Biosíntesis y caracterización de biopolímeros recombinantes para aplicaciones biomédicas

1 FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos. Biosíntesis y caracterización de biopolímeros recombinantes para aplicaciones biomédicas Autor/a: Estela Aparicio Peñacoba Tutor/es/as: Francisco Javier Arias y Alessandra Girotti 2022/2023 2 AGRADECIMIENTOS Con este apartado quiero agradecer a todas aquellas personas que me han ayudado y apoyado a lo largo de toda la realización del presente trabajo de investigación. En primer lugar a mi familia y amigos por apoyarme tanto en los buenos como en los malos momentos, acompañándome en todo momento y viéndome crecer, tanto personal como profesionalmente. En segundo lugar, a mi compañero Jonathan, por llevarme en todo momento de la mano y ayudarme durante todo el trayecto. Por último, a mis tutores Javier y Alessandra, por la ayuda recibida en la realización del presente trabajo. Además, agradecer al equipo de Procereal, RMN y DLS del LTI por prestarnos sus equipos para poder realizar el trabajo. Todo esfuerzo tiene su recompensa, y esta es la mía. 3 ÍNDICE 1. RESUMEN ...................................................................................................................................... 5 2. INTRODUCCIÓN. ............................................................................................................................ 6 2.1. PROTEÍNAS ............................................................................................................................. 6 2.1.1. Elastina ........................................................................................................................... 7 2.1.2. Polímeros tipo elastina (ELP) .......................................................................................... 8 2.2. POLÍMERO (KI)2 .................................................................................................................... 10 2.3. POLÍMERO (EI)2 .................................................................................................................... 11 3. OBJETIVOS. .................................................................................................................................. 13 4. MATERIALES Y MÉTODOS. .......................................................................................................... 14 4.1. MATERIALES. ........................................................................................................................ 14 4.1.1. Reactivos químicos ....................................................................................................... 14 4.1.2. Disoluciones tamponadas ............................................................................................ 14 4.1.3. Cepa bacteriana ............................................................................................................ 15 4.1.4. Medios de cultivo y suplementos ................................................................................ 15 4.2. MÉTODOS. ........................................................................................................................... 16 4.2.1. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida ................................................... 16 4.2.2. Selección de la colonia más productora (Screening) ................................................... 17 4.2.3. Producción de biopolímeros recombinantes.11............................................................ 18 4.2.4. Purificación de biopolímeros recombinantes. ............................................................. 20 4.2.5. Cromatografía de exclusión por tamaños .................................................................... 22 4.2.6. Caracterización biopolímeros recombinantes. ............................................................ 22 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ........................................................................................................ 24 5.1. Producción del biopolímero recombinante (KI)2 ................................................................. 24 4 5.2. Purificación del biopolímero recombinante (KI)2. ............................................................... 28 5.3. Producción del biopolímero recombinante (EI)2 ................................................................. 33 5.4. Purificación de biopolímero recombinante (EI)2 ................................................................. 35 5.5. Caracterización del biopolímero recombinante (EI)2 .......................................................... 38 5.5.1. Espectrometría de masas (MALDI-TOF) ....................................................................... 38 5.5.2. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) .......................................... 