Cuantificación de la expresión de genes de la sinapsis inmunológica por PCR digital: aplicaciones en la sepsis

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR, HISTOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA TESIS DOCTORAL: CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES DE LA SINAPSIS INMUNOLÓGICA POR PCR DIGITAL: APLICACIONES EN LA SEPSIS SILVIA MARTÍN ALFONSO Valladolid, 2019 1 2 DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR, HISTOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA Programa Oficial de Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud TESIS DOCTORAL: CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES DE LA SINAPSIS INMUNOLÓGICA POR PCR DIGITAL: APLICACIONES EN LA SEPSIS Presentado por Dña. Silvia Martín Alfonso para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid Dirigido por: Dr. Jesús Bermejo Martín y Dr. Cesar Aldecoa Alvarez-Santullano Tutor: Eduardo Tamayo 3 Parte de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la financiación de los fondos FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) “Una manera de hacer Europa” y Fondo de Investigaciones Sanitarias, “Instituto de Salud Carlos III” Proyecto [PI16/01156]. 4 AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES DE TESIS D. JESÚS F. BERMEJO MARTÍN con D.N.I. nº 09344393E Doctor en Medicina y Cirugía, licenciado especialista en Inmunología Clínica. Investigador principal del Laboratory of Biomedical Research in Sepsis (bio.sepsis), D. CESAR ALDECOA ALVAREZ-SANTULLANO con D.N.I. nº 11404508G Doctor en Medicina y Cirugía, licenciado especialista en Anestesiología y Reanimación, jefe de servicio en el Hospital Universitario Río Hortega de Valladolid, como directores de la tesis doctoral titulada: “CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES DE LA SINAPSIS INMUNOLÓGICA POR PCR DIGITAL: APLICACIONES EN LA SEPSIS” presentada por Dña. SILVIA MARTIN ALFONSO con D.N.I. nº 71163370J , alumna del Programa Oficial de Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud, autorizan la presentación de la misma, considerando que el trabajo reúne los requisitos necesarios para poder ser presentado como Tesis Doctoral y que la autora ha demostrado un adecuado manejo del método científico como para poder optar al grado de Doctor por la Universidad de Valladolid. 5 6 A mis Padres y Rober 7 Agradecimientos Pensando en todo el mundo al que quiero dar las gracias me he dado cuenta de la cantidad de gente que me ha ayudado de una manera u otra y lo afortunada que me hace sentir. Así que, ¡gracias! A todas las personas que han puesto su granito de arena para que este trabajo vea la luz. Gracias a todos mis compañeros de Anestesiología del Hospital Rio Hortega que durante muchos meses, varios años de hecho, me han ayudado reclutando pacientes, recogiendo datos, muestras, etc. Gracias sobre todo por vuestra paciencia, pero también por vuestra indispensable y valiosa colaboración. Gracias a mis directores de tesis, Dr. Jesús F. Bermejo Martín y Dr. César Aldecoa ÁlvarezSantullano, en primer lugar, por confiar en mi para llevar este proyecto a cabo, pero también por el tiempo que habéis dedicado a dirigirlo y gracias a ello lo que he aprendido de vosotros. Jesús, siempre te estaré agradecida por permitirme trabajar con vuestro increíble equipo, he descubierto lo apasionante de la investigación a vuestro lado y realmente os admiro por el esfuerzo y dedicación que poneis en todo lo que hacéis. Quiero dar las gracias también al resto del equipo de investigación con el que he trabajado, en especial a Raquel, Marta y Alicia, que como Jesús habéis tenido tanta paciencia y amabilidad conmigo. Y por supuesto, gracias Cesar, por insistir cada en día en que no me conforme, que nuestro trabajo clínico sea mucho más, y darme la oportunidad de que así sea. Gracias a las personas que más admiro en mi vida, mis padres Javier y Ana, de las que siempre he recibido apoyo y amor incondicional, pero también los valores de esfuerzo, trabajo, fuerza de voluntad, respeto, gratitud, humildad y honestidad. Gracias porque vosotros sois los que me habéis dado la posibilidad en la vida de que alcance lo que me proponga, y porque cuando no ha salido algo bien a la primera siempre habéis sido los primeros en animarme para volver a intentarlo. Estoy infinitamente orgullosa de vosotros, gracias por todo lo que me dais, muchas veces sin nada comparable a cambio. 8 Gracias al pilar fundamental de mi vida, Rober, mi compañero de vida, gracias porque sin tu ayuda y paciencia día a día nada sería posible. Gracias por mirar siempre hacia adelante y remar en la misma dirección, gracias porque haces que mi vida sea plena. Suerte la mía que apareciste en mi camino y gracias a ti que sigues guiándome en él cuando más lo necesito. De ti he aprendido que la prudencia, paciencia y perseverancia dan sus frutos, también lo importante que es ser feliz cada uno de los días de la vida, y no podría haber elegido mejor persona, de la que me sienta tan orgullosa, ni mejor acompañante en la vida. Gracias a todos aquellos de los que recibo en el día a día una sonrisa, una buena palabra, a todos aquellos que siempre están en lo bueno y en lo malo. Gracias Laura y Ester que me habéis enseñado tanto y ayudado, gracias por vuestra amistad y porque veros en el hospital me alegra el día. Gracias Sara, Emilse, Rocio, que buenos momentos hemos vivido, y todos los que vendrán. Gracias porque vuestra amistad no tiene precio, siempre estaréis ahí, como en la facultad, codo con codo ayudándonos en todo. Solo puedo deciros a todos una vez más GRACIAS, de corazón. “Todo el mundo trata de realizar algo grande, sin darse cuenta de que la vida se compone de cosas pequeñas”. Frank Clark. “Todo llega a aquél que se apresura mientras espera”. “No encuentres fallos, encuentra un remedio”. Henry Ford 15 Ig: Inmunoglobulina LOD: Logistic organ dysfunction MCP-1: proteína quimiotáctica de monocitos MIF: macrophage migration inhibitory factor MOSF: Multiple organ system failure MPM: Mortality probability model NK: Natural Killers ODIN: Organ dysfunction and/or infection OOP: Optimal operating point OSF: Organ system failure PCR: Polymerasa Chain Reaction PCR: proteína C reactiva PCT: procalcitonina PD-1: receptor de muerte programada PD-L1: Ligando del receptor de muerte programada proADM: pro-adrenomedulina REA: Unidad de Reanimación Rpm: Revoluciones por minuto qRT-PCR: Transcripción reversa en tiempo real Reacción en cadena de la polimerasa SAPS: Simplified acute physiologic score SDRA: Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo SI: Sistema Inmune SOFA: Sequential organ failure assessment. 16 TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa TTPA: Tiempo de tromboplastina parcial activado UCI: Unidad de cuidados intensivos 17 Resumen 18 RESUMEN La sepsis es uno de los mayores problemas de nuestros días que ha de afronta la sanidad en todo el mundo, siendo una de las patologías más prevalentes en los servicios de urgencias y cuidados críticos, constituyendo la primera causa de muerte no coronaria a nivel mundial. Debido a su elevada morbilidad y mortalidad, es una grave amenaza cuando se diagnostica y además cuenta con un incremento progresivo en su prevalencia e incidencia, siendo un serio reto para el sistema sanitario también debido a la carga socioeconómica que representa. En concreto en los pacientes quirúrgicos, algunos de los signos que nos podrían hacer pensar en el diagnóstico de esta enfermedad pueden enmascararse debido a la propia cirugía o a su manejo farmacológico. Debido a esto, es primordial que podamos contar con biomarcadores que puedan diagnosticar la sepsis de la forma más precoz y fiable posible. En la sepsis vemos cómo coexiste el desarrollo de un inmunofenotipo proinflamatorio, y por otro lado una depresión en los niveles de expresión de los genes que codifican las moléculas implicadas en la sinapsis inmunológica, es decir, los genes codificantes de las moléculas presentadoras de antígeno. Esta tesis doctoral trata de mostrar la utilidad de la cuantificación del grado de inmunosupresión en el diagnóstico de la sepsis y además cómo puede mejorarse el diagnóstico de la enfermedad gracias a la combinación de un marcador que valora la inmunosupresión con un biomarcador clásico como la procalcitonina. Para ello, cabe destacar que nuestro trabajo es pionero en el uso de una nueva tecnología de PCR de tercera generación para la cuantificación de expresión génica, la PCR digital (ddPCR). 19 I. Introducción 20 I. INTRODUCCIÓN I.A) HISTORIA Y EPIDEMIOLOGÍA DE LA SEPSIS La sepsis es uno de los mayores problemas sanitarios de nuestros días. Esta enfermedad presenta una elevada morbilidad y mortalidad, suponiendo un motivo de actuación urgente cuando se diagnostica. Debido al incremento progresivo en su prevalencia e incidencia, representa una importante carga socioeconómica para el sistema sanitario. Además, es una de las patologías más prevalentes en los servicios de urgencias y en las unidades de cuidados de críticos (UCI), constituyendo la primera causa de muerte no coronaria a nivel mundial. ❖ EPIDEMIOLOGIA La sepsis es una enfermedad frecuente, con una incidencia global estimada del 27%. La mortalidad asociada a shock séptico es elevada, oscilando entre el 40% y el 70% en pacientes independientemente de su edad, tanto si ha sido adquirida en la comunidad o bien en pacientes hospitalizados. Es responsable de más fallecimientos que otras patologías frecuentes como el cáncer de mama, próstata o el infarto agudo de miocardio1. Estudios a nivel mundial afirman que la incidencia de sepsis, sepsis grave o shock séptico continúa aumentando a razón de 750.000 casos por año, con mayor frecuencia en hombres de raza negra y con gran protagonismo microbiológico de las bacterias Gram positivas y hongos2. Siguiendo esta estimación se ha pronosticado un aumento de la sepsis grave en Estados Unidos de 800.000 a 1.600.000 casos para el año 20503. En Europa, cabe destacar el estudio SOAP4 (Sepsis Ocurrence in Acutelly ill Patients) realizado en una muestra amplia y heterogénea de pacientes hospitalarios, el cual afirma que la sepsis ya en la actualidad podría ser la enfermedad más frecuentemente atendida en las UCIs, incrementando la mortalidad y el gasto económico comparado con otras patologías de similar prevalencia. 21 Aunque serían necesarios registros más exhaustivos sobre epidemiología de la sepsis en Europa, la evidencia científica afirma que la incidencia de la enfermedad se incrementa de forma progresiva como ocurre a nivel mundial, estimando en un 40% de media los costes causados por esta patología en las UCIs. Se estima que hay 18 millones de casos de sepsis que ocurren cada año en el mundo. Sólo en Reino Unido mueren 37.000 personas al año por sepsis5, siendo atribuible un 49,7% a la mortalidad debida al desarrollo de shock séptico. Recientemente, la Sociedad Europea de Medicina de Cuidados Intensivos (ESICM) y la Sociedad de Medicina de Cuidados Críticos (SCCM) están poniendo en marcha el protocolo llamado IMPRESS para determinar la epidemiología mundial de la sepsis6. En España, extrapolando los datos de los que disponemos, se estima la incidencia de sepsis al año en 74.000 casos, de los cuales un 40% presentarían shock séptico con una mortalidad media asociada de un 35%7. Algunos estudios en nuestro país datan la mortalidad media de los pacientes con shock séptico en el 45,8% y las estimaciones realizadas a partir de ellos dimensionan el problema en 50.000 casos nuevos de sepsis grave cada año, una incidencia de shock séptico de 31 casos/100.000 habitantes año y 17.000 fallecimientos anuales por sepsis, de los cuales el 70% de los casos fallece durante los tres primeros días a partir del diagnóstico8. Además, debemos tener presente el aumento progresivo de la población anciana, en la que existen diversos factores que les predisponen a un mayor riesgo de desarrollar formas graves de sepsis, como las comorbilidades asociadas que padecen, el estado previo al ingreso padeciendo frecuentemente malnutrición, fragilidad, y por supuesto, la alteración del sistema inmune conocido como inmunosenescencia9. El porcentaje de personas mayores de 60 años en el año 1950 era entorno el 8% de la población mundial, incrementándose este porcentaje al 10% en el año 2000, y se estima que sea del 21% en el año 205010. Además, en las próximas décadas se prevé que la población más envejecida, por encima de los 80 años, crezca al doble de la actual siendo en el 2050 el 9.6% de la población total en Europa y entorno al 9% en América del Norte3. 