Estudio del efecto de compuestos tensioactivos en el aumento de hidrolisis enzimática de biomasa pretratada

ESTUDO DO EFEITO DE COMPOSTOS TENSIOACTIVOS NO AUMENTO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PRÉ-TRATADOS. _ ______________________________________________ ESTUDIO DEL EFECTO DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS EN EL AUMENTO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE BIOMASA PRE-TRATADA. DANIEL PÉREZ ANTOLÍN TRABAJO EFECTUADO CON LA ORIENTACIÓN DEL PROFESOR Nuno Cláudio da Rocha Meses Pedro j ulio 2012 Anexo 1 DECLARAÇÃO Nome: DANIEL PÉREZ ANTOLÍN . E-mail: [email protected] . Telefone: +34 680 511 180 . Bilhete de Identidade: 71940909-Z . Título do trabalho: ESTUDO DO EFEITO DE COMPOSTOS TENSIOACTIVOS NO AUMENTO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PRÉ-TRATADOS . ESTUDIO DEL EFECTO DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS EN EL AUMENTO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE BIOMASA PRE-TRATADA . Orientador(es): Nuno Cláudio da Rocha Meses Pedro . Ano de conclusão: 2012 . Designação do trabalho de fim de curso: . ENGENHARIA BIOLÓGICA E ALIMENTAR . 1. É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTE TRABALHO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE; Instituto Politécnico de Castelo Branco, ___/___/______ Assinatura: ________________________________________________ Anexo 2 DECLARAÇÃO Nome: DANIEL PÉREZ ANTOLÍN . E-mail: [email protected] . Telefone: +34 680 511 180 . Bilhete de Identidade: 71940909-Z . Título do trabalho: ESTUDO DO EFEITO DE COMPOSTOS TENSIOACTIVOS NO AUMENTO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PRÉ-TRATADOS . ESTUDIO DEL EFECTO DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS EN EL AUMENTO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE BIOMASA PRE-TRATADA . Orientador(es): Nuno Cláudio da Rocha Meses Pedro . Ano de conclusão: 2012 . Designação do trabalho de fim de curso: . ENGENHARIA BIOLÓGICA E ALIMENTAR . Declaro que concedo ao Instituto Politécnico de Castelo Branco e aos seus agentes uma licença não-exclusiva para arquivar e tornar acessível, nomeadamente através do seu repositório institucional, nas condições abaixo indicadas, o meu trabalho, no todo ou em parte, em suporte digital. Declaro que autorizo o Instituto Politécnico de Castelo Branco a arquivar mais de uma cópia do trabalho e a, sem alterar o seu conteúdo, converter o trabalho entregue, para qualquer formato de ficheiro, meio ou suporte, para efeitos de preservação e acesso. Retenho todos os direitos de autor relativos ao trabalho, e o direito de a usar em trabalhos futuros (como artigos ou livros). Concordo que o meu trabalho seja colocada no repositório do Instituto Politécnico de Castelo Branco com o seguinte estatuto (assinale um): 1. □ Disponibilização imediata do conjunto do trabalho para acesso mundial; 2. □ Disponibilização do conjunto do trabalho para acesso exclusivo no Instituto Politécnico de Castelo Branco durante o período de □ 1 ano, □ 2 anos ou □ 3 anos, sendo que após o tempo assinalado autorizo o acesso mundial. 3. □ Disponibilização do conjunto do trabalho para acesso exclusivo no Instituto Politécnico de Castelo Branco Instituto Politécnico de Castelo Branco, ___/___/______ Assinatura: ________________________________________________ Instituto Politécnico de Castelo Branco Escola Superior de Agrária ESTUDO DO EFEITO DE COMPOSTOS TENSIOACTIVOS NO AUMENTO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PRÉ-TRATRADA. ESTUDIO DEL EFECTO DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS EN EL AUMENTO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE BIOMASA PRE-TRATADA. DANIEL PÉREZ ANTOLÍN Dissertação apresentada ao Instituto Politécnico de Castelo Branco para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do titulo de Engenharia Biológica e Alimentar, realizada sob a orientação científica do Doutor Nuno Cláudio da Rocha Meses Pedro do Instituto Politécnico de Castelo Branco. 