Efecto del pretratamiento con ultrasonidos en la valorización de fangos aerobios generados en aguas residuales

TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos. “EFECTO DEL PRETETRAMIENTO CON ULTRASONIDOS EN LA VALORIZACIÓN DE FANGOS AEROBIOS GENERADOS EN AGUAS RESIDUALES “ Autora: Ainhoa Moreno Solana Dirigido y tutorizado por: Ángel Alejandro Filipigh / Silvia Bolado Rodríguez Septiembre del 2023 FACULTAD DE CIENCIAS ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 1.1 LA IMPORTANCIA DE LOS FANGOS DE DEPURADORA........................................... 1 1.2 MÉTODOS DE HIDRÓLISIS DE FANGOS ....................................................................... 8 2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 14 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 15 3.1 BIOMASA DE FANGOS AEROBIOS.......................................................................................... 15 3.2 METODOLOGÍA DE HIDRÓLISIS APLICADA A LA BIOMASA .................................................. 16 3.2.1 Pretratamiento con ultrasonidos .............................................................................. 18 3.2.2 Ensayos de hidrolisis alcalina (ALK)....................................................................... 19 3.2.3 Ensayos de hidrólisis térmica (HT) y combinación térmica-alcalina (HT+ALK) 20 3.2.4 Ensayos de hidrólisis biológica: Enzimática (EH) y Autohidrólisis (AH) ............ 21 3.3 CÁLCULOS ......................................................................................................................... 22 3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS ................................................................................................. 23 3.4.1 Sólidos totales, volátiles y cenizas ............................................................................. 23 3.4.2 Análisis de nitrógeno y proteínas ............................................................................. 23 3.4.3 Análisis de carbohidratos ......................................................................................... 24 3.4.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ............................................. 26 3.4.5 Determinación de lípidos y ácidos húmicos ............................................................ 27 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 28 4.1 EFECTO DEL ULTRASONIDOS EN LOS RENDIMIENTOS DE SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y CARBOHIDRATOS. ....................................................................................................................... 28 4.2 EFECTO DEL ULTRASONIDOS EN LOS RENDIMIENTOS DE RECUPERACIÓN DE PEPTIDOS 31 4.2.1 Efecto del ultrasonidos en el tamaño de los péptidos recuperados ....................... 34 4.3 EFECTO DEL ULTRASONIDOS EN LA RECUPERACIÓN DE MONOSACÁRIDOS .... 37 5. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 43 6. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 45 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Distintas fuentes de origen de las aguas residuales ........................................ 1 Figura 2: Generación de fangos primarios, secundarios y terciarios en una planta de tratamiento de aguas residuales ..................................................................................... 2 Figura 3: Concepto de economía circular relacionado con la valorización de residuos y recuperación de recursos a partir de aguas residuales y fangos de depuradora................ 4 Figura 4: Diversos constituyentes de sustancias poliméricas extracelulares en fangos granulares ..................................................................................................................... 7 Figura 5: Representación de los fenómenos de cavitación, colapso y liberación del material celular ............................................................................................................. 9 Figura 6: Desarrollo y colapso de la burbuja de cavitación. ........................................ 10 Figura 7: Proceso de recuperación de componentes valiosos a partir de biomasa de fangos aerobios generada en las EDAR urbanas .......................................................... 13 Figura 8: Biomasa de fangos aerobios (BS) ................................................................ 15 Figura 9: Esquema de las alternativas de hidrólisis estudiadas .................................... 16 Figura 10: Experimentación del proceso secuencial en dos etapas de ultrasonidos seguido de hidrólisis ................................................................................................... 18 Figura 11: Procedimiento experimental bajo condiciones de NaOH. .......................... 19 Figura 12: Experimentación de hidrólisis hidrotérmica (HT) y combinación hidrotérmica+alcalina (HT+ALK) ............................................................................... 20 Figura 13: Experimentación de hidrólisis biológica (autohidrólisis, AH y enzimático, EH) ............................................................................................................................ 21 Figura 14: Esquema y equipo experimental para la determinación de proteínas por el método NKT ............................................................................................................... 23 Figura 15: HPLCUV acoplado a RID (Shimazu LC-2050C). Cromatogramas de los principales monosacáridos presentes en la biomasa BS ............................................... 25 Figura 16: Sistema de electroforesis (SDS-PAGE) para la determinación del tamaño molecular de las proteínas recuperadas ........................................................................ 27 Figura 17: Efecto del ultrasonido en los rendimientos de solubilización (SY, %) de proteínas y carbohidratos. ........................................................................................... 30 Figura 18: Efecto del ultrasonido en el rendimiento de recuperación de péptidos ....... 33 Figura 19: Efecto del ultrasonido en los tamaños de los péptidos recuperados ............ 35 Figura 20: Tamaño de los péptidos recuperados en hidrolisis individual ..................... 36 Figura 21: Efecto del ultrasonido en el rendimiento de recuperación de glucosa. ........ 39 Figura 22: Algunos compuestos de degradación detectados con HPLC-UV. A) Biomasa inicial, B)HT+ALK, C)US-HT+ALK, D) US-AH ....................................................... 42 INDICE DE TABLAS Tabla 1:Diferencias en la composición entre un fango primario y un secundario ........... 8 Tabla 2: Condiciones experimentales de hidrólisis individual y combinada térmico+ alcalino ....................................................................................................................... 