, 5: T98, 6: wtEGFR control, 7: EGFRvIII control; M: marcador molecular. Además en las líneas del estudio también se secuenciaron los exones 18 al 21 del gen de EGFR, correspondientes al dominio tirosina quinasa, ya que en estos exones se encuentra la mayor frecuencia de mutaciones en cáncer de pulmón que se relacionan con la respuestas a TKIs. No se GAPDH EGFRvIII wtEGFR a) a) b) Resultados 67 encontraron mutaciones en ninguno de estos exones para ninguna de las líneas. En concreto, ninguna de las líneas celulares presentaba la mutación T790M que está asociada a resistencia adquirida al ERL, ni la mutación L858R o deleción del exón 19, que están asociadas a una mejor respuesta a los TKIs, en cáncer de pulmón. 1.2.3 TP53 Se analizó la expresión de la proteína TP53 mediante el marcaje por IHC. Se sabe que las mutaciones en este gen habitualmente producen una proteína anómala, más estable de lo normal, que la hace detectable mediante IHC, lo que ha llevado a asociar la detección TP53 por IHC con la mutación del gen (Pardo et al., 2004). Se ha observado que diversos tumores que muestran positividad para TP53 mediante IHC, presentan mutaciones en el gen (Ruano et al., 2009; Yemelyanova et al., 2011). Con esta técnica, se detectó positividad para las 6 líneas que tenían mutaciones recogidas en las bases de datos del CGP y del ATCC (T98, LN18, U118, SW1088, SW1783, U373). Del resto de las líneas que no aparecen en la base de datos, encontramos que GOS3 tenía marcaje de TP53 y por tanto puede presentar mutación del gen. Se observó ausencia de marcaje para A172, U87, SF767 y H4 (Figura 28). De éstas, U87 y SF767 presentan la forma nativa de TP53 según la bibliografía (Data et al., 2004; Blough et al., 2011). Figura 28. Resultados de IHC para TP53 en dos líneas representativas. a) Se muestra el marcaje positivo nuclear de TP53 en la línea T98. b) La ausencia de marcaje para la inmunotinción de TP53 indicaría ausencia de mutación en la línea H4. a) b) Resultados 68 1.3. RESUMEN DE LAS ALTERACIONES EN LÍNEAS CELULARES DE GLIOMAS Como se ha indicado en la introducción, las tres rutas más frecuentemente alteradas en GBM son la ruta TP53 (87% de los tumores afectados), la ruta RB1 (78%) y la ruta RTK/PI3K/PTEN (88%) (Chin et al, 2008). Respecto a la ruta PI3K, las alteraciones en EGFR, PTEN y PIK3CA suelen ser mutuamente excluyentes en GBM, ya que forman parte de una misma ruta de señalización intracelular (Karakas et al., 2006; Kita et al., 2007; Samuels et al., 2005). Sin embargo, en las líneas celulares de gliomas hemos visto que pueden contener alteraciones en los tres componentes de la ruta simultáneamente (Tablas 11). En resumen, todas las líneas celulares de gliomas de nuestro estudio, tienen alterada la ruta del EGFR/PI3K/PTEN en algún punto (Tabla 12). RUTA RB RUTA PI3K RUTA TP53 CDKN2A PTEN PTEN sec EGFR EGFRvIII PIK3CA1 TP53 TP532 T98 del HOMO N - G No N Pos p.M237I LN18 del HOMO N - N No G Pos p.C238S SF767 N del HEMI - G No N Neg No U373 del HOMO N* c.723_724insTT G No G Pos p.273C U87MG del HOMO N* c.209+1G>T G No N Neg No SW1088 del HOMO del HOMO* - G No N Pos p.R273C H4 del HOMO del HOMO* - G No N Neg nd SW1783 N N* c.691C>T N No G Pos p.R273C U118 del HOMO N* c.1026+1G>T G No N Pos p.R213Q GOS3 del HOMO del HEMI - G No N Pos nd A172 del HOMO del HOMO*# - G No G Neg nd Tabla 11. Resumen de las alteraciones encontradas en las rutas RB, TP53 y PI3K del HOMO: deleción homocigota; del HEMI: deleción hemicigota; *No detectada expresión proteica de PTEN mediante western-blot; #deleción de PTEN excepto para los exones 1 y 2; G: ganancia; N: no cambio en el número de copias; No: no mutación detectada; 1PIK3CA: datos obtenidos de Kita et al., 2007 y de MLPA TP53: Pos: Inmunotinción positiva Neg: Inmunotinción negativa; 2TP53: datos obtenidos del CGP y ATCC, Data et al., 2004, Blough et al., 2011; nd: datos no disponibles. Resultados 75 Cabe destacar que ninguna de las cinco líneas sensibles expresaban CDKN2A. Sin embargo, el hecho de que sólo dos líneas de 11 mantengan la proteína y que no haya otros estudios que apoyen este hallazgo, impiden que se puedan sacar más conclusiones. También se observó que más de la mitad de las líneas con mutaciones en TP53 (4/7) y que la mayoría de líneas con ganancias en PI3KCA (3/4) eran resistentes a TEMS (Tabla 11, Figura 30). Por otra parte, no se observó relación con otros marcadores moleculares estudiados (EGFR, CDKN2C) y la respuesta a TEMS. 2.2.2 Efecto del tratamiento combinado sobre la viabilidad celular Las ocho líneas clasificadas como resistentes a ERL fueron sometidas a un tratamiento en el que se administraron distintas cantidades de ERL junto con una cantidad constante de TEMS (0,01 µM). Se eligió está concentración de TEMS ya que estaba por debajo de la IC50 obtenida con el tratamiento en monoterapia, evitando así que la disminución en la viabilidad celular se deba solamente al efecto del inhibidor de mTOR. Para cuatro de estas líneas, el tratamiento combinado mostró una respuesta mejor que el tratamiento en terapia única: LN18, U87, SW1088, U118 (Figura 31). De estas cuatro líneas que respondieron al tratamiento combinado, 3 no expresaban PTEN, sugiriendo que la terapia combinada de ERL y TEMS puede revertir la resistencia a ERL en monoterapia a pesar de que la expresión de PTEN esté alterada. Resultados 76 Figura 31. Gráfica de viabilidad celular para las cuatro líneas resistentes a ERL que responden al tratamiento combinado. a) Se representa la viabilidad celular (%, eje y) frente a la concentración ERL (µM; eje x). La línea con marcador pequeño indica el tratamiento con ERL y la línea con marcador grande representa el tratamiento con ERL a distintas concentraciones combinando con una cantidad constante (0,01µM) de TEMS. b) Análisis estadístico de la terapia individual o combinada en las líneas celulares de gliomas. *: significatividad respecto al solvente (P<0.05); #: significatividad respecto a TEMS(P<0.05); significatividad respecto a ERL (P<0.05). Doble símbolo (P<0,01). 0 50 100 0 0.01 0.1 1 10 100 LN18 0 50 100 0 0.01 0.1 1 10 100 U118 0 50 100 0 0.01 0.1 1 10 100 U87 0 50 100 0 0.01 0.1 1 10 100 SW1088 b) 0 20 40 60 80 100 120 ** ## ** ## LN18 SW1088 U87U118 % Viabilidad celular TEMS (0,01µM) ERL(1µM) - + - + - + - + - + - + - + - +- + - + - - + + - - + + - - + + - - + + ** ## ** #** ## ** * # ** # a) ) Resultados 77 2.2.3 Comparación de la sensibilidad a erlotinib y temsirolimus con la de otros inhibidores Comparando nuestros resultados con los obtenidos para otros agentes terapéuticos en uso o en estudio para el tratamiento de gliomas, observamos que no existía ninguna correlación entre la sensibilidad de estas líneas celulares frente a ERL con las encontradas para carmustina (biscloroetilnitrosourea, BCNU), temozolomida (TMZ) o 9-Tetrahidrocanabinol (THC) obtenidos por Lorente y colaboradores (Lorente et al., 2011) (Figura 32). Esto sugiere que los mecanismos de resistencia para ERL son específicos y no están asociados con las presencia de mutaciones inductoras de resistencia en el EGFR y que son distintas de otras formas de resistencia existentes para otros agentes terapéuticos. Figura 32. Diferencias