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2014 74 Aurora Gimeno Soriano Receptores de la prostaglandina E2 implicados en los trastornos motores digestivos y la fiebre inducidos por endotoxinas en la oveja: Papel de los macrófagos Departamento Director/es Farmacología y Fisiología Plaza Carrión, Miguel Ángel Castro López, Marta Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Aurora Gimeno Soriano RECEPTORES DE LA PROSTAGLANDINA E2 IMPLICADOS EN LOS TRASTORNOS MOTORES DIGESTIVOS Y LA FIEBRE INDUCIDOS POR ENDOTOXINAS EN LA OVEJA: PAPEL DE LOS MACRÓFAGOS Director/es Farmacología y Fisiología Plaza Carrión, Miguel Ángel Castro López, Marta Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA TESIS DOCTORAL Receptores de la prostaglandina E2 implicados en los trastornos motores digestivos y la fiebre inducidos por endotoxinas en la oveja. Papel de los macrófagos. AURORA GIMENO SORIANO 2014 2014 Receptores de la prostaglandina E2 implicados en los trastornos motores digestivos y la fiebre inducidos por endotoxinas en la oveja. Papel de los macrófagos. T es i s D oc t ora l A u r o r a G im e n o DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y FISIOLOGÍA UNIDAD DE FISIOLOGÍA Receptores de la prostaglandina E2 implicados en los trastornos motores digestivos y la fiebre inducidos por endotoxinas en la oveja. Papel de los macrófagos. Memoria presentada por la Licenciada Aurora Gimeno Soriano para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, Julio 2014 DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y FISIOLOGÍA UNIDAD DE FISIOLOGÍA MIGUEL ANGEL PLAZA CARRIÓN y MARTA CASTRO LÓPEZ, Profesor Titular y Profesora Ayudante Doctor del Área de Fisiología, pertenecientes al Departamento de Farmacología y Fisiología de la Universidad de Zaragoza, CERTIFICAN: Que la presente Tesis Doctoral, presentada por Aurora Gimeno Soriano, con el título: “Receptores de la prostaglandina E2 implicados en los trastornos motores digestivos y la fiebre inducidos por endotoxinas en la oveja. Papel de los macrófagos.”, ha sido realizada bajo nuestra dirección, en el Departamento de Farmacología y Fisiología de la Universidad de Zaragoza. La memoria presentada se corresponde con el proyecto de tesis aprobado en su momento y cumple todas las condiciones exigidas, por lo que autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que conste a los efectos oportunos, firman la presente en Zaragoza, a 19 de mayo de 2014. Fdo. Miguel Angel Plaza Carrión Fdo. Marta Castro López Índice 1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1 1.1.- Anatomía del tracto gastrointestinal (GI) de la oveja ..................................................... 3 1.1.1.- Estómago ........................................................................................................... 3 1.1.2.- Intestino delgado ............................................................................................... 3 1.1.3.- Intestino grueso ................................................................................................. 4 1.1.4.- Inervación y vascularización ............................................................................. 6 1.2.- Áreas y núcleos hipotalámicos ....................................................................................... 7 1.3.- Histología del tubo digestivo, hígado, pulmón, hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja .............................................................................................................................. 11 1.3.1.- Tubo digestivo .................................................................................................... 11 1.3.1.1.- Mucosa ................................................................................................ 11 1.3.1.2.- Submucosa .......................................................................................... 13 1.3.1.3.- Muscular ............................................................................................ 13 1.3.1.4.- Serosa ................................................................................................. 14 1.3.2.- Hígado ................................................................................................................ 15 1.3.3.- Pulmón ............................................................................................................... 17 1.3.4.- Hipotálamo y bulbo raquídeo ............................................................................ 18 1.4.- Motilidad del tracto GI ...................................................................................................... 19 1.4.1.- Estructura de la célula muscular lisa GI ............................................................ 19 1.4.2.- Mecanismo de la contracción y relajación muscular ......................................... 20 1.4.3.- Actividad eléctrica del músculo liso GI: las ondas lentas ................................. 21 1.4.4.- El complejo motor (o mioeléctrico) migratorio (MMC) ................................... 22 1.4.5.- Características de la actividad motora GI en la oveja ........................................ 25 1.4.6.- Regulación de la motilidad GI ........................................................................... 27 1.4.7.- El sistema inmunitario como regulador de la actividad GI .................................. 29 1.5.- El lipopolisacárido (LPS) y las citocinas ........................................................................ 30 1.5.1.- La pared celular de las bacterias Gram negativas .............................................. 30 1.5.2.- Estructura del LPS ............................................................................................. 32 1.5.3.- Las citocinas ...................................................................................................... 33 1.5.4.- Efectos producidos por el LPS y las citocinas ................................................... 33 1.6.- Las prostaglandinas (PGs) .............................................................................................. 38 1.6.1.- Papel de las PGs en la fisiopatología del tracto GI y en la fiebre ...................... 40 1.7.- Receptores de la PGE2 (EPs) .......................................................................................... 43 1.7.1.- Distribución de los receptores de la PGE2 (EPs) ............................................... 48 1.8.- Macrófagos como moduladores de la inmunidad ........................................................... 50 1.8.1.- Macrófagos hepáticos y pulmonares ................................................................. 50 1.8.2.- Microglía o macrófagos cerebrales .................................................................... 52 Índice 2.- OBJETIVOS .......................................................................................................................... 55 3.- MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 59 3.1.- Animales y mantenimiento ............................................................................................. 61 3.2.- Estudios de motilidad gastrointestinal in vivo ................................................................. 62 3.2.1.- Procedimiento quirúrgico .................................................................................. 62 3.2.2.- Registros de la temperatura corporal ................................................................. 65 3.2.3.- Registros electromiográficos ............................................................................. 65 3.2.4.- Análisis de la señal electromiográfica ............................................................... 67 3.2.5.- Administración de los agentes ........................................................................... 68 3.2.6.- Diseño experimental .......................................................................................... 69 3.2.7.- Agentes ensayados ............................................................................................. 69 3.3.- Obtención de las muestras para inmunohistoquímica y western blotting ....................... 70 3.4.- Estudios de western blotting (WB) ................................................................................. 71 3.4.1.- Homogeneización de las muestras ..................................................................... 71 3.4.2.- Cuantificación de proteínas ............................................................................... 72 3.4.3.- Preparación de las muestras ............................................................................... 73 3.4.4.- Detección y cuantificación de las COX y los receptores de la PGE2 ................... 73 3.4.5.- Detección y cuantificación de β-actina y GAPDH ............................................ 78 3.5.6.- Análisis de las bandas obtenidas por WB .......................................................... 78 3.5.- Estudios de inmunohistoquímica (IHC) .......................................................................... 79 3.5.1.- Doble inmunohistoquímica ................................................................................ 82 3.6.- Tratamiento estadístico ................................................................................................... 83 4.- RESULTADOS ...................................................................................................................... 85 4.1.- Efecto del clorhexahidrato de gadolinio (III) y del tiloxapol sobre las alteraciones inducidas por el LPS ..................................................................................................... 87 4.1.1.- Motilidad gastrointestinal (GI) en la oveja en periodo control ........................... 87 4.1.2.- Efectos del LPS sobre la temperatura corporal y la motilidad GI en la oveja ... 87 4.1.3.- Efecto del clorhexahidrato de gadolinio (III) y del tiloxapol sobre las alteraciones inducidas por el LPS ..................................................................... 90 4.2.- Expresión de la COX-1 y la COX-2 en el sistema nervioso central de la oveja ............... 92 4.3.- Efecto del LPS sobre la expresión de la COX-1 y la COX-2 en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja ........................................................................................................ 101 4.4.- Identificación de las células productoras de COX en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja ............................................................................................................................ 101 4.5.- Expresión de la COX-1 y la COX-2 en tejidos periféricos (hígado y pulmón) de la oveja ................................................................................................................................ 110 4.6.- Efecto del LPS sobre la expresión de la COX-1 y la COX-2 en los tejidos periféricos (hígado y pulmón) de la oveja ......................................................................................... 118 Índice 4.7.- Identificación de las células productoras de COX en los tejidos periféricos (hígado y pulmón) de la oveja ......................................................................................................... 118 4.8.- Efecto de los agonistas de los receptores de la PGE2 (EPs) sobre la fiebre y las alteraciones motoras GI en la oveja ............................................................................. 124 4.8.1.- Efecto del agonista EP3 Sulprostona .................................................................. 124 4.8.2.- Efecto del agonista EP1 17-fenil-trinor PGE2 .................................................... 126 4.8.3.- Efecto del agonista EP2 Butaprost ..................................................................... 128 4.8.4.- Efecto del agonista EP4 L-902,688 .................................................................... 129 4.9.- Expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja ............................................................................................................................. 132 4.10.- Expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el tracto GI de la oveja ................... 143 4.11.- Efecto del LPS sobre la expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el hipotálamo, bulbo raquídeo y el tracto GI de la oveja .................................................................. 160 5.- DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 161 5.1.- Papel de las ciclooxigenasas (COX) en la fiebre y las alteraciones motoras GI inducidas por el LPS ...................................................................................................................... 163 5.1.1Expresión de las COX en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja y su papel en los efectos inducidos por el LPS ................................................................. 163 5.1.2Expresión de las COX en tejidos periféricos (hígado y pulmón) de la oveja y su papel en los efectos inducidos por el LPS ........................................................ 167 5.2.- Papel de los receptores de la PGE2 (EP1, 2, 3 y 4) en la fiebre y las alteraciones motoras gastrointestinales (GI) inducidas por el LPS ................................................................. 174 5.2.1.- Expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja ........................................................................................... 175 5.2.2.- Expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el tracto GI de la oveja ....................................................................................................... 176 5.2.3.- Efecto del LPS en la expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el hipotálamo y bulbo raquídeo .............................................................................. 179 5.2.4.- Efecto del LPS en la expresión de los receptores de la PGE2 (EPs) en el tracto GI ..................................................................................................................... 180 5.2.5.- Participación de los receptores de la PGE2 (EPs) en la fiebre y las alteraciones motoras GI inducidas por el LPS ..................................................................... 182 6.- CONCLUSIONES ............................................................................................................... 189 7.- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 193 1.- INTRODUCCIÓN Introducción 3 1.1 ANATOMÍA DEL TRACTO GASTROINTESTINAL DE LA OVEJA 1.1.1 ESTÓMAGO El estómago de los rumiantes es muy voluminoso (3/4 partes de la cavidad abdominal) y pluricavitario, estando dividido en 4 compartimientos bien diferenciados: retículo, rumen, omaso y abomaso (Fig. 1.1). Los tres primeros se denominan preestómagos y están recubiertos internamente por un epitelio escamoso estratificado aglandular (en ellos no se segregan ni moco ni jugos gástricos). El abomaso es la parte glandular, semejante al estómago de los monogástricos. El retículo, situado en la parte anterior, está separado del rumen por el pliegue retículo-ruminal, formando con él una unidad funcional, ya que dichas estructuras se comunican internamente por la parte superior. El rumen es el compartimento más voluminoso y está en contacto con la pared abdominal izquierda. Está dividido a su vez en varios sacos (saco craneal, saco dorsal, saco ventral, saco ciego dorsal y saco ciego ventral). El omaso, situado en la parte derecha, está conectado al retículo por el orificio retículo-omasal y al abomaso por el orificio omaso-abomasal. El abomaso es el estómago glandular de los rumiantes. Morfológicamente, es un saco alargado, que asienta fundamentalmente en el suelo abdominal de la zona derecha. En él se distinguen tres zonas: fundus, cuerpo y antro pilórico. El interior del abomaso está tapizado por una mucosa glandular, dispuesta a modo de pliegues espirales para aumentar su superficie y posee las mismas características de las regiones glandulares de otros mamíferos. La mayor parte de la mucosa abomasal se encuentra ocupando el fundus y el cuerpo y está destinada a la secreción de pepsinógeno y ácido clorhídrico principalmente. La zona antral es más reducida y en su parte final la capa de tejido muscular circular se engrosa, formando el esfínter pilórico. 1.1.2 INTESTINO DELGADO El intestino delgado es una estructura tubular continua, que se divide en tres partes: duodeno, yeyuno e íleon (Fig. 1.2). Posee una longitud de unos 25 metros en la oveja y el promedio de su diámetro es de 2 a 3 cm en pequeños rumiantes. Se caracteriza por pliegues permanentes de la mucosa y por la presencia de vellosidades. Las glándulas duodenales están presentes en los primeros 60-70 cm. Los agregados de nódulos linfáticos o placas de Peyer son grandes y tienen la forma de bandas estrechas. Introducción 4 El duodeno tiene alrededor de 70 cm de longitud. Comienza en el píloro y la parte craneal pasa dorsalmente a la superficie visceral del hígado, donde forma una curva en forma de S denominada asa sigmoidea. La segunda porción, denominada duodeno descendente, se dirige horizontalmente hacia atrás, casi a nivel de la tuberosidad coxal y luego se incurva de nuevo hacia delante para formar la flexura ilíaca. En esta porción descendente desemboca el conducto pancreático y biliar común, a unos 25-40 cm del píloro. La tercera porción, llamada duodeno ascendente, se dirige hacia delante sobre el lado interno del duodeno descendente, dando lugar a una segunda curva similar a una S, en el extremo posterior del riñón derecho, para continuar posteriormente con el yeyuno. El yeyuno forma numerosos pliegues dispuestos alrededor del borde del mesenterio. Caudalmente, antes de unirse al íleon, se prolonga en una serie de asas en forma de U sobre una extensión del mesenterio. Se asienta por regla general sobre el receso supraomental al lado derecho del rumen. El íleon es la parte terminal del intestino delgado, que finaliza en el orificio ileocecal. Alrededor de dicho orificio, la mucosa hace prominencia y posee numerosos nódulos linfáticos agregados. Su parte craneal se adhiere al ciego y colon. 1.1.3 INTESTINO GRUESO A diferencia de otras especies, el intestino grueso de los rumiantes no posee bandas longitudinales ni saculaciones. A excepción del extremo libre del ciego, está situado, junto con el intestino delgado, en el receso supraomental. A nivel histológico no posee vellosidades, sino pliegues de la mucosa de forma semicircular y se observa comparativamente al intestino delgado, un aumento de las células caliciformes. En él se distinguen tres zonas: ciego, colon y recto (Fig. 1.2). El ciego tiene una capacidad de 1,5 litros con una longitud media de 30 cm y un diámetro de 8 cm. Se extiende desde 8 cm detrás de la cara visceral derecha del hígado, hasta la cavidad pelviana. El colon de la oveja mide entre 4 y 5 m, con un diámetro que va disminuyendo gradualmente en toda su longitud desde 8 a 2 cm. Comienza como una continuación directa del ciego en el orificio ileocecal y se pueden distinguir en él tres partes: colon ascendente, transverso y descendente. El colon ascendente es muy largo en los rumiantes ya que posee numerosas asas y pliegues centrípetos y centrífugos. El colon descendente está unido a la región sublumbar y porción ascendente del duodeno. Introducción 5 Por último el recto, que se extiende desde el promontorio sacro hasta el límite entre la 2ª y la 3ª vértebra coccígea y está formado por una zona craneal cubierta por peritoneo y otra retroperitoneal más ancha, denominada ampolla rectal. Figura 1.1.