22 ❖ HISTORIA Desde la antigüedad hay tratados médicos en los que se deja constancia del terrible cuadro que sufrían algunas personas y la posible extensión generalizada de una infección, y de los remedios que se utilizaban para evitarlo. Así en el “papiro Ebers”, compuesto en escritura hierática egipcia hacia el año 1550 a.C., se describen cuadros de “hinchazones malolientes con abundante pus y aire en su interior, que si se inciden quirúrgicamente pueden extender su mal a todos los miembros del cuerpo”11. La palabra sepsis viene del griego σήψις (sipsis) que significa putrefacción: sēpσήπω (gr. ‘pudrir’) más el sufijo -sis σήψις (pudrir-se). Homero fue el primero en usarla hace más de 2700 años, la consideraban una descomposición biológica que ocurría dentro del cuerpo causada por unos “principios internos” capaces de provocar una peligrosa autointoxicación, resultante en una putrefacción maloliente12. Este concepto de “generación espontánea” perduró hasta el siglo XIX13. No usó como tal el término sepsis, pero el médico griego Hipócrates (460-370 a.C) fue probablemente el primero en describir el curso clínico del shock séptico y años después el filósofo florentino Niccolò Maquiavelo (1469-1527) describió lo difícil que era diagnosticar la enfermedad así como tratarla14. Por otro lado, el concepto de contagio fue formulado por primera vez en 1546 por el médico italiano Girolamo Fracastoro, proponiendo que las enfermedades epidémicas pueden ser comunicadas por contacto directo o indirecto a través del aire, por semillas o gérmenes invisibles15. Sin embargo, no fue hasta 1683 cuando se hicieron posibles las primeras observaciones microscópicas de la mano de Anthony van Leeuwenhoek16. Dos siglos más tarde, en 1847, el médico húngaro Ignaz Semmelweis, gracias a su observación consiguió relacionar la fiebre puerperal desarrollada por las parturientas que eran asistidas durante el parto por los obstetras estudiantes de medicina que habían participado previamente en autopsias, a diferencia de las parturientas atendidas por matronas con 23 menores casos de ésta enfermedad17. Fue un hito fundamental que introdujo las prácticas antisépticas antes de los exámenes de las pacientes. Obligó al lavado de las manos con una solución de cal antes de las exploraciones ginecológicas lo que redujo la tasa de mortalidad de fiebre puerperal del 18% al 3 %. Esto representó el primer ensayo clínico en enfermedades infecciosas jamás realizado18. En la segunda mitad del siglo XIX, Louis Pasteur realizó un elegante experimento demostrando que el proceso de putrefacción no tiene lugar sin la participación de organismos vivos y poco después, en la década de 1870, Robert Koch describió los agentes etiológicos de enfermedades como el ántrax, la tuberculosis o el cólera19. Fue el inicio para intentar impedir la entrada de microorganismos en el cuerpo humano, lo que llevó a Joseph Lister, (1827-1912) cirujano del Hospital Real de Glasgow, a desarrollar métodos antisépticos en los procedimientos quirúrgicos al observar que las fracturas abiertas se infectaban más que las cerradas20. En 1892 Richard Pfeiffer (1858-1945) que trabajó con Robert Koch, definió el concepto de “endotoxina” como un veneno bacteriano termoestable y responsable de las consecuencias fisiopatológicas de ciertas enfermedades infecciosas, diferenciando este concepto de las “exotoxinas” que son termolábiles. En 1909 se recogen y publican por primera vez los primeros doce casos de pacientes con sepsis por Gram negativos, causada por Escherichia coli, falleciendo el 50% de los infectados21. No fue hasta 1914, cuando el médico alemán Hugo Schottmüller hizo la primera definición científica de sepsis: "la sepsis es un estado causado por la invasión microbiana de una fuente infecciosa local en el torrente sanguíneo que conduce a signos de enfermedad sistémica en órganos a distancia"22. Pero fue William Osler (1849-1919) el primero en reconocer el importante papel de la respuesta del huésped en la sepsis y entenderla tal y como lo hacemos en la actualidad en uno de sus famosos libros “The Evolution of moderm Medicine", donde cita: “salvo en contadas ocasiones, el paciente parece morir de la respuesta del cuerpo a la infección en lugar de por la infección"23, 24. 24 En 1967 Ashbaugh et al. describe por primera vez un cuadro clínico de inicio agudo que hoy diagnosticamos como Síndrome de Distrés Respiratorio Agudo (SDRA) y Tilney en 1973 publica por primera vez un síndrome clínico en el que hay fallo progresivo de varios órganos25. En los años 90 el Dr. Bone establece que la disregulación de la respuesta inflamatoria sistémica en el contexto de un proceso séptico entre los mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios desencadena la disfunción orgánica26. Es en 1992 cuando el ACCP (American College of Chest Physicians) y la SCCM (Society of Critical Care Medicine) se reúnen por primera vez en una conferencia con el fin de aunar conceptos y elaborar las definiciones que serían usadas en la clínica y en los trabajos de investigación27. Aún hoy en día, las definiciones de los conceptos clínicos relacionados con la sepsis siguen creando controversia y debate entre los expertos. Además, continúa siendo un reto importante el manejo de la sepsis, requiriendo gran cantidad de recursos y habilidades médicas para el tratamiento satisfactorio del shock séptico. En lo que sí coinciden todos los profesionales médicos es en la vital importancia del diagnóstico precoz y certero como parte fundamental del éxito del tratamiento y pronóstico de la enfermedad. I.B) CONCEPTOS DE LA SEPSIS Y GRAVEDAD I.B.I DEFINICIONES DE CONSENSO Debido a la complejidad y ambigüedad para definir la sepsis y los términos relacionados con ella, hasta los años 90 no existió ninguna terminología. En 1980, Roger Bone propone el termino de “Síndrome sepsis” definido ya entonces como: hipotermia (< 35ºC) o hipertermia (>38,3ºC), taquicardia (>90 lpm), taquipnea (>20 rpm), evidencia clínica de foco de infección, y la presencia de al menos disfunción o mala perfusión de un órgano (hipoxemia, lactato elevado, oliguria)28. A pesar de que este término ha sido usado como criterios de inclusión para los 31 MEDS (“Mortality in Emergency Department Sepsis”): (Imagen 4) Consiste en una escala que predice mortalidad a los 28 días utilizada fundamentalmente en los servicios de urgencias en los pacientes sépticos, y que se realiza valorando ocho variables43. IPS (“Infection Probability Score”): (Imagen 5) En esta escala se predice la infección valorando seis variables fácilmente medibles. Cuando el resultado es inferior a 14 la probabilidad de infección se reduce a un 10%44. CPIS (“Clinical Pulmonary Infection Score”): (Imagen 6) Se trata de una escala predictora de NAV, y para ello evalúa seis ítems relacionados con infección45. Es una herramienta complementaria a otros marcadores diagnósticos pero no posee buena sensibilidad ni especificidad tanto diagnostica como pronóstica46. I Imagen 1. Escala de gravedad del prier dia APACHE II. ( 0-4 puntos; 4% probabilidad mortalidad, 5-9 puntos; 8 % probabilidad de mortalidad, 10-14 puntos; 15% probabilidad de mortalidad, 15-19 puntos; 25% probalidad de mortalidad, 20-24 puntos; 40% probabilidad de mortalida, 25-29 puntos; 55% probabilidad mortalidad, 30-34 puntos; 75% probabilidad de mortalidad, >34 puntos: 85% probabilidad de mortalidad) 32 Imagen 2. Score SAPS III (Hasta 21 puntos; 0% mortalidad, 22-44 puntos; 1-10% probabilidad mortalidad, 44-52 puntos; 10-20 % probabilidad de mortalidad, 53-57 puntos; 20-30% probabilidad de mortalidad, 58-62 puntos; 30-40% probalidad de mortalidad, 63-67 puntos; 4050% probabilidad de mortalidad, 68-72 puntos; 50-60% probabilidad mortalidad, 73-78 puntos; 60-70% probabilidad de mortalidad, 79-86 puntos: 70-80% probabilidad de mortalidad, 87-96 puntos: 80-90% probabilidad de mortalidad, 91-112 puntos: 90-95% probabilidad de mortalidad, 113-159 puntos: 95-99% probabilidad de mortalidad, 160-229 puntos: 100% probabilidad de mortalidad) 33 Imagen 3. Escala de gravedad durante la estancia SOFA (un incremento en la escala SOFA de >2 puntos se asocia a un aumento en la mortalidad, valores por encima de 8 se asocian con alto riesgo de mortalidad) MEDS SCORE (Mortality %): 0-4 points = Very Low (0.9%), 5-7 points = Low (2%), 8-12 points = Moderate (7.9%), 13-15 points = High (20%), >15 = Very High (39%) Imagen 4. MEDS Score Imagen 5. IPS Score. (<14 = 10% infección) 34 Imagen 6. CPIS SCORE. (>6 puntos sugiere neumonía) I.B.3 BIOMARCADORES El diagnóstico precoz y por consiguiente la toma de decisiones temprana en los pacientes con sospecha de sepsis es fundamental para su pronóstico y supervivencia. Por ello es de gran importancia tener a nuestra disposición pruebas diagnósticas rápidas y fiables que nos orienten en el manejo terapéutico diario. Durante el proceso de la sepsis tiene lugar una compleja y extensa interacción entre mediadores bioquímicos produciendo numerosas moléculas circulantes que podemos usar como marcadores de presencia e incluso gravedad del proceso séptico. La microbiología, el cultivo microbiológico sigue siendo una herramienta fundamental para conformar la presencia de infección en un paciente con fallo de órgano. Sin embargo, conlleva el consumo de mucho tiempo y a menudo se asocia a resultados falsos negativos47. En la actualidad, existen nuevas técnicas más rápidas con buena sensibilidad y que permiten realizar un diagnóstico más individualizado. Entre ellas, cabe destacar a la cabeza de la microbiología 35 clínica el diagnóstico molecular, la microbiología digital y las técnicas de espectrometría de masas (MALDI-ToF y ESI-ToF). En la sepsis, ante un hemocultivo positivo implementaremos el resultado y el tratamiento con el uso de MALDI-ToF directo junto con la detección de ciertos genes de resistencia así como el uso de técnicas basadas en la PCR48. Así pues, se han evaluado una gran cantidad de moléculas con el fin de encontrar el mejor biomarcador de sepsis49 . Un marcador ideal ha de tener una alta sensibilidad y especificidad, permitiendo detectar a todos los pacientes enfermos y evitando que los que no lo estén sean diagnosticados erróneamente. Así mismo, ha de ser capaz de reflejar de forma precoz la presencia de infección y reflejar el progreso de la misma y la respuesta al tratamiento50, 51. Debemos tener presente las diferencias existentes en cada sujeto, puesto que cada paciente conlleva diferentes características como la edad y el sexo, que influirán en la sensibilidad y especificidad de los marcadores. Los marcadores más extensamente usados y con un mayor conocimiento a nivel de infección son la proteína C reactiva (PCR) y la procalcitonia (PCT). La proteína C reactiva fue descubierta por Tillet y Francis en 1930. Es una proteína no glicosilada, que se encontró en el suero de los pacientes infectados con S. pneumoniae al observar que precipitaba con el polisacárido C de la pared del neumococo52. Por tanto, se trata de un reactante de fase aguda, que se sintetiza en el hígado por los hepatocitos en respuesta al daño tisular o la infección. Los hepatocitos son estimulados por las citoquinas IL-6 e IL-8 para producir esta proteína 53, 54. Los valores normales en plasma se sitúan < 10 mg/dl. Su producción aumenta pasadas entre 4 y 6 horas tras la agresión inicial, pudiendo elevarse varios cientos por encima del nivel basal en las primeras 24-48 horas55. La PCR se mantendrá elevada durante la fase aguda de la infección, volviendo a valores normales cuando cese la agresión. El punto de corte para la detección de infección se sitúa en torno a 10 mg/dl teniendo una sensibilidad del 88% y una especificidad del 58%, correlacionándose la concentración plasmática y la gravedad de la infección56. Una disminución en sus valores en las primeras 48 horas indica una respuesta eficaz de la terapia antibiótica57. Sin embargo, este biomarcador presenta ciertas limitaciones. Su especificidad moderada conlleva que de falsos positivos en procesos inflamatorios no infecciosos58. Además, su 36 farmacocinética es variable en función del sexo, edad o estilos de vida del paciente (alcohol, tabaquismo, obesidad). Por último, posee una cinética lenta de eliminación que hace que su capacidad pronóstica sea menor en comparación con otros biomarcadores59. La procalcitonina (PCT) se describió por primera vez como precursor de la calcitonina, siendo marcador tumoral para el cáncer medular de tiroides. La PCT es una pro hormona sintetizada por