Síntesis y caracterización de polímeros recombinantes para terapias génicas dirigidas

1 Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Síntesis y caracterización de polímeros recombinantes para terapias génicas dirigidas Autora: Mónica Queipo Riera Tutor/es: Dr. Francisco Javier Arias Vallejo Dra. Alessandra Girotti 2 AGRADECIMIENTOS Quiero dar las gracias a todas aquellas personas que han hecho posible la realización de este trabajo, así como las que me han apoyado para sacarlo adelante durante todos estos meses. Gracias a mis tutores, Javier y Alessandra, por los consejos y las respuestas a todas mis preguntas, así como la ayuda prestada y los conocimientos que he adquirido sobre un campo fascinante del que sabía muy poco. Gracias a Sara por ser mi red y mi apoyo, por la cantidad de horas dedicadas a ayudarme, y por ser como una hermana en la ciencia durante todos estos meses. A Irene, por las traducciones “químicabiología” en las primeras semanas, y por tantos consejos de cara al futuro que tanto me han servido y servirán. A Sandra, por estar dispuesta ayudarme en cualquier momento y situación con tanto cariño sin pedir nada a cambio. Y a Alejandro, por amenizar estos meses y compartir conmigo nuestra primera experiencia en esta rama. Y, por supuesto, gracias a mi familia y mis amigos por todo el apoyo día a día, la comprensión y los ánimos incansables. Haber llegado hasta aquí es gracias a vosotros. 3 ÍNDICE 1. RESUMEN ................................................................................................ 5 2. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 6 2.1. INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOMATERIALES ........................................................................6 2.2. CLONACIÓN GÉNICA ..........................................................................................................7 2.2.1. Herramientas enzimáticas para la clonación .............................................................8 2.3. ELASTINA ...........................................................................................................................9 2.3.1. Polímeros tipo elastina (ELP) .....................................................................................9 2.3.2. Polímeros recombinantes tipo elastina (ELR) ..........................................................10 2.4. POLIPLEXOS .....................................................................................................................11 2.5. APLICACIONES BIOMÉDICAS DE LOS POLIPLEXOS CON ELRs: CÁNCER...........................12 2.5.1. Fragmento scFv: direccionamiento ..........................................................................12 3. OBJETIVOS ..............................................................................................14 4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................15 4.1. MATERIALES ....................................................................................................................15 4.1.1. Reactivos químicos ..................................................................................................15 4.1.2. Disoluciones tamponadas ........................................................................................15 4.1.3. Disoluciones de teñido ............................................................................................16 4.1.4. Materiales de biología molecular ............................................................................16 4.1.5. Vectores plasmídicos ...............................................................................................18 4.1.6. Plásmidos empleados para la introducción de insertos ...........................................19 4.1.7. Enzimas ....................................................................................................................21 4.1.8. Kits para el tratamiento de DNA ..............................................................................22 4.2. MÉTODOS ........................................................................................................................22 4.2.1. Electroforesis en gel ................................................................................................22 4.2.2. Digestión de DNA mediante enzimas de restricción ................................................26 4.2.3. Defosforilación de DNA ...........................................................................................26 4.2.4. Reacción de ligación de DNA en el proceso de clonación ........................................27 4.2.5. Transformación en cepas bacterianas .....................................................................27 4.2.6. Crecimiento de bacterias en medio líquido .............................................................29 4.2.7. Purificación de DNA plasmídico ...............................................................................29 4.2.8. Identificación y análisis de los fragmentos de DNA .................................................31 4.2.9. Determinación de la concentración y la pureza de los fragmentos de DNA ............32 4.2.10. Secuenciación del DNA ............................................................................................32 4.2.11. Preparación de muestras para electroforesis SDS-PAGE .........................................33 4 4.2.12. Bioproducción de polímeros recombinantes ...........................................................34 4.2.13. Purificación de polímeros recombinantes ...............................................................36 4.2.14. Caracterización físico-química de polímeros recombinantes ..................................38 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................41 5.1. CONSTRUCCIÓN DEL GEN pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6...................................................41 5.2. Descripción de la construcción del gen pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 ..............................42 5.2.1. Síntesis experimental del gen pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 .....................................43 5.3. BIOPRODUCCIÓN DE ELR .................................................................................................49 5.3.1. Optimización de la bioproducción del recombinámero P12VOKH6 .........................49 5.3.2. Bioproducción del polímero recombinante .............................................................50 5.3.3. Purificación del polímero recombinante P12VOKH6 ...............................................51 5.4. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE ELR ..................................................................53 5.4.1. FT-IR .........................................................................................................................53 5.4.2. Espectrometría de masas: MALDI-TOF ....................................................................54 5.4.3. Cromatografía de exclusión molecular en columna .................................................55 5.4.4. Espectroscopía DLS (Dynamic light scattering) ........................................................56 5.4.5. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) ........................................57 5.4.6. Análisis de aminoácidos por HPLC ...........................................................................58 6. CONCLUSIONES .......................................................................................59 7. PERSPECTIVAS DE FUTURO ......................................................................59 8. BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................60 9. ABREVIATURAS .......................................................................................62 ANEXO I 64 5 1. RESUMEN La elastina, por sus propiedades elásticas y resistentes, es una de las proteínas naturales de mayor interés en la ciencia de los biomateriales. El análisis de su estructura reveló una relación entre dicha estructura y las cualidades físico-químicas de la molécula, lo que despertó el interés por la síntesis de polímeros recombinantes tipo elastina (ELR) obtenidos mediante ingeniería genética. Estos biopolímeros, caracterizados por su biocompatibilidad, son excelentes candidatos para llevar a cabo numerosas funciones como biomateriales en el campo de la Biomedicina. En este trabajo se ha diseñado, utilizando técnicas de Ingeniería genética, un nuevo gen recombinante que codifica para el polímero tipo elastina scFv(EpCAM)-VOK-H6, que podrá ser bioproducido en trabajos posteriores para estudiar su potencial como biomaterial en aplicaciones biomédicas. Para su síntesis, se han utilizado diferentes cepas de la bacteria Escherichia coli (E. coli) por su sencilla maquinaria de replicación y traducción de DNA. Por otra parte, se ha sintetizado y purificado el recombinámero tipo elastina scFv(P12)-VOK-H6 (también nombrado P12VOKH6), cuya estructura permite la formación de poliplexos estables capaces de albergar moléculas de DNA plasmídico terapéutico. Este polímero, por lo tanto, tiene un excelente potencial como biomaterial en aplicaciones biomédicas, en concreto en terapias anticancerígenas dirigidas. El mencionado polímero se ha caracterizado físico-químicamente mediante diferentes técnicas: electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), espectroscopía de infrarrojo (FT-IR), espectrometría de masas (MALDI-TOF), dispersión dinámica de la luz (DLS), cromatografía en fase sólida de exclusión por tamaños, resonancia magnética nuclear (RMN) y análisis de aminoácidos por HPLC. ABSTRACT Elastin, due to its elastic and resistant properties, is one of the natural proteins of greatest interest in biomaterials science. Analysis of its structure revealed a correlation between this structure and the physicochemical properties of the molecule, which sparked interest in the synthesis of genetically engineered elastin-like recombinant polymers (ELR). These biopolymers, characterized by their biocompatibility, are excellent candidates to perform numerous functions as biomaterials in the field of biomedicine. In this project a new recombinant gene encoding for the elastin-like polymer scFv(EpCAM)-VOK-H6 was designed using genetic engineering techniques. This polymer can be bioproduced in subsequent work to study its potential as a biomaterial in biomedical applications. For its synthesis, different strains of E. coli bacteria were used due to their simple DNA replication and translation machinery. Moreover, the elastin-like recombinamer scFv(P12)-VOK-H6 (also named P12VOKH6), whose structure allows the formation of stable polyplexes capable of harboring therapeutic plasmid DNA molecules, was synthesized and purified. This polymer, therefore, has excellent potential as a biomaterial in biomedical applications, especially in targeted anticancer therapies. The polymer has been physico-chemically characterized by different techniques: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), Fourier transform infrared (FT-IR), mass spectrometry (MALDI-TOF), dynamic light scattering spectroscopy (DLS), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and and amino acid analysis by HPLC. 6 2. INTRODUCCIÓN 2.1. INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOMATERIALES La genética molecular, como una contribución importante en el ámbito de la biología molecular, se basa en el “Dogma central de la genética molecular” introducido por Francis Crick (Figura 1), que describe el proceso por el cual la información genética contenida en la secuencia de DNA sufre un proceso de transcripción para dar lugar al RNA que, a su vez, se somete a un proceso de traducción que da lugar a las proteínas. De este modo, cada uno de estos tres elementos aporta la información necesaria para la síntesis del siguiente1. Por su parte, la Ingeniería genética puede entenderse como el proceso de la utilización de la tecnología del DNA recombinante (rDNA) para alterar la composición