Estudio del momento de inoculación de bacterias lácticas encapsuladas en biocomposites de alginato-sílice para desarrollar la fermentación maloláctica en vino tinto

Campus de Palencia ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERIAS AGRARIAS Grado en Enología ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso Tutor: José Manuel Rodríguez Nogales Cotutor: Encarnación Fernández Fernández Cotutor: Josefina Vila Crespo ÍNDICE 1 Resumen .............................................................................................................. 1 2 Antecedentes ....................................................................................................... 2 3 Objetivo ................................................................................................................ 6 4 Material y métodos .............................................................................................. 7 4.1 Inmovilización de las bacterias lácticas en cápsulas de alginato-sílice .............. 7 4.2 Protocolos de vinificación .................................................................................. 7 4.3 Seguimiento del desarrollo de la fermentación alcohólica y maloláctica ............ 9 4.3.1 Fermentación alcohólica .......................................................................... 9 4.3.2 Fermentación maloláctica ........................................................................ 9 4.4 Análisis microbiológico de las bacterias lácticas durante la vinificación ............. 9 4.5 Análisis químico del mosto y vino .................................................................... 10 4.6 Análisis sensorial de los vinos ......................................................................... 11 4.7 Tratamiento estadístico ................................................................................... 11 5 Resultados y discusión ..................................................................................... 12 5.1 Evolución de la fermentación alcohólica .......................................................... 12 5.2 Evolución de la fermentación maloláctica ........................................................ 14 5.3 Seguimiento microbiológico de las BAL .......................................................... 17 5.4 Efecto del tiempo de inoculación y tipo de inóculo en la composición fisico-química del vino ............................. 19 5.5 Efecto del tiempo de inoculación y tipo de inóculo en las características sensoriales del vino ............................. 23 6 Conclusiones ..................................................................................................... 25 7 Bibliografía ......................................................................................................... 26 ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 1 de 29 1 Resumen La fermentación maloláctica (FML) es una etapa importante en la elaboración del vino tinto. La vinificación en esta etapa se ha visto comprometida ya que las condiciones de vinificación son más exigentes debido, entre otros factores, al cambio climático. En este trabajo se han estudiado algunas técnicas para combatir esta problemática existente, como es la inmovilización de las bacterias lácticas (BAL) en geles de ALG-Si y la inoculación de las BAL en diferentes momentos (coinoculación e inoculación secuencial). En el régimen de coinoculación, levaduras y BAL se han sembrado e inoculado al inicio de la fermentación alcohólica (FA), y en la inoculación secuencial se han inoculado las levaduras una vez finalizada la FA. Paralelamente a la inoculación de BAL inmovilizadas, se ha realizado una inoculación con BAL libres y BAL inmovilizadas con lisozima en el medio, para estudiar y realizar una comparación de la técnica utilizada. Para elaborar este estudio se ha realizado un seguimiento de las cinéticas fermentativas alcohólica y maloláctica, un control microbiológico de las BAL y un análisis químico y sensorial del vino elaborado. Las BAL inmovilizadas realizaron satisfactoriamente la FML en ambos tiempos de inoculación, incluso en presencia de lisozima. Este sistema de inoculación no alteró ni las características sensoriales ni la composición físico-química de los vinos. Abstract Malolactic fermentation is an important stage in the production of red wine. Winemaking at this stage has been compromised due to winemaking conditions, such as climate change. In this study some techniques have been developed to combat the existing problem, such as the immobilization of lactic bacteria in ALG-Si gels. In addition, LAB have been inoculated at different times: coinoculation and sequential inoculation. The first of them, yeasts and LAB have been inoculated at the beginning of alcoholic fermentation (AF), and the second of them, yeasts have been inoculated once AF is finished. Parallel to the inoculation of immobilized LAB, an inoculation with free LAB and immobilized BAL with lysozyme in the medium has been carried out to study and make a comparison of the technique used. In order to carry out this study, the degradation of malic acid, fermentative kinetics, microbiological monitoring and chemical analysis of the wines produced have been monitored. The study was completed with a tasting to corroborate the conclusions obtained. The immobilized LAB have successfully performed MLF, and the use of lysozyme helps to control the fermentation of native LABs. This inoculation does not alter either the sensory characteristics or the physical-chemical composition of the wines. ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 2 de 29 2 Antecedentes La fermentación maloláctica (FML) es un proceso complicado, que generalmente sigue después de finalizar la fermentación alcohólica (FA) por las levaduras que se encuentran en el vino (Lerm, Engelbrecht and du Toit, 2010). La reacción de la FML se define como la conversión del ácido L-málico, ácido dicarboxílico, en ácido L-láctico, ácido monocarboxílico, con la producción de CO2. La reacción es catalizada por las bacterias lácticas (BAL), principalmente de los géneros Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc (Wibowo et al., 1985). La transformación es producida por la acción de tres posibles rutas enzimáticas que poseen las BAL, en especial la especie Oenococcus oeni (Bauer and Dicks, 2017). Estas rutas son: a) transformación directa del ácido málico en ácido láctico por la enzima maloláctica, b) oxidación del ácido málico en ácido oxalacético por la enzima malato deshidrogenasa y c) oxidación del ácido málico, con pérdida de CO2, en acido pirúvico y reducción por la enzima L-lactato deshidrogenasa (Lerm, Engelbrecht and du Toit, 2010). De estas, la principal que tiene lugar en el vino es la llevada a cabo por la enzima maloláctica. Como consecuencia de la FML, el vino sufre una serie de transformaciones que inciden en la calidad y estabilidad del vino, principalmente, un aumento del pH y una caída de la acidez total del vino, la formación de compuestos secundarios que aportan complejidad organoléptica al vino y el aumenta de su estabilidad microbiológica, entre otros (Hidalgo, 2011). La población de BAL antes del inicio de la FA suele oscilar entre 102 y 104 UFC/mL, cayendo a valores inferiores a 10 UFC/mL cuando las levaduras comienzan a producir etanol. Posteriormente la FML comienza al finalizar la FA, y las poblaciones de BAL superan las 106 UFC/mL. La duración es variable, pero si se desarrolla correctamente puede finalizar después de unos 15-20 días (Suárez and Morata, 2015). El progreso de la FML es difícil de controlar, ya que el vino puede ser un medio hostil para el crecimiento y metabolismo de las BAL. Su desarrollo va a depender principalmente de los parámetros fisicoquímicos del vino como son: pH (Bauer and Dicks, 2017), concentración en etanol (Davis et al., 1985), concentración de sulfuroso (Guzzo, Jobin and Diviès, 1998), temperatura (Henick-Kling, 1993) y presencia de inhibidores para las BAL, por ejemplo, ácidos grasos de cadena larga (Johnsson et al., 1995). En los últimos años, la problemática del cambio climático afecta aún más su desarrollo. En nuestras latitudes y zonas de producción el cambio climático está provocando una subida de las temperaturas, y con ello un aumento de los azúcares del mosto de uva (Mira, 2010). Esto provoca unos desequilibrios en el vino con una mayor graduación alcohólica (Vila-Crespo et al., 2010), una subida del pH, un déficit de nutrientes y un menor contenido en ácido málico. Todo ello provoca la dificultad de realizar la FML por parte de las BAL de manera espontánea (Reguant et al., 2010). Actualmente, se están implantado una serie de estrategias para mejorar el desarrollo de la FML. Una de ellas es la inducción de la FML con cultivos comerciales de BAL. Los cultivos iniciadores de la FML son preparados con una o varias cepas de O. oeni, principalmente, debido a su correcta adaptación a pH bajos y altas concentraciones de etanol (Wibowo et al., 1985). Se seleccionan en base a tres criterios (Torriani, Felis and Fracchetti, 2011): ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 3 de 29 • Criterios de primer orden: pH, etanol, temperatura… • Criterios de segundo orden: viabilidad, cinéticas de supervivencia y propagación… • Criterios de tercer orden: producción de características organolépticas deseadas y metabolitos indeseables, seguridad alimentaria... Sin embargo, la inoculación de cepas comerciales de O. oeni no es siempre efectiva, a pesar del esfuerzo realizado en la selección de las BAL basado en métodos moleculares y bioquímicos. Además, aunque la población de inóculo inicial es elevada (106-108 UFC/mL) esto no garantiza su implantación en el medio, por el cambio climático y por el desarrollo de nuevas prácticas agronómicas y enológicas que interfieren en el metabolismo habitual de las BAL (Lerm, Engelbrecht and du Toit, 2010). Existen otras posibilidades para mejorar la gestión de la FML como son la inoculación de levaduras capaces de degradar también el ácido málico, añadir la enzima maloláctica o bien emplear bacterias inmovilizadas, entre otras (Hidalgo, 2011). Otra de las estrategias que se sigue estudiando en la actualidad es la modificación genética de los genes de las BAL o de las levaduras capaces de degradar el ácido málico. En el año 2005, se consiguió la secuenciación completa del genoma de O. oeni. (Mills et al., 2005), información que está permitiendo adaptar su código genético a las características enológicas deseadas. Recientemente se ha descubierto el locus responsable de la tolerancia al etanol en O. oeni (Betteridge et al., 2018), resultados que abren nuevos caminos para mejorar su adaptación al vino. Aunque la investigación en este campo de la ingeniería genética está avanzando de manera notoria, muchas instituciones y los propios consumidores de vino, no aceptan aun el uso de organismos genéticamente modificados, por lo que se siguen buscando otras alternativas no moleculares. Una técnica con gran interés es la coinoculación de levaduras y BAL al inicio de la FA. Se ha observado que al añadir de forma simultánea las levaduras y las BAL se reducen los tiempos de las fermentaciones, además de reducir la acidez volátil en los vinos (Tristezza et al., 2016), sin cambiar su calidad sensorial (Homich et al., 2016). Es interesante ya que las bacterias pueden aclimatarse a la concentración de