en la sensibilidad de las líneas celulares de gliomas entre ERL y distintos agentes terapéuticos usados en glioma. El gráfico representa 8 de las 11 líneas de nuestro estudio en relación a su sensibilidad a erlotinib (ERL), carmustina (BCNU), temozolomida (TMZ), D9-TetrahIdrocannabinol (THC) y temsirolimus (TEMS). THC GOS3 U87 A172 SW1783 U118 U373 T98 SW1088 BCNU GOS3 SW1783 U118 U373 U87 SW1088 A172 T98 TMZ SW1783 GOS3 SW1088 U87 U118 T98 A172 U373 ERL T98 U87 U118 SW1783 SW1088 GOS3 U373 A172 TEMS SW1088 U87 GOS3 SW1783 T98 A172 U118 U373 + sensible - sensible Resultados 78 2.3 EFECTO DEL ERLOTINIB SOBRE EL CICLO CELULAR El tratamiento de las líneas celulares con 10 µM ERL demostró una detención del ciclo celular en la fase G1. El análisis mediante citometría de flujo reveló un aumento del porcentaje de población celular en fase G1 en las células tratadas respecto a las células sin tratar. Este efecto es independiente de la respuesta a ERL determinada por MTT, es decir, que no se observan diferencias en la parada del ciclo celular con el tratamiento entre líneas resistentes y sensibles (Figura 33). Figura 33. Resultados del estudio del ciclo celular analizado por citometría de flujo. a) En la gráfica se representan los porcentajes de células en fase G1 del ciclo para 9 de las líneas celulares analizadas tras tratamiento con ERL (barras gris claro) o sin tratamiento (barras gris oscuro), en ambos casos, tras la estimulación de la ruta de EGFR. b) Imagen representativa del análisis de ciclo celular para la línea SF767. Se muestra un aumento en el porcentaje de células en fase G1 (zona de la gráfica en rojo, marcado con flecha) tras el tratamiento con ERL. En la gráfica se muestran los porcentajes de células en cada fase del ciclo antes (SF767+EGF) y después del tratamiento (SF767+EGF+ERL). SF767+EGF G1= 59.75 % S = 40.25 % G2= 0 SF767+EGF+ERL G1= 75.13 % S= 17.62 % G2= 7.25 0 20 40 60 80 100 U118 GOS3 LN18 SW1088 A172 U373 U87 T98 SF767 %G1 RS a) b) Resultados 79 2.4 EFECTO DEL ERLOTINIB SOBRE LA SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR También se estudiaron los efectos del tratamiento con ERL en las rutas EGFR/PI3K/AKT y MAPK/ERK, basándonos en el conocido papel que tienen como promotoras de progresión tumoral, tanto en gliomas como en otro tipo de cánceres. Para estudiar la activación de estas dos rutas se analizaron los niveles de AKT y ERK fosforilados antes y después del tratamiento con ERL. La cuantificación de P-AKT y de P-ERK se realizó mediante ICW en 8 de las 11 líneas celulares del estudio. Se observó que ERL inhibía la señalización en ambas rutas debido a la disminución de los niveles de P-AKT y de P-ERK por debajo del nivel basal, es decir, por debajo de los niveles de proteínas fosforiladas previos a estimular la ruta con EGF en las dos líneas sensibles estudiadas (T98 y SF767), mientras que no se inhibía la señalización en la mayoría de las resistentes (4/6) estudiadas. Dos de las líneas resistentes (GOS3 y U118) sí experimentaban la inhibición de estas rutas tras el tratamiento con ERL (Tabla 13, Figura 34). Tabla 13. Resumen del efecto del tratamiento con ERL en la fosforilación de PAKT y P-ERK en líneas celulares de gliomas. S: sensible R: resistente; +: expresión de PTEN; -: no expresión de PTEN; ▼: disminución de proteína fosforilada; = : no disminución. Por otro lado, cabe destacar que en la mayoría de las líneas celulares que conservaban la expresión de PTEN (3/4), el tratamiento con ERL producía la inhibición de las rutas AKT y ERK, pero esto no ocurría en la mayoría de las líneas celulares que no expresababan PTEN (3/4). Estos resultados sugieren P-AKT P-ERK ERL PTEN T98 S + SF767 S + GOS3 R + U118 R - SW1088 = = R - U87 = = R - A172 = = R - LN18 = = R + Resultados 80 que la expresión de PTEN, que es un conocido modulador de la ruta del EGFR, favorece el efecto de ERL en las líneas celulares de gliomas (Tabla 13, Figura 34). Figura 34. Cuantificación de P-AKT y P-ERK por ICW, comparando la cantidad de proteína fosforilada antes y después del tratamiento con ERL. Se observa que ERL no inhibe ninguna de las rutas en la mayoría de las líneas celulares resistentes ni en la mayoría de líneas celulares que no expresan PTEN. Las líneas celulares sensibles T98 y SF767 si sufren una inhibición en ambas rutas tras el tratamiento con ERL. 0.0 0.5 1.0 1.5 A172 U87 LN18 SW1088 GOS3 U118 SF767 T98 P-Akt Basal P-Akt Treated P-AKT basal P-AKT tratado 0.0 0.5 1.0 1.5 A172 U87 LN18 SW1088 U118 GOS3 T98 SF767 P-Erk Basal P-Erk treated P-ERK basal P-ERK tratado - - + - + - + + PTEN NO INHIBICIÓN INHIBICIÓN RS Resultados 81 Estos resultados se validaron mediante WB e ICW, obteniéndose resultados equivalentes, como se muestra en la figura 35. Figura 35. Resultados de WB e ICW para el análisis de P-AKT y P-ERK. a) Western Blot para la línea SW1088 donde se observa que no hay disminución de la fosforilación por el tratamiento en ninguna de las dos rutas. Se ha utilizado como control de carga la tubulina (Tub). b) ICW para una línea celular sensible, donde se observa disminución de P-AKT y de PERK con respecto al nivel basal, y para la línea celular resistente SW1088, donde no se observa disminución de la señal. Además del tratamiento con 10 µM ERL también se probó el combinado 10 µM ERL+ 0,01 µM TEMS, usado en los ensayos de viabilidad celular. En el tratamiento combinado se observa un aumento de la mortalidad celular que aparece como zona no marcada dentro del pocillo. DRAQ5 se ha utilizado para la normalización y cuantificación de la señal. -EGF +EGF ERL 1µm ERL 10µm ERL+TEMS 1µm 10µM P-Akt P-Erk Tub 54 54 85 85 116 a) -EGF +EGF ERL ERL+TEMS P-AKT P-ERK DRAQ5 DRAQ5 SW1088SF767 -EGF +EGF ERL ERL+TEMS b) P-AKT P-ERK Resultados 82 2.5 ESTUDIO DEL PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA EN LÍNEAS SENSIBLES Y RESISTENTES A ERLOTINIB El efecto del tratamiento con ERL sobre la expresión génica se analizó mediante microarrays de expresión en las líneas celulares de gliomas. Para esto, los cultivos de las once líneas celulares del estudio fueron sometidos a un tratamiento de 24 horas con 10 µM de ERL o 10 µM de ERL y 0,01 µM de TEMS. Por otra parte, también se analizaron los cultivos de las líneas celulares sin tratamiento. En todos los casos se estimuló la ruta EGFR mediante la adición del factor EGF al cultivo. En primer lugar, para valorar los resultados de manera global se realizó un agrupamiento o clúster jerarquizado no supervisado de las once líneas celulares utilizadas, además de cuatro muestras derivadas de tumores primarios cedidos por el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Virgen de la Salud. Se utilizaron para ello los datos de expresión génica obtenidos de los distintos tratamientos, de las células o tumores sin tratar y de tres muestras de cerebro no tumoral comercial como control. (Figura 36). Para asegurar que el cultivo celular procedente de las muestras tumorales mantenía características génicas similares a las del tumor primario, se realizó un análisis mediante MLPA del DNA extraído del tumor y del extraído de los cultivos derivados (datos no mostrados), confirmándose la similitud. En