2012 a toda minha família e amigos, porque sem eles tivesse sido impossível chegar até onde cheguei Resumo. Na produção de etanol celulósico é fundamental que na etapa de fermentação os microorganismos tenham à sua disposição açúcares simples. Para tal são necessárias duas etapas prévias que promovam a “desconstrução” da madeira nestes monómeros. Na primeira etapa o material lenho-celulósico é submetido a pré-tratamentos químicos que têm o objectivo de quebrar a estrutura organizada da madeira permitindo por essa acção que as enzimas hidrolíticas possam transformar a celulose e hemicelulose em hexoses e pentoses. Neste trabalho de estágio pretende-se estudar o efeito da adição de compostos tensioactivos no aumento da conversão enzimática de materiais pré-tratados. Assim, testar-se-à a adição de polyethylene glycol 4000 (peg4000), polysorbate 20 (tween 20) e bovine serum albumine (bsa) no aumento da eficiência da hidrólise enzimática. Cada um destes compostos será testado em dois tipos de pré-tratados, o primeiro resultante dum pré-tratamento com ácido H2SO4 - 4,09% (w/w), 156ºc, 102min, o segundo proveniente de um pré-tratamento com NaOH – 10%(w/v), 156ºc,102min. No final pretendem-se analisar quais dos compostos gera maior incremento e se esse efeito se faz sentir da mesma forma nos dois pré-tratados analisados (ácido e alcalino). Biomassa utilizada – resíduos das podas do olival com granulometria inferior a 0,5mm Resumen. En la producción de etanol celulósico, es esencial, en la etapa de fermentación que los microorganismos tengan a su disposición azúcares simples. Esto requiere dos pasos preliminares para promover la "desconstrucción" de la madera en estos monómeros. . En el primer paso el material de madera celulósica se somete a pre-tratamientos químicos que están destinados a romper la estructura y así facilitar à las enzimas hidrolíticas la acción de conversión de celulosa y hemicelulosa en pentosas y hexosas. En este trabajo se pretende evaluar el efecto de la adición de compuestos tensioactivos en el aumento de la conversión enzimática del material pretratado. Así, se testara la adición de polietilenoglicol 4000 (PEG4000), polisorbato 20 (Tween 20) y albúmina de suero bovino (BSA) para aumentar la eficiencia de la hidrólisis enzimática Cada uno de estos compuestos será testado en dos tipos de pre-tratado, lo primero como resultado de un pre-tratamiento ácido H2SO4 - 4,09% (w / w), 156 ° C, 102min, el segundo de un pre-tratamiento alcalino con NaOH - 10% (w / v), 156 ° C, 102min. Al final vamos a analizar cuáles de los compuestos conduce a un mayor incremento y se este efecto se siente de la misma manera en lo pre-tratado ácido e alcalino. La biomasa utilizada - residuos de la poda del olivar, con un tamaño de partícula inferior a 0,5 mm. Abstract. In the production of cellulosic ethanol, is essentially l in the fermentation step that microorganisms have available to simple sugars. This requires two preliminary steps to promote the "deconstruction" of wood in these monomers. In the first step the wood cellulosic material is subjected to chemical pre-treatments are intended to break the structure and thus facilitate the action hydrolytic enzymes to convert cellulose and hemicellulose into pentoses and hexoses. In this work was to assess the effect of addition of surfactants in enhancing the enzymatic conversion of pretreated materials. Thus, it will test the addition of polyethylene glycol 4000 (PEG4000), polysorbate 20 (Tween 20) and bovine serum albumin (BSA) to increase the efficiency of enzymatic hydrolysis Each of these compounds will be tested in two types of pre-treated, first as a result of an acid pretreatment H2SO4 - 4.09% (w / w), 156 ° C, 102min, the second pre-treatment alkaline with NaOH - 10% (w / v), 156 ° C, 102min. At the end we will analyze which of the compounds leads to a further increase this effect and feel in the same manner as acid pretreated and alkaline. The biomass used - waste of pruning the olive grove, with a particle size less than 0.5 mm ÍNDICE RESUMO/ RESUMEN/ ABSTRACT Pág. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS………………………………………………………………………………………….8 2. ASPECTOS GENERALES……………………………………………………………………………………………………10 2.1. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………………………………………11 2.2. PRETRATAMIENTO……………………………………………………………………………………………………11 2.2.1. PRE-TRATAMIENTO ÁCIDO……………………………………………………………………12 2.2.2. PRE-TRATAMIENTO ALCALINO…………………………………………………………….13 2.3. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA……………………………………………………………………………………13 2.4. APLICACIÓN DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS………………………………………………..16 3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL………………………………………………………………………………………….17 3.1. MATERIAL UTILIZADO……………………………………………………………………………………….19 4. RESULTADOS…………………………………………………………………………………………………………………………22 5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………………….29 6. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………………………………………………………30 Página | 13 2.2.2. PRE-TRATAMIENTO ALCALINO El uso de este pre tratamiento depende del contenido de lignina en el material. El mecanismo de la hidró-lisis alcalina se basa en la saponificación de los enlaces de ester que atraviesan los xilanos en la hemicelu-losa y otras componentes como la lignina y otra hemicelulosa. Así, el tratamiento con NaOH diluido aumenta el área superficial y disminuye el grado de polimerización y cristalinidad por la remoción de los enlaces entre la lignina y los carbohidratos. [4] El pre tratamiento alcalino ha sido reflejado en menor medida en la bibliografía, debido principalmente a que mediante esta técnica se consiguen resultados bastante inferiores al pre tratamiento con ácido. Como principal ventaja presenta que el acceso al NaOH es muy fácil y a bajo costo. El pre tratamiento básico llevado a cabo fue con hidróxido sódico diluido a una temperatura de 120ºC durante 100 minutos. 2.3. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA En la hidrólisis enzimática se produce la ruptura de las cadenas poliméricas de la celulosa y la hemicelulosa, que previamente han sido modificadas estructuralmente en el pre tratamiento. A partir de la celulosa se obtiene glucosa, mientras que a partir de la hemicelulosa se obtienen diferentes monosacaridos, tales como xilosa, glucosa, arabinosa, galactosa y manosa, entre otros. La hidrólisis enzimática es realizada por enzimas de alta especificidad, como las celulasas y xilanasas producidas a partir de hongos y bacterias. Las celulasas son una mezcla de enzimas de al menos tres grupos: 1) las endoglucanasas, las cuales atacan regiones de celulosa de baja cristalinidad descomponiendo los enlaces β(1-4) y creando finales de cadena; 2) las exoglucanasas, la cuales degradan la celulosa cristalina y amorfa para producir celobiosa y 3) las β-glucosidasas, que hidrolizan la celobiosa y oligosacaridos menores para producir glucosa y así evitar su efecto inhibidor por acumulación en el medio de reacción. [3] Página | 14 Los principales factores que afectan la eficiencia de la hidrólisis enzimática son: el sustrato, la actividad de la celulasa y las condiciones de reacción. [3] La susceptibilidad de las celulasas al sustrato celulósico depende de las características de éste, incluyendo el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad, la cristalinidad y el grado de polimerización de la celulosa. El contenido de lignina es determinante en el