39 5.5.3. Espectrocopía DLS (Dynamic Light Scattering) ............................................................. 40 6. CONCLUSIONES. .......................................................................................................................... 45 7. BIBLIOGRAFÍA. ............................................................................................................................. 46 5 1. RESUMEN La elastina es una proteína fibrosa presente en la matriz extracelular de los vertebrados caracterizada por sus propiedades de elasticidad y resistencia a la fatiga. Por medio de ingeniería genética se han diseñado un polímero similar a la elastina (ELP) con múltiples funciones en el campo de la Biomedicina. En este trabajo experimental se han bioproducido y purificado los polímeros tipo elastina (KI)2 y (EI)2. Además, el polímero (EI)2 se ha caracterizado físico-químicamente mediante técnicas como electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de exclusión por tamaños, espectrometría de masa MALDI-TOF, Espectroscopía de Resonancia magnética nuclear (RMN) y Espectroscopía DLS (Dynamic Light Scattering). ABSTRACT Elastin is a fibrous protein present in the extracellular matrix of vertebrates characterized by its elasticity and fatigue resistance properties. By means of genetic engineering, an elastinlike polymer (ELP) with multiple functions in the field of biomedicine has been designed. In this experimental work, elastin-like polymers (KI)2 and (EI)2 have been bioproduced and purified. In addition, the (EI)2 polymer has been physico-chemically characterized by techniques such as polyacrylamide gel electrophoresis, size exclusion chromatography, MALDI-TOF mass spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Spectroscopy Dynamic Light Scattering (DLS). 6 2. INTRODUCCIÓN. 2.1. PROTEÍNAS Las proteínas son un tipo de biomoléculas constituidas por monómeros, los aminoácidos, unidos por medio de un enlace peptídico1. Este enlace surge de la reacción de deshidratación entre un grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del siguiente (Figura 1). Estos enlaces amida poseen características que lo aproximan más a un doble enlace debido a la estabilización del enlace C-N, lo que da lugar a la rotación del mismo. Figura 1: Reacción de formación de un enlace petídico.1 Las proteínas presentan cuatro niveles de organización estructural en función de su complejidad (estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria).1, 2 Las proteínas se clasifican en dos grandes grupos: holoproteínas o proteínas simples (formadas únicamente por aminoácidos); y, heteroproteínas o proteínas conjugadas (formadas por una parte proteica y una no proteica, el grupo prostético). 7 En este trabajo se va a centrar en las proteínas simples o holoproteínas Estas pueden ser globulares o fibrosas. Las proteínas globulares presentan una estructura terciaria plegada y compacta dando una forma más o menos esférica. Con esto, los presentes grupos hidrofílicos quedan hacia fuera de la estructura, haciendo que las proteínas de este tipo sean mayoritariamente soluble. Además, presentan múltiple función como enzimática, moléculas transportadoras, de defensas, receptores... Por el contrario, las proteínas fibrosas presentan una estructura secundaria extendida y repetitiva de cadena larga; son menos solubles que las anteriores; y, presentan funciones bio-mecánicas, estructurales o de soporte y movimiento. 3 y 4 2.1.1. Elastina La elastina es un tipo de proteína fibrosa que se encuentra en los tejidos de los vertebrados como componente de la matriz extracelular, debido a sus propiedades mecánicas (elasticidad, resistencia a la fatiga, durabilidad y capacidad de autoensamblaje).5 La estructura de la fibra de elastina se forma a partir del entrecruzamiento de entre las lisinas de su monómero precursor, la tropoelastina (compuesto por aproximadamente un 90% de aminoácidos hidrofóbicos)5 y 6. Contiene numerosos bloques repetidos entre los que destaca el (VPGVG)n , que le dota de sus propiedades elásticas. Una de las características más importantes de la elastina es la transición inversa con la temperatura. Esta propiedad se caracteriza por un cambio de conformación de la elastina a una determinada temperatura, denominada temperatura de transición. Debido a la gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos presentes en su estructura, por encima de la temperatura de transición, la elastina se compacta en una estructura esférica ordenada, siendo insoluble en medio acuoso; y, por debajo de la temperatura de transición, la elastina adopta una estructura extendida desordenada, siendo soluble en medio acuoso.7 8 2.1.2. Polímeros tipo elastina (ELP) Los polímeros tipo elastina son un tipo de biomaterial artificial que consta de repeticiones cortas que se encuentran en la estructura de la elastina 8, conservando sus propiedades mecánicas, su biocompatibilidad y