17 ABREVIACIONES  AGV: Ácidos orgánicos volátiles  AH: Autohidrólisis  ALK: Hidrólisis alcalina  BS: Biomasa de fangos aerobios  DA: Digestión anaerobia  EDAR: Estación de depurada de aguas residuales  EH: Hidrólisis enzimática  EPS: Sustancias poliméricas extracelulares  HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución  HT: Hidrólisis hidrotérmica  HT+ALC: Hidrólisis termo-alcalina asistida  NKT: Nitrógeno total Kjeldahl  PHA: Polihidroxialcanoatos  RID: Detector de índice de refracción  RY: Rendimientos de recuperación de componentes  SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida  ST: Sólidos totales  SV: Sólidos volátiles  SY: Rendimientos de solubilización de componentes  TSS: Sólidos solubles totales  US: Ultrasonidos  US-AH: Ultrasonidos seguido de autohidrólisis  US-ALK: Ultrasonidos seguido de hidrólisis alcalina  US-EH: Ultrasonidos seguido de hidrólisis enzimática  US-HT: Ultrasonidos seguido de hidrólisis térmica  US-HT+ALK: Ultrasonidos seguido de hidrólisis termo-alcalina  WAS: Fangos activos residuales- Waste activated sludge. RESUMEN La biomasa de fangos generada en las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) es un importante material renovable. A pesar del interés en la utilización de esta biomasa para mejorar la viabilidad económica de las EDAR a través del proceso de digestión anaerobia, son muy escasas las investigaciones dedicas a la valorización fraccionada de sus principales componentes, las proteínas y carbohidratos. En este estudio se evalúo el efecto del empleo de ultrasonidos (US) seguido de hidrólisis alcalina (US-ALK), térmica (US-HT), termo-alcalina (US-HT+ALK) y biológica, enzimática (US-EH) y autohidrólisis (US-AH) en términos de rendimiento de solubilización (SY) y recuperación (RY) de proteínas y carbohidratos. Se realizaron, además, experimentos bajo hidrólisis individual sin pretratamiento en las mismas condiciones (ALK, HT, HT+ALK, EH, AH) para comprobar el efecto del pretratamiento. Los resultados revelaron que el US como método de pretratamiento, en general, permitió incrementar la solubilización y recuperación de estos dos componentes respecto a la hidrólisis individual. La combinación secuencial de ultrasonidos e hidrólisis termoalcalina (US-HT+ALK) a 121ºC permitió altos rendimientos de solubilización (≈92.3%) con pérdidas mínimas (≈17.6%) para ambos componentes. A 50ºC (US-ALK), la solubilización de proteínas aumentó un 28.2%, respecto a la hidrólisis individual (ALK), mientras que los carbohidratos aumentaron un 41% con pérdidas significativas (≈32.7). Se recuperaron péptidos de 70-250 kDa con posibles usos en surfactantes y bio-fertilizantes. Por otro lado, el uso de autohidrólisis como método alternativo a las costosas enzimas comerciales proporcionó rendimientos de solubilización de proteínas de 45% con bajos factores de pérdidas (≈3%). La combinación secuencial de US y autohidrólisis (US-AH) consiguió solubilizar el 68% de las proteínas, pero con elevadas pérdidas (37.9%), y reducidos tamaños de los péptidos recuperados (inferiores a 50 kDa). ABSTRACT The sludge biomass generated in wastewater treatment plants (WWTPs) is an important renewable raw material. Despite the interest in using this biomass to improve the economic viability of WWTPs through anaerobic digestion process, limited research has been devoted to the fractional valorization of its main components, proteins and carbohydrates. In this study, the effect of the use of ultrasound (US) followed by alkaline (US-ALK), thermal (US-HT), thermal-alkaline (US-HT+ALK), biological, enzymatic (US-EH) and autohydrolysis (US-AH) hydrolysis was assessed in terms of solubilization yield (SY) and recovery (RY) of proteins and carbohydrates. In addition, single hydrolysis experiments without pretreatment were performed under the same conditions (ALK, HT, HT+ALK, EH, AH). The effect of pretreatment was also tested. The results showed that US as a pretreatment method, in general, allowed to increase the solubilization and the recovery of these two components with respect to the individual hydrolysis. The sequential combination of US and thermo-alkali hydrolysis (US-HT+ALK) at 121°C allowed allowed high yields (≈92.3%) with minimal losses (≈17.6%) for both components. At 50°C (US-ALK), protein solubilization increased by 28.2%, relative to single hydrolysis (ALK), while carbohydrates increased by 41% with significant losses (≈32.7). Peptides of 70-250 kDa with potential uses in surfactants and bio-fertilizers were recovered. On the other hand, protein solubilization yields of 45% with low loss factors (≈3%) were obtained using autohydrolysis as an alternative to expensive commercial enzymes. The sequential combination of US and autohydrolysis was able to solubilize 68% of the proteins. However, the losses were high (37.9%) and the size of the recovered peptides was reduced (below 50 kDa). Página 6 de 53 Por otro lado, resulta de interés la obtención de péptidos con propiedades tecnofuncionales para aplicaciones industriales como tensioactivos, espumantes o emulsionantes (Lorenzo-Hernando et al., 2019). Para preparar un agente espumante utilizando péptidos extraídos de biomasas residuales, el rendimiento espumante del hidrolizado depende no sólo del contenido de péptidos, sino también del grado de hidrólisis. El factor clave para la formación y la estabilidad de la espuma es controlar el grado de hidrólisis para convertir las proteínas en polipéptidos en lugar de aminoácidos (Gao et al., 2020). También pueden ser aprovechadas en la producción de biofloculantes, compuestos poliméricos extracelulares principalmente constituidos por glicoproteínas, polisacáridos y proteínas, generados por microorganismos durante la secreción y lisis celular (Aljuboori et al., 2013). Dado su carácter biodegradable, estos biofloculantes se han utilizado ampliamente para la eliminación de contaminantes presentes en las aguas residuales, como sólidos suspendidos, contaminantes orgánicos e iones de metales pesados (Aljuboori et al., 2013). El tamaño de los péptidos recuperados a partir de biomasas es un parámetro crítico que desempeñan un papel fundamental en sus propiedades tecno-funcionales. Además, también afecta a las etapas subsiguientes de separación y purificación (Lorenzo-Hernando et al., 2019; Rojo et al., 2021). Por otra parte, la fracción de carbohidratos puede ser recuperada como monosacáridos fermentables para la producción de diferentes productos de valor añadido. Una alternativa a los plásticos derivados del petróleo son los polihidroxialcanoatos (PHAs), que se producen por fermentación bacteriana de carbohidratos y lípidos. Los PHAs producidos por bacterias tienen propiedades similares a las de los plásticos convencional (Balasubramanian & Tyagi, 2017). El uso de fangos de aguas residuales urbanas como materia prima para la producción de bioplásticos podría ser una alternativa sostenible. Por otro lado, se ha informado también de su uso como biocombustibles (Zhang et al., 2018) a partir de la transesterificación de lípidos y grasas o la generación de bio-alcoholes mediante la fermentación de carbohidratos y otros subproductos procedentes de los mismos como los ácidos orgánicos volátiles (AGV) (Sivaramakrishnan & Incharoensakdi, 2018). Página 7 de 53 Figura 4: Diversos constituyentes de sustancias poliméricas extracelulares en fangos granulares (Feng et al., 2009) La mayoría de los estudios, enfocados en mejorar la etapa de hidrólisis en la digestión anaerobia, se centran en la solubilización de la biomasa, en términos de reducción de sólidos totales (ST) o volátiles (SV) incrementando la demanda química de oxígeno de la fracción soluble (DQOS) (Carvajal et al., 2013; Kim et al., 2003; Li et al., 2013; Tian et al., 2016). Estos estudios trabajan con los fangos aerobios debido a su mayor contenido en componentes orgánicos, mayor contenido en nitrógeno y menor contenido en sólidos inorgánicos, grasas y lípidos (Tabla 1). Esta composición facilita el aislamiento, enriquecimiento y purificación del biogás producido durante el proceso de digestión anaerobia (Chen et al., 2019; Devlin et al., 2011). En los sistemas de tratamiento biológico de aguas residuales, la mayoría de los microorganismos están presentes en forma de agregados microbianos, como flóculos de fango, biopelículas o gránulos. La presencia de sustancias poliméricas extracelulares (EPS), que constituyen una mezcla compleja de polímeros de alto peso molecular presentes tanto en la superficie de las células como en el interior de los agregados microbianos, también desempeña un papel importante en estos procesos (Nielsen et al., 2002). Página 8 de 53 Tabla 1: Diferencias en la composición entre un fango primario y un secundario Parámetro Fango Primario Secundario Sólidos totales (%ST) 2.0-9.0 0.8-3.3 Sólidos orgánicos/sólidos volátiles (%ST) 60-80 59-88 Nitrógeno (N, %ST) 1.5-4.0 2.4-5.0 Fósforo (P, %ST) 0.17-2.8 0.5-2.3 Potasa (K2O, %ST) 0-1 0.5-0.7 Celulosa (%ST) 8.0-15.0 7.0-9.7 Hierro (Fe g/kg) 2-0-4.0 n.d Sílice (SiO2, %ST) 15-20 n.d pH 5.0-8.0 6.5-8 Grasas (%ST) 7.0-65 2-12 Proteína (%ST) 20-30 32-41 Ácidos orgánicos 200-2000 1100-1700 Carbohidratos (%ST) n.d 6.1-9.88 La eficacia de la recuperación de componentes depende del tipo de fango, de la naturaleza y severidad del método de tratamiento. El desafío principal sigue siendo elegir las condiciones óptimas de hidrólisis que permitan maximizar la recuperación de componentes de alto valor añadido. Para la recuperación de las proteínas, es fundamental llevar a cabo la disrupción tanto de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) como de los materiales intracelulares (citoplasma) minimizando las pérdidas y maximizando la recuperación de los componentes solubilizados (Nielsen et al., 2002). 