general, las muestras de la misma línea celular agrupaban juntas, independientemente del tratamiento. En el clúster se podía observar que las muestras de los cultivos primarios agrupaban con el grupo de líneas celulares resistentes a ERL, y no con las sensibles ni con las muestras de tejido no tumoral. Además, las líneas celulares agrupaban según la respuesta al tratamiento, independientemente de si el tratamiento se combinaba con TEMS (Figura 36). Resultados 83 Figura 36. Clúster jerarquizado no supervisado de las líneas celulares de gliomas y los cultivos tumorales primarios con los distintos tratamientos, junto a las muestras de cerebro no tumoral usadas como control. Los rectángulos indican: azul oscuro, líneas resistentes a ERL; azul claro, líneas sensibles; rojo, cultivos tumorales primaros; verde, tejido cerebral no tumoral. Los símbolos representan los distintos tratamientos: 2.5.1 Genes y rutas diferencialmente expresados entre líneas resistentes y sensibles La identificación de la firma molecular responsable de la respuesta al tratamiento con ERL en líneas celulares de gliomas se realizó mediante la comparación de los perfiles de expresión génica de las líneas resistentes (8 líneas) y las sensibles (3) (t-test, método supervisado) en las muestras no tratadas. De esta manera, se encontraron 1.191 genes diferencialmente expresados entre líneas sensibles y resistentes (FDR <0.15). De estos, un subgrupo de 262 genes presentaba una diferencia de expresión superior a cuatro veces: 176 genes (67,2%) y 86 (32,8%) estaban sobreexpresados y reprimidos, respectivamente, en las líneas sensibles respecto a las resistentes. (Tabla 14). La caracterización funcional de los genes diferencialmente expresados de la firma molecular de respuesta mediante el sistema de análisis DAVID, demostró que las funciones más representadas eran las de apoptosis y muerte celular. * TS65 * * **** * * * * * * * * TS63 TS79 TS108 U118 TS65 TS63 A172 GOS3 U373 U87 LN18 SW1783 SW1088 H4 T98 LN18 SF767 TS63 Cerebro Normal +EGF +EGF+ERL +EGF+ERL+TEMS * Resultados 84 SOBREEXPRESADOS EN LÍNEAS SENSIBLES (67.2%) GENES R-S GENES R-S GENES R-S GABRE -5,328 NCK1 -2,898 CCNL1 -2,404 KTN1 -4,856 TFB2M -2,897 FAM45A -2,399 CRLF1 -4,683 ZC3H15 -2,885 CLDND1 -2,397 PNN -4,68 PITX2 -2,883 MTMR15 -2,389 HECTD1 -4,292 NOL11 -2,844 ILDR1 -2,35 IGF2BP3 -4,264 H3F3A -2,844 NCBP1 -2,321 SFRS11 -4,224 CCDC77 -2,842 TIPIN -2,315 SLC38A1 -4,211 EIF4G2 -2,812 CAT -2,31 CCDC14 -3,975 MTIF2 -2,799 HNRPR -2,307 GCLC -3,908 WAC -2,749 CNOT8 -2,304 OSBPL9 -3,875 TMEM123 -2,747 ZC3H11A -2,303 CLTC -3,844 SAE2 -2,728 IFNGR1 -2,298 UBE4A -3,838 PPP2R5E -2,718 HERC1 -2,251 IDI1 -3,81 SQLE -2,716 HIST1H3E -2,244 FANCL -3,781 RPS8 -2,695 PIK3C2B -2,227 SMC3 -3,77 FAT -2,674 TMED10 -2,227 RAD21 -3,736 YLPM1 -2,669 CCNG1 -2,227 ERCC5 -3,726 PDCD4 -2,653 ISOC1 -2,191 DHX36 -3,681 RDX -2,65 ZCCHC8 -2,181 DEK -3,67 USP9X -2,644 CCDC6 -2,179 RGS2 -3,645 PIK3C3 -2,61 ETF1 -2,16 EML4 -3,589 GLI3 -2,605 AFG3L1 -2,152 TOP2B -3,576 SERPINF1 -2,601 UBE1DC1 -2,15 XPO1 -3,564 NCL -2,6 HNRPH3 -2,143 KLF9 -3,546 S75896 -2,59 BLM -2,114 COX1 -3,503 TOP1 -2,583 RNASEN -2,11 RMI1 -3,488 NUP133 -2,566 NUP153 -2,104 NARS -3,379 RPS6 -2,55 VAV3 -2,094 ITGA6 -3,345 CYTB -2,549 ARFGEF1 -2,082 DLG7 -3,335 MAFB -2,527 RAB3GAP1 -2,073 KCTD3 -3,308 EIF1AX -2,526 TMEM131 -2,073 SLC35E4 -3,303 RPL11 -2,52 GBP6 -2,072 MATR3 -3,245 ATXN2 -2,507 ATP2C1 -2,063 SLTM -3,23 KPNB1 -2,503 SIN3A -2,052 GALNAC4S6ST -3,222 EIF3S3 -2,484 NASP -2,05 NR3C1 -3,196 CR603272 -2,484 CCDC45 -2,048 ADNP -3,183 ZNF131 -2,461 TMEM41B -2,045 KIF2A -3,154 GPBP1L1 -2,447 GNAI1 -2,038 LRPPRC -3,1 BCLAF1 -2,441 SYBL1 -2,038 CCAR1 -3,067 RPS23 -2,435 CAMSAP1L1 -2,034 CTR9 -3,006 MSH6 -2,426 ND2 -2,025 MSH2 -2,983 TCF20 -2,425 RPL26 -2,025 RLF -2,966 FUSIP1 -2,42 TDG -2,023 RPS24 -2,939 AMD1 -2,417 DHX15 -2,936 ATXN10 -2,416 Resultados 91 El análisis realizado mediante GSEA para comprobar qué rutas celulares diferenciaban a ambos grupos de líneas celulares tras el tratamiento con ERL mostró una sobrexpresión de los genes de apoptosis y de la ruta PI3K en líneas las resistentes respecto a las sensibles tras el tratamiento con ERL (P<0.01) (Figura 41). Como era de esperar, estos resultados confirman que la ruta más afectada por el tratamiento con ERL es la ruta PI3K. Figura 41. Resultados de GSEA donde se muestra que la ruta PI3K está diferencialmente expresada entre las líneas resistentes y sensibles. Gráfica de enriquecimiento de los genes de la PI3K en líneas resistentes tras tratamientos con ERL y estimulación del EGFR. Se muestran los genes significativos dentro de los genes de la ruta PI3K. Los cuadrados rojos muestran expresión más alta y los azules, más baja. En particular, al analizar los diez genes de la ruta PI3K diferencialmente expresados entre las líneas sensibles y resistentes, se observó que el tratamiento con ERL causaba un cambio de expresión en dos de estos genes: PIK3R3 y E2F1. La expresión de PIK3R3, que era significativamente superior en sensibles que en resistentes antes del tratamiento, reducía su expresión tras b) SENSIBLES RESISTENTES Resultados 92 el tratamiento sólo en el grupo de las líneas sensibles (Figura 42a; Figura 42b). Por el contrario, el gen E2F1, que tenía una expresión más alta en resistentes que en sensibles antes del tratamiento, redujo su expresión con el tratamiento en ambos grupos (Figura 42 a,b). Estos resultados sugerirían un papel importante de E2F1 en la respuesta al ERL. Figura 42. Representación del cambio de expresión tras el tratamiento con erlotinib en los diez genes de la ruta PI3K más diferencialmente expresados entre líneas resistentes y sensibles (FDR<0.05). a) Cambio en la expresión génica en las líneas sensibles. Se observa la disminución de la expresión de PIK3R3 y de E2F1 en este grupo. b) Cambio en la expresión génica en las líneas resistentes. Se observa la reducción de expresión de E2F1 en las líneas resistentes. Sin embargo, apenas se observa cambio de expresión de PIK3R3 en este grupo. 2.6.2 Comparación de los perfiles de expresión génica. Para comprobar qué genes se veían más afectados por el tratamiento con ERL, se compararon los perfiles de expresión génica de las once líneas celulares (sin distinción entre resistentes y sensibles) antes y después del tratamiento. Este análisis demostró que había 44 genes diferencialmente expresados (FDR<0.15) al comparar la expresión génica de las líneas celulares antes y después del tratamiento (Tabla 15). -1,5 -0,5 0,5 1,5 PIK3R3 E2F1 PIK3C3 PPP2R5C BAD PPP2R5E GSK3A MAPK8IP1 PIK3C2B BCL2 STTO-SNoTTO -3 -1 1 3 E2F1 BAD PIK3R3 GSK3A BCL2 MAPK8IP1 PPP2R5C PIK3C3 PPP2R5E PIK3C2B RTTO-RNoTTO a) b) Resultados 93 AUMENTAN CON EL TRATAMIENTO DISMINUYEN CON EL TRATAMIENTO GEN FDR TTO/NoTTO GEN FDR TTO/NoTTO GAS5 0,008 1,595 BIRC5 0,011 -1,04 PSAT1 0,09 1,976 PLK1 0,011 -1,596 SLC25A33 0,09 0,979 PTTG1 0,09 -0,838 SHOX 0,09 0,301 TUBB2C 0,09 -1,051 ASNS 0,102 1,159 UBE2T 0,09 -1,081 DKFZp547E087 0,102 0,251 NY-SAR-48 0,09 -1,129 ZFYVE20 0,103 0,333 PTTG2 0,09 -1,342 DDIT3 0,123 2,481 CDCA3 0,09 -1,918 CBS 0,123 1,688 CDC20 0,09 -2,028 ENTHD1 0,123 0,285 HIC1 0,092 -0,433 BQ014494 