Conformación y estructura de moléculas de interés biológico: conformación de la amoxicilina

FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Químicas CONFORMACIÓN Y ESTRUCTURA DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO: CONFORMACIÓN DE LA AMOXICILINA Autora: ANDREA GONZÁLEZ GÓMEZ Tutores: JUAN CARLOS LÓPEZ ALONSO SUSANA BLANCO RODRÍGUEZ Año 2022/2023 2 ÍNDICE 1. RESUMEN/ABSTRACT ........................................................................................... 3 2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 4 3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO ........................................................................... 6 4. FUNDAMENTO TEÓRICO ...................................................................................... 7 4.1 ECUACIÓN DE SCHR𝐎DINGER Y APROXIMACION DE BORNOPPENHEIMER ______ 7 4.2 METODOS DE CÁLCULO ______________________________________________ 10 4.2.1 MECÁNICA MOLECULAR ____________________________________________ 10 4.2.2 MÉTODOS AB INITIO ______________________________________________ 12 4.3 METODOS SEMIEMPIRICOS ___________________________________________ 15 4.4 TEORIA FUNCIONAL DE LA DENSIDAD DFT _______________________________ 16 4.5 FUNCIONES DE BASE _________________________________________________ 17 4.6 MÉTODO DE BÚSQUEDA DE CONFORMEROS CREST ________________________ 20 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 22 5.1 PROCEDIMIENTO ____________________________________________________ 22 5.2 ETIQUETADO DE CONFORMEROS_______________________________________ 22 5.3 ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES INTRAMOLECULARES Y PUNTOS CRÍTICOS ____ 29 5.4 RESULTADOS OBTENIDOS _____________________________________________ 30 6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 43 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 44 8. LISTADO DE TABLAS ........................................................................................... 47 9. LISTADO DE FIGURAS ......................................................................................... 47 3 1. RESUMEN/ABSTRACT Este Trabajo de Fin de Grado tiene como objetivo principal el estudio teórico de la amoxicilina, analizando sus conformaciones, estimando sus energías y evaluando las interacciones intramoleculares que las estabilizan. Para la búsqueda de confórmeros se ha empleado el método CREST1 (Conformer-Rotamer Ensemble Sampling Tool). Los confórmeros obtenidos se han optimizado utilizando el funcional B3LYP con correcciones empíricas GD3-BJ a la dispersión y la base de Pople 6-311++G(d,p). Se han encontrado 54 confórmeros y se han analizado en detalle los 16 de menor energía. El confórmero más estable tiene una estructura extendida. El conocimiento de la estructura molecular es básico para entender otras propiedades moleculares y como actúa en los procesos de reconocimiento molecular. The main objective of this End-of-Degree project is the theoretical study of amoxicillin, analyzing its conformations, estimating its energies, and evaluating the intramolecular interactions that stabilize them. The CREST1 method (Conformer-Rotamer Ensemble Sampling Tool) has been used for the conformational search. The obtained conformers were optimized using the B3LYP functional with GD3-BJ empirical corrections for dispersion and the 6- 311++G(d,p) Pople basis set. A total of 54 conformers were found, and a detailed analysis was conducted on the 16 conformers with the lowest energy. The most stable conformer has an extended structure. Understanding the molecular structure is fundamental to comprehend other molecular properties and how it functions in molecular recognition processes. 4 2. INTRODUCCIÓN Durante muchos años, las enfermedades infecciosas han sido una de las principales preocupaciones en cuanto a la salud mundial, llegando a ser catalogadas por la organización mundial de salud, en el año 2005, como la principal carga mundial de morbilidad y la principal causa de mortalidad en los niños. Con el fin de frenar su propagación y encontrar una cura han sido estudiadas a lo largo de la historia. Sin embargo, no fue hasta el año 1928 con el descubrimiento de la penicilina y la posterior aparición de novedosos antibióticos que se produjo un gran avance en el tratamiento y cura de estas enfermedades y, por lo tanto, en la ciencia y la medicina. 