autoensamblaje.9 Una de las características de estos polímeros es la biocompatibilidad en múltiples aplicaciones (en este caso, y de interés en el grupo de investigación, como vehículo de fármacos para el cáncer). Su estructura se basa en secuencias repetitivas tipo (VPGXG)n, donde X (podría ser cualquier aminoácido, excepto la prolina) va a variar en función del polímero y modulará la temperatura de transición de los mismos. Estos ELP se pueden diseñar genéticamente controlando su composición de aminoácidos y sus propiedades.9 Al igual que la elastina, los ELP también se caracterizan por su temperatura de transición, alcanzando un estado agregado a temperaturas por encima de su temperatura de transición, causa de una disminución de la entropía; y, una conformación extendida a temperaturas menores de su temperatura de transición, debido a un aumento en la entropía. Este hecho es destacable puesto que en la mayoría de las proteínas ocurre a la inversa.10 9 Figura 2: Representación de las cadenas extendida desordenada y plegada ordenada de los polímeros tipo elastina.10 16 4.2. MÉTODOS. 4.2.1. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida La electroforesis se basa en un método de separación y caracterización de diferentes moléculas por aplicación de un campo eléctrico. En este trabajo se ha utilizado la electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS), es decir SDS-PAGE, para la separación de proteínas en función de su densidad de carga (relación carga / masa). Para ello el gel se prepara siguiendo básicamente el protocolo para sistemas discontinuos, descrito por Laemmli. El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria; y además va a proporcionar una carga negativa por cada dos residuos de aminoácidos, induciendo un movimiento simultáneo de las proteínas por la presencia del campo eléctrico aplicado. Así, las proteínas se van a separar únicamente en función de su peso molecular. Asimismo, el gel consta de dos partes: un gel separador, que separa las proteínas en función de su masa molecular; y un gel concentrador (en la parte superior del gel) en menor proporción, que alinea la proteínas en una fina banda que entra al mismo tiempo y velocidad en el gel separador. El gel separador se prepara en una concentración de acrilamida 10% (w/v) debido al peso molecular de ambos polímeros Una vez preparado el gel, se preparan las muestras a analizar, incubándolas durante 5 minutos a 100 ⁰C en tampón de carga de electroforesis en condiciones reductoras. Este tampón se encarga de eliminar las conformaciones de las proteínas; permitir el seguimiento del frente de la electroforesis conteniendo un trazante, el azul de bromofenol; y además contiene detergente SDS, proporcionando carga negativa a las proteínas y dirigiendo su movimiento hacia el polo opuesto por la corriente eléctrica aplicada. Preparadas las muestras, se aplican 5 µL en los pocillos del gel, y se emplea un aparato “MiniVE vertical electrophoresis system” de Hoefer para la electroforesis con una intensidad de corriente de 25 mA durante unos 90 minutos a temperatura ambiente. Además de las muestras a ensayar, se aplican una mezcla comercial de marcadores de masa molecular conocida, con la finalidad de comparar el peso molecular de las proteínas. 17 Finalizada la electroforesis, se tiñe el gel con una disolución de cloruro de cobre 0,3 M durante 6 minutos en un agitador basculante (Galileo) a temperatura ambiente, y, posteriormente se lava con agua destilada. Las bandas se observan empleando el programa Gel DocTM Imager, en el que se usa un transiluminador de luz blanca. Además se ha probado la tinción de BlueSafe GelCodeTM, para los geles de (KI)2, con la finalidad de obtener un mayor contraste y mejor visualización de las bandas. (Figura 5) Para ello se lava el gel en agua ultrapura durante dos minutos y se tiñe durante 40 minutos en agitación constante, al igual que la tinción con cloruro de cobre. Finalmente se destiñe en agua ultrapura durante una hora y se analiza con el programa Gel DocTM Imager. Figura 5: Comparación de diferentes tinciones utilizadas para distinguir el biopolímeros respecto a las proteínas bacterianas. En la imagen A muestra de (EI)2 y (KI)2 respectivamente, con tinción Biotium One-Step Blue Protein Gel Stain. En la imagen B, muestra de (EI)2 y (KI)2 con tinción BlueSafe GelCodeTM Fisher. En la última imagen, C, muestra de (EI)2 y (KI)2 con tinción BlueSafe NZYtech 4.2.2. Selección de la colonia más productora (Screening) Se ha proporcionado, por el grupo de investigación, los clones de las bacterias productoras E.coli BLR (DE3) que contienen en su interior el plásmido que produce la proteína de interés, en este caso, (KI)2 o (EI)2. Se siembra en un placa Petri LB-Agar (con glucosa y el antibiótico correspondiente, en este caso ampicilina para ambos polímeros) el clon de la bacteria con un sutil rayado de la placa, y, se