0,123 0,217 PSRC1 0,092 -1,771 PCK2 0,145 1,547 SPBC25 0,092 -2,41 MKNK2 0,145 1,061 UBE2C 0,103 -1,166 ProSAPiP1 0,145 0,243 S100A13 0,123 -0,685 TRIB3 0,147 3,046 TUBA3 0,123 -0,956 ATF3 0,147 1,226 TK1 0,123 -1,04 CDCA8 0,123 -1,065 AI608782 0,123 -3,447 GINS2 0,125 -0,698 LIG1 0,125 -1,261 PKM2 0,138 -0,735 TUBB 0,143 -0,683 AV737563 0,145 -2,343 KDELR1 0,147 -0,8 MYBPC3 0,148 -0,479 UBE2S 0,148 -0,938 SPBC24 0,148 -2,426 TUBB4 0,149 -1,097 Tabla 15. Genes diferencialmente expresados entre líneas celulares de gliomas tratadas con ERL y sin tratar (FDR<0.15). En la tabla se recogen los genes que aumentan su expresión con el tratamiento (izquierda) y los genes que disminuyen su expresión después del tratamiento (derecha). Junto al símbolo de cada gen se incluye el valor de FDR obtenido y el cambio en la expresión tras el tratamiento referido al valor sin tratar. Tres de estos genes presentaban una mayor significación (FDR<0.05) tanto en líneas sensibles como en resistentes: GAS5, PLK1 y BIRC5. Mientras que GAS5 estaba sobreexpresado después del tratamiento, PLK1 y BIRC5 estaban reprimidos tras la inhibición del receptor EGFR (Tabla 15). Se sabe que GAS5 y BIRC5 actúan como promotor o inhibidor de la apoptosis, respectivamente, mientras que PLK1 activa el ciclo celular. Resultados 94 El cambio de expresión de BIRC5 en la respuesta a ERL fue confirmado mediante análisis de ICW, que demostraba una disminución en la expresión de la proteína codificada por BIRC5, la survivina, tras el tratamiento (Figura 43). Figura 43. Resultados de la cuantificación de la expresión de survivina (BIRC5) antes y después del tratamiento con ERL. a) Imagen de ICW para la línea celular sensible H4, se cuantifica la expresión de survivina (verde) en relación a la proporción de células del experimento marcadas mediante tinción nuclear con DRAQ5 (rojo). b) Cuantificación de survivina en dos líneas celulares representativas, A172 (resistente) y H4 (sensible) (expresado en unidades arbitrarias). Se observa una disminución en su expresión tras el tratamiento confirmando los resultados de expresión génica. Por otra parte, el análisis funcional mediante GSEA entre líneas tratadas y no tratadas, demostró que había dos rutas reprimidas tras el tratamiento: la ruta del ciclo celular y la de la ubiquitina (FDR<0.1) (Figura 44). Estos resultados son concordantes con los obtenidos previamente en los ensayos de citometría de flujo (apartado 2.3 de resultados), donde se demostró que ERL detenía el ciclo celular en las líneas celulares de gliomas, aumentando el porcentaje de células en la fase G1 tras el tratamiento. 1.587 1.322 1.0 1.5 UNTREATED TREATED A172 1.689 1.415 1.0 1.5 UNTREATED TREATED H4 UNTREATED TREATED BIRC5 DRAQ a) b) Resultados 95 Figura 44. Resultados de GSEA para el análisis de las rutas significativamente afectadas tras el tratamiento con erlotinib (FDR<0.15). a) Gráfica de enriquecimiento de los genes de ciclo celular que están diferencialmente expresados antes y después del tratamiento. b) Gráfica de enriquecimiento de los genes de la ruta de la ubiquitina que están diferencialmente expresados antes y después del tratamiento. Los cuadrados rojos muestran expresión más alta y los azules, más baja. Sin tratamiento Con Tratamiento a) PLK1 BIRC5 CDC20 PTTG1 E2F1 HDAC3 CDC45L CDKN2D CCND3 CCNB2 ORC6L MAD2L2 CDC25C RBL1 E2F2 MAD2L1 ESPL1 MAD1L1 CDC6 MCM5 CDC14A CCNA2 CDC2 Sin tratamiento Con Erlotinib b) UBE2C UBE2S UBE1 UBE2L6 UBE2L3 UBE2H UBE2F3 TAX1BP3 UBE2D2 NRE1 CDC34 UBE2E1 UBE2M HIP2 Resultados 96 Gefitinib 2.7. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON GEFITINIB SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR Los resultados de viabilidad celular para el tratamiento con gefitinib (GEF) mostraron que todas las líneas celulares de nuestro estudio eran resistentes a este inhibidor (Figura 45). Además, al contrario que con ERL, las líneas que expresaban PTEN estaban entre las más resistentes al tratamiento con GEF. No se observaba relación con los otros marcadores estudiados (EGFR, TP53, PI3KCA, CDKN2C). Figura 45 Resultados de los ensayos de viabilidad celular para Gefitinib a) Gráfica de viabilidad celular. Las líneas representadas en azul muestran las gráficas de viabilidad a las siguientes concentraciones de gefinitib: 25, 50, 100, 200, 300 µM y las líneas en negro, a las concentraciones que indica el eje. b) Representación de los valores de IC50 ordenados de menor (más sensible) a mayor (menos sensible). Todas las líneas son consideradas como resistentes, ya que tienen valores muy elevados de IC50 (*: Valor IC50 > 500 µM). A pesar de que los resultados de viabilidad celular con GEF parecían indicar ausencia de respuesta en nuestras líneas celulares, estudiamos en profundidad el efecto del inhibidor sobre la biología celular (ruta del EGFR, ciclo celular y apoptosis). Para estudios posteriores se utilizó una concentración de 10 µM, de acuerdo con la literatura previa en líneas celulares (Costa et al., 2007; Gong et al., 2007, Li et al., 2011). + sensible -sensible 0 100 200 300 400 U373 SW1783 A172 SW1088 T98 IC50 (µM) b) PTEN - - - - + - + + + - - CDKN2A - + - - - - - + - - - U118 LN18 SF767 GOS3 U87 H4 * 0 50 100 150 DMSO 25 50 100 150 200 %viabilidad GEFITINIB (µM) a) Resultados 97 2.8 EFECTO DEL TRATAMIENTO CON GEFITINIB SOBRE EL CICLO CELULAR El análisis del ciclo celular se realizó mediante la técnica de citometría de flujo en 5 líneas celulares de gliomas (A172, U118, SF767, GOS3 y T98), todas ellas con una baja sensibilidad a GEF (valor de IC50 superior a 50 µM). Por un lado, se observó que estas líneas presentaban distinto porcentaje de células en fase G1 al estimular el receptor EGFR. Esto podría indicar que las respuestas frente a la activación de la ruta serían diferentes en estas líneas, con distintos grados de activación entre ellas (la disminución de células en fase G1 indica que hay más células en división, por tanto, cuanto menos células haya en G1, mayor activación del ciclo celular habrá) (Figura 46a). A172 es la línea que más porcentaje de células en fase G1 presenta y por tanto la que tiene menor cantidad de células en división. Esto indica que la estimulación con EGF, activa menos el ciclo celular en la línea A172 que en las otras. Por otro lado, tras el tratamiento con GEF durante 48 horas a una concentración 10 µM, se observó que en todas las líneas celulares se producía un incremento en la proporción de células en fase G1 (a costa de un descenso en la proporción de células en fase S; Figura 46b). Esto indica que el tratamiento con GEF produce detención del ciclo celular en todas las líneas celulares analizadas. El incremento es mínimo para A172 (sólo un 5%), siendo en la que menos se activa el ciclo tras la adición de EGF (Figura 46a). Figura 46. Resultados del estudio del ciclo celular analizado por citometría de flujo. a) En la gráfica se representan los porcentajes de células en fase G1 para las 5 líneas celulares analizadas tras la estimulación de la ruta con EGF. b) Incremento (%) de células en fase G1 tras tratamiento con GEF (% células en G1 con tratamiento - % células en G1 sin tratamiento). 