Repositorio Institucional de Documentos

2014 73 Cristina Costana Duque Royo Estrategias para el rescate de ovocitos humanos inmaduros tras estimulación ovárica controlada en tratamientos de reproducción asistida Departamento Director/es Patología Animal Stojkovic, Miodrag Cervera Juanes, Rita Pilar Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Cristina Costana Duque Royo ESTRATEGIAS PARA EL RESCATE DE OVOCITOS HUMANOS INMADUROS TRAS ESTIMULACIÓN OVÁRICA CONTROLADA EN TRATAMIENTOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Director/es Patología Animal Stojkovic, Miodrag Cervera Juanes, Rita Pilar Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria Departamento de Patología Animal “Estrategias para el rescate de ovocitos humanos inmaduros tras estimulación ovárica controlada en Tratamientos de Reproducción Asistida” TESIS DOCTORAL Cristina C. DUQUE ROYO Zaragoza, 2014 Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria Departamento de Patología Animal “Estrategias para el rescate de ovocitos humanos inmaduros tras estimulación ovárica controlada en Tratamientos de Reproducción Asistida” TESIS DOCTORAL Presentada por: Cristina C. DUQUE ROYO Dirigida por: Rita P. CERVERA JUANES Miodrag STOJKOVIC Zaragoza, 2014 ! Los trabajos experimentales de esta tesis quedaron incluidos en el proyecto “Derivation of human stem cell lines using nuclear transfer and parthenogenetically activated oocytes” aprobado por el Instituto de Salud Carlos III y llevado a cabo en el Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF, Valencia, España). Además contó con la aprobación del Comité de Ética e Investigación del Hospital Universitari i Politécnic La Fe de Valencia. FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Patología Animal Dra. Rita P. CERVERA JUANES, Investigador Sénior Asociado del Departamento de Neurociencias del Oregon National Primate Research Center (Oregon Health and Science University), Portland (Oregon, US) y Dr. Miodrag STOJKOVIC, Profesor del Departamento de Genética Humana de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Kragujevac, Serbia, como Directores, CERTIFICAN: Que Dª. Cristina C. DUQUE ROYO ha realizado bajo nuestra dirección los trabajos correspondientes a su Tesis Doctoral titulada “Estrategias para el rescate de ovocitos humanos inmaduros tras estimulación ovárica controlada en tratamientos de Reproducción Asistida” que se ajusta totalmente al Proyecto de Tesis presentado y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza (Facultad de Veterinaria), por lo que autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Y para que conste, firmamos el presente certificado. Portland, 20 de Marzo de 2014 Kragujevac, 20 de Marzo de 2014 Dra. R.P. Cervera Juanes Dr. M. Stojkovic En estas líneas pretendo expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que me han ayudado en esta etapa tan importante de mi vida. A la Dra. Rita P. Cervera Juanes, directora de esta tesis, por haber confiado plenamente en mi, incluso desde la distancia. Por haberme guiado en todo momento y por haber compartido conmigo sus conocimientos y sobre todo, su amistad. Al Dr. Miodraj Stojkovic, co-director de esta tesis, por haberme abierto las puertas de su laboratorio y haberme hecho partícipe de su proyecto. Por sus palabras de ánimo y por estar siempre que lo he necesitado. Al Dr. Alberto Romeu Sarrió, mi maestro, mi amigo, gracias por introducirme en este maravilloso mundo de la Reproducción Humana, me hiciste cambiar de especie. Gracias por haber “peleado” tanto por mí. Al Profesor Fernando García Ximénez, mentor de mi mentora, sabios consejos en el mejor formato. A la Dra. Mª Victoria Falceto Recio y al Dr. Daniel Salamone, porque todo esto empezó a gestarse con vosotros. A mis compañeros de la Unidad de Reproducción Humana Asistida del Hospital Universitario la Fe de Valencia: Luisa, Pedro, Inma, Marina, Irene, Juanvi y Patri. Gracias por enseñarme tantas cosas, por todo vuestro apoyo en la realización de esta tesis y por todos los momentos que pasamos juntos. También a Carmen, Elisa, Estrella, Anita, Mamen, Rosa, Tere, Mercedes... gracias a todas por haberme cuidado mucho todo este tiempo. Gracias Luci, te quiero. En general, a todo el personal del Servicio de Reproducción Humana del Hospital Universitario la Fe de Valencia donde he pasado unos años estupendos. A mis compañeros del Centro de Investigación de Tecnología Agraria (CITA): Elenica, Nacho, Alberto, Empar y Migue, porque entre ovarios andaba el juego. A mis compañeros del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF): Darío, Nuria, y Eva. Gracias. A todos mis amigos y familiares que en algún momento han padecido los efectos colaterales de escribir una tesis. En especial a Javi, por estar siempre de forma incondicional, por ayudarme, por allanarme el camino, por tu complicidad, por todo. Gracias. A mis padres, a mis hermanos. Nobleza obliga. A Julia y Jaime. Gracias. ! Índice - VI 2. Estimulación del DFM: empleo de gonadotropinas………………………………. 43 3. Inducción de la ovulación…………………………………………………………. 44 IV.1.2 Técnicas de inseminación ovocitaria…………………………………………...... 45 1. FIV convencional o técnica de microgota………………………………………… 45 2. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides……………………………....... 45 IV.2 Maduración in vitro de ovocitos procedentes de ovarios no estimulados……………... 46 IV.2.1 Pacientes con síndrome de ovario poliquístico………………………………....... 46 IV.2.2 Protocolos de MIV……………………………………………………………….. 47 1. FSH priming………………………………………………………………………. 47 2. hCG priming………………………………………………………………………. 48 3. FSH + hCG priming………………………………………………………………. 48 IV.2.3 Condiciones de cultivo in vitro………………………………………………....... 51 V. Maduración in vitro de ovocitos procedentes de ciclos de estimulación ovárica……....... 55 V.1 MIV de ovocitos procedentes de ovarios estimulados………………………………….. 55 V.2 Avances en la MIV de ovocitos MI………………………………….…………………. 55 V.3 Avances en la MIV de ovocitos VG……………………………………………………. 58 V.4 Empleo de inhibidores meióticos……………………………………………………….. 58 Inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 3 (IPDE3)……………………………………………. 59 V.5 Co-cultivo de ovocitos VG procedentes de EO con células del cúmulo..……………… 60 VI. Activación ovocitaria……………………………………………………………………… 63 VI.1 Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide………………………………… 63 VI.2 Activación ovocitaria artificial (activación partenogenota, AP).……………………… 66 VI.2.1 Agentes activadores inductores del incremento del Ca2+ intracelular……………. 66 VI.2.2 Agentes inhibidores de la síntesis o fosforilación proteica: inhibidores del MPF.. 67 1. Inhibidores de la síntesis proteica…………………………………………………. 68 2. Inhibidores de la fosforilación proteica…………………………………………… 68 VI.3 Aplicaciones de la activación ovocitaria artificial…………………………………....... 69 VI.3.1 Aplicaciones en clínica…………………………………………………………... 69 VI.3.2 Aplicaciones en investigación……………………………………………………. 69 II. Objetivos…………………………………………………………………………………….. 71 III. Material y Métodos I. Obtención y recuperación de los ovocitos………………………………………………….. 73 I.1 Protocolo de estimulación ovárica...…………………………………………………....... 73 I.2 Recuperación de los ovocitos……………………………………………………………. 74 II. Diseño experimental……………………………………………………………………....... 75 II.1 Experimento 1.1 Competencia nuclear y citoplasmática en ovocitos VG y MI tras su maduración in vitro en diferentes medios de maduración ………………………………….. 75 1. Tasa de maduración in vitro………………………………………………………. 77 2. Volumen citoplasmático ………………...…………………................................... 77 3. Configuración del aparato meiótico (spindle)…………………………………….. 77 ! Índice - VII 4. Tasa de activación y desarrollo embrionario tras activación partenogenota……… 80 II.1 Experimento 1.2: Efecto del ITS sobre la maduración nuclear………………...……… 82 II.2 Experimento 2: Cuantificación del número de copias de ADN mitocondrial tras la maduración in vitro en diferentes medios de maduración…………………………………... 82 1. Extracción del ADN total ...………………………………………………………. 82 2. Preparación de los estándar externos……………………………………………… 82 3. Cuantificación del número de copias de ADNmt mediante PCR a tiempo real…... 83 II.3 Experimento 3: Efecto del medio de maduración in vitro sobre la expresión génica en ovocitos VG………...……………………………………………………………………….. 84 1. Extracción del ARN ovocitario…………………………………………………… 84 2. Transcripción reversa……………………………………………………………... 84 II.4 Experimento 4: Efecto del bloqueo temporal de la maduración nuclear sobre la competencia citoplasmática y capacidad de desarrollo de ovocitos VG………………………... 87 1. Adición de la CT al medio de maduración………………………………………... 87 2. Tasa de maduración in vitro………………………………………………………. 87 II.5 Experimento 5: Co-cultivo de ovocitos VG con células del cúmulo.…………………... 88 1. Aislamiento y tratamiento de las células del cúmulo……………………………... 88 2. Co-cultivo tridimensional…………………………………………………………. 89 3. Medio de cultivo para la maduración ovocitaria………………………………...... 89 4. Activación y desarrollo embrionario tras AP……………………………………... 90 II.6 Experimento 6: Derivación de líneas de células madre embrionarias partenogenotas humanas (hpESC)…………………………………………………………………………… 90 1. Activación partenogenota…………………………………………………………. 91 2. Aislamiento y cultivo de células madre…………………………………………… 91 3. Caracterización de las hpESC……………………………………………………... 92 3.1 Detección de marcadores de totipotencia mediante inmunofluorescencia…... 92 3.2 Análisis del perfil de expresión génica………………………………………. 93 3.3 Cariotipado…………………………………………………………………… 94 3.4 Capacidad de diferenciación in vitro e in vivo……………………………...... 94 3.5 Actividad telomerasa………………………………………………………… 95 III. Análisis de los resultados………………………………………………………………...... 96 IV. Resultados………………………………………………………………………………….. 97 V. Discusión…………………………………………………………………………………….. 119 VI. Conclusiones……………………………………………………………………………….. 139 VII. Limitaciones………………………………………………………………………………. 143 VIII. Perspectivas de futuro…………………………………………………………………... 145 IX. Referencias bibliográficas………………………………………..……………………….. 147 X. Índice de abreviaturas…...…………………………………………………………………. 169 ! Índice de Figuras-IX Índice de Figuras Figura 1: Formación de las gónadas y colonización de las células germinales. a) Localización de la cresta genital. b) Formación de la rete ovarii y cordones sexuales secundarios ………………………………………………………………………………… 1 Figura 2: Ovogénesis………………………………………………………………………. 3 Figura 3: Descenso en el número de folículos primordiales desde el nacimiento hasta la menopausia……………………………………………………………………………….... 4 Figura 4: Etapas y control hormonal del desarrollo folicular……………………………… 6 Figura 5: Emparejamiento cúmulo-ovocito mediante proyecciones transzonales y uniones tipo gap…………………………………………………………………………………….. 7 Figura 6: Cascada de señalización de los factores paracrinos entre el ovocito y las células del cúmulo………………………………………………………………………………….. 9 Figura 7: Vía de regulación del arresto meiótico del ovocito en el folículo antral………… 13 Figura 8: Cascada de señalización responsable del arresto meiótico del ovocito en el folículo antral………………………………………………………………………………. 15 Figura 9: Cascada de señalización desencadenada por el estímulo preovulatorio de LH…. 16 Figura 10: Cascada de activación de la MAPK……………………………………………. 17 Figura 11: Activación de la MAPK y MPF en las células foliculares/ovocito como respuesta al estímulo ovulatorio……………………………………………………………. 19 Figura 12: Disolución de la VG……………………………………………………………. 20 Figura 13: Mecanismo de regulación de la fosforilación de las lamininas nucleares y de la integridad de la membrana nuclear durante la GVBD……………………………………... 20 Figura 14: Imagen de microscopía confocal de un ovocito humano MII………………….. 22 Figura 15: Imagen de microscopía confocal de ovocitos humanos………………………... 23 Figura 16: Regulación de la separación y segregación de cromosomas homólogos durante la meiosis ovocitaria……………………………………………………………………… 24 Figura 17: Mecanismo de control de la cohesión y separación de cromosomas homólogos durante la meiosis I………………………………………………………………………… 25 Figura 18: Representación de la protusión del capuchón cortical y la inducción del surco mediado por el aparato meiótico (zona media) durante la extrusión del CP………………. 26 Figura 19: Representación de la variación de los niveles de MAPK y MPF a lo largo de la progresión meiótica ovocitaria……………………………………………………………... 28 Figura 20: Resumen de la distribución de las organelas citoplasmáticas y del citoesqueleto durante la maduración ovocitaria (A) y redistribución de las organelas citoplasmáticas en un ovocito MII maduro nuclearmente pero inmaduro a nivel citoplasmático (B)………………………………………………………………………….. 30 Figura 21: Representación esquemática de las vías de producción de energía en el ovocito 34 Figura 22: Protocolos de administración de los a-GnRH………………………………….. 40 Figura 23: Protocolos de administración de los ant-GnRH………………………………... 41 ! Índice de Figuras-X Figura 24: Protocolos de administración de gonadotropinas………………………………. 43 Figura 25: Cambios acontecidos en el RE durante la maduración ovocitaria que permiten la activación del ovocito tras la fecundación………………………………………………. 64 Figura 26: Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide. Teoría del receptor…… 65 Figura 27: Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide. Teoría del factor espermático………………………………………………………………………………… 65 Figura 28: Ovocitos en estadio de a) MII, b) MI y c) VG…………………………………. 74 Figura 29: Montaje de los ovocitos para el estudio del aparato meiótico………………….. 79 Figura 30: Imágenes de microscopía confocal que muestran una configuración normal del complejo aparato meiótico/cromosomas tanto de ovocitos MII in vivo (a, b y c) como ovocitos MII miv (d, e y f)…………………………………………………………………. 80 Figura 31: Imágenes de microscopía confocal que muestran una configuración alterada del complejo aparato meiótico/cromosomas en ovocitos MII miv………………………… 80 Figura 32: Ovocitos activados partenogenotamente……………………………………….. 81 Figura 33: Evolución del proceso de co-cultivo de ovocitos inmaduros VG con células del cúmulo y posterior AP y desarrollo embrionario………………………………………. 90 Figura 34: Tasa de maduración in vitro de ovocitos VG y MI tras el cultivo en los tres medios de maduración……………………………………………………………………... 97 Figura 35: Imagen de microscopía confocal de un ovocito HOM-miv VG que muestra una configuración alterada del complejo aparato meiótico/cromosomas………………….. 99 Figura 36: Imagen de microscopía confocal de un ovocito MI 4h que muestra una configuración del complejo aparato meiótico/cromosomas en anafase……………………. 100 Figura 37: Tasa de maduración in vitro de ovocitos VG cultivados en los medios HOM y 199s, suplementado o no con ITS………………………………………………………….. 104 Figura 38: Comparación del número de copias de ADNmt en ovocitos inmaduros VG y MI antes y después de su MIV……………………………………………………………... 105 Figura 39: Número de copias de ADNmt en ovocitos miv en los tres medios de maduración establecidos…………………………………………………………………… 106 Figura 40: Expresión del producto del gen HPRT y ausencia de expresión en el caso de las muestras blanco………………………………………………………………………… 107 Figura 41: Expresión génica en ovocitos MII in vivo para RFSH, RLH, REGF, EGF y TGF α ………………………………………………………………………………………. 108 Figura 42: Expresión de REGF en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados…………………………………………………. 108 Figura 43: Expresión de EGF en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados…………………………………………………. 109 Figura 44: Expresión de TGF α en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados…………………………………………………. 109 Figura 45: Morfología de las células del cúmulo cultivadas en matriz de colágeno 3D…... 112 Figura 46: Co-cultivo de células del cúmulo en matriz de colágeno 3D…………………... 113 ! Índice de Figuras-XI Figura 47: Detalle de proyecciones citoplasmáticas entre células del cúmulo vecinas……. 113 Figura 48: Unión y crecimiento primario de un embrión procedente de la activación de un ovocito MI 4h miv…………………………………………………………………………. 116 Figura 49: Primeros estadios de la derivación de la línea RiMi1………………………….. 116 Figura 50: Caracterización de la línea hpESC RiMi1 para marcadores específicos evaluados mediante inmunocitoquímica (a) y PCR semicuantitativa (b)………………….. 117 Figura 51: a) Actividad PA (barra escala 200 mm). b) Actividad telomerasa. c) Cariotipo. 117 Figura 52: Técnica de inmunocitoquímica para identificar marcadores de ectodermo (btubulina III), mesodermo (desmina) y endodermo (α-fetoproteína) tras la diferenciación del cuerpo embrioide de RiMi1……………………………………………………………. 117 Figura 53: Imagen histológica de los teratomas. Las estructuras identificadas de forma positiva incluyeron: (ne) neuroepitelio; (in) epitelio intestinal, (c) cartílago, (cn) tejido conectivo, (cy) quistes y (gl) cavidades llenas de líquido con un epitelio tipo glandular. Tinción hematoxilina/eosina (barras escala 150 mm)……………………………………... 118 Figura 54: Efecto de la presencia de ITS en el medio de cultivo sobre la maduración ovocitaria nuclear (VG)……………………………………………………………………. 123 ! Índice de Figuras-XII ! Índice de Tablas-XIII Índice de Tablas Tabla 1: Resultado de los ciclos de MIV en pacientes con ciclos regulares…………………... 49 Tabla 2: Resultado de los ciclos de MIV en pacientes con SOP………………………………. 50 Tabla 3: Tasa de MIV de ovocitos MI obtenidos tras tratamientos de EO en función del periodo de CIV………………………………………………………………………………… 56 Tabla 4: Tasa de MIV de ovocitos MI obtenidos tras tratamientos de EO tras diferentes periodos de CIV………………………………………………………………………………... 56 Tabla 5: Tasa de fecundación tras la microinyección de ovocitos MI miv……………………. 57 Tabla 6: Resumen de los distintos protocolos de activación empleados en la especie humana.. 69 Tabla 7: Composición de los medios IVF, 199s y HOM……………………………………… 76 Tabla 8: Soluciones empleadas para la tinción inmunocitoquímica de microtúbulos y microfilamentos………………………………………………………………………………... 78 Tabla 9: Secuencia de oligonucleótidos de los primers utilizados para la RT-PCR…………... 86 Tabla 10: Número de efectivos incluidos en los grupos de activación………………………... 91 Tabla 11: Composición de los medios de cultivo de HFFs y MCI/hpESC……………………. 92 Tabla 12: Secuencia de oligonucleótidos de los primers utilizados para la PCR……………… 94 Tabla 13: Diámetro/Volumen ovocitarios en diferentes estadios de maduración y tras maduración in vitro en los tres medios de maduración ensayados…………………………….. 98 Tabla 14: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos VG madurados in vitro con los tres medios de maduración ensayados……………………………. 99 Tabla 15: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos MI 4h madurados in vitro con los tres medios de maduración ensayados………………………… 100 Tabla 16: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos MI 24h madurados in vitro con los tres medios de maduración ensayados……………………….. 101 Tabla 17: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos VG madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados……………………………... 102 Tabla 18: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos MI 4h madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados……………………………... 102 Tabla 19: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos MI 24h madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados……………………………... 103 Tabla 20: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos VG tras su maduración in vitro en el medio HOM y 199s, suplementado o no con ITS…………... 104 Tabla 21: Progresión meiótica en ovocitos VG arrestados temporalmente con diferentes concentraciones de CT seguida de miv durante 48 horas en los medios HOM y 199s………... 110 Tabla 22: Organización de microtúbulos y cromosomas en ovocitos madurados in vivo (control in vivo) y en ovocitos VG que extruyen el 1CP tras una miv de 48 horas en los medios HOM y 199s con y sin presencia del inhibidor CT……………………………………. 111 Tabla 23: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario en ovocitos VG miv en ! Índice de Tablas-XIV HOM y 199s, con y sin presencia de inhibidor CT……………………………………………. 112 Tabla 24: Tasa de maduración, activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos VG tras su miv en co-cultivo 3D ó en su ausencia (sistema microgota)…………….. 114 Tabla 25: Tasa de maduración, activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos VG tras su miv en co-cultivo 3D, en presencia o no del inhibidor meiótico CT…….. 115 Tabla 26: Derivación de hpESC a partir de ovocitos miv y MII in vivo………………………. 115 I. Introducción Introducción-1 I. Introducción I. Gonadogénesis, ovogénesis y foliculogénesis en la especie humana I.1 Gonadogénesis ovárica Al inicio de la 4ª semana de desarrollo embrionario aparece la primera manifestación de las gónadas en forma de un par de eminencias longitudinales o crestas genitales, situadas entre el mesonefros y el mesenterio dorsal (Figura 1a). Éstas se desarrollan por la condensación del mesénquima subyacente y la proliferación del epitelio celómico que lo recubre. Por su parte, las células germinales primordiales, que ya han quedado determinadas en el estadio de mórula (4º día después de la fecundación), se localizan en el extremo caudal del embrión. Entre la 4ª y la 6ª semana de embarazo y siguiendo el trayecto del mesenterio dorsal del intestino posterior, migran mediante movimientos ameboideos hasta alcanzar las crestas genitales (Figura 1a). Aquí, experimentan divisiones mitóticas sucesivas. De forma simultánea, el epitelio celómico penetra el mesénquima subyacente para formar los cordones sexuales primitivos. Se forma así, la gónada indiferenciada, que no pasará a diferenciarse en ovario o testículo hasta la 7ª semana de vida fetal. Por defecto, y en ausencia del factor determinante testicular (TDF), codificado por el gen SRY (sex-determining region) del cromosoma Y (Tho et al., 1992), la gónada indiferenciada formará el ovario. Figura 1: Formación de las gónadas y colonización de las células germinales. a) Localización de la cresta genital. Trayecto de las células germinales hasta alcanzar la cresta genital. b) Formación de la rete ovarii y cordones sexuales secundarios (Reproducido de Sadler TW. Langman´s Medical Embryology. 