Técnicas de secuenciación masiva aplicadas a la viticultura

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación Grado en Enología TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA Alumno: María del Prado Orduñez Cáceres Tutora: Elena Hidalgo Rodríguez Julio de 2019 TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 1 / 31 TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 2 / 31 ÍNDICE 1. RESUMEN ............................................................................................................. 3 2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 3 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 7 4. METODOLOGÍA .................................................................................................... 7 4.1. CLASIFICACIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA ....................................................... 7 4.2. REDACCIÓN DEL TEXTO ............................................................................. 7 5. ANÁLISIS BIBLIOGRÁFICO .................................................................................. 8 5.1. TÉCNICAS MOLECULARES DISPONIBLES PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA DEL VIÑEDO. ......................................... 8 5.2. APLICACIONES EN LA PROTECCIÓN DEL VIÑEDO ................................. 14 5.3. IDENTIFICACIÓN Y MANEJO DE HONGOS MICORRÍCICOS .................... 15 5.4. IDENTIFICACIÓN Y MANEJO DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES FÚNGICAS DE LA MADERA .................................................................................. 17 5.4.1. PIE NEGRO........................................................................................... 17 5.4.2. ENFERMEDAD DE PETRI Y YESCA. ................................................... 19 5.4.3. EUTIPIOSIS .......................................................................................... 21 5.4.4. PODREDUMBRE GRIS ......................................................................... 22 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 24 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 25 TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 3 / 31 1. RESUMEN Los viñedos son reservorios naturales de diversidad biológica. La diversidad encontrada en los suelos de viñedos es determinante no solo por las propiedades físico-químicas y nutricionales del suelo, sino también por la salud, el rendimiento y la calidad de la uva. El principal inconveniente que encontramos en los cultivos de vid y especialmente en plantaciones de viñedo joven son las enfermedades fúngicas de madera que afectan de manera importante al cultivo de la vid. Las plantas infectadas muestran alteraciones internas en la madera como necrosis y pudriciones, dando lugar a un menor desarrollo de la planta e incluso la muerte. Actualmente, se utilizan diversos productos fitosanitarios de origen químico para combatir dichas enfermedades, lo cuales pueden no ser inocuos y cuando entran en la cadena alimentaria originar alteraciones en la salud humana. Además, según el tipo de agricultura, estarán o no autorizados para su empleo. En su lugar, se pueden utilizar medidas de control biológico caracterizado por el uso de microorganismos para combatir los distintos agentes que causan las enfermedades derivador de la información obtenida al utilizar técnicas moleculares basadas en el análisis del ADN. Estas técnicas permitirán detectar de una forma precisa y precoz la presencia/ausencia de microorganismos en suelos vitícolas y en la cepa en sí para, posteriormente, tomar medidas acordes respetando en todo momento el cultivo. Por ello, la presente revisión bibliográfica analiza las nuevas tecnologías utilizadas para la detección, identificación y caracterización de microorganismos, mediante el empleo de técnicas moleculares (PCR y sus derivadas y secuenciación) en casos particulares o en enfermedades fúngicas relevantes en el viñedo. 2. INTRODUCCIÓN En el año 2017, el área total mundial de viñedo alcanzó los 7.5 millones de hectáreas, más de la mitad se encuentran en el continente europeo. España cuenta con una superficie de 1.1 millones de hectáreas, seguido de Francia e Italia (OIV, 2017). Como todos los cultivos alberga un reservorio natural de microorganismos, que interactúan con ella, juegan un papel importante en la evolución de la uva, y, en la fermentación y producción del vino (Pinto et al., 2014, entre otros). Las poblaciones de microorganismos presentes en el suelo del viñedo están influenciadas por las propiedades físico-químicas y nutricionales del suelo, por las condiciones externas como la ubicación del viñedo, las prácticas vitícolas, la variedad de la vid, el rendimiento y la calidad de la uva (Morgan et al., 2017). Dichos microorganismos se conocen como el microbioma de la vid y se compone de hongos filamentosos, levaduras y bacterias. El microbioma influye en las relaciones planta-suelo, por ello es importante controlar los microorganismos, no solamente en el suelo, sino también dentro de la planta. Dentro del microbioma del suelo, las plantas y los hongos se pueden establecer tres tipos de interacciones: (i) simbiosis: la interacción puede resultar beneficiosa o neutra, ya que aumentan la disponibilidad de los nutrientes y estimula el desarrollo de la planta. (ii) competencia: se genera competencia por el espacio y los nutrientes, inhiben el crecimiento de patógenos y producen metabolitos antibióticos, y por último (iii) patogenicidad: se produce un debilitamiento de la planta. Estos microorganismos también pueden influir sobre la planta y sobre todo en la sucesión biológica de la bodega, pudiendo arrastrarse desde el viñedo hasta la misma (Pinto et al., 2016) Para conocer el microbioma de la vid se nos plantean tres cuestiones importantes, la primera referida a qué microorganismos están presentes en el medio ambiente, la segunda cuál es su comportamiento y la tercera cuestión cómo afectan al viñedo las poblaciones de esos microrganismos. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 4 / 31 Para responder a la primera de las cuestiones, se requiere aplicar métodos de análisis genéticos de gran precisión, a nivel intraespecífico puesto que pequeñas variaciones genéticas pueden afectar de forma distinta a la calidad de uva o vino. Para la segunda y tercera cuestiones, la identificación debe ser complementada mediante la evaluación de sus propiedades fenotípicas y genotípicas y también a nivel cuantitativo y fisiológico. La viticultura es el sector agrícola en el que se utilizan más tratamientos fitosanitarios (plaguicidas, fungicidas, herbicidas, etc.) para el control de plagas y enfermedades por su valor añadido de producto (Pinto et al., 2016). Estos tratamientos no son inocuos, y tienen consecuencias tanto desde el punto de vista ecológico, puesto que afectan a la vid y al entorno, como sanitarias ya que cuando entran en la cadena alimenticia pueden influir de una forma indirecta en la salud humana. Los distintos países establecen legislaciones para garantizar la sostenibilidad de las plantaciones y, junto con los consejos reguladores de las Denominaciones de Origen, también establecen requisitos de calidad tanto en la viticultura como en las prácticas de enología cuyo objetivo es definir estándares de calidad. Los reglamentos que se aplican para regular todas las actividades se recogen en el Reglamento (CE) 128/2009, en el que la Comisión Europea estableció una serie de normas para el uso sostenible de plaguicidas a fin de reducir los riesgos y los impactos del uso de plaguicidas en la salud de las personas y en el medio ambiente. Una de las claves del reglamento determina que "…cada Estado miembro debe desarrollar y adoptar su Plan de acción nacional y establecer objetivos cuantitativos, metas, medidas y calendarios para reducir los riesgos y los impactos del uso de plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente, y fomentar el desarrollo y la introducción del manejo integrado de plagas y de enfoques o técnicas alternativos para reducir la dependencia en el uso de plaguicidas". El uso de productos fitosanitarios y sus límites máximos residuales (LMR) en la Unión Europea está regulado por el Reglamento (CE) n°396/2005, el cual afecta directamente a la salud pública y es pertinente para el funcionamiento del mercado interior. Y establece que, “...en favor de la libre circulación de mercancías, de la equidad de las condiciones de competencia entre los Estados miembros, así como de un nivel elevado de protección de los consumidores es conveniente fijar a escala comunitaria los límites máximos de residuos (LMR) en productos de origen vegetal y animal, teniendo en cuenta las buenas prácticas agrícolas”. Algunos de estos productos fitosanitarios no están permitidos en determinadas formas de cultivo. Los distintos tipos de agricultura está regulada por los Reglamentos (CE) nº 834/2007 y nº 889/2008, y el nº 203/2012 que modifica el Reglamento (CE) nº 889/2008 y certificada por distintos organismos dependiendo del país en el cual nos encontremos (Tabla 1). Tabla 1. Ejemplos de símbolos y organismos de certificación de los distintos tipos de agricultura según el ámbito geográfico afectado (Fuente: elaboración propia). Agricultura ecológica UE Certificación internacional ecológica TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 5 / 31 Etiqueta ecológica europea Certificación internacional ecológica vfd Entidad de certificación Agroalimentaria Certificación agricultura biológica francesa v Certificación orgánica A mediados del siglo XIX, ya se sabía que la transformación de la uva en vino era el resultado de un proceso microbiano descrito por Luis Pasteur (revisado entre otros, por Bokulich et al., 2016). Desde entonces, la diversidad de la microbiota del viñedo, de la uva y del vino ha sido ampliamente investigada, utilizando los métodos disponibles en cada momento, inicialmente, métodos microbiológicos tradicionales que implican el uso de la microscopía, el cultivo en diferentes medios y el análisis de algunas características bioquímicas. A lo largo de los años, se han realizado numerosos estudios relacionados con el microbioma de la vid, presentando distintas dificultades como: (i) los síntomas externos presentan una gran inestabilidad, es decir, se ha demostrado que las plantas afectadas pueden desarrollar síntomas externos durante un ciclo vegetativo y no mostrarlos al año siguiente (Di Marco et al., 2000); (ii) la aparición de los síntomas de cada enfermedad se relaciona con factores como las condiciones climáticas, principalmente la humedad y la temperatura (Surico et al., 2004); (iii) la sintomatología es versátil, múltiple, compleja y a veces confusa ya que un mismo síntoma puede asociarse a varias patologías. Actualmente, debido a las evidentes consecuencias de la actividad microbiana, se han propuesto diferentes métodos para diagnosticar las condiciones fitosanitarias de los viñedos (Belda et al., 2017). Entre ellas encontramos el uso de imágenes aéreas multiespectrales tomadas por satélite o por drones, técnicas moleculares basadas en ADN como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Cococlin et al., 2013; Wang et al., 2014; Abbasian et al., 2015). Una variante de esta técnica, la qPCR (PCR cuantitativa) o RT-PCR (PCR a tiempo real), permite además cuantificar las poblaciones de cada especie, cepa o tipo de microorganismos presentes en las muestras. Cabe TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 6 / 31 destacar que, las dos últimas décadas han estado caracterizadas por un cambio importante en los enfoques utilizados para el examen microbiano, debido a la introducción de distintos métodos moleculares que incluyen los siguientes: SSCP (Single Stranded Conformational Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism), RAPD-PCR(Random Amplified Polymorphic ADN-PCR) , RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) y ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) que han sido empleados para estudiar el perfil genético de la diversidad microbiana de la vid y el vino (Bruison et al., 2012), y en particular, aquellos basados en los espaciadores genéticos de los genes del ADNr (ADN ribosómico). También la secuenciación del ADN, especialmente cuando se apoya en la amplificación mediante PCR o utiliza nuevas plataformas desarrolladas en este siglo es de gran utilidad para comprender y diagnosticar enfermedades (Kchouck et al., 2017). El empleo de nuevas técnicas moleculares permite detectar la mayoría de los microorganismos (tradicionalmente ignorados) presentes en muestras complejas y deducir las interacciones de la microbiota del viñedo con su estado sanitario y productivo. Para este tipo de análisis, se deben diseñar algoritmos que permitan relacionar los datos microbiológicos de muestras ambientales (suelo, agua, … etc.) con aspectos como la tipicidad del viñedo o con la ocurrencia de anomalías en el proceso de elaboración del vino. Así, en los últimos años se han generado gran cantidad