2 Debido a la gran diversidad de medicamentos surgidos para combatir las bacterias es necesario su clasificación. La identificación de los antibióticos se lleva a cabo de diversas formas, como su origen, efectos y configuración química. El último criterio es el más habitual, puesto que se basa en las similitudes químicas entre los núcleos bases de su estructura. Esto posibilita identificar posibles interacciones entre diferentes sustancias y prever posibles efectos secundarios o incompatibilidades en el uso terapéutico. En definitiva, la clasificación de compuestos en función de su estructura química es una herramienta útil en el estudio y desarrollo de nuevos fármacos, así como en la optimización de tratamientos ya existentes. Estructuralmente, las penicilinas están formadas por la fusión de los anillos betalactámico y tiazolidínico, originando el ácido 6-aminopenicilánico, con una cadena lateral en la posición 6 del anillo β-lactámico (Figura 1). Variando esta cadena se modifican propiedades y surge la diversidad de miembros de la familia. Figura 1. Estructura básica de los compuestos b-lactámicos3 Son antibióticos potentes, de amplio espectro bactericida y baja toxicidad. Dentro del grupo se pueden destacar la bencilpenicilina (penicilina G) y la fenoximetilpenicilina (penicilina V), consideradas como representantes clásicos de esta familia de betalactamas, efectivas frente a gérmenes grampositivos. También resultan relevantes la ampicilina y la amoxicilina, caracterizadas por su amplio espectro de acción y eficacia al ser combinadas con inhibidores de las betalactamasas. 4,5 5 Figura 2. Estructuras moleculares de las penicilinas5 La amoxicilina es un antibiótico bacteriolítico β lactámico de espectro moderado obtenido en 1970 que se utiliza para tratar infecciones bacterianas. Es eficaz contra muchas bacterias, como la Haemophilus influenzae, la Neisseria gonorrhoeae y la Escherichia coli, entre otras. En general, es el medicamento más recomendado de los antibióticos β-lactámicos, esto es debido a su alta eficacia y absorción por administración oral. Su mecanismo de acción se basa en interferir con la síntesis de la pared celular bacteriana, lo que debilita la estructura de la bacteria y la hace más susceptible a ser destruida por el sistema inmunológico o por otros mecanismos de defensa del cuerpo.6 En este trabajo se realizó una búsqueda conformacional de la amoxicilina con el fin de estudiar la flexibilidad de este antibiótico y obtener su panorama de conformaciones. La estructura de los confórmeros obtenidos se optimizo, empleando la teoría del funcional de la densidad, a nivel B3LYP-D3BJ/ 6-311++G(d,p). Asimismo, se ha buscado caracterizar las interacciones intramoleculares que estabilizan sus conformaciones estables. El estudio estructural permite además identificar los posibles puntos de interacción con otros sistemas esenciales para controlar la función biológica. También se calcularon sus propiedades espectroscópicas. 4,5,7,8 Figura 3. Molécula de Amoxicilina 6 3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO El objetivo de este Trabajo de Fin de Grado es el estudio teórico de la amoxicilina, conocer las posibles conformaciones, estimar sus correspondientes energías y analizar las interacciones intramoleculares que las estabilizan. Para ello se diseña el siguiente plan de trabajo: Búsqueda bibliográfica, que permite obtener información sobre las funciones de la molécula, su mecanismo de acción en el organismo, etc. Consulta de estudios previos. Búsqueda de confórmeros mediante el empleo del programa CREST (Conformer- Rotamer Ensemble Sampling Tool). Optimización geométrica de las conformaciones obtenidas, utilizando el programa Gaussian a nivel B3LYP-D3BJ/ 6-311++G (d, p), así como las energías electrónicas, las frecuencias, las constantes de rotación, las constantes de acoplamiento de cuadrupolo y los momentos dipolares. Esto permite eliminar las conformaciones duplicadas. Cálculo con la aproximación armónica de las frecuencias de vibración, para comprobar que se corresponden con mínimos de la función de potencial, y obtención de las energías de Gibbs para cada confórmero. Estudio de la estructura de los confórmeros más estables. Análisis QTAIM (Quantum Theory of Atoms in Molecules) y NCI (Non-covalent Interaction) de las fuerzas intramoleculares de los confórmeros del apartado anterior mediante el análisis de la teoría cuántica de átomos en el programa Multiwfn. 