6th Ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1990: 373; modificado). Cresta genital Cresta genital Células germinales primordiales Tubo neural Intestino posterior Cloaca Mesonefros Mesenterio dorsal Epitelio celómico Embrión de 5-6 semanas Gónada semana 8-10 (a) (b) Médula suprarrenal Corteza suprarrenal Aorta Células germinales primordiales Cordones sexuales secundarios Rete ovarii Introducción-8 Las uniones gap facilitan el aporte crucial de glucosa al ovocito El metabolismo de la glucosa es crucial para los procesos de maduración ovocitaria (capítulo II) y posterior desarrollo embrionario (Sutton-McDowall et al., 2010). La captación de glucosa desde el fluido folicular requiere de la presencia de transportadores de glucosa (GLUT) en la membrana celular (Dan Goor et al., 1997). El ovocito sólo presenta una de las isoformas del transportador de la glucosa (GLUT-1). Además, los ovocitos tienen una menor cantidad de la enzima glicolítica fosfofructoquinasa (Cetica et al., 2002), limitando su capacidad para utilizar este sustrato (Sutton-McDowall et al., 2010). Por otro lado, las células del cúmulo expresan las cuatro isoformas del transportador de glucosa (Dan-Goor et al., 1997), con mayor afinidad por este sustrato y con mayor actividad fosfofructoquinasa que, de forma eficaz, convierte la glucosa en otros sustratos energéticos que sí pueden ser utilizados por el ovocito (Sutton-McDowall et al., 2010; Songsasen, 2012). Las células del cúmulo metabolizan la glucosa a través de la glicólisis y la vía de las pentosas fosfato (PPP) (Songsasen, 2012). La mayor parte de la glucosa es metabolizada en la vía glicolítica para producir adenosín trifosfato (ATP), piruvato y lactato. El piruvato y lactato entran en el ovocito y son metabolizados para producir nuevas moléculas de ATP (Songsasen, 2012). En la vía de las PPP se obtiene dinucleótido adenina nicotinamida (NADH, forma reducida), esencial para la producción de glutation (Sutton-McDowall et al., 2010; García et al., 2010) y ribosa-5fosfato, necesaria para la síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) (Sutton-McDowall et al., 2010). I.3.2 Factores paracrinos secretados por el ovocito Además de las uniones tipo gap, la comunicación ovocito-células del cúmulo está también mediada por factores paracrinos (Eppig, 1994). El ovocito secreta factores de crecimiento conocidos como factores de secreción ovocitaria (OSFs) que actúan directamente sobre las células de la granulosa mural y del cúmulo, regulando gran variedad de sus funciones. Dos de los OSFs más importantes son el factor de crecimiento y diferenciación 9 (GDF-9) y la proteína morfogenética ósea 15 (BMP15). Estos factores pertenecen a la familia de los factores de crecimiento transformadores beta (TGFβ) que, además de ser esenciales en la foliculogénesis temprana, regulan la diferenciación de las células de la granulosa mural y las células del Introducción-9 cúmulo. Ambas proteínas, GDF9 y BMP15, son expresadas por el ovocito de forma progresiva a lo largo del crecimiento folicular (Kathirvel et al., 2013). Las células de la granulosa/cúmulo expresan gran parte del sistema de señalización de la familia TGFβ, incluyendo la mayoría de los receptores Tipo I (quinasas tipo activina, ALK), los receptores Tipo II, co-receptores como el betaglicano, proteínas de unión como la folistatina y mensajeros celulares como las moléculas transductoras de señal intracelular (SMAD) (Juengel y McNatty, 2005). La unión de los factores paracrinos a ambos receptores (Tipos I y II) resulta en la heterodimerización del receptor, en la fosforilación de ALK y SMAD (Figura 6), que en última instancia modifica la expresión génica. Figura 6: Cascada de señalización de los factores paracrinos entre el ovocito y las células del cúmulo (Reproducido de Gilchrist, 1996). El receptor de BMPs normalmente utilizado por los OSFs es de Tipo II (BMPsRII). La unión del GDF9 al heterodímero BMPRII/ALK5 activa al ALK5, que seguidamente fosforila SMAD2-3, que al asociarse con SMAD4 forma un complejo que actúa a nivel nuclear activando la expresión de genes específicos. Por su parte, la unión de BMP15 (también BMP6) al heterodímero BMPRII/ALK6 activa al ALK6 que fosforila SMAD1-5-8 que, al asociarse con SMAD4, forma un complejo que actúa a nivel nuclear activando la expresión de genes que preparan al folículo para la ovulación (Russell y Robker, 2007). Entre las funciones que regulan los OSFs destacan las siguientes: 1) Regulación del ligando Kit (tirosin quinasa) de las células de la granulosa. El ligando Kit (Kitl) es producido por las células de la granulosa del folículo preantral y al unirse al receptor Kit localizado en el oolema ovocitario estimula el crecimiento del ovocito (Packer et al., 1994). Estudios in vitro indican que la expresión del Kitl en células de la granulosa es inhibida por GDF9 y estimulada por BMP15 (Joyce et al., 2000). Así, mientras el co-cultivo de ovocitos en crecimiento con células de la granulosa preantrales estimula la expresión de Kitl, cuando el ovocito ha alcanzado su tamaño definitivo este estímulo queda suprimido (Joyce et al., 2000). Introducción-10 2) Estimulación de la proliferación de células de la granulosa/cúmulo. A través de los OSFs, los ovocitos son potentes estimuladores de la síntesis de ADN y de la proliferación celular de la granulosa mural y del cúmulo (Gilchrist et al., 2008). 3) Prevención de la apoptosis de las células del cúmulo. La eliminación microquirúrgica del ovocito del complejo CCO incrementa la apoptosis en las células del cúmulo, mientras que la exposición del CCO ovocitectomizado a OSFs la revierte (Hussein et al., 2005). 4) Inhibición de la luteinización de las células del cúmulo. La principal característica de la luteinización de las células foliculares es la producción esteroidogénica, en particular de progesterona. En ausencia del ovocito (mediante eliminación microquirúrgica) la FSH estimula la producción in vitro de progesterona en las células de la granulosa mural y del cúmulo, pero este efecto se revierte cuando los CCOs ovocitectomizados son co-cultivados con ovocitos (Li et al., 2000). 5) Regulación del metabolismo de las células del cúmulo. Pese a los diferentes requerimientos y actividades metabólicas de los compartimentos celulares del complejo CCO (Thompson et al., 2007), el ovocito dirige el metabolismo de las células del cúmulo para que le aporten los metabolitos que es incapaz de generar por sí mismo (Gilchrist et al., 2008). 6) Estimulación de la expansión y mucificación de las células del cúmulo. El inicio de la expansión de las células del cúmulo depende de dos señales: a) gonadotropinas o factores tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) y b) factores activadores de la expansión del cúmulo (CEEFs) liberados de forma paracrina por el ovocito. Éstos permiten que las células del cúmulo respondan a la señal gonadotrópica/EGF y sinteticen moléculas de la matriz extracelular (ECM). Mientras que en ratón la expansión de las células del cúmulo depende exclusivamente de la secreción de los CEEFS por parte del ovocito, en la especie humana todavía se desconoce si la expansión del cúmulo requiere la secreción de dichos factores (Gilchrist et al, 2008). I.3.3 Interrupción de la comunicación celular Cuando el folículo alcanza el estadio antral y contiene un ovocito en MII, las uniones gap quedan inutilizadas mediante su fosforilación (capítulo II.2.1 Procesos desencadenados por el pico preovulatorio de LH). La ruptura de la comunicación intercelular es un requisito para que tenga lugar la ovulación. A partir de este momento, Introducción-11 las células del cúmulo sólo quedan unidas al ovocito mediante microvellosidades apicales capaces de proporcionar a la ZP un esqueleto citoplasmático y suficientes para el suministro de nutrientes y la retirada de catabolitos del ovocito maduro (Makabe et al., 2006). I.4 Control hormonal de la fase folicular Las gonadotropinas FSH y LH (hormona luteinizante), producidas en la adenohipófisis son esenciales para el desarrollo y funcionamiento normal de las gónadas. Ambas coordinan y regulan el crecimiento gonadal, su diferenciación, la función endocrina y la gametogénesis en ambos sexos (Moyle y Campbell, 1996). Los folículos primordiales y primarios son insensibles a las gonadotropinas (debido a la ausencia de receptores, Figura 4). Con la llegada a la pubertad, la FSH se une a sus receptores (RFSH) localizados en las células de la granulosa de folículos preantrales y en las células de la granulosa mural y del cúmulo en folículos antrales (Peters, 1979; Caixeta et al., 2009) estimulando el desarrollo folicular. La FSH interviene también en el proceso de reclutamiento, crecimiento folicular, selección y desarrollo del folículo dominante. En la fase antral temprana, la FSH estimula la producción de estrógenos en las células de la granulosa. Este aumento intrafolicular de estrógenos incrementa la sensibilidad del folículo a la FSH. En la mitad de la fase folicular, uno de los folículos reclutados habrá producido un nivel de estrógenos mayor que los demás de la cohorte (folículo dominante), y éste será el que se transforme en el folículo ovulador. Además, el aumento de los niveles de estrógenos estimula la aparición de receptores para la LH (RLH) en las células de la granulosa (DiZerega et al., 1980; Zeleznik et al., 1981), de la teca y luteales (Yamoto et al., 1992). En las células de la teca, la LH estimula la producción de andrógenos aromatizables (aromatización estrogénica) (Hillier et al., 1994). La mayor parte de estos andrógenos pasarán al sistema vascular del ovario, mientras que una parte más pequeña pasará a las células de la granulosa, donde serán transformados en estrógenos. Al final de la fase folicular disminuye la concentración creciente de estrógenos (Fritz y Speroff, 1982) e inhibina B producida por las células de la granulosa, inhibiendo la secreción hipofisiaria de FSH y resultando en la atresia del resto de los folículos de la cohorte, asegurando que solo el folículo dominante sea ovulado (Figura 4). Además, la LH desencadena el reinicio de la meiosis y la Introducción-12 luteinización de las células foliculares (formación del cuerpo lúteo) (Richards y Hedin, 1988), que sintetizan prostaglandinas necesarias para la ruptura folicular y la ovulación. Introducción-13 II. Arresto y reanudación de la meiosis ovocitaria II.1 El arresto meiótico El ovocito primario permanece detenido en la profase de la primera división meiótica hasta la llegada de la pubertad (capítulo I). Son los elevados niveles intraovocitarios de AMPc los responsables de este arresto meiótico (Bornslaeger et al., 1986; Mehlmann et al., 2002). La concentración intraovocitaria de AMPc depende del ratio de síntesis y metabolismo a nivel ovocitario, que a su vez depende de la síntesis de GMPc en las células de la granulosa, así como del mantenimiento de las uniones tipo gap. En la Figura 7 se resume el mecanismo de regulación del arresto meiótico del ovocito en el folículo antral. Figura 7: Vía de regulación del arresto meiótico del ovocito en el folículo antral. La unión del NPC al NPR2 presente en las células del cúmulo resulta en la producción de GMPc, que difunde hacia el ovocito inhibiendo la actividad de la PDE3A, manteniendo el arresto meiótico del ovocito. AC: adenilato ciclasa. AMPc: adenosín monofosfato cíclico. CC: célula del cúmulo. CG: célula de la granulosa mural. Cx: conexina. GMPc: guanosín monofosfato cíclico. GPR3: receptor ligado a proteína G. Gs: Proteína G. NPC: péptido natriurético C. NPPC: precursor péptido natriurético C. NPR2: receptor péptido natriurético 2. OO: ovocito. PDE: fosfodiesterasa. RLH: receptor LH. El precursor del péptido natriurético C (NPPC) producido en las células de la granulosa mural es metabolizado en péptido natriurético C (NPC), que se acumula en el espacio extracelular. El NPC se une al receptor del péptido natriurético 2 (NPR2, también conocido como guanilil ciclasa B, GC-B) presente de forma mayoritaria en las células del cúmulo, aunque también, en menor medida, en las células de la granulosa RLH CG Gs CC NPC NPR2 NPPC GMPc GPR3 OO PDE5 PDE3A PDE1A PDE1A Cx43 Cx43 AMPc Inactiva Activa NPR2 Cx37 Gs AC AC Introducción-14 mural (en proximidad a las células del cúmulo) (Zhang et al., 2010). El estradiol producido por las células de la granulosa estimula la expresión de receptores NPR2 (Zhang et al., 2011), no obstante se desconoce cuál es la señal que induce la síntesis de NPPC. La unión del NPC al receptor NPR2 estimula la producción del GMPc a partir del guanosín trifosfato (GTP) (mediado por la guanilato ciclasa). El GMPc difunde a través de la uniones gap llegando hasta el ovocito donde inhibe la PDE3A (fosfodiesterasa 3A), que degrada el AMPc cuando está activa (Conti et al., 2012). Al mismo tiempo, la estimulación del receptor de membrana ovocitario GPR3 (receptor ligado a proteína G) por un ligando desconocido procedente de las células foliculares activa la proteína Gs, que a su vez estimula a la AC, que hidroliza el ATP sintetizando AMPc. La presencia de GMPc procedente de las células del cúmulo impide su degradación y el AMPc activa la proteína quinasa A (PKA) (Mehlmann et al., 2005) (Figura 8). La PKA es una proteína dependiente de AMPc que, en su forma inactiva, es un tetrámero constituido por dos subunidades reguladoras (RI y RII) y dos subunidades catalíticas idénticas (C) (Skalhegg y Tasken, 2000). En función de la subunidad reguladora existen dos tipos de PKA; PKA I y II. Las dos isoformas poseen diferentes características estructurales y bioquímicas que se traducen en diferentes funciones (Di Benedetto et al., 2008). A pesar de que ambas utilizan el mismo mensajero intracelular, su mecanismo de acción todavía es desconocido (Di Benedetto et al., 2008). Ambos tipos de PKA están presentes en ovocitos y en células de la granulosa (Brown et al., 2002). La unión del AMPc a la subunidad reguladora (dos moléculas de AMPc por subunidad) libera las subunidades catalíticas activando la PKA. La PKA activa, por un lado induce (directa o indirectamente) la fosforilación e inactivación de la fosfatasa cdc25b (Zhang et al., 2008; Pirino et al., 2009) y por otro, estimula la actividad de la quinasa Wee1/Myt1 (Figura 8). Estas dos moléculas (fosfatasa cdc25b y quinasa Wee1/Myt1) actúan sobre las subunidades que constituyen el factor promotor de la maduración (MPF; Masui y Markert, 1971), la quinasa dependiente de ciclina (CDK1 ó p34cdc2) y la ciclina B1. En particular, la cdc25b inactiva deja de defosforilar la CDK1 y la Wee1/Myt1 activa fosforila la CDK1 en sus residuos treonina 14 y tirosina 15. En última instancia, el MPF queda inactivo, impidiéndose el reinicio de la meiosis (Mehlmann et al., 2005) (Figura 8). Introducción-15 Figura 8: Cascada de señalización responsable del arresto meiótico del ovocito en el folículo antral. El GMPc procedente de las células del cúmulo actúa evitando la degradación del AMPc (por inhibición de la actividad de la PDE3A), lo que resulta en la activación de la PKA, que a su vez impide el reinicio meiótico (por inactivación del MPF). AC: adenilato ciclasa. AMPc: adenosín monofosfato cíclico. ATP: adenosín trifosfao. CC: célula del cúmulo. Cx: conexina. GMPc: guanosín monofosfato cíclico. GPR3: receptor ligado a proteína G. Gs: proteína Gs. MPF: factor promotor de la maduración. PDE3A: fosfodiesterasa 3. PKA: proteína quinasa A. VG: vesícula germinal. II.2 Reanudación de la meiosis Una vez alcanzada la pubertad, el pico preovulatorio de LH desencadena la reanudación de la meiosis. Mientras que la presencia de RLH en las células del cúmulo y en el ovocito es controvertida (Amsterdam et al., 1975; Dekel et al., 1988; Patsoula et al., 2001; Park et al., 2004; Papamentzelopoulou et al., 2012), las células de la granulosa mural y las de la teca expresan estos receptores (Ye et al., 2009; Ding et al., 2011), mediando así la acción de la LH sobre el ovocito. II.2.1 Procesos desencadenados por el pico preovulatorio de LH La estimulación de los RLH en las células de la granulosa mural activa la AC y en consecuencia se produce AMPc en estas células. A continuación se describen las consecuencias de este incremento de AMPc: - Disminución de GMPc La LH, mediante un mecanismo no bien conocido, reduce los niveles de GMPc en las células de la granulosa y, por extensión en el ovocito. GPR3 Gs AC Cx37 GMPc PDE3A CC AMPc PKA Wee1/Myt1 (activa) ATP “MPF inactivo” cdc25b- (inactiva) P CDK1 Ciclina B1 fosforilación P P -Thr -Tyr VG Ovocito VG defosforilación Introducción-16 - Activación de la red de EGFs En respuesta al aumento de AMPc, las células de la granulosa mural expresan factores tipo EGF como la anfirregulina (areg), epirregulina (ereg) y beta-celulina (BTC) (Park et al., 2004; Zamah et al., 2010; Ben-Ami et al., 2011). Estos factores de crecimiento, por un lado, actúan de forma autocrina/yuxtacrina sobre las células de la granulosa mural y por otro activan las células del cúmulo (mediante su unión a receptores EGF [REGF]) induciendo su expansión (Conti et al., 2006). La activación de los REGF contribuye a la disminución de los niveles de GMPc en las células de la granulosa, a la fosforilación de la Cx 43 (bloqueando las uniones tipo gap entre las células de la granulosa mural y el cúmulo) y a la fosforilación de la proteína quinasa activadora de la mitosis (MAPK) (Conti et al., 2012) (Figura 9). Figura 9: Cascada de señalización desencadenada por el estímulo preovulatorio de LH. La estimulación de los RLH es responsable de: 1) aumento del AMPc y disminución de los niveles de GMPc en las células de la granulosa, 2) activación de la red de EGFs que resulta en la fosforilación de la Cx 43 y en la activación de la MAPK, 3) producción de Insl-3 en las células de la teca que al unirse al receptor ovocitario LGR8 inhibe la actividad de la AC y 4) aumento de los niveles de Ca2+ intraovocitarios que inhiben la actividad de la AC. AC: adenilato ciclasa. AMPc: adenosín monofosfato cíclico. Areg: anfirregulina. BTC: beta celulina. Ca2+: calcio. CC: célula del cúmulo. CG: célula de la granulosa mural. Cx: conexina. Ereg: epirregulina. Gi: proteína G inhibitoria. GMPc: guanosín monofosfato cíclico. GPR3: receptor ligado a proteína G. Gs: Proteína G. Insl-3: factor de Leydig tipo insulina 3. IP3: inositol 1,4,5 trifosfato. LGR8: receptor de unión a la proteína G rico en leucina. LH: horoma luteinizante. MAPK: proteína activadora de la mitosis. NPPC: precursor péptido natriurético C. NPR2: receptor péptido natriurético 2. OO: ovocito. PDE: fosfodiesterasa. PIP2: fosfatidil inositol 4,5 bifosfato. RLH: receptor LH. RLH CG Gs CC Areg, Ereg, BTC NPR2 NPPC? GMPc GPR3 OO PDE5 PDE3A PDE1A PDE1A Cx43 Cx43 AMPc Inactiva Activa NPR2 Cx37 Gs AC LH AC REGF REGF P ? ? Disminución GMPc MAPK Insl-3 (Teca) LGR8 Gi PIP2 IP3 IP 3 IP3 Ca 2+ Introducción-17 - Activación de la MAPK La fosforilación y activación del sistema MAPK en las células de la granulosa está mediada por la LH de manera indirecta. Así, de un lado la activación de PKA y proteína quinasa C (PKC) mediada por el aumento en AMPc y de otro lado la estimulación de los REGF resultan, en última instancia, en la activación del sistema MAPK. Se han descrito dos isoformas de la MAPK (también denominada ERK, quinasa de regulación extracelular), ERK1 (p44) y ERK2 (p42) (Sun et al., 1999). La quinasa MEK1 (también denominada MAP quinasa quinasa) activa a la MAPK mediante la fosforilación de sus residuos treonina 183 y tirosina 185 (Crews y Erikson, 1992). En las células somáticas, la fosforilación y activación de MEK1 es catalizada por la quinasa Raf1 (Seger y Krebs, 1995). A su vez, la MAPK activa fosforila a la p90rsk (quinasa ribosómica S6) en sus residuos serina 369 y treonina 577 (Dalby et al., 1998) (Figura 10), ejerciendo ésta las funciones de la cascada de las MAPKs. Figura 10: Cascada de activación de la MAPK. La fosforilación (activación) de la MEK1 resulta en la fosforilación (activación) de la MAPK que finalmente fosforila y activa a la p90rsk. MAPK: proteína quinasa activadora de la mitosis. MEK1: MAP quinasa quinasa. p90rsk: quinasa ribosómica S6. La activación de la cascada MAPK en el compartimento somático del folículo y no en el ovocito, es indispensable para que se produzca la reanudación de la meiosis ovocitaria (Liang et al., 2007). La MAPK (mediada por la LH) induce la fosforilación de la Cx 43 en sus residuos serina (Norris et al., 2008) bloqueando la comunicación entre las células somáticas (Figuras 9 y 11a). Tal y como se ha mencionado anteriormente, la activación de los REGF (mediada por la LH) es también necesaria para la fosforilación de la Cx 43 y el cierre de las uniones gap (Norris et al., 2010). Esta interrupción parece ser suficiente para inducir el reinicio meiótico, presumiblemente mediante el bloqueo en el paso de señales inhibitorias hacia el complejo CCO (GMPc) (Conti et al., 2012). Mos (ovocito) P MEK1 MAPK Thr183-- P Tyr185- - p90rsk P Ser369-- P Thr577-- Raf1 (cél. somática) P Introducción-24 Durante este proceso, cromátidas no hermanas de cromosomas homólogos se unen formando los denominados quiasmas. Éstos, son puntos de intercambio genético entre cromátidas no-hermanas, que permiten generar ovocitos con combinaciones genéticas distintas. Las cromátidas hermanas se mantienen unidas a través del complejo cohesina, que las abraza en una estructura en forma de anillo (Nasmyth y Haering, 2005). Este complejo se encuentra formado por las proteínas SMC1b, SMC3, REC8 y STAG3 (Jones, 2008) y presenta una doble función. De un lado, asegura que ambas cromátidas hermanas se mantengan estrechamente unidas hasta y durante la separación de los cromosomas homólogos (Lee y Orr-Weaver, 2001) (Figura 16). De otro lado, estabiliza los quiasmas durante este periodo de gran tensión mecánica ejercida por los microtúbulos y permite que la recombinación homóloga se produzca correctamente. Figura 16: Regulación de la separación y segregación de cromosomas homólogos durante la meiosis ovocitaria. a) La activación de la GSK-3 aumenta la actividad de la PP1 (por inhibición de su regulador I2) que permite la normal separación y segregación de cromosomas homólogos (por hipofosforilación de la histona H3 y del complejo cohesina). b) La disminución de la actividad resulta, por el contrario, en una separación y segregación de cromosomas homólogos alterada. GSK-3: glucógeno sintasa quinasa-3. I2: Inhibidor 2. PP1: proteína fosfatasa 1. Son varias las moléculas implicadas en la cohesión y separación de los cromosomas homólogos. La PP1 controla el estado fosforilativo y la función de las cohesinas. La PP1δ y su regulador endógeno, el inhibidor-2 (I-2), se han identificado en la cromatina condensada de ovocitos de ratón. La GSK-3 activa fosforila el I-2 en su residuo treonina 72, aumentando la actividad de la PP1δ. Como consecuencia, disminuye la fosforilación de la histona H3 y del complejo cohesina, proceso requerido Introducción-25 para una normal separación y segregación cromosómica (Wang et al., 2003) (Figura 16). Al mismo tiempo, el MPF regula la fosforilación y la actividad de la separasa (responsable de la degradación de la cohesina) en el control de la segregación cromosómica (Madgwick et al., 2004). Cuando se alcanza la anafase, el complejo promotor de anafase (anaphase-promoting complex, APC) o ciclosoma (Herbert et al., 2003), induce la proteólisis de la securina y la ciclina B1 (componente del MPF) (Herbert et al., 2003), lo que resulta en la fosforilación y activación de la separasa y en la consiguiente degradación de la cohesina y de los quiasmas, y en última instancia, en la separación de los cromosomas homólogos (Lee y Orr-Weaver, 2001; Terret et al., 2003; Peters, 2006) (Figura 17). Figura 17: Mecanismo de control de la cohesión y separación de cromosomas homólogos durante la meiosis I. MPF: factor promotor de la maduración. APC: Complejo promotor de anafase. a) La actividad del MPF y de la securina impiden la actividad de la separasa, manteniéndose los cromosomas homólogos cohesionados. b) La activación del APC durante la anafase induce la separación de los cromosomas homólogos al degradar la securina y la ciclina B1. Resultados recientes indican que al alcanzar los estadios finales de la vida reproductiva femenina (alrededor de los 50 años) se produce una disminución en cohesina, que resulta en una reducción en el número de quiasmas y en alteraciones en la segregación cromosómica, que en última instancia se traducen en la alta tasa de aneuploidías detectadas en mujeres de edad avanzada (Kurahashi et al., 2012). 