rendimiento de la hidrólisis, debido a que bloquea el acceso de las celulasas por impedimento estérico causado por los enlaces lignina – carbohidratos y por la naturaleza hidrofóbica de la lignina que rechaza la acción hidrofílica de las enzimas. Por lo tanto la degradación de la lignina es determinante en el rendimiento de la hidrólisis enzimática, comparado con la hidrólisis de la hemicelulosa. [3] La actividad de las celulasas se ve afectada por la presencia en menor proporción de celobiosa y glucosa. Entre los métodos implementados para reducir la inhibición están: el aumento de la concentración de enzimas, la adición de β-glucosidasas en la hidrólisis y la remoción de glucosa por hidrólisis y fermentación simultánea (SSF). [3] En el proceso de producción de etanol lignocelulósico no solo se obtienen azúcares provenientes de la hidrólisis y solubilización de la celulosa y hemicelulosa, sino que, debido a las altas temperaturas y condiciones en las que se desarrollan estos procedimientos, se producen una serie de compuestos que pueden actuar como inhibidores potenciales de la fermentación. La naturaleza y concentración de estos compuestos depende del tipo de biomasa, del pre tratamiento utilizado, las condiciones de proceso y la utilización o no de catalizadores ácidos. [3] --- Fig. 5 --- Página | 15 Los compuestos inhibidores son producidos por la degradación de los monosacáridos obtenidos en la hidrólisis de la hemicelulosa y el fraccionamiento de la lignina durante el pre tratamiento, se pueden clasificar en tres grupos: derivados del furano, ácidos alifáticos de baja masa molecular y derivados fenólicos.[3] Los derivados del furano son producto de la degradación de la hemicelulosa y celulosa durante el pre tratamiento a altas temperaturas y tiempos de residencia prolongados. El furfural es formado por la degradación de las pentosas xilosa y arabinosa, mientras que el 5-hidroximetilfurfural (HMF) es obtenido por la degradación de las hexosas glucosa, manosa y galactosa. Dentro de los ácidos alifáticos que se pueden encontrar el ácido fórmico y levulínico, resultantes de la subsecuente degradación del furfural en HMF, respectivamente. Adicionalmente se puede encontrar ácido acético procedente de la hidrólisis de los grupos acetil presentes en la hemicelulosa. El fraccionamiento de lignina durante el pre tratamiento da lugar a la formación de los derivados fenólicos, tales como el ácido 4-hidroxibenzoico, un compuesto abundante en biomasas de alto contenido de lignina, el siringaldehído y el ácido siríngico, procedente de la degradación de la unidad siringilo, la vainillina y el ácido vainillínico originados por la degradación de las unidades guayacilo de la lignina. En la Figura 6 se esquematiza la formación de los compuestos que inhiben la fermentación de los azúcares fermentables. --- Fig. 6 --- Página | 16 Entre los efectos producidos por el furfural y el 5-HMF sobre los microorganismos de fermentación de los azúcares, se encuentran la reducción de la tasa de crecimiento de los microorganismos y la disminución de la productividad volumétrica de etanol. [3] 2.4. APLICACIÓN DE COMPUESTOS TENSIOACTIVOS El interés de los compuestos tensioactivos radica en su carácter anfifílico: es decir, en la presencia en una misma molécula de dos o más grupos con propiedades antagónicas respecto de un mismo disolvente. Todas las sustancias anfifílicas tienen una estructura molecular común que tiene dos partes: un grupo polar que contiene heteroátomos como O, S, P ó N que se encuentran en grupos alcohol, ácido, sulfato, sulfonato, fosfato, amina, amida, etc., y un grupo apolar o poco polar que es en general un grupo hidrocarbonado de tipo alquil o alquil benceno, y que puede contener eventualmente átomos de halógeno u oxígeno. En concreto, los compuestos tensioactivos o