- Estómago de la oveja; lado derecho (procedente de una muestra fijada in situ. Línea de trazos: posición del bazo). Tomada de Sisson y cols., 1998. Figura 1.2.- Intestino de la oveja; lado izquierdo. a, duodeno descendente; b, flexura caudal del duodeno; c, duodeno ascendente; d, flexura duodenoyeyunal; e, yeyuno; f, íleon; g, ciego; h, asa proximal del colon; i, giro centrípeto; j, giro centrífugo; k, asa proximal del colon; m, colon transverso; n, colon descendente; o, arteria mesentérica craneal; q, arteria cecal; r, linfáticos mesentéricos. Tomada de Habel, 1956. Introducción 6 1.1.4 INERVACIÓN Y VASCULARIZACIÓN El sistema nervioso autónomo inerva el intestino y las glándulas mayores. La inervación parasimpática del estómago de los rumiantes se realiza a través del nervio vago, que en la cavidad torácica se encuentra dividido en un tronco vagal dorsal y en un tronco vagal ventral (Fig. 1.3). La inervación simpática es de menor importancia funcional y procede de los plexos celiaco, mesentérico caudal y lumbar. Las arterias que llevan sangre al estómago de los rumiantes proceden de la arteria celiaca y la sangre venosa, es recogida por la vena esplénica y la gastroduodenal, que desembocan en la vena porta. La parte inicial del duodeno recibe sangre arterial a partir de la arteria celiaca. El resto del intestino delgado así como la mayor parte del intestino grueso está irrigado a partir de la arteria mesentérica craneal. El colon descendente y parte del recto por la arteria mesentérica caudal y la otra porción del recto recibe además irrigación por parte de las arterias iliacas internas. Todo el intestino, a excepción de la última porción, drena su sangre venosa hacia la vena porta. Figura 1.3.- Tronco vagal dorsal de la oveja; lado derecho. El omaso y abomaso se han dirigido hacia delante. No se presenta el tronco simpático sobre las arterias gástricas. a, tronco vagal dorsal; b, rama comunicante entre los troncos vagales; c, ramas al plexo celiaco; d, rama ruminal derecha; e, rama al plexo sobre la arteria ruminal izquierda; f, continuación del tronco vagal dorsal; g, tronco vagal ventral; h, rama al lado izquierdo del atrio del rumen; j, ramas hepática y pilórica larga; k, gran nervio esplácnico; l, ganglio celiaco-mesentérico; n, arteria mesentérica craneal; o, arteria celiaca; p, arteria hepática; r, arteria ruminal derecha; s, arteria esplénica; t, arteria reticular; u, arteria reticular izquierda; v, arteria gástrica izquierda; w, arteria gastroepiploica izquierda. Tomada de Habel, 1956. Introducción 7 1.2 ÁREAS Y NÚCLEOS HIPOTALÁMICOS El hipotálamo constituye el centro principal de gobierno de las funciones homeostáticas, estando organizado mediante conexiones aferentes y eferentes para controlar funciones autonómicas, neuroendocrinas y somáticas. Así, tiene gran importancia en la regulación de la presión arterial, la sed y la conservación del agua, la regulación térmica y el control endocrino. El hipotálamo está dividido en una zona anterior y en una zona posterior (Figs. 1.4 a 1.7). En la zona anterior se localizan el área preóptica y los núcleos paraventricular y supraóptico. En la zona posterior se localizan los núcleos dorsomedial, peritrigonal, ventromedial, infundibular y posterior, así como el cuerpo mamilar (Fig. 1.4). Además, a cada lado del hipotálamo existe un gran área hipotalámica lateral, la cual reviste especial importancia para controlar la sed, el hambre y muchos de los impulsos emocionales. Estas áreas laterales están conectadas de forma recíproca con la porción superior del tronco encefálico y estructuras límbicas superiores. El hipotálamo está implicado en el control de las siguentes funciones vegetativas: - Regulación cardiovascular: La estimulación de diferentes áreas por todo el hipotálamo puede causar cualquier tipo de efecto neurogénico sobre el sistema cardiovascular. En general, la estimulación del hipotálamo posterior y lateral aumenta la presión arterial y la frecuencia cardíaca, mientras que la estimulación del área preóptica tiene frecuentemente los efectos opuestos. - Regulación de la temperatura corporal: La porción anterior del hipotálamo, especialmente el área preóptica, se ocupa de la regulación de la temperatura. El aumento de la temperatura de la sangre que fluye a través de esta área eleva la actividad de las neuronas sensibles a la temperatura, mientras que un descenso de la temperatura disminuye su actividad. A su vez, estas neuronas controlan los mecanismos que incrementan o reducen la temperatura corporal. - Regulación del agua corporal: El hipotálamo regula el agua corporal provocando la sensación de sed y controlando la excreción de agua por la orina. El centro de la sed se sitúa en el hipotálamo lateral. Cuando los electrolitos del interior de las neuronas de este centro o de las áreas relacionadas del hipotálamo se concentran en exceso, surge en el animal un intenso deseo de beber agua. El control de la excreción renal de agua depende, en esencia, del núcleo supraóptico: cuando los líquidos corporales se concentran demasiado, las neuronas de esta área se estimulan. Las fibras nerviosas procedentes de estas neuronas se proyectan hacia la parte posterior de la hipófisis a través del infundíbulo del hipotálamo, donde las terminaciones nerviosas segregan hormona antidiurética o vasopresina. Esta Introducción 14 capas musculares son las responsables de los fenómenos de motilidad del tubo digestivo (Fig. 1.11). AB CD 100 µm 100 µm 50 µm MC ML MC ML MC M SM SM 50 µm AB CD 100 µm100 µm 100 µm100 µm 50 µm50 µm MC ML MC ML MC M SM SM 50 µm50 µm Figura 1.11.- Histología de los plexos nerviosos mientérico o de Auerbach (A y B) y submucoso o de Meissner (C y D) en cortes de duodeno de oveja. ML: muscular longitudinal. MC: muscular circular. M: mucosa. SM: submucosa. Flechas amarillas: neuronas del plexo mientérico. Flechas rojas: neuronas del plexo submucoso. 1.3.1.4 SEROSA La serosa es una capa relativamente fina equivalente al mesenterio, que rodea al aparato digestivo a cualquier nivel considerado. Introducción 15 1.3.2 HÍGADO El hígado es una gran glándula lobulada rodeada por una cápsula delgada de tejido conectivo (cápsula de Glisson) y un mesotelio. Cada lóbulo está dividido en numerosos lobulillos clásicos constituidos por unos espacios vasculares o sinusoides y por placas de células parenquimatosas, los hepatocitos, de morfología hexagonal. Estos últimos se organizan radialmente alrededor de una vena central. Las áreas donde se reúnen tres o más lobulillos se denominan espacios portales, cada uno de los cuales contiene una o más ramas de la vena porta y de la arteria hepática, y uno o más conductillos biliares y vasos linfáticos. Estos componentes están sostenidos por una trama de tejido conectivo. Los conductillos biliares se unen para formar el conducto biliar. El epitelio de los conductillos biliares es cúbico simple mientras que el del conducto biliar es cilíndrico simple. En los conductos mayores se observan células caliciformes. (Fig. 1.12). Las hileras de hepatocitos delimitan unos espacios vasculares o sinusoides donde se localizan los macrófagos hepáticos o células de Kupffer. Estas células poseen uno o dos núcleos y emiten unas prolongaciones alargadas. Introducción 16 Figura 1.12.- Histología del hígado. Modificada de Principios de Anatomía y Fisiología, Tortora y Derrickson, 11/e. 2006. Introducción 17 1.3.3 PULMÓN Los pulmones, cubiertos por la hoja visceral de la pleura, contienen una trama conectiva rica en fibras elásticas que sostienen al árbol bronquial y divide a los pulmones en lóbulos y lobulillos. Los bronquios están revestidos por un epitelio cilíndrico seudoestratificado ciliado con células caliciformes. La lámina propia está rodeada por una capa de músculo liso cuyas fibras se orientan en sentido oblicuo. El tejido conectivo que rodea la muscular presenta glándulas mixtas y placas de cartílago hialino. Los bronquios más pequeños dan origen a los bronquiolos, que carecen de cartílago y glándulas. Estos últimos, a su vez, originan sucesivamente los conductos y sacos alveolares, cuyas paredes delgadas están constituidas por alvéolos. Cada conducto alveolar se ramifica para originar tres o más sacos alveolares. Los alvéolos están revestidos por células epiteliales extremadamente planas (neumocitos tipo I). Los alvéolos están separados entre sí por una delgada capa de delicadas fibras colágenas y elásticas muy vascularizada. Esta capa, junto con el revestimiento epitelial de los alvéolos adyacentes, forman el septo o tabique interalveolar (Fig. 1.13). AB CD 100 µm 100 µm 50 µm 50 µm V BR BR A AB CD 100 µm100 µm 100 µm100 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm V BR BR A Figura 1.13.- Histología del pulmón de oveja A y B: Bronquiolo respiratorio (BR) revestido por células cilíndricas ciliadas, entre las cuales puede observarse la presencia de células caliciformes (flechas amarillas). Además se observa el corte transversal de un vaso sanguíneo (V) cuya pared posee fibras musculares lisas. C y D: Los bronquiolos se ramifican dando lugar a los conductos alveolares y alvéolos (A), los cuales están separados entre sí por una delgada capa de fibras colágenas y elásticas (flechas rojas). Introducción 18 1.3.4 HIPOTÁLAMO Y BULBO RAQUÍDEO El sistema nervioso está constituido por neuronas de varias clases y tamaños y por sus elementos de sostén. Este sostén lo proporcionan por las células de la glía (astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células ependimales) y sus procesos, que se disponen constituyendo una trama compleja. Sus funciones incluyen la formación de mielina, asegurar un ambiente iónico adecuado, la recaptación de los neurotransmisores o una función de defensa (Fig. 1.14). AB CD 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm AB CD 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm Figura 1.14.- Histología del hipotálamo de oveja. Neuronas (flechas amarillas en A-D) de las que se distingue su axón (puntas de flechas amarillas en A, B y D) y núcleo (punta de flecha azul en A, B y C), en cuyo interior se intuye el denominado Cuerpo de Barr (B). También se observan células de la glía, concretamente oligodendrocitos (puntas de flechas rojas en A-D), astrocitos (flechas rojas en D) y microglía (puntas de flechas verdes en A y D). Introducción 19 1.4 MOTILIDAD DEL TRACTO GASTROINTESTINAL La motilidad intestinal tiene varias funciones: mezcla el alimento con las secreciones pancreáticas, biliares e intestinales, transporta el contenido intestinal a la velocidad adecuada para que se produzca una eficaz digestión de glúcidos, lípidos y proteínas, facilita una exposición máxima de los nutrientes digeridos a la mucosa del intestino delgado para permitir su absorción, y por último, elimina los restos de los alimentos y secreciones que quedan en la luz intestinal tras el paso del alimento. La motilidad es posible gracias a las contracciones de la musculatura circular y longitudinal del tracto GI. 1.4.1 ESTRUCTURA DE LA CÉLULA MUSCULAR LISA GASTROINTESTINAL En el sarcoplasma de la célula muscular lisa podemos distinguir dos dominios estructurales: un dominio contráctil y otro citoesquelético (Small y cols., 1986). El dominio contráctil contiene miofilamentos gruesos formados por miosina y filamentos finos formados por actina y tropomiosina. El citoesquelético posee α-actinina (formando parte de los cuerpos densos), desmina, filamina, laminina, gelsolina, vimentina y el isómero citoplasmático de ß-actina (Stromer, 1995). La molécula de miosina representa el motor molecular de las células musculares lisas de los vertebrados. Las dos propiedades biológicas más destacadas de esta molécula son su capacidad para convertir la energía química del ATP en trabajo mecánico, y la posibilidad de organizarse en filamentos en los que todas las cabezas de miosina presentan la misma polaridad a lo largo de un borde, y la polaridad opuesta en el otro borde del filamento. Además existen zonas descubiertas (sin cabezas) en uno de los extremos de cada borde del filamento (Craig y Megerman, 1977). Constituye los filamentos gruesos y, como muestra la Fig. 1.15, esta molécula está formada por dos cadenas pesadas (HCs) de aproximadamente 220 kDa cada una y dos pares de cadenas ligeras (LCs) localizadas en la región del cuello de la cabeza globular de la miosina (Sellers y cols., 1988). Las HCs conforman un filamento rígido (alfa-hélice) y dos cabezas ligeramente elongadas de estructura globular. Cada cabeza presenta su dominio motor en dos regiones conocidas como porción S-1 (Sellers y Harvey, 1984). Cada porción globular tiene dos tipos de LC, una cadena ligera reguladora (MLC20) y una cadena ligera esencial (MLC17) (Flicker y cols., 1983). Introducción 20 Figura 1.15.- Molécula de miosina del músculo liso (Aldstein y Sellers, 1996). Tomada de Alcón, 2000. La actina en el músculo liso desempeña un papel fundamental, por formar parte del aparato contráctil, así como del citoesqueleto. Puede existir bajo dos formas: la actina-G monomérica (globular) y la actina-F polimérica (filamentosa). Esta última es la que constituye los filamentos finos (Ikebe y cols., 1987). En el músculo liso también adquieren gran importancia las proteínas receptoras de Ca2+. Destaca entre ellas la calmodulina, ubicua y multifuncional, que interviene en el proceso contráctil. La calmodulina posee 4 sitios de unión al Ca2+ y cuando se produce dicha unión desarrolla una configuración funcional que le permite reconocer gran variedad de proteínas tales como fosfodiesterasas, proteínas cinasas, bombas de Ca2+ y proteínas de motilidad. 1.4.2 MECANISMO DE LA CONTRACCIÓN Y RELAJACIÓN DE LA CÉLULA MUSCULAR LISA El mecanismo básico para la generación de fuerza es el mismo en todos los tipos de músculo de los vertebrados: la interacción cíclica entre la actina y la miosina y, consecuentemente, el deslizamiento de los filamentos finos sobre los gruesos (Taylor, 1987) e implica la fosforilación del puente cruzado en el residuo de serina específico (Ser 19) de la MLC20. Este mecanismo emplea ATP como donante de fosfato. Las uniones entre la actina y la miosina tienen dos conformaciones: la llamada conformación “débil”, en la que la afinidad de unión es baja, producida en presencia de ATP y la conformación “fuerte”, con afinidad de unión elevada y que aparece cuando la molécula de miosina pierde el Pi procedente de la hidrólisis de ATP (Sweeney y cols., 1994). Cuando en el músculo liso se incrementa la concentración del Ca2+ intracelular, éste se une a la calmodulina, la cual sufre un cambio conformacional que expone los lugares de interacción con la cinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK). Así se constituye el Introducción 21 complejo ternario Ca2+-calmodulina-MLCK que transfiere el fosfato del ATP a la MLC20. Esta fosforilación resulta esencial para la activación de la actividad ATPásica de la cabeza de la miosina. La consiguiente pérdida de Pi por la cabeza de la miosina, como se ha comentado anteriormente, genera la transición de la conformación “débil” a la “fuerte”, dando lugar a otro cambio en la conformación de la zona del cuello de la cabeza de la miosina. Así se produce el denominado “golpe de fuerza”, responsable del deslizamiento del filamento de actina sobre el de miosina, lo cual constituye el proceso de contracción propiamente dicho (Ikebe y cols., 1987). La liberación del ADP es rápida y tras ella el sitio de unión para otra molécula de ATP queda libre y la unión de ésta provoca de nuevo la conformación “débil” y el inicio de un nuevo ciclo (Somlyo y Somlyo, 1994). Al disminuir la concentración del Ca2+ intracelular (por la bomba de Ca2+ de la membrana plasmática, el intercambiador de Na+/Ca2+ y la recaptación hacia los depósitos intracelulares), la cinasa se inactiva y se produce la defosforilación de la cadena ligera impidiendo que se formen los enlaces cruzados, lo que lleva a la relajación de la fibra muscular. 1.4.3 ACTIVIDAD ELÉCTRICA DEL MÚSCULO LISO GASTROINTESTINAL: LAS ONDAS LENTAS Las células musculares lisas del tracto GI mantienen una diferencia de potencial eléctrico a ambos lados de la membrana (potencial de membrana), siendo negativo el interior respecto al exterior (entre -70 y -60 mV). Esta diferencia de potencial fluctúa espontáneamente, constituyendo las ondas lentas o ritmo eléctrico de base. Se trata de despolarizaciones lentas, espontáneas y transitorias, registrándose desde la parte media del cuerpo gástrico hasta el colon. Estas ondas son generadas en las células intersticiales de Cajal (ICCs) (Huizinga y cols., 1995). La despolarización de las ICCs se transmite a las células musculares, para posteriormente propagarse de una célula muscular a otra a través de las uniones en hendidura. Cuando la despolarización de la onda lenta supera el umbral de descarga, se producen potenciales de acción sobre las crestas de las ondas lentas, debidos a la apertura de los canales de Ca2+ y al paso de éste al citosol desde el exterior de la célula (Horowitz y cols., 1999). Sobre una onda lenta se pueden producir varios de esos potenciales de acción, constituyendo la salva de potencial, de manera que la contracción será proporcional al número de potenciales de acción generados sobre dicha onda lenta. Como sólo pueden ocurrir salvas de potencial sobre las ondas lentas, la frecuencia de éstas determinará la máxima frecuencia de las contracciones. Esta actividad eléctrica y la contracción asociada se transmite de unas células a otras, de manera que se produce la contracción coordinada de un área localizada del órgano. Por ello, la función de las ondas lentas sería la de sincronizar las contracciones del músculo GI, Introducción 22 para conseguir que esta motilidad tenga la máxima eficacia. Normalmente, las ondas lentas se propagan en sentido aboral durante unos pocos centímetros con una velocidad de propagación de aproximadamente 1 cm/seg y por ello la contracción también viaja en ese sentido. La amplitud de las ondas lentas y en menor medida su frecuencia están controladas por los sistemas nervioso (extrínseco e intrínseco) y endocrino. En general, la estimulación parasimpática aumenta la amplitud y la estimulación simpática la disminuye o la suprime. Los neurotransmisores y hormonas que aumentan la permeabilidad al Ca2+ en la célula muscular aumentarán la despolarización de la onda lenta, facilitando la producción de potenciales de acción y sus contracciones asociadas. Por el contrario, los agentes inhibidores que aumentan la permeabilidad al K+, hiperpolarizarán la célula haciendo más difícil que se generen los potenciales de acción. 