las células neuroendocrinas del tiroides y del pulmón que en condiciones normales su concentración plasmática es indetectable60. Sin embargo, ante una infección bacteriana grave su concentración se eleva rápidamente en sangre, detectándose a las 4-6h de la agresión, con una concentración máxima entre 6-12h y un aclaramiento de 20-36h, lo cual permite la detección precoz de la infección, permitiendo monitorizar la evolución de las misma y la respuesta al tratamiento antibiótico61. La presencia de endotoxinas y exotoxinas bacterianas hace que se imposibilite la hidrólisis de procalcitonina a calcitonina, de ahí su elevación en infecciones bacterianas graves. Desafortunadamente, no es especifica de las mismas puesto que puede verse elevada también en infecciones fúngicas sistémicas, en traumatismos o en pacientes con fallo renal 62. A pesar de todo ello, cuando se compara con otros biomarcadores, la PCT presenta una mayor sensibilidad y especificidad en sepsis63, siendo superior tanto en la diferenciación entre un proceso infeccioso de uno no infeccioso, como en la distinción entre la infección bacteriana de la vírica. Los valores normales de la PCT en sangre son menores a 0,5 ng/ml. Se consideran anormales valores por encima de esta cifra, pudiendo darse en pacientes con infección pero también en enfermedades crónicas autoinmunes o infecciones leves o moderadas. Valores superiores a 10 ng/dl se asocian a una alta probabilidad de tener sepsis grave y desarrollar síndrome de disfunción multiorgánica64. Además, valores mantenidos de PCT son útiles en la valoración de la efectividad del tratamiento y en este sentido hay estudios que correlacionan los cambios de valor de la PCT con la mortalidad de los pacientes, afirmando que una disminución significativa en los valores de éste marcador pronostica mejores resultados en la supervivencia, cuando además sus 37 valores habían alcanzado cifras superiores a 10ng/ml, y a su vez también relacionando estas observaciones con el valor del score SOFA65. A parte de la PCR y la PCT, podemos observar otros marcadores biológicos que pueden ayudarnos en la definición y pronóstico de la sepsis: El lactato ha demostrado ser buen marcador para valorar la evolución y la mortalidad del paciente. La elevación de este parámetro se traduce en hipoxia e hipoperfusión tisular como consecuencia del aumento del metabolismo anaerobio que tiene lugar en los procesos sépticos. Su disminución durante las primeras horas del tratamiento ha demostrado correlacionarse con la disminución en la mortalidad de los pacientes66. Recientemente se ha estudiado la pro-adrenomedulina (proADM) en sus funciones en los procesos infecciosos. La adrenomedulina fue descrita primeramente como vasodilatador67, siendo usada como biomarcador su parte intermedia, la proADM, debido a su mayor estabilidad. Sus niveles en condiciones normales son mínimos, aumentando en procesos patológicos cardiacos, respiratorios, renales y sépticos. Su síntesis y secreción es regulada por citoquinas inflamatorias, LPS, hormonas (glucocorticoides, angiotensina II, aldosterona) y factores de hipoxia, isquemia, estrés oxidativo o la hiperglucemia68. En el shock séptico se elevan sus valores debido a la disminución de su aclaramiento y al aumento de su producción por las citoquinas. Funciona como un biomarcador en sepsis tanto de diagnóstico como pronóstico, puesto que niveles más elevados de proADM se correlacionan con pacientes de mayor gravedad y mayor tasa de mortalidad67-69. Otros biomarcadores relacionados con la sepsis son las citoquinas: Interleucina 6 y 8 (IL-6 y IL8), a las que se les atribuye capacidad de predicción de mortalidad70-72 o bien IL-10, IL-18, TNF a, MIF (macrophage migration inhibitory factor) o MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos), cuyos niveles se encuentran más elevados en los pacientes sépticos que fallecen en comparación con los que sobreviven73. Así pues, vemos en el estudio de Andaluz-Ojeda D.et al que evalúan el valor pronóstico de la presencia en el paciente séptico de la combinación de citoquinas pro-inflamatorias y antiinflamatorias IL-8, IL-6, MCP-1 e IL-1074. 38 Otros biomarcadores como CD64 o suPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor) están en investigación y su validez para diagnóstico y pronostico en sepsis requieren de estudios de validación75. Hasta el momento presente se han evaluado más de 180 biomarcadores diferentes por su potencial para la detección de infección y sepsis, dando lugar a numerosos estudios clínicos y preclínicos73, 75, 76. Sin embargo, no existe todavía ningún marcador que individualmente haya demostrado suficiente sensibilidad y especificidad para su uso clínico. El análisis de la expresión génica está demostrando un gran potencial para mejorar el diagnóstico y la evaluación de pronóstico de la sepsis77-80. El problema es que hasta ahora las tecnologías disponibles para analizar el ARNm eran o bien de uso exclusivo en investigación por su alta complejidad (microarrays, ultrasecuenciación), o presentaban problemas de estandarización, como la PCR a tiempo real81, 82. Estos problemas se han solventado con la aparición de técnicas de PCR de última generación como la PCR digital, sobre la cual se comentará más adelante. I.C) SISTEMA INMUNE Y SEPSIS El sistema inmune (SI) juega un papel fundamental en la sepsis, y así se ve reflejado en las últimas definiciones de consenso del año 2016, siendo las alteraciones en la regulación de la respuestas del huésped el evento central de la patogénesis de la enfermedad, entre las cuales está la respuesta inmune 83, 84. La gran heterogeneidad de la enfermedad pone en juego la alteración a la vez tanto del sistema inmunológico, como el sistema inflamatorio y el sistema de coagulación, con una alta variabilidad de un paciente a otro. Algunos factores tales como la virulencia del patógeno o el grado de invasión que presenten los tejidos, así como las comorbilidades del paciente, intervienen en la respuesta a la infección85. Entre las manifestaciones clínicas que puede desarrollar el paciente están el shock séptico, el síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), o el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS)86, 87. 39 En un escenario ideal, en el primer contacto del patógeno con el sistema inmune del huésped, éste sistema debería eliminar el microbio y volver a un estado de homeostasis. Cuando la enfermedad séptica se ha desarrollado, ésto no ocurre, haciendo que continúe la activación de los neutrófilos, así como los macrófagos y monocitos. Sin embargo, se desarrolla una sobreexpresión de las moléculas coestimuladoras de linfocitos y una rápida apoptosis de estos, por el contrario, se retrasa la apoptosis de los neutrófilos, contribuyendo así, a la patogénesis de la sepsis. La activación de los receptores de las células que participan en el SI innato reconociendo moléculas asociadas a los patógenos, produce una gran cascada de activación de mediadores inflamatorios como son TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, y IFN-γ. Esta reacción no sólo produce daño al patógeno sino que también produce alteraciones en el endotelio vascular, en la síntesis de proteínas en el hígado, en la quimiotaxis leucocitaria o incluso en la activación del sistema de coagulación88. El sistema de coagulación está íntimamente ligado al sistema inflamatorio, generando activación y consumo de trombina que acaba desarrollando una coagulación intravascular diseminada (CID)89. El rápido consumo de factores de la coagulación produce el desarrollo de una hemorragia de tipo difuso en la enfermedad séptica. Los receptores de las proteasas, que se encuentran en células endoteliales, neutrófilos y monocitos, se activan uniéndose a la trombina, factor Xa y factor tisular, lo que conlleva una activación del factor VIIa que activa la vía extrínseca de la coagulación, pero también la producción de mediadores proinflamatorios (IL-6, IL-8), y la adhesión molecular. Esta adhesión hace que se reclute en la vasculatura endotelial leucocitos activados, fundamentalmente neutrófilos que producen enzimas de lisis, así como radicales de oxígeno y nitrógeno que facilitan el fallo microcirculatorio y de órgano90 91. En los últimos años, son numerosos los estudios que han intentado esclarecer y cuantificar esta disrregulación inmunológica, incluso establecer un perfil inmunológico que permita distinguir un paciente séptico de uno no infectado84, 92-94. El estudio EXPRESS (Gene Expression In Sepsis) evaluó los perfiles de expresión génica que se daban en los pacientes sépticos ingresado en UCI durante un año de 2012 a 2013, 40 realizando un análisis transcriptómico de estos genes y relacionándolos con scores pronósticos como el SOFA95. Así, identificaron 2396 genes que se expresaban de manera diferente en un paciente con sepsis de un paciente quirúrgico sin la enfermedad. De ellos, 1394 se expresaban de forma mayor y 1032, por contrario, sufrían menores niveles de expresión, en comparación con un paciente sano. Aquellos genes que se observaron que sufrían una sobreexpresión estaban relacionados con la inmunidad innata codificando proteasas de neutrófilo y receptores de las interleuquinas IL-1 y IL-18, así como genes relacionados en la síntesis de las inmunoglobulinas. Estos genes pueden estar relacionados también con el daño endotelial y tisular. Los genes principalmente involucrados son: MMP8 (Metalopeptidasa 8), LCN2 (Lipocalina 2), OLFM4 (Olfactomedina), LTF (Lactotransferrina), PRTN3 (Polimorfonuclear leucocito serin proteasa), MPO (Mieloperoxidasa) Por el contrario, los genes cuya expresión está deprimida son aquellos asociados a la inmunidad adaptativa, con funciones que afectan a la presentación de antígeno (Imagen 7), fundamentalmente moléculas de clase HLA II, siendo de ellas la más significativa el HLADRA92, 96, 97, pero también aquellos genes relacionados con la expresión de la respuesta de las células T y Natural Killers (NK). Los genes detectados relacionados con sinapsis inmunológica, que sufren una disminución de su expresión en la sepsis son fundamentalmente: HLA-DRA (Complejo mayor de histocompatibilidad clase II, DR alfa), CD40LG (Ligando de factor de necrosis tumoral), CD3E (glicoproteína CD3 de superficie células T) CD28 (glicoproteína CD28 de superficie células T), ICOS (coestimulador inducible células T). Todos estos genes están asociados a la presentación de antígeno, y en la sepsis vemos como la expresión de estas moléculas esta disminuída tanto en tejidos linfoides como no linfoides, alterando la regulación inmune y la respuesta antimicrobiana de las células T, así como la respuesta de anticuerpos96 (Imagen 7). 47 (ddPCR), la cual permite conocer los niveles de expresión de un gen en particular, y todo ello de forma más sensible y precisa que las anteriores generaciones, con menores tasas de error96, 107. Nuestro trabajo es el primero que estudia la cuantificación de los genes alterados de la sinapsis inmunológica analizando sus niveles de expresión mediante una tecnología novedosa como la PCR digital en pacientes con sepsis y que además analiza la combinación de un biomarcador que refleja la fase proinflamatoria como la PCT con la fase de inmunosupresión representada por los niveles de HLA-DRA. 48 III. Hipótesis 49 III. HIPÓTESIS En la sepsis existe disfunción de la sinapsis inmunológica. La cuantificación de la expresión de genes que codifican proteínas participantes en la misma mediante PCR digital puede ser una buena herramienta para la identificación de sepsis en pacientes quirúrgicos, así como para la predicción de su pronóstico. La combinación de la cuantificación de la expresión de estos genes con los niveles de procalcitonina podría mejorar el rendimiento de esta última para diagnosticar la presencia de sepsis. 50 IV. Objetivos 51 IV. OBJETIVOS OBJETIVO PRINCIPAL • Evaluar si la cuantificación de niveles de expresión en sangre de genes de la sinapsis inmunológica mediante PCR digital permite diferenciar al paciente quirúrgico con sepsis del paciente quirúrgico que no presenta sepsis. • Evaluar si la combinación de la cuantificación de los niveles de expresión de genes de la sinapsis inmunológica junto con los valores de procalcitonina puede mejorar el rendimiento de esta última para el diagnóstico de la sepsis en pacientes quirúrgicos. • Evaluar si los niveles de expresión de los genes de la sinapsis inmunológica se asocian al riesgo de mortalidad en estos pacientes. OBJETIVOS SECUNDARIOS • Reclutar prospectivamente una cohorte derivación y una cohorte de validación de pacientes en los hospitales colaboradores con el estudio en Valladolid procedentes del Hospital Universitario Rio Hortega, Hospital Clínico Universitario y de Salamanca del Hospital Clínico Universitario. • Describir las características clínicas de los pacientes reclutados. • Desarrollar un método de cuantificación de la expresión de genes de la sinapsis inmunológica basado en la PCR digital. 