surfactantes sobre los cuales se ha desarrollado el estudio son 3, PEG, BSA y TWEEN-20 El polietilén-glicol (PEG) es un poliéter ampliamente empleado en la industria. Su nombre generalmente aparece asociado a un número que hace referencia a la masa molecular del polímero; por ejemplo, un PEG con n=80 poseerá una masa molecular media de unos 3500 Da, por lo que se llamará PEG 3500. Su estructura química puede representarse como HO-(CH2-CH2-O-)n-H. La albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), es una proteína extraída del suero bovino que es ampliamente usada en muchos procedimientos bioquímicos. El polisorbato 20 o Monooleato de Polioxietileno Sorbitan conocido comercialmente como Tween 20, es un surfactante polisorbato cuya estabilidad y relativa ausencia de toxicidad permiten que sea usado como detergente y emulsionante en numerosas aplicaciones domésticas, científicas y farmacológicas. Página | 17 3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. El procedimiento experimental llevado a cabo en el presente proyecto se muestra de manera esquematizada en la siguiente figura, explicándose de manera detallada cada uno de los pasos a continuación. BIOMASA PROCEDENTE DE LA PODA DEL OLIVAR PREPARACIÓN PREVIA DE LA MUESTRA PRETRATAMIENTO ÁCIDO PRETRATAMIENTO BÁSICO MUESTRAS DE 2,5 g MATERIA SECA/ 50 ml ADICIÓN DE SUSTRATO PEG/BSA/TW20 BAÑO TERMOSTÁTICO 50ºC/150rpm EXTRACCIÓN DE 0.75 ml CADA 24/48/72/174 h ANÁLISIS DE AZÚCARES REDUCTORES PREPARACIÓN PREVIA DE LA MUESTRA.- La biomasa empleada se obtiene de la poda de los olivares de la zona, y llega al laboratorio en forma de astillas y trozos de madera de diferentes tamaños. En primer lugar estos trozos de madera se introducen en el molino para triturarlos y conseguir un serrín fino pero con diferente gramaje. A continuación se debe tamizar el serrín obtenido para asegurarse de que la granulometría del mismo no supere los 0,5mm. --- Fig. 7 --- Página | 18 PRETRATAMIENTO ÁCIDO/BÁSICO.- Una vez obtenido el serrín adecuado se lleva a cabo el pre tratamiento ácido o básico según proceda. Para ello se introduce el serrín en un biorreactor con una disolución ácida o básica, (H2SO4 - 4,09% (w/w), 156ºC, 102 minutos / NaOH - 5% (w/w), 120ºC, 100min). Tras lavar los biorreactores para recuperar toda la materia sólida, se lleva a un vaso de precipitados grande para conseguir un pH de 4,8. A continuación se filtra a vacío para retirar la mayor parte de líquido posible y diferentes inhibidores y se analiza el grado de humedad resultante de la biomasa. Por último se envasa en sacos de plástico para su posterior análisis en el laboratorio. PREPARACÓN DE LAS MUESTRAS.- Los ensayos se llevan a cabo en frascos herméticos de 50ml cada uno. Se emplean 16 frascos en cada turno de análisis, correspondiendo 12 frascos a la adición de 0%/10%/20%/30% de sustrato en cada muestra respectivamente, y estando estos frascos por triplicado para tener certeza de los resultados en el posterior análisis. Los 4 frascos restantes hasta llegar a 16 corresponden a los controles de sustrato para cada uno de los porcentajes añadidos. En primer lugar se adiciona la biomasa, 2,5g de materia seca en cada frasco, y como la biomasa resultante del pre tratamiento ácido/básico contiene diferentes grados de humedad se deben hacer cálculos para añadir los 2,5g de materia seca. El volumen de biomasa húmeda ronda los 12,5ml, pero siempre dependiendo del grado de humedad. A continuación se añade el sustrato correspondiente PEG/BSA/TWEEN20, y la cantidad estimada para el 0%/10%/20%/30% según corresponda. Posteriormente, se hace la operación de restar a los 50ml de cada frasco la cantidad de 1ml de enzima, la cantidad correspondiente a la biomasa añadida, y la cantidad correspondiente al sustrato añadido, siempre en volumen, y este resultado, es la cantidad de tampón citrato que se debe añadir a cada frasco. Por último se adiciona 1ml de la mezcla de enzimas que se ha preparado previamente a todos los frascos excepto a los correspondientes al control sustrato. Una vez que todos los frascos estén bien cerrados se colocan en el baño termostático (50ºC/150r.p.m.) y se anota la hora, para posteriormente extraer muestras cada (24/48/72/174) h. EXTRACCIÓN DE EPPENDORFS®.