5. Extrusión del primer CP (1CP) La maduración meiótica se caracteriza por la sucesión de dos divisiones asimétricas, en cada una de las cuales se genera un pequeño CP. Esta división asimétrica asegura que la mayoría de los componentes maternos queden retenidos en el ovocito, puesto que serán necesarios para el desarrollo embrionario. Para que esta división a) Cohesión de homólogos Separasa Securina MPF P b) Separación de homólogos Separasa Securina MPF P APC Proteolisis Introducción-26 ocurra de forma correcta, los cromosomas migran al córtex ovocitario y se ensamblan con el complejo proteico formina-2. Se trata de uno de los centros nucleadores de la actina, responsable de la creación de nuevos filamentos (Azoury et al., 2009). Aunque el mecanismo por el cual se lleva a cabo esta división asimétrica no es del todo conocido, estudios recientes sugieren que son los cromosomas los que inducen la formación de un capuchón de actina rodeado de un anillo de miosina II en el córtex ovocitario (Wang et al., 2011) (Figura 18). Figura 18: Representación de la protusión del capuchón cortical y la inducción del surco mediado por el aparato meiótico (zona media) durante la extrusión del CP. Los cromosomas inducen la formación del capuchón/anillo de actomiosina a nivel cortical. La región rectangular del capuchón/anillo cortical se muestra en la parte superior, un capuchón de actina (color rojo) rodea a un anillo de miosina II (color verde). Durante la transición de metafase a anafase el capuchón de actina/anillo de miosina II protruye en el córtex formando un cono (Deng y Li, 2009). Simultáneamente, la zona media del aparato meiótico en anafase induce la formación de un surco unilateral en el córtex más cercano, que, coordinado con el capuchón de actina protuído produce la rotación del aparato meiótico. Es necesario que el aparato meiótico se sitúe de forma perpendicular al córtex para que el 1CP sea extruído, de forma que un polo roce el cono cortical y el otro se posicione en el citoplasma (Figura 18). A continuación la zona media del aparato meiótico induce la formación de un surco bilateral que desencadena la escisión del CP (Wang et al., 2011) (Figura 18). Hasta el momento se han identificado dos vías de regulación de la migración y extrusión cortical del aparato meiótico; mediante la tirosina quinasa 2 rica en prolina (Pyk2; Azoury et al., 2009) y la formina-2. La Pyk2 es sensible al aumento de la concentración de Ca2+ (desencadenado por el pico de LH) y su activación induce, a su Formación del capuchón/anillo inducido por los cromosomas Protusión del capuchón Surco unilateral inducido por la zona media aparato meiótico Rotación aparato meiótico Surco bilateral y escisión del corpúsculo polar Introducción-27 vez, la cascada de señalización de la MAPK. De otro lado, la formina-2 es una de las dianas de la MAPK (Dumont et al., 2007). Además de las proteínas anteriores, en respuesta al pico preovulatorio de LH las células de la granulosa mural y del cúmulo liberan el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Este se une a los receptores TrkB (trompomyosin related kinase B), expresados exclusivamente en ovocitos, y es esencial para que se produzca la extrusión del 1CP (Kawamura et al., 2005). 6. Re-arresto meiótico Una vez que finaliza la meiosis I el ovocito inicia la meiosis II, pero queda detenido en MII, estadio en el que es ovulado in vivo. Dicho arresto está mediado por el CSF (Masui y Markert, 1971; Sagata, 1997; Madgwick y Jones, 2007) al impedir la disminución de los niveles de MPF. De forma fisiológica, esta disminución se produce tras el aumento de los niveles de Ca2+ inducidos por el espermatozoide tras la fecundación. En este momento, los niveles elevados de Ca2+ activan el complejo APC que a su vez degrada la subunidad reguladora del MPF (ciclina B1) (Madgwick y Jones, 2007). Actualmente, se desconoce la identidad del CSF, aunque debido a la relación funcional existente entre MPF y el APC, se ha asumido que el CSF actuaría como un inhibidor del APC (Tunquist y Maller, 2003). Así pues, se han propuesto varios candidatos a CSF, como c-mos/MEK/MAPK/p90rsk/Bub1, Mad1 y Mad2, ciclina E1/cdk2 y Emi2 (early mitotic inhibitor 2) (Tunquist y Maller, 2003). Puesto que la proteína ovocitaria Emi2 mantiene el arresto meiótico mediante la inhibición del complejo APC y su degradación es Ca2+-dependiente (Hansen et al., 2006), es un buen candidato a CSF. Mientras que el arresto en MII se debe a la inhibición del APC mediada por el CSF (Emi2), su mantenimiento se debe tanto al CSF como a la cascada de señalización c-mos/MAPK. En última instancia, los cambios en los niveles de MPF y MAPK regulan el ciclo celular ovocitario. La actividad de la MAPK presenta un pico de actividad en el momento de la GVBD y se mantiene elevada hasta que el ovocito queda detenido en MII (Figura 19). Por otro lado, la actividad del MPF varía a lo largo de la progresión meiótica. Durante el estadio de VG, el MPF se encuentra en su forma inactiva. Cuando se reanuda la meiosis y se produce la GVBD, el MPF inicia un incremento en actividad, Introducción-28 que alcanza un pico cuando el ovocito alcanza el estadio de MI. Seguidamente, disminuye drásticamente durante anafase I y telofase I, para alcanzar de nuevo un pico cuando el ovocito queda detenido en MII (Naito y Toyoda, 1991) (Figura 19). Parece ser que es la MAPK, que se mantiene elevada durante el arresto en MII, la causante de la reactivación de la actividad del MPF (Gordo et al., 2001), posiblemente disminuyendo la degradación de la ciclina B1 (Minshull et al., 1994). Una vez alcanzado el pico de actividad, el MPF se mantiene en estos niveles gracias al equilibrio constante entre la síntesis y degradación de ciclina B1 (Zubiak et al., 1993). Figura 19: Representación de la variación de los niveles de MAPK y MPF a lo largo de la progresión meiótica ovocitaria. Mientras que la MAPK presenta un pico de actividad alrededor de la GVBD y se mantiene elevada hasta que el ovocito queda detenido en MII, el MPF varía su actividad a lo largo de la progresión meiótica. MI: metafase I. MII: metafase II. MAPK: proteína quinasa activadora de la mitosis. MPF: factor promotor de la maduración. VG: vesícula germinal. GVBD: disolución de la vesícula germinal. El ovocito permanecerá detenido en este estadio hasta que reciba un estímulo que le indique que puede proseguir con la meiosis II. En condiciones in vivo, y en la aplicación de técnicas de Reproducción Asistida, este estímulo es aportado por el espermatozoide durante la fecundación. En condiciones in vitro, este estímulo puede mimetizarse por medio de la aplicación de pulsos eléctricos o bien con el tratamiento químico del ovocito (capítulo VI.2 Activación ovocitaria artificial). La fecundación/activación ovocitaria resultará en la disminución de la actividad del MPF, permitiendo al ovocito liberarse del arresto en MII (Kikuchi et al., 1995) y proseguir con el desarrollo embrionario. Si no hay fecundación/activación ovocitaria, el ovocito se mantiene detenido en MII y, en última instancia, degenera. Introducción-29 III. El ovocito competente III.1 Competencia ovocitaria La competencia ovocitaria, definida como la capacidad del ovocito para completar el desarrollo embrionario tras la fecundación, es adquirida gradualmente a lo largo de la maduración ovocitaria hasta quedar detenido en MII. Podemos dividir la maduración ovocitaria, y así pues la adquisición de competencia ovocitaria, en nuclear, citoplasmática y molecular. La maduración nuclear refleja la progresión meiótica del ovocito hasta alcanzar el estadio de MII. La maduración citoplasmática comprende los cambios en la distribución y organización de las organelas citoplasmáticas. Finalmente, la maduración molecular es la acumulación del legado de instrucciones que controlan tanto la maduración nuclear como la citoplasmática, así como la capacidad de desarrollo posterior, al menos hasta la activación del genoma embrionario (EGA) (Sirard, 2001). III.1.1 Maduración nuclear La competencia meiótica depende de la adquisición y correcto funcionamiento de las proteínas que regulan la progresión de la meiosis, principalmente componentes del citoesqueleto y de la placa metafásica (Eppig, 1993). Dichos componentes se han descrito extensamente en el capítulo II. III.1.2 Maduración citoplasmática La competencia ovocitaria requiere de la presencia de una adecuada maquinaria de transcripción y traducción que permita la maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario posterior. Ello exige la generación de nuevas organelas y la modificación y redistribución de las ya existentes (Picton et al., 1998; Assou et al., 2006) acorde con los diferentes estadios evolutivos de la maduración ovocitaria. A continuación se describen dichos cambios en ovocitos humanos: Ovocito VG: mientras que las mitocondrias se agregan en torno al núcleo, el aparato de Golgi (AG) se localiza en posición más o menos central y los filamentos intermedios (en forma de grandes agregados) quedan relegados al córtex. El RE, los gránulos corticales, los microfilamentos y los microtúbulos se distribuyen uniformemente por todo el citoplasma (Figura 20). En el momento de la GVBD, las Introducción-30 mitocondrias abandonan la región perinuclear, el AG se fragmenta y forma agregados en el centro ovocitario, el RE se localiza en la región cortical y los microtúbulos se condensan alrededor de los cromosomas mientras que los microfilamentos se acumulan en la región subcortical (Mao et al., 2013) (Figura 20). Ovocito MI: el AG continúa fragmentándose y queda disperso por todo el ovocito, el RE se concentra en el polo vegetal y los gránulos corticales migran hacia el córtex citoplasmático. Los filamentos intermedios se dispersan en forma de múltiples y pequeñas “manchas” y los microtúbulos se organizan completamente en el aparato meiótico (Mao et al., 2013) (Figura 20). Figura 20: Resumen de la distribución de las organelas citoplasmáticas y del citoesqueleto durante la maduración ovocitaria (A) y redistribución de las organelas citoplasmáticas en un ovocito MII maduro nuclearmente pero inmaduro a nivel citoplasmático (B). AG: aparato de Golgi. CP: corpúsculo polar. MI: metafase I. MII: metafase II. REL: retículo endoplásmico liso. RER: retículo endoplásmico rugoso. VG: vesícula germinal. GVBD: disolución de la vesícula germinal (Reproducido de Mao et al., 2013; modificado). Ovocito MII: cuando el ovocito alcanza este estadio presenta una mayor complejidad citoplasmática. Se caracteriza por la presencia de microvellosidades que se interrelacionan con las capas internas de la ZP. El aparato meiótico se sitúa debajo del recién extruído CP, orientado perpendicular a la superficie del ovocito. Las mitocondrias, ocupan la mayoría del volumen ovocitario, formando agregados con el RE liso y con vesículas citoplasmáticas. Además, se observan grupos de RE rugoso por todo el citoplasma y los gránulos corticales se distribuyen a lo largo de la membrana ovocitaria incluida la región donde se ubica el aparato meiótico. Finalmente, los VG GVBD MI MII VG GVBD Placa metafásica Mitocondria 1CP AG RER REL Vesícula Gránulo cortical Microtúbulos Filamentos Actina Filamentos Intermedios A B Introducción-31 filamentos intermedios se distribuyen de forma uniforme por el citoplasma (Mao et al., 2013) (Figura 20). No obstante, ovocitos MII maduros nuclearmente pero inmaduros citoplasmáticamente presentan 1) gránulos corticales dispersos por el citoplasma en vez de localizados debajo del oolema; 2) el AG persiste en forma de vesículas corticales en lugar de desaparecer casi completamente; 3) las mitocondrias, que deberían mostrar una distribución homogénea, están ausentes del córtex; 4) el RE suele presentarse como una gran vesícula sin mitocondrias asociadas y 5) se observan defectos en la disposición de los microtúbulos y microfilamentos (Kim et al., 1998). III.1.2.1 Las mitocondrias en el ovocito Una de las organelas de gran importancia en el ovocito, y por ello de las mejor estudiadas, es la mitocondria. Se trata de una organela membranosa formada por una membrana externa permeable que deja atravesar moléculas de hasta 10 kDa y una membrana interna o matriz que contiene las enzimas implicadas en la cadena respiratoria. Estas organelas contienen su propio ADN (ADNmt), una molécula de doble cadena circular de 16.6 kb que codifica 13 de las proteínas de la cadena respiratoria asociadas al proceso de fosforilación oxidativa. Las mitocondrias se heredan exclusivamente por vía materna con independencia del genoma nuclear (Cummins, 2000). Las mitocondrias de origen paterno son específicamente eliminadas tras la fecundación y antes de alcanzar el estadio de 4 células (Kaneda et al., 1995). 1. Número de mitocondrias A lo largo de la ovogénesis-foliculogénesis, los ovocitos de mamíferos experimentan un incremento en el número de mitocondrias. Así, en la especie humana, las células germinales primordiales pre-migratorias tienen aproximadamente 10 mitocondrias, al alcanzar el ovario, cuentan con aproximadamente 100 mitocondrias y tras proliferar y diferenciarse en ovogonias, tienen unas 200 mitocondrias (Jansen, 2000). Esta proliferación mitocondrial continúa y los ovocitos de folículos primordiales tienen entre 6.000 y 10.000 mitocondrias (Jansen y de Boer, 1998) que continúan replicándose durante la foliculogénesis alcanzando entre 100.000 y 400.000 mitocondrias en el ovocito maduro (Steuerwald et al., 2000). Es entonces cuando esta replicación exponencial parece quedar detenida (Jansen y de Boer, 1998) y no tiende a aumentar de nuevo hasta después de la fecundación, en el momento de la implantación Introducción-32 embrionaria (Pikó y Taylor, 1987). Esto sugiere que las mitocondrias presentes en el ovocito MII deben ser suficientes para sustentar los requerimientos energéticos asociados al desarrollo embrionario preimplantacional (Dumollard et al., 2006). Es por ello que, el número de mitocondrias en el ovocito maduro se considera un parámetro descriptivo de la competencia citoplasmática. Ovocitos incapaces de madurar, o embriones que detienen su desarrollo preimplantacional carecen del número suficiente de mitocondrias para proveer la energía necesaria en dichos estadios de desarrollo (Reynier et al., 2001; Wai et al., 2010). No es únicamente necesario tener un número mínimo de mitocondrias, sino que además dichas mitocondrias tienen que ser funcionales. Aunque se desconoce con exactitud el mecanismo de aparición y transmisión, se han descrito deleciones y mutaciones puntuales en el ADNmt en ovocitos humanos (Steffann y Fallet, 2010) que pueden comprometer la funcionalidad mitocondrial. Parece ser que la existencia de un cuello de botella durante la migración y especificación de las células germinales, junto con la replicación exponencial de las mitocondrias durante la ovogénesis, son responsables de la distribución aleatoria de la población mitocondrial en diferentes ovogonias y de su posterior expansión homogénea (Shoubridge, 2000; Wai et al., 2008; Lee et al., 2012). Así pues, ovocitos que hayan heredado mitocondrias con alto contenido en mutaciones en el ADNmt verán penalizada su maduración, fecundación y/o desarrollo preimplantacional. No obstante, aquellos ovocitos que hayan heredado mitocondrias con ADNmt sano o bien con un contenido en mutaciones que sea compatible con el desarrollo embrionario, serán capaces de ser fecundados y generar una nueva vida. Si las mutaciones heredadas son lo suficientemente predominantes, es muy probable que la descendencia padezca alguna enfermedad mitocondrial, como por ejemplo neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), síndrome de Leigh de herencia materna (MILS), síndrome de neuropatía con ataxia y retinitis pigmentaria (NARP), etc. (DiMauro e Hirano, 2009). 2. Localización, distribución y función de las mitocondrias El aumento del número de mitocondrias coincide con un cambio en su distribución, probablemente como respuesta a la demanda energética en cada etapa de la maduración ovocitaria (Ramalho-Santos et al., 2009) (apartado III.1.2 Maduración citoplasmática). Tras la fecundación, las mitocondrias se acumulan alrededor de los pronúcleos (PN) y se mantienen cerca del núcleo hasta el estadio de mórula. No es de Introducción-33 sorprender que una re-distribución mitocondrial incorrecta, así como la carencia del número mínimo de mitocondrias por blastómera (no hay replicación mitocondrial hasta el estadio de blastocisto) pueda comprometer la fecundación y desarrollo embrionario (Au et al., 2005; Van Blerkom et al., 2000). La polaridad mitocondrial (∆ΨM) también se asocia con la capacidad de desarrollo tanto del ovocito como del embrión (Fujii y Funahashi, 2009). El potencial de membrana mitocondrial aumenta de forma diferente durante la maduración, resultando en dos poblaciones mitocondriales con diferente potencial de membrana en el ovocito MII (Ramalho-Santos et al., 2009). En humanos, las mitocondrias altamente polarizadas se agrupan en el citoplasma pericortical probablemente para 1) asegurar que el aporte de ATP sea suficiente para que se produzca la fecundación y 2) regular la homeostasis del Ca2+ durante la activación ovocitaria (Ramalho-Santos et al., 2009; capítulo VI). La falta del potencial de membrana necesario disminuye la capacidad del ovocito para formar el pronúcleo tras la fecundación y afecta al desarrollo embrionario posterior (Fujii y Funahashi, 2009). 