etanol que se vaya generando con la FA, incluso potenciando su desarrollo por el incremento de la temperatura en esta fase. La única desventaja de esta estrategia, según algunos autores, es el efecto inhibidor de las levaduras durante la FA sobre las BAL, por los metabolitos que producen (Alexandre et al., 2004). Para realizar esta técnica, hay que elegir adecuadamente las cepas de levaduras y bacterias que se van a utilizar para evitar incompatibilidades. Tal como se mencionó anteriormente, una de las alternativas a la inoculación de BAL libres es la inoculación de BAL inmovilizadas, como herramienta para mejorar la FML en condiciones difíciles. Se ha descrito que favorece el rendimiento en la degradación de ácido málico, que es más elevado que el de las BAL libres (Rossi, 1984). Además, al posibilitar añadir altas concentraciones del inóculo inmovilizado, se elimina o reduce la fase de latencia de las bacterias, con lo que conlleva a reducir la duración de FML y los riesgos de alteraciones microbianas (Hidalgo, 2011). También, otorga la posibilidad de reutilizar ese mismo inóculo en varios ciclos (Simó et al., 2019) y posibilita desarrollar un proceso de manera continua (Simó et al., 2018). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 4 de 29 La inmovilización de las BAL para su uso en bebidas alcohólicas se ha ido desarrollando a lo largo de la última década (Maicas, 2001; Kourkoutas, Manojlović and Nedović, 2010; Simó et al., 2019) y se define como “el confinamiento físico o la localización de células intactas en una cierta región del espacio con la preservación de alguna actividad catalítica deseada” (Karel, Libicki and Robertson, 1985; Kourkoutas et al., 2004). Existen una serie de técnicas de inmovilización celular aplicadas a la elaboración de bebidas alcohólicas entre las que se encuentran: a) inmovilización en la superficie de un soporte sólido por adsorción física de fuerzas electroestáticas o por la unión covalente entre la membrana celular y la del soporte; b) atrapamiento dentro de una matriz porosa; c) autoagregación por floculación (natural) o con agentes reticulantes (inducidos artificialmente) y d) contención celular con ayuda de membranas, lo que también se denomina biorreactores de membrana (Pilkington et al., 1998; Kourkoutas, Manojlović and Nedović, 2010). Las técnicas de inmovilización celular más utilizadas, para aplicarlas en la inmovilización de BAL, son el atrapamiento en geles e inmovilización en la superficie de un soporte sólido (Simó et al., 2017a). Como soporte sólido, generalmente, se utiliza matrices orgánicas con diferentes materiales: alginato cálcico, carragenato, quitosano, material celulósico deslignificado, virutas de madera, etc. El más popular para la inmovilización de células es el gel de alginato (ALG). Los geles de ALG se forman a partir del ácido algínico e iones multivalentes como el Ca2+ (Yabur, Bashan and Hernández-Carmona, 2007). El ácido algínico es un biopolímero que se encuentra en la pared celular de las algas marinas pardas (feofíceas). Los ALG son una familia de polisacáridos lineales de ácido β-D-manurónico (M) y de α-L-gulurónico (G). Su composición y secuencian varían dependiendo de la fuente de la cual proviene el polisacárido. La extensión y la composición de las secuencias y el peso molecular determinan las propiedades físicas de los ALG (Lupo et al., 2012). Se agrupan constituyendo bloques tipo G (-GGG-), bloques M (-MMM-) o se alternan M y G (-MGG-). Tanto la distribución de los monómeros en la cadena polimérica como la carga y volumen confieren al gel formado características de flexibilidad o rigidez, dependiendo del contenido de G. Esos bloques en presencia de los cationes multivalentes como el Ca2+ (Coradin et al., 2001), provocan un entrecruzamiento molecular con una estructura similar a la forma de una “caja de huevos” (Figura 1). Las principales ventajas del gel de ALG como soporte para la encapsulación celular son las siguientes: es fácil de preparar, es económico y las condiciones de inmovilización para las bacterias son suaves. También presenta una serie de inconvenientes o desventajas como son problemas de resistencia mecánica y de estabilidad química que dificultan su aplicación en enología (Melvik and Dornish, 2004; Rodriguez-Nogales, 2017). Se han diseñados biocápsulas de ALG con O. oeni (Guzzon et al., 2012), pero debido a los inconvenientes que presenta el biopolímero se están buscado soluciones para mejorar esta estrategia. ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 5 de 29 Figura 1: Estructura en forma de “caja de huevo” del gel de alginato ( Reddy, 2010) Una de las alternativas para mejorar las características de estos compuestos son el diseño de polímeros mixtos de alginato y sílice (ALG-Si) (Coradin, Nassif and Livage, 2003; Callone et al., 2008; Simó et al., 2017b). Mediante precursores de sílice se pueden formar redes poliméricas entrecruzadas de ALG-Si. La sílice, el cual es un compuesto inorgánico, confiere a la matriz de alginato dureza y estabilidad química y térmica. El entrecruzamiento que tiene lugar en este gel inorgánico es de naturaleza covalente, y confiere más estabilidad que las interacciones electroestáticas o puentes de hidrogeno que se dan en el gel de alginato (Callone et al., 2008). Existen dos vías, ligadas al proceso sol-gel, que permite la formación de geles inorgánicos en presencia de precursores de sílice: la ruta con alcóxidos y la ruta acuosa (Livage, 1998). La ruta con alcóxidos es la ruta tradicional para la síntesis de geles inorgánicos, pero durante este proceso se pueden producir sustancias tóxicas para las BAL. Además, la síntesis del gel tiene lugar a valores de pH extremos para las