genética de un organismo. Dicha tecnología ha evolucionado a un campo enorme donde es posible clonar genomas, modificarlos y transmitirlos de una célula a otra2, utilizando técnicas abarcadas por todas las ramas mencionadas. El acercamiento entre las diferentes ramas implicadas en el estudio de la biología molecular ha permitido que investigadores de muchas áreas biológico-médicas hayan basado sus estudios en el DNA recombinante. Esto ha derivado en la aparición de áreas de conocimiento como la biomedicina y la ciencia de los materiales para aplicaciones biomédicas, cuya contribución a la medicina actual es cada vez mayor gracias a los avances científicos en terapias génicas, entendidas como el uso de la ingeniería genética para tratar o diagnosticar enfermedades3. Los Biomateriales se definen como sustancias naturales o sintéticas no farmacológicas que pueden ser utilizadas en el campo de la biomedicina pretendiendo observar, curar, mejorar o reemplazar un órgano, tejido o función mediante su uso como implantes, medios terapéuticos, dispositivos diagnósticos4, etc. Por lo tanto, una de las características más importantes que deben poseer estos biomateriales es la biocompatibilidad, es decir, su estructura y propiedades físico-químicas deben permitirle llevar a cabo sus funciones sin afectar negativamente al organismo5. Ello implica que no sean tóxicos ni causen rechazo por el sistema inmune, que sean estables químicamente, que sus productos de degradación sean bioinertes y que posean buenas características mecánicas6. Figura 1. Representación esquemática del Dogma central de la genética molecular 7 Una aplicación muy importante en este campo es el estudio de polímeros que puedan ser utilizados como vehículos en terapias génicas dirigidas. Los polímeros son compuestos químicos, naturales o sintéticos, formados por polimerización y que consisten, esencialmente, en unidades estructurales repetidas llamadas monómeros7. La combinación de diferentes polímeros puede llegar a ser muy útil a la hora de desarrollar biomateriales que realicen funciones específicas sin interferir con otras funciones del organismo. Entre los polímeros de nueva generación encontramos los proteicos, que se inspiran en las proteínas naturales, y pueden utilizarse para aplicaciones biomédicas. 2.2. CLONACIÓN GÉNICA La síntesis de biopolímeros que puedan ser utilizados como biomateriales para aplicaciones biomédicas debe diseñarse de forma cuidadosa. Un método prometedor de síntesis que está adquiriendo gran importancia es la biosíntesis, es decir, el empleo de microorganismos como biorreactores que utilicen material genético recombinante para obtener los productos deseados. Este proceso se lleva a cabo partiendo de la clonación génica. Se define como Clonación génica a la técnica de ingeniería genética por la cual se obtienen clones idénticos de determinado gen. En el caso de este trabajo, el objetivo es producir grandes cantidades de un polímero para formar posteriormente un poliplexo (apartado 2.4.). El proceso comienza por la identificación del gen a aislar, que se extrae del cromosoma en el que se encuentra mediante digestión enzimática, se aísla y se purifica. El gen aislado (representado en rojo, Figura 28) debe unirse a un sistema vectorial que actuará como transportador de ese DNA, proceso conocido como ligación (Figura 2). En este caso, como vector se utiliza un plásmido de clonación (representado en azul, Figura 2), cuya función es favorecer la síntesis de gran cantidad de copias del gen de interés. Los plásmidos son moléculas de DNA circular de doble hebra que se encuentran naturalmente en el citosol de las bacterias. Estos son muy utilizados en ingeniería genética por su pequeño tamaño, por ser fáciles de aislar, manipular y caracterizar, y por poseer una secuencia y mapa de restricción conocidos. Figura 2. Representación esquemática de las etapas que constituyen el proceso de clonación de material genético. 8 Obtenida la molécula de DNA recombinante compuesta por el vector plasmídico y el inserto génico, se debe introducir en una célula huésped mediante el proceso conocido como transformación (Figura 2) y su cultivo en el medio adecuado. Esta célula huésped es la que actúa como biorreactor y amplifica selectivamente el gen de interés mediante la producción de gran cantidad de copias del gen. Finalmente se debe realizar una segunda clonación del inserto génico en un vector plasmídico diferente, llamado vector de expresión, seguida de una segunda transformación. La función del mencionado vector es favorecer la producción, por parte de la célula huésped, del polímero recombinante codificado por la secuencia génica. Las transformaciones pueden llevarse a cabo en distintos tipos de células huésped, dependiendo de sus características y las necesidades del proceso. En este caso se realizan transformaciones bacterianas debido a su facilidad para multiplicarse e incubarse, su sencillez y el amplio conocimiento de su genética. 2.2.1. Herramientas enzimáticas para la clonación Se puede afirmar que la tecnología del DNA recombinante se basa en la enzimología de los ácidos nucleicos. Los fragmentos de DNA que se utilizan en una clonación deben haber sido extraídos previamente de otro vector o de un cromosoma. Deben ser unidos a otros vectores durante los procesos de ligación, y ser fragmentados en los procesos de digestión. Además, son necesarios pasos intermedios de modificación de los extremos de las secuencias con el fin de favorecer las reacciones posteriores. Es decir, se requieren sistemas con una especificidad muy elevada para desempeñar estas tareas de corte y unión, cruciales en el proceso de clonación. Esta función la llevan a cabo las enzimas de restricción y de modificación como ligasas o fosfatasas. Las enzimas de restricción se denominan también endonucleasas, porque digieren secuencias internas a la cadena del DNA. Su función es cortar el DNA de doble cadena al reconocer un patrón de secuencia específico llamado secuencia diana, generando los llamados fragmentos de restricción. Las diferentes enzimas de restricción se agrupan de acuerdo con sus propiedades de reconocimiento y corte: las de tipo I y tipo III reconocen secuencias específicas pero cortan la cadena a distancias variables de las mismas; las de tipo II reconocen secuencias palindrómicas específicas y cortan siempre en el mismo punto de las mismas; las de tipo IIS son similares a las de tipo II pero las secuencias que reconocen no son palindrómicas; y las de tipo IV solo digieren cadenas de DNA modificado (por ejemplo, metilado). Se nombran con tres letras que hacen referencia al género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente (por ejemplo EcoRI de Escherichia coli), seguidas a veces por una letra más que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria), y un número romano que identifica la especificidad de la variante en el caso de que no sea la primera enzima aislada de dicha variante. Es importante elegir correctamente las enzimas a utilizar a la hora de digerir fragmentos génicos en cuanto a los extremos que generan en el corte, de manera que los fragmentos que se pretendan unir posteriormente posean extremos que sean compatibles para la unión. Las enzimas pueden 9 cortar la doble hebra generando extremos cohesivos, que dejan de dos a cuatro nucleótidos desapareados en cada extremo; o extremos romos, que no dejan bases despareadas en los extremos ya que cortan en el centro del palíndromo (Figura 3). 2.3. ELASTINA La elastina (del griego elast(o)- que significa “golpeado”, “dúctil”; e -in(a) que significa “sustancia”) es una proteína natural de la familia de las holoproteínas (ya que contiene solamente aminoácidos) que se localiza en la matriz extracelular del tejido conjuntivo de los vertebrados aportando elasticidad y resistencia. Abunda en tejidos como la piel, los pulmones, las arterias principales o el útero9. Han sido descritas varias secuencias repetitivas de aminoácidos como estructura primaria, siendo la más frecuente en la elastina el pentapéptido de secuencia Valina-Prolina-Glicina-Valina-Glicina (comúnmente expresado como VPGVG)10. La estructura de la proteína nativa se forma gracias a los entrecruzamientos formados entre las lisinas de la tropoelastina, su precursor soluble. La reticulación de la tropoelastina se inicia gracias a la acción de la enzima lisil oxidasa (LOX), y el proceso por el cual se forman las fibras elásticas de elastina a partir de su precursor es complejo y requiere la coordinación de numerosos mecanismos celulares11. Las soluciones de tropoelastina se autoagregan al aumentar la temperatura, proceso conocido como coacervación, y se ha demostrado que este proceso está impulsado por el autoensamblaje en el medio extracelular de los dominios hidrofóbicos9, que ocurre de forma reversible. Este hecho, no solo confiere a la elastina una elevada elasticidad y durabilidad, sino que hace que los polímeros tipo elastina o ELPs (elastin like polimers) sean adecuados para su aplicación como biomateriales. 2.3.1. Polímeros tipo elastina (ELP) Como se ha mencionado, los polímeros tipo elastina o elastin-like-polymers (ELPs) son polímeros polipentapeptídicos cuya secuencia de aminoácidos está basada en la de la elastina natural. Su composición en aminoácidos más común está formada por la repetición del pentapéptido (VPGXG)n, donde X es cualquier aminoácido menos prolina. Se ha demostrado que el polipentapéptido (VPGPG)n en el que la prolina (P) ocupa la cuarta posición desestabiliza la estructura secundaria impidiendo el correcto plegamiento necesario para formar la estructura cuaternaria y, por tanto, neutralizando las propiedades de interés del polímero12. Según las investigaciones de D. W. Urry acerca de este tipo de polímeros, los ELPs experimentan una transición inversa desde un estado de mayor a menor desorden al aumentar la temperatura. Figura 3. Representación de enzimas (SmaI y EcoRI) que generan extremos romos y cohesivos, respectivamente, en la digestión de una secuencia de nucleótidos. 16 - Tango Buffer 10x: 33 mM Tris-acetato, 10 mM acetato de magnesio, 66 mM acetato de potasio, 0.1 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA); pH 7.9. - Buffer SAP 10x: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2; pH 9.0. - Buffer DNA ligasa 10x: 300 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1mM ATP; pH 7.8. - Tampón de sonicación: 20 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF; pH 8.0. - Buffer de lavado de bacterias: Tris-base 20 mM, NaCl 140 mM, pH 8. - Buffer de lisis o de sonicado: Tris-base 20 mM, EDTA 1mM, PMSF 1mM, pH 8 - MES Buffer (Columna Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin): 20 mM 2-(N-morpholine)- ethanesulfonic acid, NaCl 0.1 M; pH 5. - Buffer de equilibrado (Columna Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin): guanidina-HCl 3M, imidazol 10 mM, en PBS; pH 7. - Buffer de lavado en gradiente 1 (Columna Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin): guanidina-HCl 3M, imidazol 25 mM, 10 mM DTT en PBS; pH 7.4. - Buffer de lavado en gradiente 2 (Columna Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin): imidazol 25 mM, en PBS; pH 7.4. - Buffer de elución (Columna Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin): imidazol 250 mM, en PBS; pH 7.4. 4.1.3. Disoluciones de teñido 4.1.3.1. Geles de poliacrilamida - Azul brillante de Coomasie: el Azul de Coomasie se une a muchos tipos de aminoácidos. Se prepara en una disolución de 0.1% de Azul de Coomasie, 40% metanol, 10% ácido acético y 50% agua. Se elimina el exceso de tinte en una disolución de 40% metanol, 10% ácido acético y 50% agua. - Disolución de teñido de cobre (II); CuCl2. Se prepara una disolución 0.2M de CuCl2 en agua destilada. Se destiñe con agua destilada. 