7 4. FUNDAMENTO TEÓRICO A causa de la incapacidad de la mecánica clásica para describir correctamente el comportamiento de las partículas microscópicas, surgió la mecánica cuántica. Con su llegada en el siglo XX, se originó un nuevo campo científico, conocido hoy en día como la química cuántica.9 La aplicación de los ppos de la mecánica cuántica al estudio de las moléculas ha revolucionado el campo de la química. Gracias a la resolución de la ecuación de Schrödinger somos capaces de obtener información acerca de las siguientes propiedades: Geometría molecular Energías de las moléculas Reactividad química Espectros moleculares Interacciones Propiedades físicas Evolución temporal Nuestra comprensión sobre estas propiedades y otros problemas químicos fundamentales se basan en gran medida a nuestro conocimiento del comportamiento detallado de los electrones en los átomos y moléculas.10 En los últimos años ha cobrado protagonismo el empleo de ordenadores como herramientas básicas en la investigación química. Esto condujo al desarrollo de una nueva rama dentro de la química cuántica, la química computacional. Cuyo propósito es el estudio cuantitativo de los sistemas químicos mediante teorías y modelos capaces de deducir información previa a la realización de un experimento. De manera que su objetivo no es sustituir la experimentación, que siempre será necesaria, sino complementarla. Se pueden considerar tres tipos de métodos de cálculos teóricos: métodos de orbitales moleculares ab initio y semiempíricos así corno los métodos de mecánica molecular o campos de fuerzas empíricos. La elección de uno u otro depende de varios factores, como el tamaño de la molécula, el tiempo de información y el tiempo requerido. 11,12 4.1 ECUACIÓN DE SCHR𝐎󰇘DINGER Y APROXIMACION DE BORNOPPENHEIMER La ecuación de Schrödinger independiente del tiempo es la siguiente: 𝐻 𝜳=𝑬𝜳 donde 𝜳 es la función de onda del sistema, 𝐻  es su Hamiltoniano, y E es su energía. Para poder llevar a cabo la resolución de la ecuación el primer paso es establecer el hamiltoniano, para poder determinar los valores propios de la energía y de las funciones de onda propias. 8 En una molécula se tienen no solo varios electrones sino también varios núcleos. La función de onda total va a depender de la posición de los núcleos, 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 , y de las coordenadas de los electrones, 𝑟 󰇍 󰇍 . 𝐻 𝜳 ( 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 , 𝑟 󰇍 󰇍 )= 𝑬𝜳 ( 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 , 𝑟 󰇍 󰇍 ) Es por ello que el hamiltoniano se puede desglosar en una parte electrónica y en otra nuclear: 𝐻 =𝐻 𝑒𝑙𝑒𝑐 +𝐻 𝑁 Donde los subíndices Alfa y Beta se refieren a los núcleos, y los subíndices i y j a los electrones, y los subíndices e y n a electrones y núcleos respectivamente. Por lo tanto: 𝐻 = 𝑇 𝑒 + 𝑉 𝑁𝑒 + 𝑉 𝑒𝑒 + 𝑇 𝑁 + 𝑉 𝑁𝑁 Mientras que en los átomos monoelectronicos se puede considerar el núcleo fijo y estudiar el movimiento de los electrones alrededor del núcleo, para moléculas la función de onda depende a la vez de las posiciones de los núcleos y de las posiciones de los electrones. Por este motivo la ecuación de Schrödinger solo se puede resolver de forma exacta si se aplica para sistemas monoectrónicos (como es el átomo de hidrogeno o la molécula de H2+), siendo irresoluble para moléculas con más de un electrón, ya que no es posible obtener la función de onda exacta. De modo que se han desarrollado métodos para resolver esta ecuación de forma aproximada, pudiendo ser empleada así en sistemas polielectrónicos. 𝐻 𝑒𝑙𝑒𝑐 = − 1 2 ෍∇𝑖 2 − ෍෍ 𝑍 𝐴 𝑟𝑖𝐴 + 𝑖 𝐴𝑖 ෍෍ 1 𝑟𝑖𝑗 𝑗>𝑖𝑖 𝐻 𝑒𝑙𝑒𝑐 = 𝑇 𝑒 + 𝑉 𝑁𝑒 + 𝑉 𝑒𝑒 Cinética electrónica Atracción núcleos-electrones interelectrónica Repulsión 𝐻 𝑁= − 1 2 ෍ 1 𝑀𝐴∇𝐴 2 − ෍෍ 𝑍 𝐴 𝑍 𝐵 𝑅𝐴𝐵 𝐴>𝐵 𝐴𝑖 𝐻 𝑁= 𝑇 𝑁 + 𝑉 𝑁𝑁 Cinética nuclear internuclear Repulsión 9 Estos métodos, que proporcionan soluciones aproximadas, se agrupan según el modelo del que parten y los procedimientos utilizados, conociéndose: - Métodos semiempíricos: Utilizan valores obtenidos de manera experimental para facilitar la resolución de la ecuación. - Métodos ab initio: No emplean ningún tipo de información experimental, sino que parten de las leyes físicas. - Teoría del funcional de la densidad (DFT): aplica una metodología alternativa, centrándose en la densidad electrónica. El primer paso en el tratamiento de la mecánica cuántica de los sistemas moleculares es la consideración de los movimientos electrónicos y nucleares por separado, que se puede lograr utilizando la aproximación de Born-Oppenheimer. Esta aproximación se basa en la gran diferencia de masa entre los electrones y los núcleos. Dado que los núcleos son bastante más pesados que los electrones, su movimiento es mucho más lento. Es por ello que se puede asumir que ambos movimientos están desacoplados. Se considera a los núcleos en posiciones fijas, debido a su mayor masa. Esto permite la eliminación del término de la energía cinética de los núcleos y hace que la repulsión intranuclear (𝑉 𝑁𝑁 ) sea una constante que se pueda sumar al final, siendo posible trabajar únicamente con el denominado hamiltoniano electrónico geométrico. 