de datos y metadatos que permiten identificar microorganismos presentes con precisión, los cuales han dado lugar a la creación de grandes bancos de información que se están utilizando con profusión. Este tipo de datos permiten establecer correlaciones estadísticas entre presencia/ausencia de microorganismos con cuestiones fisiológicas en el viñedo y en un tiempo posterior intentar establecer relaciones causa/efecto (Belda I. et al., 2016). Una de las empresas más relevantes en este sentido es BiomeMakers (véase https://biomemakers.com), se trata de una empresa española de biotecnología con sede en California, especializada en la identificación y comprensión del microbioma. Entre otras aplicaciones, han desarrollado un test de monitorización del microbioma del suelo del viñedo a través de una herramienta denominada WineSeq (véase https://wineseq.com), que pretender relacionar los datos metagenómicos de los suelos de los viñedos con datos referidos a enfermedades, tratamientos y control de microorganismos. Para el desarrollo de esta tecnología se llevó a cabo el estudio del microbioma del suelo de bodegas pertenecientes a 14 países diferentes, constituyendo un total de 1.500 muestras de tierra procedente de sus viñedos. Gracias a estos estudios han desarrollado una base de datos que relaciona los microbiomas asociados a las diferentes características del suelo. La necesidad de realizar esta revisión bibliográfica está relacionada con la diversa información que se tiene sobre la utilización de tecnologías novedosas que permiten monitorear y diagnosticar las condiciones fitosanitarias del viñedo. Ya que preservar la salud de los viñedos es la única forma de garantizar su vida futura, y para ello es necesario comprender desde la base las posibles enfermedades y controlar y prevenir su desarrollo en el campo. Como bien se sabe, estas técnicas aún son poco conocidas en el mundo de la viticultura, si bien, en otros ámbitos, como la salud humana están siendo ampliamente utilizadas. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 7 / 31 3. OBJETIVOS El objetivo general del presente trabajo es revisar el conocimiento actual sobre la caracterización de la comunidad microbiana del viñedo, y sus aplicaciones a la ecología del viñedo, centrándonos en las diversas interacciones de los microorganismos con la planta. Este tipo de conocimiento permitirá desarrollar estrategias menos agresivas enfocadas a una viticultura sostenible compatible con las cada vez más habituales técnicas de cultivo ecológicas, orgánicas o biológicas y biodinámicas, con el fin de obtener productos inocuos para la salud de los consumidores. Para ello, como objetivo específico, se analizarán las técnicas moleculares disponibles para la identificación y caracterización del microbioma desde su inicio hasta la actualidad. Y también se analizará la aplicación de dichas técnicas para dos aspectos clave en la protección del viñedo: → La identificación de hongos micorrícicos en el suelo del viñedo y sus beneficios. → La determinación de agentes causales enfermedades fúngicas de la madera. 4. METODOLOGÍA Para realizar la búsqueda de los distintos artículos revisados en el presente trabajo, se han utilizado varias bases de datos como: ProQuest, Scopus, Dialnet, Web of Science y Science Direct con las palabras clave (utilizadas tanto en inglés como en español): metagenómica, microbioma del viñedo, enfermedades fúngicas de madera, micorrizas y las siglas PCR, qPCR, ITS, RAPD, AFLP, entre otras. 4.1. CLASIFICACIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA La bibliográfica se ha clasificado en: ▪ Artículos generales sobre técnicas de identificación masiva de microorganismos, los cuales han sido utilizados para describir las distintas técnicas disponibles y comprender su utilización. ▪ Artículos de hongos beneficiosos para el viñedo como las micorrizas. ▪ Artículos sobre enfermedades fúngicas de la madera y sus correspondientes ensayos utilizando estas técnicas. 4.2. REDACCIÓN DEL TEXTO El documento utilizado para la redacción del texto está basado en las normas recogidas en “Normas de Estilo y Formato de TFG Enología”, aunque también nos hemos basado en la nueva propuesta aprobada por la Junta de Centro y el Comité del Grado de Enología, que ha entrado en vigor en el curso 2018/2019, en formato de “Normas de Revisión bibliográfica para Enología”. Además, hemos seguido el documento escrito por Fernández et al., en 2008 “Para empezar a entendernos”, en dicho artículo establece que para realizar una buena revisión bibliográfica se deben revisar al menos 30 – 50 artículos y citar como máximo 30. Dado que los artículos revisados son superiores a 30 artículos y que la utilización de estas nuevas tecnologías es reciente, algunos de los parámetros elegidos para seleccionar los distintos artículos son los siguientes: ▪ Relevancia de autores y numero de citaciones. ▪ Fecha de publicación de artículos, teniendo en cuenta que más del 80% de ellos son publicados a partir de 2010. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 8 / 31 ▪ Considerar que cuando la información está recogida en más de dos artículos, se opta en poner el más reciente o de mayor impacto. 5. ANÁLISIS BIBLIOGRÁFICO 5.1. TÉCNICAS MOLECULARES DISPONIBLES PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA DEL VIÑEDO La identificación del microbioma presente en muestras ambientales del viñedo se apoya básicamente en dos grupos de técnicas, que han evolucionado a lo largo del tiempo: 1. La secuenciación nucleotídica: 2. Los marcadores moleculares Las primeras tecnologías de secuenciación fueron desarrolladas simultáneamente en 1977 por Sanger, de la Universidad de Cambridge y Maxam & Gilbert, de la Universidad de Harvard (Kchouck et al., 2017). Una de estas técnicas de “primera generación de secuenciación”, se convirtió en la técnica de secuenciación más utilizada por su alta eficiencia y su amplia versatilidad (Pareek et al., 2011). A partir de 1990, cuando se empezó a conocer el Genoma Humano, empezaron a surgir variaciones en la técnica de secuenciación de Sanger, como el uso de fluorocromos no radiactivos, su combinación con PCR, la automatización de parte del proceso…, entre otras y así, se ha mantenido vigente durante 30 años, y se sigue utilizando en la actualidad de forma puntual. Sin embargo, su alto coste en términos económicos tanto de tiempo como de mano de obra han limitado su utilización. A partir de los años 2000 y a raíz de la necesidad de secuenciar grandes cantidades de ADN a bajo