1.4.4 EL COMPLEJO MOTOR (O MIOELÉCTRICO) MIGRATORIO (MMC) El MMC es el patrón cíclico básico de la motilidad GI que se observa en el estómago e intestino delgado de mamíferos y que se caracteriza por la aparición de un grupo de contracciones regulares que migra lentamente desde el estómago hasta la parte distal del intestino delgado. En 1902, Boldyreff describió en el perro periodos de actividad motora gástrica que alternaban con periodos de quiescencia. La ingesta de alimento interrumpía este patrón de actividad motora, pero cuando el estómago estaba vacío el periodo rítmico se reestablecía. A finales de los años sesenta, dos grupos de investigación hicieron grandes avances en el campo de la electromiografía, técnica clave para el estudio del MMC: Ruckebusch y Laplace en Francia y Code y Szurszewski en EEUU. Ruckebusch y Laplace en 1967 utilizando técnicas de electromiografía, identificaron en el intestino de la oveja unos ciclos de aumento de actividad que se producían aproximadamente 16 veces al día. Además, se demostró que existía una buena correlación entre las salvas de potencial y las contracciones de la musculatura GI, por lo que la representación de la actividad mioeléctrica era directamente proporcional a la amplitud de la contracción (Ruckebusch, 1970). Gracias a este descubrimiento se utiliza actualmente la electromiografía como estimación de la motilidad GI. Code y Szurszewski, utilizando también técnicas de electromiografía, describieron en el perro por primera vez el carácter continuo e ininterrumpido del MMC. Al mismo tiempo demostraron que el MMC migraba a lo largo de todo el intestino delgado, de manera que cuando un frente de actividad alcanzaba el íleon, otro nuevo se estaba iniciando ya en el Introducción 23 duodeno (Szurszewski, 1969, Code y Marlett, 1975). Basándose en estos estudios dividieron la actividad intestinal en tres periodos consecutivos:  Fase I (fase de quiescencia): no se produce ninguna salva de potencial sobre las ondas lentas y por tanto no hay contracciones.  Fase II (fase de actividad irregular): algunas ondas lentas presentan salvas de potencial y otras no, de manera que se producen contracciones pero de forma aislada y se propagan poco.  Fase III (fase de actividad regular): todas las ondas lentas llevan asociadas salvas de potencial. Consiste en un grupo de contracciones peristálticas que se propagan aboralmente. La fase III puede terminar de forma brusca o bien ir seguida de un periodo corto de contracciones intermitentes que algunos autores denominan fase IV y que da paso a la fase I. La fase de quiescencia del MMC permite que el músculo descanse y se regenere. Sus fases activas aseguran el ejercicio físico del músculo liso. Dependiendo de la especie animal, los MMCs pueden iniciarse en el estómago o en el intestino. En el hombre, perro, hurón y zarigüeya la actividad motora del estómago presenta cambios cíclicos que van asociados a los MMCs intestinales. La fase III gástrica comienza antes que la duodenal pero ambas terminan al mismo tiempo. Por otra parte en animales como la rata, el cerdo, el cobaya y la oveja, la fase III comienza en el duodeno, mientras que en el conejo empieza en el yeyuno. Además, en cerdo, cobaya y oveja las contracciones gástricas se inhiben coincidiendo con la fase III duodenal, mientras que en rata y conejo la motilidad gástrica no fluctúa con el MMC. La duración de los MMCs depende de la especie animal aunque por término medio varía entre 60 y 120 minutos (Buéno y Ruckebusch, 1978a), excepto en la rata en la que se repiten cada 15-20 min (Ruckebusch y Fioramonti, 1975). Existen diferencias considerables entre las distintas especies según se trate del periodo postprandial o del interdigestivo (Fig. 1.16). En la mayoría de las especies monogástricas la ingesta de alimentos interrumpe los MMCs y aparece en su lugar una actividad motora continua de tipo irregular muy similar a una fase II. Por ello, en estas especies los MMCs sólo se observan en los periodos interdigestivos (Romanski, 2009a). La duración de esta interrupción depende de la especie, de la cantidad de alimento y de las propiedades físicas y químicas del mismo. Cuando los MMCs reaparecen tras una comida, generalmente lo hacen a nivel del yeyuno o del íleon y los ciclos posteriores comienzan ya normalmente en el duodeno o estómago. En estas especies el mayor flujo de contenido del intestino delgado se produce durante la interrupción postprandial de la actividad cíclica. La función de los Introducción 30 en el establecimiento de la estrecha y compleja relación entre el tracto GI, el sistema inmunitario y el SNC. La mucosa GI posee gran cantidad de mastocitos. Estudios histológicos demuestran que existe una asociación íntima entre los mastocitos y las neuronas tanto del SNC como del periférico (Dimitriadou y cols., 1990). Por lo que estas células podrían funcionar como transportadores bidireccionales de información entre el sistema nervioso y el inmunológico. La degranulación de los mastocitos puede producirse por la acción directa del NGF sobre los receptores localizados en los mastocitos y/o por un mecanismo indirecto a través de la liberación de SP desde los nervios intrínsecos o extrínsecos (Dray y Bevan, 1993). Tras la degranulación, se expulsan al medio una serie de mediadores como 5-HT, histamina, eicosanoides y citocinas, que pueden modular la fisiología digestiva. Los neurotransmisores también pueden desencadenar respuestas inmunitarias actuando sobre receptores de neuropéptidos localizados en otras células del sistema inmune, como son las células T, células B y los macrófagos. Esto sugiere que las señales nerviosas locales en los folículos linfoides y en la lámina propia regulan también diferentes aspectos de la respuesta inmune, que pueden alterar las funciones intestinales. En muchos procesos inflamatorios provocados experimentalmente se ha observado una importante infiltración de macrófagos debido a su capacidad para fagocitar sustancias extrañas al organismo, además de ser una importante fuente de mediadores de la inflamación y citocinas, en particular de IL-1. Además, pueden producir óxido nítrico (NO) cuando se encuentran expuestos al LPS o a las distintas citocinas. El NO a altas concentraciones posee propiedades citotóxicas y/o citostáticas que son muy importantes para la eliminación de los microorganismos, pero al mismo tiempo puede producir daños en las propias células intestinales. Los granulocitos (basófilos, neutrófilos y eosinófilos) están también implicados en la modificación de las funciones intestinales asociadas a procesos infecciosos o inflamatorios. Estos leucocitos se activan, entre otros factores, por endotoxinas bacterianas (LPS) y liberan al medio potentes reactivos oxidantes, proteasas y metabolitos del ácido araquidónico. Además son capaces de sintetizar y de reaccionar con diversas citocinas. 1.5 EL LIPOPOLISACÁRIDO (LPS) Y LAS CITOCINAS 1.5.1 LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS La pared celular de las bacterias Gram negativas es mucho más compleja que la de las Gram positivas (Fig. 1.17). Consta de tres zonas bien diferenciadas: membrana plasmática interna, espacio periplásmico (en donde se encuentra el péptidoglucano) y membrana Introducción 31 externa (Le Brun y cols., 2013). La membrana interna está constituida por una bicapa de fosfolípidos y regula el transporte de materiales. La proteína de membrana más abundante en la membrana externa de las bacterias Gram negativas es la lipoproteína de Braun o lipoproteína de mureína, la cual sirve de unión entre el péptidoglucano y la membrana externa. Sin embargo los constituyentes más característicos de la membrana externa son los lipopolisacáridos (LPS) que sustituyen a los fosfolípidos, que predominan en la membrana interna. La membrana externa es relativamente permeable a pequeñas moléculas hidrofílicas, si la comparamos con la membrana citoplasmática. Esto es debido a la presencia de unas proteínas denominadas porinas, que se agrupan en trímeros formando unos canales que atraviesan la membrana externa. Algunas porinas son inespecíficas y forman canales rellenos de agua, a través de los cuales se produce el transporte de sustancias pequeñas. Otras porinas son muy específicas ya que sólo poseen un sitio de unión para una o más sustancias. Sin embargo, dicha membrana externa no es permeable a enzimas o a otras moléculas de gran tamaño. Una de las principales funciones de esta membrana externa es la de retener algunas enzimas que se encuentran en el espacio periplásmico, evitando su salida al medio externo. En el periplasma o espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas podemos encontrar además del péptidoglucano, enzimas hidrolíticas, proteínas de unión y quimiorreceptores. Figura 1.17.- Envoltura de una bacteria Gram negativa. Tomada de Prescott y cols., 1999. Introducción 32 1.5.2 ESTRUCTURA DEL LIPOPOLISACÁRIDO El LPS es uno de los componentes estructurales más característicos de la membrana externa de las bacterias Gram negativas, que ayuda a mantener la estabilidad de dicha membrana. El LPS está formado por tres regiones distintas: el lípido A, que ancla el LPS a la membrana externa; el polisacárido central (core) y la cadena lateral O (Fig. 1.18) (Le Brun y cols., 2013). La región del lípido A es el componente hidrofóbico, conteniendo de cuatro a siete cadenas de ácidos grasos unidas a dos derivados del azúcar glucosamida. El lípido A es a menudo citotóxico representando el componente biológicamente activo, de modo que el LPS podrá actuar como una endotoxina y causar algunos de los síntomas que se desarrollan en las infecciones causadas por bacterias Gram negativas. Sin embargo, para que se produzca una respuesta citotóxica en los animales es necesario que esté presente la molécula completa. El polisacárido central está formado por 10 azúcares, entre los que podemos destacar las heptosas, la galactosa y el cetodesoxioctonato (KDO), que sirve de unión entre el lípido A y el cuerpo del LPS. La cadena lateral O ó polisacárido O específico, es una cadena de polisacáridos que se extiende hacia fuera. La composición en azúcares varía extraordinariamente según la cepa bacteriana, pero consta generalmente de galactosa, glucosa, ramnosa y manosa así como de uno o más dideoxiazúcares poco frecuentes como la abecuosa, colitosa, paratosa o tivelosa. Estos azúcares se unen entre sí formando secuencias de 4 ó 5 azúcares que se repiten para formar el lipopolisacárido O. Las cadenas O son reconocidas muy fácilmente por los anticuerpos del huésped, sin embargo las bacterias Gram negativas pueden incapacitar las defensas del huésped modificando la naturaleza de sus cadenas O para evitar ser identificadas. Figura 1.18.- Estructura del lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas señalando las tres partes principales en las que se divide. KDO: cetodesoxioctonato, Hep: heptosa, Glu: glucosa, Gal: galactosa, GluNac: N-acetilglucosamida, GlcN: glucosamida. Tomada de Madigan y cols., 1999. Introducción 33 1.5.3 LAS CITOCINAS Se denomina de forma genérica citocinas a un conjunto de proteínas de bajo peso molecular y vida media relativamente corta, que se sintetizan fundamentalmente en las células del sistema inmune, en respuesta a distintos patógenos o a sus productos. Las citocinas se producen en los primeros momentos de la activación celular, para alertar a las células que poseen en sus membranas receptores para las mismas, y así desencadenar una respuesta inmune. La mayoría de las citocinas son sintetizadas por macrófagos y linfocitos T (concretamente por los linfocitos Th, o “linfocitos T helper”). Sin embargo, también son capaces de sintetizarlas otras células del sistema inmune, así como las células endoteliales, los mastocitos y los hepatocitos. Las citocinas son moléculas muy potentes, que actúan a muy bajas concentraciones y poseen gran afinidad de unión con sus receptores. Las citocinas que son producidas por monocitos o macrófagos se denominan monocinas y si se liberan a partir de los linfocitos, linfocinas (Cominelli, 1993). Por otra parte, teniendo en cuenta las funciones que realizan, se pueden clasificar en tres grandes grupos (Van Miert, 1994): 9 Citocinas que actúan como estimuladoras o inhibidoras de los factores de crecimiento: IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12 y GM-CSF. 9 Citocinas con propiedades pro-inflamatorias: TNF-α, TNF-ß, IL-1α, IL-1ß, IL6, IFN-α, IFN-γ, y la IL-8. 9 Citocinas que actúan como factores anti-inflamatorios: IL-1ra, receptores solubles de la IL-1 y proteínas de unión del TNF-α y de la IL-1. Para realizar sus funciones las citocinas deben unirse a los receptores de membrana de las células diana, lo que produce una cascada de reacciones bioquímicas en el interior celular que se traducen en una regulación de su actividad, estimulando o inhibiendo sus funciones. Las citocinas actúan como “hormonas” del sistema inmune. Están implicadas en la respuesta inmune innata debido a la activación de linfocitos NK y macrófagos y en la respuesta inmune específica, tanto humoral como celular, actuando sobre los linfocitos T y B. También poseen un importante papel en la regulación de la hematopoyesis. 1.5.4 EFECTOS PRODUCIDOS POR EL LPS Y LAS CITOCINAS Muchos de los efectos tóxicos de las bacterias Gram negativas son debidos al LPS, endotoxina termoestable que se libera en grandes cantidades tras la lisis celular. El LPS es el responsable de una cascada de acontecimientos asociados con las infecciones por este tipo de bacterias, que de forma simplificada se representan en la Fig. 1.19. Introducción 34 Bacterias Gram negativas Infección LPS Liberación hacia el torrente sanguíneo Células que responden al LPS Unión a receptores del LPS Señalización Mediadores primarios Citocinas Óxido nítrico (NO) Células Diana Unión a receptores de citocinas Señalización Mediadores secundarios Prostaglandinas y leucotrienos PAF Cininas Metabolitos oxígeno-reactivos, NO Enzimas proteolíticas Efectos Fisiológicos Fiebre Activación del complemento Coagulación intravascular diseminada Disfunción vascular Depresión miocárdica Daño tisular y fallo orgánico múltiple (cerebro, hígado, riñón, pulmones…) Desenlace del shock endotóxico Muerte o recuperación Figura 1.19.- Esquema simplificado de la cascada del shock endotóxico (Chaby, 1999). Introducción 35 En la Fig. l.20 se muestra la cascada de activación del LPS. El reconocimiento de esta endotoxina por parte de las células de la respuesta inmune está mediado al menos por 4 moléculas: la proteína de unión al LPS (LBP), el CD14, la MD-2 y el receptor toll-like 4 (TLR4) (Miyake, 2007). Para que se produzca el reconocimiento del LPS, y posterior señalización intracelular por parte del receptor TLR4, es necesario que el LPS se encuentre unido a una proteína sérica denominada LBP (LPS-binding protein) (Viriyakosol y Kirkland, 1995). LBP funciona como una opsonina de partículas que contienen LPS, incluyendo a bacterias Gram negativas enteras, facilitando la unión de estas partículas con el CD14 presente en las células mieloides (Ulevitch y Tobias, 1995). El CD14 es una glicoproteína que puede encontrarse anclada a una molécula de glicofosfatidilinositol (GPI) en la membrana de monocitos, macrófagos y leucocitos polimorfonucleares, o bien, soluble en la circulación (Ulevitch y Tobias, 1995). El CD14 se asocia físicamente con un complejo proteico que incluye al TLR4 y una proteína accesoria, MD-2. Parece ser que el complejo TLR4/MD-2 es el responsable del reconocimiento directo de diferentes estructuras del LPS, que varían en función de la especie, proporcionando una alta especificidad al receptor (Akashi y cols., 2000; Shimazu y cols., 1999). La unión del LPS al TLR4 inicia una cascada de reacciones que culmina con la translocación del NFκB al núcleo. En reposo, el NFκB se encuentra unido a proteínas inhibitorias como el IκB. Tras producirse el estímulo, el IκB es fosforilado por el complejo IKK y se separa del NFκB, que se transloca hacia el núcleo e induce la transcripción de genes (Iwai y Tokunaga, 2009). Introducción 36 Figura 1.20.- Cascada de activación del LPS. La unión del LPS al TLR4 recluta varias proteínas, entre otras a la MyD88, TIRAP, TRIF (a través de la proteína TRAM) y a las MAPKs, como la p38, JNK y ERK. Finalmente, se activan factores de transcripción de genes, como el NFκB y los factores reguladores de interferón (IRFs), que inducen la transcripción de citocinas proinflamatorias. Tomada de Cohen, 2002. Cuando las endotoxinas son inyectadas experimentalmente a un animal, le provocan una serie de síntomas que se engloban bajo la denominación de “respuesta de fase aguda” (APR). Entre ellos, cabe destacar: fiebre, escalofríos, disnea, taquicardia, inapetencia, diarrea, disminución de las secreciones gástricas, inhibición de la tasa de vaciamiento gástrico, activación de linfocitos y neutrófilos, movilización de fagocitos, disminución de las tasas plasmáticas de hierro y zinc, reducción del número de leucocitos y plaquetas y alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas (Van Miert, 1990). Hay que tener en cuenta que el LPS a dosis altas puede llegar a causar la muerte debido a la aparición de un síndrome de disfunción multiorgánica que cursa con insuficiencia circulatoria, daño tisular inducido por los leucocitos, activación de los sistemas de coagulación, etc. (Brun-Buisson, 1995). El inicio de la respuesta de fase aguda, parece estar causado por la producción y liberación de citocinas proinflamatorias como el TNF-α y la IL-1 (Kilbourn y cols., 1990a y b). Las citocinas a su vez producen degranulación de mastocitos, macrófagos y neutrófilos, y la liberación de una serie de mediadores endógenos como el factor activador plaquetario (PAF), las PGs, el tromboxano, los leucotrienos, la vasopresina, el NO, etc. Todos estos mediadores son los responsables de la aparición de los distintos síntomas descritos Introducción 37 anteriormente. Existen a su vez otros mediadores antiinflamatorios que contribuyen a la modulación de esta respuesta. La respuesta febril es uno de los signos más manifiestos de los procesos infecciosos. El LPS actúa como un pirógeno exógeno y ejerce su efecto estimulando distintos tipos de células del sistema inmune para que liberen mediadores solubles llamados pirógenos endógenos, que son los verdaderos responsables de la fiebre, actuando en el SNC. Entre estos pirógenos endógenos destacan las citocinas, fundamentalmente la IL-1 (Kluger, 1991), IL-6 (Klir y cols., 1993) y el TNF-α (Watanabe, 1992), que son las principales responsables de que la señal pirogénica llegue a la región termorreguladora del cerebro localizada en el área preóptica (POA) del hipotálamo. También se han descrito alteraciones inducidas por el LPS en el tracto GI. Así, el LPS administrado por vía endovenosa en la oveja (Duranton y Buéno, 1984, Plaza y cols., 1997b) y cabra (van Miert y cols., 1992), inhibe las contracciones de los preestómagos y provoca un descenso en la actividad mioeléctrica del área antroduodenal durante varias horas, acompañado de un aumento de la frecuencia de los MMCs. En oveja anestesiada, la inyección endovenosa de la toxina produce en los preestómagos una respuesta muy bien tipificada: existe un periodo de latencia de 10-13 min, seguido de una repentina y total parada del retículo-rumen que dura 20-40 min. Posteriormente las contracciones van reapareciendo y vuelven a la normalidad al cabo de 20 min o más. Se ha comprobado que esta respuesta se debe a una relajación inicial del músculo retículo-ruminal seguida de una posterior y prolongada depresión de los centros gástricos del bulbo raquídeo, en el SNC (Leek y van Miert, 1971). En el conejo (Fioramonti y cols., 1984) y en la rata (Pons y cols., 1989), el LPS interrumpe los MMCs y los reemplaza por una serie de grupos de potenciales de acción que se propagan aboralmente. En el cerdo, produce una inhibición transitoria de la actividad eléctrica gastroduodenal (De Saedeleer y cols., 1991). También se han descrito efectos del LPS sobre el tránsito intestinal. Cullen y cols. en 1997, estudiaron el efecto de la endotoxina sobre la motilidad y el tránsito intestinal en perros, tras la administración de alimento líquido. Se observa una disminución de la frecuencia de contracciones y de la fuerza contráctil en el yeyuno, junto con un aumento del tránsito yeyunal, asociado a un mayor porcentaje de ondas de presión propagadas aboralmente. En el colon, la endotoxina aumenta temporalmente la velocidad del tránsito de líquidos e incrementa la frecuencia y fuerza de las contracciones cólicas. Estos hechos podrían contribuir a la diarrea que aparece durante la endotoxemia. Como ya hemos comentado anteriormente, las citocinas desempeñan un papel muy importante en el desarrollo de los efectos producidos por el LPS. Nuestro grupo ha descrito Introducción 38 previamente que la liberación de IL-1β (Plaza y cols., 1997b) y de TNF-α (Guerrero-Lindner y cols., 2003) en el SNC juegan un papel primordial en el desencadenamiento de la fiebre y de los trastornos motores GI inducidos por la administración endovenosa de LPS en la oveja. Así, la administración icv de ambas citocinas reproduce los efectos del LPS, mientras que la inyección icv del antagonista de los receptores de la IL-1β (IL-1ra) o del receptor soluble del TNF (TNFR:Fc) reduce los efectos provocados por la endotoxina. Estas citocinas, a su vez, ejercen sus efectos a través de la liberación de prostaglandinas en el SNC (Plaza y cols., 1997b, Guerrero-Lindner y cols., 2003). 