𝐻 = 𝐻 𝑒𝑙𝑒𝑐 + 𝑉 𝑁𝑁 Asimismo, se podrá expresar el término de la repulsión electrónica con la variable de la posición de los electrones , 𝑟 󰇍 󰇍 , ya que, 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 󰇍 es un parámetro constante. De modo que la ecuación de Schrödinger electrónica es la siguiente: De esta manera la ecuación es ahora más sencilla, y por lo tanto más fácil de resolver, obteniéndose la función de onda y la energía electrónicas para las distintas posiciones de los núcleos. La representación de todas las energías electrónicas posibles para cada posición de los núcleos frente a la posición de éstos nos permite obtener la Superficie de Energía Potencial (SEP), una función multidimensional ( ver superficie correspondiente a dos coordenadas en Figura 4 ). 𝐻 = 𝑇 𝑒 + 𝑉 𝑁𝑒 + 𝑉 𝑒𝑒 + 𝑇 𝑁 + 𝑉 𝑁𝑁 𝐻 𝑒𝜳𝒆 ( 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 , 𝑟 󰇍 󰇍 )=𝐸𝑒( 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 ) 𝜳𝒆( 𝑅 󰇍 󰇍 󰇍 , 𝑟 󰇍 󰇍 ) 16 Los métodos semiempíricos son utilizados para el estudio de sistemas de tamaño intermedio y/o sistemas que involucran transiciones electrónicas. Una de sus principales desventajas es la fiabilidad, debido al gran número de aproximaciones esta es menor que para los métodos ab initio.27–29 4.4 TEORIA FUNCIONAL DE LA DENSIDAD DFT Los métodos DFT se fundamentan en el teorema Hohenberg-Kohn, que establecen que para el estado electrónico fundamental de un sistema la energía (E) depende de la densidad electrónica (ρ) y, por lo tanto, puede calcularse como un funcional de la densidad de electrones: Donde el término 𝑇(ρ) corresponde a la energía cinética, 𝐸𝑒𝑛(ρ) a la energía de interacción electrón-núcleo y 𝐸𝑒𝑒(ρ) a la energía de interacción electrón-electrón. Sin embargo, este teorema no era del todo correcto, dado que la densidad electrónica en un sistema de 2N electrones que no interactúan entre sí, debía coincidir con la densidad electrónica que presente un sistema real, en el cual sí que hay interacciones. No fue hasta tiempo después, cuando Kohn y Sham tuvieron en cuenta dicha idea, pudiéndose reescribir la ecuación (ec anterior) de la siguiente manera: En la que el término 𝑇𝑎𝑝𝑟𝑜𝑥(ρ) hace referencia a una aproximación de la energía cinética real, 𝐽(ρ) es la energía de interacción de Coulomb entre electrones y 𝐸𝑥𝑐(ρ) es el termino de correlación e intercambio. Su resolución se lleva a cabo de manera análoga al método HF: se busca el conjunto de orbitales que minimicen la energía con la condición de que sean ortogonales entre ellos, y, posteriormente, se obtiene las ecuaciones de Kohn-Sham. La clave del método DFT reside en la búsqueda de las expresiones apropiadas para el término 𝐸𝑥𝑐(ρ), que a su vez se subdivide en un término de intercambio y otro de correlación. Por ello, se han desarrollado diferentes funcionales basados en las distintas aproximaciones que se han llevado a cabo para la estimación de este término: - Aproximación de densidad local (LDA): En esta aproximación se considera que el funcional solo depende de la densidad un gas uniforme de electrones. - Aproximación de gradiente generalizado (GCA): En esta aproximación se incorpora a la expresión de energía una dependencia con la densidad electrónica (ρ) y con el módulo del gradiente de dicha densidad electrónica (|∇ρ|) - Funcionales híbridos: El empleo de funcionales híbridos implica la incorporación de la energía de intercambio del método HF a la energía. 𝐸(ρ)=𝑇(ρ) + 𝐸𝑒𝑛(ρ) +𝐸𝑒𝑒(ρ) 𝐸(ρ)=𝑇𝑎𝑝𝑟𝑜𝑥(ρ) + 𝐸𝑒𝑛(ρ) +𝐽(ρ)+𝐸𝑥𝑐(ρ) 17 El empleo de funcionales híbridos junto con otros funcionales, permite mejorar los resultados HF, pero a un menor coste computacional. Es por esta ventaja que la teoría de DFT es una de las técnicas más usadas para cálculo de estructura molecular. 18,29,30 4.5 FUNCIONES DE BASE Como se ha mencionado anteriormente el conjunto de funciones elegidas es crucial a la hora de obtener de una resolución óptima del método. Está elección se basa en dos características: tipo de función elegir y cuántas funciones usar. 4.5.1 TIPOS DE BASES Los orbitales moleculares se describen como combinaciones lineales de un conjunto de funciones orbitales atómicas (OM-CLOA) Un orbital molecular se define: 𝜙𝑖= ෍𝐶𝜇𝑖𝜒𝜇 𝑁 𝜇=1 Que puede expresarse como: 𝜒 =𝑁 𝑌(𝜃,𝛾) 𝑅 (𝑟) En la que N es una constante de normalización, 𝑌(𝜃,𝛾) la parte angular y 𝑅 (𝑟) la función radial. La función angular se describe mediante los armónicos esféricos para todos los orbitales. En cambio, para la función radial hay dos tipos de orbitales: Orbitales Tipo Slater (STO) y Orbitales Tipo Gaussiano (GTO). Los orbitales de tipo Slater, STO (Slater Type Orbitals), están definidos por: 𝜙𝑛𝑙𝑚𝑙 𝑆𝑇𝑂 = 𝑁𝜁𝑟𝑛−1𝑒𝜁𝑟𝜙𝑙𝑚𝑙 Siendo 𝜁 un parámetro variacional y 𝑁𝜁 la constante de normalización. Los orbitales de tipo gaussiano, GTO (Gaussian Type Orbitals), están definidos por: 𝜙𝑛𝑙𝑚𝑙 𝐺𝑇𝑂 = 𝑁𝛼𝑟𝑛−1𝑒𝛼𝑟2𝜙𝑙𝑚𝑙 Siendo 𝛼 es un parámetro variacional y 𝑁𝛼 es la constante de normalización. 