almacena en la incubadora estática a 37⁰C durante aproximadamente 16 horas. La placa A B C 18 tiene que disponerse boca abajo, para que la condensación que se pueda producir no interfiera en el crecimiento de las colonias, y, además, se debe tapar con papel aluminio debido a que el mismo resiste cambios de temperatura y humedad, y, lo más importante, permite el paso de oxígeno para el crecimiento de bacterias. Una vez se observe el crecimiento de las colonias, se seleccionan 8 colonias bien aisladas y se analiza la calidad de la expresión del polímero recombinante en la fracción proteica total. Para eso tras la producción en medio líquido de inducción TB complementado con ampicilina a 37⁰C con agitación orbital de 250 rpm, durante aproximadamente 16 horas, se toma una muestra de 1mL. Las bacterias se por centrifugación a 12000xg durante 1 minuto, el sedimento se resuspende en 1mL de agua ultrapura y se repite la centrifugación suspendiendo el precipitado en tampón de carga de electroforesis. Finalmente, las muestras se hierven 2 minutos, y se realiza una electroforesis de las proteínas totales expresadas por cada colonia en gel de poliacrilamida A partir de la selección de la colonia más productora, da comienzo el proceso de bioproducción. 4.2.3. Producción de biopolímeros recombinantes.11 La biosíntesis de los biopolímeros recombinantes (KI)2 y (EI)2 proceden de la misma manera detallado a continuación. Comienza con la preparación del preinóculo, que consiste en el cultivo de la colonia más productora, seleccionada en el proceso 4.2.2, en 5 mL de LB complementado con ampicilina y glucosa. Una vez cultivado, se incuba a 37 ⁰C y con agitación orbital de 250 rpm durante toda la noche (18 horas, durante ese tiempo se alcanza una masa suficiente de células bacterianas). El día siguiente se prepara el inóculo transfiriendo 100 µL del preinóculo a 30 mL de LB suplementados con ampicilina y glucosa en dos matraces Erlenmeyer estériles que se incuban durante aproximadamente 5 horas a 37 ⁰C y en agitación de 250 rpm. De esta forma se asegura que el inóculo este en una fase de crecimiento exponencial, condición necesaria 19 para la bioproducción del polímero recombinante a mayor escala. Para ello, se toman Flask estériles de dos litros necesarios para producir 6 litros (en total 15 Flask). El volumen de medio en los Erlenmeyers no debe superar el 20-25% de su capacidad para favorecer una buena oxigenación del cultivo mediante la agitación. Se le añaden a cada uno de ellos 400 mL de medio de cultivo TB/LB suplementado con ampicilina, en proporción 2/3 TB y 1/3 LB para un balance de expresión génica adecuado y, 4 mL de inóculo. Se cultivan los matraces a 37 ⁰C y 250 rpm durante al menos 16 horas. Transcurrido este tiempo, se toman muestras en períodos de 30 minutos para realizar un seguimiento del crecimiento bacteriano por turbidimetría. Se analiza su absorbancia a 600 nm, con dilución 1:10 de agua ultrapura, utilizando el medio de cultivo como blanco de la medida. Si se observa que la absorbancia no varía, el crecimiento celular se encontrará en etapa estacionaria, o disminuye (decrecimiento celular) se detiene la producción incubándola en hielo. La composición de la fracción proteica total de las muestras tomadas durante la producción se analiza por electroforesis para asegurar el rendimiento de la producción. Una vez terminada la producción, se procede al lavado de células para que el medio de cultivo no contamine el polímero final. Para ello se transfiere el contenido de los flask en botes de centrífuga de 1 L, y se sedimentan las células centrifugando durante 15 minutos a 1700 xg a 4 ⁰C. Posteriormente se decanta el sobrenadante y se añade tampón de lavado (aproximadamente 100 mL/L de cultivo). Se resuspende el cultivo sedimentado y se pasan a botes de centrífuga de 250 mL. Acto seguido se somete a una centrifugación durante 15 minutos a 1700 xg y 4⁰C. Se repite el proceso hasta que en el sobrenadante no queden trazas del medio de cultivo (observación de sobrenadante prácticamente incoloro). Para finalizar el proceso de producción, se procede a la ruptura celular. Las bacterias se lisan mediante sonicación, el cultivo sedimentado tras su resuspención en Buffer de sonicación junto con PMSF (un inhibidor de proteasas), y, clorhidrato de benzamidina hidratado. Se realiza un proceso de sonicación durante 15 minutos para favorecer la ruptura de las membranas de las células, y así, liberar el polímero de interés. Se utiliza el equipo, aportado por el grupo Procereal, Hielscher UP400St, en condiciones de amplitud máxima del 100% y 20 ciclos con pulsos de 10 segundos cada 10 segundos, durante los 15 minutos, a una temperatura de aproximadamente 4⁰C y con agitación constante. Se realiza una centrifugación a 1600 xg durante 15 minutos a 4ºC con la finalidad de recuperar (debido a su mayor peso) en el sedimento las bacterias que no hayan lisado. Esta fracción se vuelve a sonicar para conseguir maximizar la lisis de células. Posteriormente se centrifuga el lisado bacteriano durante 45 minutos a 16000 xg a 4⁰C, para separar el sobrenadante que constituye la fracción soluble total, desde el sedimento, la fracción insoluble total. Se analizan ambos por electroforesis para individuar donde se encuentra mayoritariamente el polímero de interés. 