- cuando se cumple el tiempo establecido se deben retirar 0,75ml de muestra de cada uno de los frascos, para ello se marcan pertinentemente cada uno de los eppendorfs® a emplear y se llenan con la cantidad indicada. A continuación se llevan a la centrifugadora (104 r.p.m./10’) y posteriormente se extrae de cada uno de ellos la cantidad establecida para cada tubo de ensayo, dependiendo de la dilución que se deba emplear dependiendo de la muestra con la que se esté trabajando. ANÁLISIS DE AZÚCARES REDUCTORES.- para llevar a cabo este análisis se precisa de tantos tubos de ensayo como muestras se quiera analizar y siete tubos mas para llevar a cabo la recta de Página | 19 calibración. Dependiendo de la muestra a analizar (24/48/72/174 h), se deberá realizar una dilución diferente, y para ello se colocarán entre 25 y 100 µl de muestra una vez centrifugados, se deberá añadir tampón citrato hasta llegar a la cantidad de 1000 µl y 3 ml de DNS. A continuación se agita cada tubo en el vortex y se introduce en el equipo de cocción durante 5’exactos. Tras extraer los tubos, se sumergen en un baño de agua helada y se añade 5 ml de agua destilada a cada tubo para posteriormente volver a agitar cada tubo de nuevo en el vortex. El último paso es analizar cada muestra en el espectrofotómetro, para ello se selecciona previamente la longitud de onda de 540nm y definiendo previamente el blanco, a continuación se va llenando la cubeta del análisis con cada una de la muestras, yendo siempre de disoluciones menores a mayores. Con los resultados obtenidos se obtienen las tablas y gráficas que posteriormente se muestran en la presente memoria. 3.1. MATERIAL UTILIZADO PRODUCTO/EQUIPO PRINCIPAL SUBPRODUCTO/COMPONENTES Biomasa Pre Tratada Biomasa proveniente de la poda del olivar Biorreactor Tamices --- Fig. 8 --- Página | 20 H2SO4 - 4,09% (w/w) NaOH - 5% (w/w) Molino Tampón Citrato Ácido Cítrico Citrato De Sodio Dns Ácido Dinitrosalicilico Tartrato De Sodio-Potásico Hidróxido De Sodio Azida Sustratos PEG (Polyetilenglicol 4000) Tween 20 (Polisorbato 20) BSA (Albúmina De Suero Bovino) Enzimas Celulasa Beta Xilasa Glucosa Contenedores de 1000g. de glucosa anhidra para laboratorio. P.M. 180,15. Riqueza > 98% Página | 21 Espectrofotómetro Baño Termostático Página | 22 Equipo De Cocción Material Diverso De Laboratorio EPPENDORFS®, Matraces, vasos de precipitados, tubos de ensayo, micro pipetas…. 4. RESULTADOS Los resultados expresados a continuación son fruto de largas semanas de trabajo en el laboratorio de bioquímica de la Escuela Agraria del Instituto Politécnico de Castelo Branco. En ellos se reflejan los datos obtenidos para cada ciclo de ensayos, habiéndose realizado un total de 6; 3 ensayos con pre tratamiento ácido y 3 con pre tratamiento básico. Cada uno de los ensayos dentro de cada pre tratamiento hace referencia a cada uno de los 3 surfactantes utilizados, PEG, BSA y TWEEN-20. Cada uno de los 6 ciclos de ensayos hace referencia a un total de 16 muestras analizadas, 12 muestras referentes a los 4 estados de adición de surfactante (0%, 10%, 20% y 30%), las cuales están por triplicado para asegurar la veracidad de los resultado, y las 4 muestras restantes que hacen referencia a los controles de sustrato para cada uno de los valores añadidos de surfactante. En las siguientes tablas se muestran dichos resultados de manera ordenada juntamente los 3 pre tratamientos ácidos por un