18 Un orbital Slater difiere de un orbital hidrogenoide en el término r. Se reemplaza el término polinómico en r por una única potencia de r, manteniéndose el termino exponencial. Por otra parte, un orbital gaussiano y un orbital Slater difieren en la forma de la función exponencial. En el caso de los orbitales GTO y STO, ambos, presentan una característica común y es su no ortogonalidad. Sin embargo, la resolución de las integrales bielectrónica es más sencilla cuando se trata de orbitales tipo gaussiano. No obstante, los orbitales GTO presentan claras deficiencias en cuanto a su comportamiento asintótico y cerca del origen. Esto se debe a que mientras que en los orbitales de tipo Slater en el caso del orbital 1s del átomo de hidrogeno coincide exactamente con el orbital hidrogenoide, en el caso de los orbitales de tipo gaussiano 1s para el átomo de hidrógeno no coincide. Se inserta, a continuación, la Figura 7 en la que se puede apreciar lo mencionado. Figura 7. Descripción gráfica de las funciones GTO y STO (a) y de su función de distribución radial (b) A la vista de la pobre representación que supone el uso de una única función gaussiana, se emplean los denominados orbitales atómicos contractos (CGTO), que son combinaciones lineales de las mismas con diferentes exponentes, conocidas como funciones primitivas. Los coeficientes de la combinación lineal no son parámetros variacionales, sino que se determinan sus valores para cálculos atómicos y se mantienen fijos para los cálculos moleculares. Cuantas más funciones participen en la contracción, más similar al orbital de Slater será la función obtenida y por tanto mejor será el resultado. Aunque sí que es verdad que el uso de orbitales CGTO implica un mayor número de integrales a evaluar, este cálculo es bastante rápido, siendo su uso más eficiente que otro tipo de funciones. 31,14,28,32 𝜙𝐶𝐺𝑇𝑂 = ෍𝑑𝑝𝑔𝑝 𝐺𝑇𝑂 𝐿 𝑝=1 19 Figura 8. Aproximación de varios orbitales GTO a un orbital STO. 4.5.2 NÚMEROS DE BASES Una vez elegido el tipo de funcion de base a utilizar, debe establecerse el número de las mismas a usar. Este número de funciones será proporcional al coste computacional, siendo más preciso el cálculo cuantas más bases se empleen, pero mayor el coste computacional. La aproximación más simple, denominada base mínima, es aquella en la que cada orbital atómico esta descrito por un STO. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, esto no da buenos resultados. Por lo que se debe aumentar el número de funciones primitivas empleadas en la descripción de cada orbital atómico, utilizando para ello bases extendidas. Así pues, dependiendo de las funciones de base que se combinen para describir el orbital atómico hay bases doble𝜻 (doble-Zeta), cuando se describe cada orbital atómico con una combinación de dos funciones de base que difieren en el término exponencial; triple-𝜻 (triple- Zeta), si se utiliza una combinación de 3 funciones de base; y así sucesivamente con el número de funciones de base que se combine. Estas funciones de base adicionales se eligen de manera específica, adaptándose mejor a la forma y el comportamiento del orbital que estamos tratando de describir. Al combinar varias de estas funciones de base, podemos obtener una representación aún más detallada y precisa de cómo se distribuyen los electrones en un átomo o molécula. En resumen, se trata de utilizar un conjunto más grande y específico de funciones de base para capturar con mayor precisión la estructura de los orbitales. En una molécula, los orbitales atómicos, al estar en el entorno de otros átomos, se distorsionan, y, en consecuencia, su distribución de carga no se encuentra centrada en el átomo, es decir, existe una cierta polarización en la distribución de carga. Para tener en cuenta este efecto, los cálculos incluyen funciones de base que representan orbitales desocupados en el estado fundamental, llamadas funciones de polarización 1 . 1 orbitales con un número cuántico orbital mayor que el orbital de valencia 20 Hay veces en las que para algunas moléculas es de gran interés conocer su densidad electrónica a largas distancias del núcleo. Para ello, se añade a la base funciones difusas 2 , que son funciones descritas por orbitales GTO de tipo s y p , pero con exponentes menores. Ninguna de estas posibles extensiones de las bases es excluyente, así que se puede tener una base de funciones con funciones de polarización y funciones difusas simultáneamente. 