1.2 MÉTODOS DE HIDRÓLISIS DE FANGOS Se han investigado diversos tratamientos para hidrolizar los fangos aerobios generados en las EDAR, incluyendo métodos de hidrólisis térmicas a bajas (<100°C) y altas temperaturas (> 200°C) (Fernández-Polanco et al., 2021), métodos químicos incluyendo el ajuste de pH o disolventes orgánicos (Chen et al., 2001), así como métodos biológicos (Carvajal et al., 2013), que abarcan la autohidrólisis o el uso de enzimas comerciales (Burgess & Pletschke, 2008) con el objetivo mejorar la etapa de hidrólisis en la digestión anaerobia. Por ejemplo, Yan et al., (2013) consiguieron una Página 9 de 53 concentración de 3000 mg/L y 520 mg/L de péptidos y monosacáridos solubles tras un tratamiento hidrotérmico a 120°C durante 30 min, a partir de fangos en exceso, alcanzando una producción de hasta 142.6 ml CH4/g de sólidos volátiles. Carvajal et al., (2013) observaron que el tratamiento por autohidrólisis a 55ºC y 12 h, en condiciones de alta concentración de sólidos (8%) y ambiente microaerobio, aumentó en un 40% la solubilización de la materia orgánica y mejoró la productividad de metano en un 23% y se produjo una mejora general de la fluidez de los fangos. Los métodos tradicionales de tratamientos de fangos incluyen la hidrólisis química y el pretratamiento físico. La razón del primero es que la operación es sencilla y el efecto es estable, por lo que es ampliamente utilizado. Sin embargo, existen ciertas limitaciones cuando se aplican solos, como la necesidad de dosis elevadas y largos tiempos de tratamiento, que a veces dan resultados insatisfactorios y con costes elevados (Liu et al., 2008; Xiao & Zhou, 2020). En la actualidad, muchos investigadores han optado por combinar varios tipos de tratamientos de forma secuencial (en dos etapas) o asistidas (en una etapa) con el objetivo de mejorar el rendimiento de deshidratación de los fangos o incrementar la producción de biogás a través del proceso de digestión anaerobia (Kim et al., 2010). La tecnología de ultrasonidos se ha utilizado ampliamente como proceso de pretratamiento para mejorar el proceso de digestión anaerobia de fangos aerobios (Kim & Youn, 2011) y anaerobios (Assawamongkholsiri et al., 2013) y en la recuperación de componentes como proteínas, carbohidratos, y compuestos fenólicos a partir de biomasas hemi-y lignocelulósica (Martin Juárez et al., 2021). Figura 5: Representación de los fenómenos de cavitación, colapso y liberación del material celular Página 10 de 53 La cavitación y los efectos térmicos inducidos por las ondas de ultrasonido tienen la capacidad de generar altas temperaturas, altas presiones y fuerzas de cizallamiento mecánico. Esto conduce a la disrupción de la estructura celular bacteriana y mejora el rendimiento en la ruptura de las paredes celulares (Burgess & Pletschke, 2008). El ultrasonido implica el uso de ondas de sonido de alta frecuencia para descomponer, deshidratar las partículas de fango y liberar el material deseado (Figura 5). Estas ondas sonoras viajan a través de un transductor en el líquido y provocan cambios de presión que dan lugar a la formación de burbujas de cavitación. Estas burbujas aumentan de tamaño a medida que la presión disminuye y finalmente alcanzan un tamaño crítico antes de colapsar de manera abrupta, liberando una considerable cantidad de energía (Burgess & Pletschke, 2008) (Figura 6). El estudio realizado por Martín et al. (2015) reveló que la concentración de carbono orgánico soluble total (TOCs) en los fangos aumentaba en un 176% cuando se realizaba un tratamiento con ultrasonidos (20 kHz) durante 60 min. Estos resultados demostraron que el ultrasonido puede liberar sustancias intracelulares de las bacterias, lo que es beneficioso para la disolución de proteínas y otras sustancias poliméricas presentes en el flóculo del fango. Figura 6: Desarrollo y colapso de la burbuja de cavitación. La disrupción física causada por los ultrasonidos hace esperar que su combinación secuencial con otros métodos mejore la hidrólisis de la materia orgánica, integrando fenómenos físicos, biológicos, químicos y térmicos. Por ejemplo, Feng et al., (2009) alcanzaron una concentración de péptidos y monosacáridos solubles de 1000 y 200 mg/L tras un pretratamiento con ultrasonidos (10 min, 20 kHz, 26.000 kJ/kg SV) de biomasa WAS. Hwang et al., (2008) aplicaron un proceso secuencial ultrasónico (1010 kJ/kgSV)-alcalino (pH 12) para liberar proteínas de WAS, consiguiendo una concentración de péptidos liberados de 3178 mg/L después de 120 min de pretratamiento. Combinando ultrasonidos y condiciones alcalinas (pH > 12.2), Tian et Página 11 de 53 al., (2015) observaron que las moléculas pequeñas (con pesos moleculares de aproximadamente 5.6 kDa) en los fangos se disolvían y la concentración de proteínas solubles aumentaba significativamente. Por otro lado, Liu et al., (2008) investigaron los efectos de diversos métodos de pretratamiento, como el termo-ácido (90ºC, pH 3), el termo-alcalino (90ºC, pH 13), el ultrasónico (28 kHz, 60 min)-alcalino (pH 13) y el ultrasónico (28 kHz, 60 min)-ácido (pH 3) sobre la solubilización de fangos aerobios y la producción de ácidos orgánicos volátiles (AGV). Los resultados indicaron que la proteína soluble era el sustrato principal para la producción de AGV a partir de los WAS después del pretratamiento termo-alcalino o ultrasónico-alcalino. Por un lado, la combinación termo-alcalina, así como la combinación ultrasonidos-alcalinos mejoraban significativamente la solubilización de los WAS a una concentración elevada de sólidos totales (7.4%). La solubilización de los sólidos volátiles (SV) y de la proteína bruta fue del 60.2-61.6% y del 66.8-67.5%, respectivamente. La relación de conversión de SV a ácidos grasos volátiles totales (AGVT) fue de 0.230 en el caso del pretratamiento ultrasónico-alcalino. Mediante este pretratamiento, el nivel de AGTV fue un 68% superior al de los WAS no tratados tras 252 h de fermentación. Se puede esperar que el pretratamiento previo con ultrasonidos extraiga las proteínas de los fangos para reducir el consumo de energía, acortar el tiempo de reacción y evitar reacciones indeseadas. A pesar de los estudios realizados sobre el efecto de los métodos de hidrólisis en la degradabilidad de WAS, la información disponible en la literatura sobre la recuperación de proteínas y carbohidratos de esta biomasa es muy escasa. García et al., (2017) recuperaron 86% y 87% de proteínas después de tratamiento hidrotérmico y oxidación húmeda. Por otro lado, Chishti et al., (1992) reportaron un 40% de recuperación de proteínas de fangos primarios después de hidrólisis salina con NaCl (180 min, pH 13). Sin embargo, estos estudios no informan sobre la recuperación de la fracción de carbohidratos, o el tamaño de los péptidos recuperados, los cuales tienen una gran influencia para sus posteriores etapas de separación y purificación, así como en sus potenciales aplicaciones. (Lorenzo-Hernando et al., 2019; Rojo et al., 2023). Existen estudios previos sobre solubilización de proteínas a partir de otras biomasas, como la biomasa algal crecida en fotobiorreactores de tratamiento de purines (Lorenzo- Hernando et al., 2019; Martin Juárez et al., 2021; Martín-Juárez et al., 2019; Rojo et al., 2023). En estos trabajos se han utilizado habitualmente condiciones suaves para preservar la estructura del producto deseado. Por un lado, el uso