3. Papel de las mitocondrias en la producción de energía Las mitocondrias producen la energía (ATP) necesaria para todos los procesos celulares y moleculares que acontecen durante la foliculogénesis, maduración, fecundación y desarrollo embrionario preimplantacional. De hecho, existe una estrecha asociación entre la reorganización mitocondrial y el contenido de ATP a lo largo de la maduración ovocitaria (Stojkovic et al., 2001). La disfunción de las mitocondrias ovocitarias, expresada como una disminución en la respiración celular y en el transporte de electrones, puede contribuir a una disminución de la fertilidad al causar un retraso y/o arresto del desarrollo embrionario (Ramalho-Santos et al., 2004). La energía celular en forma de ATP puede obtenerse mediante diferentes rutas metabólicas. La glucólisis permite la obtención de 2 moléculas de ATP y piruvato a partir de una molécula de glucosa. Cuando la disponibilidad de oxígeno es limitada o bien tiene que conservarse para otros procesos, el piruvato y NADH producido en la glucólisis se utilizan por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) para obtener lactato (Figura 21). A pesar de que la glucólisis anaerobia permite obtener ATP de forma rápida, es una ruta ineficiente resultando en tan solo 10 moléculas de ATP. No obstante, en condiciones aerobias las 2 moléculas de piruvato producidas en la glucólisis (citoplasma) entran en la membrana interna de la mitocondria y se Introducción-40 Alrededor de una semana después se observa un efecto supresor debido a la desensibilización de los receptores hipofisarios (down regulation), resultado de la administración continua no pulsátil, desencadenando un bloqueo reversible de la liberación hipofisaria de FSH y LH (estado hipogonadotrópico). En función del momento del ciclo en que comienzan a administrarse los a-GnRH y la duración de tratamiento distinguimos 3 protocolos (Cohen, 2003). El más utilizado es el protocolo largo de a-GnRH en el que el agonista comienza a utilizarse diariamente en la mitad de la fase lútea del ciclo anterior y se mantiene hasta el momento de inducir la ovulación. En el protocolo corto de a-GnRH la administración del agonista se inicia desde los días 1-3 del ciclo y se mantiene igualmente hasta el momento de la descarga ovulatoria. En ambos protocolos la administración de gonadotropinas se inicia en los primeros días del ciclo, simultáneamente con el empleo de los agonistas. En el protocolo ultracorto de a-GnRH el agonista es administrado únicamente durante los tres primeros días de ciclo (Figura 22). Figura 22: Protocolos de administración de los a-GnRH. a) Protocolo largo. El a-GnRH se inicia en la mitad de la fase lútea del ciclo previo y se mantiene hasta la inducción de la ovulación. b) Protocolo corto. El a-GnRH se inicia los días 1-3 del ciclo y se mantiene hasta la inducción de la ovulación. c) Protocolo ultracorto. El a-GnRH se administra únicamente durante los 3 primeros días del ciclo. a) a-GnRH. Protocolo largo Menstruación Menstruación a-GnRH Gonadotropinas b) a-GnRH. Protocolo corto Menstruación Menstruación a-GnRH Gonadotropinas c) a-GnRH. Protocolo ultracorto Menstruación Menstruación a-GnRH Gonadotropinas Introducción-41 En los tres protocolos la dosis de a-GnRH varía en función del a-GnRH empleado: • 0.1-0.05 mg/día (triptorelina) • 0.2-0.1 mg/día (leuprorelina) • 800-400 µg/día (nafarelina) Los protocolos cortos/ultracortos suelen emplearse en raras ocasiones en pacientes con baja reserva ovárica, ya que permiten unir al efecto de flare up inicial la ausencia de una supresión hipofisaria prolongada. Es opinión generalizada que los mejores resultados se obtienen con el protocolo largo, siendo con mucho el más empleado. Antagonistas de la GnRH Los ant-GnRH actúan de forma competitiva uniéndose al receptor de la GnRH, bloqueándolo y causando así una supresión hipofisaria profunda e inmediata, sin efecto flare up. Esto permite que los ant-GnRH puedan administrarse una vez ha comenzado la estimulación del desarrollo folicular múltiple con gonadotropinas lo que condiciona una menor duración del tratamiento. Los ant-GnRH pueden ser administrados en dosis múltiple, es decir, de forma diaria a partir del sexto día de estimulación ovárica con gonadotropinas y hasta el día de la hCG incluido, dosis de 0.25 mg/día (Diedrich et al., 1994); o en dosis única, administrada cuando el folículo de mayor tamaño ha alcanzado 14 mm de diámetro, dosis de 3 mg (Figura 23). Figura 23: Protocolos de administración de los ant-GnRH. a) Protocolo de dosis múltiple. El antGnRH se administra desde el sexto día de estímulo hasta la inducción de la ovulación. b) Protocolo de dosis única. El ant-GnRH se administra cuando el folículo de mayor tamaño alcanza 14 mm de diámetro. a) Protocolo de dosis múltiple b) Protocolo de dosis única Introducción-42 El uso de análogos de la GnRH anula prácticamente los picos endógenos de LH, disminuyendo el número de ciclos que deben ser cancelados por ovulaciones endógenas extemporáneas. Sin embargo, la utilización de estos fármacos provoca, por un lado, insuficiencia del cuerpo lúteo, obligando al soporte de la fase lútea con progesterona y, por otro, una mayor incidencia del síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO); al requerirse dosis elevadas de gonadotropinas. El SHO se presenta como una respuesta exagerada al tratamiento exógeno con gonadotropinas. Normalmente se trata de un trastorno autolimitante que se resuelve de forma espontánea en pocos días. El SHO presenta un gran abanico de manifestaciones clínicas desde trastornos leves como distensión abdominal a severos como ascitis o hidrotórax, requiriendo en algunas ocasiones la hospitalización de la paciente (Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, 2008). Como ha sido indicado, con el uso de ant-GnRH se requiere un menor número de días de tratamiento y una menor dosis de gonadotropinas, por lo que disminuye la presentación del SHO (Ludwig et al., 2001; Al-Inany y Aboulghar, 2001; Kurzawa et al., 2008; Firouzabadi et al., 2010). Pese a que ambos protocolos (agonistas y antagonistas) se han mostrado eficaces en su capacidad de frenado hipofisario, los resultados en cuanto al número y calidad ovocitaria se muestran contradictorios. Algunos autores observan un mayor número de ovocitos totales así como un mayor número de ovocitos MII en los tratamientos con agonistas (Depalo et al., 2009), mientras que otros no observan diferencias (Firouzabadi et al., 2010). En cuanto a las tasas de gestación/implantación, algunos autores defienden que no existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos (Kurzawa et al., 2008; Firouzabadi et al., 2010; Al-Inany et al., 2011; Gilliam, 2011), mientras que otros mantienen la superioridad de los a-GnRH (Orvieto et al., 2010; Orvieto y Pasquale, 2013). La eficacia de la implantación embrionaria se ha convertido en el caballo de batalla de los ant-GnRH para consolidarse como la primera opción. Existe preocupación por su actividad inhibidora sobre el ciclo celular (Moretti et al., 1996). La interacción del antagonista con el receptor de la GnRH presente en localizaciones extrahipotalámicas, como el folículo ovárico, el embrión o el endometrio, podría comprometer la mitosis celular y penalizar procesos como la foliculogénesis, la maduración ovocitaria, la formación de blastómeras o el desarrollo endometrial (Hernández, 2000; Impicciatore y Tiboni, 2012). Introducción-43 2. Estimulación del DFM: empleo de gonadotropinas Las gonadotropinas se han utilizado desde los años sesenta como método de estimulación folicular y en FIV a partir de la década de los ochenta (Jones et al., 1982). En general, existen dos pautas básicas de tratamiento según las dosis utilizadas. En ambos casos se comenzará el segundo o tercer día de ciclo. En la primera pauta, denominada pauta de dosis fija, el tratamiento se inicia con una dosis fija de gonadotropinas, que se mantiene durante 5 días y, tras el primer control ecográfico/hormonal puede modificarse en función de la respuesta ovárica (número y tamaño folicular) (Figura 24). En la segunda pauta, denominada pauta descendente, el tratamiento se inicia con una dosis de gonadotropinas de reclutamiento que se mantiene durante 2-3 días, reduciéndose a una dosis de mantenimiento los días posteriores (Figura 24). Figura 24: Protocolos de administración de gonadotropinas. a) Protocolo de dosis fija. La dosis de gonadotropinas es fija durante 5 días y posteriormente se ajusta en función de la respuesta ovárica. b) Protocolo de dosis descendente. La dosis de gonadotropinas se mantiene durante 2-3 días y posteriormente se reduce. Entre las gonadotropinas empleadas para la estimulación del DFM se encuentran la gonadotropina menopáusica humana (hMG), FSH y LH. Gonadotropina menopáusica humana La hMG se obtiene mediante purificación de la orina de mujeres postmenopáusicas. Su componente FSH permite reclutar folículos y estimular su crecimiento, y su componente LH facilita la maduración del folículo. La proporción de FSH/LH es 1/1. a) Protocolo de dosis fija b) Protocolo de dosis descendente Introducción-44 Hormona folículo estimulante La FSH actúa de forma similar al componente FSH de la hMG. El continuo avance de la industria farmacológica ha permitido obtener una FSH recombinante altamente purificada (FSHr). En general, en las pacientes normorespondedoras no es necesario asociar LH a la FSH para provocar el DFM. Hormona luteinizante La LH purificada también obtenida mediante tecnología recombinante se utiliza en combinación con FSHr en pacientes con hipogonadismo hipogonadotropo, en las que la hipófisis no secreta la cantidad suficiente de LH para estimular el ovario, o en algunas pacientes con supresión hipofisaria profunda por el uso de análogos de la GnRH. Por el contrario, no debiera utilizarse LH en pacientes con hiperestrogenismo o con niveles elevados de LH. 3. Inducción de la ovulación La ovulación puede inducirse con hCG (gonadotropina coriónica humana) ó aGnRH. El momento para inducir la ovulación viene indicado a nivel ecográfico por la presencia de, al menos, 2-3 folículos en torno a 18 mm de diámetro medio y a nivel analítico mediante la valoración del estradiol plasmático, teniendo en cuenta que por cada folículo que alcance un diámetro medio de 18 mm se producen sobre 200-300 pg/mL de estradiol. Mediante el uso de inductores de la ovulación se consigue la liberación del ovocito en el líquido folicular y la maduración (nuclear) final del mismo. Gonadotropina coriónica humana La hCG posee una estructura y actividad biológica similar a la de la hormona natural del embarazo (βhCG), actuando sobre los receptores para la LH e induciendo la ovulación. Se sabe que ésta tiene lugar 36 horas después de la administración de la hCG, realizándose entonces la aspiración folicular (Nader y Berkowitz, 1990). Actualmente, además de la hormona urinaria, se dispone también de hCG recombinante. Introducción-45 Agonistas de la GnRH Los a-GnRH sólo pueden utilizarse como inductores de la ovulación cuando se usa un ant-GnRH para el frenado hipofisario. Su uso con este fin ha mostrado un perfil hormonal más fisiológico que otros agentes y entre sus ventajas estaría la disminución del SHO (Tay, 2002). IV.1.2 Técnicas de inseminación ovocitaria Los ovocitos recuperados tras la EO y punción folicular pueden ser inseminados utilizando dos técnicas: a) FIV convencional o técnica de microgota y b) la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). 1. FIV convencional o técnica de microgota La FIV se instaura como tratamiento de infertilidad asociada a patología tubárica bilateral, esterilidad por factor masculino no severo, fallos repetidos tras ciclos de inseminación artificial, disfunción ovárica, endometriosis o esterilidad de origen desconocido. La esencia de la técnica es la fecundación del ovocito en condiciones de cultivo in vitro (CIV) previa obtención y preparación de los gametos. Tras la punciónaspiración folicular, los complejos CCOs recuperados se clasifican en función del aspecto morfológico y del grado de expansión del cúmulo, reflejando el estado aproximado de maduración nuclear. Una vez clasificados, los complejos CCOs son colocados en microgotas de medio de cultivo donde se ha depositado una concentración determinada de la muestra de semen capacitada. Tras 18-22 horas, los ovocitos son liberados (denudados) de las células del cúmulo para valorar la fecundación. 2. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides La ICSI aparece como solución a los casos en los que la FIV convencional no puede aplicarse, mayoritariamente en casos de factor masculino severo. Sin embargo, actualmente existe un amplio abanico de indicaciones para esta técnica, como factor masculino grave/azoospermia (ausencia de espermatozoides en el eyaculado), infertilidad de causa inmunitaria, fallos de fecundación tras FIV, diagnóstico genético preimplantacional (DGP), etc. La ICSI consiste en la microinyección de un espermatozoide viable e inmovilizado en el citoplasma de un ovocito MII que ha sido previamente denudado (Palermo et al., 1992). Introducción-46 IV.2 Maduración in vitro de ovocitos procedentes de ovarios no estimulados El coste de los tratamientos de EO supone casi el 50% del valor total de los tratamientos de infertilidad (alrededor de 2.000 euros). Pero además del coste económico, pueden desencadenar el SHO. A falta de que se puedan reducir estos costes económicos y biológicos, la forma más fiable para prevenir ambas desventajas sería evitar los protocolos de EO (Buckett et al., 2005). La maduración in vitro (MIV) de ovocitos fue estudiada por primera vez por Pincus y Enzmann (1935) y su utilización clínica en la especie humana se inicia en la década de los 60 con los trabajos realizados por Robert Edwards en Reino Unido (Edwards, 1965). Sin embargo, no es hasta entrados los años 90 cuando se consiguen las primeras gestaciones y nacimientos con esta técnica (Cha et al., 1991; Trounson et al., 1994; Barnes et al., 1995; Jaroudi et al., 1997; Russell et al., 1997; Jaroudi et al., 1999). Hasta el año 2008 más de 1.000 niños han nacido mediante el empleo de la MIV (Son y Tan, 2010). Sin embargo, esta tecnología es considerada todavía experimental y por razones que se discutirán a continuación, su aplicación clínica está muy limitada actualmente. Las pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP) son las candidatas naturales para tratamientos de MIV. En los últimos años el rango de aplicaciones clínicas de la MIV se ha extendido además a pacientes normovuladoras (que reglan regularmente y tienen ovarios normales) con un recuento de folículos antrales elevado (Fadini et al., 2009a) y niveles elevados de la hormona antimülleriana (AMH) (Fadini et al., 2011). Además la MIV podría estar indicada para preservar la fertilidad en pacientes con cáncer en las que la estimulación hormonal esté contraindicada (Holzer y Tan, 2005). IV.2.1 Pacientes con síndrome de ovario poliquístico El SOP es una disfunción metabólica frecuente con desorden endocrino heterogéneo en mujeres en edad reproductiva (Toulis et al., 2009). Se caracteriza por la presencia de hiperandrogenismo, hiperinsulinemia, hipersecreción de LH, disfunción menstrual, hirsutismo, infertilidad y complicaciones durante el embarazo así como neonatales (Toulis et al., 2009). Los ovarios de pacientes con SOP se caracterizan por la presencia de numerosos folículos antrales en la corteza ovárica así como la ausencia de un folículo dominante. La mayoría de estos folículos, de aproximadamente 5 mm, se caracterizan por permanecer bajo un ambiente androgénico (LH) debido a un aumento Introducción-47 de la secreción por parte de las células de la teca y a un bloqueo de la aromatización por parte de las células de la granulosa. Como consecuencia, las pacientes con SOP pueden ser extremadamente sensibles a las gonadotropinas exógenas y corren el riesgo de presentar con frecuencia el SHO, incluso con concentraciones relativamente bajas de gonadotropinas (Barnes et al., 1996). La respuesta ovárica exagerada tras la EO se caracteriza por el desarrollo de una gran cohorte de folículos de calidad dispar y una recuperación de ovocitos normalmente inmaduros. En estos ciclos las tasas de fecundación, división e implantación son menores y hay un aumento en la tasa de aborto (Sahu et al., 2008; Boomsma et al., 2008; Siristatidis et al., 2009). IV.2.2 Protocolos de MIV El ovario contiene numerosos folículos antrales, tanto en la fase folicular como en la fase lútea en cada ciclo ovulatorio. La forma más genuina de la MIV se caracteriza por la ausencia total de gonadotropinas artificiales y en consecuencia, todos los ovocitos recuperados de los folículos antrales visibles en la corteza ovárica son inmaduros (VG). Seguidamente se usan medios de MIV para estimular su maduración a MII en el laboratorio. En ciclos en los que no se realiza ningún tipo de estimulación ovárica existe una relación proporcional entre el número de ovocitos inmaduros recuperados y la tasa de embarazo tras MIV, alcanzando un 28% en pacientes con más de 10 ovocitos inmaduros recuperados (Tan et al., 2002). No obstante, estos resultados son subóptimos si los comparamos con los protocolos de EO (37,8% gestación/transferencia [Registro Sociedad Española de Fertilidad [SEF] 2011]). Por esta razón, y con objeto de mejorar la calidad y cantidad de los ovocitos, se realiza una imprimación o priming con gonadotropinas, tanto FSH como hCG antes de la recuperación de los ovocitos (Chian et al., 2000). 1. FSH priming Bajos niveles de FSH son capaces de estimular las células de la granulosa, permitiendo la recuperación de un mayor número de ovocitos VG y de mejor calidad (Coticchio et al., 2012). Por lo general suelen administrarse 150 UI de FSH durante 3 días, comenzando el día 3 de ciclo, seguido de 2-5 días sin administración de FSH (coasting) antes de la recuperación de los ovocitos (Mikklesen et al., 2003). Se ha comprobado que la deprivación hormonal tras la imprimación con FSH mejora la calidad de los ovocitos (Nivet et al., 2012). Introducción-48 En pacientes con ciclos regulares el priming con FSH no parece influir en la tasa de gestación (Fadini et al., 2009b) (Tabla 1). En el caso de pacientes con SOP el priming con FSH resulta en tasas de gestación variables, ya que mientras algunos autores observan su efecto beneficioso (Mikkelsen y Lindenberg, 2001), otros no encuentran diferencias (Son et al., 2006) (Tabla 2). 2. hCG priming En el caso de pacientes con ciclos regulares, los resultados son controvertidos, habiendo estudios que observan una mayor tasa de gestación/implantación (Lim et al., 2009), mientras que otros no observan ningún beneficio (Fadini et al., 2009a) (Tabla 1). En pacientes con SOP, hay autores que observan un aumento en la tasa de maduración ovocitaria cuando se realiza un priming con hCG (Chian et al., 2000), mientras que otros no describen diferencias significativas (Söderstrom-Anttila et al., 2005). Varios estudios muestran la tendencia a una mayor tasa de gestación, aunque las diferencias no alcanzan niveles significativos (Chian et al., 2000; Son et al., 2006) (Tabla 2). 3. FSH + hCG priming Mientras que en pacientes con SOP no se ha observado un efecto beneficioso (Lin et al., 2003), una combinación de FSH y hCG incrementa de forma significativa la tasa de gestación clínica en pacientes con ciclos regulares, en comparación con el priming de FSH o hCG por separado (Fadini et al., 2009a) (Tablas 1 y 2). Introducción-49 Autores (Año) Ciclos (N) Ciclos con TE (%) Priming Nº Ovos Rec Horas CIV Tasa de MIV (%) TI (%) Tasa GC/TE (%) Mikkelsen et al., 1999 10 10 Ninguna 3,7 36 76 18,8 30,0 Mikkelsen et al., 1999 10 10 FSH 4,0 36 85 11,8 20,0 Mikkelsen et al., 2000 87 63 Ninguna 6,1 28-36 61,1 8,8 17,4 Mikkelsen et al., 2001 132 83 Ninguna 3,8 28-36 60,1 NA 18,0 Child et al., 2001 56 50 hCG 5,1 48 78,4 1,5 4,0 Yoon et al., 2001 63 51 Ninguna 9,0 56 74,3 6,5 17,6 Söderström-Anttila et al., 2005 91 58 (IVF) Ninguna 6,3 24-36 66,9 22,6 31,0 Söderström-Anttila et al., 2005 100 86 (ICSI) Ninguna 6,5 24-36 54,5 15,0 21,0 Dal Canto et al., 2006 207 164 Ninguna 4,7 26 56,4 8,8 15,2 Fadini et al., 2009a 256 197 Ninguna 4,1 26 56,2 8,5 14,7 Lim et al., 2009 140 138 hCG 12,1 48 66,6 17,8 40,4 Fadini et al., 2009b 100 73 Ninguna 5,3 30 48,4 9,2 15,3 Fadini et al., 2009b 100 66 hCG 5,3 30 57,9 4,0 7,6 Fadini et al., 2009b 100 75 FSH 4,8 30 50,8 10,6 17,3 Fadini et al., 2009b 100 87 FSH + hCG 5,4 30 77,4 16,4 29,9 Tabla 1: Resultado de los ciclos de MIV en pacientes con ciclos regulares (Son WY, Tan SL. Laboratory and embryological aspects of hCG-primed in vitro maturation cycles for patients with polycystic ovaries. Hum Reprod Update 2010; 16 (6): 675-89). CIV: cultivo in vitro. MIV: maduración in vitro. N: número. Nº Ovos Rec: número de ovocitos recuperados. TE: transferencia embrionaria. TI: tasa de implantación. GC: gestación clínica. Introducción-56 Ovocitos MI de maduración rápida: El proceso de extrusión del 1CP puede ser relativamente rápido, pudiendo observarse tras 0.5-3 horas de CIV (Tabla 3; Balakier et al., 2004). En base a ello, la valoración de la maduración (extrusión del 1CP de forma espontánea) suele realizarse entre 2 y 4 horas tras la recuperación ovocitaria, momento en el que además se realiza la ICSI de los ovocitos MII recuperados in vivo. Dicho periodo de incubación se ha llegado a extender hasta las 7 horas en algún caso (Vanhoutte et al., 2005). Las tasas de MIV obtenidas por diferentes grupos durante los distintos periodos de tiempo evaluados se muestran en la Tabla 4. Tiempo de CIV 0.5 horas 1 hora 2 horas 3 horas Tasa de MIV 90/468 (19%) 182/468 (39%) 168/468 (36%) 28/468 (6%) Nº MI a CIV: 604. Nº MI miv: 468. Tabla 3: Tasa de MIV de ovocitos MI obtenidos tras tratamientos de EO en función del periodo de CIV. CIV: cultivo in vitro. MIV: maduración in vitro. miv: madurados in vitro) (Balakier et al., 2004). Autor Tiempo de CIV Tasa de MIV Medio CIV De Vos et al., 1999 4 horas 26,7% Ménézo B2 Chen et al., 2000 3 horas 16,4% HTF (Irvine Scientific) Strassburger et al., 2004 4 horas 45,1% G1.2 (Vitrolife) Vanhoutte et al., 2005 2-4 horas 41% Sydney IVF (Cook) Vanhoutte et al., 2005 4-7 horas 42% Sydney IVF (Cook) Shin et al., 2013 3-4 horas 62,8% - Tabla 4: Tasa de MIV de ovocitos MI obtenidos tras tratamientos de EO tras diferentes periodos de CIV. CIV: cultivo in vitro. HTF: human tubal fluid. MIV: maduración in vitro. La calidad de los embriones obtenidos tras la fecundación de los ovocitos en función del momento de extrusión del 1CP indica que entre 3 y 6 horas tras la extrusión la incidencia de multinucleación es menor (Tabla 5; Balakier et al., 2004). Esto parece sugerir que la maduración nuclear no se completa solamente con la extrusión del 1CP y que es necesario un periodo de tiempo adicional para que el aparato meiótico (spindle) se forme y funcione correctamente. No obstante, un periodo demasiado prolongado en CIV puede resultar en envejecimiento ovocitario y detención del desarrollo embrionario. Por esta razón, es necesario encontrar el intervalo que asegure normalidad cromosómica y competencia citoplasmática. Introducción-57 Tabla 5: Tasa de fecundación tras la microinyección de ovocitos MI miv. BMN: blastómeras multinucleadas (más de un núcleo por célula). CP: corpúsculo polar. DDE: detención del desarrollo embrionario en 1-4 células. ICSI: inyección intracitoplasmática de espermatozoides. PN: pronúcleos. (Balakier et al., 2004). Ovocitos MI de maduración lenta: El cultivo de ovocitos MI durante 24 y 36 horas resulta en tasas de maduración de 73% y 84% respectivamente (Chen et al., 2000). A pesar de que la tasa de división al estadio de 2-4 células (día +2 de desarrollo) no difiere respecto a la de los ovocitos recuperados en MII (95.3% vs. 94.6%; respectivamente), la tasa de embriones de buena morfología es significativamente inferior (24.4% vs. 62.5%; Chen et al., 2000). Además, los embriones resultantes muestran un incremento en la incidencia de anomalías en la organización del citoesqueleto y alteraciones cromosómicas. Se argumenta que el envejecimiento celular (a nivel citoplasmático) que los ovocitos experimentan tras periodos prolongados de CIV aumenta su susceptibilidad para activarse de forma espontánea (Krisher, 2004; Vanhoutte et al., 2005; Miao et al., 2009), resultando en mayores tasas de maduración y de división temprana (justo hasta alcanzar la EGA), pero generando embriones de calidad defectuosa y pobre desarrollo tras la EGA. Con independencia del periodo necesario para completar la meiosis, la mayoría de estudios muestran unas tasas de fecundación con ovocitos MI miv inferiores a las obtenidas con ovocitos MII in vivo (Strassburger et al., 2004: 44% vs. 68%; Vanhoutte et al., 2005: 52% vs. 68%; Shin et al., 2013: 37 vs. 72%; Álvarez et al., 2013: 56% vs. 71%). También se observa una mayor