33 4.5.3 MÉTODOS Y FUNCIONES DE BASES UTILIZADOS Se utilizó el programa Gaussian para la optimización de la geometría, aplicando uno de los funcionales híbridos DFT más utilizado en cuanto a moléculas orgánicas se trata, el B3LYP. El funcional B3LYP34 (Becke Three Parameter Hybrid Functional) es un funcional híbrido que combina una expresión para la energía de intercambio del método Hartree-Fock con una expresión para la energía de correlación que mezcla el funcional VWN y el funcional LYP (Lee, Yang y Parr)35. Sin embargo, este funcional no describe las fuerzas de dispersión, por lo que se complementa con la corrección semiempírica GD336 y el factor de ‘’dumping’’ de Becke-Johnson (BJ). Por otro lado, se aplicó la base 6-311++G (d, p). Se trata de un base de Pople en la que los orbitales internos son descritos como una combinación de 6 funciones gaussianas primitivas y los orbitales de valencia se encuentran desdoblados, es decir, cada orbital es triple𝜻, la parte más interna es descrita con una combinación de 3 GTO primitivas, mientras que la parte más externa con una GTO. Los dos símbolos ‘’+’’ indican la incorporación de funciones difusas ‘’s’’ y ‘’p’’ a los átomos más grandes, como son el carbono (C), el oxígeno (O) y el nitrógeno (N), y solamente funciones difusas ‘’s’’ a los átomos de hidrógeno (H). EL término (d,p) hace referencia a una función de polarización de para los átomos pesados y una función de polarización p para los átomos de Hidrógeno.37 4.6 MÉTODO DE BÚSQUEDA DE CONFORMEROS CREST La química computacional ha ganado popularidad en las últimas décadas debido a los avances en los métodos de teoría funcional de la densidad (DFT), siendo útil en distintos campos de la química. Uno de sus principales usos es la búsqueda conformacional. Es de vital importancia conocer las conformaciones de una molécula para entender sus propiedades. Para resolver el desafío de encontrar los confórmeros de moléculas biológicas se han desarrollado diferentes métodos. Uno de estos métodos se basa en algoritmos que intentan crear estructuras moleculares a partir de datos estructurales previos. Asimismo, las conformaciones también pueden generarse a partir de cálculos mecanocuánticos, los cuales no requieren reglas especiales y determinan la estructura molecular a través del análisis de la SEP. 2 Orbitales con un número cuántico orbital igual al orbital de valencia 21 El paquete CREST1 (Conformer-Rotamer Ensemble Sampling Tool) es un programa de cálculo que utiliza un nuevo método para generar las diferentes conformaciones de una molécula. Este método se basa en muestras semiempíricas que ofrecen resultados precisos y razonables para todas las sustancias químicas. El programa es especialmente útil para generar diferentes conformaciones de una molécula utilizando el algoritmo iMTD-GC (Improved Moments Transition State Theory with the G Conductor). También puede ser utilizado para estudiar agregados con enlaces no covalentes y para identificar los distintos sitios de protonación de una molécula. 4.6.1 Identificación de confórmeros Los confórmeros son estereoisómeros de una molécula que se diferencian en su forma tridimensional. Esto se debe a que, aunque su estructura covalente es la misma, su posición relativa en el espacio varía. Cada uno de ellos tiene una energía potencial mínima diferente, lo que significa que uno puede ser más estable que el otro. Es crucial diferenciar entre estructuras idénticas para así evitar el doble conteo. La distinción se puede hacer mediante estructuras tridimensionales y energías de los isómeros, puesto que cada uno de los confórmeros se caracteriza por su mínimo en la superficie de energía potencial. Aunque los parámetros estructurales son útiles para comparar, la información estructural siempre debe combinarse con la energía para la correcta identificación de las diferentes conformaciones, pues, los parámetros estructurales no proporcionan ninguna información sobre si la estructura está en la geometría de equilibrio o si es un estado transitorio de mayor energía. 4.6.2 Algoritmo La generación de conformaciones moleculares mediante la rotación alrededor de ángulos diedros no es una opción práctica para moléculas grandes y flexibles, y, además, requiere de una definición manual previa de las coordenadas conformacionales. Para abordar este problema, se ha propuesto un método basado en la simulación metadinámica (MDT). La energía asociada a las fuerzas atómicas se expresa mediante un potencial Gaussiano: 𝑉𝑏𝑖𝑎𝑠 =෍𝑘𝑖exp(−𝛼𝑖Δ𝑖 2) 𝑛 𝑖 Siendo 𝑘𝑖 la fuerza de empuje, 𝛼𝑖 el parámetro que determina la forma de los potenciales y Δ𝑖 2 las variables colectivas. De manera, que esta expresión de energía genera fuerzas a nivel atómico que son incluidas como fuerzas adicionales en las simulaciones MTD. 22 