52 V. Material y Métodos 53 V. MATERIAL Y MÉTODOS • Diseño del estudio Se trata de un estudio observacional prospectivo donde se recogieron datos demográficos, clínicos y de laboratorio de pacientes quirúrgicos ingresados en la planta de los servicios de cirugía general, Unidades de Reanimación y Unidades de Cuidados Críticos del Hospital Universitario Río Hortega de Valladolid, Hospital Universitario Clínico de Valladolid y Hospital Universitario Clínico de Salamanca durante el periodo de abril 2013 a enero de 2018 y que desarrollaron signos de infección, así como también pacientes quirúrgicos control sin infección. También se reclutaron donantes sanos, no habiendo sido sometidos a cirugía, que procedieron del centro de hemoterapia de Castilla y León. • Pacientes Se definieron los siguientes criterios para la selección de pacientes: - Criterios de inclusión: pacientes quirúrgicos ≥ de 18 años de edad con signos de infección y sospecha de sepsis que ingresaron en las plantas de los servicios de cirugía general, REA o UCI del Hospital Universitario Rio Hortega de Valladolid, Hospital Clínico Universitario de Valladolid y Hospital Clínico Universitario de Salamanca. Grupo control sanos: pacientes sanos donantes del banco de sangre. Grupo control de pacientes quirúrgicos: pacientes quirúrgicos ingresados sin signos de infección. Grupo casos de pacientes quirúrgicos con sepsis: pacientes quirúrgicos ingresados con signos de infección, sospecha o confirmación de sepsis, reclutados en las primeras 24h desde el inicio de los signos de infección (de acuerdo a la definición propuesta por “the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference”)27, 119. Grupo casos de pacientes quirúrgicos con shock séptico: pacientes quirúrgicos ingresados con diagnóstico de sepsis, que requieren la administración de fármacos 54 vasoconstrictores, o fallo orgánico grave (de acuerdo a la definición propuesta por “the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference”)27, 119. - Criterios de exclusión: pacientes menores de edad, o bien que no firmen el consentimiento informado. Se reclutaron dos cohortes de pacientes diferentes, una inicial a la que llamamos cohorte I o derivación, y una cohorte posterior llamada cohorte II o de validación, en la que confirmamos nuestros resultados obtenidos en la primera cohorte (Imagen 8). - Cohorte I o derivación: se reclutaron 101 pacientes adultos (≥18 años) hospitalizados en el servicio de Cirugía o en las Unidades de Reanimación Quirúrgica de los hospitales participantes, diagnosticados de sepsis (de acuerdo a la definición propuesta por “the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference”)27, 119 prospectivamente en el estudio desde Abril de 2013 hasta Enero de 2016. Se reclutó un grupo control, constituido por 53 pacientes quirúrgicos sin signos de infección. Finalmente, se reclutaron 16 donantes de sangre, todos ellos de edades similares a las de los pacientes. Se utilizó un protocolo estándar de recogida de datos clínicos, incluyendo la historia clínica, examen físico, análisis hematológico, bioquímico, microbiológico y pruebas radiológicas. Las decisiones de tratamiento se tomaron de forma individual no estandarizada por un médico especialista. - Cohorte II o validación. Esta cohorte estaba constituida por un total de 74 pacientes adultos (≥18 años) hospitalizados en el servicio de Cirugía o en las Unidades de Reanimación Quirúrgica de los hospitales participantes, con el diagnóstico de sepsis (de acuerdo a la definición propuesta por “the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference”)27, 119 incluidos prospectivamente en el estudio en las fechas de Enero 2017 a Enero 2018. Se reclutó además un grupo control formado por 21 pacientes quirúrgicos sin signos de infección. 55 Se diseñó un protocolo estándar de recogida de datos clínicos, incluyendo la historia clínica, examen físico, análisis hematológico, bioquímico, microbiológico y pruebas radiológicas. Las decisiones de tratamiento se llevaron a cabo de forma individual no estandarizada pero todas ellas realizadas por un médico especialista. Imagen 8. Esquema pacientes reclutados. • Comite ético y Consentimiento informado: El estudio fue aprobado por los respectivos Comités de ética para la investigación clínica de los hospitales participantes (Hospital Universitario Rio Hortega, Hospital Clínico Universitario de Valladolid y Hospital Clínico Universitario de Salamanca). Los métodos utilizados siguen la legislación española para la investigación Biomédica del 2007. El consentimiento informado escrito fue obtenido de todos los pacientes participantes o bien de sus familiares o representantes legales, previamente a su reclutamiento. Cohorte Derivación Abril 2013-Enero 2016 101 pacientes quirúrgicos con sepis Grupo control 53 pacientes quirúrgicos sin infección 16 donantes de sangre sanos Cohorte de Validación Enero 2017-Enero 2018 74 pacientes quirúrgicos con sepsis 21 pacientes quirurgicos sin infección 56 • Selección de Genes Los genes seleccionados participan en la presentación de antígeno, es decir, en la sinapsis inmunológica entre la célula presentadora de antígeno y el linfocito T CD4 114: HLA-DRA, CD40LG, CD3E, CD28 y ICOS (tabla 7). Moléculas presentadoras de antígeno Disminuidas en los tejidos linfoides y no linfoides, disregulación de células T y anticuerpos. HLA-DRA (Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II, DR alfa) Presentación de péptidos de los antígenos para que sean reconocidos en su la superficie por las células T CD4 CD40LG (Ligando Factor de Necrosis Tumoral) Expresado en la superficie de las células T. Regula la función de las células B, uniéndose a ellas en superficie CD3E (Glicoproteina de superficie de las células T) Forma el complejo CD3-receptor en las células T activando vías de transducción al reconocer señales activadas por el antígeno CD28 (Glicoproteina de superficie de las células T) Este gen está involucrado en la activación de la célula T, su proliferación, la producción de citoquinas y la supervivencia de las células T. ICOS (Coestimulador inducible de las células T) Promueve la respuesta de la célula T ante el estímulo de un antígeno extraño y la secreción de anticuerpos por las células B. Tabla 7. Genes seleccionados para el estudio, implicados en la sinapsis inmunológica que ven disminuida su expresión en la sepsis. 63 pacientes sin sepsis (tabla 10). En cuanto a la microbiología de esta cohorte, se obtuvieron resultados similares a los de la cohorte derivación. 64 Pacientes sépticos (n=101) Controles quirúrgicos(n=53) p Características Edad [años, mediana IQR] 72.0 (15.0) 64.0 (18.0) 0.006 Hombres 65.3 (66) 71.7 (38) n.s. Comorbilidades% (n) Hipertensión arterial 55.4 (56) 60.0 (30) n.s. Enfermedad crónica cardiovascular 47.5 (48) 34.0 (18) n.s. Enfermedad crónica respiratoria 14.8 (15) 21.1 (11) n.s. Enfermedad crónica renal 14.9 (15) 2.0 (1) n.s. Enfermedad crónica hepática 3.0 (3) 5.8 (3) n.s. Enfermedad neurológica 5.0 (5) 3.7 (2) n.s. Enfermedad cerebrovascular 4.0 (4) 5.6 (3) n.s. Diabetes mellitus 34.0 (34) 18.8 (10) 0.005 Cancer 29.7 (30) 45.3 (24) 0.050 Inmunosupresión 18.0 (17) 13.9 (5) n.s. Tipo de cirugía, % (n) Cirugía urgente 63.4 (64) 3.8 (2) < 0.001 Cardio-toracica 30.0 (30) 39.6 (21) n.s. Abdominal 62.0 (62) 43.4 (23) n.s. Neurocirugía 1.0 (1) 1.9 (1) n.s. Vascular 3.0 (3) 3.7 (2) n.s. Urologica/Renal 1.0 (1) 9.4 (5) 0.011 Otros 3.0 (3) 1.9 (1) n.s. Evolución y pronóstico Estancia hospitalaria [dias, mediana IQR] 26.5 (23.5) 10.0 (7.0) < 0.001 Estancia en UCI [dias, mediana IQR] 14.0 (17.0) 4.0 (3.0) < 0.001 SIRS, % (n) 100.0 (101) 56.6 (30) < 0.001 Shock septico, % (n) 61.4 (62) n.a n.a. No supervivencia a dia 28, % (n) 19.8 (20) 0 < 0.001 Mortalidad hospitalaria, % (n) 24.7 (25) 0 < 0.001 Origen de infección, % (n) Desconocido 14.8 (15) n.a. n.a. Tracto Respiratorio 18.8 (19) n.a. n.a. Abdomen 45.5 (46) n.a. n.a. Tracto urinario 4.9 (5) n.a. n.a. Herida quirurgica 5.9 (6) n.a. n.a. Bacteriemia 4.9 (5) n.a. n.a. Otros 4.9 (5) n.a. n.a. Microbiología, % (n) Gram + 46.5 (47) n.a. n.a. Gram - 60.4 (61) n.a. n.a. Hongos 9.9 (10) n.a. n.a. Virus 2.0 (2) n.a. n.a. Polimicrobianos 44.6 (45) n.a. n.a. Datos al diagnóstico, [mediana (IQR)] SOFA score 8 (6) 1 (3) < 0.001 Total bilirubina (mg/dl) 0.7 (1.3) 0.8 (0.5) n.s. Glucosa (mg/dl) 152.0 (78.0) 135.0 (55.0) n.s. Contaje plaquetario (cell/mm3) 180000 (194.7) 155000 (740000) n.s. INR 1.3 (0.4) 1.2 (0.4) n.s. ScvO2 (%) 73.1 (19.0) 68.8 (80.0) n.s. PCR (mg/L) 232.3 (169.2) 57.7 (77.7) < 0.001 Procalcitonina (ng/mL) 5.5 (17.5) 0.5 (0.9) < 0.001 Células blancas (cells/mm3) 14465 (10257.5) 12290 (4875.0) 0.023 Linfocitos (cells/mm3) 944.32 (818.6) 1008 (894.3) n.s. Monocitos (cells/mm3) 1068.48 (51887.6) 781.8 (1327.8) n.s. Neutrofilos (cells/mm3) 12337.0 (9220.5) 10016.0 (4704.5) 0.017 Eosinofilos (cells/mm3) 49.9 (2052.6) 12.3 (70.4) 0.019 Basofilos (cells/mm3) 78.4 (1593.2) 28.8 (68.9) 0.006 65 Tabla 8. Características descriptivas de los pacientes de la cohorte derivación. Variables continuas representadas por mediana, (rango interquartil, IQR); variables categóricas representadas (%, n). ICU: unidad de cuidados críticos; SIRS: síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; INR, ratio internacional normalizado; ScvO2: saturación central venosa de oxígeno; n.s: no significación; n.a: no aplicable 66 Tabla 10. Características descriptivas de los pacientes de la cohorte II o validación. Variables continuas representadas por mediana, (rango interquartil, IQR); variables categóricas representadas (%, n). ICU: unidad de cuidados críticos; SIRS: síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; INR, ratio internacional normalizado; ScvO2: saturación central venosa de oxígeno; n.s: no significación; n.a: no aplicable Pacientes sépticos (n=74) Controles quirúrgicos(n=21 ) p Características Edad [años, mediana IQR] 70.50 (20) 70.00 (12) n.s Hombres 58.10 (43) 61.90 (13) n.s. Comorbilidades% (n) Hipertensión arterial 45.94 (34) 61.90 (13) n.s. Enfermedad crónica cadiovascular cadcardiovascular 9.46 (7) 9.52 (2) n.s. Enfermedad crónica respiratoria 5.41 (4) 4.76 (1) n.s. Enfermedad crónica renal 8.11 (8) 9.52 (2) n.s. Enfermedad crónica hepática 2.70 (2) 0 (0) n.s. Diabetes mellitus 14.86 (11) 19.04 (4) n.s Cancer 18.91 (14) 42.86 (9) 0.024 Inmunosupresión 9.46 (7) 4.76 (1) n.s. Tipo de cirugía, % (n) Cirugía urgente 79.73 (59) 9.52 (2) < 0.001 Abdominal 47.30 (35) 23.81(5) n.s. Vascular 2.70 (2) 9.52 (2) n.s. Urologica/Renal 1.35 (1) 14.29 (3) 0.009 Otros 4.05 (3) 0 (0) n.s. Evolución y pronóstico Estancia hospitalaria [dias,medianaIQR] 16 (17) 10 (10) 0.048 Estancia en UCI [dias, mediana IQR] 3 (5) 2 (2) 0.050 SIRS, % (n) 100 (74) 23.81 (5) 0.003 Shock septico, % (n) 48.64 (36) 0 (0) <0.001 Mortalidad hospitalaria, % (n) 12.16 (9) 0 (0) n.s Tracto Respiratorio % (n) 14.86 (11) n.a. n.a. Abdomen % (n) 40.54 (30) n.a. n.a. Tracto urinario % (n) 5.41 (4) n.a. n.a. Herida quirurgica % (n) 25.68 (19) n.a. n.a. Bacteriemia % (n) 14.86 (11) n.a. n.a. Otros % (n) 10.81 (8) n.a. n.a. Microbiología, % (n) Cultivo positivo 45.94 (34) n.a. n.a. Gram + 18.92 (14) n.a n.a Gram - 32.43 (24) n.a. n.a. Hongos 1.35 (1) n.a. n.a. Virus 0 (0) n.a. n.a. Polimicrobianos 18.92 (14) n.a. n.a. Datos al diagnóstico, [mediana (IQR)] SOFA score 6 (7) 2.50(5) n.s Total bilirubina (mg/dl) 0.82 (1.06) 0.83 (0.59) n.s. Glucosa (mg/dl) 160.0 (73) 162 (39) n.s. Contaje plaquetario (cell/mm3) 135000 (191.5) 209000 (146000) n.s. INR 1.22 (0.33) 1.11 (1.20) 0.023 PCR (mg/L) 216.84 (179.83) 103.34 (98.85) < 0.001 Procalcitonina (ng/mL) 2.70 (9.35) 0.29 (0.71) < 0.001 Células blancas (cells/mm3) 14960 (10600) 11280 (8075) n.s Neutrofilos (cells/mm3) 13358.50 (11962.50) 10341(9362) n.s 67 I. Niveles de expresión en sangre de genes de la sinapsis inmunológica para identificar la presencia de sepsis y predecir mortalidad. Resultados publicados en el artículo “Quantification of Immune Dysregulation by Nextgeneration Polymerase Chain Reaction to Improve Sepsis Diagnosis in Surgical Patients” publicado en Annals of Surgery83. I.1 Niveles de expresión