Repositorio Institucional de Documentos

2014 63 David Martínez Durán Estudio epidemiológico sobre brucelosis por Brucella suis en jabalíes, liebres y perros de caza en Aragón Departamento Director/es Patología Animal Fernández de Luco Martínez, Daniel Blasco Martínez, José María Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es David Martínez Durán ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO SOBRE BRUCELOSIS POR BRUCELLA SUIS EN JABALÍES, LIEBRES Y PERROS DE CAZA EN ARAGÓN Director/es Patología Animal Fernández de Luco Martínez, Daniel Blasco Martínez, José María Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Área de Sanidad Animal. Departamento de Patología Animal Estudio epidemiológico sobre brucelosis por Brucella suis en jabalíes, liebres y perros de caza en Aragón TESIS DOCTORAL Memoria presentada por el Licenciado D. David Martínez Durán Para optar al grado de Doctor en Veterinaria D. Daniel Fernández de Luco Martínez, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, D. Jose María Blasco Martínez, Investigador de la Unidad de Sanidad Animal del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria del Gobierno de Aragón, INFORMAN: Que la memoria titulada “Estudio epidemiológico sobre brucelosis por Brucella suis en jabalíes, liebres y perros de caza en Aragón”, presentada por el Licenciado en Veterinaria y Bioquímica D. David Martínez Durán, ha sido realizada bajo su dirección, cumpliendo los requisitos exigidos en la legislación vigente y ajustándose al proyecto de Tesis Doctoral inicialmente presentado para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Zaragoza, a 25 de marzo de dos mil catorce. Daniel Fernández de Luco Martínez Jose María Blasco Martínez Doctor en Veterinaria Doctor en Veterinaria Este trabajo ha sido posible gracias al proyecto INIA FAU2008-00015-C02-00 y el Gobierno de Aragón , mediante la colaboración del Departamento de Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente para la realización del seguimiento sanitario de la fauna cinegética en la Comunidad Autónoma de Aragón. Agradecimientos A Pier Guiseppe Meneguz y Luca Rossi, profesores de la Universidad de Turín, vosotros fuisteis los primeros en abrirme las puertas al estudio de la fauna. Con vosotros coloque las primeras piedras de mi conocimiento. A Ángel y Jose Manuel, técnicos de informática de la Facultad de Veterinaria, que tantas veces habéis salvado mi trabajo y que me habéis ayudado cuando pensaba que tenía todo perdido. No puedo dejar escapar la ocasión de agradecer a los amigos que me han acompañado a lo largo de todo este tiempo. A los compañeros de promoción de la Faculta de Veterinaria (Amaia, Latorre, Fernando, Jabón, Pedro, Ponz, Raúl y Viti). A los amigos de la Bodega (Angelito, Ballano, Benito, Chipi, Mario, Nacho, Paco, Paneta, Perrus y Tico) gracias por vuestro apoyo siempre incondicional, gracias por interesaros y preguntar. Cuantas veces os conté entre copas lo que hacía, aquí está el resultado!! A la gente de la Happy Family por esas noches estupendas, Calatayud no sería lo mismo sin vosotros. A mis compañeros de Erasmus Torino 1999-2000, que después de tanto tiempo parece que fue ayer. Gracias a las chicas de Via Ormea, a la gente de Corso Sebastopoli, Corso Carducci, Via Po y Via Rossini. Gracias por los ánimos, las llamadas y que después de tanto tiempo parece que aún fue ayer. También dar las gracias a mis compañeras de la Facultad de Ciencias (Ana, Angela, Elena, Maria, Merche y Patricia) de la licenciatura de Bioquímica, vosotras fuisteis lo mejor. A los chicos de Club de Montaña Ayud (Antonio Ramis, Aragües, Heredia, Juanote, Larios, Martinazo, Recio, Roy, Tron, Vicente) cuantas cosas he aprendido de vosotros y cuantas veces os he contado lo que hacía. Gracias a la gente de la Peña La Solera, va por ti Abuelo, estés donde estés. A la sección italiana, infinitas gracias a la familia Mattalia y la gente de Beinette, todos vosotros sois una parte fundamental de esta Tesis y ocupáis un espacio en mi corazón, al final soy un Cunesse. Ana, Isa, Marcos vivir con vosotros fue para mí una época estupenda, donde aprendí el arte de la clínica Veterinaria, de la cocina y la amistad. Agradecimientos Si a lo largo de mi paso por la Facultad de Veterinaria han sido muchos los compañeros y amigos que me han ayudado, que voy a decir de mi familia. Durante este tiempo siempre han estado apoyándome, animándome y en el final sufriéndome. A mis hermanos Javier y Pedro que siempre me han apoyado en todo y no han dejado que saltara sin red. A mis padres Marisa y Pedro, muchas gracias por la educación recibida sin la cual no hubiese llegado aquí, costase lo que costase. A mis cuñadas Eva y Montse que suerte teneros y a mis sobrinas Ana, Emma y Paula. A mis innumerables primos hermanos que son como hermanos (Alberto, Dolores, Kike, Juan Carlos, Pedro Jesus, Ramiro…). A mis tios Manolo y Manuel “el americano”, que por el discurrir de la vida no están presentes. Al final cada uno da lo que recibe y luego recibe lo que da, nada es más simple, no hay otra norma, nada se pierde, todo se transforma. Me gustaría acabar haciendo mención a la intrahistoria de esta Tesis. Hay otro material y métodos, otros resultados, otra discusión y otras conclusiones. Sobre el otro material y métodos puedo dar las gracias al Corsa y Navara, me habéis permitido recorrer toda la geografía aragonesa, sin dejarme nunca tirado, más de 60.000 km, gracias a Repsol y Cepsa, siempre me disteis de beber y de comer, a mí y a los coches (pagando). Gracias a bares, bodegas, casinos, casas de amigos, cocheras, fondas, hoteles, pensiones, refugios y teleclubs, en todos encontré hospitalidad. Gracias al Sistema Ibérico por sus magníficos atardeceres cuando volvía a casa. En esta Tesis he utilizado un par de cuchillos y numerosas pinzas y tijeras que he ido perdiendo por todos los rincones. He utilizado infinitos rotuladores, bolsas y tubos de plástico, he manchado de sangre numerosos pantalones y zapatillas. He realizado centenares de fotografías de cada rincón de esta región y he estado en las 33 comarcas que forman Aragón. He perdido un GPS en el valle de Otal y volveré a buscarlo. He aprendido a escuchar a la gente, a permanecer en silencio, a entender sus situaciones, a trasmitir la información necesaria y hacerse valer. He aprendido muchas cosas que no están en la tesis pero son necesarias para su realización. Los otros resultados han sido geniales y sorprendentes. La otra discusión, no hay cabida para la duda. Las otras conclusiones son claras y rotundas, mereció la pena tanto tiempo, dedicación y esfuerzo. A todos muchas gracias ÍNDICE Índice i ÍNDICE 1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1 2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 5 2.1.- GENERALIDADES: TAXONOMÍA Y ESTRUCTURA ANTIGÉNICA ................ 5 2.2.- BRUCELOSIS EN FAUNA SILVESTRE .................................................................... 10 2.2.1.- ORDEN: ARTIODACTYLA ................................................................................... 13 2.2.1.1.- Familia: Bovidae ............................................................................................... 13 2.2.1.2.- Familia: Cervidae .............................................................................................. 19 2.2.1.3.- Familia: Camelidae ........................................................................................... 23 2.2.1.4.- Familia: Antilocapridae ................................................................................... 24 2.2.1.5.- Familia: Suidae .................................................................................................. 24 2.2.1.6.- Familia: Tayassuidae ........................................................................................ 28 2.2.2.- ORDEN: LAGOMORPHA ..................................................................................... 28 2.2.3.- ORDEN: CARNIVORA ........................................................................................... 29 2.2.4.- ORDEN: RODENTIA .............................................................................................. 32 2.2.5.- MAMIFEROS MARINOS ..................................................................................... 33 2.3.- ESTRATEGIAS DE DIAGNÓSTICO DE LA BRUCELOSIS Y SU APLICACIÓN A LOS ESTUDIOS DE FAUNA SILVESTRE ........................................ 34 3.- MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 45 3.1.- ÁREA Y PERIODO DE ESTUDIO .............................................................................. 45 3.2.- ESTUDIO DE LA BRUCELOSIS EN EL JABALÍ .................................................... 47 3.2.1.- OBTENCIÓN Y ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUESTRAS ................. 47 3.2.2.- METODOLOGÍA DE ESTUDIO ......................................................................... 53 3.2.2.1.- Estudio serológico ............................................................................................ 53 3.2.2.2.- Estudio bacteriológico y molecular de las cepas aisladas ......................... 54 3.2.2.3.- Estudio anatomopatológico ............................................................................ 55 3.3.- ESTUDIO DE BRUCELOSIS EN LA LIEBRE .......................................................... 57 Índice ii 3.3.1.- OBTENCIÓN Y ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUESTRAS ................ 57 3.3.2.- METODOLOGÍA DE ESTUDIO ......................................................................... 62 3.3.2.1.- Estudio serológico ............................................................................................ 62 3.3.2.1.1.- Obtención de sueros positivos y negativos de referencia ................. 62 3.3.2.1.2.- Preparación del inóculo ........................................................................... 63 3.3.2.1.3.- Procedimiento de obtención de sueros e hiperinmunización .......... 64 3.3.2.1.4.- Puesta a punto del método iELISA con sueros de liebre .................. 65 3.3.2.2.- Estudio bacteriológico ..................................................................................... 67 3.3.2.3.- Estudio anatomopatológico ........................................................................... 67 3.4.- ESTUDIO DE LA SEROPREVALENCIA DE BRUCELOSIS EN LOS PERROS DE CAZA ................................................................................................................................. 68 3.4.1.- OBTENCIÓN Y ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUESTRAS ................ 68 3.4.2.- METODOLOGÍA DE ESTUDIO ......................................................................... 71 3.4.2.1.- Determinación de anticuerpos inducidos por infecciones por especies lisas de Brucella .............................................................................................................. 71 3.4.2.2.- Estudio bacteriológico ..................................................................................... 72 3.5.- ANÁLISIS ESTADíSTICO .......................................................................................... 73 4.- RESULTADOS ...................................................................................................................... 75 4.1.- RESULTADOS EN EL JABALÍ ................................................................................... 75 4.1.1.- RESULTADOS SEROLÓGICOS ......................................................................... 75 4.1.1.1.- Distribución de la seroprevalencia de brucelosis en jabalí en función de la temporada de caza y distribución por comarcas .................................................. 75 4.1.1.2.- Distribución de la seroprevalencia de brucelosis en jabalí en función de la edad y sexo .................................................................................................................. 77 4.1.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS .............................................................. 79 4.1.2.1.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalí en función de la temporada de caza y distribución por comarcas ...................................................... 79 4.1.2.2.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función de la edad y sexo.................................................................................................................................... 81 Índice iii 4.1.2.3.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalí en función del origen y naturaleza de la muestra analizada ............................................................. 83 4.1.2.4.- Caracterización molecular de las cepas de B. suis biovar 2 aisladas en jabalí .................................................................................................................................. 84 4.1.3.- RESULTADOS ANATOMOPATOLÓGICOS DE BRUCELOSIS EN EL JABALÍ .................................................................................................................................. 89 4.2RESULTADOS EN LAS LIEBRES ............................................................................... 92 4.2.1.- RESULTADOS SEROLÓGICOS ......................................................................... 92 4.2.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS ............................................................... 95 4.2.3.- RESULTADOS ANATOMOPATOLÓGICOS .................................................. 96 4.3RESULTADOS EN LOS PERROS DE CAZA ............................................................ 96 4.3.1.- RESULTADOS SEROLÓGICOS ......................................................................... 96 4.3.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS ............................................................... 99 5.- DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 101 5.1.- ESTUDIOS EN EL JABALÍ ........................................................................................ 102 5.2.- ESTUDIOS EN LA LIEBRE ........................................................................................ 116 5.3.- ESTUDIOS EN EL PERRO DE CAZA ..................................................................... 121 6.- CONCLUSIONES ............................................................................................................... 125 7.- RESUMEN ............................................................................................................................ 127 8.- SUMMARY .......................................................................................................................... 129 9.- BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 131 10.- PÁGINAS WEB ................................................................................................................. 177 11.- ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................... 179 12.- ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... 181 13.- ABREVIATURAS .............................................................................................................. 183 INTRODUCCIÓN Revisión bibliográfica 5 2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1.- GENERALIDADES: TAXONOMÍA Y ESTRUCTURA ANTIGÉNICA El género Brucella está constituido por diversas especies de bacterias Gramnegativas, que son patógenas intracelulares facultativas y capaces de multiplicarse tanto en el interior de las células del hospedador como en otras condiciones. Si bien las bacterias de género Brucella se pueden cultivar en el laboratorio sin gran dificultad en medios inertes, su hábitat primario son las células de los hospedadores que infecta, y su presencia fuera de los mismos es solo accidental y por un tiempo reducido. Esta estrecha asociación con el hospedador guarda relación con la estructura y fisiología de la bacteria y es reflejo de su posición taxonómica (Corbel, 1997; Corbel & Brinley-Morgan, 1984). El análisis genético del perfil proteico y la reactividad cruzada, así como la composición química de la envoltura celular y ciertos aspectos de su fisiología, sitúan a Brucella dentro de la subdivisión α-2 de la clase Proteobacteria, en la que están incluidos también otros patógenos de animales (Rickettsia y Bartonella), endosimbiontes de vegetales (Agrobacterium y Rhizobium) y ciertas bacterias de la tierra. Las semejanzas biológicas entre los miembros de la subdivisión α-2 demuestran que la asociación con células eucariotas es una tendencia evolutiva de estas bacterias y explica por qué comparten ciertas estrategias y factores de virulencia, independientemente de que sus hospedadores sean animales o vegetales (Moreno, 1992; Moreno & Moriyón, 2001; Ugalde, 1999). Por lo tanto, aunque las brucelas sean patógenos intracelulares de animales, comparten una estrecha relación con organismos del suelo (Paulsen et al., 2002; Wattam et al., 2009), con simbiontes de plantas y con bacterias fitopatógenas que, al igual que Brucella, tienen la habilidad o la necesidad de vivir en asociación con células eucariotas (Moreno, 1992; Whatmore, 2009). El género Brucella está compuesto por diferentes especies de cocobacilos Gram-negativos, inmóviles y aerobios estrictos, de crecimiento lento, que no poseen cápsulas ni forman esporas, y que son capaces de vivir y replicarse en el interior de células del sistema fagocítico mononuclear del hospedador (Corbel, 1997; Corbel & Brinley-Morgan, 1984). El genoma de Brucella está formado por dos cromosomas circulares (con la notable excepción de B. suis biovar 3, que posee un solo cromosoma), y no se ha puesto en evidencia la existencia de plásmidos en ninguna de las especies de este género (Michaux-Charachon et al., 1997). Del mismo modo que otras Revisión bibliográfica 6 bacterias Gram-negativas, el género Brucella tiene un componente estructural principal en la membrana externa, el lipopolisacárido (LPS), que además de su función estructural, es un importante factor de virulencia (Lapaque et al., 2005). Dependiendo de la naturaleza de dicho LPS, la morfología colonial se denomina “lisa” (S) o “rugosa” (R). De hecho, es habitual dividir el género Brucella en dos grandes grupos según su morfología colonial: las especies rugosas y las especies lisas. El género se ha agrupado en 6 especies clásicas (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis) siguiendo, entre otros, el criterio de su hospedador animal preferencial y sus características de patogenicidad. Además, dentro de algunas de estas especies clásicas se han diferenciado biotipos o biovariedades: por el momento B. abortus posee 8, B. melitensis tres y B. suis cinco (Nielsen, 2012). Las brucelas son un grupo muy homogéneo genéticamente, con valores de hibridación ADN-ADN próximos al 100%, por lo que se ha propuesto que todas las especies clásicas se incluyan en una sola -B. melitensis- (Verger et al., 1985). Sin embargo, no existen razones científicas ni prácticas para admitir que Brucella sea un género mono-específico y el rango de hospedador es, con algunas excepciones, un buen criterio biológico para definir las especies (Moreno & Moriyón, 2001). A las 6 especies clásicas mencionadas antes, en los últimos años se han añadido otras dos nuevas, B. ceti y B. pinnipedialis, aisladas de diversas especies de mamíferos marinos (Foster et al., 2007). Además, una nueva enfermedad fue identificada en el topillo campesino Microtus arvalis en Chequia, y una nueva especie, B. microti, aislada de los topillos enfermos, así como de zorros y del suelo (Hubálek et al., 2007; Scholz et al., 2008; Scholz et al., 2009). Finalmente, otra nueva especie, B. inopinata, aislada a partir de un implante de glándula mamaria en una paciente con signos de brucelosis, ha sido también incluida recientemente dentro del género (Scholz et al., 2010). Teniendo en consideración que algunas cepas que presentan las características de Brucella, pero diferentes a las especies descritas hasta ahora, han sido aisladas también en un paciente humano con historial de neumonía crónica (Tiller et al., 2010), de casos de abortos en babuinos (Schlabritz-Loutsevitch et al., 2009), así como de abscesos en ranas (Eisenberg et al., 2012; Fischer et al., 2012), parece razonable concluir que la clasificación y situación taxonómica definitivas de este complejo género bacteriano restan por ser definidas todavía con suficiente precisión. Como se ha indicado, atendiendo a la morfología lisa (S) o rugosa (R) de la superficie de las colonias cuando se examinan en la lupa con luz incidente tras ser teñidas con una solución de cristal violeta y oxalato de amonio (Alton et al., 1988), se Revisión bibliográfica 7 acostumbra a diferenciar las especies de Brucella en dos grandes grupos: las rugosas (B. ovis y B. canis) y las lisas (todas las demás). Este fenómeno refleja diferencias estructurales y antigénicas en la envoltura celular y, muy particularmente, en el lipolisacárido (LPS). La estructura más característica de las bacterias Gram-negativas es su envoltura celular, formada por una membrana externa, la membrana interna (o citoplasmática), y un periplasma intermedio entre las anteriores. La membrana externa contiene los antígenos inmunodomiantes y está constituida por fosfolípidos, proteínas y LPS. La asimetría en la distribución del LPS, junto con sus propiedades y las proteínas de la membrana externa, hace que esta actúe como una barrera de permeabilidad. Siendo Brucella una bacteria Gram-negativa, su envoltura celular se adapta a este modelo, si bien su membrana externa es diferente a la típica de las bacterias Gram-negativas (enterobacterias y pseudomonas). La diferencia radica, en primer lugar, en que es relativamente permeable a agentes hidrófobos, con diferencias entre especies y biovariedades que se reflejan en las técnicas bacteriológicas de tipificación (Martínez de Tejada & Moriyón, 1993). En segundo lugar, es resistente a los péptidos catiónicos bactericidas presentes en lisosomas y fluidos corporales (lisozima, lactoferrina, defensinas, etc.) y a otros policationes bactericidas como la polimixina B (Martínez de Tejada et al., 1995). Como en otras bacterias Gram-negativas, el LPS-S consta de una parte glucolipídica (lípido A), insertada en la membrana externa y por tanto no expuesta en la superficie, y otra polisacarídica dirigida hacia el exterior, y dividida en dos secciones: el núcleo oligosacarídico, más interno, y el polisacárido O, también llamado cadena O. El LPS es el antígeno principal de la bacteria y el que estimula una respuesta inmune mediada por anticuerpos que es rápida, intensa y duradera, pero no induce hipersensibilidad retardada (Díaz et al., 1968). El lípido A es diferente del típico de las bacterias Gramnegativas