La generación de conformaciones se lleva a cabo a nivel GFNn-xTB (Geometries, Frequencies and Noncovalent interactions extended Tight-Binding) dentro del algoritmo iMTD- GC. El enfoque se basa en métodos semiempíricos y proporciona cálculos rápidos y robustos.1 5. RESULTADOS 5.1 PROCEDIMIENTO En primer lugar, se empleó el programa CREST para realizar una búsqueda conformacional de la molécula de amoxicilina 3 , encontrándose un total de 85 confórmeros. Seguidamente, con Gaussian16, se llevó a cabo su optimización con el funcional híbrido de correlación de intercambio B3LYP con la corrección empírica de dispersión GD3-BJ junto con el conjunto de bases estándar 6-311++G (d, p). Se obtuvo la energía libre de Gibbs de cada confórmero, así como sus constantes de rotación y sus componentes del momento dipolar, en MHz y Debyes respectivamente. Se realizó una tabla en Excel en la que se recogían todos estos parámetros, en ella se expresó la energía relativa respecto a la del confórmero más estable (en cm-1). Durante el proceso de optimización, se encontró que algunos confórmeros convergían en la misma estructura, lo que significa que representaban el mismo confórmero. De modo que se procedió a eliminar dichas estructuras duplicadas, dejando un total de 54 confórmeros. Con objeto de comprobar que los confórmeros obtenidos son mínimos de la SEP se hizo un cálculo de frecuencias dentro de la aproximación armónica que además nos proporciona datos termodinámicos relevantes como la energía de Gibbs necesaria para predecir la población relativa de los distintos confórmeros. En esta memoria se dan los detalles para los 16 confórmeros de menor energía (<800 cm-1). Por último, haciendo uso del paquete Multiwfn38 se pudieron visualizar las interacciones intramoleculares tales como enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals que actúan en los diferentes confórmeros seleccionados. 5.2 ETIQUETADO DE CONFORMEROS Es necesario describir la nomenclatura utilizada para los diferentes confórmeros antes de presentar los resultados y su correspondiente análisis. Se ha considerado por una parte el 2-amino-2-(4-hidroxifenil) acetamido (parte roja) y el biciclo (parte azul) como se muestra en la siguiente imagen: 3 ácido (2S,5R,6R)-6-[(2R)-2-amino-2-(4-hidroxifenil) acetamido]-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1-azabiciclo [3.2.0] heptano-2-carboxílico 23 Figura 9. Molécula de amoxicilina En cuanto a la variación de la 2-amino-2-(4-hidroxifenil) acetamido se han realizado las proyecciones de Newman correspondientes, considerándose el grupo hidroxilo como R: Tabla 1. Proyecciones de Newman Anti (R) Anti (S) Gauche (R) g 𝜶 Gauche (S) G β Gauche (R) g β Gauche (R) G β Gauche (S) G 𝜶 Para llevar a cabo la nomenclatura de las proyecciones de Newman se han considerado la posición del grupo R con respecto a la del O del enlace C=O. Se ha respetado S en sentido de las agujas de reloj y R en sentido anti horario. Por otra parte, G y g hacen referencia a la posición del grupo R, siendo G cuando R se encuentra arriba y g cuando R se encuentre abajo. Las letras 𝛼 y β indican el grupo que se encuentra en la misma posición que el O del enlace C=O, siendo 𝛼 cuando este grupo sea la amina y β cuando el grupo que ocupa esa posición es el H. 24 En cuanto a los anillos de cuatro y cinco átomos (Círculo azul) se encuentran dos orientaciones distintas; plegado cuando un metilo se orienta hacia arriba y el otro hacía abajo, y Torsionado cuando ambos metilos se orientan hacia arriba. Tabla 2. Nomenclatura del biciclo plegado Torsionado Los hidrógenos de la amina primaria pueden estar orientados de dos formas etiquetado como up o Down: Tabla 3. Nomenclatura de la amina primaria Up Down Médium up (m up) Por otro lado, el grupo hidroxilo y el ácido carboxílico pueden estar orientados de dos formas etiquetado como a o b (hidroxilo) y A o B (grupo ácido): Tabla 4. Posible nomenclatura de los grupos hidroxilo y COOH Ácido carboxílico Hidroxilo A B a b 25 A continuación se inserta en la Tabla 5 en la que se recoge el etiquetado final de los confórmeros: Tabla 5. Nomenclatura de confórmeros Los conformeros 9 y 10 tienen la misma proyección de Newman: Anti (S). Se diferencian en la posción de los ciclos, así como en la orientación del grupo OH del hidroxílo. Confórmero 9 Anti (S) plegado aB up Confórmero 10 Anti (S) torsionado bB up Tabla 5. Nomenclatura de confórmeros El conformero 5 tiene la siguiente proyección de Newman: Gauche (S) G β. Confórmero 5 Gauche (S) G β torsionado bB Down 32 Tabla 6. Parámetros energéticos y rotacionales obtenidos con el método B3LYP‐D3/6‐311G++G(d, p) para los 16 confórmeros más estables de la amoxicilina