4.1.3.2. Geles de agarosa - Disolución de teñido para gel de agarosa. Se prepara una disolución del 0.005% de colorante SYBR Safe en Buffer TAE 1x. 4.1.4. Materiales de biología molecular 4.1.4.1. Cepas bacterianas En este trabajo se utilizaron cepas bacterianas de E. coli. - SHuffle® T7 competent E.coli (cfu/μg de pUC18 DNA ≥ 107) empleada para la expresión de proteínas o polímeros recombinantes. Esta cepa está modificada por ingeniería genética para promover el plegamiento de la proteína en el citoplasma mediante la formación de puentes disulfuro. 17 - BLR (DE3) competent Cells (Novagen); eficiencia (cfu/μg de pUC19 DNA ≥ 106) empleada para la expresión de proteínas o polímeros recombinantes. Esta cepa bacteriana genera altos rendimientos de producción a partir de plásmidos que contienen secuencias repetitivas o cuyos productos pueden causar la pérdida del profago DE3. - NZY5α Competent Grade (Nzytech; eficiencia (cfu/μg de pUC18 DNA) ≥ 109) empleada para clonación o ligación de DNA. En microbiología, cfu es un término que hace referencia al número de colonias formadas respecto a la concentración de plásmido utilizado y el volumen de bacterias sembrado en la placa. 4.1.4.2. Medios de cultivo bacteriano Las bacterias necesitan medios de cultivo específicos para su crecimiento. Estos medios se han utilizado y preparado según los protocolos optimizados para obtener el mayor rendimiento. Se han utilizado los siguientes medios: - LB (Lysogeny Broth) (Formedium™): Su composición es de 10 g/L de bactotriptona, 10 g/L NaCl y 5 g/L de extracto de levadura. El medio líquido contiene 25 g/L de LB en agua destilada; pH 7.0. Es el medio líquido para el crecimiento bacteriano de elección en la fase de clonación. - LB-agar: Se prepara en una disolución de 25 g/L del medio LB mencionado anteriormente y 15 g/L de bacto-agar; pH 7.0. Se trata del medio sólido con el cual se recubren las placas de cultivo bacteriano. El medio semisólido (50-60Cº) se vierte en las placas de cultivo bacteriano (unos 30 mL), y solidificará al enfriarse permitiendo su posterior uso para la siembra de cultivos bacterianos. - TB (Terrific Broth) (Formedium™): Su composición es de 20 g/L de triptófano, 24 g/L de extracto de levadura, 4 mL/L de glicerol, KH2PO4 0.017 M y K2HPO4 0.072 M; pH 7.0. Es el medio líquido seleccionado si se pretende aumentar la biomasa y, por lo tanto, la producción un polímero recombinante tipo elastina. - S.O.C. Medium Fisher (Bioreagents™): Se trata del medio líquido seleccionado para producir transformaciones bacterianas de manera satisfactoria. Su composición es 2% (m/v) de triptófano, 0.5% (m/v) de extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 y 20 mM Glucosa; pH 7.0. Los medios de cultivo deben ser esterilizados en ambiente húmedo mediante un ciclo de autoclave a 121°C y 1 atm de presión durante 15 minutos. Una vez atemperado el medio, se puede añadir la cantidad adecuada de antibiótico. 18 4.1.5. Vectores plasmídicos 4.1.5.1. Vector de clonación Como vector de clonación de partida se ha utilizado el plásmido pDriveAll (también nombrado como pDA), modificado por el Dr. A. Ribeiro36 en el grupo de Materiales Avanzados y Nanobiotecnología BIOFORGE a partir del vector de clonaje pDrive de Qiagen. Este plásmido ha sido modificado previamente a la realización de este trabajo, de forma que se le ha introducido una cola de histidinas para la posterior purificación del polímero por cromatografía de afinidad, ya que la histidina es el aminoácido con mayor capacidad de interacción con matrices de iones metálicos inmovilizados. Por tanto, los experimentos de clonación en este trabajo utilizan como vector de clonación de partida el pDAH6 (Figura 6). Además, contiene genes que le confieren resistencia a los antibióticos Ampicilina y Kanamicina. Este vector está constituido por 3988 pb. 4.1.5.2. Vector de expresión Como vector de expresión se ha utilizado el plásmido pET7, compuesto por el vector de expresión p7rare o pET7 (construido a partir de un pET-25b(+) (Figura 7) por la Dra. Alessandra Girotti5 en el grupo de Materiales Avanzados en Nanobiotecnología BIOFORGE) y los insertos scFV y VOK. El plásmido contiene un gen que le confiere resistencia al antibiótico Ampicilina, además de fragmentos de DNA imprescindibles para la síntesis del polímero recombinante tipo elastina que se pretende producir. En este trabajo se parte del plásmido p7rare-scFv(P12)-VOK-H6 o p7-scFv(P12)-VOK-H6 ya sintetizado. Es decir, previamente se ha construido un plásmido que contenía el inserto scFv(P12)- VOK-H6 y este ha sido introducido en el vector de expresión pET7 o p7rare mencionado. Figura 6. Representación esquemática del plásmido pDAH6. Se indican los sitios específicos de corte de las enzimas de restricción EarI, EcoRI y SapI para este plásmido. 19 4.1.6. Plásmidos empleados para la introducción de insertos En el presente trabajo se ha necesitado introducir insertos génicos en los vectores plasmídicos mencionados. Estos insertos contienen los genes que codifican los bloques cruciales para la obtención del polímero recombinante que se sintetizará posteriormente. 4.1.6.1. pD-VOK El inserto génico VOK, que adopta su nombre a partir del inserto proteico que codifica, se obtiene a partir del vector de clonación pDVOK. Este fragmento génico codifica un polímero policatiónico cuya función es interaccionar con las cargas negativas del DNA para formar un poliplexo estable. El tamaño de este inserto génico es de 1080 pb. Este fragmento proteico está constituido por la repetición de la secuencia de aminoácidos básica de los ELR con la lisina como aminoácido huésped. Esta secuencia pentapeptídica se repite un total de 72 veces, formando el polipentapéptido (VPGKG)72 (Figura 8), que le confiere un tamaño de 33 kDa. La gran cantidad de grupos amino cargados positivamente en condiciones fisiológicas gracias Figura 7. Representación esquemática del vector de expresión pET-25 modificado, denominado pET7. En rojo se representan las modificaciones del pET7 respecto del pET-25. Figura 8. Representación esquemática de la molécula del inserto VOK. Se indican el número de veces que se repite la secuencia y los aminoácidos representados, donde V es valina, P es prolina, G es glicina y K es lisina (según el código de aminoácidos de una letra). 20 a los 72 aminoácidos lisina a lo largo de la cadena polipeptídica es lo que aporta esa característica policatiónica al polímero. 4.1.6.2. Plásmidos con scFv El inserto génico scFv (single chain fragment variable) adopta su nombre a partir del inserto proteico que codifica y posee actividad reconocedora de antígeno (anticuerpo). Todos los fragmentos proteicos scFv poseen la característica común de tener 4 L-cisteínas (C) capaces de formar dos puentes disulfuro formando la estructura terciaria de la proteína y generando así su conformación nativa y activa. En este trabajo se utilizan dos plásmidos que contienen fragmentos de scFv distintos. 4.1.6.2.1. Plásmido PUC57-scFv(EpCAM) Este inserto génico se obtiene a partir del vector pUc57-scFv(EpCAM) ya construido, adquirido comercialmente, y está constituído por 762 pb. Este fragmento génico codifica para el fragmento de anticuerpo que se une de manera específica al antígeno EpCAM (Epithelial Cell adhesión molecule), el cual se encuentra sobreexpresado en tejidos de carcinomas de colon en humanos34. La secuencia de aminoácidos del fragmento proteico scFv(EpCAM) es la siguiente (aparecen marcadas en amarillo las cuatro cisteínas que permiten el plegamiento de la proteína): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVELKRATPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGSEVQLVQSG PGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASA AYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSS 4.1.6.2.2. Plásmido PUC57-scFv(P12) Este inserto se obtiene a partir del vector de clonación pUc57-scFv(P12) ya construido, adquirido comercialmente, y está constituido por 720 pb. Este fragmento génico codifica para el fragmento de anticuerpo que se une de manera específica al antígeno Tenascina C, una proteína que se encuentra sobreexpresada en tejidos tumorales en cánceres de mama33. La secuencia de aminoácidos de la proteína scFv(P12) es la siguiente (aparecen marcadas en amarillo las cuatro cisteínas que permiten el plegamiento de la proteína): VEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYSMSWVRQAPGKGLEWVSAITGTGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSEL TQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRRQPASWYQQKPGQAPVLVIYYKKLRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTI TGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPVVFGGGTKLTVLG 21 4.1.7. Enzimas Se utilizaron diferentes tipos de enzimas para el tratamiento y manipulación del DNA plasmídico. Para el uso de todas ellas se siguió cuidadosamente el protocolo correspondiente (Thermo Fisher®) y se utilizó su correspondiente tampón o buffer. 4.1.7.1. Enzimas de restricción Las enzimas de restricción son proteínas endonucleasas con actividad catalítica nucleasa, es decir, catalizan la reacción de hidrólisis de enlaces fosfodiéster en secuencias de pares de bases muy específicas, originando diferentes fragmentos de restricción a partir de un fragmento de DNA. En este trabajo se emplearon enzimas de restricción de tipo II y de tipo IIS. A continuación, se muestran las enzimas de restricción de tipo II que se han utilizado (Tabla 1). Tabla 1. Enzimas de restricción. Se muestran sus secuencias diana y su uso principal en este trabajo. Enzima de restricción Secuencia diana Tampón o buffer Uso en este trabajo EcoRI 5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’ Green Buffer Fast Digest 10x Digestiones analíticas: Identificación cualitativa de fragmentos de DNA. EarI 5’ C T C T T C N N N N 3’ 3’ G A G A A G N N N N 5’ Digestiones analíticas: Green Buffer Fast Digest 10x Digestiones preparativas: Tango Buffer 10x Digestiones analíticas: Identificación cualitativa de fragmentos de DNA. Digestiones preparativas: Extracción de inserto en pDA. SapI 5’ G C T C T T C N N N N 3’ 3’ C G A G A A G N N N N 5’ Tango Buffer 10x Digestiones preparativas: Linealización de plásmidos. VspI 5’ A T T A A T 3’ 3’ T A A T T A 5’ Tango Buffer 10x Digestiones analíticas: Identificación cualitativa de fragmentos de DNA. Digestiones preparativas: Digestión de plásmidos. XbaI 5’ T C T A G A 3’ 3’ A G A T C T 5’ Green Buffer Fast Digest 10x Digestiones analíticas: Identificación cualitativa de fragmentos de DNA. 4.1.7.2. Enzimas de modificación En este apartado se hace referencia a otras enzimas (tipo IIS) que han sido utilizadas en este trabajo pero que no tienen la mencionada actividad endonucleasa, sino que cumplen otras funciones. Son las siguientes: - T4 DNA Ligase. Enzima con actividad ligasa. Su función es catalizar la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3’ y 5’ de una cadena de DNA linealizada. - FastAP (Thermosensitive Alkaline Phosphatase). Enzima fosfatasa de la familia de las esterasas. Su función es catalizar la reacción de defosforilación de fragmentos de DNA, es 22 decir, aumentar la velocidad de reacción de hidrólisis de los grupos fosfato del DNA, evitando así su linealización sin haber incorporado el inserto en la reacción de ligación. 4.1.8. Kits para el tratamiento de DNA Dado que en este trabajo se pretende obtener biopolímeros con características concretas que cumplan funciones específicas, cabe destacar la importancia de trabajar con fragmentos de DNA puros de secuencias y concentraciones conocidas. Para asegurar que esto se cumpla, se trabaja con kits que contienen protocolos previamente optimizados por la marca comercial con el objetivo de garantizar la eficacia del procedimiento experimental. Estos kits son: - NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid) (Macherey-Nagel). Se utiliza para la purificación de pequeñas muestras de DNA plasmídico a partir del cultivo bacteriano previo (5-10mL). El fundamento teórico en que se basa la técnica se explica en el apartado 4.2.7.1. - PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen, Life Technologies). Se utiliza para la purificación de DNA a partir de una banda de gel de agarosa. El fundamento teórico en que se basa la técnica se explica en el apartado 4.2.7.2. 