coste y con el mayor rendimiento posible, surgieron nuevas técnicas de secuenciación, dando lugar a lo que se ha denominado “segunda generación de secuenciación” basada en: (1) generación de millones de lecturas en paralelo, (2) acortar tiempos y (3) disminuir el coste (Kchouck et al., 2017). Entre las nuevas tecnologías encontramos tres plataformas principales como la secuenciación de Roche/454® que apareció en el mercado en el año 2005, utilizando la técnica de la pirosecuenciación (Mardis, 2008), que permite registrar la energía liberada durante la rotura del pirofosfato en cada unión de un nuevo nucleótido. En 2010, Life Technologies comercializó la tecnología de secuenciación Ion Torrent TM se basa en la detección del ion hidrógeno liberado durante el proceso de secuenciación (Rothberg, 2011) y en cuanto a las principales ventajas se centra en las longitudes de lecturas más largas y el tiempo de ejecución entre 2 y 8 horas (Reuter, 2015). Y, por último, la compañía Solexa desarrolló una nueva tecnología denominada Illumina®, en esta técnica las muestras de ADN se fragmentan al azar, admiten secuencias masivas paralelas utilizando un método patentado que detecta bases simples, ya que se incorporan a cadenas de ADN en crecimiento. Esta última es la técnica más utilizada en el mercado de secuenciación masiva (Balasubramaniam, 2015). Las tecnologías de secuenciación masiva han revolucionado el análisis del ADN y han sido las más utilizadas en comparación con la primera generación, pero en los últimos años, para corregir los problemas causados por las tecnologías de segunda generación, los científicos han desarrollado nuevas técnicas conocidas como “tercera generación de secuenciación”. Esta “tercera generación” pretender ofrecer un bajo coste de secuenciación y una fácil preparación de la muestra sin necesidad de amplificar por PCR y tratar de realizar la propia secuenciación a partir de una única molécula de ADN, en un tiempo más rápido consiguiendo lecturas más largas y detectar variaciones en la TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 15 / 31 5.3. IDENTIFICACIÓN Y MANEJO DE HONGOS MICORRÍCICOS Entre los microorganismos del suelo, los hongos micorrícicos son capaces de establecer asociaciones simbióticas con las raíces de la vid (Trouvelot et al., 2015) siendo probablemente la interacción beneficiosa más extendida entre plantas y microorganismos. Se produce cuando las plantas y las hifas de los hongos reconocen moléculas señal en la rizosfera y realizan un intercambio de compuestos solubles en el suelo (Trouvelot et al., 2015). El crecimiento de estos hongos se ve afectado en cierta manera por el manejo y las características del suelo y en menor medida por la etapa de desarrollo de la vid (Schreiner, 2009). Entre los principales beneficios de la micorrización se suelen citar los siguientes: (i) mejoran el acceso de la planta al agua y a los nutrientes del suelo y regula el transporte de fósforo, nitrógeno y otros elementos que hay en el suelo; (ii) aumentan la tolerancia a la salinidad, reducen la clorosis férrica y la toxicidad de metales pesados del suelo; (iii) protegen frente a enfermedades. Existen numerosos estudios basa en metagenómica en los que se establecen relaciones en cuanto a la presencia y cantidad de determinados hongos o microorganismos con la presencia de micorrizas y sus beneficios asociados entre determinados tipos de hongos como: Glomus s.str., Rhizophagus, Funneliformis, Claroideoglomus y Paraglomus. (Holland et al., 2014). Pero a veces es difícil su detección puesto que no suelen ser capaces de completar su ciclo de vida en ausencia de una planta hospedante (Trouvelot et al., 2015) y carecen de las estructuras en las que se basa la identificación morfológica de las especies Entre los beneficios concretos documentados de las micorrizas en vid podemos destacar: • Contribución significativa de absorción de fósforo y realizar un control ecológico y con menos residuos que pudiesen entrar en la cadena alimentaria (Smith et al.,011) • Absorción de nitrógeno (Smith et al., 2010). Tanto el aporte de fósforo como el de nitrógeno, hace que microorganismos que no tenían una presencia numéricamente significativa aprovechen estos nutrientes para desarrollarse. Este tipo de interacciones entre microorganismos no siempre dan lugar a resultados beneficiosos para la vid, sino que también puede ocasionar un problema, por la generación de residuos y por contribuir al desorden del ecosistema biológico. Entre otros elementos que regulan funciones básicas que las plantas, encontramos otros elementos químicos que encontramos en el suelo están el potasio, el magnesio, el zinc y el boro. Los suelos con deficiencia de potasio son más propensos s sufrir problemas derivados de la sequía y el frío (Reynolds, 2010), y la deficiencia de boro puede ocasionar corrimiento en el racimo. Las principales ventajas que encontramos en la asociación viñedo-hongos micorrícicos son: • Mejorar la absorción de agua y nutrientes al mismo tiempo (Kohler et al., 2008). • Mejorar la absorción de nutrientes del suelo y la tolerancia a la salinidad y aumentan el crecimiento del viñedo (Khalil, 2013) • Reducir las altas concentraciones de caliza activa que pueden inhibir la disponibilidad de hierro, e inducir a la clorosis férrica afectando al rendimiento de la planta y a la calidad de la uva (Bavaresco et al., 2006). TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 16 / 31 Teniendo en cuenta todas las ventajas que suponen los hongos micorrícicos, también esta simbiosis se establece como una alternativa para el desarrollo de una agricultura sostenible, reemplazando el uso de productos fitosanitarios que, como hemos mencionado previamente, pueden ocasionar graves problemas si pasan a la cadena alimentaria. Para ello debemos conocer la biodiversidad de los hongos micorrícicos presentes en los suelos de los viñedos y su efecto a lo largo del ciclo vegetativo, ya que no todas las variedades de vid presentan la misma afinidad. También se ha observado que las condiciones ambientales y geográficas pueden afectar a las distintas especies de hongos e interferir en los beneficios previamente descritos. También en otros estudios como el de Trouvelot et al., en 2015 se ha observado que la presencia de ciertos hongos micorrícicos promueve la acumulación de metabolitos secundarios más abundantes en las plantas como terpenos o fenoles. Aún no está claro por qué o a través de qué rutas bioquímicas podrían aumentar la cantidad de metabolitos