1.6 LAS PROSTAGLANDINAS (PGs) Las PGs, tromboxanos y leucotrienos son los principales miembros de una gran familia de derivados de ácidos grasos endógenos que se sintetizan a partir de los fosfolípidos de membrana de la mayor parte de las células de los mamíferos y que se conocen con el nombre de eicosanoides. Los eicosanoides se pueden sintetizar a partir de células endoteliales vasculares, células del músculo liso, neutrófilos, macrófagos, plaquetas y otros tipos celulares. Las PGs y los leucotrienos no se almacenan en el interior de las células sino que difunden al medio inmediatamente después de su síntesis, para iniciar una gran variedad de actividades biológicas. Los eicosanoides están implicados en numerosas funciones celulares importantes para mantener la homeostasis celular, pero también contribuyen en el amplio espectro de efectos celulares que se producen en la inflamación y como respuesta a una invasión bacteriana. Tanto el LPS como las citocinas estimulan la actividad de la fosfolipasa A2 (PLA2), una enzima de la membrana celular que hidroliza fosfolípidos de membrana liberando ácido araquidónico y lisofosfolípidos (Fig. 1.21). Estos a su vez darán lugar a la liberación de PGs, tromboxanos, leucotrienos y PAF, que serán potenciales mediadores de los efectos observados en casos de endotoxemias. El ácido araquidónico es el principal precursor de los eicosanoides. Es un ácido graso esencial que se encuentra unido a los fosfolípidos de membrana por un enlace éster. Las PLA2 implicadas en la generación de eicosanoides son la citosólica (cPLA2) y las secretadas (sPLA2), en particular los grupos IIA, V y X. Tras la liberación del ácido araquidónico, queda un residuo lisofosfolípido en la membrana celular que posteriormente será acetilado para formar el factor PAF. El ácido araquidónico liberado, puede ser metabolizado en el citoplasma por enzimas diferentes: la ciclooxigenasa (COX) o la lipooxigenasa. La COX es la principal enzima productora de PGs y presenta dos isoformas: la COX-1, considerada clásicamente como constitutiva, presente prácticamente en todos tipos celulares a niveles constantes y la COX-2, considerada inducible por ciertos estímulos asociados a la Introducción 39 inflamación, como el LPS o las citocinas. La COX cataliza la transformación del ácido araquidónico en PGG2, la cual, por la acción de una peroxidasa, se transforma en la PGH2. A partir de la PGH2 y mediante la acción de varias isomerasas, se forman el tromboxano A2 (TXA2), la PGI2, la PGD2 y la PGE2, Este paso final de síntesis de PGE2 es catalizado por unas enzimas denominadas sintasas de PGEs (PGES), tanto citosólicas (cPGES) como ligadas a membranas intracelulares, llamadas también microsomales (mPGES). Figura 1.21.- Diagrama esquemático de la producción de eicosanoides. PAF: factor activador plaquetario; HPETE: ácido hidroperoxieicosatetraenoico; COX: ciclooxigenasa; LP: lipoxina; PG: prostaglandina; TX: tromboxano; LT: leucotrieno. Modificado de www.sigmaaldrich.com. La COX-1 y la COX-2 son casi idénticas en estructura pero tienen importantes diferencias en su selectividad por el sustrato y en su localización intracelular (Vane y cols., 1998). La COX-1 y COX-2 ovinas son homodímeros de 600 y 603 aminoácidos, respectivamente. Las PGs protectoras son sintetizadas por la COX-1, y preservan la integridad de las paredes mucosas del estómago e intestino y mantienen la función renal normal en el riñón comprometido. La COX-2, además de ser inducida en lesiones inflamatorias, está presente constitutivamente en el cerebro y médula espinal, donde podría estar involucrada en la transmisión nerviosa, en particular aquella relacionada con el dolor y la fiebre. Las PGs Introducción 46 Figura 1.22.- Biosíntesis de la PGE2 y receptores sobre los que actúa. El ácido araquidónico es liberado a partir de fosfolípidos de la membrana por medio la enzima fosfolipasa A2 y da lugar a la PGG2 y la PGH2 por medio de la acción de las enzimas COX-1 y COX-2. La PGE2 se forma a partir de la PGH2 y se une para activar cuatro subtipos de receptores, denominados receptores EP1 a EP4. Están asociados a proteínas G con la consiguiente activación de vías de transducción de señales. Tomada de Konya y cols., 2013. Introducción 47 Figura 1.23.- Vías de señalización de los receptores EP de la PGE2. Cuatro tipos principales de receptores EP están involucrados en la vía de señalización mediada a través de proteínas G y de diferentes segundos mensajeros. La PGE2 induce un aumento de Ca2+ o AMPc intracelular al acoplarse con los receptores EP1 o EP2/EP4 respectivamente. Sin embargo, induce una disminución del AMPc intracelular al unirse a receptores EP3. AC: adenilato ciclasa. DAG: diacilglicerol. IP3: inositol trifosfato. PIP2: fosfatidilinositoldifosfato. PKA: proteína cinasa A. PKC: proteína cinasa C. PI3K: fosfoinosítidos-3-cinasa. Akt: proteína cinasa B. ERK: proteína cinasa regulada por señales extracelulares. JNK: c-Jun N-terminal cinasa. EGR-1: respuesta temprana de crecimiento 1. EGFR: factor de crecimiento epidérmico. FGFR: factor de crecimiento de fibroblastos. GSK-3β: glucógeno sintasa cinasa-3. Tomada de Dey y cols., 2006. Introducción 48 1.7.1 DISTRIBUCIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA PGE2 (EPs) Los receptores contráctiles EP1 tienen una distribución muy amplia en la mayoría de las especies, siendo más abundantes en cobayas y roedores. En el hombre, estos receptores han sido descritos en el miometrio (Senior y cols., 1991), venas pulmonares (Norel y cols., 2004), mastocitos (Wang y Lau, 2006), músculo longitudinal del colon (Smid y Svensson, 2009) y queratinocitos (Konger y cols., 2009). Estudios de Northern blot en ratón identificaron el receptor EP1 en pulmón, estómago y riñón (Watabe y cols., 1993). En estas localizaciones se ha descrito que este receptor está implicado en la contracción de vías aéreas (Tilley y cols., 2003), secreción de surfactante en células alveolares tipo II (Morsy y cols., 2001), secreción de HCO3en el estómago en respuesta a la acidificación de la mucosa (Takeuchi y cols., 2006) o inhibición de la absorción de Na+ en el conducto colector renal (Guan y cols., 1998). Mediante el empleo de modelos animales se ha establecido un vínculo directo entre el receptor EP1 y el cáncer de colon (Watanabe y cols., 1999). A nivel central, la microinyección de PGE2 en el hipotálamo ventromedial produce un efecto antinociceptivo mediado por el receptor EP1 (Hosoi y cols., 1999) y la estimulación de este receptor ha mostrado inducir hipertermia (Oka y Hori, 1994). Los receptores EP2 están ampliamente distribuidos y, en sus diferentes localizaciones, inducen relajación, como es el caso de la broncodilatación inducida por la PGE2 en preparaciones bronquiales en el hombre (Norel y cols., 1999) y en el ratón (Tilley y cols., 2003). Otros estudios han relacionado cambios en la expresión de este receptor con el embarazo y parto, disminuyendo al término de la gestación (Astle y cols., 2005) y aumentando durante el parto (Grigsby y cols., 2006) para facilitar la distensión uterina. Lo mismo sucede en el caso de los receptores EP4, si bien el acoplamiento funcional al AMPc parece ser menos eficiente en el caso de este receptor en comparación con el EP2. Los receptores EP3 tienen una distribución muy amplia, poseyendo un importante papel en el SNC y en los sistemas cardiovascular, reproductor y renal, y se han implicado en el cáncer, inflamación y regulación inmune. Estudios de Northern blot han mostrado que el mRNA del receptor EP3 era el más abundante en el cerebro (Sugimoto y cols., 1994), expresándose en neuronas hipotalámicas del núcleo preóptico medial rodeando al OVLT, una estructura carente de barrera hematoencefálica. Por ello, este receptor podría estar involucrado en la génesis de la fiebre. La distribución de los receptores de las PGs depende de la especie animal, pero de manera general y gracias a estudios de Northern blot e hibridación in situ se ha mostrado que casi todos los tipos y subtipos de los receptores de los prostanoides se expresan a lo largo del tracto GI. Así, la expresión de los receptores EP a lo largo del tracto GI será crítica para las funciones que realice la PGE2. Introducción 49 En la oveja no se ha estudiado la distribución de los receptores EP en el tejido GI, pero sí en otras especies animales (Dey y cols., 2006). En el caso del ratón, se ha detectado el mRNA del receptor EP1 en la muscularis mucosae del estómago, y en menor cantidad, del esófago e intestino, donde este receptor está implicado en movimientos locales y en el plegamiento de la mucosa. El mRNA del receptor EP3 se ha localizado en los miocitos de la capa muscular longitudinal de todo el tracto GI, pero no en la capa circular. Así mismo, se ha localizado en glándulas fúndicas y en las neuronas del plexo mientérico. El receptor EP3 podría regular la contracción del músculo liso, directa o indirectamente a través del sistema nervioso entérico. El mRNA del receptor EP4 ha sido detectado en las glándulas del antro gástrico, indicando que podría mediar la producción de moco. Además, se ha localizado en células epiteliales, especialmente en la parte superior de las vellosidades y parece estar implicado en los procesos diarreicos en los que interviene la PGE2. En este estudio, no se encontraron evidencias de la presencia del mRNA del receptor EP2 en el tracto GI del ratón (Morimoto y cols., 1997; Narumiya y cols., 1999). Sin embargo, otros autores por medio de Northern blot describen una abundante expresión del receptor EP2 en el estómago e íleon (Katsuyama y cols, 1995). En la rata se ha detectado la presencia del mRNA de los cuatro receptores en células mucosas del estómago y en células caliciformes del intestino delgado y grueso, indicando que las PGs podrían desempeñar un papel en la secreción mucosa de estos órganos. Los receptores EP1 y EP3 también se han encontrado en ganglios entéricos (Northey y cols., 2000). El mRNA del receptor EP1 se ha localizado en las capas musculares del estómago, intestino delgado y colon. Por su parte, el receptor EP3 se ha identificado en las capas musculares del intestino, pero no del estómago, donde se ha observado en la mucosa, especialmente en células parietales (Ding y cols., 1997). Así, en el conejo, se ha determinado la expresión de los receptores EP1, EP2 y EP3 en células epiteliales de las vellosidades intestinales y en neuronas entéricas, así como de EP3 en el músculo liso GI. En este estudio no se ha detectado expresión de EP4 en ninguno de los segmentos (Grasa y cols., 2006). Otros autores sí describen la presencia de EP4 en células epiteliales gástricas en esta especie (Takahashi y cols., 1999). En el íleon de cobayas se ha detectado la presencia de receptores EP2 en neuronas entéricas (Lawrence y cols., 1992). En el hombre, la expresión de los receptores EP2 y EP3 se limita a la superficie luminal del epitelio gástrico y al ápice de la mucosa del colon. La expresión del receptor EP4 es modesta en el epitelio gástrico pero intensa en células mononucleares de la lámina propia (Takafuji y cols., 2000). Introducción 50 1.8 MACRÓFAGOS COMO MODULADORES DE LA INMUNIDAD 1.8.1 MACRÓFAGOS HEPÁTICOS Y PULMONARES Estudios previos de nuestro grupo determinaron que la administración iv de PGE2, a dosis que no modifican la temperatura corporal, disminuía la motilidad GI, de forma similar a los efectos observados tras la administración iv de LPS (Guerrero-Lindner, 2002), sugiriendo un posible papel de las PGs periféricas en las alteraciones motoras digestivas inducidas por la endotoxina. En cuanto a la procedencia de dichas prostaglandinas, observamos por estudios de WB e IHC que la administración de LPS en la oveja no aumenta la expresión de COX-1 o COX2 en el tracto GI (Castro, 2010) descartando así estos tejidos en la síntesis periférica de las PGs. Por otra parte, dado que el LPS era inyectado por la vena yugular, cuya sangre alcanza rápidamente el pulmón y que tanto el pulmón como el hígado son órganos que poseen numerosas células del sistema inmune, consideramos la posibilidad de que las PGs periféricas pudieran ser sintetizadas en macrófagos pulmonares o hepáticos y liberadas al torrente circulatorio. Estas PGs, a su vez, podrían transmitir la señal hasta el cerebro. Otros autores también han descrito que los efectos inhibitorios de la PGE2 sobre la motilidad GI se podrían deber a su interacción con receptores tanto centrales como periféricos (van Miert, 1998). El hígado es uno de los principales órganos encargados de eliminar sustancias exógenas y productos de desecho de la circulación sanguínea. Dado que es el principal órgano de eliminación del LPS circulante (Fox y cols., 1990), los macrófagos hepáticos o células de Kupffer son responsables de esta eliminación y están implicadas en la producción de citocinas y PGE2 y, por tanto, también en la fiebre inducida por el LPS. Las células de Kupffer derivan de monocitos circulantes y son el mayor grupo de macrófagos residentes del cuerpo, suponiendo de un 80 a un 90% de la población total de macrófagos tisulares (Bioulac-Sage y cols., 1996). Estas células se sitúan en el espacio vascular sinusoidal, y predominan en el espacio periportal, lugar donde están perfectamente situadas para eliminar las endotoxinas que circulan por los sinusoides y fagocitar microorganismos. Asimismo, las células de Kupffer pueden pasar a través del espacio de Dissé y contactar directamente con los hepatocitos, de forma que cuando éstos son apoptóticos, los fagocitan (Fig. 1.24). Tras la activación de las células de Kupffer por varios estímulos bacterianos, incluidos los lipopolisacáridos, liberan mediadores de la inflamación como eicosanoides, NO, TNF-α y otras citocinas importantes en la modulación de la proliferación y diferenciación de otras células, representando así una parte importante de la defensa inmune innata. Una elevada exposición de las células de Kupffer a productos bacterianos, especialmente endotoxinas, Introducción 51 puede conducir a una intensa producción de mediadores inflamatorios y, por último, a daño hepático (Kmiec, 2001). El papel fundamental de las células de Kupffer en el desencadenamiento de la fiebre inducida por el LPS iv quedó demostrado en un estudio realizado en cobayas en las que se producía la depleción de las células de Kupffer mediante la administración de cloruro de gadolinio (GdCl3). A diferencia del aumento de la temperatura y de los niveles de PGE2 producidos en el área preóptica por la administración iv de LPS, las cobayas pretratadas con GdCl3 mostraron una bajada de la temperatura corporal mientras que los niveles de PGE2 en el área preóptica no se modificaron (Sehic y cols., 1997). Figura 1.24.- Células inmunitarias en el hígado sano. LSEC: células endoteliales sinusoidales. B: linfocitos B. T: linfocitos T. DC: células dendríticas. HSC: células estrelladas hepáticas. KC: células de Kupffer. NK: células natural killer. Tomada de Racanelli y Rehermann, 2006. El hígado, bazo y médula ósea han sido clásicamente los lugares donde se ha descrito la presencia de macrófagos con acceso directo a la sangre circulante. Sin embargo, diversos estudios han demostrado que ovejas, terneros, caballos y cerdos tienen a nivel pulmonar una importante captación de partículas, bacterias o endotoxinas cuando se inyectan por vía iv. Ovejas y cabras experimentan un aumento en la reactividad vascular pulmonar conforme aumentan de edad (Longworth y cols., 1992). Por lo tanto, al aumentar la edad, el sitio principal de eliminación de partículas extrañas inyectadas iv cambia del hígado a los pulmones. Este cambio se ha relacionado con la colonización perinatal del pulmón por monocitos que se replican y diferencian en una nueva población de grandes y muy activos macrófagos residentes, conocidos como macrófagos pulmonares intravasculares (PIMs). La colonización del pulmón por los PIMs ocurre o bien después del nacimiento en algunas especies (PIMs constitutivos), o bien tras la estimulación con LPS o en condiciones como la cirrosis (PIMs inducidos). Estos PIMs tienen entre 20 y 80 µm de diámetro y se localizan ligados al endotelio de los capilares pulmonares. Se ha estimado que el número de PIMs en el parénquima pulmonar ovino y porcino es similar al de células de Kupffer hepáticas en rata (Winkler, Introducción 52 1988). Concretamente, la mayor concentración de PIMs se ha documentado en el pulmón ovino, los cuales cubren un 20% del endotelio de los capilares (Warner y cols., 1986). Además, se estimó que en la oveja (Warner y cols., 1986), cerdo (Carrasco y cols., 1996a) y ciervo (Carrasco y cols., 1996b) el número de PIMs era superior al de macrófagos alveolares. Varios estudios han mostrado una eritrofagocitosis por PIMs en cabras (Atwal y cols., 1985), ovejas (Warner y cols., 1987) y gatos (Schneeberger y Burger, 1970), sugiriendo que éstos puedan desempeñar un papel en la eliminación normal de eritrocitos envejecidos, restos celulares y fibrina durante la inflamación. Un estudio en 13 especies diferentes mostró similares cinéticas de aclaramiento de partículas inyectadas vía iv en oveja, cerdo, cabra y gato con una elevada captación en el pulmón en comparación con el mono, conejo, rata, ratón, cobaya y pollo. En comparación, este segundo grupo de especies mostró mayoritariamente captación de partículas por células de Kupffer en el hígado (Brain y cols., 1999). En óvidos, Warner y cols., (1987) mostraron que, tras la administración iv de Pseudomonas aeruginosa, la captación a nivel pulmonar era superior al 90%. Un estudio posterior de este mismo grupo (1988) mostró una captación pulmonar similar de endotoxina radiomarcada en oveja. Sin embargo, las especies que presentan PIMs pueden tener también una depuración hepática eficaz. Cuando las partículas o las bacterias entran a través del intestino y se presentan primero en el hígado a través de la circulación portal, serán eliminadas principalmente por las células de Kupffer y la captación hepática será mucho mayor (DeCamp y cols., 1992). Curiosamente, ésto no ocurre con el LPS, ya que cuando es inyectado en la vena porta puede eludir la captación hepática, ser secuestrado en los pulmones, e iniciar allí la inflamación (DeCamp y cols., 1992). 