4.2.4. Purificación de biopolímeros recombinantes. 4.2.4.1. Purificación del biopolímero recombinante (KI)2 Finalizado el proceso de producción, se procede a la purificación del mismo. Debido a las dificultades encontradas en el proceso de purificación del biopolímero (KI)2 se han realizado varios experimentos que se detallarán en el apartado de “Resultados y discusión”. 4.2.4.2. Purificación del biopolímero recombinante (EI)2 Tras la sonicación, da comienzo la purificación de la proteína con una serie etapas sucesivas de calentamiento-precipitación y enfriamiento-resuspensión. El sobrenadante de la centrifugación se acidifica hasta un pH 4 manteniendo la muestra en hielo y en agitación para que precipiten proteínas bacterianas ácidas y DNA mientras que la proteína de interés se mantiene soluble. Se retira por centrifugación a 16000 xg, 45 min a 4ºC. Se analiza el sobrenadante y el pellet obtenido por electroforesis en gel de poliacrilamida, para corroborar que la proteína de interés se encuentra en el sobrenadante. El sobrenadante se incuba a 42⁰C durante dos horas con el fin de que el polímero precipite. Se separa el precipitado centrifugando a 25⁰C, 10000g durante 15 minutos. Se comprueba 21 la presencia del biopolímero (EI)2 en el sobrenadante y en el precipitado obtenidos por electroforesis en gel de poliacrilamida para constatar que la proteína (EI)2 está en el pellet. Se resuspende el precipitado en tampón Tris a pH 8,8, 20mM, en agitación a 4⁰C durante 16 horas, para disolver la proteína, gracias a la propiedad de transición inversa con la temperatura. Se centrifuga la disolución a 4⁰C, 18000 xg durante 15 minutos para clarificar la muestra. Al sobrenadante obtenido, se le añade NaCl 1M con la finalidad de que el polímero precipite (debido a la mayor afinidad de la sal por el agua, esta va a interaccionar con la sal dejando libre al polímero y disminuyendo su temperatura de transición). Se calienta durante dos horas a baño maría a 42°C. La resuspensión obtenida se centrifuga a 25⁰C y 10000 xg, durante 15 minutos. El precipitado obtenido se resuspende en 25 mL de agua ultrapura, y se agita a 4⁰C durante 16 horas. Con esto se consigue que la proteína se rehidrate y pase al sobrenadante. Posteriormente se centrifuga de nuevo a 18000 xg, 4⁰C durante 15 minutos. Se vuelve a repetir la etapa de purificación por precipitación con sal y su posterior disolución en agua ultrapura, mencionada anteriormente. Si el polímero ya estuviese lo suficientemente puro (analizado por electroforesis en gel de poliacrilamida) se realiza una diálisis, y finalmente, se liofiliza para obtener la proteína de interés pura. Se recolectaron muestras de todas las etapas realizadas que fueron analizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida. 22 4.2.5. Cromatografía de exclusión por tamaños La cromatografía de exclusión por tamaños es una técnica analítica basada en la separación de componentes en función de su tamaño molecular. Se basa en la separación de los componentes en dos fases: una fase estacionaria (columna) y una fase móvil líquida.12 En la columna se utiliza una matriz porosa que retiene las moléculas más pequeñas, eluyendo primero las moléculas de mayor tamaño molecular al no retenerse en dicha matriz. La elución de dichas moléculas se detecta mediante un detector de absorbancia UV a 210nm. Se ha utilizado una columna preparativa “Superdex 75” de 75 cm de altura y 26 mm de diámetro encamisada. 4.2.6. Caracterización biopolímeros recombinantes. Se han previsto utilizar diferentes técnicas (que se detallarán a continuación) para la caracterización físico-química de los biopolímeros recombinantes. 4.2.6.1. Espectrometría de masas (MALDI-TOF) La espectrometría de masas es una técnica de análisis cualitativo y destructivo para la determinación de átomos e incluso moléculas de mayor tamaño. Se fundamenta en la obtención de iones gaseosos que posteriormente se van a separar en función de su relación masa/carga.13 En este trabajo se va a utilizar la espectroscopía de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) combinada con un analizador por tiempo de vuelo (TOF) El análisis de la muestra se realiza en el Laboratorio de Técnicas instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid, por técnicos de dicho laboratorio. 