0 20 40 60 80 100 A172 GOS3 T98 SF767 U118 % Células en fase G1 a) b) 0 10 20 A172 GOS3 T98 SF767 U118 ΔG1 GEF–G1 EGF Resultados 98 2.9 EFECTO DEL TRATAMIENTO CON GEFITINIB SOBRE LA APOPTOSIS En las mismas cinco líneas celulares se realizó el estudio de apoptosis también mediante citometría de flujo. De éstas, sólo U118 y SF767 mostraron un aumento en el porcentaje de células en apoptosis tras el tratamiento con 10 µM GEF durante 48 horas (Figura 47), mientras que apenas se observaron cambios en las otras tres líneas estudiadas. Cabe resaltar que los marcadores moleculares analizados en relación con la ruta (PTEN, EGFR) no se encontraron correlacionados con la apoptosis ya que S767 expresa PTEN mientras que U118 es deficiente para la proteína y en ningún caso, estas líneas presentaron mutaciones puntuales en EGFR. Figura 47. Resultados del análisis de apoptosis tras el tratamiento con GEF (10 µM; 48 horas) analizado por citometría de flujo. a) De las cinco líneas estudiadas, SF767 y U118, muestran un aumento en el porcentaje de células en apoptosis tras el tratamiento con GEF (barra gris) respecto a las células no tratadas (barra blanca), en ambos casos (n=3, media ±error). b) Gráficos obtenidos en el citómetro de flujo para el análisis de la apoptosis para la línea SF767. El cuadrante inferior izquierdo muestra la población de células vivas, mientras que el cuadrante superior derecho, muestra la población de células en apoptosis. Se indica el % de células en apoptosis, observándose un aumento de la apoptosis con el tratamiento a las concentraciones de 1 µM (panel central) y 10 µM de GEF (panel de la derecha). 0 10 20 30 40 1 A172 GOS3 T98 SF767 U118 % Células en apoptosis +EGF 2.8% 6.8% 10.10% +EGF+ 1µM GEF +EGF+ 10µM GEF a) b) Resultados 99 2.10 EFECTO DEL TRATAMIENTO CON GEFITINIB SOBRE LA SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR 2.10.1 Efecto sobre las rutas MAPK/ERK y PI3K/AKT El efecto de GEF sobre la señalización intracelular se estudió en las mismas cinco líneas celulares de gliomas. Pudo observarse que la mayor inhibición de ambas rutas, se produjo en las dos líneas en las que GEF causaba apoptosis (SF767, U118) (Tabla 16, Figura 48). Por otro lado, y como era de esperar, la línea A172, que no respondía al GEF ni en la detención del ciclo celular ni en el incremento de la apoptosis, tampoco mostró inhibición de la ruta. Además, en las otras dos líneas en las que sí se detenía el ciclo celular pero no había apoptosis (T98 y GOS3), se observó que había inhibición de la ruta PI3K (por la disminución de los niveles de P-AKT), o de ambas rutas, PI3K y ERK (al disminuir tanto P-AKT como P-ERK). Esta inhibición, sin embargo, era siempre menor que para las líneas en las que sí había apoptosis (Figura 48). En definitiva, a pesar de que los ensayos de viabilidad celular indicaban ausencia de respuesta a GEF en las líneas celulares derivadas de gliomas, el estudio en profundidad posterior indicó que el tratamiento con GEF inducía detención del ciclo celular en todas las líneas celulares analizadas y, además, inducía apoptosis en aquellas líneas donde el tratamiento más inhibía la fosforilación de AKT y ERK. Esto podría indicar que, en este caso, la técnica del MTT no es la más concluyente para determinar la sensibilidad del tratamiento con GEF en las líneas celulares de gliomas. Resultados 100 Tabla 16. Resumen del efecto del tratamiento con GEF sobre la apoptosis y la fosforilación de P-AKT y P-ERK en líneas celulares de gliomas. (+ ó -: expresión o no de PTEN; ↓: disminución de proteína fosforilada; = : no disminución). Figura 48. a) Gráfica de porcentaje de inhibición de AKT y ERK en líneas celulares de gliomas. Se representa el porcentaje de disminución de proteína fosforilada tras el tratamiento y estimulación del EGFR, con respecto a la proteína fosforilada antes del tratamiento y sin estimulación de la ruta. (No se representa A172, porque no presenta inhibición ni en AKT ni en ERK). b) ICW para una línea celular representativa, SF767. Se observa que el tratamiento con 10µM de GEF disminuye la intensidad de la señal de P-ERK y P-AKT (verde) respecto al pocillo basal (-EGF) y al estimulado con EGF (+EGF). DRAQ5 es utilizado para normalizar la señal. a) P-AKT P-ERK DRAQ5 DRAQ5 -EGF +EGF GEF1 GEF10 -60 -40 -20 0 20 GOS3 T98 SF767 U118 P-Akt P-Erk % Inhibición P-AKT P-ERK b) APOPTOSIS P-AKT P-ERK PTEN A172 NO = = - GOS3 NO + T98 NO = + SF767 SI + U118 SI - Discusión 109 La presente tesis doctoral se realizó con el objetivo de identificar los marcadores moleculares y de expresión génica característicos de la respuesta al tratamiento con inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT en líneas celulares derivadas de gliomas. Para conseguir este objetivo, en primer lugar, se realizó la caracterización molecular de las líneas celulares del estudio y, posteriormente, se estudió su respuesta frente al tratamiento con cuatro inhibidores de EGFR (gefitinib, erlotinib, temsirolimus y LY294002). Además, para los inhibidores tirosina quinasa, erlotinib y gefitinib, se estudió el efecto sobre la apoptosis, el ciclo celular y la señalización intracelular. Por último, se analizaron los cambios en la expresión génica en las mismas líneas debidos al tratamiento con ERL, identificando aquellas dianas o marcadores moleculares que pueden estar asociados a la respuesta a este inhibidor. 1. Las líneas celulares derivadas de gliomas tienen más pérdidas que ganancias génicas y no mantienen las amplificaciones de los tumores de los que proceden En esta tesis doctoral se realizó la caracterización molecular completa de once líneas celulares derivadas de gliomas habitualmente utilizadas en experimentación, mediante distintas técnicas de Biología Molecular. El análisis general demostró que las líneas celulares de glioma mostraban las principales pérdidas génicas que son típicas de GBM, pero no se observaban las ganancias de alto nivel que suelen encontrarse en este tipo de tumores. Las líneas celulares conservaban las pérdidas y/o alteraciones más frecuentes en GBM, como pérdida de PTEN y de CDKN2A/CDKN2B, ganancia de 7q (EGFR) y mutación de TP53. Sin embargo, no mantenían las amplificaciones frecuentemente descritas para GBM primarios como 1q (MDM4, PIK3C2B), 7q (MET, PEX1, CDK6), 12p (CCDN2), 12q (MDM2, GLI, CDK4) o 13q, descritas en la bibliografía (Rao et al., 2010; Ruano et al., 2006). La única amplificación típica de tumores que se detectó en una línea celular de este estudio (SW1783), fue la del gen PDGFRA en 4q. Este gen codifica para un receptor celular de respuesta a factores de crecimiento que regulan distintos Discusión 110 procesos biológicos, como desarrollo embrionario, angiogénesis o proliferación y diferenciación celular. Por otra parte, A172 mostró ganancia de PIK3C2B pero no la amplificación descrita en GBM primarios. También observamos que las líneas celulares adquirían nuevas mutaciones durante el proceso de inmortalización del cultivo que no se dan en tumores primarios. En concreto, nuestro análisis demostró que las líneas celulares presentaban ganancias de bajo nivel en los cromosomas 5, 16 y 17 y pérdidas en los cromosomas 6, 8, 11 y 18, que, aunque