1.8.2 MICROGLÍA O MACRÓFAGOS CEREBRALES Las células de la microglía son la población de macrófagos residentes en el cerebro (Hanisch y Kettenmann, 2007) y están implicadas en la vigilancia inmunitaria del parénquima cerebral (Marín-Teva y cols., 2012; Prinz y Mildner, 2011). Por características morfológicas, proliferativas e histoquímicas, se puede clasificar a la microglía como un tipo de fagocito mononuclear cerebral. Durante el desarrollo, los monocitos invaden el cerebro y se van diferenciando para llegar a ser células de la microglía. Las células de la microglía se encuentran dispersas en el tejido nervioso y, ante una lesión o un estímulo inmunitario, se transforman desde un fenotipo en reposo a uno activado. Éstas últimas células migran al sitio de la lesión, liberan citocinas y otras Introducción 53 sustancias indicadoras de neuroinflamación (Hanisch, 2002). Posteriormente, liberan moléculas citotóxicas como el NO y especies reactivas del oxígeno y se transforman en fagocitos para limpiar el sitio de la lesión de patógenos y desechos celulares. Otros estudios ponen de manifiesto que las células de la microglía también desempeñan un papel funcional en el cerebro normal, de forma que expresarían neurotransmisores y receptores neuro-hormonales que las capacitarían para detectar la actividad neuronal y astrocítica (Pocock y cols., 2007). 2.- OBJETIVOS Material y Métodos 62 En el estabulario se mantenía un fotoperiodo constante de 12 horas de luz y 12 de oscuridad, iniciándose la fase de luz a las 8:00. La temperatura se mantenía constante entre 18 y 20 °C. 3.2 ESTUDIOS DE MOTILIDAD GASTROINTESTINAL IN VIVO Con el objetivo de analizar la motilidad digestiva en ovejas conscientes se empleó la técnica de la electromiografía. 3.2.1 PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO Los animales eran sometidos a un periodo de ayuno previo a la cirugía de 24 horas, disponiendo de agua ad libitum hasta 12 horas antes de la intervención. Inicialmente, se procedía a realizar la premedicación de los animales mediante la administración intravenosa (iv) de xilazina (0,2 mg/kg, Xilagesic 2%, Laboratorios Calier, Barcelona) y clorhidrato de ketamina (0,4 mg/kg, Imalgene 1000, Merial, Barcelona). Se completaba la inducción anestésica con propofol iv (4-5 mg/kg, Vetofol, Esteve, Barcelona) y se procedía a realizar la intubación endotraqueal. El mantenimiento de la anestesia se realizó con isofluorano al 2,5% y oxígeno al 3%. Con la oveja colocada en decúbito lateral izquierdo y la zona de abordaje (pared abdominal lateral derecha) rasurada y lavada con jabón germicida, se realizaba una incisión paracostal (5-6 cm por detrás del hipocondrio), que permitiera el acceso al aparato digestivo. Para registrar la actividad mioeléctrica se implantaron electrodos (Microfil Industries SA, Renens, Suiza) constituidos por un hilo de aleación níquel/cromo (80%/20%), de 0,12 mm de diámetro y 1,2 m de longitud y recubiertos por una triple capa aislante de éster de poliimida. Se eliminaba la capa protectora de uno de los extremos del electrodo para implantarlo en la pared muscular según el procedimiento descrito en la Figura 3.1. Se implantaron grupos de tres electrodos intraparietales, con una distancia entre cada uno de aproximadamente 5 mm, en la capa muscular de las siguientes estructuras: dos grupos en el saco dorsal del rumen, dos en el antro abomasal, dos en el duodeno, y seis en el yeyuno. Para ello se siguió la técnica descrita por Ruckebusch y cols. en 1968 y modificada por Ruckebush en 1970. La reacción fibroserosa que se desarrolla entre las 24 y 48 horas después de la intervención, asegura un perfecto enquistamiento del electrodo en la pared del órgano (Fig. 3.1). Para registrar la temperatura corporal de forma continua, se introducía en la cavidad abdominal una sonda termosensible compuesta por un termistor (tipo NTC, Farnell, Leeds, Reino Unido) soldado a dos cables recubiertos de silicona. Material y Métodos 63 Los extremos libres de los electrodos y los cables de la sonda termosensible eran reagrupados por la parte superior de las incisiones quirúrgicas, pasados por vía subcutánea y exteriorizados en el dorso del animal. Figura 3.1.- Técnica de implantación crónica de electrodos intraparietales o intramurales. A: Con una aguja hipodérmica (que actuaba a modo de trócar) se atravesaba la pared muscular en 2 ó 3 mm, y a través de ella se introducía el extremo del electrodo (sin aislante, en negro). B: Se retiraba la aguja, dejando el límite de la capa aislante del electrodo a nivel de la serosa. C: El electrodo se fijaba a la pared por medio de un bucle. D: Una reacción fibroserosa aseguraba el aislamiento del conjunto. Tomado de Ruckebusch y cols., 1968. En la misma intervención quirúrgica se colocaba una cánula intracerebroventricular (icv) para proceder posteriormente a administrar agentes a nivel del sistema nervioso central, siguiendo la técnica descrita por Buéno y cols. en 1983. Se realizaba una incisión cutánea sagital de 5-6 cm a la altura de la línea que une los conductos auditivos con la base del cráneo. Posteriormente se trepanaba el hueso frontal derecho, a 0,75 cm de la sutura media frontal y a 1 cm por delante de la sutura frontoparietal. A través de este orificio se insertaba una cánula de acero de 24 mm de longitud y 2 mm de diámetro externo, cuyo extremo se situaba a 2-4 mm del techo del ventrículo lateral derecho del cerebro (Fig. 3.2). La cánula de acero estaba soldada a una placa de latón de 4 cm de largo, 1 cm de ancho y 2 mm de espesor. Ésta se fijaba al hueso frontal mediante dos tornillos de osteosíntesis. Durante el transcurso de toda la intervención las estructuras eran irrigadas con solución salina fisiológica (Braun, Barcelona) y las suturas fueron desinfectadas con gentamicina y cubiertas con un aerosol de aluminio (Aluspray Aerosol, Vetoquinol, Madrid) para proteger y favorecer la cicatrización. Material y Métodos 64 frontal parietal occipital nasal cánula i.c.v. VLD parietal occipital frontal nasal 0.75 cm 1 cm cánula i.c.v. Figura 3.2.- Esquema de la implantación de la cánula intracerebroventricular (icv), siguiendo la técnica descrita por Buéno y cols., 1983. Para estimular la actividad respiratoria postoperatoria, se administraba por vía iv clorhidrato de doxapram (5-10 mg/kg, Docatone-V, Fort Dodge Veterinaria, Girona). El mismo día de las intervenciones se administraba por vía intramuscular (im) un antibiótico de amplio espectro como es la oxitetraciclina (20-40 mg/ kg, Terramicina 100, Pfizer, Madrid) y se repetía esta antibioterapia cada 3 días. Para prevenir el dolor postoperatorio, se utilizó como antiinflamatorio meloxicam (0,2 mg/kg, Metacam, Boehringer Ingelheim, Barcelona) por vía sc cada 24 horas, y se repetía dicha pauta durante los 3 días posteriores a la operación. Si los animales mostraban signos de dolor, el meloxicam era administrado cada 12 horas. Para tratar posibles íleos paralíticos y estimular la motilidad ruminal se administró un parasimpaticomimético como es la neostigmina (0,5 mg/kg, Neostigmina, Braun, Barcelona) por vía sc cada 12 horas. En estos casos además se administró menbutona, derivado del ácido propiónico, para normalizar el funcionamiento digestivo (0,1 g/kg, Rapifan, Boehringer Ingelheim, Barcelona), por vía im cada 24 horas; un estimulante metabólico a base de fósforo orgánico con vitamina B12 (1 ml/kg, Catosal, Bayer, Barcelona) por vía im cada 24 horas; y un ruminatorio (25 g/animal, Rumiol, Laboratorios Pino, Cantabria) por vía oral cada 24 horas. La herida quirúrgica era vigilada durante el periodo postoperatorio y a las dos semanas de la intervención se retiraban los puntos y grapas. Además, durante todo este tiempo se monitorizaba la temperatura corporal con el fin de controlar el estado del animal. Material y Métodos 65 3.2.2 REGISTROS DE TEMPERATURA CORPORAL La temperatura corporal era medida mediante un termómetro electrónico de 4 canales basado en un termistor, desarrollado por el Servicio de Instrumentación Electrónica de la Universidad de Zaragoza. El aparato estaba calibrado para dar una salida inicial de 0 voltios a 35 ºC, con una sensibilidad de 400 mV/ºC. Posteriormente, la señal era captada por un conversor analógico digital (ADC-16, Pico Technology Ltd., Cambridge, Reino Unido), con una resolución de 16 bits (512 puntos de resolución), que la transmitía a un ordenador con una frecuencia de muestreo de 3 muestras/min/canal. Los datos se representaban en la pantalla de un ordenador y se grababan en el disco duro a través de un programa informático diseñado por el Servicio de Instrumentación Electrónica de la Universidad de Zaragoza basado en el software LabView v7 (National Instruments, Texas, EE.UU.). Los datos se exportaban a ficheros Excel y GraphPad Prism para su análisis. 3.2.3 REGISTROS ELECTROMIOGRÁFICOS Denominamos ondas lentas o ritmo eléctrico de base a las oscilaciones rítmicas y espontáneas del potencial de la membrana celular en reposo de las células musculares del tracto gastrointestinal de los mamíferos. Cuando la membrana supera el potencial umbral, se desencadena un conjunto de potenciales de acción denominado salva de potencial, que producirá la contracción. Ruckebush en 1970 demostró en la oveja que existía una buena correlación entre las salvas de potencial y las contracciones de la musculatura gastrointestinal, por lo que la representación de la actividad mioeléctrica era directamente proporcional a la amplitud de la contracción. Por tanto, se utiliza de forma frecuente la electromiografía como estimación de la motilidad gastrointestinal (Fig. 3.3). Material y Métodos 66 Figura 3.3.- Representación simultánea de la actividad mioeléctrica (1) y mecánica (2), según Ruckebusch y cols., 1981. La actividad eléctrica a diferentes niveles del tracto digestivo puede ser registrada durante varias semanas mediante la técnica de electromiografía a partir de electrodos intraparietales desarrollada por Ruckebusch y cols., 1968 y modificada por Ruckebusch en 1970. Los extremos libres de los electrodos (desprovistos de la lámina de protección) se conectaban mediante clavijas a un panel de entrada para poder llevar a cabo los registros electromiográficos. La señal eléctrica ajena a los electrodos implantados se eliminaba conectando al animal a la toma de tierra del panel mediante un cable soldado a un imperdible fijado de forma subcutánea en la oveja. La señal eléctrica pasaba a una caja de conmutación para seleccionar las combinaciones de electrodos y posteriormente a un amplificador de alta ganancia (MT8P, Lectromed, St Peter Jersey Channel Islands, Reino Unido) con 8 unidades de amplificación. Seguidamente, la señal era filtrada mediante filtros pasa-altos (15 Hz) y pasa-bajos (50 Hz). Los filtros pasaaltos (EMG-FU8CH Pb 40010, Panlab, Barcelona) permiten atenuar las ondas lentas, y observar sólo las salvas de potencial. Los filtros pasa-bajos, presentes en los amplificadores, eliminan ruidos de fondo de frecuencia elevada que no pertenecen al sistema (corriente de red, medio externo...). Un conversor analógico digital (MP100, Biopac Systems Inc, SDR Clinical Technology, Sydney, Australia) recogía la señal mioeléctrica amplificada y filtrada con una resolución de 16 bits, y era transmitida a un ordenador. El programa de adquisición de datos Acqknowledge v3.8 (Biopac Systems Inc) almacenaba todos los datos del registro en el disco duro con una frecuencia de muestreo de 100 muestras/segundo/canal. Este programa informático también permitía visualizar el registro en la pantalla del ordenador e imprimirlo (Fig. 3.4). Material y Métodos 67 Figura 3.4. - Esquema de la jaula metabólica donde se mantenían las ovejas y del tratamiento de la señal electromiográfica. 3.2.4 ANÁLISIS DE LA SEÑAL ELECTROMIOGRÁFICA El procesamiento de la información electromiográfica se realizó mediante el programa de software Acqknowledge v3.8. Se analizó la frecuencia del complejo mioeléctrico migratorio (MMC) determinando la duración en minutos de cada MMC (periodo) tomando como inicio de cada ciclo el comienzo de la fase III. Para analizar la motilidad gastrointestinal se realizaba una estimación de la carga mioeléctrica total (integral) de las espigas en un periodo de tiempo determinado. Para cada tramo estudiado, el ordenador sumaba todas las diferencias de potencial (positivas y negativas) en valor absoluto de un tramo seleccionado y expresaba el valor medio en mV/s, ya que se ha comprobado que es un parámetro altamente estable en periodo control (Plaza y cols., 1996c). La amplitud del registro electromiográfico depende del número de células musculares que sean rodeadas por los electrodos. Por ello, los resultados en mV/s obtenidos de un tramo gastrointestinal no son comparables entre varios animales. Para analizar los parámetros de las distintas fases del MMC en periodo control, se hallaba la media de los Electrodos Selector de electrodos Amplificadores Filtros Impresora Análisis automático de la señal Panel de electrodos Ordenador Conversor A / D Pantalla Material y Métodos 68 valores de actividad mioeléctrica integrada durante las fases II y se expresaban los datos de las fases I y III como porcentaje relativo a la media del valor de las fases II. El LPS y varios de los agonistas de los receptores EPs inducen un aumento de la frecuencia de las fases III del MMC. En este efecto es difícil de distinguir entre la fase I y II, ya que la actividad mioeléctrica disminuye mucho. Por ello, en estos experimentos se ha unificado la cuantificación de la actividad mioeléctrica durante las fases I y II, denominando a este parámetro “fase I+II”. Así, en cada experimento se analizó un periodo control de 5 horas antes de la administración del agente. En este tiempo se cuantificó la media de los valores de actividad mioeléctrica integrada durante las fases I y II del MMC de forma conjunta, utilizando este valor como dato control. Tras la administración del agente, se analizó la actividad mioeléctrica de la misma manera, pero cuantificando la media de cada periodo de 60 minutos. Esta media se expresó como porcentaje relativo a la media del periodo control de 5 horas. Con el fin de eliminar las pequeñas oscilaciones de la línea basal que no pueden ser filtradas se le proporcionaba al ordenador un valor de diferencia de potencial basal, por debajo del cual toda señal eléctrica la consideraba como 0 y la despreciaba para todos los cálculos (Fig. 3.5). Figura 3.5.- Representación de dos salvas de potencial (o espigas). 3.2.5 ADMINISTRACIÓN DE LOS AGENTES La administración a nivel periférico se realizó por vía iv en la vena yugular a través de un catéter apirógeno Vasocan Braunüle (B/Braun) de Teflón FEP (propileno etileno fluorado), de 1,3 mm de Ø externo y 45 mm de longitud. La cánula era mantenida con heparina disuelta al 0,1% en solución salina estéril y apirógena para evitar la coagulación de la sangre. La administración a nivel central se realizó a través de la cánula icv de acero implantada en el ventrículo lateral. A través de ella se introducía un catéter de Teflón PTFE (politetrafluoroetileno), de 0,56 mm de Ø interno y 1,07 mm de Ø externo, con el que se atravesaban los 2-4 mm de tejido cerebral que faltaban hasta alcanzar la luz del ventrículo lateral. Antes de la administración icv de un agente y de forma regular a días alternos, se Material y Métodos 69 verificaba que salía líquido cefalorraquídeo a través del catéter, bien de forma espontánea o tras la compresión de las venas yugulares. 3.2.6 DISEÑO EXPERIMENTAL Se organizaron lotes compuestos por 5 ovejas cada uno. Transcurrida una semana de la intervención quirúrgica comenzaban los registros electromiográficos. En cada experimento se realizaba un periodo de control de 12 horas. En una primera serie de experimentos se administró LPS por vía iv (0,1 µg/kg). En la segunda serie de experimentos se administraron iv los inhibidores de macrófagos clorhexahidrato de gadolinio (III) (10 mg/kg) ó tiloxapol (100 mg/kg/h, 1h) 72 ó 4 horas respectivamente antes de la administración de LPS (0,1 µg/kg). En otros experimentos se administraron dos dosis de gadolinio (10 mg/kg) separadas 72 horas y posteriormente LPS (0,1 µg/kg) 72 horas tras la segunda dosis de gadolinio. En la siguiente serie de experimentos se administraron los agonistas de los receptores EP de la PGE 2: 17-fenil trinor PGE2 (EP1, 2 y 8 nmol/kg, icv; así como 8 nmol/kg, iv), butaprost (EP2, 2 y 8 nmol/kg, icv; así como 8 nmol/kg, iv), sulprostona (EP3, 0,4, 2 y 8 nmol/kg, icv; así como 2 nmol/kg, iv) y L-902,688 (EP4, 0,4 y 2 nmol/kg, icv; así como 2 nmol/kg, iv). Para descartar un posible efecto per se del solvente, la solución salina y el DMSO fueron ensayados ellos sólos siguiendo el mismo protocolo que las sustancias problema y se utilizaron como control para los análisis estadísticos. Para cada tratamiento se estableció una secuencia aleatoria para la infusión de las distintas dosis de cada agente en cada animal. Los experimentos en los que se administraban agentes inductores de fiebre se separaron un mínimo de 7 días entre sí. 3.2.7 AGENTES ENSAYADOS El LPS (E. coli serotipo 0111:B4), clorhexahidrato del gadolinium (III), tiloxapol, y el DMSO eran de Sigma (Madrid). La solución salina estéril y apirógena era de Braun (Barcelona). El gadolinio y el tiloxapol se diluyeron el mismo día de su utilización en 2 y 500 ml de solución salina estéril respectivamente. El LPS se disolvía en agua destilada estéril a 0,1 mg/ml, se alicuotaba y se mantenía congelado a -20 ºC hasta su utilización, en la que se disolvía en 2 ml de solución salina estéril. Material y Métodos 70 La sulprostona era de Tocris Bioscience (Reino Unido). El butaprost, 17-fenil trinor PGE2 y el L-902,688 eran de Cayman Chemical (USA). La sulprostona y el butaprost venían disueltos comercialmente en metilacetato, mientras que el 17-fenil trinor y el L-902,688 venían disueltos en etanol. Todos fueron desecados mediante una corriente de nitrógeno. Posteriormente, los agonistas de los receptores EP eran disueltos en DMSO puro, se alicuotaban y se mantenían congelados a -20 ºC hasta su utilización. 