proporción de embriones de mala calidad, con mayor detención de la división y un mayor número de blastómeras multinucleadas, además de un menor desarrollo al estadio de blastocisto. Además, la tasa de implantación es menor respecto a la alcanzada con ovocitos MII in vivo (De Vos et al., 1999) y el desarrollo a término queda limitado a muy pocos casos (De Vos et al., 1999; Chen et al., 2000; Strassburger et al., 2004). Es por esta razón, que los ovocitos MI Momento ICSI tras extrusión CP 2PN 1PN/3PN Embriones con DDE Embriones con BMN 1-1.5 horas 25% 10% 47% 36% 2-2.5 horas 43% 12% 38% 17% 3-6 horas 62% 8% 37% 23% Control MII 77% 5% 17% 13% Introducción-58 procedentes de ciclos estimulados son normalmente descartados para fines reproductivos. V.3 Avances en la MIV de ovocitos VG La tasa de recuperación de ovocitos VG tras los tratamientos de EO es aproximadamente del 9% (datos no publicados). Al igual que con los ovocitos MI, los ovocitos VG son capaces de madurar in vitro con unas tasas que oscilan entre el 35% y el 45% (Reichman et al., 2010; McElroy et al., 2010; Farsi et al., 2011). No obstante, estos ovocitos generan embriones con una capacidad de desarrollo in vitro seriamente comprometida, con defectos en número de células, simetría y fragmentación (Reichman et al., 2010). Además, los ovocitos VG miv muestran una expresión génica dos veces mayor que los ovocitos MII in vivo (Reichman et al., 2010; Jones et al., 2008). Este conjunto de defectos unido a una mayor proporción de anomalías cromosómicas (Magli et al., 2006) resulta en un potencial de implantación y gestación a término muy limitado y en mayor riesgo de aborto (Chen et al., 2000; Balakier et al., 2004; Strassburger et al., 2004). Razones por las que los ovocitos VG se descartan, de forma automática, con fines reproductivos. Con los sistemas de cultivo actuales, derivados de la maduración de ovocitos de ciclos no estimulados (ovocitos incluidos en complejos CCOs) y desarrollados en otras especies animales (ver capítulo IV.2.3 Condiciones de cultivo in vitro), los progresos han sido muy limitados, por no decir inexistentes. Es probable que los ovocitos inmaduros posean defectos irreversibles (Trounson et al., 2001; Strassburger et al., 2004; Li et al., 2006), aunque también es posible que los sistemas de MIV actuales sean incapaces de proveer las condiciones in vitro adecuadas. Así pues, son necesarios estudios que investiguen el potencial real de estos ovocitos (sin cúmulo) para desarrollar sistemas de cultivo que provean sus requerimientos y permitan obtener ovocitos competentes (Tan y Child, 2002). V.4 Empleo de inhibidores meióticos Una de las posibles causas de las anomalías de los ovocitos miv es que dichos ovocitos comienzan el proceso de maduración nuclear de forma precoz mientras todavía deben adquirir la maquinaria citoplasmática y molecular (capítulo III.1 Competencia ovocitaria) necesaria para sustentar el desarrollo embrionario preimplantacional (Sirard et al., 2006; Gilchrist y Thompson 2007). En este sentido, se ha tratado de mejorar la Introducción-59 competencia ovocitaria mediante la inhibición temporal de la maduración meiótica (Anderiesz et al., 2000; Ponderato et al., 2001). Los sistemas de cultivo con inhibidores de la meiosis constan de dos pasos: un pre-cultivo inicial en presencia de inhibidores reversibles de la reanudación meiótica, para posteriormente transferirse al medio de maduración definitivo, carente de inhibidores (Nogueira et al., 2003a). Existen diferentes inhibidores meióticos, entre los fisiológicos encontramos el cultivo con fluido folicular (Sirard y First, 1988), células de la granulosa mural (Kalous et al., 1993) y células de la teca (Richard y Sirard, 1996) entre otros; mientras que entre los inhibidores químicos encontramos la dibutyryl AMPc, butirolactona, cicloheximida (CHX), 6-dimetil amino purina (6-DMAP), citocalasina B, roscovitina y los inhibidores específicos de la fosfodiesterasa (cilostamida [CT], milrinona, Org9935). Inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 3 (IPDE3) La presencia de elevados niveles de AMPc es necesaria para mantener el arresto meiótico (capítulo II.1 El arresto meiótico). En ausencia de células del cúmulo (en ovocitos VG procedentes de EO), y por tanto de GMPc (inhibidor natural de la PDE3A), la PDE3A está activa, degradando el AMPc intraovocitario, y facilitando la reanudación de la meiosis. Empleo de IPDE3 en ovocitos procedentes de ovarios no estimulados La adición de IPDE3 al medio de cultivo mantiene al ovocito, tanto en complejos CCOs como denudados, en profase I de forma reversible (Mayes y Sirard 2002; Thomas et al., 2002). Además, la exposición combinada de los complejos CCOs a CT (IPDE3) y forskolina (activador de la AC) mejora la tasa de fecundación tras MIV (Shu et al., 2008). Más allá del efecto sobre la maduración, el cultivo “previo” de los complejos CCOs en presencia de IPDE3 ejerce un efecto positivo sobre la capacidad de desarrollo (Nogueira et al., 2003b; Thomas et al., 2004). Sin embargo, estos resultados son todavía subóptimos en comparación con los MII in vivo, indicando la necesidad de continuar con la mejora de la MIV. Para explotar el potencial de los IPDE3, y prolongar la comunicación entre el ovocito y las células del cúmulo, se han cultivado los complejos COCs durante 24 o 48 horas en presencia del inhibidor (Nogueira et al., 2006). A pesar de que no se encontraron diferencias en la tasa de maduración tras 48 Introducción-60 horas de MIV sin inhibidor (74 y 73% respectivamente), el cultivo durante 24 horas resultó en embriones de mejor calidad (Nogueira et al., 2006). Empleo de IPDE3 en ovocitos procedentes de ovarios estimulados El pre-cultivo con IPDE3 de complejos CCOs y ovocitos denudados procedentes de EO es también capaz de mantener al ovocito en profase I de forma reversible (Jensen et al., 2002; Nogueira et al., 2003a). En la especie humana, el cultivo de los complejos CCOs presumiblemente inmaduros (basándose en el grado de expansión y compactación del cúmulo) con el IPDE3 Org9935 durante 24 y 48 horas mejora la tasa de maduración nuclear, aunque el cultivo durante 24 horas da lugar a embriones con una menor tasa de fragmentación (Nogueira et al., 2006). El pre-cultivo de ovocitos VG denudados procedentes de ciclos de ICSI con inhibidores meióticos mejora la sincronización entre la maduración nuclear y citoplasmática (Vanhoutte et al., 2007). Estos autores demostraron que cuando se cultivan ovocitos VG con CT (concentración 1 µmol/L), la tasa de maduración tras 48 horas es similar a la de los ovocitos cultivados en su ausencia (control). Sin embargo, la proporción de ovocitos con configuraciones normales del aparato meiótico y cromosomas correctamente alineados fue superior respecto al grupo de VG miv y no tratadas con el inhibidor, sin mostrar diferencias con los ovocitos MII in vivo (Vanhoutte et al., 2007). Pese a los avances realizados hasta la fecha, no existe una clara evidencia del efecto beneficial del cultivo previo con IPDE3 en cuanto a la capacidad de desarrollo de ovocitos humanos VG procedentes de EO (denudados previamente). V.5 Co-cultivo de ovocitos VG procedentes de EO con células del cúmulo La estrecha relación entre las células del cúmulo/granulosa y el ovocito (ver capítulo I.3 Comunicación entre ovocito y células del cúmulo) sugiere que la denudación ovocitaria previa a la finalización de la maduración del ovocito puede ser detrimental para la calidad ovocitaria (Nogueira et al., 2006). En un intento por restablecer el apoyo de las células del cúmulo al ovocito denudado y para estudiar la interacción entre los dos compartimentos celulares algunos investigadores han intentado establecer sistemas de co-cultivo en diferentes especies. El co-cultivo de ovocitos VG denudados de ratón (procedentes de ovarios no estimulados) sobre monocapas de células del cúmulo mejora la maduración ovocitaria (Ge et al., 2008). Luciano y Introducción-61 colaboradores (2005) observaron que mientras el co-cultivo de ovocitos VG bovinos denudados (procedentes de ovarios no estimulados) con células del cúmulo disgregadas no mejoraba su competencia, sí lo hacía cuando éstos eran co-cultivados con complejos CCOs intactos. En la especie humana el co-cultivo de ovocitos EO-VG denudados con células del cúmulo disociadas (Häberle et al., 1999; Johnson et al., 2008; Zhu et al., 2008) no mejoró las tasas de MIV de forma significativa, probablemente por la ausencia de conexiones directas entre ambos tipos celulares. En un intento por establecer una situación más fisiológica se introdujo el concepto de co-cultivo en presencia de una ECM (matriz extracelular) (Combelles et al., 2005; Torre et al., 2006). La ECM confiere al co-cultivo una estructura tridimensional (3D) que regula la morfogénesis, supervivencia, migración, proliferación, comunicación, metabolismo y respuesta a estímulos externos (Bissell, 1998). De esta forma un ambiente 3D resulta en un comportamiento celular y en unos perfiles de expresión génica similares a los observados en cultivos vivos (Cukierman et al., 2002). Pero además, la ECM regula la supervivencia, proliferación y esteroidogénesis de las células de la granulosa (Huet et al., 2001). Así, el cultivo de folículos y complejos CCOs en geles de colágeno demostró que los folículos requieren de una ambiente físico rígido para sobrevivir y crecer in vitro y, que el cultivo con el gel de colágeno incrementó el número de capas de células de la granulosa y el tamaño del ovocito (Abir et al., 1999; Hornick et al., 2012). Estos resultados sugieren que el co-cultivo 3D con células del cúmulo en presencia de inhibidores de la progresión meiótica podría mejorar la MIV de ovocitos humanos VG denudados. Introducción-62 Introducción-63 VI. Activación ovocitaria VI.1 Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide Tras la ovulación, los ovocitos únicamente proseguirán con la división meiótica si son fecundados. Es en este momento cuando el espermatozoide, por medio de señales no bien conocidas, genera oscilaciones periódicas de Ca2+ (Kline y Kline 1992) que reducen los niveles de MPF (propios del ovocito en arresto meiótico, ver capítulo II.2.2 Etapas de la reanudación de la meiosis. 6. Re-arresto meiótico) e inducen la liberación del arresto meiótico y el desarrollo embrionario posterior. Las oscilaciones de Ca2+ deben ser elevadas en momentos puntuales para que la reanudación y finalización de la meiosis, el establecimiento del bloqueo de la poliespermia y la correcta utilización de los ARNm maternos necesarios para la EGA (Ducibella et al., 2006) se produzcan de forma adecuada (Toth et al., 2006). La habilidad del ovocito para generar oscilaciones de Ca2+ se adquiere de manera progresiva durante la maduración meiótica. Así, los ovocitos fecundados en profase I generan menos oscilaciones de Ca2+ que aquellos fecundados en MII (Cheung et al., 2000). Además, el primer pico de Ca2+ es de mayor amplitud y duración en ovocitos maduros que en inmaduros (Jones et al., 1995). Ésto se debe a la adquisición de los siguientes cambios citoplasmáticos (Figura 25): 1) Reorganización del RE, principal almacén de Ca2+ del ovocito. 2) Incremento de la concentración de iones de Ca2+ en el RE. 3) Redistribución de las proteínas de unión al Ca2+ en el RE. 4) Incremento del número de receptores de IP3 (RIP3). 5) Cambios en las propiedades bioquímicas de los RIP3. No obstante, esta capacidad para generar oscilaciones de Ca2+ no es un indicador absoluto de competencia ovocitaria. De hecho, ovocitos bloqueados en MI generan oscilaciones de calcio continuas y similares a las generadas por los ovocitos maduros (Jones et al., 1995). Las oscilaciones de Ca2+ producidas durante la activación ovocitaria no son solo necesarias en la fecundación ovocitaria sino que también afectan el desarrollo embrionario y posterior implantación (Toth et al., 2006; Ozil et al., 2006; Borges et al., 2009). Se desconoce el mecanismo molecular exacto, pero se ha postulado que las oscilaciones de Ca2+ podrían regular la expresión génica (Borges et al., 2009). Introducción-64 Figura 25: Cambios acontecidos en el RE durante la maduración ovocitaria que permiten la activación del ovocito tras la fecundación. El primer pico de Ca2+ (amplitud y duración) así como el número de oscilaciones de Ca2+ varía en función del estadio de maduración ovocitario. Ca2+: calcio. MII: metafase II. RE: retículo endoplásmico. R1IP3: receptor 1 del inositol 1, 4, 5 trifosfato. VG: vesícula germinal. Se han propuesto 3 teorías para explicar el mecanismo de liberación de Ca2+ desencadenado por el espermatozoide durante la fecundación (Whitaker, 2006): Teoría del conducto espermático: el Ca2+ fluye a través de un canal desde el espermatozoide al ovocito durante la fusión de gametos (Jaffe, 1983). Sin embargo, no existe evidencia que soporte el incremento en la concentración de Ca2+ en el lugar de fusión. Además, la activación no se impide al disminuir los niveles de Ca2+ (Jones et al., 1998). Teoría del receptor: diversos estudios indican que la liberación de Ca2+ durante el proceso de fecundación está mediado por el IP3 (Parrington et al., 2007). El ovocito presenta un receptor de membrana, probablemente la tetraspanina CD9 (Miyado et al., 2000; Li et al., 2004; Ziyyat et al., 2006; Zhou et al., 2009), donde se une el ligando IZUMO1 (Inoue et al., 2013) presente en el espermatozoide. Dicha unión activa a la CD9 que se une a una proteína G o a una proteína tirosina quinasa (PTK) que activa a su vez a la fosfolipasa C (PLC). Ésta induce la hidrólisis del PIP2 en diacilglicerol (DAG) e IP3. El IP3 generado se une al receptor RIP3 presente en la superficie del RE. La producción constante y elevada de IP3 es responsable del incremento periódico de los niveles de Ca2+ (Lee et al., 2010) (Figura 26). Ovocito VG Reorganización RE Incremento número de R1IP3 Cambio propiedades bioquímicas R1IP3 Incremento iones Ca2+ almacenados en la célula [?] Redistribución de proteínas RE de unión al Ca2+ [?] Ovocito MII [Ca2+] Tiempo [Ca2+] Tiempo Introducción-65 Figura 26: Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide. Teoría del receptor. La unión del ligando espermático IZUMO1 al receptor de membrana ovocitario CD9 resulta en la cascada de liberación de Ca2+ del RE. Ca2+: calcio. CD9: tetraspanina CD9. IP3: inositol 1, 4, 5 trifosfato. MPF: factor promotor de la maduración. PG: proteína G. PIP2: fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato. PLC: fosfolipasa C. PTK: proteína tirosina quinasa. R: receptor. RIP3: receptor inositol 1, 4, 5 trifosfato. Las dos teorías anteriores asumen que la liberación de Ca2+ es absolutamente dependiente de la interacción física entre el espermatozoide y el ovocito. Sin embargo, la ICSI merma su credibilidad. Teoría del factor espermático: sugiere que el espermatozoide al fusionarse con el ovocito introduce un factor citosólico soluble (factor espermático) que provoca la liberación de Ca2+. Se trata de una PLC específica del espermatozoide, denominada PLCζ, con una elevada sensibilidad al Ca2+ comparado con otras isoformas (Wu et al., 2001; Saunders et al., 2002). La liberación de la PLCζ al citoplasma ovocitario activa la enzima que hidroliza el PIP2 en DAG e IP3. El IP3 se une al receptor RIP3 presente en la superficie del RE, provocando el incremento periódico de los niveles de Ca2+ (Ito et al., 2010) (Figura 27). Figura 27: Activación ovocitaria mediada por el espermatozoide. Teoría del factor espermático. La fusión del espermatozoide con el ovocito es responsable del aumento de los niveles de Ca2+ citoplasmático, que, a su vez, activan al ovocito. Ca2+: calcio. IP3: inositol 1, 4, 5 trifosfato. MPF: factor promotor de la maduración. PIP2: fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato. PLCζ: fosfolipasa C zeta. RE: retículo endoplasmático. RIP3: receptor inositol 1, 4, 5 trifosfato. Reanudación de la meiosis (inhibición MPF) Bloqueo poliespermia (exocitosis gránulos corticales) Utilización ARNm maternos (activación genoma embrionario) Desarrollo embrionario posterior Factor espermático (PLCζ ) IP3 RIP3 Ca 2+ RIP3 Ca 2+ RIP3 Ca 2+ PIP2 RE RE RE IP 3 Retículo endoplásmi co Ca2+ Membrana plasmática Exocitosis gránulos corticales Inhibición actividad MPF R PG PIP2 PTK Fertilina β ? CD9 PLC RIP3 Ca2+ Objetivos-71 II. Objetivos El objetivo general del presente trabajo de tesis es evaluar la competencia de ovocitos humanos inmaduros metafase I (MI) y vesícula germinal (VG) obtenidos tras un tratamiento de estimulación ovárica controlada y madurados in vitro en distintos medios de maduración. El objetivo general se desglosa en los siguientes objetivos parciales: 1. Determinar la capacidad de maduración in vitro de ovocitos MI y VG en diferentes medios de maduración. 2. Determinar la configuración del aparato meiótico (spindle) de ovocitos MI y VG tras ser madurados in vitro en diferentes medios de maduración. 3. Determinar la tasa de activación partenogenota y posterior desarrollo embrionario de ovocitos MI y VG tras ser madurados in vitro en diferentes medios de maduración. 4. Determinar el número de copias de ADN mitocondrial en ovocitos MI y VG antes y después de ser madurados in vitro en diferentes medios de maduración. 5. Determinar la expresión de los receptores para la FSH, LH y EGF y para los ligandos de este último, TGF α y EGF en ovocitos VG madurados in vitro utilizando diferentes medios de maduración. 6. Determinar el efecto del inhibidor de la fosfodiesterasa 3 cilostamida sobre la tasa de maduración, la configuración del aparato meiótico (spindle) y la tasa de activación partenogenota y posterior desarrollo embrionario de ovocitos VG tras ser madurados in vitro en diferentes medios de maduración. 7. Determinar el efecto del co-cultivo con células del cúmulo sobre la tasa de maduración, la tasa de activación y posterior desarrollo embrionario de ovocitos VG tras ser madurados in vitro. 8. Evaluar la competencia y potencial de desarrollo de los ovocitos inmaduros tras ser madurados in vitro mediante la derivación de células madre embrionarias partenogenotas. Objetivos-72 III. Material y Métodos ! Material y Métodos-73 III. Material y Métodos I. Obtención y recuperación de ovocitos I.1 Protocolo de estimulación ovárica Este trabajo de investigación queda incluido en el proyecto “Derivation of human stem cell lines using nuclear transfer and parthenogenetically activated oocytes” aprobado por el Instituto de Salud Carlos III y que fue llevado a cabo en el Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF, Valencia, España). Además recibió la aprobación del Comité de Ética e Investigación del Hospital Universitari i Politècnic La Fe de Valencia. Las pacientes incluidas dentro del Programa de FIV de la Unidad de Reproducción Asistida (Servicio de Ginecología) firmaron el correspondiente consentimiento informado de participación en el citado proyecto. Las pacientes incluidas en el estudio fueron tratadas siguiendo los protocolos de EO controlada para FIV, utilizando tanto agonistas como antagonistas de la GnRH. En el grupo de agonistas, se administró una dosis diaria de agonista desde la mitad de la fase lútea previa (acetato de nafarelina, 200 mg/3 veces/día vía intranasal ó triptorelina 0.1 mg/día vía subcutánea) seguida de la inyección diaria de gonadotropinas (urinarias o recombinantes). En el grupo de antagonistas, la estimulación ovárica se realizó mediante la inyección diaria de gonadotropinas seguida de una dosis diaria de 0.25 mg de un antagonista de la GnRH (Cetrotide, Merck-Serono ó de Orgalutran, Organon) una vez se observó un folículo dominante de 14 mm o los niveles séricos de estradiol alcanzaron los 400 pg/mL. Los criterios de finalización del tratamiento fueron los mismos para ambos grupos. Se administró hCG cuando, al menos, se observaron en ecografía 2-3 folículos en torno a 18 mm de diámetro medio. La aspiración folicular se realizó bajo sedación general y mediante punción transvaginal guiada por ecografía 36 horas después de la administración de hCG (Ovitrelle, Merck-Serono; 250 µg/0.5 mL, equivalente a 6.500 UI aproximadamente). La técnica empleada para la inseminación de los ovocitos fue la ICSI en todos los casos. ! Material y Métodos-74 I.2 Recuperación de los ovocitos Los tubos con el fluido folicular aspirado en el quirófano de FIV fueron remitidos al laboratorio de FIV, situado junto al quirófano con el fin de reducir el tiempo desde la aspiración hasta su cultivo. Una vez en el laboratorio, los complejos CCOs fueron localizados bajo estereomicroscopio y mantenidos en medio IVF (Universal IVF Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark) a 37º C y 5% de CO2 durante al menos 2 horas (protocolo estándar establecido en el laboratorio). A continuación, los complejos CCOs fueron incubados durante un tiempo inferior a 30 segundos (tiempos de exposición superiores son perjudiciales para el ovocito) en 80 UI/mL de hialuronidasa (Hyadase, Medicult, Jyllinge, Denmark) seguido del pipeteado mecánico de los ovocitos para eliminar las células del cúmulo y determinar el estadio madurativo de los mismos. Los ovocitos fueron entonces evaluados en un microscopio invertido (200x). Los ovocitos MII, se caracterizan por la presencia del 1CP y por presentar los cromosomas condensados y desprovistos de envoltura nuclear. Los ovocitos inmaduros en MI carecen del 1CP pero presentan los cromosomas condensados sin envoltura nuclear y los ovocitos en profase I, que también carecen del 1CP, presentan los cromosomas descondensados dentro de la VG (Figura 28). Los ovocitos inmaduros (VG y MI) fueron distribuidos de forma aleatoria en los diferentes medios de maduración (descritos en II.1 Experimento 1.1 Medios de maduración in vitro) y los ovocitos MII in vivo sirvieron como grupo control en todos los experimentos del estudio. Figura 28: Ovocitos en estadio de a) MII, b) MI y c) VG. Imágenes cedidas por la Unidad de Reproducción Asistida Humana del Hospital Universitari i Politècnic la Fe de Valencia. Para la realización del presente estudio se incluyeron un total de 1751 ovocitos, de los cuales 76 fueron ovocitos MII, 771 ovocitos MI y 904 ovocitos VG. a b c ! Material y Métodos-75 II. Diseño experimental Todos los reactivos químicos utilizados en el estudio son de Sigma (SigmaAldrich, Madrid, España), a menos que se indique lo contrario. II.1 Experimento 1.1: Competencia nuclear y citoplasmática en ovocitos VG y MI tras su maduración in vitro en diferentes medios de maduración En este experimento se comparó el efecto que tres medios de maduración (IVF, 199s y HOM) tienen sobre: 1. Tasa de maduración in vitro. 