de genes de la sinapsis inmunológica entre los diferentes grupos Como se puede observar en los siguientes diagramas de cajas, los controles quirúrgicos presentaron niveles menores de expresión de los genes relacionados con la sinapsis inmunológica en comparación con los controles sanos, demostrando así la existencia de depresión de la inmunidad adaptativa en estos pacientes por el mero hecho de someterse a la agresión quirúrgica. Esto se observa en todos los genes y de manera significativa, como se puede comprobar en sus respectivos diagramas de cajas (Imagen 11, Imagen 12, Imagen 13, Imagen 14, Imagen 15). En comparación con los controles sanos, los pacientes quirúrgicos sépticos presentaron niveles significativamente menores de expresión de todos los genes estudiados (tabla 11). Con respecto a los controles quirúrgicos, es decir aquellos pacientes quirúrgicos que no presentan infección, todos los genes de la sinapsis inmunológica presentaron niveles menores de expresión génica de forma significativa, excepto en el caso del gen ICOS, que no demuestra significación en la disminución de los niveles de expresión de este gen entre el grupo control quirúrgico y el grupo de pacientes quirúrgicos sépticos pero con menor fallo de órgano (tabla 11). Los pacientes quirúrgicos sépticos presentaron una depresión todavía mayor de los genes de la sinapsis inmunológica analizados. El gen que presentó una mejor capacidad para diferenciar entre pacientes quirúrgicos sépticos y pacientes sin sepsis atendiendo a sus niveles de 68 expresión en sangre fue el HLA-DRA (Imagen 11). Observamos diferencias significativas al comparar los niveles de expresión de HLA-DRA entre todos los grupos a excepción de la comparación entre el grupo de pacientes sépticos con menor fallo de órgano y aquel con mayor fallo de órgano (tabla 11). Imagen 11. Diagrama de cajas de HLA-DRA según sus niveles de expresión en los diferentes grupos. La presencia de una línea denota diferencias significativas entre grupos. 69 Imagen 12. Diagrama de cajas de CD3E según sus niveles de expresión en los diferentes grupos. La presencia de una línea denota diferencias significativas entre grupos. Imagen 13. Diagrama de cajas de CD40LG según sus niveles de expresión en los diferentes grupos. La presencia de una línea denota diferencias significativas entre grupos. Imagen 14. Diagrama de cajas de ICOS según sus niveles de expresión en los diferentes grupos. La presencia de una línea denota diferencias significativas entre grupos. 70 Imagen 15. Diagrama de cajas de CD28 según sus niveles de expresión en los diferentes grupos. La presencia de una línea denota diferencias significativas entre grupos. Observamos como varía la expresión de los genes de la sinapsis en la sepsis de forma paralela con el grado de disfunción de órgano, objetivado por la escala SOFA. A mayor fallo de órgano, menor expresión en los niveles de los genes de la sinapsis inmunológica. En el análisis de Mann Whitney (tabla 11) podemos objetivar como la expresión de los genes de la sinapsis inmune disminuye de forma significativa conforme al fallo de órgano y también cuando comparamos entre grupos. De igual manera, ocurre en los diferentes grupos de nuestros pacientes con la determinación de los valores en sangre del biomarcador clásico procalcitonina, que asciende de forma significativa a mayor fallo de órgano. Observamos como la procalcitonina también varia su valor, en este caso aumenta, al comparar el grupo control de pacientes sanos con respecto a los pacientes controles quirúrgicos que no están infectados, atribuyendo este aumento al propio hecho de haberse sometido a la cirugía. Como ocurre en el caso de los genes, sus valores se ven alterados de manera significativa al comparar las diferencias de sus niveles en todos los grupos, con un gran aumento en el grupo de pacientes sépticos con más fallo de órgano. Controles Controles Sepsis Sepsis p p p P p p 71 sanos (0) quirúrgicos (1) SOFA<8 (2) SOFA≥8 (3) (0 vs 1) (0 vs 2) (0 vs 3) (1 vs 2) (1 vs 3) (2 vs 3) PCT 0.03 [0.02] 0.50 [0.97] 1.63 [5.25] 12.09 [50.46] < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 HLA-DRA 7618 [2973] 4468 [3884] 2142 [2449] 1824 [2320] < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 n.s CD40LG 247 [119] 60 [59] 37 [43] 23 [26] < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.006 < 0.001 0.008 CD3E 2524 [1054] 712 [754] 404 [461] 243 [278] < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.003 < 0.001 0.005 CD28 386 [117] 99 [109] 73 [75] 47 [68] < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.017 < 0.001 0.014 ICOS 92 [47] 33 [36] 27 [30] 15 [20] < 0.001 < 0.001 < 0.001 n.s < 0.001 0.015 Tabla 11. Mann Whitney. Niveles de expresión de los genes de la sinapsis inmunológica en los diferentes grupos de pacientes. Mediana [Rango Interquartil] n.s: no significativo I.2 Sensibilidad y Especificidad para identificar la presencia de sepsis En un siguiente paso utilizamos curvas ROC para evaluar la precisión de la expresión de los niveles de los genes de la sinapsis inmunológica para el diagnóstico diferencial entre pacientes quirúrgicos con sepsis y los no sépticos. Todos los genes de la sinapsis inmunológica estudiados presentaron AUROC significativas para el diagnóstico diferencial de pacientes quirúrgicos con sepsis de aquellos que no padecían sepsis. De entre los genes de la sinapsis inmunológica, el que presentó un mejor balance entre sesibilidad y especificidad para diferenciar entre la presencia o ausencia de sepsis fue el HLADRA (figura 16) Al gen HLA-DRA, le siguieron los genes CD3E (figura 17), CD40LG (figura 18), CD28 (figura 19) y por último el gen ICOS (figura 20). 72 Imagen 16. AUROC expresión del gen HLA-DRA para el diagnóstico diferencial de pacientes sépticos y no sépticos (ausencia de sepsis) 79 Imagen 22. Gráfica de puntos de la distribución de los pacientes en función de la escala SOFA, niveles de PCT, niveles de HLA-DRA, y el ratio PCT/HLA-DRA. II.2 Sensibilidad y Especificidad para identificar la presencia de sepsis El área bajo la curva obtenido de la procalcitonina para la diferenciación entre pacientes quirúrgicos sépticos de los no infectados se comparó con el obtenido del ratio PCT/HLA-DRA. Como evidencia el test DeLong, el ratio PCT/HLA-DRA es capaz de mejorar la precisión diagnóstica de la PCT de manera significativa (Imagen 23). Controles Sanos Controles Quirúrgicos Sepsis Shock Séptico 80 Imagen 23. Análisis AUROC para el diagnóstico diferencial entre pacientes quirúrgicos sépticos y los controles quirúrgicos sin sepsis. OOP: optimal operating point, Se: sensibilidad, Sp: especificidad. El ratio PCT/HLA-DRA mejora la capacidad diagnóstica del uso aislado de la PCT al tener mejor balance sensibilidad y especificidad con una AUROC de 0.85 en comparación con la PCT en solitario de AUROC 0.80. Además, observamos que esta diferencia es significativa con una p 0,003. Como podemos observar en la tabla de la imagen 23, ambas curvas ROC posen muy buenos valores tanto de sensibilidad como especificidad, siendo capaz de alcanzar el ratio propuesto de PCT/HLA-DRA una sensibilidad mayor de 0.8. Además, calculamos el punto de corte óptimo (OOP) para la procalcitonina y el ratio que combina ambos biomarcadores, obteniendo de nuevo muy buenos valores de sensibilidad y especificidad y demostrando mejores resultados para la combinación de PCT/HLA-DRA en comparación de los resultados de la procalcitonina de forma aislada. 81 El análisis multivariable demostró que el ratio PCT/HLA-DRA mejora la precisión diagnostica de la procalcitonina en solitario (tablas 15 y 16). La asociación entre este ratio y sepsis fue independiente de la gravedad de la enfermedad o de otros factores de confusión como las comorbilidades que pudiese padecer el paciente previamente, como también el estado inflamatorio basal valorado por los niveles de proteína C reactiva en plasma y la cantidad de neutrófilos en sangre. En nuestros resultados también observamos que tanto el aumento en la escala SOFA, como que la cirugía sea urgente o la proteína C reactiva son marcadores independientes de sepsis, incrementando el riesgo de padecer la enfermedad en los pacientes quirúrgicos. Por lo tanto, tener ratio PCT/HLA-DRA > 0,0003 multiplica por siete la probabilidad de padecer sepsis de manera significativa en los pacientes quirúrgicos. En cuanto a la procalcitonina en solitario, vemos que valores >1.115 ng/ml aumentan por cuatro el riesgo de padecer sepsis entre los pacientes sometidos a cirugía (tablas 15 y 16). Análisis multivariante ratio PCT/HLADRA Análisis multivariante PCT OR IC 95% p OR IC 95% p SOFA score 1,47 1,16-1,87 0,002 1,49 1,17-1,90 0,001 Edad 1,00 0,94-1,06 0,873 1,01 0,96-1,07 0,714 Cirugía urgente 45,70 7,02-297,33 <0,001 41,57 6,77-255,39 <0,001 Enfermedad crónica renal 8,09 0,40-165,00 0,174 4,74 0,26-86,12 0,293 Cáncer 1,08 0,29-4,00 0,908 1,24 0,33-4,60 0,748 Diabetes Mellitus 2,89 0,69-12,22 0,149 2,41 0,61-9,57 0,210 Concentración de neutrófilos en sangre 1,00 1,00-1,00 0,467 1,00 1,00-1,00 0,436 Proteína C Reactiva 1,00 1,00-1,01 0,026 1,00 1,00-1,01 0,021 PCT/HLA-DRA>OOP (0,0003) 7,66 1,82-32,29 0,006 - - - PCT>OOP (1.115ng/ml) - - - 4,21 1,15-15,43 0,030 82 Tabla 15. Análisis multivariante para evaluar el riesgo de padecer sepsis en la cohorte I basado en el ratio PCT/HLA-DRA o en función de los niveles de PCT. (Concentración de neutrófilos en sangre; cel/mm3 ) Los resultados fueron validados en una segunda cohorte: Análisis multivariante ratio PCT/HLA-DRA Análisis multivariante PCT OR IC 95% p OR IC 95% p SOFA score 0,94 0,7-1,25 0,690 1,00 0,77-1,30 0,992 Cirugía urgente 45,68 2,8-744,81 <0,007 31,87 2,95-344,67 <0,004 Cáncer 0,17 0,02-1,34 0,092 0,20 0,03-1,34 0,097 Concentración de neutrófilos en sangre 1,00 1,00-1,00 0,471 1,00 1,00-1,00 0,754 Proteína C Reactiva 1,00 0,98-1,02 0,941 1,01 0,99-1,02 0,503 PCT/HLA-DRA>OOP (0,0003) 34,86 1,22-995,08 0,038 - - - PCT>OOP (1.115ng/ml) - - - 5,52 0,40-75,78 0,201 Tabla 16. Análisis multivariante para evaluar el riesgo de padecer sepsis en la cohorte II basado en el ratio PCT/HLA-DRA o en función de los niveles de PCT. (Concentración de neutrófilos en sangre; cel/mm3 ) 83 VII. Discusión 84 VII. DISCUSIÓN La detección precoz de la sepsis es vital para el éxito del tratamiento y evolución de la enfermedad. Es un reto particularmente importante en los pacientes sometidos a cirugía, donde una pronta intervención y control del foco infeccioso es crucial para aumentar la supervivencia de éstos. En los pacientes quirúrgicos, algunos de los signos que nos podrían hacer pensar en el diagnóstico de sepsis, pueden enmascararse debido a la propia cirugía o del manejo perioperatorio analgésico que precisan. Por lo tanto, es fundamental que en este tipo de pacientes podamos contar con biomarcadores que puedan diagnosticar la enfermedad de la forma más precoz y fiable posible. En la sepsis observamos la coexistencia de una respuesta inflamatoria exacerbada con la depresión de la expresión de los genes de la sinapsis inmunológica 114. Los biomarcadores clásicos hasta ahora utilizados nos ayudan en el diagnostico ante la sospecha de sepsis49, pero ante esta realidad parece razonable apostar por la combinación de biomarcadores que reflejen el estado proinflamatorio con aquellos que muestran inmunosupresión71, 115, 116. Esta tesis doctoral trata de mostrar la utilidad de la cuantificación del grado de inmunosupresión en el diagnóstico de la sepsis y cómo este diagnóstico mejora gracias a la combinación de un marcador que valora la inmunosupresión con los biomarcadores clásicamente utilizados como la PCT. Utilidad de la PCR digital Un punto importante a remarcar en nuestro trabajo es el uso pionero de una nueva tecnología de PCR de tercera generación para la cuantificación de expresión génica, la PCR digital (ddPCR) 96, 107, (Imagen 24). Cabe destacar también que para este trabajo desarrollamos una nueva forma de reportar los resultados de cuantificación de los niveles de expresión génica, 85 consistente en referir los mismos a copias de ADNc por nanogramo de ARNm de partida, método que evita utilizar genes housekeeping de referencia y que ha sido refrendado por una publicación en Annals of Surgery, primera revista en impacto en el área de la Cirugía83. Ventajas de la PCR digital frente a la PCR en tiempo real y a la citometría de flujo La cuantificación de la expresión génica mediante microarrays o PCR en tiempo real (2ª generación) ha sido muy utilizada para la identificación de biomarcadores en sepsis. Como referencia encontramos los trabajos de Cajander y col.92, 124 en los cuales esta tecnología ha sido utilizada para medir HLA-DR. Sin embargo, el uso de ddPCR para este fin es novedoso, siendo nuestro trabajo el primero realizado mediante PCR digital en sepsis. La PCR en tiempo real es una técnica que precisa de un gen de referencia housekeeping, a partir del cual crea una curva patrón, lo que crea problemas en la estandarización y además la medición que ofrece es semicuantitativa, a diferencia de la PCR digital que es cuantitativa absoluta y no precisa de genes de referencia. La PCR digital es capaz de dar resultados de cuantificación de ARNm en menos de cuatro horas, con un coste aproximado de veintiseis euros por determinación. A diferencia de la PCR en tiempo real, la PCR digital es una técnica fácilmente reproductible, muy exacta y rápida, que además posee gran sensibilidad y evita problemas de otras generaciones anteriores como la necesidad de utilizar curvas patrón108. Por lo tanto, pensamos que es buen método para ser aplicado en clínica (tabla 17). 