clásicas, lo que explica que muchas de las actividades características de los LPSs, como la estimulación de los macrófagos, sean en general más bajas en Brucella que en otros Gram-negativos. La estructura básica del lípido A es igual en todas las especies de Brucella, si bien pudieran existir pequeñas diferencias cuantitativas a nivel de los ácidos grasos. El lípido A no tiene relevancia diagnóstica (Moreno & Moriyón, 2001). La estructura del núcleo oligosacarídico no se conoce en detalle, y puede estar completa o, por el contrario, reducida en los mutantes rugosos. Se desconoce si hay diferencias a este nivel entre las distintas especies de Brucella. En otras bacterias Gram- Revisión bibliográfica 8 negativas, el núcleo y el lípido A del LPS juegan un papel crítico en la impermeabilidad frente a agentes hidrófobos y representan el lugar primario de acción de los péptidos bactericidas (Velasco et al., 2000). El LPS de Brucella es diferente, ya que no actúa como tal barrera y es refractario a la unión de tales péptidos (Velasco et al., 2000). Muchos hospedadores infectados por Brucella producen anticuerpos frente a esta sección interna del LPS, pero su análisis requiere pruebas especiales no disponibles en los laboratorios de rutina (Rojas et al., 1994). El polisacárido O (O/PS) constituye la sección más externa e inmunodominante del LPS-S y, por tanto, de la totalidad de la bacteria. Está formado por un homopolímero de N-formil-perosamina (Caroff et al., 1984). En la biovar 1 de B. abortus el único enlace que presenta este polímero es de tipo α-1,2 mientras que en B. melitensis biovar 1 hay un enlace α-1,3 por cada cuatro enlaces α-1,2, que se encuentran en una sola cadena de longitud heterogénea (entre 25 y 130 azúcares). Por tanto, en el O/PS de B. abortus biovar 1 hay trechos de 5 o más azúcares con el mismo enlace (α -1,2), mientras que en B. melitensis biovar 1 hay un enlace (α-1,3) ausente en el primero. Esto genera tres tipos básicos de epítopos: A (5 o más azúcares en enlace α -1,2); M (que contiene el enlace α1,3), y el C o común (4 o menos azúcares con enlaces α-1,2) (Cherwonogrodzky et al., 1990; Douglas & Palmer, 1988). Esto es de gran relevancia práctica ya que la inmensa mayoría de los anticuerpos producidos tras la infección por cepas S de Brucella reconocen el epítopo C lo que explica por qué, en el diagnóstico serológico, es irrelevante el origen (B. abortus, B. suis o B. melitensis) del antígeno utilizado (sea una suspensión celular o LPS-S) y, por ello, usando la serología exclusivamente no es posible distinguir el serotipo (AC, MC o AMC) de la cepa infectante (Alonso-Urmeneta et al, 1998). Como queda dicho, el O/PS (cadena O) está totalmente ausente en el LPS de los mutantes rugosos de las especies lisas. Además de la cadena O del LPS, las cepas de Brucella en fase S contiene un segundo polisacárido, que reacciona con anticuerpos producidos durante la infección, pero que no es inmunogénico, y que habitualmente se denomina hapteno nativo –NH- (Aragón et al., 1996). Existe una cierta confusión en el uso de los términos NH, cadena O libre (O/PS) y polisacárido B. Los dos primeros han sido empleados de forma equivalente, pero el O/PS y NH no son estructuras idénticas. Si bien el tipo de azúcar y enlace son semejantes en ambos, el NH contiene alrededor de un 40% de perosamina no formilada, lo que, como puede demostrarse con anticuerpos monoclonales, hace que su estructura Revisión bibliográfica 9 epitópica difiera sutilmente de la del O/PS (Moreno et al., 1981; Moreno et al., 1987). Además, a diferencia de lo que ocurre cuando se extrae el O/PS, cuando se extrae el NH este no está unido al núcleo oligosacarídico del LPS y, desde el punto de vista estructural, parece representar una molécula individual que contribuiría a dar a la superficie características de tipo liso sin incrementar la densidad de LPS y sus secciones internas (Aragón et al., 1996). Por lo que respecta al polisacárido B (también denominado “polyB”), algunos consideran erróneamente que es un glucano cíclico periplasmático sin actividad serológica, pero se trata de un polisacárido de perosamina parcialmente formilada, observable por inmunoprecipitación en gel y que se acumula en el citosol del mutante rugoso B. melitensis 115B (Alonso-Urmeneta et al., 1998). El polisacárido B es pues semejante al NH, pero no está expuesto en la superficie de la bacteria, pudiendo representar un precursor (Cloeckaert et al., 1992; Díaz et al., 1968). Como en otras bacterias Gram-negativas, la membrana externa de Brucella contiene varias proteínas mayoritarias (Cloeckaert et al., 1996). Si bien los animales infectados por Brucella producen anticuerpos frente a todas o la mayoría de ellas, esta respuesta es de importancia diagnóstica muy reducida en comparación con la generada frente al LPS-S (Riezu-Boj et al., 1990; Zygmunt et al., 1994). Además, los componentes periplasmáticos y citosólicos incluyendo los ácidos nucleicos y ribosomas, sustancias de reserva, y una variedad de proteínas enzimáticas relacionadas fundamentalmente con el metabolismo, se comportan como antígenos relevantes durante la infección, aunque el análisis por inmunoelectroforesis no revela apenas diferencias cualitativas entre las distintas especies de Brucella que se han estudiado (Díaz et al., 1968). De manera muy relevante, y a diferencia de lo que ocurre con el LPS-S o su O/PS, estas proteínas citosólicas y periplasmáticas de Brucella inducen hipersensibilidad retardada, aspecto de gran interés diagnóstico. Revisión bibliográfica 10 2.2.- BRUCELOSIS EN FAUNA SILVESTRE Las especies de Brucella más importantes desde el punto de vista de producción animal y salud pública son B. abortus, responsable de la brucelosis bovina, B. melitensis, principal agente causal de la brucelosis ovina y caprina, y B. suis, responsable de la brucelosis porcina (Corbel, 1997; Nielsen, 2012). Estas 3 especies provocan abortos e infertilidad y cuando se detectan en un rebaño se imponen restricciones al movimiento de animales y al comercio, ocasionando elevadas pérdidas económicas en las explotaciones pecuarias (Díaz Aparicio, 2013; Ragan et al., 2013; Sherman, 2011). La brucelosis es considerada una de las zoonosis mas importantes, que se transmite por contacto directo con los animales y/o con sus secreciones o por el consumo de leche y subproductos lácteos (Acha & Szyfres, 2001; Boschiroli et al., 2001). Las especies mencionadas mantienen una preferencia sobre los hospedadores indicados, pero B. abortus y B. suis se han aislado también de una gran variedad de animales silvestres, como el bisonte Bison bison, el alce Alces alces, el ciervo Cervus elaphus, el cerdo silvestre y el jabalí Sus scrofa, el zorro Vulpes vulpes, la liebre europea Lepus europaeus, búfalo africano Syncerus caffer, el reno Rangifer tarandus tarandus y el caribú Rangifer tarandus groenlandicus (Davis, 1990; Godfroid, 2002; Godfroid et al., 2005; Rementsova, 1987; Rhyan, 2000). Sin embargo, B. melitensis ha sido raramente identificada en animales silvestres, aunque al menos en Europa ha sido aislada en gamuza Rupicapra rupicapra, íbice Capra ibex (Ferroglio et al., 1998; Garin-Bastuji et al., 1990), cabra montés Capra pyrenaica hispanica (Muñoz et al., 2010) y ciervo (Blasco, J.M. y Fernández de Luco, D. comunicación personal). Por esta razón, los animales de vida silvestre son considerados por algunos como un posible reservorio de brucelosis para el ganado doméstico (Davis, 1990; Godfroid, 2002; Rementsova, 1987; Rhyan, 2000). Puesto que la brucelosis está siendo controlada con éxito en la mayoría de especies domésticas en países desarrollados, la presencia de Brucella en las especies silvestres puede constituir una amenaza para la reinfección de los animales domésticos y el hombre (Davis, 1990; Davis & Elzer, 2002; Olsen, 2013). Sin embargo, la información disponible es controvertida y no se conoce con exactitud el papel que juega la fauna silvestre en los diferentes aspectos de la epidemiología de la enfermedad (Godfroid et al., 2013; Muñoz et al., 2010; White et al., 2013). Un aspecto de suma relevancia que resta por ser clarificado es si la presencia de Brucella en la fauna silvestre es una consecuencia de la transmisión de la infección desde los animales domésticos, o bien, se trata de una infección ancestral que se mantiene de Revisión bibliográfica 11 forma autónoma y sostenida en el tiempo. En consecuencia, se precisa de mucha más investigación multidisciplinar para clarificar con precisión la ecología de la brucelosis, y particularmente, para identificar sin ambigüedades si la infección por Brucella es sostenible en el tiempo en una determinada población silvestre y poder determinar los factores críticos para el mantenimiento de la misma en dicha población (Godfroid et al., 2013; White et al., 2013). La instauración de la enfermedad en una población susceptible necesita de varios factores que se deben de tener en cuenta, como la susceptibilidad o resistencia de los hospedadores a la infección, la dosis infectiva necesaria, el número de individuos, su densidad y el contacto entre ellos, la existencia o no de poblaciones domésticas infectadas, la estacionalidad reproductiva, y la gestión y el manejo que se haga por parte del hombre del medio natural que ocupan los animales (Godfroid, 2002; Godfroid et al., 2010). Todos estos factores influyen de manera relevante en el manteniendo de la infección por Brucella en una población silvestre, y explican que la infección en algunas especies silvestres sea de naturaleza auto limitante y no se mantenga en el tiempo (Rhyan & Spraker, 2010). De hecho, no se conoce de ningún caso en el que las infecciones por B. abortus y B. melitensis se hayan mantenido de manera autónoma en poblaciones silvestres a lo largo del tiempo en ausencia de efectos antropogénicos importantes (Davis, 1990; Rhyan, 2000). Estos efectos de la intervención humana han contribuido de manera determinante al mantenimiento de la infección por B. abortus en bisontes Bison bison y wapitíes Cervus canadensis en el parque nacional de Yellowstone –PNY- (Etter & Drew, 2006; Godfroid, 2002; Rhyan, 2000). El principal riesgo de infección en las poblaciones silvestres es el contacto con ganado doméstico infectado (Gortázar et al., 2007a). Este hecho fue claramente constatado en Aragón, al aumentar la seroprevalencia en las poblaciones de sarrio Rupicapra pirenaica pirenaica en las reservas de caza de Los Valles y Viñamala durante los años 2002 y 2004 (Arnal, 2011), periodo en el que tuvieron lugar importantes brotes de infección en ovejas y vacas que compartían territorio con los sarrios (Gobierno de Aragón, Informes inéditos). Sin embargo, en ausencia de estos efectos, parece improbable que ninguna de estas infecciones haya sido capaz de mantenerse a lo largo del tiempo en las poblaciones silvestres. Por el contrario, parece claro que determinadas especies (B. microti y B. suis biovar 2 y biovar 4 en particular) poseen un ciclo epidemiológico silvestre perfectamente establecido (Forbes, 1991; Grégoire et al., 2012; Hubálek et al., 2007; Muñoz et al., 2010; Revisión bibliográfica 12 Pikula et al., 2005; Scholz et al., 2008; Scholz et al., 2009). El auge de las especies cinegéticas en el sector agrícola como actividad económica, que favorecen el contacto entre la fauna silvestre y los animales domésticos, la mayor conciencia y conocimiento de la fauna silvestre, la alimentación y manejo artificial de las poblaciones silvestres y la expansión urbanística hacia los principales hábitats de la vida silvestre, son factores de relevancia a considerar de cara al mantenimiento de la brucelosis en el ganado doméstico y la fauna silvestre (Rhyan, 2000). Algunos autores han mencionado la posible implicación de los artrópodos hematófagos como vectores de brucelosis, ya que Brucella podría conservar su virulencia dentro del artrópodo (Zheludkov & Tsirelson, 2010; Zotova & Balditsina, 1943). Aunque Brucella ha sido aislada en varias especies de garrapatas, el papel que pueden jugar estos artrópodos en la epidemiología de la infección es desconocido y púramente especulativo (Rementsova, 1987). La brucelosis en fauna silvestre no es un fenómeno nuevo y ya en el año 1917 se detectaron reacciones de aglutinación positivas en el bisonte Bison bison en el PNY (Mohler, 1917). En el año 1930 en el refugio nacional de caza de Jackson Hole, fueron también detectadas reacciones de aglutinación en wapití Cervus canadensis (Murie, 1951). También se detectaron reacciones positivas en cerdos silvestres en 1962 en Hawaii, y en 1963 se obtuvo el primer aislamiento en el caribú, que fue identificado como B. suis biovar 4, siendo el agente causal de la denominada “brucelosis rangiferina” (Meyer, 1966). En 1994 se describe por primera vez un aborto producido por Brucella en un mamífero marino (Foster et al., 2002; Ross et al., 1994). En Chequia en el año 2007, se aisló B. microti del topillo campesino Microtus arvalis (Hubálek et al., 2007; Scholz et al., 2008), así como del zorro Vulpes vulpes y del suelo (Scholz et al., 2009). Más recientemente, como ya se ha indicado, nuevas cepas de Brucella, todavía por ubicar taxonómicamente, han sido aisladas a partir de primates y anfibios (Eisenberg et al., 2012; Fischer et al., 2012; Schlabritz-Loutsevitch et al., 2009). En la literatura científica son números los estudios de brucelosis realizados en una gran variedad de especies silvestres. Aquí revisaremos brevemente las especies y los casos más relevantes: Revisión bibliográfica 13 2.2.1.- ORDEN: ARTIODACTYLA 2.2.1.1.- Familia: Bovidae -Bisonte americano Bison bison. El parque nacional de Yellowstone (PNY) es sin duda uno de los parques nacionales más importante de EE.UU., donde podemos encontrar manadas de bisontes y wapitíes en libertad en los que la infección por B. abortus ha constituido un problema controvertido (Kreeger & Olsen, 2002; Olsen, 2010; Rhyan, 2000; Thorne et al., 1991). Las primeras evidencias serológicas en bisontes fueron realizas en 1917, concluyendo en la hipótesis que la brucelosis fue probablemente introducida en el parque a través de las vacas que usaban los empleados del parque para consumo de leche (Mohler, 1917). En 1930, B. abortus fue aislada del epidídimo de un bisonte (Creech, 1930). Actualmente la brucelosis en el PNY muestra una seroprevalencia entre el 40% y 60% (Rhyan et al., 2009; Roffe et al., 1999), siendo B. abortus biovar 1 la responsable del problema (Rhyan et al., 1994; Williams et al., 1993). Los estudios epidemiológicos realizados concluyen que el problema en los bisontes del PNY es muy similar al de cualquier rebaño de vacuno infectado crónicamente, habiéndose descrito abortos, problemas reproductivos, retenciones de placenta y lesiones inflamatorias en los órganos reproductores de bisontes infectados (Rhyan et al., 1994; Rhyan et al., 2001; Rhyan et al., 2009; Roffe et al., 1999; Williams et al., 1993). Actualmente la brucelosis no se considera una amenaza para la supervivencia del bisonte en el PNY, pero existe el riesgo de transmisión de la infección al ganado vacuno en las zonas adyacentes al PNY, que están libres de la infección (Schumaker, 2013). En la actualidad, la separación temporal y espacial se utiliza para prevenir la transmisión de la brucelosis del bisonte al ganado vacuno (Olsen, 2010; Treanor, 2013). -Búfalo cafre Syncerus caffer. El búfalo cafre (también llamado búfalo africano) habita los bosques y sabanas del África subsahariana, especialmente al este del continente. Son diversos los estudios serológicos llevados a cabo en esta especie y en diferentes países, habiéndose identificado una seroprevalencia del 12,5% al 15,1% en el parque Kruger en Sudáfrica mediante técnicas serológicas convencionales como el RBT y CFT (Chaparro et al., 1990), habiéndose confirmado la infección por B. abortus biovar 1 en un búfalo (Gradwell et al., 1977). La seroprevalencia identificada en otros países mediante técnicas similares como RBT, SAT y CFT es muy variable: 30% en Tanzania, Revisión bibliográfica 14 (Waghela & Karstad, 1986), 6,5% en Zimbabue (Madsen & Anderson, 1995), y 6% en la República de Botswana, donde solamente se utilizó RBT y FPA (Alexander et al., 2012). -Eland común Taurotragus oryx. Este antílope se encontraba distribuido a lo largo de las sabanas arboladas de África oriental y meridional, pero la expansión humana y las guerras han disminuido drásticamente su número. Sin embargo, el eland común ha sido reintroducido en cotos de caza y fincas ganaderas en el sur de África, Sudáfrica en particular, fuera de su área de distribución natural. Un estudio serológico llevado a cabo mediante técnicas como RBT, SAT y CFT en Zimbawe resultó en una seroprevalencia del 1,4% (Madsen & Anderson; 1995), habiéndose también identificado casos de seropositividad en elands criados en cautividad con cabras (Bell et al., 1977). La seroprevalencia identificada en una finca del sureste de Kenia mediante técnicas similares mostró valores más elevados (Paling et al., 1988). -Gacelas. Se denomina gacela a cualquiera de las muchas especies de antílopes que componen los generos Gazella spp., Eudorcas spp. y Nanger spp. Son animales veloces, se encuentran principalmente en los desiertos, praderas y sabanas de África, pero también se encuentran en el suroeste y centro de Asia y el subcontinente indio, viviendo en manadas. Hay muy poca información acerca de la brucelosis en estas especies, pero B. abortus fue aislada de una gacella común Gazella dorcas en Egipto (Kamel, 1949). B. melitensis también ha sido aislada en la gacela de Neumann Gazella erlangeri, en animales cautivos en Arabia Saudita que mostraron signos de brucelosis (Omer et al., 2011), también en animales cautivos en Arabia Saudita se encontaron gacelas Idmi Gazella gazella seropositivas, pero en este caso no se aisló Brucella spp. (Ostrowski et al., 2002). -Arruí Ammotragus lervia. El arruí se distribuye en montañas y terrenos desérticos del norte de África, si bien se han introducido en varios países fuera de África, como en el sureste de España, donde fue introducido en 1970. Que nosotros sepamos no existen estudios en esta especie en África, pero estudios en EE.UU. en arruís introducidos no han detectado casos de positividad (Hampy et al., 1979), como tampoco ha sido el caso de nuestro país (Candela et al., 2009). Estos dos estudios utilizaron el RBT como técnica Revisión bibliográfica 21 -Venado de las Pampas Ozotoceros bezoarticus. Es una especie endémica de las llanuras de la región templada de Sudamérica. Antiguamente extendido desde el trópico hasta la Patagonia, a causa de la caza masiva en el siglo XIX y la ocupación de su hábitat por el ganado bovino, hoy habita sólo en áreas aisladas de Brasil, Uruguay y Argentina. En el único estudio realizado con 14 individuos en una reserva en Argentina, ninguno de ellos presentó anticuerpos frente a Brucella (Uhart et al., 2003). -Reno y caribú Rangifer tarandus spp. El hábitat originario de estas especies son las zonas boreales de tundra y taiga del hemisferio norte, aunque han logrado aclimatarse en las islas subantárticas. El reno y el caribú son los hospedadores primarios de B. suis biovar 4 (Forbes, 1991). Dicha infección se localiza principalmente en las articulaciones y el tracto reproductivo, pero otros tejidos también pueden estar infectados (Tessaro & Forbes, 1986). Los signos clínicos de brucelosis en este género son orquitis, abortos y bursitis (Forbes, 1991). La brucelosis producida por B. suis biovar 4 ha estado presente históricamente en los rebaños de caribú en Alaska (Neiland et al., 1968). Los nativos del Polo Ártico americano son un grupo de riesgo, ya que pueden adquirir esta infección a través del consumo de carne cruda de caribú (Ferguson, 1997). La prevalencia de la infección por B. suis biovar 4 varía de año en año, pero se mantiene de manera autónoma en estas especies en un ciclo epidemiológico muy mal conocido (Zarnke, 2000). Algunos animales silvestres también son susceptibles a B. suis biovar 4, como el buey almizclero Ovibos moschatus, perteneciente a la familia de los bóvidos (Forbes, 1991; Gates et al., 1984). -Ciervo moteado Axis axis. Es propia de Asia y no se han detectado casos de brucelosis (Riemann et al., 1979). Sin embargo, es una especie sensible a la infección experimental (Davis et al., 1984). -Ciervo rojo Cervus elaphus. Esta especie consta de numerosas subespecies ampliamente distribuidas por el hemisferio norte. Se han documentado unas 22 subespecies distintas con un área de distribución que se extiende desde el Magreb, la península ibérica y Gran Bretaña hasta gran parte de América del Norte, y que se Revisión bibliográfica 22 diferencian entre sí por el tamaño, longitud y color del pelo y forma de las cuernas. Las seis subespecies de wapitíes norteamericanos, antaño se clasificaban dentro de Cervus elaphus, pero actualmente se clasifican como Cervus canadensis (Ludt et al., 2004). En Europa, Cervus elaphus parece no tener importancia epidemiológica como reservorio de brucelosis y la seroprevalencia encontrada esta siempre por debajo del 0,5%(Muñoz et al., 2010; Serrano et al., 2011). En ocasiones existe alguna variación anual, pero esta es debida siempre a brotes asociados de brucelosis en ganado doméstico, habiéndose aislado B. abortus biovar 1 al menos en España (Muñoz et al., 2010; Serrano et al., 2011). También existen otros casos de brucelosis en ciervos domésticos criados en cautividad, y debidos a B. abortus biovar 1 (Her et al., 2010). B. ovis ha sido hallada en el esperma de ciervos criados en cautividad en Nueva Zelanda (Bailey, 1997), siendo considerada esta especie como susceptible a la infección por B. ovis, que puede llegar a provocarles lesiones testiculares (Ridler et al., 2006; Ridler et al., 2012). En América del Norte, a principios de 1900, el desarrollo humano había complicado las rutas tradicionales de migración del wapití Cervus canadensis, interfiriendo con la cría del ganado doméstico y causando conflictos con los ganaderos. En 1912, el gobierno de los EE.UU. estableció el refugio nacional en Jackson Hole en el estado de Wyoming, donde en 2006 se estimó que 22.000 wapitíes pasaban el invierno en 23 manadas (Maichak et al., 2009). La brucelosis se describió por primera vez en el wapití en 1930 tras el hallazgo de fetos abortados en el mencionado refugio nacional de Jackson Hole (Tunnicliff & Marsh, 1935), sin que se haya podido establecer si esta infección tuvo su origen en algún tipo de transmisión desde el ganado bovino doméstico, o bien se trata de una infección mantenida de manera autónoma en esta especie. En estas zonas existe el riesgo de trasmisión de la infección al ganado vacuno (Schumaker, 2013). Los datos obtenidos sugieren que la intervención humana es un factor esencial para el mantenimiento de la enfermedad, ya que la prevalencia de brucelosis en los wapitíes con alimentación artificial es significativamente mayor que en los que no reciben alimentación artificial en invierno (Kreeger & Olsen, 2002; Maichak et al., 2009), lo que parece ser el principal responsable del mantenimiento y transmisión de la brucelosis en el wapití en el área de Yellowstone (Kreeger & Olsen, 2002). Además, los datos sugieren que la seroprevalencia puede estar asociada con la densidad de población de cada manada (Maichak et al., 2009), con la duración de la alimentación artificial (Cross et al., 2007), y con la congregación en manadas entre febrero y junio, que es la época en la que Revisión bibliográfica 23 se producen la mayoría de los abortos inducidos por Brucella spp. (Thorne et al., 1991). B. abortus es la bacteria responsable de la brucelosis en esta especie (Etter & Drew, 2006). -Gamo Dama dama. El gamo es una especie nativa de la región Mediterránea, pero reintroducida en gran parte de Europa y América, además de Australia y Nueva Zelanda (Blanco et al., 1998). La seroprevalencia encontrada en el gamo en diferentes regiones del mundo ha sido siempre muy baja o nula (Cuteri et al., 1999; Davidson et al., 1985; Giovannini et al., 1988; McDiarmid & Matthews, 1974; Muñoz et al., 2010), y no existen casos de aislamiento de ninguna especie de Brucella. Estos resultados siguieren que los gamos no constituyen un reservorio de brucelosis para el ganado doméstico (Muñoz et al., 2010). -Ciervo acuático chino Hydropotes inermis. Es una especie propia de la parte estecentral de China y Corea. Son muy pocos los estudios de brucelosis en esta especie, aunque en Corea del Sur se ha descrito una elevada seroprevalencia en esta especie, y además, B. abortus biovar 1 se ha aislado como la bacteria responsable (Truong et al., 2011). Estudios con técnicas moleculares relacionan las cepas aisladas en esta especie con las que ocurren habitualmente en el ganado doméstico, por lo que es muy posible que se trate de una infección transmitida desde el ganado doméstico (Kim et al., 2013). 