Confórmero 5 Confórmero 6 Confórmero 7 Confórmero 8 ENERGÍA E / Hartrees -1560.18503 -1560.18484 -1560.18479 -1560.18454 Erel / cm-1 393.72 435.70 445.42 501.50 ΔEGibbs / cm-1 74.0 225.4 723.8 86.5 CTES DE ROTACIÓN A / MHz 485.79 474.54 311.09 490.73 B / MHz 91.93 94.02 168.73 91.65 C / MHz 89.03 90.31 133.94 88.84 MTO DIPOLAR μa / D -1.18 -2.02 -0.60 -0.06 μb / D 1.01 1.30 2.75 3.33 μc / D -4.15 -3.69 0.59 -2.77 μt / D 4.43 4.40 2.88 4.33 33 Tabla 6. Parámetros energéticos y rotacionales obtenidos con el método B3LYP‐D3/6‐311G++G(d, p) para los 16 confórmeros más estables de la amoxicilina Confórmero 9 Confórmero 10 Confórmero 11 Confórmero 12 ENERGÍA E / Hartrees -1560.18441 -1560.18388 -1560.18388 -1560.18362 Erel / cm-1 530.49 645.23 645.23 703.77 ΔEGibbs / cm-1 365.9 367.8 368.7 444.4 CTES DE ROTACIÓN A / MHz 316.04 314.27 314.27 469.39 B / MHz 157.69 157.07 157.09 89.78 C / MHz 128.62 121.84 121.85 83.54 MTO DIPOLAR μa / D -0.84 -2.69 2.69 2.29 μb / D -4.95 -5.56 5.56 2.06 μc / D 1.22 -1.11 -1.11 1.97 μt / D 5.17 6.28 6.27 3.65 34 Tabla 6. Parámetros energéticos y rotacionales obtenidos con el método B3LYP‐D3/6‐311G++G(d, p) para los 16 confórmeros más estables de la amoxicilina Confórmero 13 Confórmero 14 Confórmero 15 Confórmero 16 ENERGÍA E / Hartrees -1560.18340 -1560.18337 -1560.18335 -1560.18323 Erel / cm-1 750.89 758.39 761.47 787.96 ΔEGibbs / cm-1 713.3 449.3 808.5 415.0 CTES DE ROTACIÓN A / MHz 312.59 479.39 313.27 313.91 B / MHz 156.68 88.51 154.26 158.24 C / MHz 126.21 82.85 123.58 122.75 MTO DIPOLAR μa / D -2.83 0.42 2.08 1.04 μb / D -4.27 3.66 4.93 4.57 μc / D -0.93 0.47 -3.21 -3.13 μt / D 5.21 3.72 6.24 5.63 35 Además, se realizó también estudio de poblaciones relativas para esos confórmeros. La población de un confórmero relativo al confórmero más estable se calcula utilizando la siguiente fórmula: 𝑁𝑖=𝑒−∆𝐺 𝐾𝑇 ⁄ Siendo ∆𝐺 la energía de Gibbs relativa al confórmero más estable medida, K la constante de Boltzmann () y T la temperatura (en este caso utilizamos la temperatura ambiente= 278K). Tabla 7. Valores de poblaciones relativas a 278 K para cada confórmero CONFÓRMEROS ΔG/cm-1 POBLACIÓN 1 81.4 0.675 2 0.0 1.000 3 76.8 0.690 4 196.6 0.387 5 74.0 0.700 6 225.4 0.337 7 723.8 0.030 8 86.5 0.659 9 365.9 0.171 10 367.8 0.169 11 368.7 0.168 12 444.4 0.117 13 713.3 0.032 14 449.3 0.114 15 808.5 0.020 16 415.0 0.135 Las variaciones energéticas entre los confórmeros se explican por las posibles interacciones que estabilizan el sistema, por lo que procederemos a analizar estas interacciones dentro de la molécula. De modo que se realizó el análisis energético (NCI y QTAIM) de los confórmeros. Asimismo, para el más estable se realizó un gráfico de dispersión. A continuación, insertan los resultados obtenidos: 36 CONFÓRMERO 1 NCI Figura 11. Diagrama de dispersión de interacción no covalente (NCI) para el confórmero 1 CONFÓRMERO 1 QTAIM Figura 12. Análisis QTAIM del confórmero 1 En el confórmero Amox Bend cis aB, al cual nos referiremos como confórmero 1, aparecen diversos puntos críticos de enlace y de anillo que ponen de manifiesto una red de interacciones intramoleculares que contribuyen a la estabilización de este confórmero. Entre estos destacan interacciones C-H···π, interacciones NH···S y contactos S···π. Estos se corresponden con interacciones de naturaleza diversa, probablemente con gran contribución de fuerzas dispersivas. En cuanto al análisis NCI pone de manifiesto la existencia de fuerzas repulsivas y fuerzas atractivas débiles no contempladas por el método QTAIM. Este tipo de interacciones se observan también en otros confórmeros analizados como se ve en las figuras que se muestran a continuación. 37 Figura 13. Análisis energético del confórmero 2 Figura 14. Análisis energético del confórmero 3 CONFÓRMERO 2 NCI QTAIM CONFÓRMERO 3 NCI QTAIM 38 CONFÓRMERO 4 NCI QTAIM Figura 15. Análisis energético del confórmero 4 CONFÓRMERO 5 NCI QTAIM Figura 16. Análisis energético del confórmero 5 CONFÓRMERO 6 NCI QTAIM Figura 17. Análisis energético del confórmero 6 39 CONFÓRMERO 7 NCI QTAIM Figura 18. Análisis energético del confórmero 7 CONFÓRMERO 8 NCI QTAIM Figura 19. Análisis energético del confórmero 8 CONFÓRMERO 9 NCI QTAIM Figura 20. Análisis energético del confórmero 9 40 CONFÓRMERO 10 NCI Q<TAIM Figura 21, Análisis energético del confórmero 10 CONFÓRMERO 11 NCI QTAIM Figura 22. Análisis energético del confórmero 11 CONFÓRMERO 12 NCI QTAIM Figura 23. Análisis energético del confórmero 12 41 CONFÓRMERO 13 NCI QTAIM Figura 24. Análisis energético del confórmero 13 CONFÓRMERO 14 NCI QTAIM Figura 25. Análisis energético del confórmero 14 CONFÓRMERO 15 NCI QTAIM Figura 26. Análisis energético del confórmero 15