secundarios en las plantas colonizadas por hongos micorrícicos, pero se cree que una razón sería la mayor absorción de nutrientes principalmente de fósforo, que actuaría como precursor de acetyl-CoA, ATP y NADPH, que participan en la biosíntesis de isoprenoides. Del mismo modo, la mayor disponibilidad de nitrógeno actuaría como precursor de diferentes aminoácidos (Zeng et al., 2013). En nuestro caso, la vid posee altas cantidades de polifenoles, encontrándose principalmente en raíces, tallos, hojas, flores y frutos y que van a depender de los factores genéticos, factores culturales y factores ambientales. En el estudio elaborado por Sbrana et al., en el año 2014, se recoge que la presencia de hongos micorrícicos favorece la acumulación de polifenoles y genera nuevas oportunidades para el empleo de los mismos. Por otro lado, en el estudio elaborado por Krüger et al., en el año 2009 establecen que la caracterización molecular de hongos micorrícicos se logra en la mayoría de los casos mediante la utilización de PCR. El principal inconveniente que encontraron en este estudio fue la extracción del ADN de las esporas, puesto que la mayoría de las veces se realiza en raíces. Además, hay muchas especies no se pueden identificar de manera veraz a partir de muestras de campo heterogéneas, y cuando se identifican se pueden determinar características morfológicas similares como una sola especie. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 17 / 31 Figura 5. Amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores SSUmAf – LSUmAr y SSUmCf – LSUmBr. (a) PCR en fragmentos de ADN, utilizando diferentes temperaturas y una concentración 1 ng µl − 1. A.s., Acaulospora sp .; G.s., Glomus sp .; G.l., Glomus luteum; P.s., Pacispora scintillans; K.k., Kuklospora kentinensis; G.i., Glomus intraradices; S.h., Scutellospora heterogama. (b) PCR usando 1 µl de una dilución de plásmidos 10 veces (100 pg - 0.01 fg µl − 1) como plantilla, correspondiente a 5 × 107 a 5 moléculas plasmídicas en 20 µl de volumen de reacción de PCR. (Fuente: Krüger et al., 2009). Concluyendo así, que actualmente no se han realizado muchos estudios sobre la aplicación de técnicas moleculares sobre hongos micorrícicos. 5.4. IDENTIFICACIÓN Y MANEJO DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES FÚNGICAS DE LA MADERA Las enfermedades fúngicas de madera son una de las principales amenazas para la sostenibilidad de la viticultura, causando importantes pérdidas económicas debido a la reducción de los rendimientos, acortan la vida útil de los viñedos y provocan elevados costes de gestión de cultivos por la utilización de m0edidas preventivas culturales y químicas (Bertsch et al., 2013; Kaplan et al., 2016). A partir de la década de 1990 es cuando se comienza a detectar un incremento de estas enfermedades en todo el mundo, principalmente en plantaciones jóvenes (Agustí-Brisach et al., 2013), que se han visto favorecidas por diversos factores como son los cambios en las prácticas culturales y en el manejo de los viñedos. A principios del siglo XX, para controlar algunas enfermedades fúngicas se utilizó arsenito sódico. Entre las características más importantes de este compuesto son la alta toxicidad y su capacidad de penetrar hasta el xilema de la cepa, aniquilando a la mayor parte de los hongos (Larignon et al., 2008). Sin embargo, las sales de arsenito sódico son cancerígenas, lo que ha llevado a la prohibición de su uso en todos los países y para todos los cultivos (Spinosi et al., 2009). También en algunos países a principios de la década de 2000 se prohibió la utilización de fungicidas como bencimidazol y bromuro de metilo debido a preocupaciones ambientales y de salud pública (Decoin 2001; EPA 1997). Posteriormente, tras la prohibición de dichos compuestos, se han investigado otros productos químicos de síntesis para sustituirles, pero en los ensayos realizados se ha demostrado una menor eficiencia, por tanto, la erradicación completa de las enfermedades no ha sido posible (Sosnowski et al., 2010). El control se centra en la prevención de las enfermedades (Úrbez-Torres, 2011) y para ello se ha elaborado un programa de manejo integrado que incluye estrategias de control físico, químico, biológico (Halleen y Fourie, 2016). Algunas enfermedades presentan sintomatologías similares, lo que dificulta su identificación. Por ejemplo, la enfermedad de Petri y el pie negro se caracterizan por brotación tardía, entrenudos cortos, follaje clorótico con bordes necróticos y marchitez de hojas o brotes enteros. Para distinguir el agente causante de la patología, se recurre a la identificación de ADN a través de técnicas moleculares. A continuación, se describen las principales enfermedades fúngicas de madera que encontramos en viñedo y el papel que pueden jugar en su detección, identificación y el empleo de las técnicas moleculares. 5.4.1. PIE NEGRO Esta enfermedad fue descrita por primera vez en el año 1961 en Francia (Maluta y Larignon, 1991), pero a finales de los años 90 fue cuando comenzaron a incrementarse las incidencias provocadas por esta enfermedad y empezó a ser relevante (Gramaje y Armengol, 2011). TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 18 / 31 En España, los primeros estudios que se conocen son del año 2000, en los cuales se establece que el pie negro está caracterizado por dañar el sistema radicular de las plantas jóvenes. En ellas se puede observar lesiones oscuras y necróticas que causan una reducción en la masa radicular. En la parte aérea se observan coloraciones oscuras y necrosis que se inician desde la base del sarmiento (Agustí-Brisach et al., 2013). Como consecuencia de estos daños, las cepas presentan un menor desarrollo y vigor, ausencia o retraso de la brotación, entrenudos cortos, clorosis en hojas o una muerte prematura de la planta durante el periodo vegetativo (Úrbez-Torres et al., 2014). Los síntomas de la parte aérea podrían confundirse con otras enfermedades como la Enfermedad de Petri que mencionaremos a continuación. En ese sentido es recomendable la utilización de técnicas moleculares para su identificación y así elaborar un plan de control eficaz y específico para dicha enfermedad. Figura 6. Pie negro (Imagen izquierda: https://wineseq.com; Imagen derecha: Petit et al., 2011) En cuando a los agentes causantes del pie negro, encontramos especies de distintos géneros que han sido descritos a lo largo de estos últimos años: Campylocarpon, Cylindrocarpon, Cylindrocladiella, Ilyonectria y Dactylonectria (Agustí-Brisach y