4.2. MÉTODOS 4.2.1. Electroforesis en gel La electroforesis en gel es un método empleado para separar macromoléculas en función de su tamaño, carga eléctrica y otras propiedades como su conformación. La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte con objeto de evitar perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. Los medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas de la muestra gracias a la tensión eléctrica aplicada, quedando la muestra embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación. 4.2.1.1. Electroforesis de DNA en gel de agarosa En concreto, la electroforesis de DNA en geles de agarosa (Figura 9) permite la separación de DNA, plásmidos o fragmentos génicos en base a su tamaño. Figura 9. Representación esquemática de una electroforesis de DNA en gel de agarosa. 23 La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal que forma fibras helicoidales al solidificar, creando una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y >200 nm. El tamaño de estos canales puede ser controlado variando la concentración y tipo de agarosa. Se emplean para separar moléculas de diferentes rangos con un peso molecular desde 20 pb hasta más de 20 kbases. En la Tabla 2 se puede observar la gama de tamaños de los fragmentos de DNA y el porcentaje de agarosa óptimo. % (m/v) de agarosa SeaKem® en el gel (disuelta en Buffer TAE) Rango de tamaños de los fragmentos de DNA medido en pares de bases 0.75 10000-15000 1.0 500-10000 1.25 300-5000 1.5 200-4000 2.0 100-2500 2.5 50-1000 El disolvente es un tampón Buffer TAE, un tampón de separación cuyo pH de 8 permite que los grupos fosfato de las moléculas de DNA se encuentren cargados negativamente asegurando que la carga de las moléculas sea constante e idéntica, y por tanto garantizando la separación única y exclusivamente en función del tamaño de las mismas. El gel de agarosa se prepara según el porcentaje óptimo de polímero (Tabla 2) disolviéndolo en la cantidad adecuada de Buffer TAE. Se calienta después hasta los 50°-60° C para obtener una mezcla homogénea, y por último se vierte en un formador con el peine adecuado que generará los pocillos donde se introducirán las muestras. Cuando el gel solidifica, se dispone en una cámara de electroforesis y se integran las muestras en un tampón de carga (DNA Loading Buffer) cuyas funciones son mantener el pH en un valor de 8 y seguir del avance de la electroforesis gracias al frente del colorante Azul de Bromofenol. Entonces se cargan las muestras y un marcador de referencia (apartado 4.2.8). A continuación, los geles se someten a un voltaje fijo comprendido entre 2 y 7 V/cm que distan los electrodos según la electroforesis sea preparativa (menor voltaje) o analítica (mayor voltaje). Esto depende de la finalidad con la que se realice la electroforesis: analítica, con el fin de identificar fragmentos cualitativa y cuantitativamente para comprobar el éxito de una reacción previa; o preparativa, con el fin de aislar, extraer y purificar un determinado fragmento de DNA contenido en una banda del gel (el proceso de purificación se explica en el apartado 4.2.7.2). En las electroforesis preparativas es mucho más importante la resolución, por tanto se busca que las bandas se desplacen lentamente y por ello el voltaje usado es menor que en las electroforesis analíticas. La electroforesis finaliza cuando los colorantes de referencia alcanzan una posición concreta en el gel. Tabla 2. Porcentaje óptimo de agarosa en el gel de electroforesis en función del tamaño del fragmento de DNA a analizar en pares de bases. 24 Terminada la electroforesis, el gel se tiñe con la disolución de teñido para gel de agarosa (apartado 4.1.3.2), que contiene un marcador fluorescente de DNA (fluoróforo protegido bajo patente) que es capaz de intercalarse entre las bases nitrogenadas del DNA en Buffer TAE durante unos minutos. Posteriormente, el gel puede ser observado empleando un transiluminador de luz UV Gel Doc™ EZ Imager. 4.2.1.2. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE discontinuo) En este trabajo se utilizan geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDSPAGE) para la separación e identificación de proteínas. El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida (Figura 10). Regulando sus concentraciones y proporciones se consiguen diferentes porosidades, que determinarán el avance de las moléculas de la muestra. Para que los componentes tengan una relación masa/carga constante, se añade un detergente aniónico (SDS). Cada molécula de detergente se une a dos aminoácidos, de modo que las moléculas que contengan el mismo número de aminoácidos se desplazarán a la misma velocidad. Además, el complejo SDS-proteína está cargado negativamente, por tanto, la carga de la proteína no afectará a su velocidad de avance. Otra de las funciones que tiene este detergente, unido al βmercaptoetanol, es la de desnaturalizar las proteínas de modo que se mantengan en su forma lineal. Todo este mecanismo conjunto provoca que la velocidad de desplazamiento de las moléculas dependa únicamente de su masa. Existe una expresión que relaciona linealmente el logaritmo de la masa molecular de la proteína con su Rf (factor de retraso), donde: 𝑅𝑓 =𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑔𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 (𝑐𝑚) 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑐𝑚) Figura 10. Mecanismo radicalario de formación de poliacrilamida. 25 Siendo así, se puede comparar el logaritmo de la masa molecular con el Rf y determinar la masa molecular de las proteínas en la muestra. Este gel de poliacrilamida requiere dos medios diferentes: un gel compactador, con menor concentración de acrilamida y menor pH, cuya función es permitir la formación del frente de proteínas en una banda compacta; y un gel de resolución con mayor concentración de acrilamida y mayor pH, cuya función es permitir el avance de las proteínas y su separación por tamaño. El gel compactador se prepara mezclando agua ultrapura, Tris 0.5M (pH=6.8), acrilamida al 40% (m/v), SDS al 10% (m/v), persulfato de sodio al 10% (m/v) y TEMED o TMEDA. El persulfato de sodio y el TEMED reaccionan para dar lugar a una especie radicalaria. Este iniciador reacciona a su vez con la acrilamida formando la mencionada malla tridimensional. Esto da lugar a una mayor rigidez en el enrejado polimérico del gel. El gel de resolución se prepara con los mismos reactivos que el gel concentrador variando la concentración y el pH del Tris (1.5M; pH=8.8). Las cantidades que se añaden a cada uno de ellos dependen del porcentaje de acrilamida del gel y del intervalo de masas moleculares en el que se encuentren las masas de las proteínas que se pretendan separar. La electroforesis se desarrolla a amperaje constante (25mA) durante aproximadamente una hora o cuando los colorantes de referencia, que poseen tanto el marcador como las muestras, alcancen el extremo del gel. Además de las muestras a analizar, debe añadirse en uno de los pocillos del gel un marcador de referencia para la identificación del peso molecular de los fragmentos proteicos. En este trabajo se utiliza el marcador NZY-Bluesafe®, una disolución que contiene fragmentos proteicos de tamaños y en cantidades perfectamente conocidos (Figura 11). De esta manera se utiliza como patrón comparativo en las electroforesis de DNA, pudiendo realizar una semicuantificación del tamaño de los fragmentos de DNA de la muestra en un intervalo entre 10 y 180 kDa. El último paso es el teñido del gel con el tinte adecuado. El Azul de Coomasie es un tinte que se une eficazmente a muchos tipos de proteínas. Su uso es limitado en proteínas con características Figura 11. Bandas del marcador NZY-Bluesafe® en gel de poliacrilamida. 32 4.2.9. Determinación de la concentración y la pureza de los fragmentos de DNA Tras una purificación de DNA, es necesario conocer la concentración de dicho DNA en disolución. Para ello se realiza un análisis de absorbancia en un espectrofotómetro de microgota NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), que permite determinar cuantitativamente la pureza de muestras génicas con un volumen de 1 μL. La absorbancia y la concentración pueden relacionarse mediante la Ley de Lambert-Beer: 𝐴 = 𝜀𝑐𝑙, donde A es la absorbancia a la longitud de onda seleccionada; ε es la absortividad molar a esa longitud de onda en mol/L; c es la concentración de la biomolécula que absorbe la radiación en mol/L; y l es el camino óptico en centímetros que recorre la radiación al pasar a través de la muestra. El espectrofotómetro es de UV-Visible de espectro completo y la radiación es emitida por dos lámparas: una de Deuterio para la zona del ultravioleta, y una de Wolframio para la zona del visible. La radiación debe atravesar un monocromador con el fin de hacer incidir sobre la muestra un haz de radiación de una sola longitud de onda. Este monocromador consta de una rendija de entrada, un sistema dispersante (red de difracción) y una rendija de salida. El espectrofotómetro es capaz de evaluar la relación de absorbancias a dos longitudes de onda diferentes. Por tanto, se pueden obtener dos índices de pureza: relación A260/A280 (absorbancia a 260 nm en relación a la corregida a 280 nm); y relación A260/A230 (absorbancia a 260 nm en relación a la corregida a 230 nm). Esto permite evaluar la pureza del DNA según la Tabla 3. Tabla 3. Grados de pureza según los valores de absorvancia en muestras de DNA medidas en NanoDrop 2000. Relación Valor (uds. absorbancia) Pureza A260/280 >2 Contaminación con RNA 1.8-2.0 DNA de pureza óptima 1.6-1.8 DNA de pureza aceptable <1.6 Presencia de aromáticos A260/230 1.5-2.2 DNA de pureza óptima <1.5 Presencia de sales, carbohidratos y fenoles Los índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como los disolventes y reactivos residuales que se utilizan normalmente en la purificación37. Es necesario utilizar un blanco para disminuir el ruido de fondo de la forma más eficazmente posible. De esta manera disminuye el límite de cuantificación (LOQ), pudiendo así detectar concentraciones más bajas sin disminuir la fiabilidad de los resultados. Como blanco se utiliza el buffer de elución con el que se haya realizado la purificación del DNA contenido en la muestra. 4.2.10. Secuenciación del DNA El objetivo de la secuenciación es conocer el orden de los monómeros que componen un polímero lineal como es, en este caso, el DNA. Del orden de nucleótidos del DNA, así como de sus bases nitrogenadas (adenina, A; guanina, G; citosina C; timina, T) se puede inferir su evolución y función, además de servir como comprobación el éxito de procesos en ingeniería genética. 33 La estrategia general implica: la degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos de interés a fragmentos suficientemente pequeños para ser secuenciados; la secuenciación propiamente dicha de estos fragmentos; y el ordenamiento de los mismos. Esto se puede llevar a cabo por distintas técnicas. En este caso se utiliza el método Sanger, el cual se basa en generar, por replicación in vitro de un DNA, segmentos copia con el mismo origen, pero distinta longitud, que se separan por electroforesis capilar. Se consigue que tengan el mismo origen utilizando primers o cebadores específicos, que reconocen una secuencia concreta hibridándose a la hebra de DNA. La DNA polimerasa elonga la cadena en sentido 5’-3’ a partir de dichos primers. Se consigue que tengan distinta longitud utilizando didesoxiNTPs, bases de DNA modificadas con fluorescencia, que actúan como terminadores, ya que su incorporación en lugar de una base convencional detiene el crecimiento del fragmento copia porque no puede reaccionar con la polimerasa. Se prepara una mezcla que contiene: bases de DNA trifosfato (A, C, G y T), DNA polimerasa, DNA primer y bases de DNA modificadas con fluorescencia (didesoxiNTPs). Se introducen en un termociclador que llevará a cabo la amplificación, y el proceso que ocurre en su interior es una consecución de calentamientos y enfriamientos que permiten la síntesis de los diferentes fragmentos de DNA. Los fragmentos de DNA sintetizados llegan al final del tubo capilar separados por tamaños y un láser permite medir la fluorescencia de la base modificada terminadora de cada fragmento. Cada base emite fluorescencia a un color diferente: A verde, C azul, G amarillo, T rojo (según el código de bases nitrogenadas). Por tanto, se obtiene información de cada nucleótido uno a uno hasta completar la secuencia. Esta secuenciación se lleva a cabo en Cenit Support Systems S.L., en el Parque Científico de la Universidad de Salamanca. 