2.2.1.3.- Familia: Camelidae -Camello Camelus spp. Es un género de mamíferos denominados popularmente como camellos (dos jorobas) y dromedarios (una joroba), nativos de zonas secas y desérticas de Asia y del norte de África. La infección por Brucella puede afectar principalmente al camello Camelus bactrianus, especialmente cuando entran en contacto con bovinos y ovinos, aunque también se han registrado casos entre los dromedarios Camelus dromedarius (Abbas & Agab, 2002; Kudi et al., 1997). En muchos países en vías de desarrollo de las zonas áridas, tanto el camello como el dromedario son un importante animal de producción para las poblaciones nómadas y el consumo de sus productos como la leche y la carne va en aumento. En consecuencia, la brucelosis puede ser un Revisión bibliográfica 24 problema de importancia en salud pública (Gwida et al., 2012), y podría estar presente en todos los países con cría de camellos, con excepción de Australia (Sprague et al., 2012). El camello y el dromedario son sensibles a las infecciones por B. melitensis y B. abortus (Gwida et al., 2012). La brucelosis también se ha descrito en los camélidos de Sudamérica: llama Lama glama, guanaco Lama guanicoe, vicuña Vicugna vicugna y alpaca Vicugna pacos, como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis (Abbas & Agab, 2002; Gwida et al., 2012). 2.2.1.4.- Familia: Antilocapridae -Berrendo o antílope americano Antilocapra americana. El berrendo es propio del norte de América, encontrándose desde el sur de Canadá, a través del oeste de los Estados Unidos, hasta el norte de México. Pese a que han sido numerosos los estudios realizados, la brucelosis nunca ha sido puesta en evidencia en esta especie (Dunbar et al., 1999; Johnson et al., 1986b; Kingscote & Bohac, 1986; McCorquodale & DiGiacomo, 1985). 2.2.1.5.- Familia: Suidae El jabalí y el cerdo doméstico asilvestrado son muy susceptibles a la brucelosis (Algers et al., 2009; Olsen et al., 2012), estando prácticamente presentes de forma natural o introducida en todos los contenientes: Eurasia, Australia, Nueva Zelanda, América del Norte, Hawái, América del Sur y numerosas islas de todo el planeta, y poseen una de las áreas de distribución de mayor extensión entre los mamíferos (Oliver, 1993). En algunos lugares en los que no existían, se han introducido jabalíes, que han llegado a hibridarse con los cerdos domésticos asilvestrados, propiciando un crecimiento exponencial de las poblaciones de suidos silvestres. Esto es debido a su elevada plasticidad ecológica y un alto potencial reproductor, lo que sustenta su capacidad de adaptación a diferentes medios que van desde la alta montaña, a los humedales pasando por todo tipo de medios naturales y seminaturales (Herrero, 2002). La infección por B. suis ha sido demostrada en jabalí o en cerdo silvestre en la mayoría de los países, tanto de Europa como de América y Australia (Al Dahouk et al., 2005a; Bergagna et al., 2009; Closa- Revisión bibliográfica 25 Sebastià et al., 2010; Cvetnić et al., 2003; De Massis et al., 2012; Garin-Bastuji et al., 2000; Godfroid et al., 1994; Grégoire et al., 2012; Leuenberger et al., 2007; Mason & Fleming, 1999; Muñoz et al., 2010; Ruiz-Fons et al., 2006; Sandfoss et al., 2012; Zygmont et al., 1982). La brucelosis suina está causada esencialmente por Brucella suis, especie de la que se conocen 5 biovariedades. La biovariedad 4 infecta a renos, caribúes, alces, bisontes, zorros árticos y lobos, mientras que la biovariedad 5 ha sido descrita en roedores en la antigua URSS (Nielsen, 2012). El ganado porcino doméstico o silvestre y el jabalí se infectan principalmente por las biovariedades 1, 2 y 3 de B. suis pero también pueden infectarse por B. abortus o B. melitensis en las zonas donde la brucelosis es enzootica en rumiantes (Algers et al., 2009; Alton, 1990). En Asia y América la brucelosis suina está causada principalmente por las biovariedades 1 y 3, mientras que la biovariedad 2 difiere de ellas en su distribución geográfica (restringida al continente europeo), el rango de hospedadores y su patogenicidad (Godfroid, 2002). Las biovariedades 1 y 3 son muy patógenas para el hombre (Algers et al., 2009), mientras que la biovariedad 2 es muy poco patógena (Algers et al., 2009; Nielsen, 2012), habiéndose aislado esta en muy pocos pacientes (Garin-Bastuji et al., 2006; Lagier et al., 2005; Paton et al., 2001; Teyssou et al., 1989). Cada vez son más los informes que describen la brucelosis en cazadores de jabalí por el contacto con estos animales (Eales et al., 2010; Garin-Bastuji et al., 2006; Giurgiutiu et al., 2009; Irwin et al., 2009; Lagier et al., 2005;). B. suis ha sido implicada en casos en EE.UU. (Giurgiutiu et al., 2009) y Australia, donde la causa más común de brucelosis humana es la caza recreativa del jabalí (Eales et al., 2010). El jabalí infectado por B. suis biovar 2 es considerado como el principal reservorio de la brucelosis para el ganado porcino doméstico en Europa (Cvetnić et al., 2003; Godfroid et al., 2005; Muñoz et al., 2010). En los EE.UU., B. suis se ha erradicado de las poblaciones de cerdos domésticos (Stoffregen et al., 2006), pero las poblaciones de cerdos silvestres del país todavía albergan la infección, que esta producida por las biovariedades 1 y 3 (Edmonds et al., 2001; Godfroid et al., 2011). Las poblaciones de cerdos silvestres están aumentando su distribución, estando presentes en 38 de los 50 estados que componen EE.UU. (Fogarty, 2007). La expansión a nuevas áreas ha sido principalmente causada por un transporte no regulado de cerdos silvestres, con el fin de establecer nuevas poblaciones con fines cinegéticos (Olsen, 2010; Sandfoss et al., 2012). Revisión bibliográfica 26 Las biovariedades 1 y 3 de B. suis se han aislado también de cerdos y seres humanos en prácticamente todos los países de América latina (Baumgarten, 2002; Luna-Martínez & Mejía-Terán, 2002; Meirelles-Bartoli et al., 2012; Moreno, 2002; Poester et al., 2002; Samartino, 2002) y de Asia (Algers et al., 2009; Deqiu et al. 2002). En Japón, se han puesto en evidencia reacciones serológicas positivas en el jabalí japonés Sus scrofa leucomystax, aunque no se llegó a aislar B. suis (Watarai et al., 2006). La infección por ambas biovariedades de B. suis se considera endémica en cerdos silvestres en Australia (Mason & Fleming, 1999; Robson et al., 1993). La información sobre la situación de la infección por B. suis en África es muy escasa (McDermott & Arimi, 2002). Ha sido puesta en evidencia en Egipto, aunque a menudo no es reconocida ni declarada (Refai, 2002). En Europa, B. suis nunca ha sido aislada en Finlandia, Suecia, Noruega y el Reino Unido (Godfroid & Käsbohrer, 2002). Por el contrario, la infección ha sido puesta en evidencia en Alemania, Austria, Bélgica, Croacia, Dinamarca, España, Francia, Italia, República Checa, Rumania, Serbia y Montenegro y Portugal (Algers et al., 2009; Godfroid & Käsbohrer, 2002; Nielsen, 2012). Aunque la infección por B. suis biovar 3 se ha descrito también en Croacia, la biovariedad 2 es la más frecuente e importante en Europa (Cvetnić et al., 2005; Francart et al., 1983; Godfroid, 2002; Loulergue et al., 1979). En el caso concreto de B. suis biovar 2, el jabalí y la liebre europea son considerados los reservorios de la infección para el ganado doméstico (Algers et al., 2009; Cvetnić et al., 2003; Godfroid et al., 2005; Pikula et al., 2005; Szulowski et al., 1999). En el cerdo doméstico, la infección por B. suis a menudo no causa signos clínicos, haciendo de la brucelosis porcina una enfermedad muy insidiosa, resultando el diagnóstico clínico una tarea difícil. En los casos clínicos, la brucelosis porcina principalmente se caracteriza por abortos, sin embargo, la bacteria también puede afectar a otros órganos, y en particular al tejido óseo y sus articulaciones (Olsen et al., 2012). La enfermedad es considerada como un problema de colectividad, afectando a todos los cerdos igual, aunque la incidencia en adultos es más alta. La transmisión de la enfermedad en los cerdos ocurre tanto por la vía venérea como por la vía oral. B. suis puede ser secretada en gran cantidad en el semen y la orina, así como en descargas uterinas y la leche (Alton, 1990). El signo clínico más importante es la infertilidad de las cerdas, con irregularidad de los estros, abortos en cualquier fase de la gestación y el nacimiento de lechones débiles con un alto índice de mortalidad neonatal. En la brucelosis porcina el fracaso reproductivo está acompañado en ocasiones por orquitis en Revisión bibliográfica 27 los verracos y alteraciones ósteo-articulares (Olsen et al., 2012). Aunque las orquitis y las epididimitis sean las lesiones más comunes en los verracos, la infección en ocasiones, puede estar restringida solamente a las glándulas sexuales y no afectar a la fertilidad (Enright, 1990). Sin embargo, estos casos asintomáticos pueden causar la diseminación del patógeno en el semen, potenciando así la transmisión venérea de la infección (Alton, 1990). B. suis puede infectar también al ganado vacuno, aunque la infección es muy rara (Cook & Noble, 1984; Ewalt et al., 1997; Forbes & Tessaro, 2003; Fretin et al., 2013; GarinBastuji & Delcueillerie, 2001), y se caracteriza por la eliminación de B. suis en la leche, pudiendo representar un riesgo para la salud pública (Ewalt et al., 1997). La infección por B. suis biovar 2 es excepcional en ganado bovino (Fretin et al., 2013). Si bien no han sido descritos casos de infección debidos a B. suis biovar 2 en perros, estos pueden infectarse con las biovariedades 1 y 3 de B. suis, resultando en abortos y orquitis (Barr et al., 1986; Meirelles-Bartoli et al., 2012; Ramamoorthy et al., 2011). Los caballos se pueden infectar de forma natural con B. suis aunque es más frecuente la infección por B. abortus (Cook & Kingston, 1988; Cvetnić et al., 2005; Ocholi et al., 2004). La infección por B. suis es muy rara en los pequeños rumiantes (Garin-Bastuji & Delcueillerie, 2001; Paolicchi et al., 1993). La elevada tasa de infección en el jabalí y los cerdos silvestres tanto en Europa, EE.UU. y Australia, representa un riesgo muy importante para la transmisión de la infección a los cerdos domésticos, sobre todo en aquellas explotaciones al aire libre, en sistemas de producción extensivos (Engeman et al., 2011; Wu et al., 2012; Wyckoff et al., 2009), como los sistemas de dehesa típicos del suroeste de España (Muñoz et al., 2003; Muñoz et al., 2010). De hecho, varios brotes de brucelosis porcina se han producido recientemente en nuestro país (Muñoz et al., 2003), que podrían ser explicados por tres factores epidemiológicos relevantes. En primer lugar, existe un aumento considerable del número de jabalíes, pese a que cada año aumenta el número de piezas abatidas (MAAM, 2012). En segundo lugar, nuestro país posee un sitema de cría del cerdo ibérico en extensivo, que facilita los contagios a partir del jabalí (Muñoz et al., 2010). Finalmente, en muchas regiones de España, está aumentando la cría a pleno aire del porcino, debido a una mayor demanda por parte del mercado de carne de calidad o productos cárnicos Revisión bibliográfica 28 de tipo orgánico. Este sistema de cria permite los contactos con el jabalí, y por tanto, facilita el contagio. 2.2.1.6.- Familia: Tayassuidae -Pecarí Tayassu pecari. Es una especie de suido ampliamente dispersada desde la América tropical hasta la subtropical, desde el sudoeste de EE.UU. hasta el norte de Argentina en Sudamérica. Este género aunque menos estudiado que el género Sus, también puede ser infectado por B. suis. Un estudio realizado en Venezuela mostró una alta seroprevalencia, así como un elevado número de aislamientos de B. suis biovar 1 (Lord & Lord, 1991). La situación parece ser similar en Brasil (Mayor et al., 2006). Sin embargo la infección en pecaríes libres no ha sido puesta en evidencia en EE.UU. (Corn et al., 1987; Gruver & Guthrie, 1996). 2.2.2.- ORDEN: LAGOMORPHA El orden Lagomorpha está compuesto por dos familias, Ochotonidae (pikas) y Leporidae (conejos y liebres). Dentro de este orden, la liebre europea Lepus europaeus se considera un hospedador natural de brucelosis, a diferencia del conejo Oryctolagus cuniculus (Thorne, 2001). Sin embargo, aunque no se ha descrito ningún caso de infección natural, los conejos son sensibles a la infección experimental por B. suis biovar 1 (Fort et al., 2012; Stĕrba, 1984). La brucelosis ha sido demostrada en otras especies de lagomorfos como la liebre de montaña Lepus timidus, la liebre de California Lepus californicus y en el conejo del desierto Sylvilagus audubonii (Thorne, 2001). Una cepa de B. suis se aisló de una liebre de California Lepus californicus en el estado de Utah, EE.UU., además se encontraron varias liebres seropositivas frente a Brucella spp. (Thorpe et al., 1965). En Europa, la brucelosis de la liebre producida por B. suis se describió por vez primera en Alemania y posteriormente en Dinamarca, Francia, Polonia, Suiza y la antigua Checoslovaquia (Algers et al., 2009; Rementsova, 1987). En Dinamarca, se identificó el primer caso en 1951 y debido a las relaciones epidemiológicas con los brotes de brucelosis porcina se comenzó a estudiar la posible implicación de la liebre europea. En 1954 se encontraron liebres seropositivas, asilándose B. suis de las lesiones típicas, Revisión bibliográfica 29 considerando estas como una posible fuente de infección para el cerdo doméstico a través de la alimentación con despojos de liebres cazadas infectadas o mediante la contaminación de los pastos (Bendtsen et al., 1956). Actualmente se dispone de escasa información acerca de la prevalencia de brucelosis en la liebre europea, aunque estudios anteriores en países del centro de Europa la han estimado entre el 3% y 10% (Rementsova, 1987). La infección en la liebre se localiza principalmente en los órganos internos como el bazo, el hígado, los linfonodos regionales y órganos reproductores, generando nódulos de diferentes tamaños (Gyuranecz et al., 2011; Vítovec et al., 1976). La infección en esta especie animal ha sido descrita en diferentes países europeos, habiéndose identificado B. suis biovar 2 como el responsable del problema en Europa (Gyuranecz et al., 2011; Lavín et al., 2006; Quaranta et al, 1995; Treml et al, 2007; Szulowski et al., 1999). De hecho, la liebre europea es considerada también, además del jabalí, como el reservorio principal de la infección por B. suis biovar 2 (Godfroid et al., 1994; Pikula et al., 2005). La brucelosis en la liebre europea también ha sido descrita en Argentina, en este caso producida por B. suis biovar 1 (Fort et al., 2006; Szyfres et al., 1968). Mientras que la brucelosis en la liebre europea ha sido puesta en evidencia en diferentes países, nunca se ha diagnosticado ni en la liebre ibérica Lepus granatensis ni en la liebre de piornal Lepus castroviejoi, ambas presentes en la península ibérica (Alzaga, 2010; Revilla et al., 2006; Rodríguez Alonso et al., 1997). 2.2.3.- ORDEN: CARNIVORA El orden Carnivora presenta una elevada diversidad de tamaños entre sus integrantes, en su mayoría terrestres. Los carnívoros en su mayor parte son depredadores y esta acción ofrece muchas oportunidades para el contagio de la brucelosis (Neiland, 1970). La presencia de anticuerpos frente a Brucella en los carnívoros silvestres, como cánidos y úrsidos ha sido bien documentada en prácticamente todos los continentes (Davis, 1990). Se han descrito evidencias serológicas de infección en el lobo Canis lupus, oso grizzly Ursus arctos horribilis, zorro ártico Alopex lagopus y zorro rojo Vulpes vulpes en las regiones Árticas, seguramente por la ingestión de renos infectados por B. suis biovar 4 (Neiland, 1970; Neiland, 1975; Rementsova, 1987). El lobo y el oso negro Ursus americanus son sensibles a la infección experimental por B. suis biovar 4 (Neiland & Miller, 1981). Tambien el coyote Canis latrans puede infectarse por B. abortus Revisión bibliográfica 30 biovar 1 y esta infección puede ser trasmitida congénitamente (Davis et al., 1979). Curiosamente, pese a la relativamente elevada prevalencia de brucelosis en bisontes y wapitíes en el PNY, no se han detectado evidencias serológicas de infección en coyotes en el PNY (Gese et al., 1997). Se han descrito evidencias serológicas de infección en zorros en Irlanda del Norte y Gales, donde la brucelosis era endémica en el ganado vacuno, habiéndose llegado a aislar B. abortus biovar 1 en zorros (Davies et al., 1973; McCaughey, 1968). En Argentina, dos especies de zorros silvestres, zorro de la pampa Lycalopex gymnocercus y zorro gris Lycalopex griseus, pueden estar infectadas naturalmente por B. abortus biovar 1 (Szyfres & González Tomé, 1968). B. abortus biovar 1 ha sido aislada en mapache Procyon lotor posiblemente como consecuencia de ingerir fetos abortados o placentas de bovinos domésticos infectados (Swann et al., 1980). En Tanzania, el chacal de lomo negro Canis mesomelas y la hiena manchada Crocuta crocuta pueden presentar anticuerpos frente a Brucella spp. (Sachs & Staak, 1968). Se han descrito brotes de brucelosis en explotaciones de visón americano Neovison vison alimentados con material contaminado, aislándose B. abortus en estos animales. La infección se caracterizó por el elevado número de abortos (Prichard et al., 1971; Rementsova, 1987). El oso es el mayor depredador en los ecosistemas que ocupa y también está expuesto a la infección por Brucella spp. No se han descrito infecciones naturales por Brucella spp. en las tres especies de osos más estudiadas, pero varios estudios han puesto en evidencia la presencia de anticuerpos en estos animales (Drew et al., 1992; Rah et al., 2005; Tryland et al., 2001; Zarnke et al., 2006). Independientemente de que muchos de los estudios anteriores pueden carecer de valor por haberse basado en pruebas diagnósticas no validadas para la correspondiente especie en estudio, la hipótesis más aceptada es que los carnívoros silvestres se infectan a través del consumo de los fetos abortados, placentas y otros tejidos de animales domésticos o silvestres infectados. Por otro lado, se acepta también que los carnívoros silvestres no juegan un papel importante en la epidemiología de la brucelosis, y podrían considerarse centinelas para detectar la presencia de la misma en las especies domésticas Revisión bibliográfica 37 algunas técnicas moleculares permiten establecer relaciones filogenéticas y epidemiológicas entre cepas. Para ello, se han desarrollado una serie de técnicas moleculares empleando diversas secuencias genéticas, como el elemento IS711, capaces de identificar la mayoría de especies de Brucella. La técnica más utilizada inicialmente era la denominada AMOS-PCR, debido a las especies de Brucella que permitía identificar -B. abortus biovar 1, 2 y 4, B. melitensis, B. ovis y B. suis biovar 1- (Bricker & Halling, 1994). Esta técnica fue modificada posteriormente para poder identificar también las cepas vacunales S19 y RB51 (Bricker & Halling, 1995). Algunas modificaciones posteriores de esta técnica mejoraron su rendimiento (Bricker, 2002; Ewalt & Bricker, 2003; OcampoSosa et al., 2005), pero no es capaz de identificar ni todas las especies del género, ni todas las biovariedades de algunas especies. La disponibilidad de información acerca del genoma de Brucella permitió el desarrollo de una nueva generación de técnicas de PCR multiplex con mayor precisión y rendimiento. De entre ellas, la más utilizada es la denominada -Bruce ladder-, una técnica de tipo PCR multiplex capaz de diferenciar las seis especies clásicas, así como también las especies de Brucella aisladas en mamíferos marinos, y las cepas vacunales B. abortus RB51 y S19 y B. melitensis Rev. 1 (García-Yoldi et al., 2006). Durante su validación se demostró que la técnica era muy eficaz, con la notable excepción de B. canis, ya que prácticamente la mitad de las cepas examinadas de esta especie fueron erróneamente identificadas como B. suis (López-Goñi et al., 2008). Una modificación ulterior de esta PCR multiplex denominada -Suis ladder-, elimina los problemas mencionados en la identificación de B. canis y, además, permite la diferenciación de las 5 biovariedades de B. suis (López-Goñi et al., 2011). Pese a ello, esta última modificación de la técnica no permite la diferenciación de las biovariedades de B. abortus y B. melitensis. Una técnica usada también para la caracterización de cepas de Brucella esta basada en el estudio de los fragmentos de restricción (RFLP) tras amplificación mediante PCR de determinados genes de Brucella (Al Dahouk et al., 2005b; Bricker, 