23 4.2.6.2. Espectroscopía de Resonancia magnética nuclear (RMN) La resonancia magnética nuclear es una técnica analítica basada en las propiedades magnéticas de los núcleos atómicos y se utiliza para determinar la composición y la estructura de las moléculas. En la espectroscopia de RMN, se somete una muestra a un campo magnético y se aplica una secuencia de pulsos de radiofrecuencia. Los núcleos atómicos en la muestra absorben energía y generan señales de sonido magnético. Estas señales se registran y se utilizan para construir un espectro de RMN, que muestra las frecuencias de sonido y las intensidades relativas de los núcleos presentes en la muestra.14 El análisis de la muestra se realiza en el Laboratorio de Técnicas instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid, por técnicos de dicho laboratorio. El laboratorio presenta dos equipos de resonancia de 400 o 500 Hz. En este caso se ha realizado el espectro con el equipo de 500 Hz. Se le aporta una muestra disuelta en agua deuterada, con una concentración final del 10mg/mL., en un tubo de RMN. 4.2.6.3. Espectrocopía DLS (Dynamic Light Scattering) La espectroscopía DLS (Dynamic Light Scattering) es una técnica utilizada para medir el tamaño de partículas en el rango nanométrico. En la espectroscopía DLS, se envía un haz de luz a una muestra líquida y se mide la intensidad de la luz dispersada a diferentes ángulos. A medida que las partículas se mueven en la solución, se producen fluctuaciones en la intensidad de la luz dispersada, lo que permite calcular el tamaño de las partículas. Además, también permite calcular el potencial zeta para detectar la carga superficial que rodea a la partícula. El análisis de la muestra se realiza en el Laboratorio de Técnicas instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid. Para ello, se disuelve la muestra en agua ultrapura en concentración 1 mg/mL, y se mide en una cubeta micro ZEN0040 el tamaño de partícula 24 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. En este trabajo se ha llevado a cabo la bioproducción de dos polímeros proteicos recombinantes: (KI)2 y (EI)2. Así, en este apartado se presentarán e ilustrarán los resultados obtenidos. Se ha partido de las bacterias de expresión que contenían los correspondientes plásmidos codificantes generados anteriormente en el grupo de investigación para producir los diferentes polímeros llevados a cabo en este trabajo. 5.1. Producción del biopolímero recombinante (KI)2 Se han llevado a cabo 3 bioproducciones del biopolímero recombinante (KI)2 cuyo peso molecular teórico es 93,726 kDa. Partiendo del clon de la bacteria proporcionada, se realiza el screening de expresión (apartado 4.2.2.) donde se analizan y comparan los extractos de las proteínas totales del caldo de cultivo de varias colonias para elegir la más productora, es decir, la que en proporción más polímero genera en un determinado tiempo y la que se va a utilizar para la producción del mismo, es la colonia 4. (Figura 6) Para realizar el escalado de la producción (4.2.3) se procede a la producción del preinóculo (a partir de la colonia 4) en medio LB con ampicilina como antibiótico y glucosa 1%. Se utiliza Figura 6: Screening de producción de las colonias analizado en gel de poliacrilamida. A la derecha se observa el marcador Unstained Protein Molecular Weight Marker, y a la izquierda 8 colonias seleccionadas en orden creciente (1-8). En amarillo se marca la colonia más productora, cuya banda correspondiente al biopolímero es proporcionalmente mayor. 1 2 3 4 5 6 7 8 25 ampicilina por que el plásmido de expresión confiere resistencia al antibiótico únicamente a las bacterias que lo contienen; es decir determina una ventaja selectiva a las bacterias productoras. La glucosa favorece el crecimiento de la biomasa (número de las bacterias) hasta su agotamiento en el medio inhibiendo la producción del polímero. Es importante para poder obtener un número elevado de bacterias en el cultivo. Tras haber acabado las fuentes de carbono preferenciales para su metabolismo (glucosa y glicerol), utilizarán la lactosa que determinará el inicio de la producción del biopolímero, y simultáneamente el arresto del crecimiento del cultivo. Se deja incubando durante toda la noche en agitación a 250 rpm y 37⁰C. Se prepara del inóculo partiendo del preinóculo incubándolo durante 5/6 horas a 37ºC en medio con las mismas características. Se escala la producción inoculando 5 L del medio TB/LB y se incuba durante toda la noche (en las mismas condiciones mencionadas anteriormente de temperatura y agitación). La etapa de expresión se finaliza, tras medir las absorbancias cada media hora para realizar un seguimiento de la producción (Tabla 3). 