BAL y en presencia de solventes tóxicos. Los alcóxidos de silicio [Si (OR)4] contienen un grupo orgánico (R: CH3, C2H5, etc.), que en contacto con agua sufre una hidrólisis, liberándose una molécula de alcohol (ROH) y creándose el grupo silanol (SiOH). Posteriormente, se produce una policondensación entre los grupos silanoles. Esto provoca que con el tiempo se produzca una serie de partículas coloidales que se unen unas con otras formando al final una estructura de gel (Coradin, Nassif and Livage, 2003; G. Simó et al., 2017b). La ruta acuosa está basada en la mezcla de derivados de sílice (silicato de sodio y sílice coloidal) con ALG antes de la gelificación en presencia de Ca2+ (Coradin et al., 2001; Trivedi, Bassi and Zhu, 2006). Los reactivos son más baratos y menos nocivos para las BAL, por eso se está estudiando a fondo esta ruta en la inmovilización de BAL para el desarrollo de la FML. Desde el grupo de investigación ENOBIOTEC se ha pretendido a lo largo de los últimos años, estudiar el uso de geles de ALG-Si para la encapsulación de BAL con el objetivo de mejorar el desarrollo de la FML en un vino tinto. Simó et al. (2017a) optimizaron las condiciones de la microencapsulación de O. oeni en una matriz basada en redes poliméricas entrecruzadas de ALG-Si, atendiendo a los criterios de mejorar la resistencia mecánica del gel y su capacidad para retener las células bacterianas, e intensificar la actividad catalítica de las BAL. Para ello se utilizó ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 6 de 29 un proceso de coacervación basándose en la mezcla de los derivados de sílice con ALG antes de la gelificación en presencia de Ca2+. Como derivados de sílice se estudiaron diferentes concentraciones de silicato de sodio y silicato coloidal, a distintos pH de inmovilización. La adición de estos derivados mejoró la resistencia mecánica del soporte de inmovilización y la capacidad de degradación del ácido málico por las BAL. Además, la matriz mixta presentó alta capacidad para retener las BAL. Otra alternativa que se evaluó para mejorar la estabilidad química de la matriz de inmovilización fue recubrir las biocápsulas de alginato con un alcóxido de sílice que contiene un grupo amino cargado positivamente (3-aminopropiltrietoxisilano, APTES). Los grupos aminos del alcóxido pueden interaccionar electroestáticamente con los grupos carboxílicos de las moléculas de alginato superficiales para formar una capa externa de sílice (Simó et al., 2017b). Sin embargo, el recubrimiento de las biocápsulas de alginato con APTES no mejoró la resistencia mecánica del soporte ni la actividad maloláctica de las BAL encapsuladas. Posteriormente, la capacidad fermentativa de O. oeni encapsulada en biocomposites basados en redes poliméricas entrecruzadas de ALG-Si se valoró bajo distintas condiciones desfavorables para el desarrollo de la FML. Las BAL encapsuladas mostraron un mejor comportamiento fermentativo que las células libres bajo extremas condiciones de fermentación, como son alto grado alcohólico (13-16%), bajo pH (3,03,3) y baja temperatura de fermentación (13-15ºC) (Simó et al., 2017b). Además, se analizó la estabilidad química y operacional de estos biocomposites en vinos con distintas condiciones de pH y grado alcohólico (Simó et al., 2019). Como conclusión a este estudio se obtuvo que la inclusión de derivados de sílice a las cápsulas de ALG incrementó su estabilidad química en vinos con pH bajos y con grados alcohólicos elevados. También las bacterias encapsuladas fueron capaces de realizar varios ciclos de FML en condiciones de pH bajos y grados alcohólicos altos que son altamente desfavorables para estas bacterias en estado libre. Recientemente, se comparó el desarrollo de la FML con BAL libres e inmovilizadas en geles de ALG, con y sin derivados de sílice, y antes de la FA (coinoculación) y al final de la FA (inoculación secuencial). El estudio se realizó a nivel laboratorio con mosto tinto estéril, variando su pH y su contenido en azúcares (Simó et al., 2018). Los resultados mostraron que la inoculación simultánea y secuencial con BAL encapsuladas en alginato-sílice redujo sensiblemente el tiempo para completar la FML bajo condiciones adversas de vinificación (mostos con una composición rica en azúcares y con un pH bajo). Además, no se observó una modificación en las cinéticas de la FA ni en la composición básica del vino. 3 Objetivo El objetivo de este estudio es comparar el efecto del tiempo de inoculación (coinoculación e inoculación secuencial) y del tipo de inóculo (BAL libres e inmovilizadas en cápsulas de alginato-sílice) sobre las cinéticas fermentativas, y la composición físicoquímica y sensorial del vino tinto. También se valoró el efecto de la adición de lisozima en los ensayos con BAL inmovilizadas. ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 7 de 29 4 Material y métodos 4.1 INMOVILIZACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS EN CÁPSULAS DE ALGINATO-SÍLICE Las BAL se inmovilizaron en un soporte mixto de ALG-Si. El procedimiento seguido para esta inmovilización se basa en un proceso de coacervación del ALG con los derivados de sílice antes de la gelificación en presencia de Ca2+ (Coradin, Nassif and Livage, 2003). Se siguió el método propuesto por Trivedi et al. (2006) con modificaciones sugeridas por Simó et al. (2017b, 2018). Se estudiaron dos tiempos de inoculación de las BAL (coinoculación e inoculación secuencia), por lo que se realizaron dos lotes de cápsulas de ALG-Si con BAL. En cada lote se elaboraron 167 mL de gel, que corresponden a unos 178 g. Para cada lote, se mezclaron 27,72 mL de silicato coloidal (Ludox HS40, Sigma-Aldrich, España) y 20,79 mL de silicato de sodio 0,4M