no son habituales en tumores primarios, sí que se han descrito en cultivos celulares procedentes de diversos tipos de tumores (Greshock et al., 2007; Li et al., 2008). Estas alteraciones se asocian a las presiones de selección que sufren los cultivos celulares tras años de mantenimiento in vitro (García-Claver et al., 2011). Por otra parte, Li y colaboradores indicaban que aunque los tumores primarios de gliomas con frecuencia presentaban pérdidas en el cromosoma 13, estas alteraciones no se encontraban en las líneas celulares. Sin embargo, nuestro análisis demostró una pérdida completa o parcial de este cromosoma en la mayoría de las líneas celulares analizadas (H4, LN18, U373, SW1088, U118, U87, SF767, SW1783, A172) (Figura 14). Solamente las líneas GOS3 y T98 no presentaban pérdidas en el cromosoma 13, confirmando los resultados de Li y colaboradores, para esta última. El análisis por CGH reveló que las líneas celulares de gliomas contenían más pérdidas que ganancias de material genético (el número de sondas perdidas casi duplicaba al de sondas ganadas (22,15% de sondas perdidas frente al 12,5% de ganadas), al contrario de lo que se observa en tumores primarios de gliomas, donde se describen con más frecuencia las ganancias (Rao et al., 2010; Ruano et al., 2006). Lo mismo ocurre en líneas celulares de cáncer de mama, donde las pérdidas genómicas casi duplicaban a las ganancias (Tsuji et al., 2010). Estos hechos concuerdan con lo propuesto en diversos estudios con diferentes líneas celulares tumorales que indican que, aunque las líneas celulares mantienen las alteraciones moleculares del tumor de origen, van adquiriendo progresivamente nuevas alteraciones a consecuencia del proceso de inmortalización y de prolongación del tiempo de Discusión 111 cultivo in vitro (Greshock et al., 2008; Naylor et al., 2005; Oga et al., 2002; Tsuji et al., 2010). La amplificación del EGFR es la alteración más común entre la mayoría de los GBM primarios (Louis et al., 2007). Esta amplificación se produce a través de dobles minutes, que son pequeños fragmentos de DNA circular extracromosómico que se replican en el núcleo, pero que carecen de centrómero y telómero. Sin embargo, en este estudio se observó que ninguna de las líneas celulares presentaba amplificación del EGFR, aunque sí mantenían ganancias de bajo nivel (principalmente ganancias en todo o parte del cromosoma 7). Esto confirmaba los estudios de otros autores que describen que es habitual la pérdida de la amplificación del EGFR durante el mantenimiento in vitro de los cultivos, al tratarse de estructuras extra cromosómicas difíciles de conservar genéticamente (Lee et al., 2006; De Witt Hamer et al., 2008). Por otro lado, ninguna de las líneas celulares de glioma analizadas presentaba el receptor mutante EGFRvIII común en GBM primarios, ni mutaciones puntuales en el dominio tirosina quinasa de EGFR. En concreto, ninguna de las líneas celulares presentaba la mutación T790M que está asociada a la resistencia adquirida al ERL, ni la mutación L858R o la deleción del exón 19, que están asociadas a una mejor respuesta a TKIs en cáncer de pulmón. Estos resultados confirmaron los estudios previos de otros autores que indicaban que mientras que en cáncer de pulmón era habitual encontrar este tipo de mutaciones, no ocurría lo mismo en gliomas (Marie et al., 2005; Toth et al., 2009). Otra de las alteraciones más comunes en la gliomagénesis es la alteración de PTEN. La mayoría de las líneas celulares analizadas en este estudio mostraban alteraciones en el gen y por ello pérdida de la expresión de la proteína PTEN, bien por deleción homocigota (3 líneas celulares), o por mutación puntual (4). Los estudios de análisis génico masivo indican que alrededor del 10,9% de los GBM tienen pérdida del gen PTEN en homocigosis (Rao et al., 2010). Esta cifra era algo más elevada en las líneas de nuestro estudio (3/11, 27% presentaban deleción en homocigosis). Estas diferencias Discusión 112 podrían deberse a que la cantidad de muestras analizadas en el estudio de Rao et al. era mucho mayor (en total analiza un total de 366 GBM recopilados de diversos trabajos y de la TGCA). Sin embargo, el mecanismo más común de pérdida completa del gen PTEN en GBM, es por pérdida de una de las copias (que ocurre hasta en el 70% de estos tumores GBM) y mutación de la copia restante (Ohgaki et al., 2007; Riemenschneider et al., 2010). En nuestro caso, dos de las líneas celulares presentaban pérdida de una de las copias, es decir, deleción en hemicigosis (SF767, GOS3), pero ambas expresaban la proteína. Por otro lado, el 40% de los GBM primarios presentan mutaciones en los exones 5 y 6 del gen PTEN, que corresponden al dominio catalítico de la proteína (Knobe et al., 2002). En nuestro caso, las líneas celulares de gliomas presentaban mutaciones en los exones 3, 7 y 8 de PTEN. La única amplificación típica de GBM que se ha mantenido en una de las líneas celulares (SW1783) ha sido la del gen PDGFRA (Riemenschneider et al., 2010). Según la clasificación de Verhaak y colaboradores en 2010, la amplificación de PDGFRA caracteriza los GBM de tipo “proneural”, mientras que el tipo de GBM “clásico” se caracteriza por amplificación de EGFR (Verhaak et al., 2010). Además, se ha encontrado que hasta en un tercio de GBM “proneural” presentaban amplificación de PDGFRA (Ozawa et al., 2011). Este resultado podría sugerir que la línea SW1783 procediera de un GBM “proneural” según esta clasificación. Sin embargo, los mismos autores reconocen que, aunque estos perfiles de expresión sí que se observan en los xenografts (tumores humanos implantados en ratones de experimentación), no se ha podido obtener la misma información en el caso de las líneas celulares. Otros de los genes que frecuentemente presentan ganancias en gliomas son: PIK3CA, BRAF y BIRC5. La amplificación de PIK3CA, subunidad activadora de la PI3K, se ha observado en varios tipos de cáncer, incluyendo los gliomas (Karakas et al., 2006; Kita et al., 2007; Vogt et al., 2006). BRAF es una serin/treonin-quinasa que está frecuentemente activada por mutación específica (V600E) en varios tipos de gliomas (extracerebelosos, gangliogliomas, xantoastrocitoma pleomórfico) o por duplicación del gen en tándem, como en los astrocitomas pilocíticos (Bar et al., 2008; Discusión 113 Riemenscheneider et al., 2010). Sin embargo, la activación de BRAF, por cualquier mecanismo, es poco frecuente en astrocitomas difusos infiltrativos. Seis de las líneas celulares analizadas presentaban ganancia de BRAF por MLPA, pudiendo deberse a la ganancia total o parcial del cromosoma 7 que se observaba en dichas líneas celulares (Figura 14). Por otra parte, la survivina, proteína codificada por el gen BIRC5 (17q), promueve proliferación celular, la angiogénesis e inhibe la apoptosis. Mientras que en el tejido adulto normal apenas es detectable, se ha encontrado sobreexpresión de esta proteína en tejidos de gran renovación celular, como ocurre en el cáncer (Altieri et al., 2003). En concreto, varios artículos recogen la sobreexpresión de BIRC5 en glioblastomas (Das et al., 2002; Hogdson et al., 2009) estando asociado a una mayor gradación del