lado y los 3 básicos por otro. En las filas de dichas tablas puede observarse el tipo y la cantidad de surfactante añadido, mientras que en las columnas podemos observar el tiempo de muestra, así como los valores de absorvancia obtenidos y su conversión a miligramos de azúcar de cada una de las muestras. En la tabla inferior tenemos recopilados los mg de azucares obtenidos de cada muestra y su conversión a tanto por ciento referida a la cantidad total máxima de azúcar presente en la muestra analizada. A continuación, estos datos están recopilados en una gráfica para hacer más fácil su comprensión e interpretación. En abscisas tenemos reflejado el tiempo del experimento, mientras que en ordenadas tenemos la tasa de conversión de azucares expresada en tanto por ciento. Página | 29 5. CONCLUSIONES Como puede observarse en las gráficas realizadas a partir de los resultados obtenidos en el laboratorio, son mucho mayores los valores para la biomasa con pre tratamiento ácido que con pre tratamiento básico. Esto nos indica que el efecto que se quiere conseguir sobre la biomasa al llevar a cabo los pre tratamientos, es mucho mayor en el ácido que en el básico, consiguiéndose por tanto una mayor rotura de las paredes celulares y permitiendo una posterior mejor actuación de las enzimas. Dentro del pre tratamiento ácido, los mejores resultados son conseguidos mediante la adición de un 30% de TWEEN20, alcanzándose algo más del 84% de conversión de azúcares sobre el total del azúcar que contenía la muestra de biomasa analizada. Dentro del análisis de la adición de este sustrato, los resultados descienden cuanto menor es la cantidad del mismo añadida. En la adición del sustrato BSA se da la situación de que los mayores valores de conversión de azúcares no se dan para la mayor adición de sustrato, sino para el 10% y 20% respectivamente, llegando a alcanzar con el primer valor de adición el 70% de conversión de azúcares y el 64% para el 20% de sustrato. Cuando llevamos a cabo los ensayos con PEG, el mayor valor alcanzado es el de 63% para una adición del 30% de sustrato en la muestra, descendiendo esta tasa de conversión a medida que desciende el sustrato añadido. Es de destacar, que como es lógico, los valores de conversión de azúcares son prácticamente iguales en las 3 muestras para una adición del 0% de sustrato, ya que si no añadimos ningún sustrato a la muestra, estas serán idénticas y por lo tanto los resultados que arrojarían tras el análisis deberían ser también exactos. Este valor en cada una de las 3 muestras esta cercano al 35%. En el caso del pre tratamiento básico los valores de conversión de azúcares permaneces prácticamente invariables a lo largo de todo el análisis, tanto para la adición de los diferentes sustratos, como para las diferentes cantidades añadidas de los mismos. Esto nos indica el poco efecto que surte el pre tratamiento básico sobre la biomasa empleada en el ensayo, no llegando a conseguirse un grado significativo de rotura de las paredes celulares como para que los valores arrojados difieran en gran medida. Página | 30 6. BIBLIOGRAFÍA 1. GARCÍA CAMÚS, Juan Manuel; GARCÍA LABORDA, José Ángel. Biocarburantes Líquidos: Biodiesel Y Bioetanol Informe De Vigilancia Tecnológica. 2006 2. ÁLVAREZ MACIEL, Carlos. Biocombustibles: desarrollo histórico-tecnológico, mercados actuales y comercio internacional. 3. MATEUS FONTECHA, Lady. Evaluación de los pre tratamientos con ácido sulfúrico diluido y AFEX en la biomasa lignocelulósica del tipo pasto gigante “Pennisetum Sp”.2011 4. CORTÍNEZ VILLALOBOS, VICTORIA ANDREA. Comparación De Pre tratamientos En Residuos Forestales Para La Producción De Bioetanol De Segunda Generación: Hidrólisis Ácida Y Líquidos Iónicos. 2010 5. DE MORAIS SOUTO, Betulia; QUIRINO, Betania. 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