2002; Cloeckaert et al., 1995; Ficht et al., 1989; Ficht et al., 1990; Ficht et al., 1996; García-Yoldi et al., 2005; Vizcaíno et al., 1997). El estudio mediante PCR-RFLP de los genes Omp31, Omp2a y Omp2b (Cloeckaert et al., 1995; Vizcaíno et al., 1997) ha resultado particularmente útil para identificar los principales haplotipos de B. suis biovar 2 presentes en Europa (Ferrão-Beck et al., 2006; Muñoz et al., 2010). Revisión bibliográfica 38 Las pruebas diagnósticas indirectas se basan en la detección de anticuerpos en pruebas serológicas o bien en la detección de la respuesta inmune mediada por células. Las pruebas indirectas son rápidas y relativamente sencillas de realizar, pudiendo analizarse un elevado número de muestras, por lo que son las más utilizadas para el estudio y seguimiento de grandes poblaciones (Godfroid et al., 2013). Es importante destacar que existen diversas bacterias Gram-negativas que comparten epitopos comunes con Brucella situados en la cadena O de sus respectivos LPSs (Yersinia enterocolitica serotipo O:9, Salmonella del grupo N [O:30], Vibrio cholerae, Escherichia coli O:157 y otras), que causan reacciones serológicas positivas falsas (Corbel, 1985; Kittelberger et al., 1995; MacMillan, 1990; Moriyón & López-Goñi, 2002) y que, en consecuencia, provocan importantísimos problemas de especificidad en las pruebas serológicas (Jungersen et al., 2006; Mittal et al., 1985; Nielsen et al., 2004). En estos casos de reacciones cruzadas tan solo la aplicación de pruebas diagnósticas de inmunidad celular permiten la diferenciación entre las reacciones provocadas por la brucelosis y las debidas a estas bacterias (Algers et al., 2009; Nielsen, 2012). La prueba más usada para esta finalidad es la conocida como prueba de la brucellina (brucellin skin test), y que está basada en la inoculación in vivo de un extracto proteico citosólico de Brucella para poner en evidencia una reacción de hipersensibilidad retardada (Pouillot et al., 1997; Saergerman et al., 1999). Existen también otros métodos de detección de la respuesta inmune mediada por células, como por ejemplo la detección de IFN-γ (Riber & Jungersen, 2007), pero ninguna de estas técnicas ha sido aplicada al diagnóstico de rutina. La forma en que se presentan los antígenos bacterianos condiciona su reconocimiento o accesibilidad a los sistemas receptores y efectores del hospedador. Por esta razón, para entender las pruebas diagnósticas hay que considerar el tipo de antígeno utilizado y su localización celular. En consecuencia, las pruebas serológicas pueden ser divididas en dos grandes grupos: las que emplean bacterias íntegras como antígenos y aquellas otras que emplean extractos solubles o antígenos purificados (Nielsen, 2002). El primer grupo de pruebas incluyen esencialmente las aglutinaciones en placa o en tubo (SAT), la aglutinación a pH ácido -rosa de Bengala- (RBT), la prueba del anillo en leche (Ring test), y la prueba de fijación del complemento (CFT). Como antígeno en estas pruebas se usan suspensiones de brucelas en fase S, lo que significa que desde el punto de vista práctico, los únicos anticuerpos detectados son aquellos generados frente a las Revisión bibliográfica 39 cadenas polisacarídicas (O/PS) del LPS y del NH, sin que las proteínas de membrana, y menos aún las citosólicas, intervengan en las mismas. Igualmente, se entiende que estas pruebas de aglutinación que usan células S íntegras como antígeno no sean útiles para el diagnóstico de las infecciones producidas por especies R (Blasco, 1990; Carmichael, 1990). El objetivo de la prueba de la seroaglutinación lenta en tubo (SAT) es detectar principalmente anticuerpos de los isotipos IgM e IgG aglutinantes dirigidos frente Brucella spp. A la concentración óptima de antígeno y anticuerpos se forman complejos antígeno-anticuerpo que aglutinan en la parte inferior del tubo de ensayo. Esta reacción es lenta ya que requiere de una incubación durante una noche a 37°C (MacMillan, 1990). Debido a la presencia en el suero normal de anticuerpos del isotipo IgM que producen aglutinaciones inespecíficas, la prueba de SAT produce muchos resultados positivos falsos (Nielsen, 2002). La prueba de rosa de Bengala (RBT) utiliza antígeno coloreado con rosa de Bengala y tamponado a pH bajo, normalmente 3,65 ± 0,05 (Angus & Barton, 1984; Davies, 1971; Morgan et al., 1969). Este pH bajo impide que algunas IgM aglutinen inespecíficamente y favorece la aglutinación de IgG1, reduciendo de este modo las reacciones no específicas (Corbel et al., 1972). Esta técnica se ha aplicado en muchos países como la prueba básica de cribado (screening) en las campañas de erradicación debido a que es muy simple y sensible (Greiner et al., 2009; McGiven, 2013). Además la técnica RBT está aceptada como una técnica universal para el diagnóstico de brucelosis en prácticamente todas especies animales (Garin-Bastuji & Blasco, 1997). En consecuencia, como prueba serológica, será positiva con los anticuerpos generados tras la vacunación asi como por infecciones de bacterias Gram-negativas que comparten epítopos comunes con Brucella, causando reacciones serológicas positivas falsas, además, se requiere de muestras de suero libres de hemolisis. La prueba de fijación del complemento (CFT) permite la detección de anticuerpos (esencialmente del isotipo IgG), que son capaces de activar el complemento. Esta prueba posee una buena especificidad, por lo que es aceptada como la prueba de confirmación en las campañas de erradicación (Greiner et al., 2009; Nielsen, 2012), pero tiene muchas limitaciones. En primer lugar, es menos sensible que la prueba de RBT ya que en algunas especies animales como la bovina, las IgM no son capaces de fijar el complemento. Además, es una técnica cara, de larga duración y muy compleja que requiere sueros de elevada calidad y libres de hemolisis (Nielsen, 2012). Finalmente, es una técnica afectada por los fenómenos de zona (prozona). Revisión bibliográfica 40 Las pruebas que usan extractos solubles o antígenos purificados en lugar de células íntegras son también usadas en el diagnóstico. Además de otras importantes ventajas, estos antígenos pueden ser utilizados en pruebas en las que no es posible usar antígenos celulares (como la inmunodifusión en gel de agar). De entre las pruebas serológicas que usan este tipo de antígenos solubles destacan los enzimo-inmunoensayos indirectos (iELISA) o de competición/bloqueo –cELISA- (Godfroid et al., 2010; Nielsen, 2002). Es muy importante entender las equivalencias que existen entre las distintas pruebas serológicas mencionadas. Debido a su naturaleza anfipática, el LPS-S forma agregados estables en soluciones acuosas en los que, como en la membrana externa de las brucelas en fase S, el O/PS está dirigido hacia el exterior. Por lo tanto, el empleo de tales agregados solubles en pruebas como la inmunodifusión en gel hace que, independientemente del isotipo de anticuerpo que interviene (IgG, IgA o IgM), los epítopos detectados mayoritariamente (O/PS) son exactamente los mismos que los detectados en las pruebas que utilizan suspensiones de bacterias íntegras en fase S. Por el contrario, los anticuerpos frente a las secciones internas del LPS (que no son detectados en las pruebas que utilizan células íntegras) pueden ser detectados en ciertas pruebas como los ELISAs. Por ejemplo, los sueros de animales infectados por especies rugosas como B. ovis no dan resultado positivo en las pruebas que emplean suspensiones celulares en fase S como RBT y CFT, pero si lo hacen en pruebas que usan extractos solubles como la difusión en gel o los ELISAs (Blasco, 1990; Blasco, 2002; Nielsen, 2002). Finalmente, además de la importancia del tipo de antígeno usado, la sensibilidad de las pruebas diagnósticas dependerá en gran medida del isotipo de los anticuerpos involucrados. Por ejemplo, pese a usar el mismo antígeno (células íntegras) la sensibilidad de la prueba de RBT (que detecta todos los isotipos de inmunoglobulinas) es superior a la CFT que solo detecta IgG, al menos en bovino (Blasco, 2002). Mientras que esto no es relevante en el caso del cELISA (todos los isotipos de anticuerpos son detectados), el tipo de conjugado utilizado en los iELISA tendrá una repercusión muy importante en la sensibilidad final obtenida (Nielsen, 2002; Nielsen et al., 2004). Las pruebas diagnósticas tienen un papel crucial en la vigilancia sanitaria de las especies silvestres. De las posibles pruebas diagnósticas aplicables al diagnóstico de la brucelosis en fauna silvestre, las pruebas serológicas son las más frecuentemente usadas, por su relativa sencillez y bajo coste. El objetivo habitual de las pruebas serológicas es discriminar entre los animales expuestos y no expuestos (Godfroid et al., 2010). Para ello, Revisión bibliográfica 41 es preciso validar las pruebas serológicas utilizadas usando sueros gold standard de animales cuyo verdadero estado infeccioso ha sido comprobado mediante la prueba inequívoca de diagnóstico que es, habitualmente, el aislamiento bacteriológico (Godfroid, 2002; Godfroid et al., 2010; Godfroid et al., 2013; Muñoz et al., 2010). La presencia de anticuerpos frente a Brucella spp. sugiere una exposición a la bacteria, pero no significa necesariamente que los animales tengan una infección en el momento del muestreo. La presencia de anticuerpos puede ser el resultado de infecciones pasadas o recientes, pero también de infecciones por patógenos que causan reacciones cruzadas (Godfroid et al., 2010). Pese a ello, la mayoría de pruebas serológicas utilizadas en especies de vida silvestre para el diagnóstico de la brucelosis se han trasladado directamente de aquellas utilizadas en el ganado doméstico sin ningún tipo de validación previa. Además, raramente se tiene en consideración que, incluso si una prueba serológica ha sido correctamente validada en especies domésticas, la prueba no tiene por qué interpretarse de idéntica manera en las especies silvestres, ya que la respuesta serológica del hospedador silvestre concernido puede ser muy diferente a la del hospedador doméstico y, además, hay que tener en consideración también la posible exposición de estas especies silvestres a otros patógenos susceptibles de dar reacciones cruzadas (Gardner et al., 1996; Gofroid et al., 2010; Gofroid et al., 2013). La inmensa mayoría de estudios de brucelosis en fauna silvestre se han limitado simplemente a la determinación de la seroprevalencia mediante diversas pruebas serológicas, y han sido escasísimos los estudios en los que la infección se ha confirmado mediante estudios bacteriológicos adecuados (Cvetnić et al., 2003; Grégoire et al., 2012; Muñoz et al., 2010; Wu et al., 2011). Además, estas pruebas de diagnóstico indirecto presentan inconvenientes muy importantes, que cuestionan seriamente muchos de los resultados obtenidos en estos estudios de determinación de seroprevalencia. Las técnicas de aglutinación (RBT en particular) son consideradas como pruebas de elección para la determinación de la seroprevalencia de brucelosis en la práctica totalidad de especies de mamíferos (Garin-bastuji & Blasco, 1997), y han sido usadas en numerosos estudios en fauna silvestre (Ebani et al., 2003; Garin-Bastuji et al., 2000; Gresham et al., 2002; RuizFons et al., 2006; Vicente et al., 2002; Vengust et al., 2006). Sin embargo, para que la prueba de RBT pueda aplicarse, es imprescindible usar muestras de suero de buena calidad y, especialmente, desprovistas de hemolisis, algo muy inusual en este tipo de estudios, en los que la hemolisis y contaminación de las muestras son habituales por la dificultades inherentes a su obtención, manipulación y transporte. Otra posibilidad es Revisión bibliográfica 42 usar la prueba de CFT para determinar la seroprevalencia en especies silvestres (Bergagna et al., 2009; Drew et al., 1992; Hubálek et al., 2002; Melzer et al., 2007; Wood et al., 1976). Sin embargo, no existe información sobre la capacidad de las inmunoglobulinas de las diferentes especies silvestres para fijar complemento de cobayo, ni se han realizado experimentos adecuados para determinar el punto de corte (título del suero a partir del cual considerar una reacción como positiva) adecuado para cada especie silvestre objeto de estudio. Además, para la realización de la CFT es imprescindible también que las muestras de suero sean de calidad y libres de hemolisis. Todos estos factores explican que los enzimo-inmunoensayos (ELISAs) hayan sido y continúen siendo técnicas cada vez más usadas en este tipo de estudios. Su principal ventaja es que permiten analizar sueros hemolizados y de baja calidad (Neumann & Bonistalli, 2009), y que existen muchos kits comerciales en el mercado, si bien ninguno desarrollado específicamente para especies silvestres, lo que representa su principal inconveniente. En muchos estudios se han usado ELISAs disponibles comercialmente para especies domésticas, directamente y sin realizar ninguna validación previa de su eficacia diagnóstica para las especies silvestres (Al Dahouk et al., 2005a; Closa-Sebastià et al., 2010; Hinić et al., 2009; Leuenberger et al., 2007; Melzer et al., 2007; Montagnaro et al., 2010; Vicente et al., 2002; Wu et al., 2011), por lo que estos estudios son muy discutibles y, por tanto, de escasa significación científica. Además de la potencial falta de sensibilidad de las técnicas utilizadas por una validación inadecuada, otro problema muy relevante es su potencial falta de especificidad. Como se ha reiterado, no hay que olvidar que existen reacciones cruzadas entre las especies lisas de Brucella y otras bacterias Gram-negativas, entre las que destaca principalmente Yersinia enterocolotica O:9 (Corbel, 1985; Kittelberger et al., 1995; MacMillan, 1990; Moriyón & López-Goñi, 2002), cuya prevalencia real en las especies silvestres es prácticamente desconocida, y que podrían dar lugar a importantes errores diagnósticos (Al Dahouk et al., 2005a; Jungersen et al, 2006). De hecho, tanto el cerdo como el jabalí pueden infectarse por Y. enterocolitica O:9 (Fredriksson-Ahomaa et al., 2009; McNally et al., 2004). En definitiva, la validación adecuada de las técnicas utilizadas para la determinación de la seroprevalencia de brucelosis en la fauna silvestre debería ser absolutamente imprescindible para que los resultados obtenidos tengan suficiente significación (Godfroid et al., 2010; Hueffer et al., 2013). La ausencia de sueros gold standard de las Revisión bibliográfica 43 diferentes especies silvestres es un problema clave que impide la adecuada validación de estas técnicas (particularmente las cuantitativas). Sin embargo, existen potenciales estrategias para resolver este problema, como podría ser el uso de sueros gold standard obtenidos de las especies domésticas más relacionadas filogenéticamente con la especie silvestre objeto de estudio (Muñoz et al., 2010; Muñoz et al., 2012). Otro problema importante de las pruebas ELISA, es que precisan de reactivos específicos (conjugados anti-especie) que normalmente no están disponibles comercialmente. Esta limitación también puede paliarse, en cierta medida, mediante el uso de conjugados a base de proteína A o proteína G (o ambas simultáneamente), que por su capacidad de unirse a inmunoglobulinas de muchas especies animales, pueden usarse como alternativa a los conjugados específicos (Muñoz et al., 2010; Nielsen et al., 2004; Tryland et al., 1999; Tryland et al., 2001). Además, también pueden utilizarse otras técnicas como los ELISA de bloqueo o competición (cELISA) o la prueba de polarización de la fluorescencia (FPA), que no necesitan conjugados específicos de especie, y podrían ser útiles en la detección de anticuerpos frente a Brucella spp. en diversas especies silvestres (Gall et al., 2000; Gall et al., 2001; Nielsen & Gall, 2001; Schumaker et al., 2010; Van Houten et al., 2003). El problema de esta última técnica es la inexistencia de valores de referencia (puntos de corte) para las especies silvestres, la ausencia de validación en las mismas, la necesidad de un equipamiento caro y sofisticado, su elevado coste, y, además, la dependencia de un único test comercial en manos de una única compañía. Material y métodos 49 muestra estaba constituida por el número correlativo al orden de entrada, seguido del año. Para un mejor conocimiento de la distribución de la brucelosis en jabalíes en Aragón, las muestras fueron clasificadas en función de la comarca de procedencia. Se consideró oportuno priorizar el muestreo en zonas que nunca antes habían sido muestreadas, así como intentar obtener el mayor número de muestras posibles por cada comarca. Además, en cada comarca se intentó obtener las muestras de diferentes cotos de caza distantes entre sí, para obtener una muestra representativa. Sin embargo, esto no fue posible en ocasiones por diversas razones, como el escaso número de piezas abatidas, la mala fortuna al asistir a batidas de jabalí sin que se lograse ninguna pieza, etc. Figura 2: Imágenes de la toma de muestras de jabalí en campo. El tamaño mínimo de muestra por comarca se determinó según la fórmula clásicamente propuesta para este tipo de estudios (Cannon & Roe, 1982), y utilizando un nivel de confianza del 99%. Ante la ausencia de datos sobre la población de jabalí de cada comarca, se utilizó como referencia el número de jabalíes abatidos por comarca, usando los datos oficiales del INAGA (Instituto Aragonés de Gestión Ambiental). Teniendo en consideración este dato de animales abatidos y utilizando datos de Material y métodos 50 prevalencia de brucelosis en el jabalí en la Comunidad Autónoma de Aragón publicados previamente (Martínez et al., 2010; Muñoz et al., 2010), se calculó el número de animales necesarios para detectar la infección con suficiente precisión estadística. De esta manera, se determinó que sería necesario tomar un mínimo de 20 muestras de jabalí por cada comarca. Exceptuando la Ribera Alta del Ebro, se obtuvieron muestras de jabalíes de todas las comarcas de Aragón, si bien en 9 de ellas (tabla 1) no se pudo llegar a obtener el número mínimo de muestras mencionado. Para determinar la situación de la brucelosis en el jabalí fueron obtenidas un total de 1.949 muestras. De este número total de muestras, 1.936 correspondían a animales cazados y tan solo 13 muestras correspondieron a animales encontrados muertos. El número de jabalíes muestreados en cada temporada de caza se presenta en la figura 3. Figura 3: Número de jabalíes muestreados por temporada de caza. En los jabalíes abatidos se determinó el sexo y se estimó su edad aproximada en función de su tamaño. Cada animal fue identificado como: Grande, Mediano o Pequeño, y esto se correspondió con animales adultos, juveniles y jabatos. Esta sencilla clasificación se utilizó para evitar confusiones y malas interpretaciones, cuenta tenida de la gran cantidad y variedad de personas que participaron en la toma de muestras. Los jabalíes abatidos en campo y muestreados por nosotros fueron, además, inspeccionados externamente y fotografiados. Del total de las 1.949 muestras de jabalí obtenidas, 1.569 correspondían a muestras con suero, mientras que el resto (380) contenían exclusivamente tejido. El número de muestras por comarca se presentan en la tabla 1. Material y métodos 51 Comarcas Nº de jabalíes muestreados Nº de sueros obtenidos Nº jabalíes con suero y muestras para cultivo Alto Gállego 186 140 118 Andorra-Sierra de Arcos 13 13 13 Aranda 19 19 19 Bajo Aragón 39 32 32 Bajo Aragón-Caspe 23 19 19 Bajo Cinca 33 32 32 Bajo Martín 18 18 18 Campo de Belchite 48 45 45 Campo de Borja 29 25 25 Campo de Cariñena 55 29 29 Campo de Daroca 22 20 20 Cinca Medio 22 22 22 Cinco Villas 209 141 138 Comunidad de Calatayud 22 21 21 Comunidad de Teruel 15 15 15 Cuencas Mineras 12 12 12 D.C. Zaragoza 42 38 38 Gúdar-Javalambre 55 47 47 Hoya de Huesca 33 33 33 Jiloca 7 7 7 La Jacetania 257 205 174 La Litera 15 15 15 La Ribagorza 237 175 167 Los Monegros 42 41 41 Maestrazgo 23 20 17 Matarraña 26 24 24 Ribera Baja del Ebro 25 24 24 Sierra de Albarracín 29 28 25 Sobrarbe 320 236 195 Somontano de Barbastro 15 15 14 Tarazona y el Moncayo 57 57 53 Valdejalón 1 1 1 Total 1.949 1.569 1.453 Tabla 1: Número de jabalíes muestreados y muestras tomadas en las diferentes comarcas. En consecuencia, de los 1.949 jabalíes muestreados tan solo se pudo obtener suero en un total de 1.569 casos. Puesto que en 116 animales solo se dispuso muestra de suero pero no de tejido, y en 380 animales solo se dispuso de muestras de tejido pero no de suero, tan solo un total de 1.453 animales poseían suero y tejidos para cultivo bacteriológico. El tamaño (edad) de los jabalíes de los que se dispuso de una muestra de suero solo pudo estimarse en 982 animales: 635 adultos, 294 juveniles y 53 jabatos. De igual manera, el sexo de los jabalíes de los que se obtuvo una muestra de suero solo pudo determinarse en 1.190 animales (594 machos y 596 hembras). La extracción de sangre se realizó directamente de la cavidad torácica o, cuando fue posible, aprovechando la hemorragia del disparo para obtener suero de mejor calidad. La sangre fue recogida en tubos de plástico de 10 ml, dejándola coagular. Todas las muestras de sangre se centrifugaron posteriormente durante 10 minutos a 800-1.000g y el suero resultante fue almacenado en viales de plástico y conservado a -20ºC. Como Material y métodos 52 consecuencia lógica del proceso de obtención, la mayoría de sueros presentaron un importante grado de hemolisis, que los hacía inadecuados para la aplicación de la técnica diagnóstica de aglutinación con antígeno rosa de Bengala (RBT). La distribución de sueros de jabalí obtenidos en las diferentes temporadas de cada se presenta en la figura 4. Figura 4: Número de sueros de jabalí obtenidos por temporada de caza. En todos los casos, la toma de muestras para bacteriología se realizó lo antes posible tras la muerte del animal, utilizando instrumentos y material estéril adecuado para evitar posibles contaminaciones de las muestras. Las muestras que se tomaron fueron: linfonodos mandibulares, linfonodos escrotales, linfonodos mamarios, bazo, hígado y pulmón, así como testículos, epidídimos, glándulas bulbo-uretrales y vesículas seminales en los machos y una muestra del útero en las hembras. En ocasiones, también se tomaron muestras de articulaciones que presentaban alguna alteración. No siempre fue posible obtener todas las muestras, dependiendo esencialmente del estado final del animal encontrado muerto por los APNs, y en el caso de los animales cazados, de la localización del disparo, la existencia de depredación por parte de perros de caza, el grado de evisceración en el que encontramos las canales y también de la autorización del cazador para realizar la apertura de la cavidad abdominal y la extracción de muestras. Los tejidos fueron colocados en bolsas de plástico que eran etiquetadas individualmente y transportados refrigerados en el menor tiempo posible a la FVUZ. En 1.409 animales se dispuso de muestras de al menos un linfonodo (mandibulares, mamarios o escrotales), en 493 se dispuso al menos de bazo y en 182 se dispuso además de muestras del aparato reproductor. Material y métodos 53 3.2.2.