de hidrólisis químicas a Página 12 de 53 altas temperaturas puede tener un efecto esterilizante, y evitar la degradación metabólica de los productos liberados, lo cual es de gran interés en la valorización de biomasas con alto contenido bacteriano(Martin Juárez et al., 2021). Por otro lado, la sonicación es un método de pretratamiento con una eficacia moderada, sin embargo, puede combinarse fácilmente con otros métodos de hidrólisis para aumentar la capacidad de disrupción celular ejerciendo un efecto sinérgico sobre la solubilización de los macrocomponentes (Liu et al., 2008; Yan et al., 2020) (Figura 7). Es decir, el empleo de ultrasonidos no es tan altamente efectivo cuando se emplea individualmente. Sin embargo, cuando se combinan junto a otros métodos de hidrólisis ambos resultan más efectivos de lo que serían de forma individual (Chng et al., 2017). En este contexto, el presente trabajo pretende evaluar el uso de ultrasonidos como método físico de pretratamiento en un proceso secuencial en dos etapas (ultrasonidos seguido de hidrólisis) en la valorización fraccionada de WAS generados en EDAR centrándose en la recuperación de proteínas y monosacáridos. Aplicando un concepto de biorrefinería, se evaluó la solubilización de los principales componentes de la biomasa, carbohidratos y proteínas, analizando el efecto del ultrasonido sobre la posterior hidrólisis bajo diferentes condiciones de severidad. Se utilizaron experimentos controles sin pretratamiento para verificar el efecto del ultrasonido. Además, se determinaron las pérdidas por degradación, en cada caso, y los rendimientos de recuperación de proteínas como péptidos y de los carbohidratos como glucosa y xilosa. Finalmente se analizó el tamaño de los péptidos recuperados. Página 13 de 53 Figura 7: Proceso de recuperación de componentes valiosos a partir de biomasa de fangos aerobios generada en las EDAR urbanas Página 14 de 53 2. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo Fin de Máster es evaluar el efecto del pretratamiento con ultrasonidos en la valorización de los principales componentes que conforman la biomasa de fangos aerobios, las proteínas y carbohidratos. Se compararán los rendimientos de solubilización a partir del sólido residual exhausto y los rendimientos de recuperación a partir de los hidrolizados enriquecido mediante la aplicación de métodos combinados secuenciales en dos etapas de ultrasonidos seguido de hidrólisis química, hidrotérmica y biológica bajo diferentes condiciones de dureza. El trabajo se centrará en la fracción mayoritaria y de mayor valor de esta biomasa, la proteíca, pero evaluando también la influencia de los diferentes procesos sobre la fracción de carbohidratos. El estudio se realiza teniendo en cuenta los parámetros de rendimientos de solubilización de proteínas y carbohidratos; y los rendimientos de recuperación como péptidos y monosacáridos. Explícitamente se persiguen los siguientes objetivos específicos: I. Comparar el efecto que posee el ultrasonido como método físico de pretratamiento en los rendimientos de solubilización y recuperación de proteínas y carbohidratos. II. Determinar las pérdidas de componentes para cada tratamiento ensayado y, con ello, los rendimientos de recuperación de proteínas como péptidos y de carbohidratos como monosacáridos. III. Evaluar la influencia del ultrasonido sobre la calidad de los péptidos recuperados en término de tamaño. Página 15 de 53 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 BIOMASA DE FANGOS AEROBIOS La biomasa de fangos aerobios (BS) utilizada en este estudio se recogió tras la unidad de decantación secundaria de la EDAR urbana local de Valladolid, España, y se concentró mediante centrifugación (Thermo ScientificTM Sorvall X4Pro, 10.000 rpm, 5 min) para reducir el contenido de humedad del 99.8% al 93.3%. La fracción sólida procedente de centrifugación (Figura 8) fue homogeneizada, siendo su composición química (en base seca sin cenizas): 47.9 ± 2.5% de proteínas, 20.4 ± 0.8% de carbohidratos (compuestos por 17.4 ± 0.6% de glucosa, 1.9 ± 0.2 % de xilosa, 1.2 ± 0.1 % de celobiosa y < 1% de arabinosa), 10.3 ± 1.1 % de lípidos, 9.6 ± 0.6 % de ácido húmico y 25.4 ± 0.2 % de cenizas. La BS se almacenó a 4 ± 0.5ºC para trabajar con fango fresco en los experimentos de hidrólisis y evitar cualquier actividad biológica (Malhotra & Garg, 2020). Figura 8: Biomasa de fangos aerobios (BS) La biomasa BS inicial contiene los 18 de los 20 tipos de aminoácidos que pueden medirse por el método analítico propuesto por (Moore & Stein, 1948) siendo los más abundantes el ácido glutámico (43.2%) y el ácido aspártico (38.9%) seguidos de alanina (33.8%), leucina (26.6%), lisina (19%), tirosina y valina (≈ 17%) y finalmente la fenilalanina, serina y cisteína se encontraron en torno al ≈ 16%. La relación entre los aminoácidos esenciales y los no esenciales (Eaa/NEaa) en la BS fue de un 74.7%. Los aminoácidos esenciales predominantes eran la treonina (17.9%), la arginina (23.8%), la valina (17.3%), la fenilalanina (16%), la leucina (26.6%) y la lisina (19.3%). Las concentraciones de histidina (12.7%) y metionina (7.3%) eran ligeramente inferiores a las recomendaciones de la OMS/FAO (Becker, 2007). Página 22 de 53 Por otro lado, la autohidrólisis (AH), como método biológico, sencillo y barato, permite establecer condiciones de pH y temperatura que permita a los microorganismos que forman parte de la biomasa liberar las enzimas hidrolíticas contenidas en su propio sistema metabólico (Carvajal et al., 2013), evitando el uso de costosas enzimas comerciales. Experimentalmente, la autohidrólisis (AH) se realizó utilizando un agitador rotatorio (Comecta-Ivymen, España) a temperatura constante (50ºC), y agitación (200 rpm) a pH 6.5 durante 60 y 180 min, incluyendo el tiempo de calentamiento inicial, correspondientes a las condiciones óptimas de la enzima proteasa (Rojo et al., 2021). Estas condiciones de operación, que favorecen la actividad de las enzimas de tipo proteasa presentes en los WAS, fueron seleccionadas siguiendo los trabajos de Carvajal et al., (2013) y Burgess & Pletschke, (2008). 3.3 CÁLCULOS A partir del balance de masas para cada componente (proteínas y carbohidratos) se definieron los siguientes parámetros para evaluar los rendimientos de solubilización (Ec.1), rendimientos de recuperación (Ec.2) así como las pérdidas de componentes (Ec.3) por los tratamientos aplicados. SY (%)= (1 − g componentes en sólido residual (FS)DH g componente en biomasa inicial BS )×100 Ec.1 RY (%)= ( g componente en hidrolizado (FL)DH g componente en biomasa inicial BS )×100 Ec.2 CL (%)= (𝑆𝑌 (%)𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 −𝑅𝑌(%)𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑆𝑌 (%)𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒 )×100 Ec.3 donde SY es el rendimiento de solubilización (%), RY es el rendimiento de recuperación (%) y CL son las pérdidas de componentes solubilizados (%). "Componente" hace referencia a proteínas/péptidos y carbohidratos/monosacáridos en gramos (g) en la fracción sólida (FS) y en la líquida (FL), después del tratamiento de hidrólisis (DH) o en la biomasa de fango inicial (BS). Página 23 de 53 3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS 3.4.1 Sólidos totales, volátiles y cenizas Para la determinación del contenido de humedad se llevó a cabo un análisis de solidos totales a la biomasa inicial, así como a las fracciones sólidas tras los diferentes tratamientos secando la muestra a 105±5ºC durante 24h. Posteriormente, estas muestras fueron calcinadas a 550±5ºC durante 24h para obtener el contenido de sólidos volátiles. 