2. Volumen citoplasmático. 3. Configuración del aparato meiótico (spindle). 4. Tasa de activación y desarrollo embrionario tras activación partenogenota. Medios de maduración in vitro Los ovocitos inmaduros fueron sometidos a MIV utilizando tres medios de maduración: 1) IVF (Universal In Vitro Fertilization Medium, Origio 1031), 2) TCM199 (Tissue Culture Medium, Sigma-Aldrich M4530) suplementado (199s) y 3) HOM (Human Oocyte Maturation Medium, preparado en el laboratorio). La composición del IVF, 199s (Heindryckx et al., 2007) y HOM (Trounson et al., 2001) se describe en la Tabla 7. IVF 199s HOM Sustituto sintético del suero (SSR®) Descrito en la información del producto (M4530; Sigma-Aldrich) Agua para transferencia embrionaria (Sigma; W1503) Sales inorgánicas Earle´s Balanced Salts Solution (EBSS) 1.8 mM CaCl2.2H2O (Sigma; C7902) 5.5 mM KCl (Sigma; P5405) 1.0 M MgSO4.7H2O (Sigma; M1880) 105 mM NaCl (Sigma; S5886) 25.0 mM NaHCO3 (Sigma; S5761) 0.5 mM NaH2PO4.H2O (Sigma; S9638) ! Material y Métodos-76 Aminoácidos Descrito en la información del producto (M4530; Sigma-Aldrich) 1X Aminoácidos esenciales (Sigma; B6766) 2X Aminoácidos no esenciales (Invitrogen; 11140) ! ! ! 0.1 mM Taurina (Sigma; T8691) ! ! ! 0.1 mM Cisteína (Sigma; C7602) 0.5 mM Cisteamina (Sigma; M9768) Vitaminas - Descrito en la información del producto (M4530; Sigma-Aldrich) 0.1X Vitaminas (Sigma; M6895) Glucosa desconocido 5.5 mM 5.5 mM (Sigma; G6152) Piruvato de sodio desconocido 0.3 mM (Sigma 490709) 0.3 mM (Sigma 490709) Lactato de sodio - - 3 mM (Sigma; L7900) Bicarbonato de sodio desconocido - - Glutamina - 1 mM (Invitrogen; 35050) 1 mM (Invitrogen; 35050) Albúmina sérica humana (HSA) desconocido 0.8% (Sigma; A1653) 0.2% (Sigma; A1653) Ácido etilendiamino tetra acético (EDTA) - - 0.1 mM (Sigma; E6511) ITS (Insulina, transferrina y selenio) - - 1!µL/mL (Gibco; 1299)! Factor de crecimiento epidérmico (EGF) - 10 ng/mL (Sigma; E9644) 10 ng/mL (Sigma; E9644) r-FSH - 0.075 UI/mL (Gonal-α, Serono, Madrid, Spain) 0.1 UI/mL (Gonal-α, Serono, Madrid, Spain) Estradiol - 1 µg/mL (Progynova, Schering, Madrid, Spain)! 1 µg/mL (Progynova, Schering, Madrid, Spain)! hCG - 0.5 UI/mL (hCG-Lepori, Farma Lepori, Barcelona) - r-LH - - 0.5 UI/mL (Luveris, Serono, Madrid, Spain) Rojo fenol + + - Antibioticos 50 mg/L Estreptomicina 1% Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen; 15070063) 1% Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen; 15070063) 50.000 IU/L Penicilina 50 µg/mLGentamicina (Sigma; G1397) Tabla 7: Composición de los medios IVF, 199s y HOM. ! Material y Métodos-77 1. Tasa de maduración in vitro El momento en el que los ovocitos fueron transferidos al medio de maduración se consideró como el punto de partida de la MIV. Los ovocitos se cultivaron en grupos (por estadio de maduración) en gotas de aproximadamente 50 µL de medio cubiertas por aceite mineral (sistema de microgota). Los ovocitos inmaduros fueron clasificados en tres grupos: a) VG, b) MI 4 horas (MI 4h), definidos como aquellos ovocitos que maduran en las primeras 4 horas de CIV y c) MI 24 horas (MI 24h), definidos como aquellos ovocitos que maduran tras 24 horas de CIV. Se realizaron observaciones seriadas de los ovocitos a intervalos aproximados de 4 (en el caso de MI), 24 (en el caso de MI y VG) y 48 horas (en el caso de VG), para verificar la maduración nuclear, evaluada por la extrusión del 1CP. 2. Volumen citoplasmático Se evaluó el volumen citoplasmático de ovocitos inmaduros tanto antes como tras su MIV en los diferentes medios de maduración, y se comparó con el de ovocitos MII. Para ello, se determinó el diámetro ovocitario individual (D) (mediante la media de dos diámetros) y el volumen ovocitario (V) fue calculado utilizando la siguiente fórmula estándar: V= 4/3 π (D/2)3. 3. Configuración del aparato meiótico (spindle) Para el estudio de microtúbulos y microfilamentos de los ovocitos se utilizó el protocolo de tinción inmunocitoquímica descrito por Lin y colaboradores (2008) con algunas modificaciones. La composición de las soluciones empleadas se muestra en la Tabla 8. ! Material y Métodos-78 SOLUCIÓN FIJADORA - MTSB, 5-X (Tampón de estabilización de microtúbulos) EGTA (Ácido tetraacético etilenglicol) 12.5 mM Cloruro de Magnesio (M4880) 25 mM PIPES (Piperacina-1,4-bis ácido 2-etilenglicol) (P6757) 0.5 M Hidróxido de sodio (72068) 1M - DTT (Ditiotreitol) (D9760) 1 mM - Óxido de deuterio (364312) 50% - Paclitaxel (T7191) 1 µM - Tritón X-100 (X-100) 0.1% - Formaldehído (F8775) 2% - Aprotina (A1153) 0.01% SOLUCIÓN DE LAVADO CON PVA PBS (Tampón fosfato salino) (Gibco 14190) PVA (Polivinil alcohol) (P8136) 0.1% SOLUCIÓN DE LAVADO BASE PBS (Tampón fosfato salino) (Gibco 14190) BSA (Albúmina sérica bovina) (A9647) 2% Ácida sódica (S8032) 0.2% SOLUCIÓN DE LAVADO (se prepara a partir de la solución de lavado base a la que se adiciona) Leche en polvo (70166) 0.2% Suero de cabra (G9023) 2% Tritón X-100 (X-100) 0.1% SOLUCIÓN DE ANTICUERPOS Anticuerpos primarios: Anticuerpo monoclonal Anti!α‐Tubulina producido en ratón (T-6074). Dilución 1/400 en solución de lavado Anticuerpo monoclonal Anti!β‐Tubulina producido en ratón (T-5293). Dilución 1/400 en solución de lavado Anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 Anti-IgG de ratón producida en pollo (H+L) (Invitrogen; A21200). Dilución 1/200 en solución de lavado TINCIÓN DE MICROFILAMENTOS Solución de rodamina-faloidina (Invitrogen; R415) Tabla 8: Soluciones empleadas para la tinción inmunocitoquímica de microtúbulos y microfilamentos. Protocolo: Los ovocitos intactos (sin eliminar la zona pelúcida) fueron incubados durante 1 hora a 37º C en la solución de fijación. Posteriormente, fueron lavados tres veces, 5 minutos cada vez, en la solución de lavado suplementada con 0.1% de PVA y se mantuvieron a 4º C hasta la tinción inmunocitoquímica. Para ello, los ovocitos fueron permeabilizados en solución de lavado con tritón X-100 al 0.5% durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) y posteriormente lavados durante 30 minutos a TA. Para la tinción, los ovocitos fueron expuestos a una solución con anticuerpos primarios anti-α y anti-β tubulina (1/400) durante 90 min a 37º C, seguido de tres lavados de 5 minutos a ! Material y Métodos-79 TA. Los ovocitos fueron entonces incubados en el anticuerpo secundario (1/200) durante 2 horas a 37º C, seguido de tres lavados de 5 minutos. Los microfilamentos fueron teñidos con rodamina-faloidina durante 1 hora a TA y posteriormente lavados tres veces. Finalmente, los ovocitos fueron montados sobre cubreobjetos a los que se les había colocado una arandela de papel autoadhesiva de un grosor aproximado de 1mm con medio de montaje con DAPI (ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI, Invitrogen; P36931). De esta manera, quedaba formada entre cubre y portaobjetos una cámara (Figura 29) del tamaño adecuado para mantener la estructura 3D del ovocito. En el centro de cada arandela se colocaron un máximo de 3 ovocitos. Durante el montaje se puso especial cuidado en no producir presión mecánica sobre la muestra que pudiese alterar su morfología. Los cubreobjetos se sellaron con laca de uñas y se mantuvieron a 4º C protegiéndolos de la luz hasta su observación. Para la observación de los microtúbulos y cromatina se utilizó un microscopio confocal (Leica DM IRE 2) equipado con un laser de argón perteneciente al Servicio de Microscopía del CIPF. Figura 29: Montaje de los ovocitos para el estudio del aparato meiótico. Evaluación de la configuración del aparato meiótico y de los cromosomas: El complejo aparato meiótico/cromosomas puede mostrar diferentes configuraciones normales (Cobo et al., 2008). Así, si el complejo se encuentra orientado paralelo al plano focal, el aparato presenta una forma típica de barril con los cromosomas alineados en el ecuador de la estructura (Figura 30a y 30d). Por el contrario, si el complejo se orienta de forma perpendicular al plano focal, los microtúbulos del aparato meiótico se asocian con los cromosomas en una estructura circular (Figuras 30b y 30e). En algún caso intermedio, los complejos se localizan de forma oblicua al plano focal, de forma que los cromosomas aparecen en una formación oval. En estos casos, el aparato meiótico se observa como una estructura en forma de barril con los polos acortados (Figuras 30c y 30f). Los aparatos meióticos ligeramente o Medio de montaje Ovocito Cubreobjetos Porta cristal Arandela papel Laca uñas ! Material y Métodos-86 Gen PCR par primers Primers 5´-3´ Secuencia primer Temparatura annealing (º C) Tamaño (bp) HPRT Outer 5´end CTCCGCCTCCTCCTCTGCT 50 3´end GCCTGACCAAGGAAAGCAAAG 50 528 Inner 5´end GCCGGCTCCGTTATGGCG 55 3´end AGCCCCCCTTGAGCACACAGA 55 226 RFSH Outer 5´end CATCATCGGATCTGTCACTG 55 3´end CAGCCCCACGAAAGAATTTC 55 318 Inner 5´end GAGAGCAAGGTGACAGAGATTCC 55 3´end CTTTTTGGAGAGAATGAATCTT 55 175 RLH Outer 5´end CACTTGCCTACCTCCCTGTCA 55 3´end CTGATGCCTGTGTTACAGAT 55 451 Inner 3´end TGCTCCGGGCTCAATGTATCT 55 313 EGF Outer 5´end TGCCAACTGGGGGAGCACAG 58 3´end CTGCCCGTGGCCAGCGTGGC 58 339 Inner 5´end TGCCAGCTGCACAAATACAGAGGG 58 3´end CATCGTGGGACAGGGGACATTCA 58 167 TGFα Outer 5´end CCTGCTGCCCGCCCGCCCGT 61 3´end GCTGGCAGCCACCACGGCCA 61 305 Inner 5´end CTGCCCGCCCGCCCGTAAAA 61 3´end CCGCATGCTCACAGCGTGCA 61 275 REGF Outer 5´end GGACGACGTGGTGGATGCCG 61 3´end GGCGCCTGTGGGGTCTGAGC 61 208 Inner 5´end CCTCATCCCACAGCAGGGCTTC 61 3´end GCTGTATCGCTGCAAGAAGCTGTC 61 163 Tabla 9: Secuencia de oligonucleótidos de los primers utilizados para la RT-PCR. 2.3 PCR cuantitativa (Q-PCR) Para determinar la expresión de los genes en estudio (RFSH, RLH, REGF, EGF y TGF α ) se empleó como gen de referencia el HPRT (hypoxanthine phosphoribosyl transferase). La mezcla patrón (master mix) para cada PCR estuvo compuesta por: 10 µL SYBR® Green PCR Master MIX (Applied Biosystems; 4309155) y 0.75 µM de cada primer (HPRT, RFSH, RLH, REGF, EGF y TGF α ; Tabla 9) completado con agua estéril. El volumen total de la reacción de PCR fue de 20 µL/pocillo. De forma individual, se añadió a cada uno de los pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos (Roche-Biotest) 1µL del producto de la primera PCR diluido 8 veces, al que se le añadieron 19 µL de la mezcla patrón. Las reacciones se realizaron en el termociclador LightCycler® 480 (Roche) bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95º C durante 3 minutos seguido de 94º C durante 30 segundos, 56º C durante 30 segundos y 72º C durante 30 segundos en un total de 40 ciclos. Todas las reacciones se corrieron por triplicado. ! Material y Métodos-87 II.4 Experimento 4: Efecto del bloqueo temporal de la maduración nuclear sobre la competencia citoplasmática y capacidad de desarrollo de ovocitos VG En este experimento se comparó el efecto del inhibidor de la fosfodiesterasa 3 cilostamida (CT; C7971) sobre: 1. Tasa de maduración in vitro. 2. Configuración del aparato meiótico (spindle). 3. Tasa de activación y desarrollo embrionario tras activación partenogenota. Se empleó como material biológico ovocitos VG y se limitaron los medios de maduración al HOM y 199s. 1. Adición de la CT al medio de maduración Con el medio que mejor tasa de maduración había generado hasta el momento (HOM), se ensayaron dos concentraciones de CT: 0.5 y 1 µM durante 24 horas, basándonos en las concentraciones empleadas por otros autores (Vanhoutte et al., 2007). En función de la tasa de maduración se seleccionó la concentración de CT 0.5µM y se compararon sus efectos bajo dos medios de CIV: 199s y HOM. Los ovocitos se distribuyeron en los dos medios de maduración (HOM y 199s) sin presencia de inhibidor (control in vitro) y con 0.5 µM de CT durante 24 horas. La CT fue eliminada del medio a las 24 horas de cultivo mediante el lavado de los ovocitos en medio fresco sin presencia del inhibidor. En ese momento se valoró la eficacia del inhibidor en función del porcentaje de ovocitos detenidos en VG. 2. Tasa de maduración in vitro La reversibilidad de la CT se valoró tras el CIV de los ovocitos durante un periodo máximo de 48 horas. Se comprobó el estadio madurativo a las 24 y a las 48 horas y se clasificó en VG, MI o MII. Cuando los ovocitos se cultivaron en ausencia de CT, la tasa de maduración se valoró tras 24-48 horas de CIV. La configuración del aparato meiótico en presencia/ausencia de CT, así como la tasa de activación y desarrollo embrionario tras AP fueron evaluadas de igual manera que en el experimento 1.1. ! Material y Métodos-88 II.5 Experimento 5: Co-cultivo de ovocitos VG con células del cúmulo En este experimento se diseñó un sistema de co-cultivo 3D con células del cúmulo para la MIV de ovocitos VG. Se comparó la capacidad para progresar a MII en función del sistema de cultivo: microgota o co-cultivo en microgota pero con células del cúmulo (ver apartado 2. Co-cultivo tridimensional). Además, se evaluaron las tasas de activación partenogenota y de desarrollo embrionario de aquellos ovocitos que maduraron in vitro. Posteriormente, se combinó el co-cultivo tridimensional con células del cúmulo con la adición durante un periodo de 24 horas de CT. Por un lado, la CT inhibe la maduración espontánea precoz, mientras que las células somáticas que rodean al ovocito lo proveen de un microambiente que favorece los procesos de maduración ovocitarios. Se evaluaron los mismos parámetros que en la primera parte del experimento. A continuación se detallan los pasos seguidos para la preparación del co-cultivo: Composición de las soluciones: Tampón de lisis: compuesto por 8.29 g/l NH4Cl (A0171), 1.0 g/L KHCO3 (P9144), 0.58 g/L EDTA (ácido etilendiaminotetraacético, E6511). Todo ello disuelto en agua para transferencia de embriones (W1503) y pH ajustado a 7.2. Solución de matriz extracelular (ECM): compuesta por colágeno humano 1% (3,53 mg/ml; Human Collagen Type I, 354243, BD Biosciences). Para llevarla a una fuerza iónica neutra y pH 7.4 se mezclan 8 volúmenes de colágeno 1%, 1 volumen de medio concentrado TCM 199 10X (M0650) y 1 volumen de NaOH 0.05 N (35249) que contiene 22 mg/mL de NaHCO3 (S5761). 1. Aislamiento y tratamiento de las células del cúmulo Las células del cúmulo fueron recuperadas tras su eliminación enzimática y mecánica de los ovocitos en su preparación para la técnica de ICSI. Para obtener un número suficiente se hizo un pool con las células del cúmulo de diferentes pacientes. Se centrifugaron durante 3 minutos a 300g. El pellet resultante fue resuspendido (500 µL) y expuesto durante 5 minutos a 37º C a un buffer de lisis para eliminar la posible presencia de células sanguíneas. A continuación las células del cúmulo fueron centrifugadas (300g 3 minutos) y resuspendidas en 1 mL de PBS (libre de calcio/magnesio; Gibco; 14190) atemperado y suplementado con un 5% de HSA (A1887) para eliminar los restos de hialuronidasa y los debris celulares. La mezcla fue ! Material y Métodos-89 centrifugada (300g, 3 minutos) y el pellet resultante resuspendido en 1 mL de PBS (libre de calcio/magnesio) sin HSA. Se centrifugó de nuevo (300g, 3 minutos) y el pellet resultante se resuspendió suavemente en 100µL de solución de tripsina (Gibco 12563) y se mantuvo durante 5 minutos a 37º C para dispersar los agregados celulares. Finalmente, se mezcló con 1 mL de PBS sin calcio/magnesio atemperado y suplementado con 5% HSA y la mezcla se centrifugó a 300g durante 3 minutos. El pellet resultante se resuspendió en 0.5mL de PBS sin calcio/magnesio suplementado con 5% HSA. Con la ayuda de un hemocitómetro se determinó la concentración celular y mediante una tinción vital con eosina se estimó la viabilidad celular, que ha de ser superior al 80%. Se realizó una última centrifugación (300g, 3 minutos) y el pellet obtenido se resuspendió en 10-20 µL de PBS sin calcio/magnesio suplementado con 5% HSA. 2. Co-cultivo tridimensional El co-cultivo se preparó siguiendo el protocolo descrito por Combelles y colaboradores, 2005, con ligeras modificaciones. Una vez preparada la solución de ECM se mantuvo en hielo hasta su uso. Las células del cúmulo recuperadas y purificadas se mezclaron con la solución ECM para obtener una concentración final de 4x106 células/mL. Se sembraron microgotas (4 µL) de esta suspensión en placas de Petri de 35mm (Nunc) consiguiendo un total de 8000 células del cúmulo por gota, aproximadamente. En cada gota se colocó un ovocito con el menor volumen de medio posible. Se permitió la polimerización del gel a 37º C durante 10 minutos y a continuación se adicionaron de 50-80 µL de medio de maduración que fueron cubiertas con aceite mineral. 3. Medio de cultivo para la maduración ovocitaria El medio de maduración empleado fue el 199s, cuya composición fue detallada en la Tabla 7. Para el cultivo previo de los ovocitos con el inhibidor de la fosfodiesterasa se adicionó CT 0.5 µM al medio 199s. ! Material y Métodos-90 Los ovocitos VG fueron distribuidos de la siguiente manera: (i) MIV convencional: los ovocitos fueron cultivados en microgotas de aproximadamente 50 µL de medio de maduración 199s. Se evaluó la tasa de MIV tras 48 horas de cultivo. (ii) MIV en un co-cultivo 3D con células del cúmulo. Tras 48 horas de permanencia en la matriz se evaluó la tasa de MIV. (iii) MIV en un co-cultivo 3D con células del cúmulo y presencia de CT. Tras 24 horas de co-cultivo con presencia de CT, se eliminó el medio, se hicieron dos lavados (durante 5 minutos a 37º C cada uno) y se cultivaron los ovocitos en medio 199s sin CT por un periodo de 48 horas, tras el cual se evaluó la tasa de MIV. 4. Activación y desarrollo embrionario tras AP La tasa de activación y desarrollo embrionario tras AP se evaluó de igual manera que en el experimento 1. En la Figura 33 se muestra la evolución del proceso de co-cultivo de ovocitos inmaduros VG con células del cúmulo y posterior activación partenogenota y desarrollo embrionario. Figura 33: Evolución del proceso de co-cultivo de ovocitos inmaduros VG con células del cúmulo y posterior AP y desarrollo embrionario. (a) Ovocito VG. (b) Ovocito VG en co-cultivo con células del cúmulo. (c): Ovocito MII tras co-cultivo con células del cúmulo. (d) Ovocito activado (1PN1CP). (e) Embrión en 4 células. (f) Embrión en 8 células. (g) Blastocisto. II.6 Experimento 6: Derivación de líneas de células madre embrionarias partenogenotas humanas (hpESC) En este experimento se empleó la AP de ovocitos humanos para la obtención de blastocistos y la derivación de líneas de células madre específicas de paciente. Para ello se utilizaron tanto MII in vivo como ovocitos inmaduros (MI 4h, MI 24h y VG) miv en medio 199s (Tabla 10). ! ! a b c d e f g ! Material y Métodos-91 Medio Tratamiento de activación Ovocito N 199s Ionóforo Ca2+ + 6-DMAP VG 10 MI 4h 11 MI 24h 22 199s Ionóforo Ca2+ + 6-DMAP + Dc VG 13 MI 4h 10 MI 24h 32 MII in vivo Ionóforo Ca2+ + 6-DMAP MII 15 Ionóforo Ca2+ + 6-DMAP + Dc MII 8 Tabla 10: Número de efectivos incluidos en los grupos de activación. 6-DMAP: 6dimetilaminopurina; Dc: demecolcina. MI: metafase I. MII: metafase II. N: número de ovocitos activados (1PN 1CP) destinados a derivación. VG: vesícula germinal. 1. Activación partenogenota Se ensayaron dos protocolos de AP: a) Ionóforo de calcio (A23187) 5 µM durante 5 minutos seguido de una incubación con 6-DMAP 2mM durante 3 horas. b) Ionóforo de calcio (A23187) 5 µM durante 5 minutos seguido de una incubación con 6-DMAP 2mM y Demecolcina 0.4 µg/mL durante 3 horas y finalmente una última incubación en Demecolcina 0.4 µg/mL durante 1 hora. Las condiciones de cultivo fueron siempre a 37º C y 5% de CO2. La demecolcina (Dc) es un inhibidor de la polimerización de los microtúbulos, concretamente, se une firmemente a los dímeros de tubulina (Ibáñez et al., 2003; Song et al., 2009) evitando la formación del aparato meiótico y la extrusión del 2CP (Song et al., 2009) durante la AP. Tras la activación, los ovocitos fueron lavados tres veces en medio IVF fresco y cultivados separadamente en gotas de 50 µL de ISM1 (Medicult, Jyllinge, Denmark) bajo aceite mineral a 37º C y 5% de CO2. Las tasas de activación y desarrollo embrionarias fueron valoradas de igual manera que en el Experimento 1. 2. Aislamiento y cultivo de las células madre Tanto los embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto, como aquellos que detuvieron su desarrollo durante el CIV (embriones en los que no hubo división durante ! Material y Métodos-92 24 horas) fueron cultivados sobre una capa de feeders de HFFs (human foreskin fibroblasts, mitóticamente inactivados con mitomicina C). En el caso de embriones detenidos la ZP fue eliminada con pronasa 0.5 % (P5147). Cuando el blastocisto quedó unido a la capa de feeders y las células del trofoblasto estuvieron expandidas, la MCI se hizo visible. Tras un cultivo adicional de 3 o 4 días, una porción de la MCI se separó del trofoectodermo de forma mecánica, mediante una pipeta de vidrio fina y fue cultivada sobre una nueva capa de HFFs durante 3-4 días más. En la Tabla 11 se detalla la composición de los medios de cultivo para los HFFs y para la MCI/hpESC. Los sucesivos pases se realizaron tras 5-6 días de cultivo. Mientras que en los pases iniciales las colonias fueron divididas en grupos (clumps) de forma mecánica, en pases posteriores se combinó colagenasa IV (Invitrogen, 17104019) con disociación mecánica. El cultivo se realizó a 37º C y 5% de CO2. HFFs MCI/hpESC 90% DMEM (Invitrogen, 31966047) VitroHES (Vitrolife) 10% Suero cordón umbilical humano 4 ng/mL hr-bFGF (Chemicon, GF003) Penicilina-Esterptomicina (100 U/100 µg) (Invitrogen) 5 ng/mL hrLIF (Chemicon, LIF1005) 10% Suero cordón umbilical humano Tabla 11: Composición de los medios de cultivo de HFFs y MCI/hpESC. DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle Medium. HFF: human foreskin fibroblast. hpESC: células madre embrionarias humanas partenogenotas. hr-bFGF: human recombinant-basic fibroblast growth factor. hr-LIF: human recombinant-leukemia inhibitory factor. MCI: masa cellular interna. Antes de preparar el medio se descartó la presencia de VIH (virus inmunodeficiencia humana), VHB (virus hepatitis B), VHC (virus hepatitis C) y sífilis en el suero de cordón umbilical. 