- METODOLOGÍA DE ESTUDIO Para determinar la situación de la brucelosis en el jabalí, las muestras tomadas fueron estudiadas mediante técnicas serológicas, bacteriológicas e histopatológicas. 3.2.2.1.- Estudio serológico Un total de 1.569 sueros de jabalí (tabla 1) fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos frente a Brucella. Debido a la imposibilidad de aplicar la técnica de aglutinación RBT, por el importante grado de hemolisis de las muestras, la técnica utilizada para dicho estudio fue un ELISA indirecto (iELISA), desarrollado recientemente para la detección de anticuerpos inducidos por especies lisas de Brucella en ungulados silvestres (Muñoz et al., 2010). Brevemente, un extracto antigénico enriquecido en lipopolisacárido liso (LPS-S) de B. melitensis 16M (Leong et al., 1970) fue adsorbido en placas de poliestireno, (Nunc Maxisorp. Dinamarca). Las concentraciones óptimas de LPS-S y de cada reactivo fueron calculadas utilizando como gold standard una colección de sueros de ganado porcino, como especie más relacionada desde el punto de vista filogenético con el jabalí, y de la cual se disponía en el laboratorio del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón. Gobierno de Aragón (CITA). La dilucion óptima de cada suero se analizaron por duplicado y la reacción fue revelada usando concentraciones adecuadas de proteína G/peroxidasa como conjugado y 2,2´- Azinodi-[3-etilbenzotiazolín sulfonato] (ABTS) como cromógeno. Los resultados se expresaron como porcentaje de la densidad óptica (DO), aplicando la siguiente fórmula: %DO = media de las DO muestra x 100/media de DO suero control positivo Debido a la ausencia de sueros gold standard (jabalíes infectados y libres de infección), para la puesta a punto (determinación de las concentraciones óptimas de los distintos reactivos) y validación (determinación del punto de corte y de la sensibilidad y especificidad diagnósticas) de dicho iELISA, se utilizó una colección de sueros de 54 cerdos domésticos infectados de manera natural por B. suis biovar 2 y de 80 cerdos libres de brucelosis (proporcionada por el laboratorio de brucelosis del CITA. Gobierno de Aragón), siguiendo la metodología descrita previamente (Muñoz et al., 2012). De acuerdo con la validación realizada, obtuvimos un 100% de sensibilidad y especificidad diagnósticas con dichos sueros porcinos. Todos los sueros de jabalí fueron analizados en Material y métodos 54 las mismas condiciones que los sueros porcinos y aquellos que presentaron una media de DO superior a la establecida como punto de corte en porcino (40% de la DO del suero control positivo) fueron considerados como positivos. 3.2.2.2.- Estudio bacteriológico y molecular de las cepas aisladas Todas las muestras de tejido tomadas de animales que resultaron positivos en la técnica de iELISA mencionada, fueron sometidas a estudio bacteriológico. Además de estas muestras, e independientemente de su resultado serológico, todas aquellas muestras de tejidos que presentaron lesiones compatibles con la infección durante la inspección macroscópica, fueron sometidas también a estudio bacteriológico. Finalmente, para comprobar la especificidad de la estrategia propuesta, un número de muestras representativo (n=50) de la población de animales seronegativos en el iELISA, fue sometido también a estudio bacteriológico. Las muestras de tejido de animales de los que no se dispuso de suero permanecieron archivadas y congeladas en FVUZ para posteriores estudios. Las muestras se procesaron asépticamente y utilizando siempre instrumentos estériles para tratar de evitar la contaminación externa o cruzada de las muestras. Tras retirar la grasa y restos de tejido conectivo, las muestras se descontaminaron superficialmente mediante inmersión en etanol y flameado breve de la superficie de las mismas. Posteriormente las muestras fueron introducidas en bolsas estériles donde se maceraron con un “Stomacher”, añadiendo previamente una pequeña cantidad de solución salina estéril tamponada (PBS 10 mM, pH 7,2; 0,85% ClNa), antes de inocularlas en medios sólidos. Aproximadamente 0,5 ml de cada homogenizado se inoculó en cada placa de medio de cultivo, extendiéndolo por toda la superficie de la placa con un hisopo estéril. Todas las muestras se inocularon siempre por duplicado, utilizando al menos una placa de medio de Farrell (Farrell, 1974) y otra de medio CITA (de Miguel et al., 2011). Todas las placas inoculadas se incubaron durante 5-7 días a 37ºC en una atmósfera con alrededor de un 90% de humedad y conteniendo un 5-10% de CO₂. Las colonias aisladas fueron identificadas presuntivamente como Brucella spp. mediante observación directa de la morfología colonial característica, y las pruebas de oxidasa y ureasa (Alton et al., 1988). La identificación definitiva y diferenciación de las Material y métodos 55 especies de Brucella, se realizó mediante “Bruce-ladder” siguiendo el procedimiento descrito anteriormente (García-Yoldi et al., 2006; López-Goñi et al., 2008). Para ello, la extracción de ADN se realizó directamente a partir de las colonias aisladas mediante un kit comercial (QIAamp DNA minikit; QIAGEN®, Hamgurg, Germany). El ADN obtenido se resuspendió en agua destilada libre de ADNasa y ARNasa y se guardó a -20ºC hasta el momento de realizar los estudios moleculares. La identificación de la biovariedad se completó utilizando las pruebas de tipificación microbiológica convencional (Alton et al., 1988; Nielsen, 2012). Además, todas las cepas identificadas como B. suis fueron caracterizadas también a nivel de biovar por análisis de las muestras de ADN mediante un PCR multiplex “Suis-ladder”, diseñado específicamente para tal fin (López-Goñi et al., 2011). Finalmente, una vez confirmada cada cepa como B. suis biovar 2, sus correspondientes muestras de ADN fueron estudiadas también mediante PCR-RFLP de los genes Omp31, Omp2a y Omp2b (Cloeckaert et al., 1995; Vizcaíno et al., 1997) para determinar su particular haplotipo, tal y como se ha descrito previamente (Muñoz et al., 2010). Como cepas control de referencia para todos estos estudios se utilizaron las siguientes: B. abortus biovar 1 (cepa de referencia 2308); B. melitensis biovar 1 (cepa de referencia 16M); B. ovis (cepa de referencia PA); B. suis biovar 1 (cepa de referencia 1330); B. suis biovar 2 (cepa de referencia Thomsem); B. suis biovar 3 (cepa de referencia 686); B. canis cepa (cepa de referencia 66/6); B. abortus biovar 1 cepa S19 (vacuna); B. abortus biovar 1 cepa RB51 (vacuna); B. melitensis biovar 1 cepa Rev.1 (vacuna); B. neotomae (cepa de referencia SK33); B. pinipedialis (cepa de referencia B2/94); B. ceti (cepa de referencia B1/94); B. microti (cepa de referencia 4915); B. inopinata (cepa de referencia BO-01). 3.2.2.3.- Estudio anatomopatológico Durante la toma de muestras en campo y en las necropsias, se incidió en la búsqueda de lesiones macroscópicas compatibles con brucelosis (Enright, 1990; Olsen et al., 2012). Solo se inspeccionaron los órganos de jabalíes abatidos en campo y en nuestra presencia, y las muestras fueron tomadas directamente por nosotros. Un total de 366 bazos, 126 testículos y epidídimos y 21 úteros de otros tantos animales fueron inspeccionados macroscópicamente. Tras dicho reconocimiento, se procedía al archivo y congelación de dichas muestras a -20ºC. Aquellas muestras que presentaron lesiones compatibles o sospechosas de brucelosis, e independientemente del resultado serológico Material y métodos 56 obtenido, fueron sometidas inmediatamente a estudio bacteriológico como se ha indicado antes. Los jabalíes encontrados muertos (un total de 13) y recogidos del medio natural por los Agentes de Protección de la Naturaleza (APNs) fueron congelados y posteriormente trasladados a la FVUZ, donde se procedió a su descongelación controlada realizándose la necropsia, recogiendo todos los órganos indicados anteriormente. Todas las necropsias se completaron con la toma de datos biométricos, la inspección macroscópica y el estudio histológico de aquellas lesiones compatibles con brucelosis. Las muestras sospechosas de presentar lesiones compatibles con brucelosis se fijaron en formol tamponado al 10% lo antes posible, evitando así procesos de autolisis. Las muestras se mantuvieron en formol el tiempo necesario hasta su completa fijación y los tejidos fijados fueron tallados en secciones de 3-4 mm de espesor y colocados en casetes de plásticos en formol tamponado al 10%. Una vez acabada la etapa de fijación de las muestras, estas eran lavadas con agua corriente durante media hora antes de su inclusión en parafina. Una vez fijadas y lavadas, se deshidrataban utilizando un procesador histológico automático con alcoholes en concentraciones crecientes. La inclusión en parafina se facilitó con una mezcla al 50% de xilol en un primer baño y en un segundo baño solo con parafina, ambos a 56ºC. Posteriormente la elaboración de los bloques se realizó de manera semiautomática mediante la unidad formadora de bloques. Estos bloques fueron cortados con un microtomo con cuchillas desechables. Los cortes obtenidos tenían un grosor de entre 4-5 µm y eran depositados en la superficie de un baño maría a 37ºC para favorecer su estiramiento. Los cortes eran recogidos de la superficie con portaobjetos ayudándonos de un pincel o aguja histológica y los portaobjetos fueron tratados previamente para favorecer la adherencia de la muestra. Para la tinción de rutina hematoxilina-eosina -H-E- (Bancroft & Gamble, 2008), los portaobjetos fueron tratados con albúmina glicerinada de Mayer. Los cortes procedentes de bloques para inmunohistoquímica (IHQ) fueron depositados en portaobjetos gelatinizados para favorecer la adhesión del corte, especialmente durante el proceso de tinción y lavado de la muestra. Dichos cortes permanecían 12-24 h en estufa a 37ºC para su secado. Una vez desparafinados, se hidrataban y se teñían de manera rutinaria con la tinción de H-E. Material y métodos 57 En aquellos órganos que presentaron lesiones macro y microscópicas compatibles con brucelosis se realizo una tinción de inmunohistoquímica para detección de antígenos de Brucella en los tejidos. Para ello las muestras fueron desparafinadas en xilol e hidratadas mediante paso sucesivo por series decrecientes de etanol y posteriormente fueron incubadas 20 minutos en una solución al 0,3% de H2O2 en TBS-metanol para bloquear la peroxidasa endógena. La recuperación o desenmascaramiento de antígenos se realizó en olla a presión con agua destilada a pH 4 (Norton et al., 1994). Una vez preparadas y enfriadas, las muestras fueron incubadas 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal de conejo frente a B. melitensis 16M, suministrado por el Dr. J.M. Blasco (CITA. Gobierno de Aragón) y la reacción detectada mediante un anticuerpo secundario anti-conejo unido a un polímero marcado con peroxidasa-HRP (Sistema EnVisionTM, Dako, CA, EE.UU.). Como revelador de la reacción se utilizó diaminobencidina (Liquid DAB, Dako, CA, EE.UU.) y para contrastar la reaccion los cortes fueron teñidos brevemente con hematoxilina de Mayer. Una vez finalizada la tinción los portaobjetos fueron deshidratados en series crecientes de etanol, aclarados en xilol y montados con DPX. Como controles de la reacción se sometieron al mismo procesado muestras de tejido de una cerda infectada por B. suis (control positivo) y muestras de tejidos similares procedentes de cerdos libres de infección (control negativo) 3.3.- ESTUDIO DE BRUCELOSIS EN LA LIEBRE 3.3.1.- OBTENCIÓN Y ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUESTRAS Al igual que en el caso del jabalí, la obtención de muestras de liebre se ha llevado a cabo gracias al proyecto INIA FAU2008-00015-C02-00 y a la colaboración entre la Universidad de Zaragoza y el Departamento de Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente del Gobierno de Aragón. Durante la temporada de caza menor, los cazadores fueron instruidos en la recogida de vísceras y sangre de liebre. Se les proporcionaron bolsas y tubos de plástico. Los cazadores evisceraban las liebres abatidas, y extraían los órganos de la cavidad abdominal (bazo, hígado, aparato digestivo y reproductor) y cavidad torácica (corazón y pulmón), que eran introducidos en la bolsa de plástico. La sangre, siempre que fue posible, fue recogida de la cavidad torácica durante la evisceración. Todas las bolsas con muestras fueron etiquetadas con la edad, sexo, fecha y lugar y nos fueron remitidas directamente o bien congeladas a la FVUZ. Material y métodos 58 Cuando era posible acudíamos a un punto de encuentro con los cazadores y personalmente extraíamos las vísceras y tomábamos las muestras de sangre. La sangre era recogida en tubos de plástico de 10 ml, en los que se dejaba coagular para después centrifugar durante 10 minutos a 800-1.000g y asi obtener el suero que almacenábamos en viales de plástico congelados a -20ºC. Dependiendo del tiempo trascurrido tras la muerte de las liebres y de las condiciones climatológicas, gran parte de los sueros presentaban un elevado grado de hemolisis, que los hacía inadecuados para la aplicación de la técnica diagnóstica de aglutinación rápida (RBT). Dependiendo del tiempo trascurrido tras la muerte de las liebres y de las condiciones climatológicas, gran parte de los sueros presentaban un elevado grado de hemolisis, que los hacía inadecuados para la aplicación de la técnica diagnóstica de aglutinación rápida (RBT). Las muestras se clasificaron según su origen geográfico (comarca), especie animal, animal cazado o muerto y, finalmente, por temporada de caza. Sistemáticamente se otorgó una referencia a los animales o muestras que eran tomadas por nosotros o llegaban a la FVUZ. Un total de 282 muestras de liebres tanto ibéricas (Lepus granatensis; n= 247) como europeas (Lepus europaeus; n= 35), fueron utilizadas durante la realización de esta tesis. Figura 5: Imágenes de la toma de muestras de liebre en campo. Ante el desconocimiento de la situación de la brucelosis en la liebre en Aragón, se consideró oportuno intentar obtener un elevado número de muestras sin importar demasiado su procedencia geográfica. Material y métodos 65 de las liebres inoculadas con solución salina, confirmando por tanto la validez del protocolo de inmunización. A los 15 días de la segunda inoculación todas las liebres fueron sacrificadas (sobredosis de barbitúrico vía endovenosa) para obtener la máxima cantidad posible de suero hiperinmune, y además, se tomaron muestras de diferentes tejidos y órganos para su posterior estudio histológico y bacteriológico. Los sueros obtenidos en esta última extracción fueron analizados también como se ha indicado antes mediante la técnica de RBT, resultando positivos todos los sueros de las liebres hiperinmunizadas, manteniéndose negativos todos los sueros de las liebres usadas como control e inoculadas con solución salina. 3.3.2.1.4.- Puesta a punto del método iELISA con sueros de liebre El antígeno utilizado fue el mismo que el usado en el iELISA desarrollado para la detección de anticuerpos en el jabalí (Muñoz et al., 2010). Se trata de un extracto antigénico que contiene mayoritariamente lipopolisacarido liso (LPS-S) de la cepa de referencia B. melitensis 16M (Leong et al., 1970). La adsorción del extracto antigénico se llevó a cabo en placas de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano (Maxisorp Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca). Para la adsorción del antígeno, varias concentraciones de antígeno (desde 1 a 20 µg/ml) fueron preparadas en tampón fosfato salino estéril (PBS; 0.01M, ClNa 0.15M y pH 7.2) y distribuidas a razón de 100 µl por pocillo. Se cubrieron las placas con tapas adhesivas para evitar la evaporación y la adsorción se realizó a 4ºC durante toda la noche. El antígeno no adherido a la placa se retiró mediante tres lavados con PBS-Tween 20 (Sigma; USA) al 0,05%. Para determinar las condiciones óptimas del iELISA, se realizó una serie de ensayos preliminares con distintas concentraciones de antígeno y suero, diferentes conjugados y tiempos de lectura. Como primer paso se testó un panel representativo de sueros, compuesto por los 10 sueros de la población positiva (extraídos tras la primera (n=5) y segunda (n=5) hiperinmunización con células inactivadas de B. suis biovar 2 -ver arriba-) y los 11 sueros de las liebres antes de la inmunización (liebres como control negativo mas las liebres antes de la hiperinmunización con células inactivadas de B. suis biovar 2). Como conjugados, se utilizaron: 1) un antisuero policlonal obtenido en cabra frente a IgG de conejo, y conjugado con peroxidasa (GAR/IgG (H+L)/PO. Nordic Material y métodos 66 Immunological Laboratories, Tilburg, Holanda) y 2) tres proteínas recombinantes conjugadas con peroxidasa (Pierce Chemical Co., Rockford, Il, EE.UU): Proteína G (Protein G/HRP), Proteína AG (Protein AG/HRP) y Proteína A (Protein A/HRP). Los 10 sueros obtenidos tras la primera (n=5) y la segunda (n=5) inmunización fueron usados por duplicado (n=20) como población control positiva para la determinación del punto de corte óptimo en el iELISA. Los sueros (n=11) obtenidos de las liebres no inmunizadas en el momento de su sacrificio al final del ensayo (n=6) mas los sueros de las liebres antes de la hiperinmunización (n=5) fueron usados como control negativo con la misma finalidad. En todos los casos, los sueros fueron diluidos al duplo desde 1/25 hasta 1/200 en PBS-Tween y distribuidos por duplicado en las placas a razón de 100 µl por pocillo, previamente adsorbido con las diferentes concentraciones de antígeno. Cada placa se cubrió con una tapa adhesiva y tras una incubación a 37ºC durante 45 minutos, se realizaron 3 lavados con PBS-Tween para eliminar los anticuerpos no reaccionantes. A continuación en cada pocillo se dispensó un volumen de 100 µl de diferentes diluciones de los distintos conjugados. El conjugado policlonal antiIgG de conejo se ensayó a diluciones 1/1.000, 1/2.000, 1/5.000 y 1/10.000 y cada una de las proteínas recombinantes (A, G y A/G), a razón de 0,1 µg/ml, 0,2 µg/ml, 0,4 µg/ml y 0,8 µg/ml, todos ellos diluidos en PBS-Tween. Las diferentes placas con los conjugados se incubaron a 37ºC durante 45 minutos y se sometieron a 3 lavados con PBS-Tween. En cada placa de conjugado se introdujo un control positivo interno según el tipo de conjugado. Para el revelado de las reacciones antígeno-anticuerpo se añadió un volumen de 100 µl/pocillo de una solución conteniendo 0,11 mg/ml de ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzo-tiazolín-6-sulfónico (ABTS, Sigma; USA) en tampón citrato 0,05M (pH 4) y 0,004% de H2O2, y se incubaron las placas en agitación a temperatura ambiente. La absorbancia (DO) fue medida a 405 nm en un espectrofotómetro (Multiskan RC; Thermo Labsystems, Vantaa, Finlandia) transcurridos 10, 15 y 25 minutos. Teniendo en consideración el promedio de las DD.OO. obtenidas en las diferentes condiciones con los sueros controles positivos y negativos, se seleccionaron aquellas condiciones que permitían una mejor resolución para diferenciar ambas poblaciones de sueros. Una vez seleccionadas las condiciones óptimas del iELISA, un total de 261 sueros de liebre obtenidos en campo fueron analizados mediante esta técnica. Material y métodos 67 3.3.2.2.- Estudio bacteriológico Todas las muestras de tejido tomadas de animales que resultasen positivas en la técnica de iELISA, deberían ser sometidas a cultivo microbiológico, utilizando la misma rutina y métodos que los descritos en el caso del jabalí. Además como procedimiento de rutina, e independientemente de sus resultados serológicos, se estudiarían también bacteriológicamente todas las muestras de liebres europeas, fuesen cazadas o encontradas muertas, así como también todas las muestras de liebres europeas obtenidas con anterioridad a nuestro trabajo y mantenidas congeladas en la FVUZ. Al no resultar positiva serológicamente ninguna de las liebres ibéricas analizadas, tan solo fueron analizadas bacteriológicamente un total de 26 liebres europeas, 18 de las cuales fueron obtenidas durante el periodo de estudio. Por otra parte, e independientemente de que resultaron todas negativas en el iELISA, se estudiaron bacteriológicamente las muestras tomadas de liebres ibéricas en aquellas comarcas en las que fue identificada una elevada seroprevalencia de brucelosis en el jabalí. En consecuencia, un total de 105 liebres ibéricas fueron estudiadas bacteriológicamente, todas ellas obtenidas durante el periodo de estudio. En vista de los resultados negativos obtenidos y por razones de logística, decidimos no analizar bacteriológicamente la totalidad de muestras de liebres ibéricas tomadas a lo largo del estudio. 3.3.2.3.- Estudio anatomopatológico Durante la toma de muestras en campo y las necropsias, se incidió en la búsqueda de lesiones macroscópicas compatibles con brucelosis en la liebre (Stĕrba, 1982; Gyuranecz et al., 2011). Tanto los órganos como las vísceras de las liebres se sometían a inspección macroscópica antes del cultivo bacteriológico. Los órganos inspeccionados macroscópicamente fueron principalmente el aparato reproductor, el bazo y el hígado. Un total de 107 vísceras de liebre fueron inspeccionadas. De las liebres encontradas muertas en el medio natural y trasladadas a la FVUZ, fueron realizadas 21 necropsias (7 liebres ibéricas y 14 liebres europeas), con la toma de datos biométricos, la inspección macroscópica y el estudio histológico. El procesado y la Material y métodos 68 tinción histológica de las muestras de liebre siguieron el mismo procedimiento que el empleado en los tejidos de jabalí, en el apartado anterior. 3.4.- ESTUDIO DE LA SEROPREVALENCIA DE BRUCELOSIS EN LOS PERROS DE CAZA 3.4.1.