y 85,09 mL de agua. Se ajustó la mezcla a un pH 6,3 con HCl concentrado. Posteriormente, se añadieron 3,34 g de ALG de sodio y 1,67 g de BAL liofilizada O. oeni (LALVIN VP41 MBR, Lallemand, Francia) previamente rehidratadas en 33,4 mL de agua, siempre en agitación. Esta mezcla se hizo gotear por gravedad a través de varias jeringuillas estériles de 10 mL sobre 4 L de Ca2Cl 0,2 M estéril a una altura de 20 cm. Se dejó en agitación a 260 rpm durante 2 h. Una vez concluido el proceso de gelificación se lavaron las perlas con agua estéril. Todo el proceso se realizó en condiciones estériles, con material y reactivos esterilizados con autoclave. La concentración teórica de BAL fue de 0,0094 g/g de gel, que corresponde con una población de BAL de 1011 UFC/g de gel. 4.2 PROTOCOLOS DE VINIFICACIÓN Para en este estudio, se empleó uva congelada de la variedad Tempranillo de la vendimia 2018, procedente de la finca Zamadueñas del Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León (Valladolid, España). Tras los procesos de descongelación, despalillado y estrujado se obtuvieron un total de 138,4 kg de pasta-mosto, a la que se añadió 4 g/HL de SO2 en forma de metabisulfito potásico y 20 g/HL de activador de BAL (Acti-ML, Lallemand, España). Se obtuvo un mosto con 25,8 ºBrix y un pH de 3,52. Una vez homogeneizado se separó la pasta-mosto de manera equitativa en 12 depósitos de acero inoxidable. A cada depósito se le añadieron 6,4 kg de pasta y 5,6 L de mosto. Se realizaron un total de 6 vinificaciones por duplicado. Las estrategias de FML estudiadas fueron diversas en función del tipo de inóculo y el tiempo de inoculación. En cuanto el tipo de inóculo, consideramos BAL libres, BAL inmovilizadas y BAL inmovilizadas más lisozima. Mientras que se emplearon dos tiempos de inoculación (inoculación secuencial y coinoculación). La numeración de los depósitos estuvo ligada a las diferentes denominaciones de las vinificaciones, que se realizaron según el siguiente esquema: • Inoculación secuencial: o Depósitos 1A y 1B: con BAL libres o Depósitos 2A y 2B: con BAL inmovilizadas ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 14 de 29 5.2 EVOLUCIÓN DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA El final de la FML, según varios autores, se da por completado cuando hay una concentración de ácido málico inferior a 0,5 g/L de acuerdo con Hidalgo (2011) o a 0,10 g/L según Henick-Kling and Park (1994). En este estudio se decidió concluir la FML a una concentración de ácido málico entre 0,1-0,2 g/L. La Figura 3 muestra las cinéticas de la FML, donde se representa la concentración de ácido málico desde la siembra de las levaduras (representada en el tiempo 0) hasta el final de la degradación del ácido málico. La inoculación de las BAL tuvo lugar 2 días (vinos coinoculados) o 14 días (vinos con inoculación secuencial) después de la inoculación de las levaduras. Paralelamente, se realizó un recuento de las BAL durante el tiempo de fermentación (Figura 4). Finalizada la FML de los vinos coinoculados con BAL libres, se esperaron unos días para comprobar si las BAL eran capaces de degradar por completo el ácido málico. Los cuatro depósitos con el inóculo de BAL libres (inoculación secuencial y coinoculación), se trasegaron y sulfitaron el mismo día. Para los vinos coinoculados con BAL libres, la degradación de ácido málico se completó a los 24 días desde la siembra de levaduras, y a los 16 días desde la siembra del inóculo de BAL para los vinos con inoculación secuencial. Para el resto de los vinos, se dio por finalizada la degradación y el fin de la FML a los 40 días desde la inoculación de las levaduras. Evaluando las cinéticas de degradación del ácido málico de la Figura 3 se observa que la duración de la FML con las BAL libres es superior en régimen de coinoculación que, en inoculación secuencial, siendo los valores de 22 días (desde día 2 al día 24) y de 16 días (desde el día 14 hasta el día 30), respectivamente. En los vinos coinoculados, las cinéticas de degradación del ácido málico se producen de manera similar para todos los tipos de inóculos, aunque fue más rápida la degradación del ácido málico con el uso de las BAL libres. También se puede asegurar que los inóculos con BAL inmovilizadas con y sin lisozima realizaron y completaron la degradación del ácido málico, aunque de manera más retardada. En la inoculación secuencial, la degradación del ácido málico durante las 2 primeras semanas es análoga para los tres tipos de inóculos, pero cuando la concentración de ácido málico empieza a ser menor a 1 g/L, su degradación se ve ralentizada en las pruebas con BAL inmovilizadas con y sin lisozima. Las diferencias observadas en las cinéticas de degradación del ácido málico entre las BAL libres e inmovilizadas pueden deberse a problemas de transferencia de nutrientes hacia las células microbianas. Por un lado, las BAL libres están dispersas en todo el medio (mosto-vino) con un acceso sencillo a los nutrientes, mientras que las BAL inmovilizadas se encuentran encapsuladas en un gel de ALG-Si, que debido a su estructura porosa puede reducir la transferencia de los nutrientes y metabolitos del medio hacia las BAL (Kourkoutas, Manojlović and Nedović, 2010). Por otro lado, las BAL inmovilizadas se encontraban contenidas en dos mallas de nylon localizadas a dos alturas del depósito que también pueden dificultan la transferencia de los nutrientes hacia las células. Si durante la ejecución del experimento no se mantiene un movimiento constante y dinámico del vino, la región del depósito donde se localiza las BAL ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 15 de 29 inmovilizadas no ha estado en contacto con parte del mosto-vino y no se