Armengol, 2014). Las dos primeras especies asociadas fueron Cylindrocarpon destructans que han sido reclasificadas como Cylindrocarpon liriodendri (Halleen et al., 2006) en base a las secuencias ITS (Internal Transcribed Spacer) del ADNr y el gen de la β-tubulina, y C. obtusisporium (Grasso & Magnano Di San Lio, 1975) y posteriormente en el año 2004 Halleen et al., describieron una nueva especie C.macrodidymum y en el año 2008 se describió otra especie denominada C. pauciseotatum. Por ello, se puede afirmar que son diversos los agentes causantes de la enfermedad del pie negro que no son identificables por su caracterización fenotípica. Actualmente no se disponen de medidas de control eficaces que erradiquen estos hongos en plantaciones establecidas, por lo que se llevan a cabo estrategias de prevención y vigilancia o la utilización de plantas cebo para detectar la presencia de este hongo (Agustí-Brisach et al., 2014). Las medidas que se han desarrollado a lo largo de los años para el control del Pie Negro se basan en medidas culturales: utilización de material vegetal sano y prevención o corrección de las condiciones que pueden ocasionar estrés a la planta y favorecer el desarrollo de la enfermedad. Se han utilizado también medidas de control químico como aplicación de fungicidas o medidas de control biológico, como en el estudio de Halleen et al., 2007 en el cual utilizaron el hongo Trichoderma harzianum, pero determinaron que el empleo de dicho hongo no era capaz de mantener las plantas con un nivel de infección bajo. Cada vez más se están recurriendo al empleo de nuevas técnicas moleculares basadas en la extracción de ADN, amplificación por PCR y su posterior secuenciación para la TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 19 / 31 detección de los agentes causantes de esta enfermedad. Basados en los resultados de la secuenciación se han desarrollado iniciadores específicos para hacer ensayos mediante métodos convencionales de PCR. Sin embargo, éstos no permiten una cuantificación precisa del ADN (Filion et al., 2003), por ello se recurre a la PCR cuantitativa (qPCR) ya que tiene la ventaja de ser más eficaz y requiere menos tiempo. En el estudio elaborado por Agustí-Brisach en el año 2014, tanto en campos de vivero como en campos de planta madre, se confirmó que los suelos de ambos tipos de campo son fuente importante de inóculo para los patógenos del pie negro. Por ello las técnicas de qPCR, tienen un elevado valor para la detección rápida de patógenos. 5.4.2. ENFERMEDAD DE PETRI Y YESCA. Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium aleophilum son dos especies de hongos que causan pérdidas económicas en viñedo. Dado que apenas se conocen medidas de control se deben tomar medidas defensivas proactivas (Martin et al., 2012). Ambas especies están asociadas a la enfermedad de Petri en planta joven y a Yesca en planta adulta. La enfermedad de Petri recibe el nombre del primer investigador que describió los síntomas típicos de esta enfermedad (Petri, 1912). Las plantas que se ven afectadas por dicha enfermedad presentan hojas pequeñas, cloróticas y necrosadas. Se observan brotaciones raquíticas y entrenudos cotos. Estos síntomas, a veces, se pueden confundir con que casusa la enfermedad de Pie Negro (Figura 6). Figura 7. Enfermedad de Petri (Fuente: MAPAMA) Por otro lado, la yesca es otra de las enfermedades más conocidas de la vid (Larginon, 2004), especialmente desde la prohibición de arsenito sódico en el 2003 (Surico et al., 2006). Tiene dos formas de propagación: (i) Lenta y crónica: las plantas que se ven afectadas presentan hojas decoloradas con necrosis internerviales de color amarillo en variedades blancas y de color rojizo en variedades tintas. Comienza desde las hojas basales y se va extendiendo por el resto de la planta. (ii) forma rápida o apopléjica: consiste en la muerte súbita de la planta. Las hojas adquieren una coloración verdegrisácea y la planta acaba secándose totalmente con las hojas unidas al sarmiento. Se debe a un drástico desequilibrio hídrico. Se da principalmente en terrenos arcillosos, profundos y frescos. En las bayas también suelen aparecer puntos necrosados, desarrollados en la epidermis. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 20 / 31 Figura 8. Yesca en vid y síntomas foliares (Fuente: MAPAMA) A lo largo de los años, diversos investigadores han tratado de estudiar el papel que desempeña el hongo Phaeomoniella chlamydospora en las enfermedades de la madera de vid y, aunque las investigaciones van avanzando, todavía no se conoce completamente la etiología de dichas enfermedades, pero se ha estudiado que pueden estar influenciadas por varios hongos que desencadenan distintas infecciones provocando necrosis en los vasos. Según Mugnai et al.,1999 las esporas de hongo Phaeomoniella chlamydospora penetran por los cortes de poda y las heridas (Edwards et al., 2007). Por tanto, para identificar especies de un mismo género se han propuesto diferentes sistemas taxonómicos, basados en caracteres morfológicos, como el tamaño y la forma de conidios; formación de clamidosporas y estructura de conidióforos. Sin embargo, muchas veces, especies muy relacionadas entre sí difieren en un solo carácter, lo que puede inducir a una mala identificación. Además, estas técnicas, como hemos citado anteriormente requieren gran cantidad de material y experiencia taxonómica para obtener resultados correctos. Las técnicas moleculares, basadas en análisis de ADN, corresponden a metodologías más rápidas, precisas, objetivas y aplicables a un gran número de muestras. Se han realizado varios estudios referidos a la utilización de la PCR, la primera estrategia propuesta, fue la utilización de PCR en tiempo real propuesta por Overton et al., en el año 2004, usando la técnica SYBRGreen®, la cual se emplea como colorante para la cuantificación de ADN de doble hélice en algunos métodos de PCR cuantitativa o para la visualización del ADN en la electroforesis con geles de agarosa. Otro estudio, como el de Edwards et al. en 2007 analiza los ensayos de PCR en tiempo real utilizando la técnica de TaqMan®. Aroca et al., en el año 2007 estudiaron la posibilidad de desarrollar una estrategia basada en PCR dirigida a regiones específicas (ITS1/ITS4 del ADNr o 5.8S del ARNr) para detectar e identificar especies de Phaeoacremonium aisladas de vides comparándola con los métodos tradicionales (cultivo tradicional en placa Petri). Los resultados se recogen en la Figura 9. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 21 / 31 Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa (1.5%) de los fragmentos de ADN amplificados por PCR con los iniciadores ITS1/ITS4 de Phaeoacremonium (19) y otras especies de hongos (1017). 1-P.aleophilum; 2-P.parasiticum; 3-P.inflatipes; 4-P.mortoniae; 5-P.angustius; 6-P.viticola; 7P.scolyti; 8-P.krajdenii; 9-P.venezuelense; 10-Botryosphaeria parva; 11-Phomopsis spp.; 12Phaeomoniella chlamydospora; 13-Botryosphaeria obusa; 14-Phialophora mustea; 15Phialemonium dimorphosporum; 16-ADN uva; 17No hay ADN. (Fuente: Aroca et al., 2007) El análisis se realizó en 6 horas (extracción y PCR), mientras que el cultivo y el posterior aislamiento de los hongos tardaron entre 20 y 30 días. Los resultados obtenidos fueron la rapidez y la sensibilidad, cualidades que son relevantes cuando se trata de este patógeno, pues dicho hongo crece muy lentamente en un medio de crecimiento enriquecido lo que hace que la detección sea prolongada. Esto también significa que Phaeocremonium suele estar cubierto de otros patógenos, que pueden ocultar resultados positivos de detección. La comparación de los métodos tradicionales y de PCR para detectar Phaeocremonium mostró que este último tiene una mayor sensibilidad y da resultados menos sesgados que los métodos tradicionales. Sin embargo, el método más exitoso fue propuesto por Martín et al. en el año 2012, en el cual logró detectar el ADN de Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium aleophilum en material vegetal utilizando la qPCR. sin la necesidad de aislamiento fúngico reduciendo así el tiempo de análisis y el coste. 5.4.3. EUTIPIOSIS Es una enfermedad crónica de la madera. En España fue diagnosticada por primera vez en el año 1979 en Badajoz (Muruamendiaraz et al., 2007) desde entonces se ha extendido a la gran mayoría de viñedos españoles. La infección de Eutipiosis ocurre a través de las heridas de poda, donde el hongo coloniza los vasos del xilema y causa necrosis al producir una serie de enzimas que degradan la pared celular. Las plantas afectadas muestran pámpanos débiles, entrenudos cortos, hojas cloróticas y deformadas con necrosis, también se observa corrimiento del racimo. La madera de poda presenta un color marrón en forma de “V”. Generalmente, el hongo causante de esta enfermedad es Eutypa lata, pero en California se ha detectado otra especie Eutypa leptoplaca causante de esta enfermedad (Trouillas y Gubler, 2004). Actualmente, no existen tratamientos eficaces que erradiquen la infección de esta enfermedad, por lo que se utilizan tratamientos preventivos mediante la utilización de métodos culturales, destinados a evitar períodos en los cuales las heridas de poda sean susceptibles a la colonización, biológicos y químicos, destinados a proteger las heridas a través de efectos antifúngicos. Uno de los métodos de biocontrol más estudiados es el uso de Trichoderma harzianum para el control de Eutypa lata. Se ha demostrado la actividad fungiestática de los compuestos volátiles producidos por Trichoderma harzianum, así como su capacidad para inhibir el crecimiento micelar y reducir la infección (Kotze et al., 2011). En un estudio elaborado por Mutawila et al., 2017 se caracterizaron los dos hongos (Eutypa lata y Trichoderma) mediante la utilización de qPCR y perfiles de metabolitos (actividades enzimáticas y contenido de polifenoles). Las muestras se trataron en autoclave y se estudió la acción de Trichoderma en la protección de las heridas de poda. El modelo de cultivo celular que se desarrolló en este estudio puede proporcionar un sistema simple pero confiable para estudios de expresión génica. Los diferentes patrones de expresión de los genes relacionados con la defensa (basados en la trascriptómica) podrían ser una indicación de la participación de factores de transcripción en la respuesta de la vid a hongos patógenos y no patógenos que posteriormente determinan si las interacciones darán lugar a enfermedad, resistencia o simbiosis. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 22 / 31 Otro de las aplicaciones de las metodologías moleculares ha sido la que se refleja en el estudio desarrollado por Moisy et al., en el 2017 desarrollaron un método basado por un lado en el aislamiento del hongo y uso de microscopía; por otro la utilización de la PCR tradicional y de la qPCR. Comprobaron que el aislamiento del hongo y su posterior microscopía era un proceso muy lento y daba lugar a una estimación de biomasa errónea. Y, por último, que el empleo de la qPCR, era una herramienta precisa la cual proporcionó una estimación cuantitativa de biomasa fúngica eficiente, mostrando así una correlación entre la capacidad del hongo para inducir síntomas foliares y colonizar la madera. 5.4.4. PODREDUMBRE GRIS Botrytis cinerea es el microorganismo fúngico más relevante en la vitivinicultura ya que puede infectar a las bayas y ocasionar la conocida “Podredumbre gris o moho gris” (Keller et al., 2003). Este hongo disminuye la calidad de los vinos puesto que contiene una enzima denominada lacasa que afecta a los ácidos principales como ácido tartárico y málico y a los compuestos aromáticos (La Guerche et al., 2006). Nair et al., en 1995, en su estudio detectaron que el primer momento de infección es en floración, seguido de un periodo de latencia en el cual el patógeno está dentro de la baya sin mostrar ningún síntoma hasta que las bayas comienzan a madurar. El control de este hongo es muy importante ya que: i) Puede funcionar como un saprófito, necrófito o parásito; ii) puede hibernar y esporular en múltiples fuentes de inóculo; iii) existen varias vías de infección; iv) pueden ocurrir con condiciones ambientales variadas, que difieren entre las vías de infección (Hill et al. 2014). En condiciones favorables para el hongo, produce abundantes conidios en racimo, por ello es muy importante detectar su infección de forma temprana. Figura 10. Infección de Botrytis cinerea en racimo de variedad Malvasía (Fotografías tomadas en viñedo de Toro, Zamora) Para reducir el impacto ocasionado por este hongo, los viticultores normalmente recurren a tratamientos preventivos con fungicidas de forma rutinaria campaña tras campaña. Pero la utilización de tratamientos químicos haciendo uso de fungicidas, es una práctica cada vez menos recomendada y menos aceptada. Puesto que como hemos mencionado previamente las leyes que rigen la producción de alimentos para el consumo humano y animal son cada día más rigurosas en relación a una producción agrícola segura y respetuosa con el medio ambiente y, sobre todo, porque estos tratamientos químicos pueden están en la cadena alimentaria y provocar graves problemas en la salud de los consumidores. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 23 / 31 Por ello, se han desarrollado métodos alternativos a los fungicidas, como la aplicación de microorganismos antagónicos, la aplicación de sustancias antimicrobianas naturales para controlar el desarrollo de la enfermedad y la cantidad de esporas, y la utilización de técnicas moleculares para identificar de forma más precisa y precoz su aparición. Estos aspectos han atraído la atención y el interés de numerosos investigadores para caracterizar las poblaciones del patógeno en distintas regiones del planeta. Los estudios dirigidos a identificar y detectar de forma precoz este hongo han seguido el modelo histórico de la evolución del uso de los diferentes tipos de marcadores moleculares descritos en el apartado 5.1. Técnicas moleculares disponibles para la identificación y caracterización del microbioma de la vid. Así, los primeros estudios llevados a cabo con marcadores moleculares en Botrytis cinerea datan de principios de los 90, en ellos se analizaron marcadores de tipo RAPD. En 1993 Van de VlugtBergmans et al., publicaron un trabajo centrado en la caracterización y diferenciación de Botrytis cinerea de una pequeña colección de aislados de campo recogidos en Holanda y su comparación con las dos cepas de referencia de esta especie SAS56 y SAS405. Con un número reducido de marcadores fue posible diferenciarlos todos ellos entre sí y con las cepas de referencia de manera inequívoca, resultando llamativo el hecho de que dos cepas recogidas con un intervalo de tiempo de 4 años y a partir de huéspedes diferentes sólo difirieran en un marcador. En el año 2000 en España, Alfonso et al., realizaron un estudio sobre 40 aislados recogidos en invernaderos del sur del país, comprobando que la población en su conjunto era muy heterogénea, mostrando muy poca diferenciación de las subpoblaciones de los diferentes invernaderos. En el estudio elaborado por Diguta et al., 2010, se concluye que la cantidad de esporas que se producen antes de la introducción de técnicas moleculares, permitían identificar y cuantificar la población del hongo mediante microscopía óptica, pero es una técnica que requiere tiempo, experiencia para la identificación precisa de las esporas y tiene un límite de detección bajo (Hunter et al., 2009). También muchos patógenos están enmascarados por el crecimiento de hongos de crecimiento más rápido (Martínez et al., 2010). Por ello cada vez más se están utilizando técnicas moleculares para la identificación de esporas, basadas en métodos derivados de la PCR (West et al., 2008), sin embargo, esta cuantificación no es muy precisa. Por lo que para evaluar la presencia de esporas específicas con mayor precisión se utilizan técnicas de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (Luo et al., 2010), esta técnica es específica para la detección y contaminación de Botrytis cinerea en uvas y así optimizar el uso de fungicidas. La introducción de qPCR ha proporcionado un mecanismo para detectar y cuantificar simultáneamente ADN de organismos específicos (Park et al., 2011). Los métodos de detección basados en PCR son rápidos, sensibles y confiables en comparación con el análisis convencional de microscopía óptica, y a menudo más sensibles que las técnicas de inmunodetección (Diguta et al., 2010). Compuestos orgánicos como polifenoles y polisacáridos presentes en los tejidos vegetales pueden inhibir o potenciar la amplificación por PCR (Varma et al., 2007). En el estudio elaborado por Saito et al., en 2013 establecen que la aplicación de qPCR, se ha desarrollado como una aplicación para evaluar el riesgo de la enfermedad la cual proporciona una alternativa a las técnicas de detección visual y cultural. El estudio más reciente ha sido realizado por Ammour et al., en el 2019, este estudio está basado en el procedimiento desarrollado por Saito et al., en 2013, en el que se introducen algunas adaptaciones con respecto al manejo del material vegetal antes de la extracción de ADN. En dicho ensayo compararon la utilización de qPCR con las técnicas micológicas tradicionales para cuantificar Botrytis cinerea en función de la colonización y la esporulación en racimos. Concluyendo así una vez más que los métodos tradicionales llevan mucho tiempo, mientras que el ensayo de qPCR tarda aproximadamente de 3 a 4 horas, y proporciona resultados sensibles, específicos y confiables. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADAS A LA VITICULTURA María del Prado Orduñez Cáceres UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Grado en Enología 24 / 31 6. CONCLUSIONES El estado sanitario de los viñedos debe ser controlado para garantizar la calidad del viñedo y su posterior proceso de vinificación. Las técnicas de identificación molecular son herramientas de investigación potentes para estudios biológicos, que pueden aplicarse a la detección de enfermedades incluso antes de la aparición de síntomas, evitando así la posible propagación de patógenos y dando lugar a definir estrategias específicas y eficaces en cada caso. El uso correcto de estas técnicas permite ahorrar grandes cantidades de dinero derivadas del uso indistinto de insumos y las enormes pérdidas ocasionadas por la muerte del viñedo y su posterior reemplazo, como ya se ha puesto de manifiesto en los estudios publicados Actualmente, como ya hemos comentado, en el mundo de la viticultura y enología sobre el uso de estas técnicas y su interés en el mundo de la enología, aún hay un gran desconocimiento pero cabe destacar que cada vez más se están empleando técnicas moleculares para determinar la presencia/ausencia de microorganismos con las condiciones sanitarias y productivas del viñedo. Sin embargo, algunos microorganismos y empresas como Biomemakers tienen registrados una serie de resultados que han sido publicados como “Casos de éxito de 2017”. La mejora de estas técnicas y su accesibilidad conllevará el desarrollo de nuevas herramientas para el estudio completo de los suelos vitícolas y a su vez proporcionaran la información necesaria para los enólogos para realizar un control estricto sobre las enfermedades fúngicas de madera presentes y su posterior control así como sobre las poblaciones de microorganismos presentes durante la elaboración de vinos, que no eran sujeto de la presente revisión bibliográfica, pero cuyo abordaje es similar al descrito.