- OBTENCIÓN Y ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUESTRAS De igual manera que en los casos anteriores, la obtención de muestras de perros de caza se realizó con la colaboración de cazadores y responsables de rehalas de perros. Durante la temporada de caza tanto mayor como menor, se realizaron contactos con cazadores, presidentes de cotos y propietarios de rehalas, explicándoles nuestro interés por obtener muestras de suero de perros que cazaban los jabalíes que nosotros muestreábamos. La extracción de sangre de perros de caza se realizó de la vena cefálica que discurre cranealmente por encima de la extremidad anterior. Todos los perros sometidos a extracción, fueron identificados por su nombre y el número de chip, también se anotó la edad, el sexo y la modalidad de caza. Además de estos datos, el propietario de los perros o la persona responsable del manteniendo de los mismos fue sometida a una encuesta epidemiológica sobre aspectos higiénico-sanitarios, alimentación y reproducción. Para realizar la extracción se inmovilizó cada perro en posición de decúbito esternal o sentado, después se aplicó alcohol al 70% en la zona de punción para limpiar la zona e identificar mejor la vena cefálica. Realizando un poco de presión por encima de la zona de punción, bloqueamos la vena cefálica y pinchamos con una palomilla (aguja con alargador, calibre 18G) logrando extraer 10 ml de sangre con una jeringa de 10 ml. La sangre se depositó en un tubo de plástico de 10 ml para obtención de suero. Tras la coagulación la sangre fue centrifugada durante 10 minutos a 800-1.000g y los sueros fueron almacenados en viales de plástico y conservados refrigerados o congelados a -20ºC. Todos los perros se sometieron a una exploración física en busca de signos clínicos compatibles con brucelosis (Wanke, 2004). Fueron visitadas un total de 37 rehalas de perros repartidas por el territorio aragonés, además algunas comarcas fueron muestreadas con varias rehalas. Pese a ello, Material y métodos 69 lamentablemente en algunas comarcas no fue posible tomar muestras de perros (figura 7). Figura 7: Distribución comarcal de muestras de perro en Aragón. Todos fueron perros de caza, tanto de caza mayor (ciervo, jabalí) como de caza menor (conejo, liebre y perdiz). En conjunto un total de 575 muestras de suero fueron tomadas a lo largo del estudio (figura 8). Material y métodos 70 Figura 8: Número de sueros de perros de caza obtenidos por año. Las muestras fueron clasificadas según su origen geográfico (comarca), tipo de caza y alimentación. Ante el desconocimiento de la situación de la brucelosis en perros de caza en Aragón, se consideró oportuno intentar priorizar la toma de muestras de aquellas comarcas con elevada seroprevalencia y mayor frecuencia de aislamientos de B. suis biovar 2 en el jabalí. La distribución de perros y rehalas por comarcas se presenta en la tabla 4. Comarcas Nº de perros Nº de rehalas Alto Gállego 5 1 Andorra-Sierra de Arcos 16 1 Bajo Aragón 32 2 Bajo Aragón-Caspe 39 2 Bajo Cinca 40 2 Bajo Martín 8 1 Campo de Borja 34 3 Campo de Cariñena 24 1 Comunidad de Calatayud 38 2 Comunidad de Teruel 19 1 Cuencas Mineras 40 2 D.C. Zaragoza 40 3 Gúdar-Javalambre 18 1 Jiloca 38 2 La Jacetania 22 1 La Ribagorza 48 3 Los Monegros 19 2 Maestrazgo 2 1 Matarraña 11 1 Ribera Baja del Ebro 20 1 Sierra de Albarracín 21 1 Sobrarbe 20 1 Tarazona y el Moncayo 21 2 Total 575 37 Tabla 4: Número y procedencia de perros de caza por comarca. En los perros muestreados la edad y el sexo fue obtenido de la cartilla oficial canina, donde aparecen el sexo, edad, raza y número de chip. Para la edad, aquellos animales con más de 6 años fueron identificados como viejos. Los perros que no habían salido a Material y métodos 71 cazar fueron identificados como juveniles y el resto fueron adultos. La edad de los perros pudo verificarse en 544 animales: 25 viejos, 465 adultos y 54 juveniles. El sexo se verificó en 541 animales: 354 machos y 187 hembras. Los perros que solo cazaban jabalí fueron 359, mientras que aquellos que también se utilizan en batidas de ciervo y jabalí fueron 211, quedando por tanto tan solo 5 perros que solo fueron utilizados en caza menor. Los perros que eran frecuentemente alimentados por sus cuidadores con carne o vísceras de jabalí fueron un total de 351 (61,04%), mientras que aquellos que recibían una alimentación convencional sin recibir subproductos de la caza del jabalí fueron 224 (38,96%). 3.4.2.- METODOLOGÍA DE ESTUDIO Para determinar la situación de la brucelosis en los perros de caza, las muestras tomadas fueron estudiadas mediante técnicas serológicas y bacteriológicas. 3.4.2.1.- Determinación de anticuerpos inducidos por infecciones por especies lisas de Brucella Puesto que la calidad de las muestras de suero tomadas en los perros fue muy buena, para determinar la presencia de anticuerpos frente a una potencial infección por B. suis se realizó la técnica de rosa de Bengala (RBT) estándar y modificada (Blasco et al., 1994; Nielsen, 2012), aceptada como una técnica universal para el diagnóstico de brucelosis en todas especies de mamíferos (Garin-Bastuji & Blasco, 1997). Si el suero resultaba positivo para las dos técnicas, se procedía a la realización de diluciones seriadas al duplo del suero en PBS estéril. Para cada una de estas diluciones se realizaba la técnica de RBT estándar, hasta detectar la dilución en la cual no se apreciaba aglutinación, pudiendo de esta manera realizar la titulación de las reacciones positivas producidas. Material y métodos 72 3.4.2.2.- Estudio bacteriológico Aquellos perros que resultaron positivos en RBT, y que sus propietarios nos lo permitieron, fueron sometidos a una extracción de sangre adicional en condiciones estériles para realizar un hemocultivo e intentar el aislamiento bacteriológico. Siempre que fue posible, se realizó en aquellos perros con títulos más altos en la prueba de aglutinación RBT, aunque no fue posible realizar un hemocultivo en todos los casos, bien por problemas de logística o, principalmente, por la falta de disposición de sus propietarios. En consecuencia, solamente 4 perros presentando positividad en la prueba de RBT pudieron ser sometidos a una extracción de sangre para intentar el hemocultivo. La obtención de sangre entera para hemocultivo se realizó mediante la técnica antes descrita pero extremando la desinfección de la zona, así como el material utilizado, para evitar contaminaciones. Después de la palpación de la vena, la piel se lavó con una solución jabonosa y la desinfección se realizó con clorhexidina alcohólica aplicándolo en forma excéntrica desde el sitio de punción elegido. Además, también se realizó la desinfección con etanol de los tapones de los tubos de vacío estériles usados. Mediante una palomilla de extracción se tomaron siempre uno o dos tubos de 10 ml de sangre entera en tubos de vacío estériles conteniendo citrato de sodio como anticoagulante (Yagupsky, 1999). Simultáneamente a la extracción para el hemocultivo, se realizó la identificación de los 4 perros y se sometió a cada animal a una exploración física exhaustiva en busca de signos clínicos compatibles, como dermatitis escrotal, epididimitis, linfadenitis generalizada, orquitis, uveítis (Carmichael, 1990; Wanke, 2004). Además se interrogó al propietario acerca de la salud del perro, sobre abortos tardíos o infertilidad tanto en machos como en hembras, así como su pauta de alimentación. Los tubos de sangre entera fueron llevados al laboratorio para su cultivo bacteriológico en el menor tiempo posible tras la extracción. Tras la descontaminación del tapón de goma, los tubos de sangre eran abiertos dentro de una cabina de flujo laminar para evitar la contaminación de la sangre y del medio de cultivo. Cada muestra de sangre fue inoculada en al menos dos frascos conteniendo 150 ml de caldo de Tripticasa Soja (TSB, Oxoid, UK) estéril. Tras agitar cuidadosamente para homogenizar el contenido, los frascos fueron incubados durante al menos 30 días a 37ºC en atmósfera con un 5-10% CO₂. Todos los frascos inoculados fueron observados diariamente en busca de signos que indicasen crecimiento bacteriano. A intervalos semanales de incubación se Material y métodos 73 sembraron 5 placas de BAB con 0,5 ml del contenido del frasco en cada una de las placas. Todas las placas de BAB se incubaron en estufa durante 7 días a 37ºC con 5-10% de CO₂. Estas placas fueron revisadas periódicamente en busca de crecimiento bacteriano, descartándose a los 7 días en ausencia de crecimiento. 3.5.- ANÁLISIS ESTADíSTICO Todas las variables (especie, edad, sexo, la comarca de procedencia y la temporada de caza) y los correspondientes resultados serológicos y bacteriológicos fueron introducidos en una base de datos realizada con el programa FileMaker Pro. Algunos de estos datos fueron exportados a hojas de cálculo Excel 2010 para su tratamiento estadístico. Debido a que se trabajó con variables cualitativas, se prepararon las correspondientes tablas de contingencia para su análisis. La prueba de χ2 o la prueba de razón de verosimilitud fueron aplicadas a dichas tablas de contingencia con el objeto de probar la existencia o no de diferencias significativas entre las diferentes variables. Para realizar los cálculos estadísticos se utilizó el programa estadístico IBM SPSS 19.0 para Windows, la hoja de cálculo Microsoft Excel 2010 y la base de datos FileMaker Pro 11. Se estableció un 5% (p<0,05) como nivel de significación estadística. Resultados 79 4.1.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS De los 341 animales que presentaron un resultado serológico positivo, tan solo se pudo disponer de muestras adecuadas para cultivo en 318 casos. Además, se estudiaron bacteriológicamente muestras de otros 11 animales seronegativos, bien por presentar lesiones macroscópicas compatibles. En conjunto, de estos 329 jabalíes sometidos a estudio bacteriológico, un total de 107 (todos ellos seropositivos) fueron encontrados infectados y las 107 cepas aisladas identificadas todas como B. suis biovar 2 (ver apartado 4.1.2.4 más adelante). La inmensa mayoría de cepas (n=104) se aislaron en animales cazados y tan solo 3 animales encontrados muertos resultaron positivos en cultivo. Finalmente, la totalidad de muestras de los 50 animales seronegativos sometidos a estudio bacteriológico resultaron negativas en cultivo (resultados no mostrados), demostrándose así la excelente especificidad de la estrategia empleada. 4.1.2.1.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalí en función de la temporada de caza y distribución por comarcas La distribución de los aislamientos obtenidos por temporada de caza se presenta en la tabla 10. Temporada Nº casos analizados Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% 1º Temporada 2008-2009 73 13 17,81% 10,71-28,12 2º Temporada 2009-2010 124 52 41,94% 33,62-50,74 3º Temporada 2010-2011 59 23 38,98% 27,58-51,73 4º Temporada 2011-2012 73 19 26,03% 17,34-37,11 Total 329 107 32,52% 27,69-37,76 Tabla 10: Distribución de la frecuencia de aislamientos de B. suis biovar 2 por temporada de caza. En la segunda temporada de caza, la frecuencia de cultivos positivos resultó significativamente mayor (p=0,002) que en el resto de temporadas. Con esta excepción, la frecuencia de aislamiento se mantuvo en valores muy similares a lo largo de todas las temporadas de caza estudiadas. La eficacia global de la sistemática utilizada fue moderada, ya que tan solo el 32,52% de los animales seropositivos estudiados bacteriologicamente resultaron en cultivo positivo. La frecuencia de aislamientos de B. suis biovar 2 en las comarcas en las que se obtuvieron muestras adecuadas para estudio bacteriológico se presenta en la tabla 11. Resultados 80 Comarcas Nº analizado Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% Alto Gállego 13 4 30,77% 12,68-57,63 Andorra-Sierra de Arcos 2 0 0,00% 0,00-65,76 Aranda 5 3 60,00% 23,07-88,24 Bajo Aragón 4 2 50,00% 15,00-85,00 Bajo Aragón-Caspe 9 2 22,22% 6,32-54,74 Bajo Cinca 9 4 44,44% 18,88-73,34 Bajo Martín 5 2 40,00% 11,76-76,93 Campo de Belchite 15 9 60,00% 35,75-80,18 Campo de Borja 7 4 57,14% 25,05-84,18 Campo de Cariñena 4 2 50,00% 15,00-85,00 Campo de Daroca 5 3 60,00% 23,07-88,24 Cinca Medio 8 3 37,50% 13,68-69,43 Cinco Villas 29 6 20,69% 9,85-38,39 Comunidad de Calatayud 5 2 40,00% 11,76-76,93 Comunidad de Teruel 4 2 50,00% 15,00-85,00 Cuencas Mineras 1 1 100,00% 20,65-100,00 D.C. Zaragoza 11 4 36,36% 15,17-64,62 Gúdar-Javalambre 7 2 28,57% 8,22-64,11 Hoya de Huesca 4 2 50,00% 15,00-85,00 La Jacetania 17 1 5,88% 1,05-26,98 La Litera 8 3 37,50% 13,68-69,43 La Ribagorza 50 14 28,00% 17,47-41,67 Los Monegros 11 8 72,73% 43,43-90,25 Maestrazgo 2 0 0,00% 0,00-65,76 Matarraña 3 2 66,67% 20,77-93,85 Ribera Baja del Ebro 10 6 60,00% 31,27-83,18 Sierra de Albarracín 4 1 25,00% 4,56-69,94 Sobrarbe 49 4 8,16% 3,22-19,19 Somontano de Barbastro 5 2 40,00% 11,76-76,93 Tarazona y el Moncayo 23 9 39,13% 22,16-59,21 Total 329 107 32,52% 27,46-37,58 Tabla 11: Número de cultivos de jabalí y frecuencia de aislamiento por comarca. Con la excepción de las comarcas de Andorra-Sierra de Arcos y Maestrazgo (en las que tan solo se pudieron analizar 2 animales en cada caso), B. suis biovar 2 fue aislada en la totalidad de comarcas aragonesas en las que se analizaron muestras, si bien la frecuencia de aislamiento varió considerablemente en función del número de animales analizados. En aquellas comarcas en la que se estudió un número significativo de animales (15 o más) la frecuencia de aislamientos osciló entre un mínimo del 5,8% (La Jacetania) y un máximo del 60% (Campo de Belchite). En general, y en clara concordancia con la seroprevalencia identificada en el estudio serológico, la frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 fue elevada en la práctica totalidad del territorio aragonés. Resultados 81 Figura 10: Distribución espacial de frecuencias de aislamiento en las comarcas de Aragón. En la figura 10 se presenta la distribución espacial de las frecuencias de aislamiento por comarcas en el conjunto del periodo de estudio, no observando ningún patrón reseñable. 4.1.2.2.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función de la edad y sexo En la tabla 12 se presenta la frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función del sexo de los jabalíes analizados, en aquellos casos en los que este pudo determinarse. Pese a que los machos presentaban aparentemente una frecuencia de aislamiento algo más elevada que las hembras, no se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas entre sexos (p=0,22). Resultados 82 Sexo Nº analizados Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% Macho 144 58 40,28% 32,62-48,44 Hembra 107 35 32,71% 24,55-42,06 Total 251 93 37,10% 31,31-43,18 Tabla 12: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función del sexo de los jabalíes examinados. En la tabla 13 se presenta la frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función de la edad de los jabalíes analizados, en aquellos casos en los que esta pudo determinarse. Edad Nº analizado Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% Adulto 181 68 37,36% 30,84-44,81 Joven 29 17 58,62% 40,74-74,49 Jabato 4 0 0,00% 0,00-48,99 Total 215 85 39,50% 33,24-46,20 Tabla 13: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función de la edad de los jabalíes examinados. Como puede apreciarse, aunque el tamaño de la muestra no fue demasiado elevado en los animales juveniles y jabatos, la frecuencia de aislamiento fue mayor (p=0,013) en los animales juveniles que en los animales adultos. En la tabla 14 se presenta la frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función del sexo y edad de los jabalíes analizados, en aquellos casos en los que estos datos pudieron determinarse con precisión. Los resultados se muestran estratificados por sexo y edad. Sexo Edad Macho Hembra Nº Frecuencia de aislamiento IC 95% Nº Frecuencia de aislamiento IC 95% Adulto 102 41,18% 32,12-50,88 79 31,65% 22,45-42,55 Joven 15 60% 35,75-80,18 13 61,54% 35,52-82,29 Jabato 2 0% 0,00-65,76 2 0% 0,00-65,76 Total 119 42,86% 34,33-51,83 94 35,11% 26,22-45,17 Tabla 14: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función de la edad y sexo de los jabalíes examinados. Como puede apreciarse, y a diferencia de lo indicado antes para la edad (tabla 13), no hubo diferencias significativas en la frecuencia de aislamiento en función de los grupos de edad ni en los machos (p=0,127), ni en las hembras (p=0,052). Resultados 83 4.1.2.3.- Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalí en función del origen y naturaleza de la muestra analizada En la tabla 15 se presenta la frecuencia de aislamiento en función de si la muestra analizada fue tomada por nosotros o bien era tomada por terceros. Como puede apreciarse claramente, la frecuencia de aislamiento disminuyó a más de la mitad (p<0,001) cuando la muestra fue tomada por personas ajenas a nuestro grupo de investigación (APNs, guardas de caza y cazadores). Origen de la muestra Nº analizado Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% Equipo FVUZ 155 70 45,16% 37,54-53,02 Otros (APNs, Cazadores, etc.) 174 37 21,26% 15,84-27,93 Total 329 107 32,52% 27,46-37,58 Tabla 15: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalíes en función de la toma de muestra. En definitiva, la probabilidad (Odds Ratio) de obtener un cultivo positivo fue 3 veces superior cuando la muestra fue tomada por nosotros que cuando fue tomada por terceros. La frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función del tipo de tejido estudiado se presenta en la tabla 16. Tejido Nº muestras Nº cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% Linfonodo mandibular 317 89 28,08% 23,41-33,26 Bazo 117 23 19,66% 13,47-27,77 Testículo 45 4 8,89% 3,51-20,73 Epidídimo 45 12 26,67% 15,96-41,04 Linfonodo escrotal 32 13 40,63% 25,52-57,74 Linfonodo mamario 31 11 35,48% 21,12-53,05 Glándula mamaria 3 2 66,67% 20,77-93,85 Útero 8 0 0% 0,00-32,44 Hígado 9 0 0% 0,00-29,92 Glándula bulbo-uretral 2 0 0% 0,00-65,76 Otras (pulmón y coagulo) 2 1 50% 9,45-90,55 Total 609 155 25,45% 22,15-29,06 Tabla 16: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalíes en función del tipo de tejido analizado. La frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 fue muy elevada cuando se dispuso de la glándula mamaria, si bien el número de muestras analizadas fue muy reducido. Los linfonodos mamarios y escrotales resultaron en elevadas frecuencias de aislamiento, generalmente por encima del 30%. Las muestras más utilizadas para cultivo fueron el linfonodo mandibular y el bazo, y como puede apreciarse, la frecuencia de aislamiento en estos órganos fue del 28,08% y 19,6%, respectivamente. En el caso de los órganos Resultados 84 genitales del macho hubo también una relativamente elevada frecuencia de aislamiento, siendo algo mayor en el epidídimo que en el testículo. Por el contrario, no se obtuvo ningún aislamiento a partir del útero, si bien el número de muestras sembradas fue muy reducido. La frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en función del número de muestras analizadas por animal se presenta en la tabla 17. Número de muestras examinadas por animal Nº animales Nº animales cultivo positivo Frecuencia de aislamiento IC 95% 7 1 0 0% 0,00-79,35 6 4 3 75% 30,06-95,44 5 10 8 80% 49,02-94,33 4 26 17 65,38% 46,22-80,59 3 29 11 37,93% 22,69-56,00 2 80 27 33,75% 24,35-44,64 1 179 41 22,91% 17,36-29,06 Total 329 107 32,52% 27,46-37,58 Tabla 17: Frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalíes en función del número de tejidos analizados. Como se evidencia en la tabla anterior, la frecuencia de aislamiento fue aumentando paulatinamente conforme aumentaba el número de tejidos sembrados de cada animal. Cuando se sometieron a estudio bacteriológico entre 4 y 5 muestras de cada animal, la frecuencia de aislamiento fue muy elevada, oscilando entre el 65,38% y el 80%. 4.1.2.4.- Caracterización molecular de las cepas de B. suis biovar 2 aisladas en jabalí Como se ha indicado anteriormente (ver 3.2.2.2. material y métodos), las 107 cepas aisladas en el jabalí fueron identificadas mediante pruebas microbiológicas convencionales, así como mediante “Bruce-ladder”. La diferenciación de las distintas especies de Brucella en esta técnica se esquematiza en la figura 11. Resultados 85 Figura 11: “Bruce-ladder” PCR multiplex. Línea 1, marcador de pesos moleculares de 100pb (Invitrogen Ltd.); línea 2, B. abortus biovar. 1 (cepa 2308); línea 3, B. melitensis biovar. 1 (cepa 16M); línea 4, B. ovis (cepa PA); línea 5, B. suis biovar. 