3. Caracterización de las hpESC 3.1 Detección de marcadores de totipotencia mediante inmunofluorescencia a) Marcadores SSEA-1 (Stage Specific Embryonic Antigen-1), SSEA-4 (Stage Specific Embryonic Antigen-4), NANOG, OCT-4 (Octamer Transcritiopn Factor-4), TRA-1-60 (Keratan sulfate antigen-1-60) y TRA-1-81 (Keratan sulfate antigen-1-81). Se fijaron las colonias con paraformaldehído 4% (P6148) durante 20 minutos a TA y se lavaron dos veces en tampón de lavado (1% BSA, 0.05% ácida sódica y 0.1% Tween 20 [P9416] en PBS). La permeabilización de las colonias se realizó con Triton X-100 al 0.1% en PBS durante 20 minutos, seguida de un lavado y una incubación de 1 hora en solución de bloqueo (5% BSA y 0.05% ácida sódica en PBS). Posteriormente, ! Material y Métodos-93 las colonias se incubaron, por separado para cada uno de los marcadores, toda la noche a 4º C con los anticuerpos primarios. Las concentraciones de anticuerpos utilizadas fueron las siguientes: SSEA-1 (IgM, 5-10 µg/mL; Invitrogen, 411200), SSEA-4 (IgG, 5-10 µg/mL; Invitrogen, 414000), NANOG (IgG, Dilución 1:100; Chemicon, MABD24A4), OCT-4 (IgG, Dilución 1:100; Chemicon, MAB4419C3), TRA-1-60 (IgM, 5-10 µg/mL; Invitrogen, 411000) y TRA-1-81 (IgM, 5-10 µg/mL; Invitrogen, 411100). El anticuerpo no unido específicamente se eliminó mediante lavado y las muestras se incubaron entonces 1 hora con el anticuerpo secundario correspondiente, Alexa Fluor 546, (fluorescencia naranja) (IgG, 1-10 µg/mL Invitrogen, A21089) y 488 (fluorescencia verde) (IgG, 1-10 µg/mL Invitrogen, A11013). Los núcleos se tiñeron con DAPI. b) Fosfatasa alcalina (PA) Para determinar la expresión de la PA las muestras se fijaron en metanol (322415): formaldehído (dilución 9:1) durante 2 minutos y se incubaron durante 15 minutos, a TA y en oscuridad con la mezcla de PA, según instrucciones del fabricante (Alkaline phosphatase detection kit; Chemicon, SCR004). Las colonias positivas se tiñen de color rojizo mientras que las negativas aparecen más tenues o sin color. 3.2 Análisis del perfil de expresión génica La expresión de los marcadores génicos de pluripotencia se analizó mediante RT-PCR. Para la extracción del ARN se utilizó TRIzol (Invitrogen, 15596018). El ADNc fue sintetizado a partir de aproximadamente 1 µg del ARN total mediante el Kit Superscript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen 56575) y posteriormente amplificado mediante PCR con los primers GADPH, GDF3, ESG1, hTERT, OCT-4, REX-1, SOX-2, NANOG y FGF4 (Tabla 12). Los HFFs sirvieron como control negativo. Los productos de la PCR fueron separados por tamaño mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio y analizados mediante un analizador de imágenes. Como control de expresión constitutiva se utilizó la expresión del GADPH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). La línea hESC H9 sirvió como control positivo. ! Material y Métodos-94 Gen Sentido (5´-3´) Antisentido (5´-3´) Tamaño (pb) GADPH ACCACAGTCCATGCCATCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA 450 GDF3 AGACTTATGCTACGTAAAGGAGCT CTTTGATGGCAGACAGGTTAAAGTA 150 ESG1 GATGGTGGTGGTGACTCAGAG CCTCCATTGCCTCTATATCAG 560 HTERT GCTTCCTCAGGAACACCAAGA TGCAACTTGCTCCAGACACTC 298 OCT-4 CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA 198 REX-1 GCTGACCACCAGCACACTAGGC TTTCTGGTGTCTTTGCCCG 298 SOX-2 GCCTGGGCGCCGAGTGGA GGGCGAGCCGTTCATGTAGGTCTG 443 NANOG CAGCTGTGTGTACTCAATGATAGATTT CAACTGGCCGAAGAATAGCAATGGTGT 142 FGF4 CTACAACGCCTACGAGTCCTACA GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG 370 Tabla 12: Secuencia de oligonucleótidos de los primers utilizados para la PCR. 3.3 Cariotipado Las colonias de hpESC se incubaron en 0.2 µg/mL de colchicina (Invitrogen, 234115) durante 2 horas a 37º C. A continuación, las células fueron tripsinizadas (solución de tripsina durante 1 minuto), lavadas en PBS e incubadas en una solución de cloruro potásico 0.075 mol/L durante 10 minutos a 37º C y finalmente fueron fijadas en metanol:ácido acético glacial (1005706) (dilución 1:3) y depositadas en portas de cristal. La extensión cromosómica fue bandeada con Giemsa y fotografiada. Se realizó el cariotipado de las ESC cada 10 pases, evaluándose 50 metafases II. Se consideró un cariotipo normal si el número de cromosomas y el patrón de bandas G fueron correctos. 3.4 Capacidad de diferenciación in vitro e in vivo Las hpESC se aislaron con colagenasa IV 1 mg/mL durante 5 minutos, seguidamente se cultivaron en microgotas invertidas permitiendo que formasen cuerpos embrioides (EB). El medio de cultivo estuvo compuesto por: 80% knockout DMEM (Gibco, 10829-018) suplementado con 20% SSS, 0.1 mM 2-mercaptoetanol (Invitrogen, 21985023) y 1% de aminoácidos no esenciales. Tras un cultivo de 14-15 días, los EB se tiñeron con marcadores de ectodermo, mesodermo y endodermo. Para la detección de marcadores ectodérmicos se emplearon anticuerpos monoclonales de ratón antiβ tubulina III (IgG; Invitrogen, 480011). Para la detección de marcadores mesodérmicos se emplearon anticuerpos monoclonales de ratón antidesmina (IgG; Invitrogen, 180016). Finalmente, para la detección de marcadores endodérmicos se usaron anticuerpos monoclonales de ratón anti-α fetoproteína humana (IgG; Invitrogen, ! Material y Métodos-95 180003). Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 546 y Alexa Fluor 488. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Para determinar la capacidad de diferenciación in vivo se evaluó la formación de teratomas en ratones macho SCID (con inmunodeficiencia combinada severa) adultos. Para ello, se inyectaron alrededor de 5-6 millones de hpESC (recuperadas de los pases 10, 15 y 20) en los testículos. El sacrificio de los animales se realizó a los tres meses y se diseccionaron varios tejidos del teratoma, que fueron fijados, procesados, seccionados y teñidos con hematoxilina/eosina. Las secciones fueron examinadas con microscopio de campo claro. 3.5 Actividad telomerasa Para determinar la actividad telomerasa se empleó el kit TRAPEZE RT Telomerase (Chemicon). Tanto el control positivo, control negativo, control H2O y control Chaps se incluyen en el kit. La línea H9 se usó como control positivo. ! Resultados-101 Medio N Configuración aparato meiótico Configuración cromosómica Microfilamentos Nm LA A Nm LA A Nm % N % N % N % N % N % N % IVF 14 10 71 1 7 3 21 10 71 1 7 3 21 14 100 199s 13 13 100 0 0 0 0 10 77 1 8 2 15 13 100 HOM 19 14 74 2 11 3 16 16 84 1 5 2 11 19 100 Total 46 37 80 3 7 6 18 36 78 3 7 7 15 46 100 Control 6 6 100 0 0 0 0 6 100 0 0 0 0 6 100 Tabla 16: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos MI 24h madurados in vitro con los tres medios de maduración ensayados. A: alterada. LA: ligeramente alterada. N: número de efectivos por grupo. Nm: normal. Valores en la misma columna con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). 4. Tasa de activación y desarrollo embrionario tras activación partenogenota Los ovocitos HOM-miv VG alcanzaron una tasa de activación partenogenota (evaluada por la formación pronuclear) estadísticamente similar al grupo control y significativamente superior (p=0.02) que la obtenida en el resto de grupos de maduración (Tabla 17). Aunque se observó una menor tasa de activación en el grupo de las VG maduradas en 199s (199s-miv VG; 43%), la tasa de división tras 48 horas de CIV fue estadísticamente similar (p=0.24) a la observada en el grupo HOM-miv VG y en el grupo control, mientras que en el grupo IVF-miv VG fue significativamente inferior (p=0.015) (Tabla 17). Tras 72 horas de CIV, la tasa de división para los grupos IVF-miv VG y 199s-miv VG (13% y 0%) fue estadísticamente inferior (p=0.001) a la observada en el grupo control (73%), mientras que esta tasa de división en el grupo HOM-miv VG (40%) no presentó diferencias con ninguno de ellos. A pesar de los resultados favorables obtenidos en el grupo HOM-miv VG, los embriones resultantes no fueron capaces de alcanzar el estadio de blastocisto, a diferencia de lo observado en el grupo control. Es muy probable que las anomalías observadas en la morfología del aparato meiótico contribuyan a este déficit en el desarrollo embrionario. La calidad embrionaria evaluada por el número, asimetría de blastómeras y grado de fragmentación fue peor en los tres grupos de ovocitos VG madurados en los tres medios de maduración comparados con el grupo control (los datos no se muestran). Debido al bajo número de efectivos, no se realizó análisis estadístico en relación a la calidad embrionaria. ! Resultados-102 Medio N Activación 48h CIV 72h CIV BT Nº PN % Nº Divididos/Nº PN % Nº Divididos/Nº PN % Nº BT/Nº PN % IVF 29 15 52a 7/15 47a 2/15 13a 0/15 0 199s 30 13 43a 10/11 91b 0/11 0a 0/11 0 HOM 32 25 78b 20/25 80b 10/25 40ab 0/25 0 Total 91 53 58 37/51 73 12/51 24 0/51 0 Control 11 11 100b 11/11 100b 8/11 73b 4/11 36 Tabla 17: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos VG madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados. BT: Blastocisto. CIV: cultivo in vitro. N: número de efectivos por grupo. PN: pronúcleos. Valores en la misma columna con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). En el grupo de ovocitos MI 4h no se observaron diferencias significativas en la tasa de activación para los tres medios de maduración ensayados, aunque cabe destacar que el grupo de MI 4h madurados en 199s (199s-miv MI 4h) es el único que mostró una tasa de activación estadísticamente similar a la del grupo control (p=0.062) (Tabla 18), probablemente debido a que el porcentaje de ovocitos en anafase fue inferior que en el resto de grupos. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de maduración y el control para la tasa de división, tanto a las 48 como a las 72 horas. Además, se obtuvieron blastocistos en todos los grupos de maduración. Aunque no se alcanzaron niveles de significancia, la tasa de blastocistos fue inferior que en el grupo control (Tabla 18). Tras el CIV, la calidad embrionaria fue similar entre los grupos de maduración y el grupo control, aunque no se realizó análisis estadístico. Medio N Activación 48h CIV 72h CIV BT Nº PN % Nº Divididos /Nº PN % Nº Divididos /Nº PN % Nº BT/Nº PN % IVF 24 12 50a 11/12 92 9/12 75 1/12 8ab 199s 27 20 74ab 17/20 85 9/20 45 1/20 5a HOM 26 13 50a 12/13 92 7/13 54 1/13 8ab Total 77 45 58 40/45 89 25/45 56 3/45 7 Control 11 11 100b 11/11 100 8/11 73 4/11 36b Tabla 18: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos MI 4h madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados. BT: Blastocisto. CIV: cultivo in vitro. N: número de efectivos por grupo. PN: pronúcleos. Valores en la misma columna con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). En el caso de los ovocitos MI 24h, la tasa de activación fue significativamente superior (p=0.018) en el grupo HOM y en el control en comparación con el resto de grupos (Tabla 19). Sin embargo, esta tendencia desapareció tras 72 horas de CIV (Tabla ! Resultados-103 19), cuando la tasa de división disminuyó drásticamente en este medio. Aunque en el grupo IVF-miv MI 24h, las tasas de activación y división a las 48h de cultivo fueron inferiores a la del grupo control, un embrión (4%) alcanzó el estadio de blastocisto. Tras 48 y 72 horas de cultivo, los embriones de los diferentes grupos de maduración mostraron una peor calidad embrionaria al ser comparados con el grupo control. Medio N Activación 48h CIV 72h CIV BT Nº PN % Nº Divididos /Nº PN % Nº Divididos /Nº PN % Nº BT/Nº PN % IVF 35 24 69a 15/24 63a 11/24 46ab 1/24 4a 199s 36 26 72a 23/25 92b 14/25 56a 0/25 0a HOM 23 22 96b 17/22 77ab 5/22 23b 0/22 0a Total 94 72 77 55/71 78 30/71 42 1/71 1 Control 11 11 100b 11/11 100b 8/11 73a 4/11 36b Tabla 19: Tasa de activación partenogenota y desarrollo embrionario de ovocitos MI 24h madurados in vitro en los tres medios de maduración ensayados. BT: Blastocisto. CIV: cultivo in vitro. N: número de efectivos por grupo. PN: pronúcleos. Valores en la misma columna con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). Experimento 1.2: Efecto de ITS en la maduración nuclear Los resultados del experimento 1.1 sugieren que uno o varios de los componentes del medio HOM son los responsables de la aceleración de la maduración nuclear observada en los ovocitos VG. Tras comparar la composición de los diferentes medios, se sospechó que el ITS podía ser el causante. Así, en este experimento se evaluó el efecto del ITS (1 µL/ mL) en el medio 199s sobre la aceleración de la tasa de MIV de ovocitos VG. Se eligió el medio 199s (y no el IVF) porque además de ser un medio empleado en la MIV de ovocitos, resultó en mejores tasas de división (48horas) que el IVF. Como era de esperar, su adición aumentó de forma significativa (p=0.004) la tasa de maduración a las 24 horas comparado con el medio 199s sin aditivar, igualando lo sucedido con el medio HOM (199s-ITS: 28% y HOM: 24% vs. 199s: 6%; Figura 37). Sin embargo, las diferencias a las 48 horas no alcanzaron niveles de significación estadística, probablemente debido al reducido número de efectivos. ! Resultados-104 Figura 37: Tasa de maduración in vitro de ovocitos VG cultivados en los medios HOM y 199s, suplementado o no con ITS. N: número de efectivos por grupo. VG: vesícula germinal. Valores entre columnas con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). La adición de ITS también resultó en una disminución estadísticamente significativa (p=0.011) en la proporción de configuraciones normales del aparato meiótico/organización cromosómica (Tabla 20). Medio N Configuración aparato meiótico Configuración cromosómica Microfilamentos Nm LA A Nm LA A Nm % N % N % N % N % N % N % 199s 10 9 90a 0 0 1 10 9 90a 0 0 1 10 10 100 199s + ITS 11 4 36b 0 0 7 64 4 36b 0 0 7 64 11 100 HOM 10 2 20b 1 10 7 70 4 40b 0 0 6 60 10 100 Control 6 6 100a 0 0 0 0 6 100a 0 0 0 0 6 100 Tabla 20: Análisis del aparato meiótico y de la configuración cromosómica en ovocitos VG tras su maduración in vitro en el medio HOM y 199s, suplementado o no con ITS. A: alterada. LA: ligeramente alterada. N: número de efectivos por grupo. Nm: normal. Valores en la misma columna con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). Experimento 2: Cuantificación del número de copias de ADN mitocondrial tras la maduración in vitro en diferentes medios de maduración Se aislaron un total de 81 muestras de ADNg (genómico) procedentes tanto de ovocitos inmaduros (n=13) como de ovocitos miv en los tres medios ensayados (n=59). Los ovocitos MII (n=9) sirvieron como grupo de referencia en cuanto a contenido de ADNmt. N=5 N=6 N=28 N=47 N=14 N=80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 199s 199s-ITS HOM VG 48h 199s 199s-ITS HOM VG 24h a b b Tasa de maduración in vitro ! ! Resultados-105 La calidad del ADNg obtenido se evaluó mediante el ratio de absorbancia 260/280 (en promedio 1.91). El número medio de copias de ADNmt en los ovocitos MII in vivo fue de 118.307±14.385,53, mostrando una elevada variabilidad inter-ovocitaria (de 65.030,81 a 204.055,18). Es interesante destacar que los ovocitos inmaduros (VG y MI) presentaron un número de copias de ADNmt estadísticamente similar al de los ovocitos MII in vivo (VG: de 60.255,94 a 183.823,27; MI: de 82.641,14 a 362.981,44). No obstante, hay que tomar estos resultados con cautela debido al reducido número de efectivos en estos grupos. Tras la MIV de los ovocitos, con independencia del medio de MIV (IVF, 199s u HOM) ni del tiempo de CIV (4h ó 24h en el caso de MI), el número medio de copias de ADNmt se mantuvo estadísticamente similar (VG miv: 137.781±10.669; MI miv: 134.491±11.244) al número previo a la MIV, así como al del grupo control (Figura 38). Figura 38: Comparación del número de copias de ADNmt en ovocitos inmaduros VG y MI antes y después de su MIV. Como grupo control se utilizaron los MII in vivo. MI: metafase I. MI miv: MI madurados in vitro. MII: metafase II in vivo. N: número de efectivos por grupo. VG: vesícula germinal. VG miv: VG maduradas in vitro. Valores entre columnas con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). En cuanto al efecto que el medio de maduración pudiera tener sobre el número de copias de ADNmt, en el caso de ovocitos VG y MI 4h los medios de maduración no afectaron estadísticamente a la cantidad de ADNmt (Figura 39). Sin embargo, los ovocitos IVF-miv MI 24h presentaron una cantidad de ADNmt inferior que el resto de grupos, y notablemente inferior al rango esperado para un ovocito MII (Figura 39). N=5 N=24 N=8 N=35 N= 9 0 50000 100000 150000 200000 250000 VG VG miv MI MI miv MII ! Número de copias de ADNmt ! Resultados-106 Figura 39: Número de copias de ADNmt en ovocitos miv en los tres medios de maduración establecidos. MI: metafase I. MII: metafase II in vivo. N: número de efectivos por grupo. VG: vesícula germinal. Valores entre columnas con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). Dentro de cada grupo (VG, MI 4h y MI 24h) se utilizaron los ovocitos sin madurar (VG y MI) como control, así como los MII in vivo. II.3 Experimento 3: Efecto del medio de maduración in vitro sobre la expresión génica en ovocitos VG Puesto que el estudio de la expresión génica se realizó en ovocitos individuales, se optó por realizar dos rondas de PCR encadenada (nested PCR) para asegurar la detección de los ARNm. Expresión del gen HPRT El producto del gen constitutivo HPRT fue detectado en todos los ovocitos, confirmando la integridad del ARN-ADNc así como la idoneidad del protocolo de PCR (Figura 40). Además, la expresión de este gen se produjo alrededor del ciclo 8, con independencia del estadio de maduración y cultivo ensayados. Todas las reacciones de PCR se corrieron por triplicado. Las muestras blanco fueron sometidas también al mismo protocolo de PCR con los primers específicos y no se detectó amplificación para ninguno de los genes en estudio (Figura 40). N=7 N=9 N=8 N=5 N=4 N=4 N=4 N=8 N=8 N=10 N=5 N=8 N=9 0 50000 100000 150000 200000 250000 HOM IVF 199s VG IVF 199s MI HOM IVF 199s HOM MI VG MI 4h MI 24h MII a b a b a b ! Número de copias de ADNmt ! Resultados-107 Figura 40: Expresión del producto del gen HPRT y ausencia de expresión en el caso de las muestras blanco. BLANK: muestra blanco. MII: metafase II. GV: vesícula germinal. VG IVF: ovocito VG madurado en medio IVF. Expresión génica en ovocitos MII La expresión de cada uno de los genes en estudio se normalizó respecto a la expresión del gen constitutivo para cada ovocito. Seguidamente, se utilizó la media de los ovocitos MII como calibrador para cada gen en estudio. De modo que la expresión de los genes diana se representa como el cambio en expresión respecto a la expresión en los ovocitos MII. Los ovocitos MII no expresaron los genes para los RFSH, RLH y REGF (Figura 41). Solamente uno de los ovocitos (que fue eliminado del análisis estadístico) mostró expresión para estos receptores, probablemente debido a la contaminación cruzada por parte de alguna célula del cúmulo remanente, que sí expresan estos receptores (ver capítulo I.4 Control hormonal de la fase folicular). ! Resultados-108 Figura 41: Expresión génica en ovocitos MII in vivo para RFSH, RLH, REGF, EGF y TGF α . EGF: factor de crecimiento epidérmico. HPRT: hypoxanthine phosphoribosyl transferase. REGF: receptor EGF. RFSH: receptor FSH. RLH: receptor LH. TGFα : factor de crecimiento transformador α. Expresión génica en ovocitos VG y VG miv Para valorar la expresión génica en ovocitos VG (no sujetos a maduración y tras MIV) se utilizó como calibrador los ovocitos MII, de forma que se comparó la expresión de los genes de estudio con este grupo. Aquellos valores que se alejaron de la expresión media de cada gen (probablemente debido a una contaminación cruzada por parte de alguna célula del cúmulo remanente) no fueron incluidos en el análisis estadístico. Expresión de los genes RFSH y RLH Basándonos en la expresión de RFSH y RLH en ovocitos MII como referencia, no se observó expresión para estos receptores en ovocitos VG. Expresión del gen REGF Los únicos ovocitos que presentaron expresión para el gen del REGF fueron los HOM-miv VG (Figura 42). De los 5 ovocitos HOM-miv VG solo 1 no expresó el gen para el REGF. Este resultado sugiere la existencia de alguna alteración en la expresión génica causada probablemente por el medio HOM. Figura 42: Expresión de REGF en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados. 199s: ovocito VG madurado en medio 199s. HOM: ovocito VG madurado en medio HOM. IVF: ovocito VG madurado en medio IVF. MII: metafase II. REGF: receptor EGF. VG: vesícula germinal intacta (sin madurar). N=6 N=3 N=5 N=4 N=4 0 2 4 6 8 10 12 REGF MII VG IVF 199s HOM ! N=7 N=7 N=5 0,00 0,50 1,00 1,50 HPRT RFSH RLH REGF EGF TGF α N=6 N=6 N=6 ! ! Resultados-109 Expresión del gen EGF Aunque todos los ovocitos estudiados expresaron EGF, los ovocitos VG miv mostraron una expresión estadísticamente superior (p<0.01) que los ovocitos MII (control in vivo) y similar a los VG intactos (no sometidos a MIV) (Figura 43). Estos resultados sugieren de nuevo anomalías en la regulación génica durante la MIV. Figura 43: Expresión de EGF en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados. 199s: ovocito VG madurado en medio 199s. EGF: factor de crecimiento epidérmico. HOM: ovocito VG madurado en medio HOM. IVF: ovocito VG madurado en medio IVF. MII: metafase II. VG: vesícula germinal intacta (sin madurar). Valores entre columnas con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). Expresión del gen TGF α Aunque todos los ovocitos estudiados expresaron TGF α , los ovocitos VG miv e intactos (no sometidos a MIV) mostraron una expresión estadísticamente superior (p<0.01) que los ovocitos MII (control in vivo) (Figura 44). ! Figura 44: Expresión de TGF α en ovocitos VG no sujetos a maduración y miv utilizando los tres medios de maduración ensayados. 