tumor y a un peor pronóstico (Shirai et al., 2009; Zhen et al., 2005). En nuestro trabajo, observamos que cinco de las 11 de las líneas celulares (H4, LN18, T98, U373, A172) presentaban también ganancia de BIRC5. En GBM secundarios, son frecuentes las mutaciones en el gen supresor de tumores, TP53 (17p13.1) y en IDH y la pérdida de heterocigosidad en 17p. En nuestras líneas, no se observaron ni ganancias ni pérdidas del número de copias de TP53, ni por CGH, ni por MLPA, pero si se han observado mutaciones puntuales en algunas de las líneas analizadas (Tabla 11). Además, nuestro análisis demostró que las líneas celulares de gliomas presentaban alteraciones génicas que en GBM son mutuamente excluyentes, como la presencia de mutaciones simultáneas en varios miembros de una misma ruta (TP53/PI3K/RB1 o EGFR/PTEN/PI3K; Tablas 11 y 12). El trabajo de Parsons y colaboradores de 2008, recogía que la mayoría de los GBM, tanto primarios como secundarios, presentaban alteraciones en genes relacionados con las rutas TP53, RB1 y PI3K, pero no en varias rutas simultáneamente, ni varios genes mutados dentro una misma ruta (Parsons et al., 2008). Sin embargo, nosotros comprobamos que las líneas celulares de gliomas habitualmente contienen alteraciones en las tres rutas a la vez (T98, LN18, SW1088, U118, GOS3, tabla 12). Del mismo modo, también es frecuente que en las líneas celulares se den a la vez alteraciones en los genes EGFR, PTEN y PIK3CA, que no suelen ocurrir en GBM. Discusión 114 Así, podemos decir que las líneas celulares derivadas de gliomas mantienen algunas de las alteraciones características de los tumores primarios como son la pérdida de PTEN, CDKN2A y CDKN2B, además de adquirir otras mutaciones durante el proceso de inmortalización del cultivo. Sin embargo, estos procesos in vitro producen la pérdida de las amplificaciones típicas en gliomas, sobre todo la del EGFR. También son frecuentes las ganancias de bajo nivel de PI3KCA. En conclusión, aunque las líneas celulares de gliomas suponen un modelo experimental sencillo de manejar y que permite una primera aproximación a la biología de los gliomas, habrá que tener en cuenta que presentan diferencias fundamentales frente a los tumores que representan, como son la pérdida de amplificaciones y la adquisición de alteraciones típicas del cultivo. 2. Las líneas celulares de gliomas responden de manera diferente a distintos inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT 2.1 Erlotinib y Temsirolimus 2.1.1 Marcadores moleculares y respuesta a Erlotinib Nuestros resultados mostraban que la mayoría de las líneas celulares resistentes al tratamiento con ERL no expresaban PTEN. De acuerdo con esto, diversos autores han asociado la pérdida de PTEN a una peor respuesta a ERL en GBMs (Wang et al., 2006; Mellinghof et al., 2007, Loew et al., 2009). Sin embargo, la predicción de la respuesta al tratamiento con ERL atendiendo a marcadores moleculares presenta controversias. Por un lado, hay un grupo de autores que defienden que la mejor respuesta a TKIs se da en pacientes que coexpresan PTEN y EGFRvIII (Friedman et al., 2005; Mellingohf et al., 2005; Mellingohf et al., 2007; Preusseur et al., 2008), mientras que otros autores no corroboran estos resultados. En concreto, indican que no presentan una respuesta más favorable al ERL atendiendo a la amplificación de EGFR (Brown et al., 2008; Raizer et al., 2010; Yung et al., 2010; Van den Bent et al., 2009). Nuestro trabajo, sin considerar la amplificación de EGFR, que no se daba en Discusión 115 las líneas celulares estudiadas, sí demostró una mejor respuesta a ERL cuando había expresión de PTEN. Por otra parte, pudimos observar que tanto las líneas celulares que tenían ganancia en PI3KCA como las que tenían mutación en TP53 presentaban una peor respuesta a ERL. Estudios previos realizados en cáncer de ovario demostraron que aquellos tumores que portaban amplificación de PI3KCA tenían una peor respuesta a la terapia convencional (Carden et al., 2012; Kolasa et al., 2009; Lee et al., 2005). En el caso de la mutación de TP53, existen trabajos en líneas celulares de gliomas que relacionan la ausencia de actividad de TP53 por mutación con una mejor respuesta a TMZ (Blough et al., 2011). Sin embargo, no existen estudios que relacionen estas alteraciones con la respuesta a inhibidores de la ruta EGFR/PI3K/AKT. Por ultimo, no se observó relación entre la respuesta a ERL y los otros marcadores moleculares estudiados (EGFR, CDKN2A). 2.1.2 Marcadores moleculares y respuesta a Temsirolimus Atendiendo a la respuesta al tratamiento con el inhibidor de mTOR, temsirolimus, nuestros resultados no indicaban ninguna relación entre la expresión de PTEN y una mejor respuesta, ya que tanto 2 de las 5 líneas celulares sensibles, como de 2 de las 6 resistentes expresaban la proteína. En este caso, TEMS actúa sobre la proteína mTOR que se encuentra por debajo de PTEN en la ruta de señalización de EFGR/PI3K y, por tanto, la expresión o ausencia de PTEN no tiene porqué influir en la acción del inhibidor. Esto coincide con los resultados de estudios previos, que indican que la inhibición de mTOR es efectiva tanto en tumores que expresan PTEN como en los que no lo expresan (Cloughesy et al., 2008). Del mismo modo, nuestros resultados, mostraban que la expresión de PTEN reforzaba la acción del ERL cuando se combinaba con TEMS, como también recogen otros autores (Wang et al., 2006). Por otra parte, cabe destacar que ninguna de las cinco líneas sensibles a TEMS expresaban CDKN2A. Sin embargo, el hecho de que sólo dos de las Discusión 116 11 líneas del estudio conservaran este gen y la ausencia de otros estudios que apoyen este hallazgo, nos impide poder elaborar conclusiones respecto a esta observación. Nuestros resultados, en concordancia con los datos del CGP, demostraron que 4 de las 6 líneas resistentes a TEMS tenía TP53 mutado. La mutación en TP53 es una de las alteraciones tumorales que aparecen más tarde en el desarrollo de un tumor y se asocia a una progresión tumoral más rápida. Es por esto que podría estar asociado a una falta de respuesta a tratamientos con inhibidores de la ruta EGFR. Del mismo modo, la mayoría de las líneas con ganancia de PI3KCA son resistentes a TEMS. De forma similar a lo observado para el ERL, la ganancia en PI3KCA y la mutación en TP53 están asociadas a una peor respuesta a TEMS en líneas celulares de gliomas. En este sentido, serían necesarios más estudios que relacionen estas alteraciones con la respuesta a inhibidores de la ruta del EGFR, como ERL o TEMS. 2.1.3 Marcadores moleculares y tratamiento combinado erlotinib y temsirolimus El uso del inhibidor de mTOR, TEMS, en combinación con ERL, favoreció la respuesta en líneas celulares de gliomas resistentes, sobre todo en aquellas que no expresaban PTEN, confirmando estudios previos (Wang et al., 2006; Mellinghof et al., 2005). Estos trabajos proponían que una terapia combinada compuesta por un TKI y otro inhibidor frente a otra proteína de la ruta del EGFR, podría revertir la falta de respuesta a TKIs en determinados tumores. Apoyando estas propuestas, nuestros resultados mostraban que la terapia combinada con