1 (cepa 1330); línea 6 B. canis (cepa 6/66); línea 7 B. canis (cepa de campo); línea 8, B. abortus S19 (vacuna); línea 9, B. abortus RB51 (vacuna); línea 10, B. melitensis Rev.1 (vacuna); línea 11, B. neotomae (cepa SK33); línea 12, B. pinipedialis (cepa B2/94); línea 13, B. ceti (cepa B1/94); línea 14, B. microti (cepa 4915); línea 15, B. inopinata (cepa BO-01). Además, la tipificación de todas las cepas de B. suis aisladas como biovar 2 se llevó a cabo también mediante “Suis-ladder”. En la figura 12 se esquematizan los resultados de esta técnica, que permite la diferenciación de las 5 biovariedades de B. suis. Figura 12: PCR multiplex “Suis ladder”. Línea 1, marcador de pesos moleculares de 100pb (Invitrogen Ltd.); línea 2, B. suis biovar 1 (cepa 1330); línea 3, B. suis biovar 2 (cepa Thomsen); línea 4, B. suis biovar 3 (cepa 686); línea 5, B. suis biovar 4 (cepa 40); línea 6, B. suis biovar 5 (cepa 513). En la figura 13 se presenta un ejemplo de los resultados de identificación de los aislamientos realizados como B. suis biovar 2 en la técnica “Suis-ladder”. Resultados 86 Figura 13: PCR multiplex “Suis ladder”. Línea 1, marcador de pesos moleculares de 100pb (Invitrogen Ltd.); línea 2, B. suis biovar 1 (cepa de referencia 1330, usada como control); línea 3, B. suis biovar 2 (cepa de referencia Thomsen, usada como control); líneas 4 a 14, cepas de campo representativas aisladas de jabalíes de nuestro estudio, e identificadas en todos los casos como B. suis biovar 2; línea 15, control negativo (H2O). Una vez identificadas todas las cepas de B. suis aisladas en jabalíes como pertenecientes a la biovar 2, se procedió a caracterizar el correspondiente haplotipo mediante PCR-RFLP de los genes de proteínas de membrana externa Omp2a, Omp2b y Omp31 (ver capítulo 3.2.2.2. material y métodos). Los patrones de restricción utilizados para la diferenciación de los principales haplotipos de B. suis biovar 2 se esquematizan en la figura 14. Figura 14: Patrones de restricción identificados para las cepas de B. suis biovar 2 tras amplificación mediante PCR de los genes de proteínas de la membrana externa (Omp2a, Omp2b y Omp31) y posterior digestión de los mismos con la enzimas de restricción indicadas (PCR-RFLP). Línea 1, marcador de pesos moleculares de 100 pb (Invitrogen Ltd.); línea 2, patrón característico de la cepa B. suis biovar 2 de referencia (Thomsen), aislado en jabalíes, liebres europeas y cerdos domésticos en varios países europeos, pero nunca aislado en Resultados 87 España; línea 3, patrón característico del haplotipo centroeuropeo de B. suis biovar 2, aislado en jabalíes y cerdos domésticos en varios países de Europa, incluyendo España (este haplotipo también se ha encontrado en liebres europeas en algunos países europeos, pero nunca en liebres españolas); línea 4, patrón característico del haplotipo ibérico mayoritario de B. suis biovar 2, aislado exclusivamente de jabalíes y cerdos domésticos en la península ibérica, y nunca aislado en los restantes países europeos; línea 5, patrón característico del haplotipo ibérico minoritario de B. suis biovar 2, aislado también exclusivamente en jabalíes y cerdos de la península ibérica, y nunca aislado en los restantes países europeos. Línea 6, patrón identificado exclusivamente en cepas aisladas de liebre europea del noreste de España y sur de Francia. De las 107 cepas de B. suis biovar 2 aisladas a lo largo del periodo de estudio, un total de 90 mostraron patrones de restricción idénticos a los del haplotipo centroeuropeo (aislado en todos los países europeos), mientras que tan solo 17 presentaron patrones idénticos a los del haplotipo ibérico mayoritario (aislado exclusivamente en la península ibérica). Ningún otro de los haplotipos descritos hasta ahora para la biovariedad 2 de B. suis fue identificado en nuestro estudio. Los haplotipos de B. suis biovar 2 aislados en función de la temporada de caza de los jabalíes estudiados se presentan en la tabla 18. Temporada Haplotipos Centroeuropeo Ibérico mayoritario Total 1º Temporada 2008-2009 12 1 13 2º Temporada 2009-2010 41 11 52 3º Temporada 2010-2011 20 3 23 4º Temporada 2011-2012 17 2 19 Total 90 17 107 Tabla 18: Distribución de los haplotipos de B. suis biovar 2 en función de la temporada de caza. Como puede apreciarse, no se apreciaron diferencias significativas (p=0,721) en la frecuencia de aislamientos de los correspondientes haplotipos en función de las diferentes temporadas de caza, si bien el haplotipo centroeuropeo se aisló siempre de manera mayoritaria. Sexo Haplotipos Centroeuropeo Ibérico mayoritario Total Macho 49 7 56 Hembra 28 7 35 Total 77 14 91 Tabla 19: Distribución de los haplotipos de B. suis biovar 2 en función del sexo de los jabalíes estudiados. Con respecto a las diferencias en función del sexo (tabla 19), el haplotipo centroeuropeo se aisló más frecuentemente en machos que en hembras, mientras que no hubo diferencias en el caso del otro haplotipo identificado (p=0,335). Resultados 88 La distribución de los aislamientos de B. suis biovar 2 en función del haplotipo y la edad de los animales analizados se muestra en la tabla 20. Edad Haplotipos Centroeuropeo Ibérico mayoritario Total Adulto 53 13 66 Joven 16 1 17 Jabato 0 0 0 Total 69 14 83 Tabla 20: Distribución de los haplotipos de B. suis biovar 2 en función de la edad de los jabalíes. No hubo ningún aislamiento en jabatos y, en sincronía con los resultados microbiológicos generales, la frecuencia de aislamiento de cada haplotipo fue mayor en los animales adultos que en las otras clases de edad. La distribución de ambos haplotipos en las diferentes comarcas aragonesas muestreadas se presenta en la figura 15. Como puede apreciarse, el haplotipo centroeuropeo se aisló en todas las comarcas en las que hubo aislamiento de B. suis, mientras que la presencia del haplotipo ibérico mayoritario quedó circunscrita a tan solo 7 comarcas, en las que, además, hubo siempre una co-existencia de los dos haplotipos. Estas 7 comarcas fueron: Aranda, Campo de Borja, Cinco Villas, D.C. Zaragoza, Hoya de Huesca, Los Monegros y Tarazona y el Moncayo. Resultados 95 ibérica y europea analizadas se presenta en la figura 21. Como puede apreciarse, no hubo diferencias en los valores de DO entre los sueros de ambas poblaciones de liebre analizadas. Dichos valores se encontraron siempre por debajo del punto de corte seleccionado, y fueron coincidentes con los valores de DO obtenidos con los sueros de las liebres europeas usados como control negativo (figura 20). En consecuencia, estos resultados demuestran la inexistencia de brucelosis en ambas poblaciones de liebre en Aragón. 100 80 60 40 20 0 N=227 N=34 % D.O. Liebres ibéricas Liebres europeas Figura 21: Distribución de las medias de densidad óptica (DO) de los sueros de la totalidad de liebres analizadas mediante el iELISA en Aragón. La barra horizontal representa el punto de corte a partir del que los valores de DO se consideran positivos. 4.2.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS Pese a no encontrar ningún animal seropositivo en el iELISA, y con la finalidad de confirmar la adecuada especificidad de nuestros resultados serológicos, tomamos la decisión de estudiar bacteriológicamente la totalidad de las liebres europeas cazadas y encontradas muertas, así como de todas las liebres ibéricas cazadas en comarcas en las que identificamos mayor seroprevalencia de brucelosis en el jabalí. Además, se realizaron cultivos bacteriológicos a todas las muestras de liebres europeas obtenidas con anterioridad al periodo de estudio, y conservadas en la FVUZ. Todos los cultivos realizados tanto de liebres europeas como de liebres ibéricas resultaron negativos, demostrándose así la adecuada especificidad diagnóstica de nuestros resultados serológicos, y la inexistencia de brucelosis en las liebres de Aragón. Resultados 96 4.2.3.- RESULTADOS ANATOMOPATOLÓGICOS Un total de 107 vísceras de liebres fueron inspeccionadas macroscópicamente durante la recepción de muestras de animales cazados durante el periodo de estudio. Además se realizó la necropsia de 21 animales encontrados muertos. Ninguna de las vísceras examinadas macroscópicamente presentó lesiones compatibles con brucelosis. 4.3RESULTADOS EN LOS PERROS DE CAZA 4.3.1.- RESULTADOS SEROLÓGICOS De los 575 sueros de perros de caza analizados mediante la técnica de rosa de Bengala modificado (RBTm), un total de 43 fueron positivos, resultando en una seroprevalencia del 7,48% (IC 95%: 5,60-9,92). Por otra parte, 16 de estos 43 sueros resultaron positivos también en la prueba de rosa de Bengala estándar (RBTest), obteniéndose en consecuencia una seroprevalencia de brucelosis del 2,78% (IC 95%: 1,724,47) con esta interpretación. En la tabla 22 se presenta la distribución de los sueros positivos por comarcas y por técnica empleada. Comarcas Nº Perros Nº positivos RBTm Nº positivos RBTest Alto Gállego 5 0 0 Andorra-Sierra de Arcos 16 2 0 Bajo Aragón 32 1 0 Bajo Aragón-Caspe 39 2 0 Bajo Cinca 40 3 2 Bajo Martín 8 0 0 Campo de Borja 34 2 1 Campo de Cariñena 24 1 0 Comunidad de Calatayud 38 1 0 Comunidad de Teruel 19 1 0 Cuencas Mineras 40 0 0 D.C. Zaragoza 40 3 2 Gúdar-Javalambre 18 2 0 Jiloca 38 4 1 La Jacetania 22 1 1 La Ribagorza 48 5 3 Los Monegros 19 1 1 Maestrazgo 2 0 0 Matarraña 11 0 0 Ribera Baja del Ebro 20 3 1 Sierra de Albarracín 21 3 2 Sobrarbe 20 3 0 Tarazona y el Moncayo 21 5 2 Total 575 43 16 Tabla 22: Distribución de los perros seropositivos en la prueba de rosa de Bengala modificada (RBTm) y estándar (RBTest) en las diferentes comarcas en las que se pudo obtener muestras. Resultados 97 En aquellas comarcas con altas frecuencias de aislamiento de B. suis biovar 2 en jabalí como La Ribagorza o Tarazona y el Moncayo, fue en las que obtuvimos el mayor número de perros seropositivos en la técnica de RBTm. En general, en 18 de las 23 comarcas analizadas se detectaron perros seropositivos, y en las 5 restantes no dispusimos de un número adecuado de perros. En todas las comarcas en las que detectamos perros seropositivos se logró aislar B. suis biovar 2 en el jabalí, con la excepción de las comarcas de Andorra-Sierra de Arcos y Jiloca, en las que no hubo aislamiento. Figura 22: Distribución comarcal de los perros seropositivos en la prueba de rosa de Bengala modificada (mapa de la izquierda) y prueba de rosa de Bengala estándar (mapa de la derecha), en las diferentes comarcas en las que se pudo obtener muestras. En la figura 22 se presenta la distribución espacial de las comarcas seropositivas y seronegativas respecto a la técnica aplicada, mostrando 5 comarcas que fueron seronegativas en ambas técnicas. Tampoco se aprecia ningún patrón de distribución reseñable. Resultados 98 En la tabla 23 se presenta el número de perros seropositivos en ambas técnicas en función del sexo y edad. Los resultados se muestran estratificados por sexo y edad, en aquellos perros en los que ambos parámetros pudieron ser determinados. Sexo Edad Macho Hembra Total Nº Nº positivo RBTm Nº positivo RBTest Nº Nº positivo RBTm Nº positivo RBT Nº Nº positivo RBTm Nº positivo RBT Viejo 19 3 0 6 0 0 25 3 0 Adulto 279 16 8 153 9 3 432 25 11 Joven 37 4 2 17 4 1 54 8 3 Total 335 23 10 176 13 4 511 36 14 Tabla 23: Resultados obtenidos en las pruebas de rosa de Bengala estándar (RBTest) y modificada (RBTm), en función del sexo y edad de los perros. Como puede apreciarse, el mayor número de perros seropositivos correspondió al grupo de adultos, siendo este grupo el más numeroso. También hubo un mayor número de machos seropositivos que de hembras. Todos los perros seropositivos participaban activamente de la caza del jabalí, excepto dos perros jóvenes (S-759/09; S-1061/09), que todavía no habían salido a cazar, ni habían comido carne ni vísceras de jabalí. Ninguna rehala visitada señaló haber tenido problemas de abortos ni de infertilidad y tampoco los perros convivían con ganado domestico de ningún tipo. Todas las rehalas realizaban una limpieza y desinfección de las instalaciones y disponían de asistencia veterinaria. De las 37 rehalas visitadas, en 13 no alimentaban a los perros con carne o vísceras de jabalí, mientras que en 24 alimentaban frecuentemente a los perros con carne, vísceras o jabalíes enteros. En la tabla 24 se presentan los resultados serológicos en función del tipo de alimentación. La mayoría de perros seropositivos, 26 en la técnica RBTm y 10 en la de RBTest, se ubicaron en las rehalas que alimentaban a sus perros con carne o vísceras de jabalí. El resto de perros seropositivos se correspondió con rehalas que realizaban una alimentación convencional. Alimentación con carne o vísceras de Jabalí Alimentación convencional + - + - RBTm 26 325 17 207 RBTest 10 341 6 218 Tabla 24: Resultados obtenidos en las pruebas de rosa de Bengala estándar (RBTest) y modificada (RBTm), en función del tipo de alimentación de los perros. Resultados 99 En las tablas 25 se describen las características más relevantes de los perros seropositivos en la técnica de RBTest. Ref Edad Sexo Comarca RBTest Diluciones límite de positividad en RBTest Caza S-759/09 Joven ♂ Campo de Borja Positivo negativo a 1/2 Sin cazar S-1061/09 Joven ♀ La Jacetania Positivo negativo a 1/4 Sin cazar S-1083/09 Adulto ♀ Bajo Cinca Positivo negativo a 1/2 Jabalí/Ciervo S-1095/09 Adulto ♂ Bajo Cinca Positivo negativo a 1/4 Jabalí/Ciervo S-1117/09 Adulto ♀ Tarazona y el Moncayo Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-1122/09 Adulto Ind. Tarazona y el Moncayo Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-1180/09 Adulto ♂ La Ribagorza Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-1234/09 Adulto ♂ Jiloca Positivo negativo a 1/4 Jabalí/Ciervo S-1260/09 Adulto ♂ Sierra de Albarracín Positivo negativo a 1/4 Jabalí/Ciervo S-1264/09 Adulto ♂ Sierra de Albarracín Positivo negativo a 1/128 Jabalí/Ciervo S-1633/09 Adulto ♀ Los Monegros Positivo negativo a 1/16 Jabalí S-1823/09 -- ♂ D.C. Zaragoza Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-124/10 Adulto ♂ La Ribagorza Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-125/10 Adulto ♂ La Ribagorza Positivo negativo a 1/4 Jabalí S-1451/10 Joven ♂ D.C. Zaragoza Positivo negativo a 1/2 Jabalí S-735/11 Adulto ♂ Ribera Baja del Ebro Positivo negativo a 1/4 Jabalí Tabla 25: Características más relevantes de los perros que fueron encontrados positivos en la prueba de rosa de Bengala estándar (RBTest). Ninguno de los perros sometidos a estudio serológico presentó signos clínicos compatibles con brucelosis. 4.3.2.- RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS En los perros seropositivos que presentaban positividad a diluciones altas y siempre que se pudo contar con la colaboración del propietario, se realizó una extracción de sangre entera del animal afectado para realizar el hemocultivo. Tan solo pudieron realizarse hemocultivos de 4 perros, 2 de la comarca de Albarracín de la misma rehala, 1 perro de la comarca de Zaragoza y otro de la comarca La Ribera Baja del Ebro. Los cuatro animales se confirmaron de nuevo como seropositivos en la técnica de RBTest, pero resultaron negativos en el hemocultivo. Resultados 100 En la tabla 26 se presentan las características más relevantes de los perros sometidos a hemocultivo. Ref Edad Sexo Comarca Diluciones límite de positividad en RBTest Hemocultivo S-1260/09 Adulto ♂ Sierra de Albarracín negativo a 1/4 Negativo S-1264/09 Adulto ♂ Sierra de Albarracín negativo a 1/128 Negativo S-1451/10 Joven ♂ D.C. Zaragoza negativo a 1/2 Negativo S-735/11 Adulto ♂ Ribera Baja del Ebro negativo a 1/4 Negativo Tabla 26: Características más relevantes de los perros sometidos a hemocultivo. DISCUSIÓN Discusión 101 5.- DISCUSIÓN Pese a la escasez o ausencia de estudios al respecto, la fauna silvestre es considerada por muchos como un reservorio potencial de brucelosis para los animales domésticos y para el hombre. Con el objetivo de clarificar si la fauna silvestre en Aragón representa o puede representar un peligro potencial de transmisión de enfermedades a los animales domésticos y al hombre, nuestro Departamento de la FVUZ viene trabajando desde hace años en la elaboración de estudios epidemiológicos en la fauna silvestre, realizando un seguimiento sanitario de la misma. En el presente trabajo hemos pretendido determinar la seroprevalencia de la infección de brucelosis en jabalíes, liebres y perros de caza de la Comunidad Autónoma de Aragón. Nuestros resultados se han obtenido mediante una búsqueda activa a través del estudio de los animales cazados y, en menor medida, también de una forma pasiva, estudiando aquellos animales encontrados muertos en la naturaleza. Todo ello ha sido posible merced a la buena disposición que hemos encontrado en los Agentes de Protección de la Naturaleza, titulares de los cotos y cazadores, tanto en la recogida de muestras como en la toma de las mismas. Esta desinteresada colaboración de todos estos actores ha hecho posible que el número de jabalíes, liebres y perros a los que hemos podido acceder ha sido muy considerable. Sin embargo, somos conscientes también que alguno de nuestros resultados habrá sido seguramente subestimado o sobrestimado, particularmente en aquellas comarcas y especies animales en las que no ha sido posible obtener un número suficientemente representativo de muestras. Una de las principales dificultades para realizar estudios de detección de enfermedades en las especies silvestres reside precisamente en la obtención de muestras. En el caso de especies cinegéticas, la obtención de muestras se realiza habitualmente de manera activa en animales cazados, ya que recurrir a la búsqueda pasiva en los animales encontrados muertos o enfermos en el medio natural es mucho más dificultoso y lento, además, puede resultar en sesgos importantes (McAloose & Newton, 2009; Mörner et al., 2002). En algunos trabajos recientes de nuestro grupo y relativos también a la detección de enfermedades en especies cinegéticas de nuestra región, el número de animales muertos o enfermos a los que se tuvo acceso fue mucho mayor que en nuestro caso, debido posiblemente al mayor valor económico de las especies estudiadas y a la mayor vigilancia cinegética y sanitaria existente en dichas especies (Arnal, 2011; Revilla, 2012). Discusión 102 Aragón es un vasto territorio compuesto por 33 comarcas y uno de los planteamientos esenciales de nuestra tesis consistió en intentar obtener un número significativo de muestras en todas las comarcas para obtener resultados suficientemente representativos. Lamentablemente, este planteamiento no pudo ser cumplido totalmente, y en algunas comarcas no logramos obtener las muestras adecuadas. Esto fue debido esencialmente a la dificultad en la coordinación con los cazadores y a la escasa dimensión de nuestro equipo, que unido a las dificultades orográficas del territorio en estudio, imposibilitaban nuestra presencia en varios lugares simultáneamente mientras se realizan las batidas. Además, otro factor importante fue la escasa actividad cinegética en algunas comarcas, en las que pese a haber realizado numerosas visitas, no logramos obtener un número representativo de muestras. Es importante tener en consideración que a diferencia de otros estudios similares al nuestro (Bergagna et al., 2009; ClosaSebastià et al., 2010; Grégoire et al., 2012; Risco et al., 2013; Vicente et al., 2002), la totalidad de muestras analizadas han procedido de animales de vida libre que han sido cazados o encontrados muertos en la naturaleza, y en ningún caso de animales situados en cercados o vallados cinegéticos, en los que la intervención humana puede condicionar en gran medida la prevalencia de las enfermedades (Gortázar et al., 2006). 5.1.- ESTUDIOS EN EL JABALÍ La población de jabalí se distribuye de manera uniforme por toda la región aragonesa, y su abundancia es importante, aunque no homogénea (Gortázar et al., 2000; Osuna et al., 2006), siendo la especie cinegética de caza mayor más importante de Aragón (Herrero, 2002). En consecuencia, el número de muestras obtenido durante el periodo de estudio ha sido muy considerable (tabla 1) y creemos que suficiente para poder extraer conclusiones muy sólidas sobre la situación de la brucelosis en esta especie en Aragón. Pese a ello, en varias comarcas sólo pudimos tomar un número muy limitado de muestras y, en algún caso (Ribera Alta del Ebro), no fuimos capaces de obtener muestras. La determinación de la seroprevalencia de brucelosis en el jabalí se ha realizado clásicamente mediante obtención de suero sanguíneo y su análisis mediante pruebas serológicas convencionales como la aglutinación rápida con antígeno rosa de Bengala (RBT), la fijación del complemento (CFT) y la seroaglutinación lenta en tubo -SAT- (Becker et al., 1978; Bergagna et al., 2009; Drew et al., 1992; Grégoire et al., 2012; Hubálek Discusión 109 hace extraordinariamente improbable la transmisión de la infección al jabalí (Blasco, 2011). Finalmente, las diferencias encontradas tampoco deberían ser achacables al número, sexo o edad de animales muestreados, ya que no han existido diferencias reseñables en dichos parámetros en los muestreos realizados por comarcas. De hecho, en aquellas comarcas en las que se tomó un número muy importante de muestras (140 o más), se pusieron también en evidencia variaciones importantes de seroprevalencia (tabla 6). La manera más adecuada para determinar la edad en el jabalí se basa en patrones de erupción dental (Sáenz de Buruaga et al., 1991), pero esta metodología es relativamente compleja y necesita bastante entrenamiento. Somos pues conscientes de las deficiencias y subjetividad de nuestro método para determinar la edad del jabalí, lo que hace muy complicado comparar nuestros resultados con los de otros estudios similares. Sin embargo, la extrapolación de la edad de los animales en función de su tamaño nos pareció una alternativa sencilla y práctica para evitar confusiones y unificar criterios entre los numerosos cazadores y guardas de caza involucrados en la toma de datos. Teniendo estas limitaciones en consideración, la seroprevalencia obtenida fue mucho mayor en jabalíes adultos que en los jóvenes (tabla 8). Esto parece bastante lógico, ya que los jabalíes adultos tienen una mayor probabilidad de exposición frente a B. suis que los animales jóvenes dentro de la misma población (Closa-Sebastià et al., 2010; Gresham et al., 2002; Leuenberger et al., 2007). Esta mayor seroprevalencia en los animales adultos puede ser explicada también por la naturaleza sexual de la transmisión de la infección (Algers et al., 2009; Alton, 1990; Metcalf et al., 1994; Olsen et al., 2012) y el comportamiento social del jabalí, puesto que solo los animales adultos participan activamente en la reproducción, mientras que los jabalíes jóvenes no son activos sexualmente (Azorit & Moro, 2010; Mauget & Boissin, 1987). Al igual que ocurre en el caso de las especies domésticas infectadas por otras brucelas, la cubrición y el partoaborto constituyen probablemente las fases productivas de mayor riesgo de transmisión de la infección por B. suis (Algers et al., 2009; Alton, 1990; Metcalf et al., 1994; Olsen et al., 2012). Por otra parte, los jabalíes machos presentaron una seroprevalencia mayor que las hembras (tabla 7). La diferencia de infección entre sexos es compatible con la conducta polígama de los machos (Azorit & Moro, 2010; Closa-Sebastià et al., 2010; Rosell & Discusión 110 Herrero, 2002), teniendo presente lo indicado anteriormente respecto a la naturaleza sexual de la transmisión que, en lógica consecuencia, tendrán un mayor riesgo de contagio que las hembras. Son muy escasos los estudios de brucelosis en fauna silvestre que complementan la simple determinación de la seroprevalencia con estudios bacteriológicos que demuestren la existencia real del problema, ya que el aislamiento de Brucella a partir del animal afectado, constituye la única prueba inequívoca demostrativa de la infección (Olsen et al., 2012), por lo que el cultivo microbiológico se considera como la mejor prueba gold standard para el diagnóstico de la brucelosis (Garin-Bastuji & Blasco, 1997; Nielsen, 2012). Sin embargo, esto también podría hacerse teóricamente mediante la identificación del ADN de Brucella spp. extraído directamente de los tejidos y utilizando técnicas de PCR. Estas herramientas moleculares son muy valiosas para identificar ADN bacteriano, y la extracción directa de dicho ADN desde muestras tisulares de animales sospechosos es considerada por algunos como una buena alternativa a la bacteriología convencional para el diagnóstico certero de la brucelosis (Amin et al., 2001; Bricker, 2002; Grégoire et al., 2012; Hinić et al., 2009; Ilhan et al., 2007; Ilhan et al., 2008; Leyla et al., 2003; Wu et al., 2011; Yu & Nielsen, 2010). De hecho, la mayor parte de estos estudios concluyen en una mayor sensibilidad de la PCR con respecto a la bacteriología convencional. Sin embargo, cuando se utiliza una metodología diagnóstica adecuada, la sensibilidad de la bacteriología convencional es siempre superior a la prueba de PCR para el diagnóstico directo de la brucelosis (Manterola et al., 2003; Romero et al., 1995) y ninguna de las técnicas basada en la detección directa de ADN de Brucella en los tejidos se ha mostrado actualmente más sensible que la bacteriología convencional, particularmente cuando esta es realizada con las muestras, medios de cultivo y sistemática adecuados (Manterola et al., 2003; Romero et al., 1995). Es por ello que en nuestro caso, pese a disponer de mucha experiencia y suficientes herramientas moleculares a nuestro alcance, decidimos