3.4.2 Análisis de nitrógeno y proteínas El contenido de nitrógeno orgánico en las fracciones sólidas, líquidas y en la biomasa inicial se determinó de acuerdo con el método del Nitrógeno Total Kjeldahl (NKT) según el método estándar descrito en detalle en (USEPA, 2001). El método NKT consta de tres etapas: digestión, destilación y valoración (Figura 14)  En la primera etapa, se realizó una digestión ácida de las muestras. Para ello, se depositaron las muestras en unos tubos de digestión junto con ácido sulfúrico concentrado al 96% en exceso para mantener el equilibrio ácido-base y una pastilla de catalizador Kjeldhl (0.3% CuSO4·5H2O) junto a unas bolitas de cerámica. La digestión se realizó mediante una rampa de temperatura de 15 min (150ºC), 45 min (270ºC) y 120 min (370ºC) convirtiendo el nitrógeno orgánico (procedente de las proteínas) en ion amonio (R1). Tras finalizar la digestión, se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente durante 1 hora, hasta que las muestras tornaron a transparente. Proteína (CHNO)+H2SO4→CO2+ SO2+ H2O+ (NH4)2SO4+ H2SO4 R1 Digestión Destilación Valoración Figura 14: Esquema y equipo experimental para la determinación de proteínas por el método NKT Página 24 de 53  La segunda etapa, la de destilación, tuvo lugar en la unidad de destilación (KjeFlex K-360). La muestra, digerida en la primera fase, se alcaliniza con NaOH 13 N, provocando que el nitrógeno se desprenda en forma de amoniaco (R2). El amoniaco se recoge sobre un Erlenmeyer que contiene una disolución de ácido bórico al 4% junto con un indicador mixto de Tashiro. Esta destilación tiene lugar en exceso de ácido bórico, el cual se utiliza como solución absorbente que captura el amonio formando iones amonio solvatados (R3). (NH4)2SO4+2 NaOH→ 2 NH3+Na2SO4+ 2 H2O R2 NH3+H3BO3+ H2O→ NH4 ++ B(OH)4 - R3  La tercera etapa, la etapa de valoración, se lleva a cabo la cuantificación del contenido de nitrógeno amoniacal de las muestras. A partir de la cantidad de ion borato que se formado, el cual es equivalente al nitrógeno absorbido, se realizó una valoración volumétrica ácido-base (R4) de manera directa con ácido sulfúrico (0.05- 0.1 N según el contenido de N en la muestra) previamente normalizada frente a un patrón primario de hidrógeno ftalato de potasio. En dicho proceso, la muestra inicialmente de color verde se tornará violeta cuando haya concluido la reacción (intervalo de viraje del indicador de Tashiro entre pH 4.4 a 5.8). 2 B(OH)4 -+H2SO4→ SO4 2-+2 B(OH)3+ 2 H2O R4 A partir del volumen utilizado de ácido sulfúrico y su normalidad, se puede calcular la cantidad de nitrógeno presente en la muestra inicial, la fracción sólida residual y la fracción líquida, y con ella saber la cantidad de proteínas que contienen a partir de un factor Nitrógeno a Proteína de 4.3 obtenido a partir del perfil de aminoácidos de la biomasa inicial (Templeton & Laurens, 2015). 3.4.3 Análisis de carbohidratos Los carbohidratos, que son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas, están compuestos por una o varias unidades de monosacáridos. Mediante hidrólisis ácida, todos los carbohidratos se descomponen en monosacáridos, siendo esta reacción más eficiente a temperaturas elevadas (Martín-Juárez et al., 2019). Para determinar el contenido de carbohidratos en la biomasa inicial, en las fracciones sólidas y en las fracciones líquidas se empleó el protocolo de NREL (Wychen & Laurens, 2013). Página 25 de 53 Dicho método implica la hidrólisis ácida de los carbohidratos presentes en la biomasa, seguida de la medición cuantitativa de los monosacáridos resultantes mediante cromatografía líquida de alta resolución con detector UV-Vis que lleva acoplado a un detector de índice de refracción (HPLC-RID). En primer lugar, la biomasa inicial, así como las fracciones sólidas obtenidas tras los tratamientos de hidrólisis, se sometieron a una hidrólisis ácida concentrada con ácido sulfúrico al 72% en peso a 35ºC en tubos de vidrio. Se dejó que la hidrólisis tuviese lugar en un baño termostático a 35ºC durante 1 hora, a la vez que se agitaban los tubos cada 5-10 minutos para favorecer la solubilización. Tras esta primera digestión se añadieron 84 mL de agua destilada para reducir la concentración de ácido hasta un 4% en peso y las muestras se sometieron a autoclave (P-Selecta) a 121ºC durante 60 min. Posteriormente, se separaron las fracciones sólidas de las líquida. Finalmente, la fracción líquida resultante de la hidrólisis del sólido se filtró con filtros de membrana de nylon de 0.22 µm Los principales monosacáridos se cuantificaron en las fracciones líquidas (las fracciones líquidas obtenidas tras los experimentos de hidrólisis aplicada y las fracciones líquidas procedentes de la hidrólisis ácida de los sólidos) utilizando una columna de exclusión iónica Aminex® HPX-87H (Bio-Rad) (300 x 7,8 mm, 9 µm de tamaño de partícula, 8% de enlace cruzado, rango de pH 1-3) instalada en un módulo de separación Shimadzu LC-2050C. Figura 15: HPLCUV acoplado a RID (Shimazu LC-2050C). Cromatogramas de los principales monosacáridos presentes en la biomasa BS Página 26 de 53 Se utilizó un detector de índice de refracción (RID) para cuantificar la concentración de monosacáridos utilizando una fase móvil isocrática constituida por una solución de ácido sulfúrico 25 mM (calidad HPLC) con un caudal de 0.6 mL/min. La columna y el RID se mantuvieron a 50ºC. Se preparó una solución de calibración multiestándar por dilución de estándares individuales (glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa) disponibles comercialmente con una pureza > 95% (Sigma, Aldrich, España). Además, con el propósito de considerar cualquier descomposición que pudiera haber ocurrido durante la hidrólisis ácida de los monosacáridos, se aplicó un tratamiento de hidrólisis ácida utilizando H2SO4 a las muestras comerciales de glucosa, arabinosa, celobiosa y xilosa, para calcular los factores de corrección necesarios. En última instancia, el cálculo del contenido de carbohidratos se efectuó sumando las cantidades de todos los monosacáridos (glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa). 3.4.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) El tamaño de las proteínas recuperadas en todas las fracciones líquidas se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS- page) según el método descrito por Rojo et al., (2021). La electroforesis SDS-page con Tris-Glicina se realizó utilizando una unidad de electroforesis Mini-PROTEAN (laboratorios Bio-Rad, EE.UU) y un gel Mini-PROTEAN 10-20% Tris-Glicina (Laboratorios Bio-Rad, EE.UU.). La separación de proteínas se llevó a cabo según las especificaciones del fabricante (BIORAD). Las muestras de las fracciones líquidas (20 μL) se mezclaron con 20 μL de una solución compuesta por Laemmli y 50 mM de reactivo de Cleland (DTT, ditiotreitol) y se calentaron a 100 °C durante 5 minutos. Posteriormente, se cargaron 30 μL en los geles prefabricados de la unidad de electroforesis que contienen running buffer 10x Tris/Glicina/SDS (25 mM de Tris, 192 mM de tricina y 0,1% de SDS, pH 8.3). Las condiciones de funcionamiento se ajustaron Monosacárido F. Degradación GLUCOSA 1.05 XILOSA 1.04 ARABINOSA 1.04 CELOBIOSA 0.72 Página 27 de 53 a una tensión constante de 200 V. La corriente eléctrica fue disminuyendo con el tiempo, pasando de 60 mA, inicialmente, a 30 mA. Se utilizó el marcador proteico PageRuler Plus Prestained (Thermo Scientific) como marcador molecular con un rango de tamaño de proteínas de 10 - 250 kDa. Las bandas de proteínas se fijan con una solución fijadora (40% v/v de metanol y 10% v/v de ácido acético) durante 30 minutos. A continuación, se tintaron con una solución de tinción (0.1% de Coomassie Blue R-250, 40% v/v de metanol y 10% v/v de ácido acético) durante 1 hora. Para finalizar, los geles se destiñen con una solución compuesta por metanol: ácido acético: agua en proporción (40:10:50, v/v). 