32 A estas muestras se le subió el pH de 7 a 11 para alcanzar el punto isoeléctrico del polímero, que según el programa protpi.ch 15es de 11,9. Con esto se quiere conseguir la precipitación del polímero. Se midió las absorbancias sin observación de cambio alguno, excepto a pH 11 lo que corrobora que se ha alcanzado el punto isoeléctrico y el polímero se encuentra soluble. Finalmente, se calentaron las 5 muestras a 42°C durante 5 minutos, con la finalidad de superar la temperatura de transición del polímero y que ayude a precipitar. Visualmente se observó cierta turbidez en la muestra a pH 11 (señal de precipitación) lo que se corroboró con una disminución en la absorbancia del mismo. Tabla 4: Experimentos para conseguir la precipitación del polímero. ABSORBANCIA a 600 nm Muestra 1 (NaCl 1M) 4⁰C 0,034 pH 7 (4⁰C) 0,001 pH 7 (42⁰C) 0,004 Muestra 2 (NaCl 1M) 4⁰C 0,020 pH 8 (4⁰C) 0,011 pH 8 (42⁰C) 0,005 Muestra 3 (NaCl 1M) 4⁰C 0,013 pH 9 (4⁰C) 0,022 pH 9 (42⁰C) 0,004 Muestra 4 (NaCl 1M) 4⁰C 0,026 pH 10 (4⁰C) 0,010 pH 10 (42⁰C) 0,022 Muestra 5 (NaCl 1M) 4⁰C 0,039 pH 11 (4⁰C) 0,097 pH 11 (42⁰C) 0,042 Se centrifugan las 5 muestras 12000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y se analizan sobrenadante y pellet de cada una por electroforesis en gel de poliacrilamida. (Figura 12) 33 Figura 12: Electroforesis en gel de poliacrilamida. En la primera calle se representa la muestra sin tratar. En la segunda y tercera calle el sobrenadante y pellet a pH 7. En la cuarta y quinta calle, sobrenadante y pellet pH 8. En la sexta calle el Marker; y en la dos última calles de la imagen de la izquierda, sobrenadante y pellet a pH 9. En la imagen de la derecha se representa sobrenadante y pellet a pH 10 y sobrenadante y pellet a pH 11 respectivamente, finalizando con el Marker. Observando la imagen se puede comprobar que no es hasta pH 10 que empieza a precipitar el polímero, consiguiendo una pequeña pero no suficiente, purificación del biopolímero recombinante (KI)2 5.3. Producción del biopolímero recombinante (EI)2 Se ha llevado a cabo una producción del biopolímero recombinante (EI)2 cuyo peso molecular teórico es 93,176 Kda. Partiendo del clon de la bacteria proporcionada, se realiza el screening de expresión (apartado 4.2.2.) al igual que en el polímero (KI)2, donde se observa que la colonia más productora es la colonia 3 aunque todas las colonias mostraron una abundante producción. (Figura 13) 0 Sob Pe Sob Pe MK Sob Pe Sob Pe Sob Pe MK pH7 pH8 pH9 pH10 pH11 34 Figura 13: Screening del clon del plásmido en gel de poliacrilamida. En la quinta columna se observa el marcador Unstained Protein Molecular Weight Marker, a su izquierda las 4 primeras colonias y a la derecha las 4 últimas. En amarillo se marca la colonia más productora (colonia 3). Se ha llevado a cabo la producción del polímero, mediante el uso de un preinóculo y un inóculo, de manera análoga a la producción anterior, y se ha realizado un seguimiento de la producción del mismo por electroforesis en gel de poliacrilamida. (Figura 14) 1 2 3 4 MK 5 6 7 8 93,176 Kda 35 Figura 14: Electroforesis en gel de poliacrilamida para el seguimiento de la producción del polímero (EI)2. En la primera calle se observa el preinóculo, seguida del inóculo y la producción. Por último el Marker. Se realiza el lavado de células y la ruptura de las mismas por sonicación, seguido de la purificación de la misma. 5.4. Purificación de biopolímero recombinante (EI)2 A diferencia de la purificación de (KI)2, en la purificación que se comentará a continuación, se ha seguido un protocolo establecido por investigaciones anteriores en el grupo. Tras el lisado de las células, se baja el pH a 4 para inducir la precipitación de las proteínas ácidas a una temperatura de 4⁰C; con esto se consigue que precipiten proteínas ácidas, mientras que la proteína de interés se mantiene soluble debido a trabajar con una temperatura menor que su temperatura de transición. Se centrifuga a altas revoluciones y se observa por electroforesis en que porción se encuentra en mayor proporción la proteína. (Figura 15) Pre Ino Pro MK 36 Figura 15: Electroforesis en gel de poliacrilamida del sobrenadante y pellet tras la sonicación. En la primera calle se tiene el sobrenadante, seguido del pellet y marker. Como se observa en la figura 13, la proteína de interés se encuentra en mayor proporción en el sobrenadante, por lo que se va a seguir trabajando con él. Atendiendo al apartado 4.2.6, se calienta el sobrenadante dos horas y se centrifuga en caliente durante 15 minutos para que la proteína precipite, debido a superar su temperatura de transición, por lo que por la propiedad de transición inversa con la temperatura, el polímero se encuentra en su forma agregada. (Figura 16) Figura 16: Electroforesis en gel de poliacrilamida. En la primera calle se presenta el sobrenadante, seguida del Marker y el pellet. Sob Pe MK Sob MK Pe 37 Se observa y confirma que el polímero se encuentra en mayor proporción en el pellet. El precipitado se resuspende en tampón Tris-base, dejándose en agitación en frío para solubilizar la proteína y posteriormente centrifugarlo. Al sobrenadante se le añade NaCl y se calienta durante dos horas con la finalidad de que el polímero precipite (lo que se confirma en las dos primeras calles