4.2.11. Preparación de muestras para electroforesis SDS-PAGE Tras un crecimiento bacteriano en una cepa bacteriana de expresión, es necesario el aislamiento y ruptura de las células para obtener la proteína expresada y llevar a cabo un análisis de la misma por electroforesis en gel de poliacrilamida o SDS-PAGE. Para ello se toma 1 mL del medio con las bacterias y se somete a dos ciclos de lavado en los cuales el cultivo se precipita con una centrífuga a 11 000 xg durante 45 segundos, se descarta el sobrenadante, se añade 1 mL de agua ultrapura y se resuspende el precipitado por completo. Realizado el lavado, se añaden 200 μL de agua ultra pura y se toman en un nuevo tubo 20 μL de la muestra anterior añadiendo 5 μL de Protein Loading Buffer 5x (1:4 v/v). Se calientan las muestras a 100ºC durante 5 minutos. El β-mercaptoetanol presente en el buffer, favorecido por la alta temperatura, reducirá los puentes disulfuro en caso de haberlos. Por su parte, el SDS desnaturalizará las proteínas desplegándolas. 34 4.2.12. Bioproducción de polímeros recombinantes La producción de un polímero recombinante tipo elastina parte de un vector de expresión ingenierizado de forma recombinante que incluye el DNA que codifica para dicho polímero (apartados 4.2.4.; 4.2.5.1; y 4.2.5.2). Lo que se pretende es favorecer la expresión de los genes que contiene ese plásmido para obtener el polímero recombinante y para la posterior purificación del mismo. En este trabajo se han utilizado dos cepas diferentes de E. coli para llevar a cabo esta producción: SHuffle® T7 competent E.coli y BLR (DE3) E. coli. Tras la transformación en la correspondiente cepa bacteriana, y obtenidas las diferentes colonias en placas de LB-Agar, se debe determinar la colonia más productora, esto es, qué colonia posee mayor cantidad de proteína expresada. Para ello se realiza una segunda siembra en medio líquido (apartado 4.2.6) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (apartado 4.2.1.2). A partir de dicha colonia más productora se puede realizar un segundo screening, esto es, volver a realizar una siembra en placas de LB-Agar y repetir el proceso para acabar seleccionando la colonia más productora del subcultivo a partir de la colonia más productora del cultivo inicial. La bioproducción se llevará a cabo a partir de la colonia seleccionada. El proceso comienza con la preparación de un pre-inóculo en 5 mL de medio LB con antibiótico Ampicilina 100 mg/mL hasta una concentración del 0.1% y 250 μL de glucosa al 20% (m/v) en un tubo estéril de 50 mL. Este pre-inóculo se incuba a 37°C en agitación orbital a 250 rpm durante 16 horas. La glucosa es necesaria para inhibir la expresión génica durante el crecimiento de la biomasa, ya que actúa como represor de la traducción en E. coli. El siguiente paso es preparar el inóculo transfiriendo 100 μL del pre-inóculo a un matraz Erlenmeyer estéril de 250 mL con 30 mL de medio LB, Ampicilina 100 mg/mL hasta una concentración del 0.1% (v/v) y 1.5 mL de glucosa al 20% (m/v). Este inóculo se incuba a 37 °C en agitación orbital a 250 rpm durante 6 horas. Se deben tomar dos muestras de 1 mL de este inóculo antes de continuar con el siguiente paso, que permitirá realizar un posterior seguimiento de la bioproducción. El hecho de hacer un pre-inóculo y un posterior inóculo con medio de cultivo nuevo favorece el crecimiento de la biomasa de las bacterias. Posteriormente se toman dos Erlenmeyer o Flask estériles de 2 litros por cada litro de producción (en total se producirán 7.5 L, por tanto, se requieren 15 Erlenmeyer) y se les añaden 500 mL de medio de cultivo y Ampicilina hasta una concentración del 0.1% (v/v). El medio de cultivo utilizado en este trabajo consta de 2/3 (v/v) de medio TB y 1/3 (v/v) de medio LB, ya que se ha observado en experimentos anteriores que esta mezcla es adecuada para este tipo de producción. Es importante que los Erlenmeyer contengan un máximo de ¼ de su volumen para permitir una adecuada agitación y, por ende, oxigenación del cultivo. Una vez preparados los Erlenmeyer, se añade 1 mL del inóculo a cada uno y se incuban a 37°C en agitación orbital a 250 rpm durante 16 horas. Se preparan además dos muestras control a pequeña escala en tubos de 50 mL: un control de esterilidad preparado del mismo modo exceptuando la presencia de bacterias; y un control positivo 35 que contiene los mismos componentes que los Erlenmeyer de producción. Estos controles permiten comprobar que no existe contaminación en el medio y que la producción se está produciendo correctamente, respectivamente. Transcurridas las 16 horas se toman dos muestras de 1 mL de los Erlenmeyer de la producción y otras dos muestras de 1 mL de la muestra control positivo. Estas muestras se diluyen 1:10 (v/v) para mantener los valores de absorbancia dentro del rango lineal dinámico, y se mide su absorbancia (muestra t0’) en un espectrofotómetro a 600 nm. El tomar dos muestras en vez de una se debe a la necesidad de utilizar uno de los tubos como blanco tras precipitar las bacterias aplicándole una centrífuga de 45 segundos 13000 xg. Esta absorbancia se anota y se estima la concentración teniendo en cuenta la dilución. Transcurridos 30 minutos de la primera medida, se toman dos muestras más de la producción y se mide su absorbancia (muestra t30’) siguiendo el mismo procedimiento. Si el valor de la absorbancia se mantiene prácticamente constante significa que el crecimiento celular se encuentra en fase estacionaria. Por lo tanto, se puede comenzar el lavado de células. Si la absorbancia hubiera aumentado significativamente, se tendrían que realizar medidas cada 30 minutos hasta conseguir esta estabilización de la absorbancia. En la tabla siguiente se muestra un esquema de lo recién explicado (Tabla 4). Tabla 4. Esquema de los distintos cultivos en el proceso de bioproducción de polímeros tipo elastina. Pre-inóculo x1 · Colonia más productora. · 5 mL medio LB · 30 μL Ampicilina 100 mg/mL · 1.5 mL Glucosa 20% (v/v) Inóculo x1 · 100 μL cultivo bacteriano · 30 mL de medio LB · 30 μL de Ampicilina 100 mg/mL Producción x15 Por matraz: · 1 mL de inóculo · 500 mL de medio LB+TB · 5 mL de Ampicilina 100 mg/mL Las muestras del inóculo y de la producción (control, muestra t0’ y muestra t30’) se analizan por electroforesis SDS-PAGE para asegurar la producción ha tenido el rendimiento esperado. Para ello se lleva a cabo el proceso de preparación de muestra explicado en el apartado 4.2.11. con la siguiente salvedad en el último paso: en vez de 200 μL, se añade la cantidad de agua ultrapura correspondiente según la absorbancia, es decir, la biomasa de cada muestra (Tabla 5). 36 Tabla 5. Volumen necesario para la última resuspensión en la preparación de muestras según absorbancia. Absorbancia a 600 nm Volumen de agua ultrapura para resuspensión (μL) 0.1-0.5 20 0.5-2 50 2-5 100 >5 200 4.2.13. Purificación de polímeros recombinantes Es preciso llevar a cabo un lavado de las células para su aislamiento del medio de cultivo y la ruptura de las mismas para la extracción del biopolímero producido. Para ello, se vierte la producción en recipientes de centrífuga de 500 mL (no superando los 2/3 del volumen del recipiente), se someten a centrifugación a 4500 xg a 4°C durante 15 minutos y se descarta el sobrenadante. Después se añade Buffer de lavado de bacterias hasta ½ del volumen del recipiente y se resuspende el precipitado para someterlo acto seguido a una centrifugación de 4500 xg a 4°C durante 15 minutos. Este lavado se repite descartando el sobrenadante y añadiendo Buffer de lavado hasta que el sobrenadante quede incoloro y transparente. Llegado ese punto, las bacterias se resuspenden en Buffer de sonicado, que contiene el inhibidor de proteasas PMSF. La función de este inhibidor durante la lisis celular evitará la proteólisis del biopolímero por parte de las proteasas bacterianas liberadas. La ruptura de células se lleva a cabo mediante ciclos de sonicación a altas presiones (1500-1800 bar) y bajas temperaturas (4°C). Este proceso de sonicado se lleva a cabo en el grupo ProcerealTech y el equipo utilizado es un sonicador Hielscher UP400St. Los ciclos de sonicación favorecen la ruptura de la pared y membrana bacterianas liberando el polímero al medio líquido. Tras la sonicación, el lisado bruto obtenido se vierte en tubos de 50 mL y se realiza una centrífuga fría a 14000 xg y 4°C durante 90 minutos. Esto permite separar los restos celulares (en el precipitado, Prec.Sonic) del polímero (en el sobrenadante, Sb.Sonic). Este sobrenadante se somete a una etapa de purificación para eliminar otros posibles interferentes como proteínas no recombinantes presentes. Con el objetivo de realizar un seguimiento para comprobar que el aislamiento se ha realizado con éxito, se toma una muestra de 1 mL del precipitado y el sobrenadante (Prec.Sonic, Sb.Sonic) para analizarlos en una electroforesis SDS-PAGE. La preparación de estas muestras se realiza como se explica en el apartado 4.2.11. La purificación se lleva a cabo aprovechando las propiedades de solubilidad de los polímeros tipo elastina. El protocolo se esquematiza en la Figura 15. 37 El precipitado obtenido tras el sonicado (Prec. Sonic) se resuspende en 100 mL de agua ultrapura. Se añaden a continuación 100 mL de disolución de sales de guanidina a una concentración de 3M, necesarias para desnaturalizar y solubilizar todas las proteínas, incluso las que se encuentran en los cuerpos de inclusión formados como consecuencia del plegamiento incorrecto de las proteínas. Las sales de guanidina, además, favorecen la ruptura de puentes disulfuro al tener propiedades desnaturalizantes. Esta mezcla se mantiene en agitación durante unas 20 horas a 4 °C. Posteriormente se realiza una centrifugación a 13000 xg y 4 °C durante 1 hora. Se toma una muestra de 1 mL tanto del precipitado (Prec.Sales) como del sobrenadante (Sb.Sales) para su posterior análisis por electroforesis. Este sobrenadante es el que se llevará a la purificación final en columna de afinidad. Para la purificación final se aprovechan las propiedades del polímero, en concreto la cola de histidinas que posee, para purificarlo mediante cromatografía en columna de afinidad en condiciones desnaturalizantes, cuya fase sólida contiene una resina recubierta de níquel (Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin). El cromatógrafo utilizado es NGC Quest System (BioRad®). Tras el acondicionamiento previo de la resina de níquel en la columna, se hacen pasar por la misma 2 volúmenes (v/v) de Buffer de equilibrado. Se prepara la muestra añadiéndole su volumen equivalente en Buffer de equilibrado y se hace pasar la proteína a través de la columna. La cola de histidinas que posee el polímero tiene mucha afinidad por el níquel de la fase sólida, lo cual permitirá el empaquetamiento del polímero en la columna. Una vez el polímero se encuentra retenido, se lleva a cabo un gradiente en el cual se comienza desde una concentración máxima de agente desnaturalizante y reductor (Buffer de lavado) hasta reducir completamente su presencia de forma que las condiciones desnaturalizantes desaparezcan y el polímero se pliegue de forma correcta progresivamente en la columna. Por último, el polímero se extrae de la columna utilizando como fase móvil un Buffer de elución que contiene imidazol, cuya afinidad por las histidinas es mayor que la de la fase móvil de la columna. De este modo se obtiene el polímero purificado en las fracciones correspondientes que se extraen de la columna. El sobrenadante contenido en las fracciones que se obtienen de la columna de afinidad se somete a diálisis en 25 L de agua destilada y ultrapura (4°C) para eliminar los restos de sales de guanidina e imidazol que se han introducido durante el proceso de purificación. Figura 15. Representación esquemática teórica de la purificación de ELR. Etapa I: salinización de la disolución obtenida tras el sonicado. Etapa II: purificación y correcto plegamiento mediante columna de afinidad. 