86 Imagen 24. PCR digital PCR tiempo real (2ª generación, 1996) PCR digital (3ª generación, 2011) Determina la cantidad relativa, determina el número de copias interpolando en una curva estándar, comparando con una referencia Mide cantidades absolutas de RNA o DNA, proporciona niveles de expresión cuantificación absoluta, en pocos abundantes, muestras complejas Los datos son una curva con una forma determinada que puede ser afectada por muchos factores (eficiencia de la rección, ruido de fondo…) Es una lectura de punto final, positivos o negativos, con menor impacto de ruido biológico o fluorescente Tabla 17. PCR tiempo real vs. PCR digital 87 Por otro lado, hasta la fecha, la mayoría de los trabajos que han medido HLA-DR se han realizado mediante citometría de flujo125-127. Una de las desventajas de esta técnica es la necesidad de preservar las células vivas para poder medir la unión de anticuerpos a la superficie de la célula, al contrario que la PCR digital que no es esclava del tiempo, puesto que es posible analizar la muestra después de haberla congelado en un tubo Pax gene, incluso si se quiere meses después. Encontramos en la literatura usos frecuentes de la PCR digital, entre ellos la detección de moléculas tumorales en las muestras biológicas128 o de enfermedad minina residual, como en el caso de la leucemia después de haber realizado el trasplante de medula ósea, así como el diagnóstico a través de ARNm de múltiples y diversas enfermedades129. Sin embargo, no existen trabajos previos que utilicen esta técnica en los pacientes con sepsis previamente a nuestro estudio. Por otro lado, no solo se propone su uso como detección, es decir diagnóstico, sino que se abre la puerta a que sea útil tanto en el seguimiento y respuesta de los tratamientos, así como en el pronóstico, poniendo de manifiesto la utilidad de la técnica y su potencial aplicación a la clínica. Depresión de los niveles de expresión de los genes de la sinapsis inmunológica en la sepsis En cuanto al diagnóstico de sepsis, la depresión de los niveles de expresión de genes involucrados en la sinapsis inmunológica es una señal biológica de la enfermedad114. En nuestro trabajo encontramos esta depresión también en los pacientes sometidos a cirugía que no presenta sepsis. Existen diversos estudios que han caracterizado los fenotipos inmunológicos que se desarrollan en los pacientes sépticos, así en el estudio de Davenport y col. se identificó la disminución de la expresión de estos genes en los pacientes sépticos con neumonía adquirida en la comunidad pero mediante el uso de microarrays82. Otro estudio a destacar es el estudio EXPRESS, en el cual entre otros se identifican los principales genes 88 relacionados con la presentación de antígeno y que ven disminuidos sus niveles de expresión con la sepsis97. En este sentido, en nuestro trabajo demostramos que debido a la depresión funcional por la que las células no están produciendo la expresión de estos genes, bien por la disminución del número de células presentadoras de antígeno, o de monocitos, o bien de linfocitos B, observamos niveles deprimidos de los transcritos de ARN mensajero correspondiente a los genes analizados en los pacientes quirúrgicos, con mayor depresión si son además pacientes sépticos, y aún más si están graves. En la sepsis se observa cómo la expresión de las moléculas presentadoras de antígeno esta disminuida tanto en tejidos linfoides como no linfoides, alterando la regulación inmune y la respuesta antimicrobiana de las células T, así como la respuesta de anticuerpos96. Realmente desconocemos el motivo por el cual estos genes ven deprimida su expresión. Puede que las células hayan muerto o bien migrado a los tejidos, o puede simplemente que no estén expresando estos genes. En cualquier caso, elucidadas las causas de esta hipo-expresión no es el objeto de esta tesis, sino evaluar su utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de la sepsis. Los genes implicados en la sinapsis inmunológica y que nosotros empleamos en nuestro estudio son HLA-DRA, CD3E, CD40LG, CD28 e ICOS. Estos genes están relacionados con la inmunidad adaptativa, realizando la presentación de antígeno, es especial las moléculas de clase HLA II, de ellas fundamentalmente HLA-DRA92, 96, 97. Entre los genes estudiados en nuestro trabajo el gen que sufre una mayor depresión en su expresión es el gen HLA-DRA, seguido de CD3E. Como podemos observar en nuestro trabajo, en los diagramas de cajas analizados en los resultados, los pacientes quirúrgicos no sépticos ven disminuidos sus niveles de expresión en los genes de la sinapsis inmunológica a pesar de no estar infectados. Además, cuanto mayor es el fracaso de la función orgánica observamos como hay una mayor diminución de los niveles de expresión en estos genes, correlacionándose con la disfunción y el fracaso de órgano. El gen HLA-DRA y la depresión de sus niveles en pacientes críticos (sepsis, pancreatitis, pacientes quemados o quirúrgicos) se ha estudiado ampliamente desde hace unos años atrás. 95 evidencia. Lo que es cierto es que un uso cada vez más eficaz del arsenal terapéutico del que disponemos ha de pasar por acortar lo máximo posible la duración del tratamiento antibiótico, minimizando así el desarrollo de resistencias antibióticas, infecciones secundarias y el coste de los cuidados sanitarios147. La monitorización de los niveles de procalcitonina es una de las herramientas mejor estudiadas que demuestra el potencial de este biomarcador. Sin embargo, la interpretación de sus niveles puede ser todo un reto, sobre todo si tenemos en cuenta las comorbilidades que muchas veces asocian nuestros pacientes y que influyen en sus niveles137, 148. No existe a día de hoy un biomarcador que en solitario haya demostrado ser infalible en el manejo de la sepsis. Es por ello que creemos tal y como demostramos en nuestro trabajo que la combinación de la procalcitonina con los niveles de expresión de HLA-DRA, que representan los dos inmunofenotipos desarrollados durante la fisiopatología de la sepsis, es una buena herramienta que mejora las opciones hasta día de hoy presentes y que podría tener implicaciones en diferentes facetas del manejo de la enfermedad. En la actualidad, existen nuevas tecnologías de point of care que permiten la medición de HLADR en la cabecera del paciente149, así como también existen otros capaces de medir procalcitonina150. Esta tecnología permite medir de forma muy rápida niveles de estos dos marcadores a pie de cama del paciente, y mejorar la capacidad diagnóstica de la sepsis con su combinación como demostramos en esta tesis. Limitaciones de este trabajo En este trabajo nos ha faltado cuantificar los niveles de expresión de HLA-DRA a lo largo de la evolución del paciente, ya que el incremento o el descenso de los mismos podría aportar información complementaria sobre el pronóstico del paciente. Tampoco hemos comparado el valor pronóstico del HLA-DRA con el de otros biomarcadores emergentes como la proadrenomedulina. La combinación de estas dos moléculas podría ser muy prometedora para estratificar riesgo y mejorar la estimación de pronóstico de los pacientes con sepsis. 96 Finalmente, no hemos estudiado si los niveles de HLA-DRA bajos son previos a la sepsis o son inducidos por la misma, o ambos escenarios se dan de forma simultánea. Para ello sería necesario estudiar los niveles de expresión de este gen en cohortes de pacientes antes de la sepsis. En resumen, la sepsis consume gran cantidad de recursos económicos en los hospitales, siendo una de las primeras causas de muerte en las UCIs, con una prevalencia que lejos de descender se incrementa de manera progresiva. Por lo tanto, es prioritario mejorar las herramientas diagnósticas que nos permitan detectar la enfermedad lo más precozmente posible, puesto que de ello depende en gran medida el éxito del tratamiento. Con nuestro trabajo demostramos que la PCR digital es un método novedoso, rápido, fiable, y aplicable a la clínica para la cuantificación de los niveles de expresión de los genes involucrados en la sinapsis inmunológica en los pacientes quirúrgicos tanto sépticos como no infectados. Además, creemos que esta técnica puede ser útil en la monitorización del estado inmune de los pacientes sépticos, ayudando a valorar el pronóstico y guiando el tratamiento de la enfermedad. Como demostramos en nuestro estudio podemos cuantificar el grado de inmunosupresión. Los pacientes quirúrgicos por el mero hecho de someterse a la cirugía presentan un estado inmune comprometido que les hace más vulnerables a la infección, por lo que creemos que sería interesante saber el estado inmune previo de nuestros pacientes antes de someterse a una agresión quirúrgica pudiendo tener incluso implicaciones en el tipo de profilaxis a llevar a cabo. Actualmente no se conoce un biomarcador ideal en sepsis que sea capaz de guiarnos con toda seguridad en el manejo de la enfermedad, desde el diagnostico, el tratamiento terapéutico, como la propia retirada de la antibioterapia. En nuestro estudio demostramos en el uso de la combinación de los niveles de procalcitonina con los niveles de expresión del gen HLA-DRA mejora la capacidad de diagnóstico de la enfermedad en comparación con el uso aislado del biomarcador clásico procalcitonina, y es por ello que creemos que es una vía interesante para desarrollar y también para estudiar su utilidad en el manejo terapéutico de la sepsis. 97 VIII. Conclusiones 98 VIII. CONCLUSIONES 1. Tanto los pacientes quirúrgicos no sépticos como sépticos presentan depresión de los niveles de expresión de genes implicados en la sinapsis inmunológica, aunque puede observarse que esta depresión es mayor en los pacientes sépticos. 2. Existe una correlación entre la gravedad de la sepsis y la depresión en los niveles de expresión de los genes de la sinapsis inmunológica, de modo que a mayor gravedad, menores niveles de expresión de estos genes. 3. De los genes implicados en la sinapsis inmunológica el que mejor diferencia entre los pacientes quirúrgicos que han desarrollado sepsis de los que no presentan infección es el gen HLA-DRA, aunque el resto de genes estudiados presentaron áreas bajo la curva significativas para la diferenciación entre sepsis y no sepsis. 4. La depresión de los niveles de expresión de HLA-DRA < 1976 copias/ng es un factor independiente que incrementa por cinco el riesgo de mortalidad hospitalaria en los pacientes quirúrgicos en el momento en que son diagnosticados de sepsis. Presentar menos de 1976 copias/ng de HLA-DRA en el momento del diagnóstico se traduce en una reducción de la supervivencia en tres días de media en los primeros veintiocho días. 5. También observamos que son factores independientes de riesgo de mortalidad hospitalaria el antecedente personal de padecer Diabetes Mellitus, así como obtener un valor por encima de ocho en la escala de SOFA en el momento del diagnóstico de sepsis. 6. La combinación resultante de la cuantificación de procalcitonina con los niveles de expresión génica de HLA-DRA es una estrategia prometedora para la detección de 99 sepsis en los pacientes quirúrgicos, mejorando la capacidad diagnostica de la procalcitonina utilizada de forma aislada. 7. Presentar un ratio PCT/HLA-DRA > 0,0003 es un factor de riesgo independiente que multiplica por siete la probabilidad de sepsis en los pacientes quirúrgicos. 8. La PCR digital es un nuevo método útil, rápido, sensible y fácilmente reproductible en la medición de los niveles de expresión génica, que puede ser aplicable para la práctica clínica diaria. 