realizar el diagnóstico directo a través del aislamiento bacteriológico en los animales seropositivos mediante métodos de microbiología convencionales (Alton et al., 1988), pero empleando una combinación adecuada de muestras y medios selectivos (de Miguel et al., 2011; Farrell, 1974; Marín et al., 1996b), y utilizando las herramientas moleculares exclusivamente para la identificación y caracterización genética de las cepas de B. suis que logramos aislar (ver más adelante). En estudios similares se han usado diversos medios de cultivo, siendo el medio de Farrell (Farrell, 1974) en combinación con otros Discusión 111 medios no selectivos, la estrategia más ampliamente utilizada (Bergagna et al., 2009; Cvetnić et al., 2003; Cvetnić et al., 2009; De Massis et al., 2012; Godfroid et al., 1994; Grégoire et al., 2012). Sin embargo, ha sido bien demostrado que alguno de los antibióticos contenidos en el medio de Farrell inhiben el crecimiento de varias especies de Brucella, incluyendo B. suis (de Miguel et al., 2011; Marín et al., 1996a). En consecuencia, todos los estudios realizados al respecto adolecen de una importante falta de sensibilidad para el diagnóstico de B. suis, una especie cuyo crecimiento es particularmente inhibido por el medio de Farrell (de Miguel et al., 2011). Además, el tipo y naturaleza de las muestras sometidas a estudio bacteriológico es de importancia trascendental para obtener la máxima sensibilidad diagnóstica. En trabajos similares se han utilizado exclusivamente el bazo y tonsilas (Godfroid et al., 1994; Grégoire et al., 2012), lo que puede explicar la relativamente baja frecuencia de aislamientos obtenidos. En otros estudios, por el contrario, la eficacia diagnóstica ha sido considerablemente superior al utilizarse diversas muestras y tejidos de cada animal (Bergagna et al., 2009; Cvetnić et al., 2003; Cvetnić et al., 2009; Hinić et al., 2009; Leuenberger et al., 2007; Wu et al., 2011). En nuestro caso hemos procurado, en la medida de lo posible, tomar muestras de diferentes órganos y tejidos (tabla 16), en asociación con los mejores medios de cultivo y de las condiciones de siembra (de Miguel et al., 2011), para obtener la máxima probabilidad de aislamiento. De esta manera, la infección por B. suis biovar 2 se ha demostrado prácticamente en un tercio de los jabalíes sometidos a estudio (tabla 11), que puede considerarse solo como moderada. Sin embargo, cuando el número y calidad de las muestras eran altos, la eficacia diagnóstica aumentó considerablemente. De particular relevancia es el número de muestras examinadas de cada animal, ya que cuando se sometieron a estudio bacteriológico entre 4 y 5 muestras por cada animal, la frecuencia de aislamiento fue muy elevada, oscilando entre el 65,38 y el 80% (tabla 17). Además, la experiencia en la recogida de muestras es de una importancia crucial, ya que la frecuencia de aislamiento disminuyó a más de la mitad (p<0,001) cuando la muestra fue tomada por personas ajenas a nuestro grupo de investigación (tabla 15). Esta mayor frecuencia de aislamiento por nuestra parte, podría deberse también a la mejor atención y cuidado que nosotros dedicamos a la hora de tomar las muestras, evitando la contaminación con bacterias saprofitas que dificultan el posterior aislamiento de B. suis biovar 2 (de Miguel et al., 2011). Las muestras tomadas por nosotros, además, fueron refrigeradas inmediatamente, procediéndose a su posterior congelación en el menor tiempo posible para evitar procesos de autolisis. Es importante considerar que la Discusión 112 congelación de las muestras no modifica significativamente el aislamiento microbiológico de B. suis biovar 2 con respecto a la utilización de muestras frescas (Hinić et al., 2009). En cualquier caso, la eficacia final del diagnóstico bacteriológico ha sido muy próxima a la obtenida en estudios realizados con metodología similar (Cvetnić et al., 2003; Muñoz et al., 2010), pero muy superior a la obtenida en otros estudios que han utilizado estrategias diferentes y que presentan los importantes problemas metodológicos y conceptuales mencionados antes (Closa-Sebastià et al., 2010; Gennero et al., 2006; Grégoire et al., 2012; Wu et al., 2011). Nuestros resultados microbiológicos guardaron, en general, un estrecho paralelismo con los resultados serológicos. En este sentido, una de nuestras principales preocupaciones era la especificidad de la estrategia utilizada y, más concretamente, determinar si la frecuencia de aislamiento hubiese aumentado significativamente en el caso de haber analizado también todos los animales seronegativos en el iELISA. Sin embargo, en los 9 animales seronegativos que fueron encontrados muertos y que analizamos bacteriológicamente (un número adecuado de muestras de elevada calidad), no fuimos capaces de obtener aislamiento alguno. Además, para asegurarnos de la adecuada especificidad de nuestra estrategia, las muestras de órganos y tejidos de un total de 50 jabalíes seronegativos tomados al azar fueron sometidos a cultivo, resultando siempre cultivo negativo en todos los casos (resultados no mostrados), demostrando en consecuencia que la estrategia usada fue correcta. B. suis biovar 2 fue aislada en 28 de las 33 comarcas que componen Aragón, quedando por tanto demostrada su amplia distribución, que parece encontrarse perfectamente distribuida en la totalidad de Aragón, al igual que ocurre en la península ibérica (Muñoz et al., 2010) y, en general, en toda Europa (Algers et al., 2009). En sincronía con los resultados del estudio serológico, existió también mucha variabilidad en la frecuencia de aislamientos en las diferentes comarcas (figura 10, tabla 11). Como se ha comentado antes para el caso del estudio serológico, son diversos los factores comunes que podrían explicar también la variación en la frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 entre comarcas. Además de la gran importancia ya comentada del número, origen y calidad de las muestras, la diferente seroprevalencia y el número de cultivos realizados por comarca, podrían explicar también las diferencias obtenidas. Las comarcas con elevada frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 poseían, en general, Discusión 113 una elevada seroprevalencia y, por tanto, una mayor cantidad de muestras adecuadas para cultivo (tablas 6 y 10). A diferencia de lo ocurrido con los resultados serológicos, no fuimos capaces de poner en evidencia diferencias significativas en la frecuencia de aislamientos en función del sexo y edad de los jabalíes, si bien esta fue algo mayor en los machos que en las hembras y en los animales jóvenes que en los adultos (tablas 12 y 13). Los tejidos más utilizados fueron el linfonodo mandibular, el bazo, el testículo y el epidídimo, pero también otros órganos y tejidos. Las frecuencias de aislamiento más elevadas se obtuvieron en el linfonodo mandibular, mamario y escrotal, así como en el bazo y epidídimo (tabla 16). En consecuencia, estos deberían ser considerados como los órganos de elección para el aislamiento de B. suis biovar 2 en el jabalí, y demuestran la relativamente elevada frecuencia de infección de los órganos del aparato genital en esta especie. Esto coincide plenamente con lo descrito en otros estudios (Hinić et al., 2009; Leuenberger et al., 2007; Wu et al., 2011), y ratifican que la vía genital puede jugar un papel determinante en la transmisión de B. suis biovar 2 en el jabalí. Por otro lado, la elevada frecuencia de aislamiento de B. suis biovar 2 en los linfonodos mandibulares sugiere que la mucosa oral podría ser una de las principales vías de entrada, en sincronía con los hábitos alimentarios del jabalí, que suele ingerir los fetos abortados y las envolturas fetales (Abril et al., 2011; Olsen et al., 2012). Otro resultado destacable fue la elevada frecuencia de aislamientos en los linfonodos mamarios (tabla 16). Las infecciones por Brucella en los animales tienden a cronificarse y localizarse de una manera particularmente frecuente en los linfonodos mamarios, con la subsiguiente excreción en la leche (Enright, 1990; Rhyan et al., 2009; Rhyan, 2013; Thoen et al., 1993). Esta excreción en leche podría ocurrir también en el jabalí, constituyendo una importante vía de transmisión. El bazo es seguramente el órgano que con mayor frecuencia se muestrea en los programas de vigilancia sanitaria en fauna silvestre, siendo muy útil para el diagnóstico etiológico de diferentes patologías (Arnal, 2011; RASVE, 2011; Revilla, 2012). En nuestro estudio, aunque generalmente no ha sido tan adecuado como los linfonodos descritos antes, el bazo es también un órgano que proporcionó una buena sensibilidad para el diagnóstico de B. suis biovar 2. La frecuencia de aislamientos que nosotros obtuvimos en bazo fue mayor que la obtenida en otros estudios, pero estos usaron una metodología diferente (Grégoire et al., 2012; Wu et al., 2011). Discusión 114 Todas las cepas aisladas se identificaron como Brucella spp. mediante técnicas de microbiología convencional (Alton et al., 1988), así como a través del análisis de su ADN (Closa-Sebastià et al., 2010; Grégoire et al., 2012; Muñoz et al., 2010; Nielsen, 2012). Todas las cepas aisladas fueron identificadas definitivamente como B. suis biovar 2. Las cepas aisladas fueron caracterizadas genéticamente mediante PCR-RFLP’s de los genes Omp31, Omp2a y Omp2b (Cloeckaert et al., 1995; Vizcaíno et al., 1997), una técnica que permite una diferenciación precisa de los 6 haplotipos descritos hasta ahora para la biovar 2 de B. suis (Muñoz et al., 2010). Ninguna de las cepas aisladas se correspondió con el haplotipo característico de la cepa Thomsen de referencia. Este haplotipo se aísla con cierta frecuencia en diferentes países europeos, pero nunca ha sido puesto en evidencia en España. Además, ninguna de las cepas aisladas presentó el genotipo característico de la cepa ibérica minoritaria (aislada en el sur de España), ni se correspondió con ninguno de los dos haplotipos de liebre europea Lepus europaeus identificados en Europa (Blasco, J.M. comunicación personal; Ferrão-Beck et al., 2006; García-Yoldi et al., 2007; Muñoz et al., 2010). Los dos genotipos de B. suis biovar 2 identificados en nuestro estudio fueron exclusivamente el ibérico mayoritario y el centroeuropeo, el segundo predominando ampliamente sobre el primero. Ambos haplotipos ya habían sido descritos anteriormente en jabalíes en Aragón (Martínez et al., 2010; Muñoz et al., 2010) y, en el caso del centroeuropeo, también en otros países europeos (Ferrão-Beck et al., 2006; García-Yoldi et al., 2007). Sin embargo, a diferencia de lo observado en Aragón, el haplotipo centroeuropeo nunca ha sido puesto en evidencia en las regiones del sur de España, en las que, hasta ahora, se han aislado exclusivamente los dos haplotipos ibéricos (Muñoz et al., 2010). La distribución del haplotipo centroeuropeo de B. suis biovar 2 en jabalí en Aragón muestra un patrón muy homogéneo, estando diseminado por todas las comarcas en las que se obtuvieron aislamientos. Sin embargo, la distribución del haplotipo ibérico mayoritario fue más restringida, estando presente tan solo en 7 comarcas ubicadas por el centro y noreste de Aragón (figura 15). El haplotipo centroeuropeo ha sido descrito como responsable de brotes de brucelosis en porcino doméstico en Croacia y Francia y aislado también en jabalí en Alemania, Bélgica, Francia, Italia y Suiza (García-Yoldi et al., 2007). Este haplotipo acaba de ser recientemente identificado también como responsable de un brote de brucelosis en porcino doméstico en Aragón (Blasco, J.M. comunicación personal). Por el contrario, ninguno de los haplotipos ibéricos ha sido aislado fuera de España, salvo en dos casos (Rumanía y Polonia), y ambos relacionados con una exportación de cerdos procedentes de España (Blasco, J.M. comunicación personal). El Discusión 115 haplotipo ibérico mayoritario es el responsable de la inmensa mayoría de los actuales brotes de brucelosis porcina que ha ocurrido recientemente en las explotaciones españolas (Blasco, J.M. comunicación personal). La presencia de ambos genotipos de B. suis biovar 2 en Aragón podría tener diferentes explicaciones. El haplotipo ibérico mayoritario podría haber existido siempre de forma natural, tal y como ocurre en el sur del país, o bien, podría haberse introducido en Aragón a través de movimientos de jabalíes desde zonas del sur de España (Soriguer et al., 1998). Aunque bastante improbable por la naturaleza de nuestra producción porcina intensiva, el jabalí en Aragón podría haberse infectado a través del contacto con materiales contaminados procedentes de explotaciones de porcino intensivo infectadas con este genotipo. El haplotipo centroeuropeo podría igualmente haber existido siempre de forma natural. Otra posibilidad podría ser consecuencia de los movimientos transpirenaicos de la especie y del contacto con jabalíes infectados procedentes de Europa, puesto que este animal es capaz de realizar desplazamientos importantes (Rosell et al., 2001). En cualquier caso, con los datos que poseemos hasta ahora no podemos concluir si la infección del jabalí se originó a partir de los cerdos domésticos infectados o el caso inverso, que parece una hipótesis mucho más plausible por la existencia de un claro ciclo silvestre, al menos para la biovariedad 2 de B. suis (Algers et al., 2009). Algunas de estas hipótesis serán seguramente confirmadas en los próximos años, cuando se conozcan los resultados de los estudios en curso y basados en el análisis de marcadores moleculares más sensibles (como por ejemplo los VNTR) sobre un número importante de cepas de B. suis biovar 2 aisladas de jabalíes, liebres europeas y cerdos domésticos en los diferentes países europeos. Las lesiones observadas en el jabalí infectado por B. suis biovar 2 son esencialmente las mismas que las descritas en el porcino doméstico (Algers et al., 2009; Enright, 1990; Olsen et al., 2012). En estudios similares al nuestro, la existencia de lesiones relacionadas con la brucelosis no fue investigada (Bergagna et al., 2009; Leuenberger et al., 2007; Muñoz et al., 2010), o bien, se concluyó en una ausencia de lesiones macroscópicas compatibles con la enfermedad (Godfroid et al., 1994; Grégoire et al., 2012; Wu et al., 2011). En consecuencia, es aceptado ampliamente que B. suis biovar 2 puede aislarse en tejidos de animales sanos sin lesiones evidentes (Godfroid, 2002), lo que es interpretado por algunos como un indicador de la baja patogenicidad de esta bacteria para el jabalí. Sin embargo, con una frecuencia baja, algunos estudios han descrito la presencia de Discusión 116 lesiones macroscópicas en jabalíes infectados por B. suis biovar 2, sobre todo orquitis y epididimitis (Cvetnić et al., 2003; Garin-Bastuji et al., 2000). Por ello, más que a la baja patogenicidad de B. suis biovar 2, la escasa frecuencia de lesiones evidenciada en los jabalíes infectados podría ser debida simplemente a que en la mayoría de estudios de campo realizados, las muestras han sido tomadas por personas sin ninguna experiencia clínica (cazadores y guardas de caza), y por tanto, las lesiones pueden pasar desapercibidas. Nuestro estudio resultó también en una baja frecuencia de lesiones macroscópicas compatibles con la enfermedad ya que tan solo identificamos 3 casos con lesiones macroscópicas sospechosas, dos de los cuales fueron confirmados perfectamente mediante aislamiento bacteriológico a partir del tejido lesionado y mediante inmunohistoquímica, que reveló la presencia de B. suis en el interior de células fagocíticas (figura 17). La presencia de lesiones en el epidídimo de ambos jabalíes, junto a la elevada frecuencia de aislamientos realizados en epidídimo (tabla 16) que no presentaban lesiones aparentes macroscópicamente, sugiere que la vía genital juega un papel importante en la transmisión de B. suis en el jabalí, de igual manera que ocurre en el porcino doméstico (Acha & Szyfres, 2001; Olsen et al., 2012). La consecuencia de estas lesiones genitales podría ser una esterilidad temporal o permanente según el grado de lesión, que podría actuar como un factor regulador de la dinámica poblacional del jabalí. 5.2.- ESTUDIOS EN LA LIEBRE En Aragón existen dos especies de liebre, la ibérica Lepus granatensis que está extendida prácticamente en toda la región, y la europea Lepus europaeus, cuyo límite inferior de distribución en Europa se sitúa precisamente en el norte de España, incluyendo el prepirineo aragonés (Palacios & Meijide, 1979). El número de muestras obtenido durante el periodo de estudio ha sido muy reducido, particularmente en el caso de la liebre europea, por lo que, lamentablemente, en varias comarcas no nos ha sido posible obtener muestras (tabla 2). Por esta razón, para dimensionar el estudio al máximo, se decidió utilizar la seroteca y el banco de tejidos del grupo SEDIFAS, ubicados en la FVUZ. El mayor número de muestras analizadas correspondió a la liebre ibérica, lógica consecuencia de la rareza y limitado rango de distribución de la liebre europea en nuestra región, especie poco abundante y restringida a la zona pirenaica (Ballesteros et al., 1996). Desde mediados de 1960, la población de liebre europea está Discusión 117 disminuyendo en Europa, hasta el punto que la especie está ya considerada en peligro de extinción en algunos países (Misiorowska & Wasilewski, 2012). Diversos factores podrían explicar su declive como la intensificación agrícola, el uso de productos químicos, la pérdida de biodiversidad, el aumento del número de predadores y las enfermedades, entre las que la infección por B. suis biovar 2 podría ser relevante, ya que afecta con cierta frecuencia a esta especie, provocándole serias consecuencias patológicas (Algers et al., 2009; Gyuranecz et al., 2011; Stĕrba, 1982). Quedan ya muy pocos cazadores de liebre europea en el Pirineo, por lo que la mayoría de liebres europeas a las que pudimos acceder correspondían a animales encontrados muertos por traumatismos al borde de carreteras y, en muy pocos casos, se trataba de animales cazados. Esta actividad cinegética precisa de un buen estado físico así como de un perro adiestrado específicamente para este tipo de liebre. Por el contrario, la población de liebre ibérica en Aragón, aunque fragmentada por las modificaciones del medio natural, es estable y relativamente importante (Gortázar et al., 2007b; Purroy, 2011), lo que nos permitió acceder a un número relativamente elevado de muestras para estudiar el problema en esta especie. Un problema esencial para la realización de estudios de prevalencia de enfermedades en fauna silvestre reside en la elección de la metodología corecta de análisis. Como se ha indicado antes, el diagnóstico directo de la brucelosis basado en el aislamiento e identificación del agente patógeno involucrado es la única prueba diagnóstica incontestable y totalmente específica (Nielsen, 2012). Sin embargo, el cultivo de muestras es muy costoso y complicado para ser llevado a cabo a nivel poblacional y a gran escala, por lo que para determinar la extensión de este proceso patológico en fauna silvestre se recurre a métodos diagnósticos indirectos, y particularmente, a los estudios serológicos. En la práctica totalidad de estos estudios en fauna silvestre, y con muy pocas excepciones (Muñoz et al., 2010), se han aplicado directamente las pruebas serológicas desarrolladas para el ganado doméstico, sin realizarse ningún estudio previo de validación en la especie objeto de estudio. En consecuencia, la inmensa mayoría de los estudios serológicos de brucelosis en fauna silvestre, particularmente aquellos realizados con tests diagnósticos cuantitativos, son inadecuados desde el punto de vista metodológico. En segundo lugar, otro de los problemas esenciales de este tipo de estudios en fauna silvestre reside en la calidad del suero. En el caso de la liebre esto es un factor limitante, ya que por el tipo de caza y la obtención de las muestras, la inmensa Discusión 118 mayoría de sueros que se obtuvieron presentaron un elevado grado de hemolisis, que imposibilita su estudio a través de determinadas técnicas diagnósticas. En el caso de la brucelosis, la hemolisis del suero impide la aplicación de técnicas de aglutinación rápida como la de RBT, que es una técnica reconocida universalmente para el diagnóstico de brucelosis en la práctica totalidad de especies de mamíferos incluida la liebre (GarinBastuji & Blasco, 1997; Stĕrba & Halacková, 1987). De hecho, en algunos estudios se han usado estas técnicas de aglutinación, pero para ello resultó imprescindible tomar el suero inmediatamente después de la muerte del animal (Baldone et al., 2004; Frölich et al., 2003; Treml et al., 2007; Winkelmayer et al., 2005), algo inaplicable en nuestras condiciones de trabajo. Por esta razón, y puesto que los enzimo-inmunoensayos (ELISA) permiten analizar sueros con alto grado de hemolisis (Neumann & Bonistalli, 2009), y son utilizados frecuentemente para la determinación de la seroprevalencia de la infección en animales silvestres (Davison et al., 2011; Köppel et al., 2007; Lynch et al., 2011; Truong et al., 2011), decidimos utilizar un ELISA. Los ELISA indirectos (iELISA) precisan de conjugados frente a las inmunoglobulinas específicas de la especie animal a estudiar, que no están disponibles comercialmente en la inmensa mayoría de casos. Los resultados de algunos trabajos sugieren que un iELISA con un conjugado policlonal anti-IgG de conejo sería eficaz para la detección de anticuerpos frente a Brucella (Szulowski et al., 1999), y otros patógenos (Frölich et al., 2003; Gustafsson & Uggla, 1994; Hotta et al., 2012) en sueros de liebre. Sin embargo, en nuestras condiciones, este conjugado heterólogo no fue capaz de detectar inmunoglobulinas específicas en nuestra población de sueros gold standard procedentes de liebres hiperinmunizadas con B. suis. Ante la ausencia de dichos conjugados comerciales, en algunos casos se ha recurrido a utilizar otras pruebas como el enzimo-inmunoensayo de bloqueo o competición (cELISA) o incluso la polarización de fluorescencia (FPA), que no precisan de conjugados específicos de la especie a estudiar (Bártová et al., 2010; Gall et al., 2000; Lynch et al., 2011; Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2005), pero que no han sido validados adecuadamente en liebres, ni en ninguna otra especie silvestre. Considerando el elevado grado de hemolisis de nuestras muestras (que imposibilitaba la aplicación de técnicas sencillas como la de RBT) y la ausencia de una adecuada validación en liebre de otras pruebas diagnósticas de potencial aplicación multi-especie tales como el cELISA y FPA, decidimos utilizar un iELISA, que lógicamente, debería ser validado previamente para esta finalidad. Puesto que