ha podido degradar adecuadamente el ácido málico. Es posible que por estas cuestiones las BAL libres hayan finalizado la FML antes, degradando rápidamente el ácido málico, a pesar de realizar una homogeneización diaria de los depósitos que facilitaría la difusión de nutrientes al interior de las cápsulas de ALG-Si. Una posible estrategia para reducir los problemas de transferencia de materia entre las bacterias inmovilizadas y el vino, y por consecuencia incrementar la velocidad de degradación del ácido málico, es el uso de sistemas de fermentación en continuo relativamente fáciles de diseñar con células inmovilizadas (Kourkoutas, Manojlović and Nedović, 2010). Por otro lado, las cinéticas de degradación del ácido málico inoculando BAL inmovilizadas con y sin lisozima son similares para ambos tiempos de inoculación (coinoculación e inoculación secuencial). La lisozima es una enzima que se puede emplear en enología con el objetivo de evitar la alteración del mosto o del vino por las BAL autóctonas alterantes. Sin embargo, su actividad no es selectiva y puede también afectar al inóculo de BAL añadidas al vino, pudiendo inhibir el desarrollo de la FML. Por ello, es necesario un tratamiento específico con un clarificante para eliminar la lisozima del vino antes de proceder a la inoculación del cultivo de BAL seleccionado (Liburdi, Benucci and Esti, 2014). Nuestros resultados ponen de manifiesto que la inmovilización de las BAL en un gel de ALG-Si protege a O. oeni del efecto antibacteriano de la lisozima. La porosidad del soporte de inmovilización ha permitido el intercambio de nutrientes y metabolitos entre las BAL y el vino, pero ha impedido el contacto entre la lisozima añadida al vino y las BAL del interior del gel. Por lo tanto, la inmovilización de las BAL en este gel permite el desarrollo de la FML en presencia de lisozima, inhibiendo a las BAL alterantes presentes en el vino que podrían ser responsables de la acumulación de compuestos tóxicos o no deseados en el vino. Además, sería posible el diseño de un protocolo de vinificación con lisozima sin la necesidad de un tratamiento con un clarificante previo a la inoculación de la cepa de BAL seleccionada. En este estudio no se puede asegurar que la coinoculación reduzca el tiempo de la vinificación, tal y como concluyen algunos autores como Jussier et al., (2006), Zapparoli et al., (2009), o Servetas et al., (2013), si bien es cierto que estos autores parten de otras condiciones de vinificación. En cualquier caso, todas las pruebas con BAL inmovilizadas han finalizado satisfactoriamente la FML. Además, el empleo de BAL inmovilizadas permitiría su simple reutilización durante varios ciclos seguidos (Simó et al., 2019) y posibilita el inicio o la parada de la FML en un instante determinado sin que ello suponga un aspecto negativo en la calidad del vino (Kourkoutas, Manojlović and Nedović, 2010). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 16 de 29 Figura 3: Evolución de la concentración de ácido málico durante la fermentación de los mostos-vinos en las distintas vinificaciones (COINO: coinoculación; SEC: secuencial). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 17 de 29 5.3 SEGUIMIENTO MICROBIOLÓGICO DE LAS BAL La Figura 4 muestra el recuento de las BAL a lo largo de la vinificación de los distintos vinos. Tal y como se comentó en el anterior apartado, la coinoculación de las BAL libres e inmovilizadas se realizó el segundo día después de la inoculación de las levaduras empleando una población de BAL de  3,4·106 UFC/mL En el régimen de inoculación secuencial, se inoculó la misma población de BAL libres e inmovilizadas a los 14 días de inocular las levaduras. Independientemente del tiempo de inoculación (inoculación secuencial o coinoculación), el recuento de BAL libres desde el principio de su inoculación se encontró por encima del umbral de población de 106 UFC/mL necesario para realizar la FML (Peynaud, 2004). En los ensayos de coinoculación e inoculación con BAL inmovilizadas, se observa un incremento de la población de BAL hasta valores de 6,8·104 UFC/mL y 6,7·103 UFC/mL al final de la FML, respectivamente, poblaciones insuficientes para poder realizar la FML. Con esto se puede deducir que las BAL que han realizado la FML, tanto en régimen de coinoculación como de inoculación secuencial, han sido las BAL inmovilizadas en las capsulas de ALG-Si. La presencia de BAL en el mosto-vino en aquellas pruebas con BAL inmovilizadas, se debe probablemente al desarrollo de las BAL autóctonas, aunque tampoco podemos descartar una fuga de BAL de la matriz de inmovilización. Previamente, Simó et al. (2017a) demostraron que el soporte de inmovilización de ALG-Si presentaba una alta capacidad para retener las BAL en su interior, observándose una tasa de liberación de tan sólo un 0,001%. En los ensayos de coinoculación, la lisozima añadida en el mosto-vino junto con las BAL inmovilizadas inhibe ligeramente la población de BAL con respecto a la población observada en la vinificación con BAL inmovilizadas sin lisozima. Su efecto fue más efectivo en el régimen de inoculación secuencial, inhibiendo su desarrollo hasta prácticamente el final de la FML. Esta enzima inhibe el crecimiento de las bacterias Gram+ y por lo tanto a las BAL (Guzzon et al., 2012), rompiendo sus paredes celulares, y es utilizada para estabilizar los vinos después de la FML, bloquear la FML o retrasar el inicio de la FML, dependiendo de la dosis empleada. Además, es usado para reducir la dosis de sulfuroso empleada (Lisanti et al., 2019). Probablemente, la baja eficacia de la enzima lisozima para la inhibición de las BAL en los ensayos de coinoculación sea debido a una disminución de su estabilidad durante el desarrollo de la FA. Paralelamente al recuento de las BAL, se tomaron al azar distintas colonias de las placas de cultivo con MLO para realizar una prueba de Tinción de Gram. Con esta prueba nos aseguramos de diferenciar sí las colonias presentes en las placas eran BAL (Gram +) o bien se trataban de bacterias acéticas (Gram -). En la Figura 5, a modo de ejemplo, se ilustra una fotografía (x100) de una muestra obtenida con un microscopio óptico donde se observan cocos encadenados de color azul violáceo, lo que demuestra que no son bacterias acéticas y si BAL (OIV, 2016). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 18 de 29 Figura 4: Evolución de la población de BAL durante la fermentación de los mostos-vinos en las distintas vinificaciones (COINO: coinoculación; SEC: secuencial). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 19 de 29 Figura 5: Fotografía obtenida por microscopía óptica (x 100) de las BAL. 5.4 EFECTO DEL TIEMPO DE INOCULACIÓN Y TIPO DE INÓCULO EN LA COMPOSICIÓN FISICO-QUÍMICA DEL VINO En la Tabla 1 se muestra el análisis físico-químico de los vinos después de haber sido embotellados. El análisis de varianza muestra únicamente diferencias estadísticamente significativas para la acidez volátil y el IPT en función del tiempo de inoculación. En el caso del tipo de inóculo, además de estos dos parámetros, se observaron diferencias estadísticamente significativas para los parámetros de color (% rojo, % amarillo y % azul), y para el contenido en ácido málico, antocianos y taninos. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para el pH y la acidez total de los vinos con inoculación secuencial y con coinoculación, ni tampoco en función del tipo de inóculo. Por el contrario, para el pH el efecto del tipo de inóculo es diferente en función del tiempo de inoculación. Sin embargo, la diferencia de pH observada fue tan sólo de 0,1 unidades, valor irrelevante a nivel tecnológico. Para la acidez volátil (AV), sí que se encuentran diferencias estadísticamente significativas para ambos factores. En primer lugar, para el factor tiempo de inoculación, se observó un valor de AV algo inferior en los vinos con inoculación secuencial (0,42 g/L) respecto a los coinoculados (0,48 g/L). Con respecto al tipo de inóculo, las muestras con BAL libres presentaron una menor AV (0,38 g/L) que aquellas con BAL inmovilizadas o inmovilizadas con lisozima (0,49 g/L). Por último, el efecto del tiempo de inoculación es distinto en función del tipo de inóculo, donde la mayor diferencia se encuentra en los vinos coinoculados entre las BAL libres e inmovilizadas. Todos los valores de AV están por debajo del límite máximo de 1,2 g/L (expresado en ácido acético), que permite la legislación española (Reglamento CE No 606/2009, 10 de julio de 2009). Existen estudios contradictores sobre el efecto que tiene el tiempo de inoculación (coinoculación frente a inoculación secuencia) sobre la AV. Algunos autores han concluido que la AV no se incrementa con un régimen de coinoculación (Antalick, Perello and De Revel, 2013; Taniasuri, Lee and Liu, 2016; Tristezza et al., ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 20 de 29 2016; Simó et al., 2018), mientras otros observaron un aumento (Cañas et al., 2012; Guzzon et al., 2013). En el presente estudio, si se observó un ligero incremento de la AV en los vinos coinoculados, que puede correlacionarse con el pequeño incremento de la duración de la FML, lo que conllevaría a una mayor producción de metabolitos secundarios, como el ácido acético, por parte de O. oeni al tratarse de una BAL con metabolismo heterofermentativo. (Ribereau-Gayon, 2003). Del mismo modo ocurre entre las BAL libres y las otras dos formas de inóculo (BAL inmovilizadas y BAL inmovilizadas con lisozima), donde el retraso en la finalización de la FML puede ser el causante de esta subida de la acidez volátil. En cualquier caso, las diferencias son muy limitadas, lo que genera poca importancia a nivel tecnológico. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para el grado alcohólico (GA) de los vinos, ni en función del tiempo de inoculación ni del tipo de inóculo. Estos resultados están en consonancia con los encontrados previamente por Simó et al., (2018), en un estudio a nivel laboratorio con mosto de uva estéril. En cuanto al contenido en ácido málico, se observaron diferencias estadísticamente significativas para el tipo de inóculo. Los vinos inoculados con BAL libres presentaron el menor valor medio (0,048 g/L), siendo algo superior para los vinos con BAL inmovilizadas (0,080-0,135 g/L). En el análisis del Índice de Polifenoles Totales (IPT), hay una diferencia estadísticamente significativa en todos los factores. Los vinos con coinoculación presentaron un valor medio ligeramente mayor en comparación con los vinos con inoculación secuencial, observándose una diferencia de tan sólo 1 unidad de IPT. Para el tipo de inóculo, hay una diferencia algo mayor, ya que los vinos con BAL libres tuvieron 5 unidades de IPT más que los restantes vinos. Esto podría deberse a que las cápsulas de ALG-Si absorban compuestos polifenólicos en su estructura porosa. Esto coincide con lo descrito por Massalha et al. (2007), que manifiestan que los geles con alginato tienen capacidad para absorber compuestos polifenólicos. Para la intensidad colorante (IC) no se observaron diferencias estadísticamente significativas en función de ninguno de los dos factores. En el caso de la tonalidad, no hay diferencia estadísticamente significativa ni para el tipo de inóculo ni para el tiempo de inoculación, pero sí para la interacción entre ambos factores, y podemos decir que el efecto del tipo de inóculo es diferente en función