100 IX. Rendimiento Científico 101 Artículos internacionales Título: Quantification of immune dysregulation by next generation Polymerase Chain Reaction to improve Sepsis diagnosis in surgical patients Almansa R, Ortega A, Ávila-Alonso A, Heredia-Rodríguez M, Martín S, Benavides D, MartínFernandez M, Rico L, Aldecoa C, Rico J, López de Cenarruzabeitia I, Beltrán de Heredia J, Gomez-Sanchez E, Aragón M, Andrés C, Calvo D, Andaluz-Ojeda D, Liu P, Blanco-Antona F, Blanco L, Gómez-Herreras JI, Tamayo E, Bermejo-Martin JF. - Revista: Annals of surgery. 2019;269(3):545-53. - Cuartil: 1 - Especialidad: Cirugía - Índice de Impacto (JRC 2019): 9.203 Título: Combined quantification of procalcitonin and HLA-DR improves sepsis detection in surgical patient. Raquel Almansa, Silvia Martín, Marta Martin-Fernandez, María Heredia-Rodríguez, Esther Gómez-Sánchez, Marta Aragón, Cristina Andrés, Dolores Calvo, Jesus RicoFeijoo, Maria Carmen Esteban-Velasco, Luis Mario Vaquero-Roncero, Alicia Ortega, Estefania GómezPesquera, Mario Lorenzo-López, Iñigo López de Cenarruzabeitia, Diana Benavides, Jaime López Sánchez, Cristina Doncel, Carmen González Sánchez, Esther Zarca, Alberto RíosLlorente, Agustín Diaz, Elisa Sanchez-Barrado, Juan Beltran de Heredia, Jose Maria CalvoVecino, Luis Muñoz-Bellvís, Jose Ignacio GomezHerreras, César Aldecoa, Eduardo Tamayo, Jesus F. Bermejo-Martin. - Revista: Scientific Reports (2018) 8:11999 - Cuartil: 1 102 - Especialidad: Multidisciplinar - Índice de Impacto (JRC 2019): 4.12 Congresos internacionales Título: Procalcitonin combined with HLA-DRA improves sepsis detection in surgical patients. Raquel Almansa, Silvia Martín, Marta Martin-Fernandez, Esther Gómez-Sánchez, Marta Aragón, Jesus Rico Feijoo, Alicia Ortega, Estefania Gómez-Pesquera, Mario Lorenzo-López, César Aldecoa, Eduardo Tamayo, Jesus F. Bermejo-Martin. 39th ISICEM International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brussels March 19-22, 2019. Título: Depressed expression of FCER1A gene is associated with increased mortality in infected surgical patients R Almansa, C Andrés, M Martin-Fernández, S Montero, C Jambrina, C Doncel, J SanchezCrespo, M Heredia, J Rico, C Gonzalez, E Sanchez, M Lorenzo, S Martín, L Muñoz, M Vaquero, E Tamayo, C Aldecoa, J Bermejo 39th ISICEM International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brussels March 19-22, 2019. Título: Low gene expression levels of FCER1A are associated to presence of sepsis in infected surgical patients M Rodriguez Rojo, R Almansa, S Martín, D Álvarez Martínez, J López Sánchez, J.F Bermejo The European Anaesthesiology Congress, Euroanaesthesia 2019. Vienna June 1-3, 201 103 Congresos Nacionales Título: Cuantificación de la expresión génica de HLA-DRA y detección de mortalidad en pacientes quirúrgicos con sepsis. S. Martin Alfonso, C. Aldecoa Alvarez-Santullano, A. Ortega Andres, R. Almansa Mora, S. Montero Caballero, F.J. Bermejo Martin XXXIV Congreso Nacional de la Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Las Palmas de Gran Canaria, del 25 al 27 de abril de 2019 104 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 127 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA INVESTIGACIÓN CLINICA QUE IMPLIQUE MUESTRAS BIOLÓGICAS Hospital Universitario Rio Hortega de Valladolid FIRMA DEL PACIENTE / REPRESENTANTE LEGAL NOMBRE Y APELLIDOS FECHA Yo he explicado por completo los detalles relevantes de este estudio al paciente nombrado anteriormente y/o la persona autorizada a dar el consentimiento en nombre del paciente. FIRMA DEL INVESTIGADOR NOMBRE Y APELLIDOS FECHA CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL PACIENTE POR ESCRITO. Estudio: Desarrollo de un escore molecular de fallo de órgano (mSOFA) para diagnóstico y pronóstico de sepsis APARTADO PARA LA REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO (CONTACTAR CON EL INVESTIGADOR PRINCIPAL) Yo ___________________________________________________ revoco el consentimiento de participación en el estudio, arriba firmado con fecha ___________________________ Firma: ANEXO 1 128 ANEXO 2 129 ANEXO 3 130 ANEXO 4 131 XI. Bibliografía 132 XI. BIBLIOGRAFÍA 1. Shankar-Hari M, Rubenfeld GD. Understanding Long-Term Outcomes Following Sepsis: Implications and Challenges. Curr Infect Dis Rep. 2016;18(11):37. 2. Martin GS MD, Eaton S, Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med.348(16):1546-54. 3. Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 2001;29(7):1303-10. 4. Vincent JL, Sakr Y, Sprung CL, Ranieri VM, Reinhart K, Gerlach H, et al. Sepsis in European intensive care units: results of the SOAP study. Crit Care Med. 2006;34(2):344-53. 5. New hope for sepsis. Lancet. 2012;379(9825):1462. 6. Luis Antonio Gorordo Delsol JAMG, ** Antonio López Gómez***, . Sepsis: Más allá de la enfermedad 2014;6:12-6. 7. Valles J, Leon C, Alvarez-Lerma F. Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis. Spanish Collaborative Group for Infections in Intensive Care Units of Sociedad Espanola de Medicina Intensiva y Unidades Coronarias (SEMIUC). Clin Infect Dis. 1997;24(3):387-95. 8. Esteban A, Frutos-Vivar F, Ferguson ND, Penuelas O, Lorente JA, Gordo F, et al. Sepsis incidence and outcome: contrasting the intensive care unit with the hospital ward. Crit Care Med. 2007;35(5):1284-9. 9. Martin Alfonso S PGA, Aldecoa Alvarez-Santullano C. Sepsis and Immunosenescence in the Elderly Patient: A Review. Frontiers in Medicine. 2017;04(Articulo 20). 10. Rusinova K, Guidet B. "Are you sure it's about 'age'?". Intensive Care Med. 2014;40(1):114-6. 11. Güemez-Sandoval E. El papiro Ebers y la olftalmología. Rev mex oftalmol.83(2):123-5. 12. Majno G. The ancient riddle of sigma eta psi iota sigma (sepsis). J Infect Dis. 1991;163(5):93745. 13. Baron R M BMJ, Perella M A. Pathobiology of sepsis. Are we still asking the same questions? Am J Respir Cell Mol Biol 2006;34:129-34. 14. Duane J.F. JEP, Anand K. Sepsis and Septic Shock: A history. Critical Care Clinic. 2009;25:83-101. 15. Geroulanos S, Douka ET. Historical perspective of the word "sepsis". Intensive Care Med. 2006;32(12):2077. 16. Rosengart MR. Critical care medicine: landmarks and legends. Surg Clin North Am. 2006;86(6):1305-21. 17. Miranda CM, Navarrete TL. [Semmelweis and his outstanding contribution to medicine: washing hands saves lives]. Rev Chilena Infectol. 2008;25(1):54-7. 18. Semmelweis K. [Ignaz Philipp Semmelweis -- remembrance and assessment of his achievement by the discovery of the causes of puerperal fever, in Austria in the 20th and 21st centuries]. Orvostort Kozl. 2015;61(1-4):19-27. 19. Nau JY. [Louis Pasteur, science and the return of "belief"]. Rev Med Suisse. 2015;11(484):16267. 20. Jessney B. Joseph Lister (1827-1912): a pioneer of antiseptic surgery remembered a century after his death. J Med Biogr. 2012;20(3):107-10. 21. Beutler B, Rietschel ET. Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin. Nat Rev Immunol. 2003;3(2):169-76. 22. Budelmann G. [Hugo Schottmuller, 1867-1936. The problem of sepsis]. Internist (Berl). 1969;10(3):92-101. 23. van Vught LA, Wiewel MA, Hoogendijk AJ, Frencken JF, Scicluna BP, Klouwenberg P, et al. The Host Response in Patients with Sepsis Developing Intensive Care Unit-acquired Secondary Infections. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(4):458-70. 24. Bryan CS. The influence of Sir Andrew Clark (1826-93) on William Osler (1849-1919). J Med Biogr. 2005;13(4):195-200. 133 25. Ashbaugh DG, Bigelow DB, Petty TL, Levine BE. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 1967;2(7511):319-23. 26. Rabuel C, Mebazaa A. Septic shock: a heart story since the 1960s. Intensive Care Med. 2006;32(6):799-807. 27. Bone RC, Sibbald WJ, Sprung CL. The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure. Chest. 1992;101(6):1481-3. 28. Bone RC, Fisher CJ, Jr., Clemmer TP, Slotman GJ, Metz CA, Balk RA. Sepsis syndrome: a valid clinical entity. Methylprednisolone Severe Sepsis Study Group. Crit Care Med. 1989;17(5):389-93. 29. Bone RC, Fisher CJ, Jr., Clemmer TP, Slotman GJ, Metz CA, Balk RA. A controlled clinical trial of high-dose methylprednisolone in the treatment of severe sepsis and septic shock. N Engl J Med. 1987;317(11):653-8. 30. Panacek EA, Marshall JC, Albertson TE, Johnson DH, Johnson S, MacArthur RD, et al. Efficacy and safety of the monoclonal anti-tumor necrosis factor antibody F(ab')2 fragment afelimomab in patients with severe sepsis and elevated interleukin-6 levels. Crit Care Med. 2004;32(11):2173-82. 31. Larsen R. [Sepsis, SIRS, MODS--new findings, unanswered questions]. Anaesthesist. 1996;45(4):311. 32. Chen YX, Li CS. Risk stratification and prognostic performance of the predisposition, infection, response, and organ dysfunction (PIRO) scoring system in septic patients in the emergency department: a cohort study. Crit Care. 2014;18(2):R74. 33. Dellinger RP, Carlet JM, Masur H, Gerlach H, Calandra T, Cohen J, et al. Surviving Sepsis Campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock. Intensive Care Med. 2004;30(4):536-55. 34. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Med. 2013;39(2):165-228. 35. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2012. Crit Care Med. 2013;41(2):580-637. 36. Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, Shankar-Hari M, Annane D, Bauer M, et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016;315(8):801-10. 37. Shankar-Hari M, Phillips GS, Levy ML, Seymour CW, Liu VX, Deutschman CS, et al. Developing a New Definition and Assessing New Clinical Criteria for Septic Shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016;315(8):775-87. 38. Guidet B AP. Índices de gravedad y aplicaciones en reanimación. AnestReanim.2009;35(2):1-11. 39. Artero A, Zaragoza R, Camarena JJ, Sancho S, Gonzalez R, Nogueira JM. Prognostic factors of mortality in patients with community-acquired bloodstream infection with severe sepsis and septic shock. J Crit Care. 2010;25(2):276-81. 40. Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, Zimmerman JE. APACHE II: a severity of disease classification system. Crit Care Med. 1985;13(10):818-29. 41. Alvear-Vega S, Canteros-Gatica J. [Performance evaluation of APACHE II and SAPS III in an intensive care unit]. Rev Salud Publica (Bogota). 2018;20(3):373-7. 42. Henriksen DP, Pottegard A, Laursen CB, Jensen TG, Hallas J, Pedersen C, et al. Risk factors for hospitalization due to community-acquired sepsis - a population-based case-control study. PLoS One. 2015;10(4):e0124838. 43. Heffner AC, Horton JM, Marchick MR, Jones AE. Etiology of illness in patients with severe sepsis admitted to the hospital from the emergency department. Clin Infect Dis. 2010;50(6):814-20. 44. Peres Bota D, Melot C, Lopes Ferreira F, Vincent JL. Infection Probability Score (IPS): A method to help assess the probability of infection in critically ill patients. Crit Care Med. 2003;31(11):2579-84. 45. Gadani H, Vyas A, Kar AK. A study of ventilator-associated pneumonia: Incidence, outcome, risk factors and measures to be taken for prevention. Indian J Anaesth. 2010;54(6):535-40. 46. Zilberberg MD, Shorr AF. Ventilator-associated pneumonia: the clinical pulmonary infection score as a surrogate for diagnostics and outcome. Clin Infect Dis. 2010;51 Suppl 1:S131-5. 47. Vincent JL. Management of sepsis in the critically ill patient: key aspects. Expert Opin Pharmacother. 2006;7(15):2037-45. 48. Vila J, Gomez MD, Salavert M, Bosch J. [Methods of rapid diagnosis in clinical microbiology: Clinical needs]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2017;35(1):41-6. 134 49. Kibe S, Adams K, Barlow G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. J Antimicrob Chemother. 2011;66 Suppl 2:ii33-40. 50. Biomarkers Definitions Working G. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clin Pharmacol Ther. 2001;69(3):89-95. 51. Schuetz P, Christ-Crain M, Muller B. Biomarkers to improve diagnostic and prognostic accuracy in systemic infections. Curr Opin Crit Care. 2007;13(5):578-85. 52. Tillett WS, Francis T. Serological Reactions in Pneumonia with a Non-Protein Somatic Fraction of Pneumococcus. J Exp Med. 1930;52(4):561-71. 53. Lobo SM, Lobo FR, Bota DP, Lopes-Ferreira F, Soliman HM, Melot C, et al. C-reactive protein levels correlate with mortality and organ failure in critically ill patients. Chest. 2003;123(6):2043-9. 54. Baidoshvili A, Nijmeijer R, Lagrand WK, Hack CE, Niessen HW. Localisation of C reactive protein in infarcted tissue sites of multiple organs during sepsis. J Clin Pathol. 