3.3 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS PARA INMUNOHISTOQUÍMICA y WESTERN BLOTTING Para llevar a cabo los estudios de inmunohistoquímica (IHC) y western blotting (WB) se utilizaron tres lotes de tres ovejas, previamente desparasitadas como se indica en el apartado 3.1. Cada lote se componía de una oveja que actuaba como control y recibía una inyección iv de 2 ml de solución salina (solvente del LPS), y dos ovejas a las que se les administraba una inyección iv de LPS (0,1 µg/kg). Transcurrida 1 hora de la inyección, se procedía al sacrificio de la oveja control y una de las que recibían LPS. La tercera oveja se sacrificaba transcurridas 4 horas de la administración del LPS. Los tiempos de sacrificio (1 y 4 horas) se eligieron debido a que los animales estaban alcanzando o habían alcanzado el primer y el segundo pico de la respuesta febril al LPS, respectivamente. El sacrificio de los animales se realizaba mediante una sobredosis iv de pentobarbital sódico (Dolethal, Vétoquinol, Madrid). De forma inmediata se realizaba una incisión en la cavidad abdominal para proceder a la extracción del aparato digestivo y se recogían fragmentos del saco dorsal del rumen, antro abomasal y duodeno (previa eliminación del mesenterio y de la grasa), hígado y pulmón. En algunos fragmentos de duodeno procedimos a obtener muestras de mucosa separada de las capas de músculo liso. Para ello realizábamos un raspado de la capa mucosa con ayuda de un portaobjetos. También se extraía el cerebro y se tomaban muestras de hipotálamo y tronco del encéfalo (bulbo raquídeo). Todos los tejidos eran lavados con tampón salino fosfato (PBS) frío (Tabla 3.1). PBS, pH 7,2 NaCl 137 mM KCl 2,68 mM Na2HPO410,14 mM KH2PO4 1,76 mM Tabla 3.1.- Composición del tampón salino fosfato (PBS). Material y Métodos 71 Una vez extraídas las muestras destinadas a IHC, eran fijadas en una solución de formol al 10%, con pH 7 (Tabla 3.2), donde permanecieron 24 horas. Solución fijadora de formol, pH = 7 Formaldehído comercial 37-38% 10% NaH2PO4 · H2O 25,6 mM Na2HPO4 anhidro 45,8 mM Tabla 3.2.- Composición del formol utilizado para fijar los tejidos. Las muestras destinadas a WB eran congeladas mediante la inmersión en isopentano (Fluka, Madrid) mantenido a una temperatura de –80 ºC. Transcurridos unos minutos, se extraía el tejido y se almacenaba a –80 ºC hasta que tenía lugar su homogeneización. 3.4 ESTUDIOS DE WESTERN BLOTTING (WB) La técnica de western blotting (WB) o inmunoblotting es una técnica basada en principios inmunológicos para detectar y cuantificar antígenos proteicos. El equipo empleado para el WB (sistema de WB en minigeles) se adquirió a la casa Biorad (Hercules, CA, EE.UU.). El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), la albúmina sérica bovina (BSA), el IGEPAL CA-630, el desoxicolato sódico, el dodecil sulfato de sodio (SDS) y el persulfato de amonio (APS) procedían de Sigma (Madrid). La tetrametiletilenodiamina (TEMED), el Tween 20, el Azul de bromofenol y el colorante Ponceau S fueron adquiridos a Acros Organics (New Jersey, EE.UU.). La acrilamida/bisacrilamida y el glicerol fueron adquiridos a AppliChem (Alemania), mientras que el colorante de Bradford fue adquirido a Biorad. El 1,4ditiotreitol (DTT), el tris base y la glicina fueron suministrados por Roche Diagnostics (Barcelona). El resto de reactivos para el WB, así como para los tampones, se adquirieron a Panreac (Barcelona), salvo que se indique lo contrario. Los anticuerpos primarios frente a los receptores de la PGE2 (EPs) y frente a la COX-1 así como el anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano fueron adquiridos a Cayman Chemical (USA). El anticuerpo primario anti-COX-2 y el anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a peroxidasa de rábano fueron adquiridos a BD Biosciences (Bélgica). El anticuerpo frente a la actina, y el secundario anti-cabra acoplado a peroxidasa de rábano, se adquirieron a Santa Cruz (California, EE.UU.). Los anticuerpos se alicuotaban y se mantenían, según las instrucciones de la casa comercial, a 4 ºC o a -20 ºC hasta su utilización. 3.4.1 HOMOGENEIZACIÓN DE LAS MUESTRAS Ayudándonos de un mortero de porcelana preenfriado a -80 ºC, las muestras congeladas se fragmentaban en pequeños trozos. Los fragmentos de tejido obtenidos se introducían en tubos de ensayo que contenían 1 ml por cada 100 gramos de tejido de un tampón de Material y Métodos 78 3.4.5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE β–ACTINA Y GAPDH Para averiguar si los posibles cambios en la expresión de nuestras proteínas eran debidos al tratamiento con LPS o por el contrario se debían a que la cantidad de muestra cargada en las distintas calles del gel no era la misma, mediante la técnica de WB se determinó la cantidad de β-actina (en el sistema nervioso central, hígado y pulmón) y de GAPDH (en los demás órganos). Estas dos proteínas se utilizaron como controles de carga puesto que se sabe que su expresión no se ve alterada por la acción del LPS. La β-actina es una proteína de 46 kDa presente en los tejidos en gran cantidad. El GAPDH, de 36 kDa, es una de las enzimas clave involucrada en la glicolisis. Con el objetivo de volver a incubar las membranas con un anticuerpo anti-β-actina o anti-GAPDH y evitar señales erróneas, las membranas se ponían en contacto con un medio que provocaba la separación de los anticuerpos primario y secundario unidos a la muestra (stripping). Para ello, las membranas se mantenían durante 30 minutos en una solución de glicina (200 mM) con 0,4% de SDS, a pH 2,5. Tras dos lavados de 15 minutos con PBST (determinación de β-actina) o TBST (determinación de GAPDH), se incubaban durante 1 hora a tª ambiente con PBST o TBST, con un 5% de leche desnatada en polvo. Las membranas se lavaban durante 10 minutos con PBST o TBST y eran incubadas toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario anti-β-actina hecho en cabra (Santa Cruz) o con el anti-GAPDH hecho en conejo (Santa Cruz), disueltos respectivamente a 1:20.000 en PBST o 1:10.000 en TBST, en ambos casos con un 1% de leche desnatada en polvo. Tras un lavado de 15 minutos y cuatro de 5 minutos con PBST o TBST, se incubaban con un anticuerpo secundario anti-IgGs de cabra (Santa Cruz) en el caso de β-actina, o bien con un anticuerpo secundario anti-IgGs de conejo (Santa Cruz) en el caso del GAPDH, disueltos 1:5.000 en el mismo medio que los anticuerpos primarios, durante 1 hora a tª ambiente. Tras un lavado de 15 minutos y cuatro de 5 minutos con PBST o TBST, las membranas se incubaban con el reactivo de quimioluminiscencia y se revelaban como se ha indicado anteriormente. 3.4.6 ANÁLISIS DE LAS BANDAS OBTENIDAS POR WB Las películas fotográficas se escanearon a una resolución de 300 puntos por pulgada y se guardaron como archivos de imagen en formato tif. La intensidad de las bandas se determinó mediante el programa informático Quantity One Analysis Software (Biorad). La cuantificación de las bandas se normalizaba teniendo en cuenta la señal de β-actina o de GAPDH obtenida para cada una de ellas. Material y Métodos 79 3.5 ESTUDIOS DE INMUNOHISTOQUÍMICA (IHC) Esta técnica fue utilizada para estudiar la localización en los tejidos de las ciclooxigenasas (COX) y de los receptores de la PGE2 (EPs). Los productos utilizados se adquirieron a Panreac (Barcelona), salvo que se indique lo contrario. Las muestras fueron procesadas en un inclusor que sustituía el agua de los tejidos por parafina, formando un bloque. En el caso de las muestras de hipotálamo, se realizaron tres secciones: una primera a nivel del área preóptica, otra por detrás del quiasma óptico (zona de los núcleos paraventricular y anterior) y una última sección justo por delante del cuerpo mamilar (zona de los núcleos dorso y ventromedial). A partir de los bloques de parafina se realizaban cortes de 4 µm de espesor con un microtomo. Los cortes se introducían en un baño de agua destilada a 37 ºC para reblandecer la parafina, y se recogían con portaobjetos cargados positivamente (Starfrost, Knittel Glaser, Burgdorf, Alemania) que atraen fuertemente los tejidos que se colocan sobre ellos, de manera que se puedan someter a los diversos tratamientos sin riesgo de desprendimiento. Los portaobjetos se introducían en posición vertical en una estufa a 37 ºC un mínimo de 24 horas para su completo secado, tras lo cual se almacenaban a temperatura ambiente. El mismo día del experimento, los cortes se desparafinaban y rehidrataban introduciéndolos sucesivamente en unas cubetas con un producto sustitutivo del xilol llamado Histo-Clear II (National Diagnostics, Atlanta, Georgia, USA) y alcoholes a distintas concentraciones durante el tiempo y en el orden que se indica en la Tabla 3.10. Una vez rehidratados se dejaban reposar 5 minutos en PBS. Producto Tiempo (min.) Histo-Clear 10 Histo-Clear 10 Etanol 100% 5 Etanol 100% 5 Etanol 96% 5 Etanol 90% 5 Etanol 70% 5 Agua destilada 5 Tabla 3.10. - Secuenciación y tiempos de inmersión de los portaobjetos en Histo-Clear, alcoholes y agua. A continuación, el siguiente paso consistía en inhibir la peroxidasa endógena de los tejidos, para lo cual los portaobjetos se sumergían durante 30 minutos en una solución de metanol con un 0,3% de peróxido de hidrógeno (H2O2). Transcurrido este tiempo se dejaban reposar durante 5 minutos en PBS. Material y Métodos 80 La siguiente etapa del protocolo consistía en realizar el denominado “desenmascaramiento del antígeno” (antigen retrieval) dado que la fijación en formaldehído podía provocar cambios en la conformación de las proteínas que podrían impedir el correcto reconocimiento de éstas por parte de los anticuerpos. Para ello se calentaban los tejidos, sumergidos en una disolución de 1,8 mM de ácido cítrico y 8,2 mM de citrato de sodio dihidratado, en un horno microondas realizando dos pases de 5 minutos a 750 W de potencia. Una vez realizado este proceso se dejaban reposar 5 minutos en PBS. Para minimizar la cantidad utilizada de anticuerpos y soluciones, se rodeaban los cortes con una barrera hidrofóbica mediante un marcador ImmEdge (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). De esta manera, las disoluciones hidrófilas no podían entrar en contacto con dicha barrera y se mantenían dentro del espacio limitado por dicho marcador. Con el objetivo de bloquear las uniones inespecíficas de los anticuerpos, los cortes se incubaban durante 1 hora con suero normal de la especie en la que se obtuvo el anticuerpo secundario. Existen algunas diferencias en el protocolo utilizado según los anticuerpos:  Para los anticuerpos primarios anti-EPs, el suero (Ref. S-2000, Vector Laboratories) se disolvía al 20% en PBS.  Para los anticuerpos primarios anti-COX-1 y anti-COX-2 se seguían las instrucciones de dilución del kit Vectastain ABC para anticuerpos primarios hechos en ratón (PK-4002, Vector Laboratories).  Para los marcadores de macrófagos perivasculares CD163/ED2 y de macrófagos pulmonares VPM32 se seguían las instrucciones de dilución del kit Vectastain ABC Universal (PK-6200, Vector Laboratories). Posteriormente, el suero se decantaba y el corte se incubaba con la solución del anticuerpo primario correspondiente durante toda la noche a 4 ºC. En la Tabla 3.11 se indican el tipo de anticuerpo utilizado (mono o policlonal), la especie animal de la que se obtuvo, el origen de la proteína inmunogénica, la dilución empleada y la casa comercial de la que se adquirió cada uno de ellos. Los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS con suero normal y Triton X-100 al 1%. Material y Métodos 81 Ac Tipo Origen del Ac Origen de la proteína inmunogénica Dilución Casa comercial EP1 Pc Conejo Humano 1:3.000 CC (101740) EP2 Pc Conejo Humano 1:6.000 (GI); 1:3.000 (H, BR) CC (101750) EP3 Pc Conejo Humano 1:6.000 (GI); 1:3.000 (H, BR) CC (101760) EP4 Pc Conejo Humano 1:3.000 CC (101775) COX-1 Mc Ratón Oveja 1:50 (BR); 1:100 (H); 1:200 (Híg, P) CC (160110) COX-2 Mc Ratón Rata 1:25 (H, BR); 1:200 (Híg, P) BD (610204) COX-2 Mc Conejo Rata Listo para uso Master Diagnóstica (MAD-000335QD-3) VPM32 Mc Ratón Oveja 1:10 Lab. Dr. NJ Watt * CD163/ED2 Pc Conejo Humano 1:500 Abgent (AP7330a) 2ario anti conejo --- --- --- Instrucciones del kit. Vectastain ABC kit Elite PK-6200 Universal. 2ario anti ratón --- --- --- Instrucciones del kit. Vectastain ABC Peroxidase Mouse IgG PK-4002. Tabla 3.11. - Anticuerpos utilizados en los estudios de IHC. Ac: anticuerpo. 2ario: Secundario. Pc: policlonal. Mc: monoclonal. GI: gastrointestinal. H: hipotálamo. Híg: hígado BR: bulbo raquídeo. CC: Cayman Chemical. BD: BD Biosciences. *: Anticuerpo procedente del laboratorio del Dr. NJ Watt (Department of Veterinary Pathology, Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, UK). Todos los anticuerpos primarios utilizados en IHC reconocieron en el WB a la proteína ovina correspondiente. Además, para comprobar la especificidad de todos los anticuerpos utilizados en la IHC se realizaron experimentos de control negativo. Para ello, los cortes se incubaban durante toda la noche a 4 ºC omitiendo el anticuerpo primario. Al día siguiente, en todos los cortes, independientemente de si se les había añadido o no el anticuerpo primario, se decantaba la solución de incubación y se hacían 3 lavados de 5 minutos en PBS en agitación constante. Posteriormente, los tejidos se dejaban en contacto con una solución con el anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo (EPs) o anti-ratón (COX-1, COX-2), siguiendo las instrucciones de los kits respectivos (Tabla 3.11). La unión específica del anticuerpo secundario biotinilado con el anticuerpo primario introducía moléculas de biotina en la zona donde se encontraba el antígeno buscado. Material y Métodos 82 Tras 3 lavados de 5 minutos en PBS, se incubaban los cortes, durante 1 hora con el reactivo ABC (Avidin Biotinylated enzyme Complex) contenido en los kits y evitando el contacto con la luz. Este complejo se unía al anticuerpo secundario, gracias a la gran afinidad entre las biotinas de éste y la avidina del complejo ABC. Tras este paso se realizaban 3 lavados de 5 minutos con PBS en agitación. El siguiente paso consistía en la adición de la diaminobenzidina (DAB, Vector Laboratories), sustrato de la enzima peroxidasa del complejo ABC, lo que provocaba una reacción de oxidación que teñía de marrón las zonas donde se encontraba el complejo ABC. La solución se preparaba inmediatamente antes de su uso siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Se ponía en contacto con las muestras y la intensidad de la reacción se controlaba mediante su visualización al microcopio. Transcurrido el tiempo suficiente, los portaobjetos se lavaban con agua destilada durante 5 minutos y posteriormente se dejaban en PBS otros 5 minutos. Para obtener un buen contraste, los tejidos se teñían con hematoxilina de Carazzi durante 5 minutos, lavándose posteriormente en agua destilada otros 5 minutos. Una vez teñidas las preparaciones, los portaobjetos se deshidrataban mediante el pasaje de los mismos por soluciones de alcohol de graduación creciente terminando en el HistoClear, en secuencia contraria a lo indicado en la Tabla 3.10. Después se pasaban por el HistoClear y se montaban colocando un cubreobjetos sobre los cortes utilizando como medio de montaje la resina sintética DPX. Transcurridos unos días se tomaban fotografías con una cámara fotográfica (Nikon Digital Sight) acoplada a un microscopio óptico (Nikon Eclipse E200) a través del software Nis Elements F 3.0 (Nikon). 3.5.1 DOBLE INMUNOHISTOQUÍMICA Para determinar si uno de los tipos celulares con inmunorreactividad frente a COX-1 y COX-2 se trataba de macrófagos, recurrimos a la técnica del doble inmunomarcaje, utilizando para ello el marcador de macrófagos perivasculares CD163/ED2 en hipotálamo, bulbo raquídeo e hígado o el marcador de macrófagos ovinos VPM32 en pulmón. Para la visualización de ambos antígenos recurrimos al empleo de la técnica del ABC, pero el revelado se basó en un cromógeno distinto en cada caso. Inicialmente, se realizó una primera IHC utilizando el anticuerpo anti-CD163 o VPM32. Se siguieron los pasos descritos en el apartado anterior, hasta el revelado con la DAB. Posteriormente, los portaobjetos no se montaron sino que, seguidamente, se procedió a realizar un bloqueo de la actividad avidina. Este paso evitaba las posibles uniones libres que le queden a la avidina conjugada con el enzima revelador del complejo ABC. Para ello, los cortes se incubaron con una solución de biotina al 0,01% (Sigma, Madrid) en PBS con 0,3% de Triton X-100 durante 30 minutos. Material y Métodos 83 Tras esto, se realizaban 3 lavados de 5 minutos en agitación con PBS. Seguidamente, los cortes se incubaban con el anticuerpo primario frente a la COX-1 o COX-2. Tras finalizar esta incubación, las secciones fueron lavadas en agitación 3 veces durante 2 minutos con un tampón fosfato (PB, 0,01M pH 6,8). Posteriormente, los portaobjetos se incubaron durante 10 minutos en una solución de trabajo compuesta por dicloruro de benzidina (BDHC) 0,01% (Sigma) y nitroprusiato sódico 0,025% (Sigma). La función del BDHC es la de colorante y es similar a la DAB. El nitroprusiato sódico libera óxido nítrico, el cual participa en la reacción. Transcurrido este tiempo de incubación se adicionaba H2O2 al 0,016%, lo que constituye el sustrato de la peroxidasa, y se visualizaban los inmunocomplejos. El producto de esta reacción se visualiza con un color gris azulado y cristalino. Tanto el color como la forma del producto, se distinguen fácilmente del color rojizo-marrón procedente de la reacción con la DAB. Para finalizar, las secciones fueron lavadas 3 veces durante 2 minutos con tampón PB y se procedió al montaje de las mismas, tal y como se ha explicado anteriormente. Para llevar a cabo la identificación del tipo de células que expresaban la COX-1 en el pulmón, recurrimos al uso de cortes consecutivos en lugar de realizar la codetección de ambos antígenos sobre un mismo corte histológico. Esto es debido a que los anticuerpos disponibles, tanto el anti-COX-1 como el VPM32, habían sido obtenidos en ratón lo que impedía hacer la colocalización. 3.6 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Para estudiar la electromiografía durante las fases del MMC control, los datos de actividad mioeléctrica integrada de cada fase del MMC se expresaron como porcentaje con respecto a la media obtenida durante las fases II. Tras la administración de un agente, se cuantificó la media de la actividad mioeléctrica integrada en cada periodo de 60 minutos excluyendo del análisis las fases III. Estos valores se expresaron como porcentaje relativo a la media del periodo control de 5 horas, en el cual se tomó de forma conjunta la actividad de las fases I y II del MMC. Finalmente se calculó la media ± el error estándar de cada periodo analizado en los animales utilizados. Los datos de temperatura corporal se tomaron cada 20 segundos y se expresaron como la diferencia con la media del periodo control. Para comparar el efecto de los tratamientos en la temperatura corporal y la actividad mioeléctrica integrada, se tomó la media de los datos obtenidos entre los minutos 60 y 180 tras la administración del agente. Los datos de frecuencia de MMC se refieren a la media de todo el efecto del agente. Material y Métodos 84 Para simplificar la presentación de los resultados, salvo que se indique lo contrario, los datos de actividad mioeléctrica integrada corresponden a los grupos de electrodos situados en el saco dorsal del rumen, antro abomasal a 5 cm del píloro, duodeno a 50 cm del píloro y yeyuno a 2 m del ligamento de Treitz. En los estudios de WB, cada dato procedente de la cuantificación se expresó en porcentaje con respecto a los animales control. Los datos fueron sometidos a un análisis de la varianza (ANOVA) y posteriormente se analizaron las diferencias entre los distintos periodos o tratamientos con un test de Scheffé, considerándose estadísticamente significativas las diferencias cuando el nivel de significación (p) era menor a 0,05. En las tablas y gráficas, el nivel de significación se ha representado con los siguientes símbolos: *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 (con respecto a la administración de solución salina) y †P<0,05, ‡P<0,01 y §P<0,001 (con respecto a la inyección de LPS en ausencia de gadolinio, tiloxapol o del antagonista EP correspondiente). Salvo que se indique lo contrario, en los estudios in vivo, los resultados se expresan para un tamaño de muestra de 5 animales. Para los estudios de IHC y WB se utilizaron 3 animales por tratamiento. Para el WB, se repitieron las determinaciones en cada muestra un mínimo de 3 veces. Para la IHC, se realizaron 3 cortes de cada una de las muestras. 