3.4.5 Determinación de lípidos y ácidos húmicos La determinación de lípidos en la biomasa inicial se llevó a cabo de acuerdo con el método de extracción con cloroformo:metanol (2:1, v/v) propuestos por Bligh, E.G. and Dyer, (1959). Por otro lado, el contenido de ácidos húmico se determinó siguiendo el protocolo de hidrólisis alcalina con NaOH (2 M) seguida de precipitación ácido (HCl, 2 M) propuesto por Shahbazi et al., (2019). Como es habitual en la biomasa de fangos aerobios generados en las EDAR la composición de lípidos y ácidos húmicos en la biomasa inicial resultaron bajas (10.3% y 9.6%, respectivamente) para considerar su valorización y estos componentes no fueron monitorizado a lo largo de los procesos estudiados. Figura 16: Sistema de electroforesis (SDS-PAGE) para la determinación del tamaño molecular de las proteínas recuperadas Página 28 de 53 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 EFECTO DEL ULTRASONIDOS EN LOS RENDIMIENTOS DE SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y CARBOHIDRATOS. La Figura 17 muestra los resultados de la solubilización de proteínas y carbohidratos obtenidos tras la aplicación secuencial de un método físico como el ultrasonido (20 kHz, 50% de amplitud) durante 5 min seguido de hidrólisis individual según se específica en el apartado experimental bajo las condiciones operativas mostradas en la Tabla 2. Además, se muestra también los resultados de rendimiento de solubilización bajo hidrólisis individual sin pretratamiento con el objetivo de observar la influencia que tiene el ultrasonido. Los resultados de los rendimientos de solubilización se expresan en referencia a la masa de proteínas y carbohidratos contenidos en la biomasa inicial (BS). El pretratamiento con ultrasonidos (US) es una técnica ampliamente utilizada para mejorar la eficiencia de la hidrólisis y solubilización de componentes orgánicos en numerosas biomasas residuales. Como se ha mencionado anteriormente, la aplicación de US a la biomasa puede generar fenómenos de cavitación, microturbulencia y cambios de presión que facilitan la desestabilización de la matriz celular y la liberación de compuestos orgánicos (Chng et al., 2017). A la vista de los resultados, el pretratamiento con ultrasonidos ha demostrado ser eficaz en la solubilización de las proteínas y carbohidratos mostrando una mayor influencia en aquellos métodos de hidrólisis bajo suaves condiciones (ALK, EH, AH) mientras que para las condiciones de mayor severidad (HT, HT+ALK) su influencia fue menos marcada. Por ejemplo, no se observó una diferencia notable del ultrasonidos, respecto a la hidrólisis sin pretratamiento (HT+ALK) en los rendimientos de solubilización de proteínas (≈ 92% y 87% con NaOH 1M, 60 min), aunque su influencia en la fracción de carbohidratos fue mucho más marcada cuando la concentración de NaOH fue mínima con un incremento del 65% (HT+ALK, 0.5 M) hasta un 95% (USHT+ALK, 0.5 M). Cuando la concentración de NaOH fue 1 M (US-HT+ALK) permitió solubilizar ambos componentes prácticamente en la misma proporción (≈ 92%). El efecto del ultrasonido sin duda fue mucho más marcado en la fracción de carbohidratos que en la proteica, de hecho, el blanco realizado sólo con US (dato no mostrado en las Página 29 de 53 gráficas) se observó una mayor solubilización de carbohidratos (26.7%) que de proteínas (15.9%). Por otro lado, para el tratamiento hidrotérmico el pretratamiento con US permitió que en tan solo 30 min de hidrólisis (US-HT) los rendimientos de proteínas y carbohidratos se vieron incrementados hasta en un 18% y 21% respecto al ensayo hidrotérmico sin pretratamiento (HT) mientras que tras 60 min estos incrementos fueron más moderados alcanzando rendimientos de solubilización del 75.5% para las proteínas y del 63.4% para los carbohidratos, aproximadamente un 16% superior al ensayo HT a 60 min sin pretratamiento. Passos et al., (2015) obtuvieron una liberación insignificante de componentes macromoleculares al aplicar un tratamiento con ultrasonidos (70 W, 30 min, 26.700 J/g ST) a microalgas cultivadas en aguas residuales urbanas. Martin-Juárez et al., (2021) estudiaron el efecto del tiempo de aplicación de US con biomasa algal generada en corrientes residuales, pasando de una solubilización del 28% y 10% de carbohidratos y proteínas con 5 min a 479 W hasta un 42% y 27% tras 20 min. Los resultados mostraron un importante efecto del ultrasonido en los rendimientos de solubilización bajo suaves condiciones (ALK) alcanzándose con US-ALK, (50ºC, 60 y 180 min) rendimientos muy similares a los de las combinaciones US-HT+ALK y USHT, lo que supone un aumento de ≈ 65%. Por lo tanto, el efecto combinado del ultrasonido seguido de álcali puede destruir eficazmente las células del lodo y solubilizar más proteínas que el ultrasonido o el álcali por sí solos. Como importante tecnología de disrupción de biomasa, el ultrasonido genera una fuerza de cizallamiento durante el funcionamiento que puede descomponer eficazmente los flóculos de lodos y, seguidamente, exponer las células microbianas de los flóculos rotos al entorno alcalino, acelerar la transferencia de masa de la solución alcalina (Tian et al., 2016) y la disolución de las células por el álcali. Chiu et al., (1997) estudiaron la solubilización de WAS (1%, p/v) pretratado con la combinación de ultrasonidos (14.4 s/mL) y alcalino (NaOH, 40 meq/L) y encontraron que el 50-60% de TSS (sólidos solubles totales) puede ser solubilizado bajo esta combinación. Liu et al., (2008) consiguieron solubilizar el 70% de proteínas con un tratamiento ultrasónico (28 kHz, 60 min)- alcalino (NaOH, pH 13), similar al rendimiento obtenido con una combinación termo-acalina a 90ºC (≈ 67%). Gao et al., (2021) observaron que 20 min de ultrasonidos a 2 W/mL a pH 12 proporcionaron un rendimiento de solubilización de proteínas del 81.4 %., mientras que, en las mismas condiciones, el rendimiento de extracción de proteínas fue sólo del 7.1 % sólo con ultrasonidos. Página 30 de 53 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M 1 M pH 13.0 pH 6.5 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 60 min 180 min 60 min 180 min pH > 12 pH > 12 50ºC 50ºC ALK US-ALK Hidrólisis alcalina SY (%) de proteínas y carbohidratos SY Proteinas (%) SY Carbohidratos (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 30 min 60 min 30 min 60 min pH > 12 pH > 12 121ºC 121ºC HT + ALK US-HT + ALK Hidrólisis termo-alcalina SY (%) de proteínas y carbohidratos SY Proteinas (%) SY Carbohidratos (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30 min 60 min 30 min 60 min pH 6.5 pH 6.5 121ºC 121ºC HT US-HT Hidrólisis Térmica SY (%) de proteínas y carbohidratos SY Proteinas (%) SY Carbohidratos (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5% 1% 0.5% 1% pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 60 min 180 min 180 min 60 min 180 min 180 min 50ºC 50ºC AH EH US-AH US-EH Hidrólisis bilógica SY (%) de proteínas y carbohidratos SY Proteinas (%) SY Carbohidratos (%) Figura 17: Efecto del ultrasonido en los rendimientos de solubilización (SY, %) de proteínas y carbohidratos en referencia a la masa de carbohidratos y proteínas inicial tras el tratamiento de ultrasonidos-hidrólisis aplicado a la biomasa BS. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar de 4 determinaciones analíticas (etapa de hidrólisis analizada en réplica). Las líneas de intervalo vertical representan la desviación estándar de las medias. Página 31 de 53 Por último, el pretratamiento con ultrasonidos permitió incrementar las escasas solubilizaciones conseguidas con los métodos biológicos, logrando incrementar la solubilización de proteínas desde un 20.5% (AH) hasta un 66.6% (US-AH) tras 60 min de incubación (casi un 69% superior), mientras que para los carbohidratos los incrementos fueron más moderados (≈ 29%) mientras que tras 180 min de incubación los rendimientos se vieron incrementados en un 33% para ambos componentes. Sin embargo, en los experimentos de hidrólisis enzimática, el efecto del US resultó moderado, especialmente para las proteínas. Se observó que el tratamiento con ultrasonidos seguido de hidrólisis enzimática con Protamex (US-EH) favoreció la solubilización de carbohidratos respecto a la hidrólisis enzimática individual (EH) con incrementos que van del 39.5% y 33% cuando se incrementó la concentración de enzima de 0.5% al 1% mientras que para las proteínas solo se observaron ligeros incrementos