199s: ovocito VG madurado en medio 199s. HOM: ovocito VG madurado en medio HOM. IVF: ovocito VG madurado en medio IVF. MII: metafase II. TGF α: factor de crecimiento transformador α. VG: vesícula germinal intacta (sin madurar). Valores entre columnas con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). N=7 N=5 N=5 N=5 N=5 0 1 2 3 4 5 EGF MII VG IVF 199s HOM a ab b b b ! N=5 N=5 N=5 N=5 N=5 0 1 2 3 4 TGF α" MII VG IVF 199s HOM b a b b b ! ! Resultados-110 II.4 Experimento 4: Efecto del bloqueo temporal de la maduración nuclear sobre la competencia citoplasmática y capacidad de desarrollo de ovocitos VG 4.1 Efecto de la concentración de cilostamida (CT) sobre la maduración nuclear Se ensayó la capacidad de dos concentraciones de CT para bloquear, de forma reversible, la progresión meiótica en ovocitos VG. Para ello se optó por el medio que asegurase mejores tasas de maduración y desarrollo para VG, el medio HOM. Ambas concentraciones de CT ensayadas (0.5 y 1 µM) fueron capaces de mantener al ovocito detenido en VG (Tabla 21). Pese a que tras la eliminación de la CT del medio, los ovocitos fueron capaces de reanudar la meiosis en ambas condiciones (ovocitos que tras 24 horas de cultivo sin inhibidor alcanzaron el estadio de MI o MII), la tasa de VG detenidas tanto a 24 horas como a 48 horas fue mayor cuando se empleó 1 µM de CT. Por esta razón, se eligió la menor concentración de inhibidor para el resto del experimento. Medio HOM 199s Sin CT CT 0.5 µM CT 1 µM Sin CT CT 0.5 µM Nº VG tras inhibición (%) 120/127 (94.5)a 26/26 (100) 79/108 (73.1)b Nº VG a MIV 118 120 26 109 79 Maduración tras 24h de MIV (%) VG (%) 41 (34.8) 23 (19.2) 10 (38.5) 29 (26.6) 28 (35.4) MI (%) 49 (41.5) 91 (75.8) 16 (61.5) 73 (67) 45 (57) MII (%) 28 (23.7%)aa 6 (5)bb 0b 7 (6.4)b 6 (7.6)b MI + MII (%) 77 (65.2)aa 97 (80.8)bb 16 (61.5)a 80 (73.4)ab 51 (64.6)a Maduración tras 48h de MIV (%) VG (%) 22 (18.6) 18 (15) 9 (34.6) 24 (22) 20 (25.3) MI (%) 16 (13.6) 42 (35) 7 (26.9) 16 (14.7) 12 (15.2) MII (%) 80 (67.8)aa 60 (50)bb 10 (38.6)b 69 (63.3)a 47 (59.5)ab Tabla 21: Progresión meiótica en ovocitos VG arrestados temporalmente con diferentes concentraciones de CT seguida de miv durante 48 horas en los medios HOM y 199s. CT: cilostamida. MI: metafase I. MII: metafase II. MIV: maduración in vitro. VG: vesícula germinal. Valores en la misma fila con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p<0.05). El recuadro rojo indica el número/porcentaje de ovocitos que reinician la meiosis tras 24h de MIV. 4.2 Efecto de la CT sobre la tasa de maduración nuclear en función del medio de maduración ensayado El 94.5% de los ovocitos expuestos a 0.5 µM CT en HOM y el 73.1% en 199s quedaron eficazmente detenidos en estadio de VG (p=0.001). Cabe resaltar que el bloqueo de la meiosis no es tan efectivo en el medio 199s. Una vez eliminado el inhibidor del medio de maduración, los ovocitos fueron capaces de reiniciar la meiosis ! Resultados-117 Figura 50: Caracterización de la línea hpESC RiMi1 para marcadores específicos evaluados mediante inmunocitoquímica (a) y PCR semicuantitativa (b). Figura 51: a) Actividad PA (barra escala 200 µm). b) Actividad telomerasa. c) Cariotipo. Otro requerimiento crítico de una línea de hESC es su amplio potencial para diferenciarse. RiMi1 fue capaz diferenciarse en las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo, tanto in vitro (formación de cuerpos embrioides) (Figura 52) como in vivo (desarrollo de teratomas) (Figura 53). Figura 52: Técnica de inmunocitoquímica para identificar marcadores de ectodermo (β-tubulina III), mesodermo (desmina) y endodermo (α-fetoproteína) tras la diferenciación del cuerpo embrioide de RiMi1 (barra escala 100 µm). a b c GADPH GDF3 ESG1 HTERT OCT-4 REX-1 SOX-2 NANOG FGF4 RiMi1 H9 B-RT B-PCR b a ! ! Resultados-118 Figura 53: Imagen histológica de los teratomas. Las estructuras identificadas de forma positiva incluyeron: (ne) neuroepitelio; (in) epitelio intestinal, (c) cartílago, (cn) tejido conectivo, (cy) quistes y (gl) cavidades llenas de líquido con un epitelio tipo glandular. Tinción hematoxilina/eosina (barras escala 150 µm). Además se realizó un perfil de ADN de la línea RiMi1, comparándolo con células somáticas de la donante (del ovocito), así como con los feeders, para confirmar la similitud genética entre RiMi1 y las células somáticas de la donante. V. Discusión Discusión-119 V. Discusión En la especie humana, la mayoría de los ovocitos recuperados tras un ciclo de EO se encuentran en el estadio de MII. Sin embargo, en determinadas ocasiones se observa una cohorte folicular asincrónica con menos del 50% de ovocitos en MII. En estos casos, la MIV se presenta como una opción para aumentar el número de ovocitos a microinyectar, y en consecuencia el número de embriones a transferir. Además de su finalidad reproductiva, los ovocitos inmaduros suponen una fuente muy valiosa de material biológico para la investigación del proceso de maduración ovocitaria, así como en medicina regenerativa. Pese al potencial teórico de estos ovocitos, los resultados obtenidos hasta la fecha sugieren que los ovocitos procedentes de ciclos de EO y miv muestran una mayor incidencia de aneuploidías embrionarias (Strassburger et al., 2004), una menor competencia de desarrollo (Trounson et al., 2001; Escrich et al., 2011) y una menor tasa de implantación (Li et al., 2006) que los ovocitos madurados in vivo (y procedentes de EO). Se ha asumido que dichas deficiencias se deben a anomalías intrínsecas e irreversibles. No obstante, hay que tener en cuenta que dichas conclusiones proceden de la MIV en medios de cultivo definidos para ovocitos de ciclos no estimulados. Aun en dichos medios, algunos de estos ovocitos tienen la capacidad de desarrollarse hasta el estadio de blastocisto (el máximo estadio que se puede alcanzar bajo condiciones in vitro), lo que sugiere que al menos parte de ellos tienen potencial de desarrollo. Es más, se han obtenido gestaciones y nacidos vivos a partir de ovocitos inmaduros recuperados tras un tratamiento de EO (en su mayoría MI), aunque queda limitado a muy pocos casos (De Vos et al., 1999; Chen et al., 2000; Strassburger et al., 2004; Vanhoutte et al., 2005; Farsi et al., 2011). En el presente trabajo de tesis, se pretende evaluar la competencia de ovocitos inmaduros obtenidos tras tratamientos de EO con el fin de diseñar medios de cultivo acordes a sus necesidades. Para ello, se utilizaron ovocitos en distintos estadios de maduración: VG, MI (4h y 24h) y MII in vivo (grupo control) y tres medios de cultivo (IVF, 199s y HOM). El HOM es un medio diseñado para cumplir con las necesidades nutricionales y de maduración de ovocitos procedentes de pacientes con SOP y ha sido evaluado a nivel de maduración, fecundación y desarrollo embrionario (Trounson et al., 2001). El medio 199s ha sido empleado (pero no diseñado) para la MIV de ovocitos Discusión-120 humanos VG (Combelles et al., 2005) y para el desarrollo embrionario tras SCNT (Heindryckx et al., 2007). El IVF es un medio simple utilizado de forma rutinaria en los laboratorios de FIV para cultivar los ovocitos, tanto maduros como inmaduros, durante breves periodos de tiempo. Éste último medio se usó como la condición base de maduración cuando no se suplementa el medio. Tanto el HOM como el 199s fueron suplementados con gonadotropinas, estradiol, ITS (solo el HOM), EGF y HSA. La elección de estos medios cubrió el abanico de posibilidades existentes para la MIV en humanos y sirvió como punto de partida para los objetivos del presente trabajo de tesis. La habilidad para dar soporte a la maduración ovocitaria de cada medio de maduración se evaluó por la capacidad de los ovocitos para miv, por la configuración del aparato meiótico, desarrollo embrionario tras AP, número de copias de ADNmt y expresión de receptores para FSH, LH y EGF. Además, se evaluó el efecto del arresto meiótico mediado por un inhibidor de la fosfodiesterasa 3 con el fin de prolongar y mejorar la competencia citoplasmática. Se ensayó también el efecto del co-cultivo con células del cúmulo sobre la competencia de los ovocitos VG. Finalmente, se evaluó su competencia y potencial de desarrollo en base a su capacidad para generar células madre embrionarias partenogenotas. Efecto de la composición del medio de cultivo sobre la competencia nuclear de ovocitos inmaduros procedentes de ciclos de EO. Cuando el folículo en crecimiento alcanza el estadio antral (>15 mm de diámetro medio), se asume que el ovocito ha alcanzado su tamaño definitivo y es capaz de responder al estímulo ovulatorio (descarga de LH) y finalizar la meiosis II in vivo. En base a ello se espera que los ovocitos recuperados tras tratamientos de EO tengan el mismo tamaño y se encuentren en el mismo estadio madurativo (MII). Puesto que es frecuente recuperar un porcentaje variable de ovocitos inmaduros, una de las primeras cuestiones a resolver fue determinar si los estadios inmaduros no han finalizado aun el crecimiento citoplasmático. El diámetro de los ovocitos VG, MI (sin ser sometidos a MIV) y MII, se evaluó justo tras su denudación, estando los ovocitos en medio IVF (medio de rutina del laboratorio), con el fin de evitar cualquier efecto inducido por el medio de maduración o por ligeras variaciones en la osmolaridad de los distintos medios. Nuestros resultados sugieren que los ovocitos MI y MII proceden de folículos de mayor tamaño que han alcanzado su plateau de crecimiento (alrededor de 114 µm de diámetro y 779 x103 µm3 de volumen). Sin embargo, los ovocitos VG (alrededor de 112 Discusión-121 µm de diámetro y 736 x103 µm3 de volumen) probablemente proceden de folículos de menor tamaño, que todavía no han alcanzado su tamaño definitivo (ni su maduración). Pese a que la diferencia en diámetro es pequeña (2 µm), los resultados son consistentes y significativos, abogando por una razón biológica para tal diferencia de tamaño. Dado el avanzado estado de maduración en el que se encuentran los ovocitos MI, habiendo ya alcanzado su tamaño definitivo, salido del bloqueo meiótico y dirigiéndose hacia el estadio de MII, no es de sorprender que prácticamente la totalidad de ellos (91-94%) alcancen el estadio de MII tras 24h de CIV, con independencia del medio de MIV. No obstante, los ovocitos VG siguen en proceso de crecimiento y maduración molecular, siendo pues de esperar que sean más susceptibles a la composición del medio de MIV. Nuestros resultados sugieren que pese al menor tamaño de los ovocitos VG, éstos son capaces de responder a las condiciones de cultivo y si éstas son favorables, son capaces de alcanzar el mismo tamaño que los ovocitos MII control. Resultados obtenidos por Cavilla y colaboradores (2008) corroboran la viabilidad de los ovocitos VG. Todos los medios presentaron una osmolaridad de 297 mOsm, descartando cualquier efecto sobre el tamaño ovocitario. Es interesante destacar que los ovocitos IVF-miv VG presentaron un menor tamaño que el resto de ovocitos. Es probable que la ausencia de factores de crecimiento en el medio IVF les impida proseguir con el crecimiento ovocitario. Son diversos los estudios que han demostrado que la adición de insulina y selenio en forma de ITS favorece el crecimiento folicular, la maduración ovocitaria y la capacidad de desarrollo (Eppig et al., 1992; Raghu et al., 2002; Kim et al., 2005; Jeong et al., 2008) de ovocitos VG incluidos en complejos CCOs. Dado que todos estos estudios utilizaron ovocitos rodeados por células del cúmulo (CCOs), se desconoce el efecto directo que el ITS pueda tener sobre el ovocito denudado. Uno de los hallazgos del presente trabajo fue que el suplemento con ITS, tanto el medio HOM como el 199s, no solo facilitó la maduración nuclear sino también su aceleración en ovocitos denudados. Además, dicho efecto sería por acción directa sobre el ovocito, sin necesidad de ser mediado por las células del cúmulo como ocurre con gran parte de factores de crecimiento (Sakaguchi et al., 2000). La aceleración en la cinética de la maduración nuclear observada en nuestro trabajo sugiere que el ITS, probablemente a través de un efecto combinado de la insulina y el EGF, podría estar aumentando los niveles de componentes moleculares clave para la reanudación de la meiosis (Sakaguchi et al., 2002; Córdova et al., 2010). Resultados relativamente recientes demuestran que, Discusión-122 además de su presencia en las células del cúmulo (Qu et al., 2000), los receptores para insulina (RI) e IGF-1 (RIGF-1) también están presentes en ovocitos (Butler et al., 2002; Nuttinck et al., 2004; Acevedo et al., 2007). La unión de la insulina o IGF-1 a los RI o RIGF-1 ovocitarios activa la cascada de señalización de la proteína quinasa B (PKB ó Akt) mediada, a su vez, por la activación de la fosfatidil inositol quinasa 3 (PIK3) (Han et al., 2006; Kalous et al., 2009; Cecconi et al., 2012). La activación de la señal PIK3/PKB regula la expresión de la ciclina B y la activación del CDK1 (ambos componentes esenciales del MPF), así como la MAPK (Kalous et al., 2009) (capítulo II.2 Reanudación de la meiosis). Además, la PKB activa fosforila y activa la PDE3A, disminuyendo en consecuencia los niveles de AMPc y permitiendo el reinicio de la meiosis (Han et al., 2006; Kalous et al., 2009). Es importante destacar que el efecto acelerador de la meiosis observado cuando el ITS está presente en el medio de cultivo solo se presentó en ovocitos VG y no en MI. Esto puede deberse a que éstos últimos ya han salido del arresto meiótico, y en consecuencia, las proteínas diana del ITS (ó insulina) ya han sido activadas a su debido tiempo. Efecto de la composición del medio de maduración sobre la organización del aparato meiótico. Alteraciones en la organización de la placa metafásica pueden resultar en una segregación cromosómica anómala y en consecuencia, en un desarrollo embrionario posterior comprometido (Vanhoutte et al., 2007). Son numerosas la referencias bibliográficas que indican que los ovocitos miv procedentes de EO presentan una morfología del aparato meiótico/organización cromosómica subóptima en comparación con los ovocitos madurados in vivo (Li et al., 2006; Trounson, 2006; Piquette, 2006; Vanhoutte et al., 2007; Barcelos et al., 2009; Barrett y Albertini, 2010). Pese a que, con independencia del medio de maduración, un 20-30% de ovocitos miv (VG y MI 24 horas) presentaron anomalías en el aparato meiótico/cromosomas, es de resaltar que la mayoría de ellos mostraron una organización normal. Nuestros resultados indican que la presencia de alteraciones cromosómicas en ovocitos miv no es tanto una característica absolutamente intrínseca de los mismos, sino que está, en gran medida, condicionada por la composición del medio de maduración. Así, la presencia de ITS resulta en una tasa de anomalías a nivel cromosómico y de configuración del aparato meiótico en ovocitos VG significativamente superior que en su ausencia. El incremento temprano de Discusión-123 la actividad quinasa de la histona H1 (sustrato de la CDK1) y de la MAPK (Sakaguchi et al., 2002) en respuesta a la insulina (componente de ITS), provoca la fosforilación (e inactivación) de la quinasa GSK-3 (capítulo II.2.2 Etapas de la reanudación de la meiosis. 3. Formación del aparato meiótico), así como la fosforilación temprana de gran parte de las proteínas implicadas en la formación de la membrana nuclear (produciéndose la disolución de la misma), en la condensación de la cromatina y en la reorganización de microtúbulos (Verde et al., 1992). En consecuencia, se producen alteraciones en la formación del aparato meiótico que en combinación con un progreso meiótico acelerado, resultan en un incremento significativo de la segregación anómala de los cromosomas homólogos durante la meiosis (Acevedo et al., 2007) (Figura 55). Figura 54: Efecto de la presencia de ITS en el medio de cultivo sobre la maduración ovocitaria nuclear (VG). GSK-3: glicógeno sintasa quinasa 3. GVBD: disolución de la vesícula germinal. ITS: complejo insulina-transferrina-selenio. MPF: factor promotor de la maduración. VG: vesícula germinal. Al contrario de lo observado en ovocitos VG, en los ovocitos HOM-miv MI 24h no se observó un aumento del porcentaje de alteraciones del aparato meiótico/organización cromosómica respecto al resto de medios, sugiriendo que, en este tipo de ovocitos, que ya han abandonado el arresto meiótico, el ITS no tiene este efecto dañino a nivel de la placa metafásica. Efecto del medio de maduración sobre el número de copias de ADN mitocondrial. Durante el crecimiento ovocitario tiene lugar la amplificación ininterrumpida de una población inicial muy restringida de mitocondrias. Se cree que dicha expansión mitocondrial cesa cuando el ovocito alcanza su tamaño definitivo (Mahours et al., 2012), y no variará a lo largo del resto del proceso de maduración. A diferencia de lo que ocurre con las células somáticas, las mitocondrias de los ovocitos maduros contienen 1 o 2 copias de ADNmt (Ferreira et al., 2009) por lo que se puede inferir con Presencia de ITS en el medio de cultivo: MPF (prematuro) Fosforilación GSK-3 (inactivación) Disolución membrana nuclear Condensación de los cromosomas Ovocito VG Reorganización anómala de los microtúbulos del huso Ovocito GVBD Discusión-124 bastante precisión la cantidad de mitocondrias en base al número de copias de ADNmt. Aunque existe variabilidad entre los distintos estudios, los datos más recientes indican que un ovocito MII fecundable alberga entre 100.000-200.000 copias de ADNmt (Steuerwald et al., 2000; Reynier et al., 2001; Barritt et al., 2002, May-Panloup et al., 2005, Santos et al., 2006; Zeng et al., 2007; Wai et al., 2010; Mahrous et al., 2012). En el presente trabajo de tesis los ovocitos MII in vivo presentan valores dentro de dicho rango, (MII in vivo, 118.000 copias en promedio). La adquisición de un número adecuado de ADNmt en el ovocito persigue un propósito clave: tener un número suficiente de mitocondrias para asegurar el desarrollo prey post-implantacional. Durante los estadios de división temprana no se produce replicación del ADNmt y no será hasta el momento próximo a la implantación cuando se reinicie la expansión mitocondrial (May-Panloup et al., 2007; St John et al., 2010). Al mismo tiempo, el ADNmt codifica componentes de la cadena respiratoria mitocondrial responsables de la producción de ATP (fosforilación oxidativa) así como de ARNt (ARN de transferencia) y ARNr implicados en la transcripción y traducción de productos génicos (Dumollard et al., 2007; St John et al., 2010; Van Blerkom, 2010). Todo ello implica que el ovocito en el momento de la fecundación debe haber acumulado una cantidad de ADNmt que asegure que cada célula del embrión hereda un número suficiente de moléculas que lo hagan viable hasta, pero también después, de la implantación. Estudios realizados en ratón indican que pese a que los ovocitos con 4.000 copias de ADNmt son fecundables y capaces de alcanzar el estadio de blastocisto, detienen su desarrollo durante la organogénesis. Estos autores postulan que en el ovocito maduro son necesarios elevados niveles de ADNmt para poder compensar la disminución exponencial que se produce en los estadios de desarrollo embrionario temprano (puesto que el embrión continua con la división pero la replicación del ADNmt está detenida) y asegurar el desarrollo embrionario post-implantacional. Este hecho permitiría además la dilución de mutaciones en el ADNmt que puedan ser deletéreas para el embrión. Así pues, se considera que, en ratón, un ovocito maduro debe tener un umbral crítico de 40.000-50.000 copias de ADNmt para ser compatible con un desarrollo post-implantacional viable (Wai et al., 2010). En humanos se ha estimado el rango de número de copias de ADNmt necesarias para asegurar la fecundación (100.000-200.000; Reynier et al., 2001), y se estima que dicho número debe ser además suficiente para asegurar el desarrollo post-implantacional (aunque no existen datos al respecto). Discusión-125 Se desconocen los mecanismos moleculares que regulan la acumulación de ADNmt en los ovocitos así como la razón por la cual los niveles de ADNmt se mantienen constantes (o disminuyen) durante las últimas etapas de la maduración y durante los estadios preimplantatorios (Mahrous et al., 2012). No obstante, se sabe que cuando el ovocito alcanza su tamaño definitivo, hay una disminución en la cantidad de ARNm de POLGA (polimerasa-γ, subunidad-α), POLG2 (POLGB) (polimerasa-γ, subunidad-β) y TFAM (factor de transcripción asociado a la mitocondria). Los dos primeros constituyen la polimerasa específica del ADNmt, mientras que el TFAM se combina con la molécula de ADNmt recién formada estabilizándola. Nuestros resultados confirman la ausencia de replicación de ADNmt desde VG a MII. Pese a tratarse de ovocitos inmaduros (MI y VG) procedentes de tratamientos de EO, su número de copias de ADNmt fue similar al de los ovocitos madurados in vivo. Ésto también sugiere que el número de copias de ADNmt no es uno de los defectos causantes del fallo en su maduración. Pero además, con independencia del medio de maduración empleado, la cantidad de ADNmt se mantuvo constante después de su MIV. En base a los resultados anteriores, no se espera que el medio de maduración tenga ningún efecto sobre el número de copias de ADNmt. No obstante, nuestros resultados indican que tanto los ovocitos IVF-miv VG como IVF-miv MI 24h presentaron un número de copias de ADNmt inferior al resto. Teniendo en cuenta que no hay replicación mitocondrial durante estos estadios, la causa del menor número de ADNmt podría residir en su degradación. La duración prolongada del CIV (IVF-miv VG y IVF-miv MI 24 h) podría conllevar envejecimiento ovocitario. Este fenómeno se caracteriza por el acúmulo de ROS en el ovocito y la aparición de estrés oxidativo. El estrés oxidativo puede afectar directamente la función mitocondrial, no solo por su proximidad con el lugar de producción de las ROS (cadena de transporte electrónico) sino también por la ausencia de mecanismos reparadores del ADN. Esta pérdida de integridad mitocondrial puede resultar en una pérdida de copias de ADNmt (Lord y Aitken, 2013). El medio IVF carece además de agentes protectores frente a las ROS. Mientras que ésto no supone un problema para ovocitos MI 4h (por la corta duración de cultivo), cultivos prolongados penalizarían el número de ADNmt. Por el contrario, la presencia de glutatión o de aminoácidos usados en su síntesis (cisteína, glicina y ácido glutámico) en el medio 199s y HOM respectivamente, podrían ejercer un efecto protector frente a las ROS, y en consecuencia mantener constante el número de ADNmt en estos medios. No obstante son necesarios más estudios para corroborar esta hipótesis.