2002;55(2):152-3. 55. Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein: a critical update. J Clin Invest. 2003;111(12):1805-12. 56. Povoa P, Coelho L, Almeida E, Fernandes A, Mealha R, Moreira P, et al. C-reactive protein as a marker of infection in critically ill patients. Clin Microbiol Infect. 2005;11(2):101-8. 57. Schmit X, Vincent JL. The time course of blood C-reactive protein concentrations in relation to the response to initial antimicrobial therapy in patients with sepsis. Infection. 2008;36(3):213-9. 58. Lavrentieva A, Kontakiotis T, Lazaridis L, Tsotsolis N, Koumis J, Kyriazis G, et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis? Burns. 2007;33(2):18994. 59. Fraunberger P, Wang Y, Holler E, Parhofer KG, Nagel D, Walli AK, et al. Prognostic value of interleukin 6, procalcitonin, and C-reactive protein levels in intensive care unit patients during first increase of fever. Shock. 2006;26(1):10-2. 60. Linscheid P, Seboek D, Nylen ES, Langer I, Schlatter M, Becker KL, et al. In vitro and in vivo calcitonin I gene expression in parenchymal cells: a novel product of human adipose tissue. Endocrinology. 2003;144(12):5578-84. 61. Muller B, White JC, Nylen ES, Snider RH, Becker KL, Habener JF. Ubiquitous expression of the calcitonin-i gene in multiple tissues in response to sepsis. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86(1):396-404. 62. Nakamura A, Wada H, Ikejiri M, Hatada T, Sakurai H, Matsushima Y, et al. Efficacy of procalcitonin in the early diagnosis of bacterial infections in a critical care unit. Shock. 2009;31(6):58691. 63. Limper M, de Kruif MD, Duits AJ, Brandjes DP, van Gorp EC. The diagnostic role of procalcitonin and other biomarkers in discriminating infectious from non-infectious fever. J Infect. 2010;60(6):409-16. 64. Muller B, Peri G, Doni A, Perruchoud AP, Landmann R, Pasqualini F, et al. High circulating levels of the IL-1 type II decoy receptor in critically ill patients with sepsis: association of high decoy receptor levels with glucocorticoid administration. J Leukoc Biol. 2002;72(4):643-9. 65. Guan J, Lin Z, Lue H. Dynamic change of procalcitonin, rather than concentration itself, is predictive of survival in septic shock patients when beyond 10 ng/mL. Shock. 2011;36(6):570-4. 66. al TTe. Early evaluation of severity in patients with severe sepsis: a comparasion with "septic shock"- subgroup analysis of the Japanese Association for Acute Medicine Sepsis Registry (JAAM-SR). Acute Med Surg 2017.Jul 27; 4(4):426-431. 67. Kang FX, Wang RL, Yu KL, Wei Q. [The study on pro-adrenomedullin as a new biomarker in sepsis prognosis and risk stratification]. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 2008;20(8):452-5. 68. Beltowski J, Jamroz A. Adrenomedullin--what do we know 10 years since its discovery? Pol J Pharmacol. 2004;56(1):5-27. 69. Andaluz-Ojeda D, Cicuendez R, Calvo D, Largo E, Nogales L, Munoz MF, et al. Sustained value of proadrenomedullin as mortality predictor in severe sepsis. J Infect. 2015;71(1):136-9. 70. Selberg O, Hecker H, Martin M, Klos A, Bautsch W, Kohl J. Discrimination of sepsis and systemic inflammatory response syndrome by determination of circulating plasma concentrations of procalcitonin, protein complement 3a, and interleukin-6. Crit Care Med. 2000;28(8):2793-8. 71. Harbarth S, Holeckova K, Froidevaux C, Pittet D, Ricou B, Grau GE, et al. Diagnostic value of procalcitonin, interleukin-6, and interleukin-8 in critically ill patients admitted with suspected sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164(3):396-402. 72. Pathan N, Hemingway CA, Alizadeh AA, Stephens AC, Boldrick JC, Oragui EE, et al. Role of interleukin 6 in myocardial dysfunction of meningococcal septic shock. Lancet. 2004;363(9404):203-9. 73. Pierrakos C, Vincent JL. Sepsis biomarkers: a review. Crit Care. 2010;14(1):R15. 135 74. Andaluz-Ojeda D, Bobillo F, Iglesias V, Almansa R, Rico L, Gandia F, et al. A combined score of proand anti-inflammatory interleukins improves mortality prediction in severe sepsis. Cytokine. 2012;57(3):332-6. 75. Bloos F, Reinhart K. Rapid diagnosis of sepsis. Virulence. 2014;5(1):154-60. 76. Samraj RS, Zingarelli B, Wong HR. Role of biomarkers in sepsis care. Shock. 2013;40(5):358-65. 77. Sweeney TE, Perumal TM, Henao R, Nichols M, Howrylak JA, Choi AM, et al. A community approach to mortality prediction in sepsis via gene expression analysis. Nat Commun. 2018;9(1):694. 78. Sweeney TE, Wong HR, Khatri P. Robust classification of bacterial and viral infections via integrated host gene expression diagnostics. Sci Transl Med. 2016;8(346):346ra91. 79. Sweeney TE, Shidham A, Wong HR, Khatri P. A comprehensive time-course-based multicohort analysis of sepsis and sterile inflammation reveals a robust diagnostic gene set. Sci Transl Med. 2015;7(287):287ra71. 80. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R, et al. Unsupervised Analysis of Transcriptomics in Bacterial Sepsis Across Multiple Datasets Reveals Three Robust Clusters. Crit Care Med. 2018;46(6):915-25. 81. Scicluna BP, van Vught LA, Zwinderman AH, Wiewel MA, Davenport EE, Burnham KL, et al. Classification of patients with sepsis according to blood genomic endotype: a prospective cohort study. Lancet Respir Med. 2017;5(10):816-26. 82. Davenport EE, Burnham KL, Radhakrishnan J, Humburg P, Hutton P, Mills TC, et al. Genomic landscape of the individual host response and outcomes in sepsis: a prospective cohort study. Lancet Respir Med. 2016;4(4):259-71. 83. Almansa R, Ortega A, Avila-Alonso A, Heredia-Rodriguez M, Martin S, Benavides D, et al. Quantification of Immune Dysregulation by Next-generation Polymerase Chain Reaction to Improve Sepsis Diagnosis in Surgical Patients. Ann Surg. 2019;269(3):545-53. 84. Bermejo-Martin JF, Tamayo E, Andaluz-Ojeda D, Martin-Fernandez M, Almansa R. Characterizing Systemic Immune Dysfunction Syndrome to Fill in the Gaps of SEPSIS-2 and SEPSIS-3 Definitions. Chest. 2017;151(2):518-9. 85. al. JFBe. Shared features of endothelial dysfunction between sepsis and its preceding risk factors (aging and chronic disease). Journal of Clinical Medicine. 2018;7, 400. 86. Christaki E, Anyfanti P, Opal SM. Immunomodulatory therapy for sepsis: an update. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011;9(11):1013-33. 87. Giamarellos-Bourboulis EJ, Raftogiannis M. The immune response to severe bacterial infections: consequences for therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2012;10(3):369-80. 88. van der Poll T, Opal SM. Host-pathogen interactions in sepsis. Lancet Infect Dis. 2008;8(1):3243. 89. Opal SM. Immunologic alterations and the pathogenesis of organ failure in the ICU. Semin Respir Crit Care Med. 2011;32(5):569-80. 90. Casey LC. Immunologic response to infection and its role in septic shock. Crit Care Clin. 2000;16(2):193-213. 91. Hattori Y, Hattori K, Suzuki T, Matsuda N. Recent advances in the pathophysiology and molecular basis of sepsis-associated organ dysfunction: Novel therapeutic implications and challenges. Pharmacol Ther. 2017;177:56-66. 92. Cajander S, Backman A, Tina E, Stralin K, Soderquist B, Kallman J. Preliminary results in quantitation of HLA-DRA by real-time PCR: a promising approach to identify immunosuppression in sepsis. Crit Care. 2013;17(5):R223. 93. Bermejo-Martin JF, Tamayo E, Ruiz G, Andaluz-Ojeda D, Herran-Monge R, Muriel-Bombin A, et al. Circulating neutrophil counts and mortality in septic shock. Crit Care. 2014;18(1):407. 94. Almansa R, Wain J, Tamayo E, Andaluz-Ojeda D, Martin-Loeches I, Ramirez P, et al. Immunological monitoring to prevent and treat sepsis. Crit Care. 2013;17(1):109. 95. Almansa R, Heredia-Rodriguez M, Gomez-Sanchez E, Andaluz-Ojeda D, Iglesias V, Rico L, et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. J Infect. 2015;70(5):445-56. 96. al. ARe. Quantification of Immune Dysregulation by Next-regeneration Polymerase Chain Reaction to Improve Sepsis Diagnosis in Surgical Patients. Annals of surgery. 2017;July. 97. Almansa R, Tamayo E, Heredia M, Gutierrez S, Ruiz P, Alvarez E, et al. Transcriptomic evidence of impaired immunoglobulin G production in fatal septic shock. J Crit Care. 2014;29(2):307-9. 98. Boomer JS, Shuherk-Shaffer J, Hotchkiss RS, Green JM. A prospective analysis of lymphocyte phenotype and function over the course of acute sepsis. Crit Care. 2012;16(3):R112. 136 99. Boomer JS, To K, Chang KC, Takasu O, Osborne DF, Walton AH, et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 2011;306(23):2594-605. 100. Hotchkiss RS, Tinsley KW, Swanson PE, Schmieg RE, Jr., Hui JJ, Chang KC, et al. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans. J Immunol. 2001;166(11):6952-63. 101. Kasten KR, Tschop J, Goetzman HS, England LG, Dattilo JR, Cave CM, et al. T-cell activation differentially mediates the host response to sepsis. Shock. 2010;34(4):377-83. 102. Muenzer JT, Davis CG, Chang K, Schmidt RE, Dunne WM, Coopersmith CM, et al. Characterization and modulation of the immunosuppressive phase of sepsis. Infect Immun. 2010;78(4):1582-92. 103. Xiao W, Mindrinos MN, Seok J, Cuschieri J, Cuenca AG, Gao H, et al. A genomic storm in critically injured humans. J Exp Med. 2011;208(13):2581-90. 104. Tang Benjamin M ea. Genome-wide transcription profiling of human sespis: a systematic review. Crit Care Lond Engl 2010;14(6):R237. 105. al. WZe. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. . Nat Rev Genet. 2009;10(1):57-63. 106. Wong HRea. Genome-wide expression profiling in pediatric shock Pediatr Res. 2013;73(4 Pt 2):564-9. 107. M. B. Digital PCR hits its stride. Nat Methods. 2012;9(6):541-4. 108. Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallichotte EN, Ruf IK, Hindson BJ, et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 2013;10(10):1003-5. 109. Jimenez-Sousa MA, Medrano LM, Liu P, Fernandez-Rodriguez A, Almansa R, Gomez-Sanchez E, et al. IL-6 rs1800795 polymorphism is associated with septic shock-related death in patients who underwent major surgery: a preliminary retrospective study. Ann Intensive Care. 2017;7(1):22. 110. Hotchkiss RS, Moldawer LL, Opal SM, Reinhart K, Turnbull IR, Vincent JL. Sepsis and septic shock. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16045. 111. Moore LJ, Moore FA, Todd SR, Jones SL, Turner KL, Bass BL. Sepsis in general surgery: the 20052007 national surgical quality improvement program perspective. Arch Surg. 2010;145(7):695-700. 112. Moore LJ, Moore FA. Early diagnosis and evidence-based care of surgical sepsis. J Intensive Care Med. 2013;28(2):107-17. 113. Moore LJ, Jones SL, Kreiner LA, McKinley B, Sucher JF, Todd SR, et al. Validation of a screening tool for the early identification of sepsis. J Trauma. 2009;66(6):1539-46; discussion 46-7. 114. Bermejo-Martin JF, Andaluz-Ojeda D, Almansa R, Gandia F, Gomez-Herreras JI, Gomez-Sanchez E, et al. Defining immunological dysfunction in sepsis: A requisite tool for precision medicine. J Infect. 2016;72(5):525-36. 115. Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, Ferguson TA. The sepsis seesaw: tilting toward immunosuppression. Nat Med. 2009;15(5):496-7. 116. Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D. Immunosuppression in sepsis: a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach. Lancet Infect Dis. 2013;13(3):260-8. 117. Cazalis MA, Friggeri A, Cave L, Demaret J, Barbalat V, Cerrato E, et al. Decreased HLA-DR antigen-associated invariant chain (CD74) mRNA expression predicts mortality after septic shock. Crit Care. 2013;17(6):R287. 118. Winkler MS, Rissiek A, Priefler M, Schwedhelm E, Robbe L, Bauer A, et al. Human leucocyte antigen (HLA-DR) gene expression is reduced in sepsis and correlates with impaired TNFalpha response: A diagnostic tool for immunosuppression? PLoS One. 2017;12(8):e0182427. 119. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med. 2003;31(4):1250-6. 120. Colbert JF, Schmidt EP. Endothelial and Microcirculatory Function and Dysfunction in Sepsis. Clin Chest Med. 2016;37(2):263-75. 121. Goligorsky MS. Vascular endothelium in diabetes. Am J Physiol Renal Physiol. 2017;312(2):F266F75. 122. Groen BB, Hamer HM, Snijders T, van Kranenburg J, Frijns D, Vink H, et al. Skeletal muscle capillary density and microvascular function are compromised with aging and type 2 diabetes. J Appl Physiol (1985). 2014;116(8):998-1005. 123. Almansa R, Martin S, Martin-Fernandez M, Heredia-Rodriguez M, Gomez-Sanchez E, Aragon M, et al. Combined quantification of procalcitonin and HLA-DR improves sepsis detection in surgical patients. Sci Rep. 2018;8(1):11999.