del 25% al 29%, existe la posibilidad de que algunas de las proteínas que se encuentran formando parte de la composición del fango de depuradora, tengan estructuras para las que la acción de Protamex no resulte óptima. En este sentido, Martin Juárez et al., (2021) consigue sólo 14% y 47% de solubilización de proteínas y carbohidratos a partir de biomasa algal generada en aguas residuales, tras 21 min de ultrasonidos seguidos de 12h de hidrólisis enzimática con una mezcla comercial de Celluclast + Novozyme 18 4.2 EFECTO DEL ULTRASONIDOS EN LOS RENDIMIENTOS DE RECUPERACIÓN DE PEPTIDOS En la Figura 18 se muestran los resultados de los rendimientos de recuperación de péptidos en hidrólisis individual y combinada termo-alcalina sin y con pretratamiento de ultrasonidos, respectivamente. La diferencia entre las proteínas solubilizadas (SY) y los péptidos recuperados (RY) proporcionó información sobre las pérdidas totales de proteínas causadas por la severidad de la hidrólisis o debido al metabolismo activo de las bacterias presentes en la biomasa inicial (Liu et al., 2008; Martin Juárez et al., 2021), además, en líneas continuas se presentan las pérdidas de proteinas solubilizadas. Las pérdidas de proteínas claramente variaron en función del tipo de hidrólisis llevada a cabo. En los dos experimentos termo-alcalinos sometidos a una duración de hidrólisis de 60 minutos, que resultaron en la mayor solubilización de proteínas, dieron lugar a pérdidas de proteínas del 6.2% y 11.1% para las concentraciones de NaOH 0.5 y Página 38 de 53 pretratamiento con el objetivo de observar el efecto que tuvo el ultrasonido sobre este componente. Las barras discontinuas muestran el rendimiento de solubilización (SY, %) de carbohidratos que dan idea de las pérdidas totales de carbohidratos. Las líneas continuas muestran las pérdidas de los carbohidratos solubilizados. Los dos monosacáridos más abundantes en la biomasa inicial (BS) fueron la glucosa y la xilosa, sin embargo, esta última no fue recuperada en ninguno de los ensayos. Se observó una tendencia muy clara en términos de recuperación de carbohidratos respecto a los rendimientos de recuperación de proteínas: mientras que las altas condiciones alcalinas favorecieron la recuperación de proteínas, para los carbohidratos, fue mucho más beneficioso el uso de condiciones con menor alcalinidad. Se puede observar que el empleo de ultrasonidos resultó tener un efecto positivo sobre los rendimientos de recuperación de carbohidratos contenidos en la biomasa puesto que los porcentajes se han visto incrementados en todas las hidrólisis respecto a las hidrólisis sin pretratamiento. Esto puede deberse a que las ondas generadas han conseguido descomponer las estructuras de las matrices biopoliméricas donde se encontraban retenidos dichos carbohidratos. Por tanto, el pretratamiento de US mejora la accesibilidad a estas macromoléculas. Analizando las pérdidas, se puede observar que los porcentajes, de forma general, son mucho menores a las pérdidas de las hidrólisis sin pretratamiento. La mayor recuperación de carbohidratos se obtuvo cuando se aplicó 5 min de ultrasonidos seguido de hidrólisis termo-alcalina (US-HT+ALK). En este caso, la combinación de una alta solubilización y pérdidas moderadas (18% y 21% para 30 y 60 min de hidrólisis) dio lugar a recuperaciones superiores a las obtenidas sin pretratamiento (50.6% y 36.5% para el método HT+ALK 0.5 M a 30 y 60 min). A diferencia de la hidrólisis sin pretratamiento (HT+ALK), donde los elevados factores de pérdidas de carbohidratos, entre un 44% (30 min) y 53% (60 min) a la mayor concentración de NaOH (1M) redujeron la recuperación, no se encontraron diferencia entre la concentración de álcali entre los ensayos US-HT+ALK realizados al mismo tiempo de hidrólisis en los rendimientos de recuperación con rendimientos promedios del ≈ 74% en las condiciones de 60 min y ≈ 63% tras 30 min de hidrólisis a ambas concentraciones de álcali. Página 39 de 53 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M 1 M pH 13.0 pH 6.5 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 60 min 180 min 60 min 180 min pH > 12 pH > 12 50ºC 50ºC ALK US-ALK Hidrólisis alcalina Pérdidas solubilizadas (%) RY (%) monosacáridos RY Monosacáridos (%) SY Carbohidratos (%) Perdidas solubilizadas (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30 min 60 min 30 min 60 min pH 6.5 pH 6.5 121ºC 121ºC HT US-HT Hidrólisis Térmica Pérdidas solubilizadas (%) RY (%) monosacáridos RY Monosacáridos (%) SY Carbohidratos (%) Perdidas solubilizadas (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 0.5 M 1 M 30 min 60 min 30 min 60 min pH > 12 pH > 12 121ºC 121ºC HT + ALK US-HT + ALK Hidrólisis termo-alcalina Pérdidas solubilizadas (%) RY (%) monosacáridos RY Monosacáridos (%) SY Carbohidratos (%) Perdidas solubilizadas (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5% 1% 0.5% 1% pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 60 min 180 min 180 min 60 min 180 min 180 min 50ºC 50ºC AH EH US-AH US-EH Hidrólisis bilógica Pérdidas solubilizadas (%) RY (%) monosacáridos RY Monosacáridos (%) SY Carbohidratos (%) Perdidas solubilizadas (%) Figura 21: Efecto del ultrasonido en el rendimiento de recuperación de glucosa (RY, %) respecto al contenido de carbohidratos en la biomasa inicial Las barras discontinuas muestran los rendimientos de solubilización (SY, %) carbohidratos en referencia al contenido inicial. La diferencia entre los SY y RY muestra las pérdidas totales de carbohidratos debido al proceso de hidrólisis. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar de 4 determinaciones analíticas (etapa de hidrólisis analizada en réplica). Las líneas de intervalo vertical representan la desviación estándar de las medias. Página 40 de 53 Es posible que la aplicación de ultrasonidos seguido de unas temperaturas más elevadas rompa las estructuras de celulosa o hemicelulosa, favoreciendo su descomposición y, por tanto, incrementando las recuperaciones en términos de glucosa. El pretratamiento de ultrasonidos puede ayudar a descomponer las estructuras complejas de los carbohidratos en el fango de depuradora. Esto facilita la posterior hidrólisis y reduce las pérdidas de carbohidratos durante el proceso. Martin Juárez et al., (2021) también observaron elevados factores de pérdidas de carbohidratos (en torno al 70%) en el tratamiento termo-alcalino (NaOH 2M, 121ºC) y la combinación alcalino-peróxido de biomasa algal. Rojo et al., (2023), trabajando con consorcios de microalgas-bacterias cultivadas en aguas residuales porcinas, reportaron elevadas pérdidas de glucosa (83.3% y 61%) tras la hidrólisis termoalcalina y alcalina alcalina (NaOH, 2 M, 120 y 60ºC). Por otro lado, Mahdy et al. (2014) informaron de rendimientos de solubilización de carbohidratos inferiores operando en condiciones más suaves, del 43.5% (5% NaOH (p/v), 50°C, 48 h) y del 36% (2% KOH (p/v), 120 °C, 2 h) para las microalgas Scenedesmus sp y Tetraselmis suecica puras crecidas en medio sintético con rendimientos de recuperación inferiores al 25% para ambas. En un medio alcalino, los grupos funcionales de los carbohidratos, como los grupos hidroxilo, pueden ser más susceptibles a reacciones químicas y a la degradación, lo que puede resultar en una mayor pérdida de carbohidratos (Tan et al., 2012). Para las condiciones más suaves (US-ALK, US-HE, US-AH) a pesar de que el ultrasonido potenció la solubilización de los carbohidratos, al final, los elevados factores de pérdidas redujeron la recuperación a rendimientos que oscilaron entre un 45% y 33%. Alvajeh et al. (2020) recuperaron un 40% de monosacáridos de Chlorella vulgaris pura con ultrasonidos seguido de hidrólisis enzimática y observaron, al igual que en nuestro estudio, altos factores de pérdidas de carbohidratos (>50%). Esta misma tendencia se observó en los experimentos sin pretratamiento con ultrasonidos con rendimientos de recuperación de carbohidratos especialmente bajos en la hidrólisis térmica (27.7%), hidrólisis