4.- RESULTADOS Resultados 87 4.1 EFECTO DEL CLORHEXAHIDRATO DE GADOLINIO (III) Y DEL TILOXAPOL SOBRE LAS ALTERACIONES INDUCIDAS POR EL LPS 4.1.1 MOTILIDAD GASTROINTESTINAL (GI) DE LA OVEJA EN PERIODO CONTROL La actividad mioeléctrica del intestino delgado se estructura en ciclos denominados complejos mioeléctricos migratorios (MMC), que se repetían aproximadamente cada 2 horas y no se interrumpían por la ingestión de alimento. Cada MMC está compuesto de tres fases. La fase I (o fase de inactividad), que es un periodo de unos 10-15 minutos en los cuales no se producía ninguna salva de potencial. Le seguía la fase II (o fase de actividad irregular), en la cual aparecían salvas de potencial de manera aleatoria sobre algunas ondas lentas. Esta fase ocupaba la mayor parte del MMC (unas 2 horas) y era seguida por la fase III (o fase de actividad regular), que es la más característica del MMC. Esta se iniciaba en el duodeno y consistía en un periodo de unos 3 minutos durante los cuales se desencadenaban salvas de potencial sobre todas las ondas lentas, aumentando la actividad integrada entre un 200-300 % con respecto a la fase II. Esta fase III (y por tanto todo el MMC) migraba en sentido caudal por todo el duodeno y el yeyuno a una velocidad de 50-60 cm/min. Tras ella aparecía una nueva fase I y comenzaba un nuevo ciclo. La actividad mioeléctrica del antro abomasal presentaba salvas de potencial en la mayoría de las ondas lentas, con una frecuencia de 6-9 contracciones/minuto. No obstante este patrón motor fluctuaba al mismo ritmo que el MMC intestinal, ya que mientras se observaban las fase III y I en el duodeno, la actividad mioeléctrica del antro gástrico disminuía un 50-60 %. La temperatura intraperitoneal no se modificó de forma significativa durante los periodos control, siendo la media de 38,78 ± 0,07 ºC. 4.1.2 EFECTOS DEL LPS SOBRE LA TEMPERATURA CORPORAL Y LA MOTILIDAD GI EN LA OVEJA La administración intravenosa (iv) de 0,1 µg/kg de LPS de E. coli producía un aumento de la tª corporal que se iniciaba hacia los 45 minutos de la inyección y permanecía elevada durante 5-7 horas. El desarrollo de la fiebre seguía una curva bifásica (Fig. 4.1.2.1), con dos picos, uno de aproximadamente 1 ºC a los 60-90 minutos del LPS y otro de 1,5-2,5 ºC hacia las 4 horas de la inyección. Resultados 94 COX-1 Control β-Actina 70 kDa Hipotálamo 4h1h LPS Control Bulbo raquídeo 4h1h LPS β-Actina 70 kDa % sobre el control Hipotálamo Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Bulbo raquídeo % sobre el control Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Figura 4.2.2 - Expresión de la COX-1 en homogenados de hipotálamo y bulbo raquídeo de ovejas control o tratadas con LPS durante 1 ó 4 horas. El WB mostró una banda de 70 kDa. La β-actina se utilizó como control de carga en cada calle. La cuantificación de las bandas se expresa como porcentaje respecto de los animales control. COX-1 Hipotálamo Bulbo raquídeo Control 100 % 100 % LPS 1h 103,36 ± 4,21 % 108,32 ± 7,69 % LPS 4h 92,58 ± 7,68 % 96,75 ± 3,67 % Tabla 4.2.1 - Efecto del tratamiento con LPS sobre la expresión de la COX-1 en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja. La cuantificación de las bandas de los animales tratados con LPS se expresa como porcentaje respecto de los animales control (100%). Resultados 95 COX-2 Control Hipotálamo 4h1h LPS Control positivo β-Actina 72 kDa Control Bulbo raquídeo 4h1h LPS β-Actina 72 kDa % sobre el control Hipotálamo Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Bulbo raquídeo % sobre el control Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Figura 4.2.3 - Expresión de la COX-2 en homogenados de hipotálamo y bulbo raquídeo de ovejas control o tratadas con LPS durante 1 ó 4 horas. El WB mostró una banda de 72 kDa. La β-actina se utilizó como control de carga en cada calle. La cuantificación de las bandas se expresa como porcentaje respecto de los animales control. COX-2 Hipotálamo Bulbo raquídeo Control 100 % 100 % LPS 1h 95,32 ± 4,97 % 113,37 ± 10,35 % LPS 4h 90,23 ± 9,17 % 95,78 ± 5,50 % Tabla 4.2.2 - Efecto del tratamiento con LPS sobre la expresión de la COX-2 en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja. La cuantificación de las bandas de los animales tratados con LPS se expresa como porcentaje respecto de los animales control (100%). Resultados 96 Estudios previos de IHC realizados en nuestro laboratorio con el mismo Ac empleado en este trabajo, ya habían identificado la expresión de la COX-2 en endotelios y neuronas del hipotálamo (Castro, 2010). En el presente trabajo hemos ampliado el estudio al bulbo raquídeo. En cortes histológicos de hipotálamo y bulbo raquídeo de animales control, mediante la técnica de IHC, se determinó la expresión de las dos COX en endotelios vasculares (Fig. 4.2.6 A). La COX-2 se expresó en ciertas neuronas del hipotálamo y del bulbo raquídeo (Fig. 4.2.6 B). En el bulbo raquídeo, las neuronas teñidas estaban dispersas, mientras que en el hipotálamo eran especialmente abundantes en determinadas zonas, como se verá en el apartado 4.4. Además, la COX-1 también se expresó en unos gránulos pequeños presentes en torno a núcleos de células cuyo citoplasma no se observó teñido. Además, se localizó en el citoplasma de unas pequeñas células redondas próximas a los vasos sanguíneos, que en algunos casos llegaban a estar localizadas dentro de la propia pared (Fig. 4.2.4 A y B. Fig. 4.2.5 A y B). Resultados 97 Hipotálamo y Bulbo raquídeo COX-1 COX-2 Control LPS Control LPS 1 h 4 h 1 h 4 h Endotelios vasculares X X X X X X Neuronas ---- ---- ---- X ↑ ↑↑ Gránulos en torno a núcleos celulares X X X ---- ---- ---- Células redondeadas próximas a vasos sanguíneos X X X ---- ↑ ↑↑ Células redondeadas en el parénquima ---- ---- ---- ---- ↑ ↑↑ Tabla 4.2.3 - Resumen de la localización de la COX-1 y la COX-2 en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja. X: expresión de la proteína. ↑: aumento en la expresión de la proteína tras el tratamiento con LPS durante 1 h. ↑↑: aumento mayor en la expresión de la proteína tras el tratamiento con LPS durante 4 h. Resultados 98 50 µm 50 µm 50 µm Hipotálamo AB C CD E F VV V LPS 1h LPS 4h 50 µm 50 µm 50 µm V 10 µm 10 µm Control COX-1 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm Hipotálamo AB C CD E F VV V LPS 1h LPS 4h 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm V 10 µm 10 µm Control COX-1 Figura 4.2.4 - Localización de la COX-1 en el hipotálamo de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). El LPS no indujo cambios en la expresión de la COX-1. A y B: Tinción en gránulos relacionados con núcleos celulares (puntas de flechas amarillas). C: Tinción de un endotelio vascular (puntas de flechas rojas). D, E y F: Células redondeadas localizadas cerca de los vasos sanguíneos (flechas amarillas). V: vaso sanguíneo. Resultados 99 50 µm50 µm Bulbo raquídeo AB 10 µm 10 µm V Control 50 µm C 10 µm 50 µm D 10 µm V 50 µm E 10 µm 50 µm F 10 µm V LPS 4h LPS 1h COX-1 50 µm50 µm50 µm50 µm Bulbo raquídeo AB 10 µm 10 µm V Control 50 µm50 µm C 10 µm 50 µm50 µm D 10 µm V 50 µm50 µm E 10 µm 50 µm50 µm F 10 µm V LPS 4h LPS 1h COX-1 Figura 4.2.5 - Localización de la COX-1 en el bulbo raquídeo de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). El LPS no indujo cambios en la expresión de COX-1. A, C y E: Tinción en gránulos redondeados relacionados con núcleos celulares (puntas de flechas amarillas). B, D y F: Tinción de células redondeadas localizadas cerca de los vasos sanguíneos (flechas amarillas). V: vaso sanguíneo. Resultados 100 AB Bulbo raquídeo 50 µm 50 µm V Control 50 µm50 µm CD V 10 µm 10 µm V 50 µm E V 20 µm 50 µm F 10 µm 10 µm LPS 4h LPS 1h COX-2 AB Bulbo raquídeo 50 µm50 µm 50 µm50 µm V Control 50 µm50 µm50 µm50 µm CD V 10 µm 10 µm V 50 µm50 µm E V 20 µm 50 µm50 µm F 10 µm 10 µm LPS 4h LPS 1h COX-2 Figura 4.2.6 - Localización de la COX-2 en el bulbo raquídeo de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). A: Tinción de un endotelio vascular. B: Tinción de neuronas. C-F: Tras el tratamiento con LPS, se observa la aparición de células redondeadas con el citoplasma intensamente teñido, cercanas a los vasos sanguíneos o incluidas dentro de la pared vascular (flechas amarillas), así como distribuidas por el parénquima (puntas de flechas amarillas). Resultados 101 4.3 EFECTO DEL LPS SOBRE LA EXPRESIÓN DE LA COX-1 Y LA COX2 EN EL HIPOTÁLAMO Y BULBO RAQUÍDEO DE LA OVEJA Las técnicas de WB e IHC mostraron que el LPS no modificó la expresión de la COX-1 en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja (Figs. 4.2.2 y 4.2.4, Tablas 4.2.1 y 4.2.5). Sin embargo, en el caso de la COX-2, mediante la técnica de IHC se observó, tras el tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas, la aparición de unas pequeñas células redondeadas con el citoplasma intensamente teñido (Fig. 4.2.6 C-F). Estas células eran muy similares a las descritas para la COX-1 en tejidos control y también estaban localizadas próximas o integradas en la pared de vasos sanguíneos, pero también aparecía este tipo celular repartido por el parénquima. Por el contrario, este aumento en la expresión de COX-2 no se apreció mediante WB (Fig. 4.2.3 y Tabla 4.2.2). 4.4 IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS PRODUCTORAS DE COX EN EL HIPOTÁLAMO Y BULBO RAQUÍDEO DE LA OVEJA Con la finalidad de determinar la identidad de las células pequeñas redondeadas que expresaban la COX-1 en control y la COX-2 tras el tratamiento con LPS, recurrimos a la técnica de la doble IHC. Esta técnica permite detectar la coexpresión de dos o más proteínas. Ya que los macrófagos son la primera línea de defensa ante estímulos patógenos, quisimos estudiar si las células que expresaban las COX podrían ser macrófagos. Así, valoramos la expresión de las COX junto con el marcador de macrófagos perivasculares CD163/ED2. Los experimentos se realizaron con los mismos anticuerpos frente a la COX-1 y la COX-2 utilizados anteriormente y además un anticuerpo policlonal hecho en conejo frente a la región N-terminal del receptor CD163 humano (Ref. AP7330a, Abgent). Cuando los cortes histológicos de hipotálamo y bulbo raquídeo de animales control se incubaron con el marcador de macrófagos perivasculares CD163/ED2, se observó tinción en unos gránulos presentes en torno a núcleos celulares (Fig. 4.4.3 G) similares a los descritos en la Fig. 4.2.4 A y B y Fig. 4.2.5 A, C y E. Además, también se marcaron unas células redondas con su citoplasma intensamente teñido, unas próximas a vasos sanguíneos (Fig. 4.4.2 A y D) y otras distribuidas por el parénquima (Fig. 4.4.6 C), también similares a las descritas en la Fig. 4.2.4 D, E y F; Fig. 4.2.5 B, D y F y Fig. 4.2.6 C-F. Posteriormente, estos mismos cortes marcados con el anticuerpo CD163/ED2 también fueron incubados con el anticuerpo anti-COX-1 ó con el antiCOX-2. Resultados 102 En los animales control, los pequeños gránulos presentes en torno a núcleos celulares así como las células redondas próximas a vasos sanguíneos coexpresaban el marcador CD163/ED2 y la COX-1 (Fig. 4.4.1), sugiriendo que eran células inmunitarias de tipo macrófago. Las células dispersas por el parénquima positivas a CD163/ED2 no coexpresaron COX-1, tal como se observó en la IHC de la COX-1. El tratamiento con LPS no modificó la expresión de los marcadores CD163/ED2 y COX-1. En animales control no se observó coexpresión de COX-2 en los macrófagos marcados con el CD163/ED2. Sin embargo, el tratamiento con LPS a 1 y 4 horas aumentó el número de las células redondas positivas a CD163/ED2 próximas a vasos sanguíneos y repartidas por el parénquima. Además, el LPS indujo coexpresión de COX-2 en estas células (Fig. 4.4.2 y 4.4.3). Tras determinar que es la COX-2 la que cambia su expresión en el sistema nervioso central de la oveja tras el tratamiento con LPS, decidimos estudiar en qué núcleos del hipotálamo se modificó dicha expresión. En los animales control, la COX-2 se localizó en los endotelios vasculares de las secciones hipotalámicas a nivel del área preóptica, en la zona de los núcleos paraventricular y anterior, y en la zona de los núcleos dorso y ventromedial (Fig. 4.4.4 B, D y F; Fig. 4.4.6 B y Fig. 4.4.7 C). La COX-2 también se expresó en neuronas del área preóptica medial y de los núcleos paraventricular y ventromedial (Fig. 4.4.4 A, C y E; Fig. 4.4.5 B; Fig. 4.4.6 A, D y G, y Fig. 4.4.7 A, D y G). En todas las áreas hipotalámicas, el tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas, provocó un aumento en el número de células positivas al marcador CD163/ED2 y además inducía la coexpresión de la COX-2. Estas células estaban localizadas en relación a vasos sanguíneos y también repartidas por el parénquima (Fig. 4.4.4 D, E y F; Fig. 4.4.5 C-F; Fig. 4.4.6 F, H e I y Fig. 4.4.7 E, F, H e I). Eran especialmente abundantes en la zona del órgano vasculoso de la lámina terminal (OVLT) (Fig. 4.4.5) y en el núcleo preóptico medial, pero en este último caso sólo en los animales tratados durante 4 h (Fig. 4.4.4). El LPS no modificó la expresión de la COX-2 en las neuronas del núcleo preóptico. Sin embargo, 1 hora tras el LPS se observó un aumento en el número de neuronas positivas a COX-2 en los núcleos paraventricular y ventromedial, aumentando todavía más este número a las 4 horas del LPS (Fig. 4.4.6 A, D y G y Fig. 4.4.7 A, D y G). Resultados 103 Además, el tratamiento con LPS indujo la expresión de la COX-2 en unas células grandes con largas prolongaciones citoplasmáticas presentes en todas las zonas estudiadas del hipotálamo. Esta expresión apareció 1 h tras el LPS, mientras que no se detectó a las 4 h de la endotoxina (Fig. 4.4.4 C; Fig. 4.4.6 E y F y Fig. 4.4.7 E). 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm Hipotálamo AB CD E V V 50 µm F Bulbo raquídeo 50 µm V 10 µm 10 µm 10 µm 5 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-1 + CD163/ED2 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm 50 µm50 µm Hipotálamo AB CD E V V 50 µm50 µm F Bulbo raquídeo 50 µm50 µm V 10 µm 10 µm 10 µm 5 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-1 + CD163/ED2 Figura 4.4.1 - Coexpresión de la COX-1 (tinción gris oscuro) y del marcador de macrófagos perivasculares CD163/ED2 (tinción marrón) en el hipotálamo y bulbo raquídeo de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). Como se ha indicado anteriormente, el LPS no modificó el patrón de expresión de COX-1. Gránulos celulares (puntas de flechas amarillas) y células relacionadas con vasos sanguíneos (flechas amarillas) positivas a CD163/ED2 y coexpresando la COX-1. V: vaso sanguíneo. Resultados 110 4.5 EXPRESIÓN DE LA COX-1 Y LA COX-2 EN TEJIDOS PERIFÉRICOS (HÍGADO Y PULMÓN) DE LA OVEJA Con el objetivo de verificar si las prostaglandinas implicadas en el inicio de los efectos del LPS podrían proceder de órganos periféricos, decidimos estudiar la expresión y localización de la COX-1 y la COX-2 en el hígado y pulmón de la oveja mediante estudios de WB e IHC. Los experimentos se realizaron con los mismos anticuerpos utilizados anteriormente. Mediante la técnica de WB, se determinó la expresión de COX-1 y COX-2 en homogenados de hígado y pulmón de ovejas control. Las bandas obtenidas tenían el mismo tamaño previsto para las COX de oveja (70 y 72 kDa para COX-1 y COX-2, respectivamente) y aparecieron a la misma altura que las bandas de los controles positivos comerciales anteriormente mencionados (Figs.4.5.1 y 4.5.2). COX-1 Control Pulmón 4h1h LPS Control positivo β-Actina 70 kDa Control Hígado 4h1h LPS β-Actina 70 kDa Hígado % sobre el control Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 % sobre el control Pulmón Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Figura 4.5.1 - Expresión de la COX-1 en homogenados de hígado y pulmón de ovejas control o tratadas con LPS durante 1 ó 4 horas. El WB mostró una banda de 70 kDa. La β-actina se utilizó como control de carga en cada calle. La cuantificación de las bandas se expresa como porcentaje respecto de los animales control. Resultados 111 COX-1 Hígado Pulmón Control 100 % 100 % LPS 1h 106,98 ± 6,45 % 90,07 ± 8,59 % LPS 4h 92,95 ± 7,89 % 108,03 ± 6,83 % Tabla 4.5.1 - Efecto del tratamiento con LPS sobre la expresión de la COX-1 en el hígado y pulmón de la oveja. La cuantificación de las bandas de los animales tratados con LPS se expresa como porcentaje respecto de los animales control (100%). COX-2 Control Pulmón 4h1h LPS Control positivo β-Actina 72 kDa Control Hígado 4h1h LPS β-Actina 72 kDa Hígado % sobre el control Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 200 250 % sobre el control Pulmón Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 200 250 Figura 4.5.2 - Expresión de la COX-2 en homogenados de hígado y pulmón de ovejas control o tratadas con LPS durante 1 ó 4 horas. El WB mostró una banda de 72 kDa. La β-actina se utilizó como control de carga en cada calle. La cuantificación de las bandas se expresa como porcentaje respecto de los animales control. *P < 0,05 y ***P < 0,001 con respecto al control. †P < 0,05 con respecto a LPS 1h. Resultados 112 COX-2 Hígado Pulmón Control 100 % 100 % LPS 1h 146,44 ± 12,88 % (p < 0,05 vs. control) 94,65 ± 6,41 % LPS 4h 193,08 ± 17,09 % (p < 0,001 vs. control) (p < 0,05 vs. LPS 1h) 89,56 ± 7,35 % Tabla 4.5.2 - Efecto del tratamiento con LPS sobre la expresión de la COX-2 en el hígado y pulmón de la oveja. La cuantificación de las bandas de los animales tratados con LPS se expresa como porcentaje respecto de los animales control (100%). Mediante la técnica de IHC, se detectó la expresión de las dos COX en endotelios vasculares de hígado y pulmón (Fig. 4.5.3 A; Fig. 4.5.4 C y Fig. 4.5.5 A). A nivel hepático, las dos COX se expresaron en unas células redondeadas próximas a vasos sanguíneos de los espacios porta (Fig. 4.5.3 E y F, y Fig. 4.5.4 B). También se localizaron en algunas células con largas prolongaciones situadas en los espacios sinusoidales, cuya morfología era comparable con células de Kupffer (Fig. 4.5.3 C y D y Fig. 4.5.4 A, C, D, E y F). Sin embargo, los hepatocitos no expresaron la COX-1 ni la COX-2. Intercaladas en el