38 Por último, la disolución se liofiliza (congelación rápida y eliminación del hielo mediante vacío) para obtener el ELR purificado y seco. Se procede entonces a la caracterización físico-química. 4.2.14. Caracterización físico-química de polímeros recombinantes 4.4.14.1. Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) El espectro infrarrojo se forma como consecuencia de la absorción electromagnética de la radiación a frecuencias correspondientes a la vibración del conjunto de enlaces químicos en una molécula38. La técnica se basa en la absorción inducida de la radiación en el rango del infrarrojo por las moléculas que poseen una vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se dé una transición vibracional. Es decir, la molécula comienza a vibrar a una determinada frecuencia resonante gracias a la energía suministrada por la radiación incidente. Las transiciones producidas en los espectros de IR son transiciones que van del estado fundamental a un nivel superior cercano en energía. Para que la molécula sea activa en infrarrojo, esta vibración debe inducir un cambio en el momento dipolar de la misma. Los espectros de infrarrojo representan una huella digital de casi cualquier molécula exceptuando aquellas que no posean un momento dipolar distinto de cero, ya que su vibración es completamente simétrica y no es detectable al no presentar cambios en el momento dipolar. El resto de moléculas poseen vibraciones activas que absorben a una longitud de onda concreta en el espectro del infrarrojo. En este trabajo se utiliza un espectrofotómetro de FT-IR (con transformada de Fourier), cuya característica principal es ser capaz de llevar a cabo un barrido de longitudes de onda utilizando una fuente de radiación infrarroja continua. Esto permite una mayor rapidez y precisión, además de una relación señal-ruido significativamente mejor. La técnica de procesamiento de datos para este tipo de medidas se denomina Transformada de Fourier, que convierte los datos obtenidos en bruto en el espectro deseado39. La muestra se mide en estado oxidado y reducido con el objetivo de comprobar la presencia de puentes disulfuro intracatenarios. Estos puentes disulfuro, en un medio reductor, se romperán para dar lugar a grupos tiol que pueden ser observados en el espectro de infrarrojo a una longitud de onda de 2950 cm-1. El agente reductor utilizado es un exceso de β-mercaptoetanol. El equipo utilizado es FT-IR Nicolet iS50 (Thermo Scientific®) con módulos para análisis por ATR y por FAR-IR. 4.4.14.2. Espectrometría de masas (MALDI-TOF) La espectrometría de masas es una técnica analítica instrumental de análisis cualitativo y cuantitativo que permite identificar átomos, compuestos sencillos e incluso macromoléculas gracias a la separación de iones desplazados según su relación masa-carga (m/q). Esta técnica proporciona información estructural sobre la molécula analizada, la energía de sus enlaces e incluso información cuántica, isotópica y fisicoquímica. 39 En este trabajo se utiliza un espectrómetro de masas MALDI-TOF (Bruker Autoflex®) para identificar la estructura del polímero recombinante obtenido tras la purificación y liofilización del mismo. La fuente empleada en el espectrómetro es, por tanto, la denominada de ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI) combinada con un analizador de tiempo de vuelo (TOF). La fuente MALDI es una fuente blanda, y por tanto idónea para el análisis de biopolímeros, ya que no se produce fragmentación de las moléculas. El analizador de tiempo de vuelo (TOF) es una buena elección a la hora de analizar biopolímeros ya que su rango de relaciones m/q es prácticamente ilimitado (hasta 200-300 kDa). La prueba se realiza en el Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid. El equipo fue manipulado por técnicos del mencionado laboratorio. 4.2.14.3. Cromatografía de exclusión molecular en columna La cromatografía de exclusión molecular permite separar diferentes componentes según su tamaño molecular en disolución, gracias a la exclusión diferencial de los componentes en las partículas del material empaquetado. Las partículas esféricas que forman la columna tienen poros de un determinado tamaño, por tanto, las moléculas más pequeñas quedarán más retenidas en estos poros eluyendo más lentamente que las moléculas de mayor tamaño que eluirán más rápidamente. Se utiliza la columna Superdex75 (GE Healthcare®). El material empaquetado en su interior es una resina denominada Superdex (matriz mezcla de agarosa y dextrano), que combina las propiedades SEC (size exclusión chromatography) del dextrano con la estabilidad de la agarosa reticulada, resultando ser una resina con elevada selectividad y resolución. Para un análisis cualitativo, se introduce en la columna 1 mL de una disolución del ELR utilizando PBS como disolvente. 4.2.14.4. Espectroscopía DLS (Dynamic Light Scattering) La técnica de dispersión de luz dinámica o DLS (Dynamic light scattering) es una técnica usada clásicamente para medir el tamaño de partículas en la región sub-micrónica dispersas en un líquido. Los sistemas modernos tienen tanta sensibilidad que pueden ser utilizados para medir el tamaño de macromoléculas en disolución, por ejemplo, proteínas. Esta técnica se basa en la medida del movimiento browniano de las partículas en relación a su tamaño. El movimiento browniano es el movimiento aleatorio de las partículas debido al bombardeo de las moléculas de disolvente que las rodean. A mayor tamaño de partícula o molécula, más lento es el movimiento browniano ya que se ven menos afectadas por el mencionado bombardeo. Es necesario realizar las medidas a temperatura conocida para un control eficaz de la viscosidad y las corrientes de convección, que podrían afectar al valor obtenido. También se han de tener en cuenta la fuerza iónica del medio y la estructura superficial molecular. Para calcular este tamaño, se mide la velocidad a la que las partículas se difunden por movimiento browniano determinando la velocidad a la que fluctúa la intensidad de la luz cuando se detecta utilizando una disposición óptica adecuada. La obtención del valor del diámetro hidrodinámico se 40 la partícula se obtiene mediante un sistema de correlación que compara la señal obtenida en diferentes intervalos de tiempo. La señal va cambiando en cada instante y, al ser aleatoria, la correlación (la similitud entre señales) disminuirá con respecto a la señal original hasta llegar a cero. El tiempo que esta correlación tarda en decaer está relacionado con el tamaño de la partícula: partículas grandes provocarán cambios lentos en la señal, y partículas pequeñas provocarán cambios rápidos ya que se mueven más rápidamente40. Se realizan medidas para los polímeros VOK y P12VOKH6, y para el poliplexo formado por ambos polímeros y un plásmido estabilizado. Para obtener este poliplexo se mezclan los componentes en las proporciones que se desea medir, se aplica un vórtex y se mantiene durante 1 hora a temperatura ambiente. Se forma así la nanopartícula formada por interacciones electrostáticas obteniendo un poliplexo estable. La prueba se realiza en un equipo Zetasizer Nano (Malvern®) el centro CARTIF del Parque Tecnológico de Boecillo (Valladolid). 4.4.14.5. Espectroscopía de Resonancia magnética nuclear (RMN) La resonancia magnética nuclear o RMN es una técnica espectroscópica que estudia el comportamiento de ciertos núcleos atómicos que son magnéticamente activos (aquellos que poseen spin nuclear distinto de cero) en presencia de un campo magnético externo. Dicho campo magnético genera un desdoblamiento de los niveles energéticos degenerados del spin nuclear, de modo que se inducen transiciones entre ellos como consecuencia de la absorción de una radiación electromagnética concreta. La disposición de los niveles de energía es función de la naturaleza de los núcleos, su entorno electrónico y las interacciones entre ellos. La resonancia magnética nuclear es la herramienta más poderosa de la que se dispone para la determinación de una estructura orgánica. Muchas estructuras se pueden determinar exclusivamente por sus espectros de RMN, aunque es frecuente utilizarla conjuntamente con otras técnicas espectroscópicas. El equipo utilizado consta de dos espectrómetros de RMN de 500 y 400 Hz de Agilent Technologies. El equipo fue manipulado por técnicos del Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) del Parque Tecnológico de la Universidad de Valladolid. Se analizan el polímero sintetizado P12VOKH6 y también el polímero VOK, para realizar un análisis comparativo. Se analiza 12 mg de polímero disuelto en 0.6 μL de agua deuterada, para una concentración final de 20mg/mL. 4.4.14.6. Análisis de aminoácidos por HPLC La cromatografía por HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography) es un tipo de cromatografía en columna utilizada para separar componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias a analizar y la columna cromatográfica. Esta técnica se ha convertido en un procedimiento estándar para la separación de aminoácidos utilizando sistemas de derivatización de los mismos en columna de fase 41 inversa. Esta derivatización puede ser pre-columna o post-columna y está optimizada para cada tipo de aminoácido, ya sean alifáticos, aromáticos, etc.41 En este trabajo se utiliza para determinar la secuencia de aminoácidos del polímero P12VOKH6. El ensayo se lleva a cabo en el Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid. El equipo, HPLC analítico 1200 Series (Agilent Technologies), fue manipulado por técnicos del mencionado laboratorio. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En este trabajo se llevan a cabo aportaciones a dos proyectos en marcha dentro del grupo de investigación Smart Devices for NanoMedicine: por una parte la síntesis del plásmido recombinante pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6; y, por otra parte, la bioproducción del polímero P12VOKH6. Para ello se utilizan técnicas de Biología molecular e Ingeniería genética. 