ERL y mTOR, lograba respuesta en líneas celulares que eran resistentes a ERL en monoterapia. Wang y colaboradores proponían, además, que esta combinación sería más beneficiosa en líneas celulares deficientes en PTEN. Este mayor beneficio se debería a que en ausencia de PTEN la ruta EGFR/PI3K está continuamente activa (Wang et al., 2006). Apoyando lo anterior, nuestro trabajó también demostró que tres de las cuatro líneas en las que se consiguió respuesta con el tratamiento combinado, no expresaban PTEN. La comparación de nuestros resultados con los obtenidos para otros agentes terapéuticos en uso o en estudio para el tratamiento de gliomas Discusión 123 Comprobamos que GEF causaba detención del ciclo celular en fase G1 y, en algunos casos, disminuía la fosforilación de AKT y ERK. Además, en algunas líneas celulares causaba apoptosis, incluso en ausencia de mutaciones en el dominio tirosina-quinasa de EGFR, al contrario de lo descrito para líneas celulares de cáncer de pulmón (Costa et al., 2007; Gong et al., 2007; Li et al., 2011). Las líneas que presentaban más apoptosis eran también en las que más disminuía la fosforilación de AKT y ERK por el tratamiento con GEF. Por otro lado, se observó que las líneas celulares que sufrían apoptosis tras el tratamiento con GEF, correspondían con las que mayor cantidad de la proteína apoptótica BIM expresaban. Además, se observó un incremento en los niveles de BIM tras el tratamiento con GEF sólo en las líneas que sufrían apoptosis, como está descrito para el cáncer de pulmón (Costa et al., 2007; Gong et al., 2007; Li et al., 2011). Aunque son necesarios más estudios, a la vista de estos resultados podemos sugerir que BIM podría ser un marcador molecular predictivo de respuesta a GEF en líneas celulares de gliomas. Los mecanismos de activación de BIM en líneas celulares sensibles a TKIs no están bien definidos, y mientras por un lado algunos estudios sugieren que dependen sólo del bloqueo de ERK (Gong et al., 2007; Li et al., 2011; Kuroda et al., 2006), otros sugieren que la principal causa es la inhibición de AKT (Jiang et al., 2004; Handrick et al., 2006; Yang et al., 2010). Por nuestra parte, comprobamos que la inhibición específica de AKT (usando el inhibidor de PI3K, LY) por sí sola no es capaz de inducir BIM en líneas celulares de gliomas. También observamos, en concreto en una de las líneas celulares (GOS3), que la inhibición de ambas rutas tampoco causaba ni apoptosis ni incremento de BIM. En este caso, se observó que la inhibición de AKT y ERK provocada por GEF era menor (Figura 48) que para las líneas en las que sí se observaba la apoptosis. Estos resultados muestran que la respuesta de las líneas celulares de gliomas a GEF está influida por diversos factores. Mientras que Acquaviva y colaboradores describieron que, en líneas celulares de GBM, GEF causaba apoptosis mediante la inhibición de la ruta de la MAPK y la inducción de BIM, nosotros hemos observado que, además de la inducción de BIM, es necesaria la inhibición de las dos rutas (MAPK y PI3K) (Acquaviva et al., 2011). Discusión 124 2.3 LY294002 El estudio de la respuesta al inhibidor de PI3K, LY294002 en las líneas celulares de gliomas, resaltó la relación de esta respuesta y la expresión de PTEN y de PI3K. Por un lado, nuestros resultados planteaban que la pérdida de PTEN provocaba una peor respuesta de las líneas celulares de gliomas a este inhibidor (6 de las 9 líneas resistentes a LY no expresaban PTEN). Por otra parte, se observa que las cuatro líneas que tienen ganancia del gen PI3KCA son resistentes a LY. De hecho, la línea celular más resistente al tratamiento, U373, era la que mayor número de copias de PIK3CA presentaba (Kita et al., 2007). Estos resultados sugieren que la ganancia de PIK3CA causaría una peor respuesta a la terapia con inhibidores de PI3K. Aunque un trabajo en líneas celulares de gliomas sugiere que no hay relación entre PIK3CA y la sensibilidad a los inhibidores de PI3K (Guillard et al., 2009), otros estudios preclínicos con estos inhibidores en diversos tipos de tumores sólidos relacionan la presencia de mutaciones activadoras en PIK3CA y/o ausencia de PTEN con una mejor respuesta a este tipo de inhibidores (Wen et al., 2012). Por otra parte, un estudio en líneas celulares derivadas de cáncer de ovario, indica que la pérdida de PTEN y la amplificación de PIK3CA provoca una resistencia al cisplatino en estas líneas celulares (Lee et al., 2005; Kolasa et al., 2009). Se necesitarían más estudios en gliomas para comprobar si la amplificación de PIK3CA podría provocar también resistencia a tratamientos quimioterápicos, en concreto a inhibidores de PI3K. Conclusiones 127 Las líneas celulares derivadas de gliomas presentan pérdidas génicas características observadas en los tumores primarios derivados de GBMs (PTEN, CDKN2A y CDKN2B), así como ganancias de bajo nivel (EGFR, PI3KCA). Sin embargo, una de las amplificaciones más características de estos tumores, la del gen EGFR, no se observó en las líneas celulares. Además adquieren otras alteraciones propias de la inmortalización de los cultivos in vitro. Las líneas celulares de gliomas se caracterizan por tener varias alteraciones en la ruta del EGFR/PI3K/PTEN. Aunque no presentan mutaciones puntuales el dominio tirosina quinasa del EGFR, ni son portadoras del receptor mutante EGFRvIII presentan alteraciones simultáneamente en PTEN, PI3KCA y EGFR, las cuales se han descrito como mutuamente excluyentes en tumores primarios. Las líneas celulares de gliomas con pérdida de expresión de PTEN muestran una peor respuesta a ERL en lo que se refiere a la viabilidad celular, pero dicha respuesta mejora cuando se combina el tratamiento de ERL con TMS. Los mecanismos de resistencia de las líneas celulares de gliomas para ERL y TEMS son específicos y distintos a las formas de resistencia frente a otros agentes terapéuticos. Las líneas celulares de gliomas que tienen mutación de TP53 y ganancia de PI3KCA muestran una peor respuesta al tratamiento con ERL o TEMS. Las líneas celulares de gliomas con ganancia de PIK3CA y pérdida de PTEN presentan una peor respuesta a inhibidores de PI3K, como LY294002. El análisis de expresión muestra represión de los genes de la ruta PI3K tras el tratamiento con ERL en las líneas celulares de gliomas sensibles a dicho tratamiento. El tratamiento con ERL causa la detención del ciclo celular en líneas celulares de gliomas, mediante la represión de E2F1, BIRC5 y PLK1 y la inducción de GAS5, principalmente. Conclusiones 128 El análisis de expresión génica realizado ha permitido proponer el estudio de los genes PIK3R3, HRAS, CTGF, HDAC3 y ERCC5 como marcadores de respuesta a erlotinib. Gefitinib presenta una peor respuesta que erlotinib en líneas celulares de gliomas. La apoptosis mediada por inducción de BIM a consecuencia del tratamiento con GEF no depende la presencia de mutaciones en EGFR, como ocurre en las líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón. La apoptosis mediada por gefitinib en las líneas celulares de gliomas depende de la inhibición de las rutas PI3K y MAPK y de la inducción de BIM. 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