epitelio de los conductos biliares se observaron unas células que presentaban una morfología a modo de lágrima con su citoplasma intensamente teñido con el anticuerpo frente a la COX-1, pero no expresaban la COX-2 (Fig. 4.5.3 B). Estas células tenían una morfología comparable a células de tipo endocrino. A nivel pulmonar, las dos COX se expresaron en unas células intercaladas en el epitelio de los bronquios y bronquiolos, con su citoplasma intensamente teñido y con una morfología a modo de lágrima, comparables a células de tipo endocrino (Fig. 4.5.5 B y Fig. 4.5.6 A). Además, se observaban algunas células redondeadas aisladas y localizadas en relación a sacos alveolares que eran positivas a COX-2, pero no mostraban expresión de la COX-1 (Fig. 4.5.6 B). Resultados 113 Hígado COX-1 COX-2 Control LPS Control LPS 1 h 4 h 1 h 4 h Endotelios vasculares X X X X X X Células con morfología de tipo endocrino en el epitelio de conductos biliares X X X ---- ---- ---- Células redondas próximas a vasos sanguíneos X X X X ↑ ↑↑ Células con largas prolongaciones (céls. de Kupffer) en los sinusoides hepáticos X X X X ↑ ↑↑ Pulmón COX-1 COX-2 Control LPS Control LPS 1 h 4 h 1 h 4 h Endotelios vasculares X X X X X X Células con morfología de tipo ndocrino en el epitelio de bronquios X X X X X X Grupos de células redondeadas próximos a vasos sanguíneos X ↑ ↑↑ X ↑ ↑↑ Células redondeadas aisladas por el parénquima ---- ---- ---- X ↑ ↑↑ Tabla 4.5.3 - Resumen de la localización de la COX-1 y la COX-2 en el hígado y pulmón de la oveja. X: expresión de la proteína. ↑: aumento en la expresión de la proteína tras el tratamiento con LPS durante 1 h. ↑↑: aumento mayor en la expresión de la proteína tras el tratamiento con LPS durante 4 h. Resultados 114 AB Hígado 50 µm 50 µm VCB C 50 µm V 50 µm D V 25 µm E 50 µm V 50 µm F V 25 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-1 AB Hígado 50 µm50 µm 50 µm50 µm VCB C 50 µm50 µm V 50 µm50 µm D V 25 µm E 50 µm50 µm V 50 µm50 µm F V 25 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-1 Figura 4.5.3 - Localización de la COX-1 en el hígado de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). El LPS no modificó la expresión descrita en los animales control. La COX-1 se expresó en endotelios vasculares (puntas de flechas rojas en A) y en células intercaladas en el epitelio de conductos biliares (flechas rojas en B). Además, se localizó en células de largas prolongaciones localizadas en los espacios sinusoidales (puntas de flechas amarillas en C y D) y en células de morfología redondeada localizadas próximas a vasos sanguíneos en los espacios porta (flechas amarillas en C, E y F). CB: conducto biliar. V: vaso sanguíneo. Resultados 115 50 µm 50 µm Hígado AB V V 50 µm 10 µm C 50 µm V D 50 µm E V F 50 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-2 50 µm50 µm 50 µm50 µm Hígado AB V V 50 µm 10 µm C 50 µm50 µm V D 50 µm50 µm E V F 50 µm50 µm Control LPS 4h LPS 1h COX-2 Figura 4.5.4 - Localización de la COX-2 en el hígado de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). La COX-2 se expresó en endotelios vasculares (puntas de flechas rojas en C), en células de largas prolongaciones localizadas en los espacios sinusoidales (puntas de flechas amarillas en A, C, D, E y F) y en células de morfología redondeada situadas próximas a vasos sanguíneos (flechas amarillas en B, C y E). V: vaso sanguíneo. Resultados 116 A Pulmón 50 µm 50 µm V B A B C 50 µm VB 50 µm D B E 50 µm V B F 50 µm VB Control LPS 4h LPS 1h COX-1 A Pulmón 50 µm50 µm 50 µm50 µm V B A B C 50 µm50 µm VB 50 µm D B E 50 µm50 µm V B F 50 µm50 µm VB Control LPS 4h LPS 1h COX-1 Figura 4.5.5 - Localización de la COX-1 en el pulmón de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). La COX-1 se expresó en endotelios vasculares (puntas de flechas rojas en A) y en unas células intercaladas en el epitelio de bronquiolos con morfología a modo de lágrima (flechas amarillas en B). El tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas indujo la expresión de COX-1 en grupos celulares situados próximos a vasos sanguíneos (puntas de flechas amarillas en C-F). V: vaso sanguíneo. A: alvéolo. B: bronquio. Resultados 117 50 µm Pulmón 50 µm B A B 10 µm A 50 µm C A A V E A V 50 µm F V 50 µm 50 µm DB V Control LPS 4h LPS 1h COX-2 50 µm50 µm Pulmón 50 µm50 µm B A B 10 µm A 50 µm50 µm C A A V E A V 50 µm50 µm F V 50 µm50 µm 50 µm50 µm DB V Control LPS 4h LPS 1h COX-2 Figura 4.5.6 - Localización de la COX-2 en el pulmón de ovejas control (A y B) y tratadas con LPS durante 1 hora (C y D) ó 4 horas (E y F). La COX-2 se expresó en unas células intercaladas en el epitelio de bronquiolos con morfología a modo de lágrima (flechas amarillas en A) y en algunas células redondeadas aisladas en el parénquima pulmonar (puntas de flechas amarillas en B). El tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas aumentó la cantidad de células positivas a COX-2 en el parénquima pulmonar, localizándose próximas a vasos sanguíneos (puntas de flechas amarillas en C-F). V: vaso sanguíneo. A: alvéolo. B: bronquio Resultados 118 4.6 EFECTO DEL LPS SOBRE LA EXPRESIÓN DE LA COX-1 Y LA COX2 EN LOS TEJIDOS PERIFÉRICOS (HÍGADO Y PULMÓN) DE LA OVEJA En el hígado, mediante las técnicas de WB e IHC, se comprobó que el tratamiento con LPS no indujo cambios en la expresión de la COX-1 (Fig. 4.5.1; Fig. 4.5.3 y Tabla 4.5.1). Sin embargo, ambas técnicas mostraron que el LPS aumenta la expresión de la COX-2 en el hígado. Concretamente, el WB reveló un aumento en la intensidad de la banda 1 y 4 horas después de la inyección de LPS, hasta valores de 135,5% (p<0,01) y 181,69% (p<0,001) frente al control respectivamente (Fig. 4.5.2 y Tabla 4.5.2). Por su parte, mediante IHC, se comprobó que estos aumentos en la expresión de la COX-2 se debían a un aumento en el número de las células redondeadas cercanas a vasos sanguíneos y en las células con largas prolongaciones (con morfología de células de Kupffer) ya descritas en el control (Fig. 4.5.4 C, D, E, F). Además, y en concordancia con la técnica de WB, se observó un mayor número de células positivas a COX-2 a las 4 horas que a 1 hora tras el LPS (Fig. 4.5.4 E y F). Sin embargo, el LPS no modificó la expresión de la COX-2 en endotelios vasculares. En el pulmón, mediante la técnica de IHC hemos observado que las células redondeadas positivas a COX-2 que en el control estaban aisladas por el parénquima, tras el tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas aumentaban en número. Además, aparecían numerosos grupos próximos a los vasos sanguíneos de estas células redondeadas positivas a COX-2 (Fig. 4.5.5 y Fig. 4.5.6). Además, todas estas células redondeadas expresaban COX-1 tras la administración de LPS, algo que no se observaba en el control. El WB no mostró ninguna variación en la expresión de ambas COX en el pulmón a pesar del aumento observado en IHC (Figs. 4.5.1 y 4.5.2; Tablas 4.5.1 y 4.5.2). El LPS no modificó la expresión del resto de los tipos celulares observados en el pulmón. 4.7 IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS PRODUCTORAS DE COX EN LOS TEJIDOS PERIFÉRICOS (HÍGADO Y PULMÓN) DE LA OVEJA Con la finalidad de determinar la identidad de las células productoras de COX en el hígado y pulmón, recurrimos a la técnica de la doble IHC. Ya que los macrófagos son la primera línea de defensa ante estímulos patógenos, y dado que la inyección de LPS se realiza por vía periférica, quisimos comprobar la posibilidad de que las células que producen COX-1 y COX-2 como respuesta a la Resultados 119 endotoxina, fueran dicho tipo celular. Así, estudiamos la expresión de las COX junto con un marcador de macrófagos. En el hígado utilizamos el anticuerpo CD163/ED2 anteriormente mencionado en hipotálamo y bulbo raquídeo. En cambio, en el pulmón utilizamos un anticuerpo monoclonal hecho en ratón frente al receptor CD11 de macrófagos pulmonares ovinos (VPM32) (procedente del laboratorio del Dr. NJ Watt). Cuando los cortes histológicos de hígado de animales control se incubaron con el marcador de macrófagos perivasculares CD163/ED2, se observó tinción en unas células redondeadas próximas a vasos sanguíneos (4.7.2 A y D) y en unas células con largas prolongaciones localizadas en los sinusoides hepáticos (4.7.2 G). Los dos tipos de células eran similares a las células que expresaban la COX-1 y la COX-2 en ovejas control y en las que el LPS aumentaba la expresión de COX-2. Cuando estos mismos cortes se incubaron con el anticuerpo anti-COX-1 y con el anti-COX-2, se observó que las células que expresaban el marcador de macrófagos CD163/ED2 descritas anteriormente, coexpresaban tanto la COX-1 como la COX-2 (Figs. 4.7.1 y 4.7.2). En el pulmón, se realizaron cortes histológicos consecutivos, de los cuales uno se incubó con el anticuerpo anti-COX-1 y el otro con el marcador de macrófagos pulmonares ovinos VPM32. Ambos anticuerpos teñían las células redondeadas reunidas en grupos próximos a vasos sanguíneos que se observaban tras la administración de LPS (Fig. 4.7.3). Por su parte, cuando los cortes histológicos de pulmón se incubaron con los anticuerpos anti-COX-2 y el marcador de macrófagos VPM32, se observó que las células en las que aumentaba la expresión de COX-2 tras el tratamiento con LPS durante 1 ó 4 horas, coexpresaban el marcador de macrófagos VPM32 (Fig. 4.7.4). Resultados 126 0 25 50 75 100 125 Rumen Antro Duodeno Yeyuno Control Sulprostona 0,4 icv Sulprostona 2 icv Sulprostona 2 iv ***** ** * * ** * * Actividad EMG integrada (%) Control Sulprostona 0,4 icv Sulprostona 2 icv Sulprostona 2 iv 0 50 100 150 MMC * * * * Tiempo (min) Control Sulprostona 0,4 icv Sulprostona 2 icv Sulprostona 2 iv -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Temperatura * * * * * Δ Temperatura (ºC) Figura 4.8.1.2 - Efecto de la administración icv de sulprostona sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. * P<0,05, ** P<0,01 y *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). 4.8.2 EFECTO DEL AGONISTA EP1 17-FENIL TRINOR PGE2 La administración icv de 17-fenil trinor PGE2 etil amida (agonista del receptor EP1 y en menor medida del receptor EP3) a las dosis de 2 y 8 nmoles/kg reprodujo la respuesta inducida por la sulprostona sobre el comportamiento, apareciendo los mismos signos de nerviosismo descritos anteriormente para la sulprostona. La dosis de 2 nmoles/kg no alteró la temperatura corporal ni la motilidad GI. Sin embargo, la administración de 8 nmoles/kg produjo un aumento monofásico de la temperatura corporal de unos 0,5 ºC que sólo duraba aproximadamente una hora. Resultados 127 También provocaba una inhibición de la motilidad gastrointestinal e inducía la aparición de un frente de actividad duodenal que se propagaba al yeyuno. Sin embargo no modificó la frecuencia de fases III (Figura 4.8.2.1, Tabla 4.8.2.1). El 17-fenil trinor PGE2 iv a la dosis de 8 nmoles/kg no produjo ningún tipo de alteración sobre el comportamiento, la temperatura corporal o la motilidad GI. Control 17-Fenil PGE2 2 icv 17-Fenil PGE2 8 icv 17-Fenil PGE2 8 iv 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Temperatura * * * Δ Temperatura (ºC) Control 17-Fenil PGE2 2 icv 17-Fenil PGE2 8 icv 17-Fenil PGE2 8 iv 0 50 100 150 MMC Tiempo (min) Figura 4.8.2.1 - Efecto de la administración icv de 17-fenil trinor PGE2 etil amida sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). Resultados 128 17-fenil trinor PGE2 etil amida (nmoles/kg, icv) 8 ∆Tª máximo (ºC) 0,54 ± 0,04 *** Inicio ∆Tª (min) 228,00 ± 20,75 Duración ∆Tª (h) 0,67 ± 0,07 Inicio en antro (min) 38,25 ± 7,32 Duración antro (h) 93,86 ± 18,21 1ª fase III (min) 57,07 ± 17,04 Tabla 4.8.2.1 - Efecto de la administración icv de 17-fenil trinor PGE2 etil amida sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). 4.8.3 EFECTO DEL AGONISTA EP2 BUTAPROST La administración de butaprost (agonista del receptor EP2) por vía icv a las dosis de 2, 4 y 8 nmoles/kg o por vía iv a la dosis de 8 nmoles/kg no modificó la temperatura corporal ni la motilidad GI (Figura 4.8.3.1). Tampoco provocó la sintomatología nerviosa observada con el17-fenil trinor PGE2 etil amida y con la sulprostona. Resultados 129 0 25 50 75 100 125 150 Rumen Antro Duodeno Yeyuno Control Butaprost 2 icv Butaprost 8 icv Butaprost 8 iv Actividad EMG integrada (%) Control Butaprost 2 icv Butaprost 8 icv Butaprost 8 iv 0 50 100 150 MMC Tiempo (min) Control Butaprost 2 icv Butaprost 8 icv Butaprost 8 iv 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Temperatura Δ Temperatura (ºC) Figura 4.8.3.1 - Efecto de la administración icv de 17-fenil trinor PGE2 etil amida sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). 4.8.4 EFECTO DEL AGONISTA EP4 L-902,688 La administración de L-902,688 (agonista del receptor EP4) por vía icv a las dosis de 0,4 y 2 nmoles/kg producía un aumento de la temperatura corporal de manera dosisdependiente, experimentando una subida rápida y aguda, y siguiendo una curva monofásica (Tabla 4.8.4.1). Al igual que el butaprost, no se observó sintomatología nerviosa. El L-902.688 icv indujo alteraciones sobre la motilidad GI (Figura 4.8.4.1, Tabla 4.8.4.1) similares a las observadas con el LPS iv. Así, se observó un descenso dosisdependiente en la actividad mioeléctrica. Además, la administración de todas estas dosis Resultados 130 producía la aparición de un frente de actividad duodenal que se propagaba al yeyuno, quedando aumentada la frecuencia de fases III durante varias horas. El L-902,688 iv a la dosis de 2 nmoles/kg no produjo ningún tipo de alteración sobre la temperatura ni la motilidad GI. 0 25 50 75 100 125 Rumen Antro Duodeno Yeyuno Control L-902.688 0,4 icv L-902.688 2 icv L-902.688 2 icv * ** * * ** * * * ** * * * * Actividad EMG integrada (%) Control L-902.688 0,4 icv L-902.688 2 icv L-902.688 2 iv 0 50 100 150 MMC * * * Tiempo (min) Control L-902.688 0,4 icv L-902.688 2 icv L-902.688 2 iv 0.0 0.5 1.0 1.5 Temperatura * * * * * * Δ Temperatura (ºC) Figura 4.8.4.1 - Efecto de la administración icv de L-902.688 sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. * P<0,05, ** P<0,01 y *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). Resultados 131 L-902,688 (nmoles/kg, icv) 0.4 2 ∆Tª máximo (ºC) 0,87 ± 0,11 *** 1,43 ± 0,22 *** Inicio ∆Tª (min) 46,20 ± 10,28 25,00 ± 4,09 Duración ∆Tª (h) 6,87 ± 0,29 14,41 ± 1,90 Inicio en antro (min) 46,00 ± 10,91 64,33 ± 7,50 Duración antro (h) 244,28 ± 42,01 373,18 ± 70,58 1ª fase III (min) 53,40 ± 10,42 8,20 ± 1,16 Duración fase III (h) 171,00 ± 29,96 384,40 ± 47,64 Tabla 4.8.4.1 - Efecto de la administración icv de L-902,688 sobre la temperatura corporal y la motilidad gastrointestinal. *** P<0,001 sobre el control (administración del solvente). Resultados 132 4.9 EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA PGE2 (EPs) EN EL HIPOTÁLAMO Y BULBO RAQUÍDEO DE LA OVEJA Se realizaron estudios de WB e IHC para detectar la expresión y localización de los receptores de la PGE2 (EP1, EP2, EP3 y EP4) en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja. Los experimentos se realizaron con Acs policlonales hechos en conejo frente al extremo C-terminal de los receptores EP1, EP2, EP3 y EP4 humanos (Refs. 101740, 101750, 101760 y 101750 respectivamente, Cayman Chemical) y validados previamente mediante WB en tejidos ovinos (Schmitz y cols., 2006). Se utilizó un homogenado de riñón de oveja como control positivo, dado que la expresión de los receptores EPs de la PGE2 ha sido ampliamente determinada en dicho tejido (Breyer and Breyer, 2000; Williams y cols. 2004; Breyer y cols., 1993; Breyer y cols., 1996; Watabe y cols., 1993). Los Acs empleados en este estudio revelaron la presencia de bandas de 56, 67, 62 y 64 kDa en las calles del control positivo y de las muestras estudiadas. Estos tamaños coinciden con los previstos para las proteínas EP1, EP2, EP3 y EP4 ovinas, respectivamente. Como se esperar, al incubar los tejidos omitiendo los Acs primarios, no se observaron bandas específicas (Fig. 4.9.1). 67 kDa EP 2 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 62 kDa EP 3 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 64 kDa EP 4 Ri Ru A D H Ru A D H Control - EP 1 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 56 kDa 67 kDa67 kDa EP 2 Ri Ru A D H Ru A D H Control -EP 2 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 62 kDa62 kDa EP 3 Ri Ru A D H Ru A D H Control -EP 3 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 64 kDa64 kDa EP 4 Ri Ru A D H Ru A D H Control -EP 4 Ri Ru A D H Ru A D H Control - EP 1 Ri Ru A D H Ru A D H Control -EP 1 Ri Ru A D H Ru A D H Control - 56 kDa56 kDa Figura 4.9.1 - Expresión de los receptores EPs en homogenados de riñón (Ri), rumen (Ru), antro (A), duodeno (D) e hipotálamo (H) de ovejas control. El WB mostró unas bandas de 56, 67, 62 y 64 kDa correspondiendo a los receptores EP1, EP2, EP3 y EP4 respectivamente. La omisión del anticuerpo primario produjo la desaparición de dichas bandas (Control -). Resultados 133 Para analizar la especificidad de la tinción en la IHC, se realizaron experimentos incubando cortes histológicos consecutivos con el Ac primario o sin él (control negativo). A diferencia de los cortes incubados con los Acs primarios, en los controles negativos no se observó tinción específica frente a los receptores EP (Fig. 4.9.2). Resultados 134 50 µm 50 µm AB MC MC ML ML CD MM 50 µm 50 µm EF 50 µm 50 µm ML MC ML MC 50 µm G M 50 µm H M 50 µm 50 µm AB MC MC ML ML 50 µm50 µm 50 µm50 µm AB MC MC ML ML CD MM 50 µm 50 µm CD MM 50 µm50 µm 50 µm50 µm EF 50 µm50 µm 50 µm50 µm ML MC ML MC 50 µm50 µm G M 50 µm H M 50 µm50 µm H M Figura 4.9.2 - Cortes de duodeno de ovejas control incubados con los anticuerpos primarios frente a los receptores EP1 (B), EP2 (D), EP3 (F) y EP4 (H) y sin ellos (A, C, E y G respectivamente) para comprobar la especificidad de los mismos. Resultados 135 Mediante la técnica de WB, se detectó la expresión de los receptores EP1, EP2, EP3 y EP4 en homogenados de hipotálamo y bulbo raquídeo de ovejas control (Fig. 4.9.3 a 4.9.6 y Tabla 4.9.1). Por otra parte, en estos tejidos y mediante la técnica de IHC, se inmunolocalizaron en neuronas, cuyo citoplasma se observó intensamente teñido (Figs. 4.9.7 a 4.9.10). Las neuronas que se observaban teñidas para los distintos receptores EPs no tenían ninguna distribución específica, sino que se encontraban como neuronas aisladas repartidas de forma uniforme por todo el parénquima hipotalámico y del bulbo raquídeo (Figs. 4.9.7 a 4.9.10). Las técnicas de WB e IHC no mostraron cambios en la expresión de los receptores EPs en el hipotálamo y bulbo raquídeo de la oveja tras el tratamiento con LPS (Figs. 4.9.3 a 4.9.10 y Tabla 4.9.1). EP 1 Control β-Actina 56 kDa 4h1h LPS Control Bulbo raquídeo 4h1h LPS β-Actina 56 kDa % sobre el control Hipotálamo Bulbo raquídeo % sobre el control Hipotálamo Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Control LPS 1h LPS 4h 0 50 100 150 Figura 4.9.3 - Expresión del receptor EP1 en homogenados de hipotálamo y bulbo raquídeo de ovejas control o tratadas con LPS durante 1 ó 4 horas. El WB mostró una banda de 56 kDa. El tratamiento con LPS no indujo cambios en la expresión del receptor. La β-actina se utilizó como control de carga en cada calle. La cuantificación de las bandas se expresa como porcentaje respecto de los animales control.