5.1. CONSTRUCCIÓN DEL GEN pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 En este trabajo se construye el gen scFv(EpCAM)-VOK-H6 clonado en el vector pET7 (Figura 16) con intención de que pueda ser utilizado en una bioproducción a gran escala del polímero recombinante scFv(EpCAM)-VOK-H6 en trabajos posteriores. Este polímero podrá ser utilizado para formar un poliplexo con aplicaciones biomédicas. El polímero recombinante que codifica este gen es una proteína constituida por tres bloques (Figura 17). El bloque scFv(EpCAM) es un fragmento de anticuerpo que hace las veces de agente de direccionamiento del poliplexo aportando total especificidad al tratamiento ya que reconoce proteínas que se encuentran únicamente en células tumorales y no en células sanas. El bloque VOK tiene la función de autoensamblado, además de aportar al polímero la característica de ser policatiónico, de modo que sea capaz de formar un poliplexo estable con una molécula de DNA con Figura 16. Representación esquemática del gen pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6. Se indican los sitios de corte de las enzimas de restricción HindIII, XbaI, EcoR y NdeI. 48 En el panel B (Figura 26) se observa la banda que corresponde al inserto scFv(EpCAM)-VOK-H6. En el panel C (Figura 26) se observa que se ha seccionado la banda que corresponde a dicho inserto. Esta banda se purifica mediante el protocolo PureLink Quick Gel Extraction (apartado 4.2.7.2). Purificado el inserto, se determina su concentración mediante NanoDrop 2000 (apartado 4.2.9). La concentración de la disolución es de 9.6 ng/μL. 5.2.1.6. Reacción de ligación del plásmido pET7 y del inserto scFv(EpCAM)-VOK-H6 Una vez obtenido el plásmido modificado, este debe introducirse en un vector de expresión con el objetivo de realizar una bioproducción posterior a gran escala. Para ello se parte de la disolución del inserto purificado scFv(EpCAM)-VOK-H6 a una concentración de 9.6 ng/μL (apartado 5.1.2.5) y del vector plasmídico pET7, ya lineal y defosforilado, a una concentración de 10 ng/μL. Se realiza la reacción de ligación (apartado 4.2.4) representada en la Figura 21. Tras la reacción de ligación se habrá obtenido el plásmido pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 (7377 pb), que se utiliza en la transformación en células competentes NZY5α (apartado 4.2.5.1) y su posterior cultivo (apartado 4.2.6) en medio LB-Ampicilina, ya que el vector de clonación pET7 posee un gen que le confiere resistencia a este antibiótico. Posteriormente se realiza la extracción y la purificación del DNA plasmídico obtenido mediante el protocolo NucleoSpin® Plasmid/Plasmid NoLid (apartado 4.2.7.1.1). Para comprobar que la reacción de ligación y posterior transformación han ocurrido correctamente se lleva a cabo una co-digestión analítica de la disolución plasmídica con las enzimas de restricción XbaI y EcoRI, cuyos sitios de corte se representan en la Figura 27-A. El producto de la digestión se corre en una electroforesis en gel de agarosa (Figura 27 – B). Se confirma que los procesos han ocurrido correctamente puesto que aparecen las bandas esperadas. Se observa una banda a 5412 pb que corresponde a la zona del plásmido sin inserto entre los dos sitios de corte de las enzimas, y otra banda a 1965 pb que corresponde al fragmento que contiene el inserto y que contiene el gen introducido (scFvEpCAM-VOK-H6) más 72 pb. Figura 27. Panel A: Representación esquemática de la co-digestión de pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 con EcoRI y XbaI. Panel B: Electroforesis de co-digestión analítica con EcoRI y XbaI del plásmido pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6 en gel de agarosa al 1% (m/v). En la calle MK se representa el marcador NZYLadderIII. En las diferentes calles se representan las colonias 7 y 8 digeridas con EcoRI y XbaI distribuidas como se muestra en la imagen. 49 Por último, se determina la concentración de las disoluciones de las colonias mencionadas (7 y 8) por NanoDrop 2000, que resultan ser: 72.3 ng/μL y 72.5 ng/μL respectivamente. Estos valores son más bajos de lo esperado para un plásmido de expresión. Aun así, los resultados obtenidos son los esperados, se podría comenzar una bioproducción a gran escala del recombinámero sintetizado. 5.3. BIOPRODUCCIÓN DE ELR En el presente trabajo se ha realizado la bioproducción del recombinámero P12VOKH6, cuyo peso molecular teórico es de 59032 Da. Posteriormente se ha purificado y caracterizado utilizando diferentes técnicas. Se parte del plásmido recombinante p7-scFv(P12)-VOK-H6 ya purificado en el grupo de investigación Smart Devices for NanoMedicine de la Universidad de Valladolid. El gen que codifica para el polímero que se pretende producir se encuentra en un vector plasmídico de expresión pET, el cual se caracteriza no tanto por producir muchas copias de sí mismo, sino por tener alta tasa de expresión de la proteína recombinante. 5.3.1. Optimización de la bioproducción del recombinámero P12VOKH6 Dado que el polímero es de nueva síntesis, se han requerido ciertos pasos de optimización para determinar las condiciones idóneas para su producción. El primer paso a realizar es una transformación en células competentes de una cepa bacteriana de expresión. Se han utilizado dos cepas bacterianas diferentes para comprobar cuál de ellas generaba mejores resultados. Por una parte se ha utilizado la cepa bacteriana SHuffle® T7 competent E.coli, que requiere un proceso de inducción con IPTG (apartado 4.2.5.2). Esta cepa está modificada por ingeniería genética para promover el plegamiento de la proteína en el citoplasma mediante la formación de puentes disulfuro. Como el polímero a producir requiere de la formación de estos puentes disulfuro para alcanzar su conformación nativa activa, el uso de esta cepa facilita su adecuado plegamiento evitando pasos adicionales tras la purificación. Por otra parte se ha utilizado la cepa BLR (DE3) competent Cells en medio autoinductor (apartado 4.2.5.3), que es adecuada para la producción de polímeros proteicos, pero que no posee la capacidad de promover el plegamiento post-traduccional que forma los puentes disulfuro. Esto quiere decir que se requieren pasos adicionales para alcanzar la conformación nativa activa del polímero tras la purificación. El cultivo bacteriano para la preparación del inóculo tras la transformación se realiza en medio LB. La realización de una electroforesis de proteínas SDS-PAGE analítica o screening (apartado 4.2.1.2) muestra cuál de las colonias bacterianas, aisladas en placas Petri tras la transformación, es la más productora, esto es, qué colonia genera más recombinámero para un tiempo determinado. En la Figura 28-A,B se muestra la mencionada electroforesis en la que se puede observar el contenido proteico en las colonias bacterianas que contienen el ELR, banda señalada con una línea roja, utilizando las dos cepas bacterianas para la transformación. En la Figura 28-A (cepa SHuffle® T7) se apreció un nivel de producción muy bajo. No se diferenció una banda significativa para la proteína deseada. En la Figura 28-B (cepa BLR (DE3)), sin embargo, se observó un nivel de producción notable y se pudo diferenciar la banda significativa para la 50 proteína deseada. Además se pudo apreciar que la 5 es la que tienen mayor tasa de producción, por tanto se eligió para comenzar la bioproducción. El control negativo de p7(EI)2 mencionado en la Figura 28-B se utiliza como guía para observar el patrón de las proteínas que produce la célula y ser capaz de diferenciarlas de la proteína concreta que se pretende expresar a partir del plásmido introducido. Analizados los resultados anteriores se decidió continuar la bioproducción con la cepa bacteriana BLR(DE3) competent Cells, a pesar de que se requieren pasos adicionales de plegamiento tras la purificación, ya que la producción del ELR es notablemente mayor en esta cepa. 5.3.2. Bioproducción del polímero recombinante La absorbancia a 600 nm de las diluciones del inóculo, del control y de las muestras a diferentes horas se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Valores de los parámetros medidos durante la bioproducción en Flask. Muestra A600nm x10 Dilución (v:v) Control 7.30 1:10 Inóculo 4.55 1:10 8h (t0) 8.36 1:20 8.30h (t30) (14.02) 1:20 9h (t60) 7.54 1:20 Cuando las absorbancias medidas con media hora de diferencia se mantienen prácticamente constantes se para la producción. En este caso se dedujo que el valor de las 8.30h no es concluyente ya que difiere demasiado de los valores anterior y siguiente. Por tanto se toman como válidos los valores de las 8h y de las 9h. En este punto las células se encuentran en fase de crecimiento estacionario. Se realiza una electroforesis SDS-PAGE para confirmar que se ha obtenido el recombinámero correcto en la producción (Figura 29). Figura 28. Screening del ELR P12VOKH6 en gel de poliacrilamida al 1%. En la calle MK se observa el marcador de proteínas NZY-Bluesafe®; en la calle C (panel B) se muestra un control negativo de p7(EI)2; en las calles 1-7 se observan las colonias bacterianas 1-7. Panel A: transformación en cepa SHuffle® T7 competent E.coli. Gel teñido con Azul de Coomasie. Panel B: transformación en cepa BLR (DE3) competent Cells. Gel teñido con cloruro de cobre. 51 En la Figura 29 se puede observar la presencia del polímero P12VOKH6, además de otras bandas significativas. Esto no es preocupante, ya que se espera su desaparición tras la purificación del polímero. El siguiente paso es realizar el lavado de células, su ruptura, el aislamiento del polímero y su purificación (apartado 4.2.13). 5.3.3. Purificación del polímero recombinante P12VOKH6 El lisado bacteriano bruto obtenido tras el proceso de sonicación (apartado 4.2.13) se somete a una centrifugación cuya función es aislar el polímero contenido en el sobrenadante de los restos celulares obtenidos en el precipitado. Para controlar esta etapa de aislamiento se realiza una electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (Figura 30) que permite identificar la porción de muestra en la que se encuentra el polímero. Como se ha indicado en el apartado 4.2.13, para obtener el polímero purificado se lleva a cabo una salinización con sales de Guanidina del sobrenadante obtenido tras el sonicado (Sb. Sonic) que contiene, además de otras proteínas, el polímero recombinante, que quedará en el sobrenadante por la presencia de estas sales (el aumento de la concentración salina disminuye la temperatura de transición, de modo que puede anularse el entorno proteico hasta hacer solubles los cuerpos de inclusión). Por tanto, tras la centrifugación, se obtiene un sobrenadante (Sb. Sales) en el que se espera que esté el polímero. En este punto se lleva a cabo una electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida para controlar que la porción de la muestra en la que se encuentra el polímero es la esperada (Figura 30). Al analizar la Figura 30 se observó que, en las calles 3 y 4 (correspondientes a la salinización) no aparecían bandas, cuando el resultado esperado era obtener la banda correspondiente al ELR en el sobrenadante (calle 4-Figura 30). Como no se observan bandas en absoluto, pero sí se observan las bandas esperadas en el paso anterior (calles 1 y 2-Figura 30) se dedujo que la elevada concentración de sales de guanidina (3M) interfiere en la electroforesis modificando el campo eléctrico por su carácter electrolítico y alterando la movilidad electroforética de las proteínas. Siendo así, se decidió Figura 29. Análisis por electroforesis SDS-PAGE del P12VOKH6 obtenido en la bioproducción. Calle MK: marcador de proteínas NZY-Bluesafe®; Calle I: l inóculo; Calle C: control; Calles posteriores: crudo de la bioproducción a las 8h, 8:30h y 9h. Tinción con Azul de Coomasie. 52 asumir que el polímero estaba en el sobrenadante (Sb. sales) como se esperaba y proceder a la purificación por columna de afinidad (apartado 4.2.13.). En el caso de que en la columna no se observara el comportamiento esperado, significaría que el polímero se encontraba, en contra de lo esperado, en el precipitado (Prec. sales). Tal y como se explica en el apartado 4.2.13, se aprovechan las propiedades de la cola de histidinas que posee el ELR para purificarlo utilizando una columna de afinidad, además de realizar un tratamiento con un gradiente de concentración de sales de Guanidina para favorecer el correcto plegamiento de la proteína mediante la formación de los puentes disulfuro correspondientes. Al hacer pasar el sobrenadante obtenido (Sb. sales) por la columna de afinidad se obtienen 6 fracciones con contenido proteico. El cromatograma obtenido se presenta en la Figura 31. Como se puede observar, los tubos de elución que presentan absorbancia a 280 nm son los que contienen el polímero P12VOKH6. Para su adecuado análisis se lleva a cabo una electroforesis de proteínas SDS-PAGE (Figura 32). Se observa una banda por debajo de la banda esperada del ELR de unos 40 kDa cuya intensidad es muy similar a la de la banda del P12VOKH6. Dado que la intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de proteína que se encuentra en disolución, esto implica que hay una cantidad muy similar del polímero de interés y de un producto de degradación del propio polímero. Se deduce que se ha producido una degradación por el extremo amino terminal, ya que la columna de afinidad utilizada Figura 31. Cromatograma obtenido en la purificación del ELR P12VOKH6 por cromatografía en columna de afinidad (Thermo Scientific HisPurTM Ni-NTA Resin). El cromatógrafo utilizado es NGC Quest System (BioRad®). Se destaca la zona en la que se aprecia la elución del polímero P12VOKH6 a 280nm. Figura 30. Electroforesis de proteínas de P12VOKH6 obtenido tras la ruptura de células (calles 1 y 2) y la etapa de salinización (calles 3 y 4). En la calle MK se representa el marcador de proteínas NZY-Bluesafe®; en las calle 1 y 2 se representan el precipitado y el sobrenadante tras el sonicado (Prec. Sonic y Sb. Sonic), respectivamente; en las calles 3 y 4 se representan el precipitado y el sobrenadante tras la salinización con sales de guanidina 3M (Prec. sales y Sb. Sales), respectivamente. Tinción con Azul de Coomasie. 