alcalina (25.7%), hidrólisis enzimática (11.5 %) y autohidrólisis (23.2%) como resultado de la baja solubilización y las elevadas pérdidas de carbohidratos atribuibles al metabolismo activo de las bacterias presentes en la biomasa cruda (Fuentes et al., 2016; Liu et al., 2008). Para un consorcio de microalgasbacterias formadas por Alphanothece sp y Scenedesmus obliquus con elevado contenido bacteriano crecidas en un fotobiorreactor alimentada con aguas residuales, Martín Página 41 de 53 Juárez et al., 2016) reportaron un alto rendimiento de solubilización de carbohidratos bajo hidrólisis enzimática (81.7%) con una recuperación de monosacáridos tan baja como el 1%. Encontraron, además, cantidades importantes de subproductos como ácido acético, ácido fórmico, metanol, ácido succínico, y ácido butírico en los hidrolizados formadas probablemente debido a la acción oxidativa y fermentativa sobre los monosacáridos como la glucosa y la xilosa, a través de las diferentes rutas metabólicas de las bacterias presentes en este tipo de biomasa. Chen et al., (2007) también reportaron altas concentraciones de subproductos (ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico y ácido butírico) como resultado de la fermentación acidogénica de carbohidratos en lodos activados. A pesar de las elevadas pérdidas de carbohidratos obtenidas bajo las condiciones experimentales propuesta en este trabajo, los hidrolizados aún pueden tener potenciales aplicaciones como medio de cultivo rico en compuesto carbonoso (ácidos orgánicos, alcoholes, entre otros). Este medio puede emplearse como sustrato para procesos de fermentación bacteriana. Recientemente, nuestro grupo ha mostrado la utilidad los hidrolizados, una vez separados los péptidos de mayor tamaño, como medio de cultivo de Paraccocus denitrificans. Estas bacterias acumulan el carbono orgánico en forma de polihidroxialcanoatos utilizados para la producción de bioplásticos. Aunque no se pudieron cuantificar estos subproductos de degradación de los carbohidratos recuperados si se pudieron identificar ciertos picos en los cromatogramas, utilizando un detector UV-Vis a 210 nm, que nos dan idea de algunos compuestos de degradación que no estaban presentes inicialmente en la biomasa BS (Figura 22 A) así como en los experimentos HT+ALK (22 B), AH (22 C), US-HT+ALK (22 D). Se observaron algunos picos importantes a 13.4 min (ácido láctico), 14.7 min (ácido fórmico), 15.9 min (ácido acético), 20.1 min (ácido butírico), 18.6 min (ácido levulínico), 19.4 (metanol), 21.6 min (etanol). Página 42 de 53 Figura 22: Algunos compuestos de degradación detectados con HPLC-UV. A) Biomasa inicial, B)HT+ALK, C)US-HT+ALK, D) US-AH Página 43 de 53 5. CONCLUSIONES Con el presente trabajo se ha logrado cumplir con el objetivo general, la valorización fraccional de los principales componentes que forman los fangos. Además, se ha podido concluir que, de forma general, el pretratamiento de ultrasonidos es capaz de mejorar e incrementar los rendimientos de solubilización y recuperación de proteínas y carbohidratos frente a los resultados de las hidrólisis que se realizan sin pretratamiento. El empleo de ultrasonidos tuvo un efecto más marcado en la solubilización de carbohidratos en comparación con las proteínas. Con el método USHT+ALK, un tiempo de hidrólisis de 60 minutos y NaOH 0.5M se consiguió un rendimiento de solubilización de carbohidratos del 95% frente al 65,1% que se obtuvo con el mismo método, pero sin pretratamiento ultrasónico. Por otro lado, las solubilizaciones de los métodos biológicos también fueron significativamente superiores tras el pretratamiento de US. En particular, se destacó la mejora en la solubilización de proteínas, que pasó de un 20.5% (AH) a un 66.6% (US-AH) después de 60 minutos de incubación. En general, los carbohidratos muestran mayor sensibilidad a los cambios en las condiciones de tratamiento en comparación con las proteínas. Los aumentos en la solubilización de carbohidratos fueron más pronunciados en respuesta a cambios en la temperatura, concentración y tiempo, favoreciéndose con mayores tiempo de hidrólisis y temperaturas. Por otro lado, el pretratamiento con ultrasonidos mostró ser una estrategia efectiva para mejorar la recuperación de monosacáridos y péptidos, reduciendo las pérdidas de carbohidratos y proteínas en comparación con los procesos sin pretratamiento. El pretratamiento con ultrasonidos antes de la hidrólisis termo-alcalina redujo las pérdidas de proteínas, resultando pérdidas del 3.1% y 8.9% después de 30 y 60 minutos de hidrólisis con NaOH 0.5 M. En cuanto a la hidrólisis enzimática con pretratamiento de ultrasonidos, se lograron recuperaciones de hasta el 42.2%, un 23% superior a la hidrólisis enzimática sin pretratamiento previo, lo que indica una mejora significativa en la extracción de proteínas. En lo que respecta a la recuperación de carbohidratos, la aplicación de ultrasonidos tuvo un efecto positivo sobre dichos rendimientos, puesto que los porcentajes se incrementaron en todas las hidrólisis en comparación con las hidrólisis sin pretratamiento. La recuperación de carbohidratos fue más alta cuando se aplicaron 5 minutos de ultrasonidos seguidos de hidrólisis termo-alcalina (US- Página 44 de 53 HT+ALK). Esto resultó en una alta solubilización y pérdidas moderadas (18% y 21% para 30 y 60 minutos de hidrólisis), lo que superó las recuperaciones obtenidas sin pretratamiento (50.6% y 36.5% para el método HT+ALK 0.5 M a 30 y 60 minutos). Por último, el empleo de ultrasonidos antes de la hidrólisis también resultó en un mayor fraccionamiento de los péptidos en comparación con la hidrólisis sin pretratamiento. Esto se reflejó en una mayor diversidad de tamaños de péptidos en los experimentos con ultrasonido. En el tratamiento térmico a 121ºC (HT), solo se observaron péptidos de 100 kDa a 30 y 60 minutos. Sin embargo, en el tratamiento térmico alcalino (HT+ALK), se observaron proteínas con tamaños de péptidos de 250 kDa, 130 kDa y 70 kDa. La hidrólisis biológica con proteasa (EH) produjo bandas de proteínas difusas en la parte inferior del gel, lo que indica la presencia de péptidos de baja masa, probablemente fraccionados por bacterias viables presentes en la biomasa bacteriana. Como se ha determinado en el proyecto, el empleo de ultrasonidos puede mejorar la solubilización de proteínas y péptidos, facilitando su separación y purificación posterior. Esto puede ser beneficioso en aplicaciones donde se requiere una alta pureza de péptidos, mejorando la calidad de los péptidos recuperados. En definitiva, los resultados obtenidos en este trabajo revelan que el uso de ultrasonidos previos a la hidrólisis tiene múltiples ventajas. La estrategia de hidrólisis combinada de ultrasonido e hidrólisis alcalina + tratamiento térmico ha demostrado ser la más efectiva en la solubilización y recuperación de proteínas y carbohidratos a partir de biomasa de fangos residuales secundarios. Este enfoque, que combina ultrasonidos y condiciones alcalinas, muestra un efecto sinérgico que aumenta significativamente los rendimientos de recuperación y permite obtener péptidos de gran tamaño, lo que los hace potencialmente adecuados para aplicaciones industriales en la producción de proteínas. El uso de ultrasonidos como pretratamiento en la valorización de los fangos de depuradora es una estrategia prometedora que mejora la eficiencia de la hidrólisis, aumenta la recuperación de compuestos valiosos y reduce las pérdidas. Página 45 de 53 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Ahn, J. H., Shin, S. G., & Hwang, S. (2009). Effect of microwave irradiation on the disintegration and acidogenesis of municipal secondary sludge. Chemical Engineering Journal, 153(1–3), 145–150. https://doi.org/10.1016/j.cej.2009.06.032 2. Aljuboori, A. H. R., Idris, A., Abdullah, N., & Mohamad, R. (2013). Production and characterization of a bioflocculant produced by Aspergillus flavus. 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