de la Figura 17); se centrifuga y el precipitado se resuspende en agua ultrapura, se agita toda la noche en frío para disolver de nuevo la proteína (lo que se reafirma en las dos últimas calles de la Figura 17). Figura 17: Electroforesis en gel de poliacrilamida del seguimiento de la purificación. Con esto se llega a polímero puro que se ha liofilizado durante 3 o 4 días obteniéndose el biopolímero (EI)2 puro, como se puede observar en la figura. Sob Pe MK Sob Pe 38 Figura 18: Electroforesis en gel de poliacrilamida del biopolímero recombinante (EI)2 puro. En la figura 18 se puede observar que el biopolímero (EI)2 se encuentra lo suficientemente puro y además sufre un retardo electroforético por su naturaleza hidrofóbica debido a que el peso experimental de la electroforesis es de 102,9 kDa. 5.5. Caracterización del biopolímero recombinante (EI)2 5.5.1. Espectrometría de masas (MALDI-TOF) Se ha obtenido el espectro de masas con la finalidad de corroborar el peso molecular del polímero (EI)2. Así, en la figura 18 se puede observar un pico mayoritario promedio de 95415,33 Da correspondiente al peso molecular experimental del polímero. Se ha obtenido por tanto un error del 2,40% respecto a la masa teórica de 93176 Da, que puede ser atribuible al error inherente de la técnica cuando analiza moléculas de tales dimensiones, por lo que puede considerarse un valor adecuado. Además, se puede observar un segundo pico de menor intensidad de 47659 correspondiente probablemente a la segunda ionización del polímero, que presenta aproximadamente la mitad de intensidad que el pico mayoritario, e incluso se podría ver la tercera ionización. 39 Figura 19: Espectro de masas MALDI-TOF del polímero (EI)2 en agua MQ. Con esto se puede corroborar que en la figura 18, el polímero sufre retardo electroforético en la SDS-PAGE por dar un peso molecular superior (102,9 kDa) que el real obtenido en el espectro de masas MALDI-TOF (95415,33 Da). Este retardo electroforético es debido a que el polímero es mayoritariamente hidrofóbico y su movilidad electroforética se ve alterada, como ha podido observarse en otros ensayos publicados. 5.5.2. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) Con objeto de corroborar la composición química del polímero se realizó el análisis por RMN de la disolución del polipéptido. En el espectro de la figura 20, se muestra el espectro de Resonancia Magnética Nuclear de protón del biopolímero (EI)2 a una temperatura de 5°C. Para realizar el espectro se disolvió el polímero en D2O en una concentración de 10 mg/mL. En primer lugar se muestran entre 0,4 y 0,6 ppm los metilos correspondientes a las valinas, isoleucinas y leucinas del polímero. Entre 1,5 y 2,0 ppm se representan señales características de –CH2 de las prolinas (cabe destacar que los hidrógenos son diastereotópicos). Entre 3,3 y 4,3 ppm resuenan las señales de los –CH de la cadena principal 95367 47659 31700 24763 0 200 400 600 800 Intens. [a.u.] 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 m/z 40 de los aminoácidos. Por último, las señales entre 7,3 y 8,4 ppm corresponden a los hidrógenos del grupo amino de cada aminoácido. Figura 20: Espectro de Resonancia Magnética Nuclear 1H. Con todo esto se puede corroborar que el espectro obtenido corresponde al biopolímero (EI)2. 16 5.5.3. Espectrocopía DLS (Dynamic Light Scattering) Se ha medido el tamaño de las partículas resultantes del biopolímero (EI)2 a 4 ⁰C (figura 21) y a 40 ⁰C (figura 22) con la finalidad de observar el cambio de conformación debida al aumento de la temperatura por encima de la temperatura de transición del polímero, que según la bibliografía es de 15 ⁰C para el bloque derivado del aminoácido Isoleucina. Con esto cabría esperar una conformación extendida y desordenada a una temperatura inferior a la temperatura de transición, con un tamaño molecular de partícula; y, una conformación 41 plegada y ordenada al superar los 15 ⁰C, dando un tamaño muy superior de partícula debido a la agregación molecular. Figura 21: Gráfico de la intensidad y el coeficiente de correlación para el polímero (EI)2 a 4 ⁰C. En la figura de la izquierda se representa el porcentaje de cada pico respecto a su tamaño. En la figura de la derecha se representa el coeficiente de correlación respecto al tiempo. Como se puede observar en la figura 21, existe a 4⁰C dos picos correspondientes a las dos conformaciones del biopolímero (EI)2: el primer pico correspondiente a la conformación extendida del polímero con un tamaño de molécula de 5,86 nm; y, un segundo pico correspondiente a la conformación plegada que se está agregando del biopolímero con un tamaño de partícula de 118,40 nm. Además, el gráfico de la derecha nos muestra un coeficiente de correlación de aproximadamente 0,85, lo que indica una buena medición aunque el elevado PDI (Índice de Polidispersidad) de 1,067 es debido a la presencia de ambas estructuras