53 permite retener el polímero desde el fragmento de la cola de histidinas, que está en el extremo carboxilo terminal. Que se produzca este tipo de degradación no es deseable, pero aun así no es estrictamente necesario realizar una separación exhaustiva para aislar el polímero de interés, ya que cuando se forma el poliplexo, hay muchas moléculas de polímero policatiónico por cada molécula de DNA, y la presencia de fragmentos proteicos que solo contenga el polímero estructural sin el fragmento de anticuerpo no impide la correcta formación de la nanopartícula. Por lo tanto, se procede a finalizar la purificación llevando a cabo la diálisis para eliminar las sales que se han añadido durante el proceso de purificación. La disolución obtenida se liofiliza para obtener el polímero purificado y seco (apartado 4.2.13). Obtenido el ELR final, su masa es de 32.3 mg. Esto permite calcular un rendimiento de 4.3 mg/L de producto purificado. 5.4. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE ELR En este trabajo se han utilizado diferentes técnicas de caracterización del polímero bioproducido P12VOKH6. Los resultados obtenidos se muestran a continuación. 5.4.1. FT-IR El espectro obtenido mediante espectroscopía de infrarrojo para el polímero P12VOKH6, en sus formas oxidada y reducida, se muestra en la Figura 33. Como se explicaba en el apartado 4.2.14.1., se esperaba observar, en la muestra del polímero reducido, un pico a 2950 cm-1 indicativo de la presencia de los grupos tiol en las L-cisteínas que forman los puentes disulfuro, lo cual confirmaría la presencia de dichos puentes disulfuro en la forma oxidada de la molécula. Figura 32. Electroforesis de proteínas SDS-PAGE tras columna de afinidad de P12VOKH6. En la calle MK se observa el marcador de proteínas NZY-Bluesafe®; en las calles 1-6 se observan las fracciones 55 a 60 que se han obtenido de la columna de afinidad al hacer pasar por ella el sobrenadante obtenido tras la adición de sales de Guanidina (Sb. sales). Tinción con Azul de Coomasie. 54 Figura 33. Espectro de FT-IR del recombinámero P12VOKH6 obtenido. Línea azul: P12VOKH6 forma oxidada. Línea gris: P12VOKH6 forma reducida. Se representa el % de transmitancia frente a la longitud de onda en cm-1. La señal que aparece a 1640 cm-1, común en ambos espectros, corresponde con el enlaces C=O de los grupos carboxilato de los aminoácidos presentes. En el espectro de la forma reducida (Figura 33-Línea gris) se observan tres señales entre 2800 y 3000 cm-1. Las que aparecen a 2850 y 2920 cm-1 corresponden a los enlaces S-H de las moléculas de β-mercaptoetanol42 en su forma reducida, presente debido al exceso de agente reductor empleado. La señal que aparece a 2950 cm-1 es la correspondiente a los enlaces S-H procedentes de la reducción y consecuente ruptura de los puentes disulfuro que unen las L-cisteínas del fragmento proteico scFv(P12). Por lo tanto, se puede concluir que, efectivamente, el polímero se ha plegado como se esperaba formando los puentes disulfuro pertinentes. 5.4.2. Espectrometría de masas: MALDI-TOF El espectro obtenido mediante espectroscopía de masas para el polímero P12VOKH6 se muestra en la Figura 34. Aparece un pico a 59342 umas (o Dalton) que se corresponde con el ion molecular ya que proporciona el peso molecular del polímero P12VOKH6. Además presenta un pico minoritario a 29895 umas correspondiente al peso molecular de la segunda ionización del polímero. Por otra parte, se observa un pico intenso a 33501 umas. Esta señal confirma la afirmación realizada en el apartado 5.3.3 sobre una posible degradación del polímero. El peso molecular de este producto de degradación se corresponde con el peso molecular del fragmento VOK. Por último, aparece un pico muy leve a 46606 umas, que se asume que es otro producto de degradación cuya concentración es más baja y por eso no se ha observado en la electroforesis SDS-PAGE (Figura 32). Como conclusión, se asume que se produce una cantidad significativa de degradaciones. Observando las electroforesis anteriores a la purificación (Figuras 28-30), se pueden apreciar levemente las bandas correspondientes al peso molecular de estos productos de degradación, que se habían pasado por alto previamente. Esto quiere decir que la degradación no se produjo en la purificación del polímero, sino que estos productos se sintetizaron ya degradados durante la bioproducción. Esto puede deberse a la presencia de proteasas en la cepa bacteriana. 55 5.4.3. Cromatografía de exclusión molecular en columna A pesar de que, como se ha explicado en el apartado 5.2.3., no es imprescindible realizar una separación entre el polímero de interés y el degradado, se ha utilizado la cromatografía de exclusión molecular por tamaños para analizar cualitativamente si este aislamiento del polímero P12VOKH6 de sus productos degradado era posible. El cromatograma obtenido en la columna de exclusión molecular Superdex75 se presenta en la Figura 35. Se observa cómo la muestra es eluida en las fracciones 4-8. Se esperaba obtener una sola señal para el polímero P12VOKH6, sin embargo se observan al menos 3 señales significativas, de las cuales dos se encuentran solapadas. Las señales que eluyen a 8.04 y 9.71 mL, por su destacada intensidad, corresponden a la elución del polímero. Al observar más de una señal en la misma zona, se sospecha que el polímero no se ha separado correctamente de los otros productos obtenidos. La señal de menor intensidad, que eluye a 15.64 mL, es probablemente un producto de degradación cuya concentración es muy baja para ser observado por SDS-PAGE, y que sí ha sido posible separar del P12VOKH6 por esta técnica dado su menor tamaño. Figura 34. Espectro de masas del polímero P12VOKH6 realizado en un espectrómetro MALDI-TOF (matriz 2,5-DHAP) en agua. Figura 35. Cromatograma obtenido tras eluir el recombinámero P12VOKH6 en la columna de exclusión molecular Superdex75. Se representa destacada el intervalo de volumen en el que aparece señal de absorción en el cromatograma. Las franjas 4-8 representan las fracciones tomadas en ese intervalo. 56 Las fracciones obtenidas son analizadas por electroforesis SDS-PAGE (Figura 36-A). Como se puede observar, no se ha conseguido realizar una separación satisfactoria del polímero P12VOKH6 y sus productos de degradación, puesto que ambos polímeros han eluido en su mayoría en la fracción número 5. Además, se ha realizado una segunda electroforesis SDS-PAGE con el objetivo de comprobar la diferencia de movilidad electroforética entre muestras con y sin agente reductor, pretendiendo demostrar que las proteínas plegadas generan una movilidad electroforética menor y aparecen a pesos moleculares menores. Para ello se han tomado dos muestra de polímero P12VOKH6 disuelto en agua y concentrado; y dos muestras de la fracción número 5 obtenida a partir de la columna de exclusión molecular para observar su comportamiento al tratarlas con Protein Loading Buffer con y sin agente reductor (βmercaptoetanol). Las muestras se distribuyen como se indica en la Figura 36-B. Se observa que existe un shift (representado en amarillo, Figura 36-B) entre las muestras que están en presencia de agente reductor y las que no, debido a que en las primeras el polímero se encuentra completamente desplegado y en las segundas se encuentra plegado. 5.4.4. Espectroscopía DLS (Dynamic light scattering) Esta técnica se ha utilizado con el objetivo de observar la eficacia del polímero sintetizado P12VOKH6 para formar un poliplexo estable, con una carga superficial positiva capaz de interaccionar con la membrana plasmática y de un tamaño adecuado (Tabla 7). Tabla 7. Resultados obtenidos en la espectroscopía DLS para VOK, P12VOKH6 y los poliplexos formados con dichos polímeros y moléculas de DNA plasmídico. Carga superficial (mV) Diámetro (nm) PDi VOK 1mg/mL 30.6 23.82 0.518 P12VOKH6 1mg/mL 15.2 80.06 0.557 Figura 36. Panel A: Electroforesis de proteínas SDS-PAGE tras cromatografía de exclusión por tamaños de P12VOKH6. Calle MK: marcador de proteínas NZY-Bluesafe®. Calles 4-9: fracciones 4-9 obtenidas tras la elución de la columna. Panel B: Electroforesis de proteínas SDS-PAGE P12VOKH6. Calle MK: marcador de proteínas NZY-Bluesafe®. Calle 1: muestra de polímero P12VOKH6 concentrado con agente reductor. Calle 2: muestra de la fracción 5 obtenida tras la elución de la columna con agente reductor. Calles 3 y 4 vacías. Calle 5: muestra de polímero P12VOKH6 concentrado sin agente reductor. Calle 2: muestra de la fracción 5 obtenida tras la elución de la columna sin agente reductor. Tinción con Azul de Coomasie. 57 Carga superficial (mV) Diámetro (nm) Ratio(P12VOKH6/VOK) PDi Poliplexo (DNA+VOK) 35.6 Rt1/9: 159.0 Rt1/4: 181.9 Rt1/2: 243.2 0.586 0.416 0.496 Poliplexo (DNA+P12VOKH6) 26.8 Se han probado diferentes ratios de la mezcla P12VOK/VOK para ver cuál consigue complejar mejor el DNA plasmídico. Todas las pruebas se realizan con una cantidad fija de 2 µg de pDNA y un ratio 50:1 de lisinas frente a fosfatos, optimizado previamente por el grupo Smart Devices for NanoMedicine43. Ya que el P12VOK se produce con una degradación de aproximadamente el 50%, el ratio ½ es el de partida obtenido al disolver el polímero liofilizado, los ratios ¼ y 1/9 se consiguen mezclando el P12VOK con VOK en la medida adecuada. El ratio ¼ resulta ser el más prometedor, ya que la nanopartícula tiene un tamaño adecuado entre 150 y 180 nm (181.9 nm) y la polidispersidad (amplitud del pico que da una idea de la homogeneidad de la muestra), aun siendo elevada, es la menor de las tres (se considera adecuado un valor de pDi inferior a 0.2). En la Figura 37 se observa una gráfica que representa las tres medidas de la muestra de P12VOK/VOK con ratio ¼ formando un poliplexo con DNA plasmídico. El pequeño pico de la izquierda corresponde al polímero que no ha sido capaz de complejarse por estar en exceso o por causas de impedimento estérico. Esta es la razón por la que la polidispersidad supera el valor adecuado: la falta de homogeneidad en la muestra se debe a la presencia de polímero sin complejar. Esto podría mejorarse optimizando aún más los ratios polímero/plásmido. El ratio 50/1 de lisinas y fosfatos utilizado con otros polímeros policatiónicos en trabajos anteriores puede no ser el adecuado cuando se tiene el scFv que puede ocasionar impedimentos estéricos y no dejar que las moléculas de polímero interaccionen correctamente con el plásmido. 5.4.5. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) Los espectros obtenidos por 1H-RMN se pueden observar en el Anexo I (Figuras 38-41). En la Tabla 8 se resumen los datos esperados (según las predicciones obtenidas utilizando el software Chemdraw (PerkinElmer®)) y obtenidos experimentalmente para los polímeros VOK y P12VOKH6. En los espectros experimentales obtenidos se ha utilizado como referencia el número de protones de CH3 (0.96 ppm) para normalizar el resto de integrales. Figura 37. Gráfica obtenida en el equipo DLS. Se observan las tres medidas realizadas de la muestra P12VOK/VOK con ratio ¼ complejado con DNA plasmídico. 64 ANEXO I Figura 39. Espectro 1H-RMN del polímero VOK en espectrómetro de 500Hz. Disolvente usado: D2O. No aparecen señales por encima de 5ppm. (Zoom) Figura 38. Espectro 1H-RMN del polímero VOK en espectrómetro de 500Hz. Disolvente usado: D2O. No aparecen señales por encima de 5ppm. 65 Figura 40. Espectro 1H-RMN del polímero P12VOKH6 en espectrómetro de 500Hz. Disolvente usado: D2O. Figura 41. Espectro 1H-RMN del polímero P12VOKH6 en espectrómetro de 500Hz. Disolvente usado: D2O. (Zoom)