del tiempo de inoculación. Para los % de amarillo, rojo y azul no existieron diferencias estadísticamente significativas en función del tiempo de inoculación, lo mismo que ocurre para la concentración de antocianos y taninos. Sin embargo, para estos parámetros sí que se observaron diferencias estadísticamente significativas en función del tipo de inóculo. Las principales diferencias para estos parámetros se observan entre las bacterias libres y las bacterias encapsuladas con lisozima. Los vinos inoculados con BAL libres presentaron altos % de rojo y azul y bajo % de amarillo. Sin embargo, los vinos con lisozima presentan menores % de rojo y azul y mayor % de amarillo. Aunque el aumento del porcentaje de amarillo y la disminución de azules y rojos indican una mayor evolución (Zamora, 2013) de los vinos con lisozima, las diferencias observadas entre los vinos no son importantes. ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 21 de 29 Los vinos inoculados con BAL libres presentaron un alto contenido en antocianos y taninos, que no se correlacionaron con una mayor intensidad de color, pero si con un mayor IPT y % rojo. Las menores concentraciones de antocianos y taninos observadas en los vinos elaborados con BAL inmovilizadas podrían deberse a la capacidad de los geles de ALG de adsorben compuestos polifenólicos, tal y cómo se ha comentado anteriormente. Por otro lado, a pesar de que se ha descrito que la enzima lisozima tiene la capacidad para unirse a taninos y a otros compuestos fenólicos, provocando una disminución del color del vino tinto (Liburdi, Benucci and Esti, 2014), este efecto no se ha observado en nuestros vinos. Finalmente, el tiempo de inóculo no ha generado diferencias significativas ni en los parámetros del color ni en el contenido polifenólico, tal y como demuestran otros estudios (Abrahamse and Bartowsky, 2012; Versari et al., 2016). ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 22 de 29 Tabla 1. Composición química final de los vinos inoculados con BAL libres, BAL inmovilizadas y BAL inmovilizadas con lisozima, usando inoculación secuencial y coinoculación1. Tiempo de inoculación Tipo de inóculo pH AT (g/L) AV (g/L) GA (%) IPT IC Tn Amarillo (%) Rojo (%) Azul (%) Ant (mg/L) Tan (g/L) Am (g/L) Secuencial Libres 3,85bc 4,7a 0,39a 14,75a 50d 9,9a 0,74a 37,1a 50,3b 12,6b 686,4b 1,8ab 0,041a Inmovilizadas 3,87c 4,8a 0,44a 14,69a 45b 9,9a 0,77ab 38,1ab 49,5ab 12,5b 632,8a 1,6ab 0,080ab Inmovilizadas + Lisozima 3,79a 4,8a 0,44ab 14,67a 44ab 9,7a 0,75a 37,5a 50,1b 12,4ab 622,6a 1,4ab 0,0141c Coinoculación Libres 3,81ab 4,7a 0,37a 14,73a 48c 10,0a 0,75a 37,5a 50,2b 12,3ab 677,0b 2,3b 0,050a Inmovilizadas 3,84abc 4,7a 0,55c 14,64a 42a 10,4a 0,73a 36,8a 50,6b 12,7b 608,1a 2,0ab 0,080ab Inmovilizadas + Lisozima 3,87c 4,8a 0,53bc 14,59a 44ab 10,5a 0,98b 43,4b 45,2a 11,4a 614,5a 1,2a 0,125bc Tiempo de inoculación Secuencial 3,84a 4,8a 0,42a 14,70a 46b 9,8a 0,75a 37,6a 50,0a 12,5a 647,3a 1,8a 0,090a Coinoculación 3,84a 4,8a 0,48b 14,65a 45a 10,3a 0,82a 39,2a 48,7a 12,1a 633,2a 1,6a 0,085a Tipo de inoculo Libres 3,83a 4,7a 0,38a 14,80a 49b 10,0a 0,75a 37,3a 50,3b 12,4ab 681,7b 2,0b 0,048a Inmovilizadas 3,85a 4,8a 0,49b 14,71a 44a 10,2a 0,75a 37,4ab 50,0ab 12,6b 620,5a 1,8ab 0,080ab Inmovilizadas + Lisozima 3,83a 4,8a 0,49b 14,68a 44a 10,1a 0,86a 40,4b 47,7a 11,9a 618,5a 1,3a 0,135b Análisis factorial Tiempo de inoculación (T) n.s. n.s. * * n.s. * * * n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. Tipo de inoculo (I) n.s. n.s. * * * n.s. * * * n.s. n.s. * * * * * * * * * T*I * * * n.s. * n.s. * * n.s. * * * n.s. n.s. n.s. 0,135 1Los valores representan las medias para dos factores (n=8 para el tipo de inóculo; n=12 para el tiempo de inoculación). Las letras en las medias indican una diferencia estadísticamente significativa para cada factor individual con un 95,0 % de nivel de confianza. Para el análisis factorial, la significancia estadística para cada factor y su interacción se muestra como: * = p<0,05; * * = p<0,01; * * * = p<0,001; n.s.= no significativas. AT: acidez total; AV: acidez volátil; GA: grado alcohólico; IPT: índice de polifenoles totales; IC: intensidad colorante; Tn: tonalidad; Ant: antocianos; Tan: taninos; Am; ácido málico. ESTUDIO DEL MOMENTO DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS ENCAPSULADAS EN BIOCOMPOSITES DE ALGINATO-SÍLICE PARA DESARROLLAR LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN VINO TINTO Alumno: Álvaro Damián Cortejoso UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) – E.T.S. DE INGENIERÍAS AGRARIAS Titulación de: Grado de enología Página 23 de 29 5.5 EFECTO DEL TIEMPO DE INOCULACIÓN Y TIPO DE INÓCULO EN LAS CARACTERÍSTICAS SENSORIALES DEL VINO El resultado del análisis sensorial realizado por el grupo de catadores se muestra en la Tabla 2. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para ningún descriptor estudiado, exceptuando el ácido láctico (fase olfativa), que si presentó una diferencia significativa en función del tipo de inóculo. Para este descriptor, los catadores dieron una puntación ligeramente superior a los vinos elaborados con BAL libres (6,1) respecto a los inoculados con BAL inmovilizadas (5,3-5,4). Este resultado esta correlacionado con lo descrito anteriormente, donde se observó una degradación más completa del ácido málico en los vinos inoculados con BAL libres, lo que conlleva una mayor concentración de ácido láctico. Como se comentó en el anterior apartado, para los parámetros físico-químicos pH, acidez total, tonalidad e intensidad de color no se encontraron diferencias estadísticamente significativas ni en función del tiempo de inoculación ni del tipo de inóculo. Estos resultados están en consonancia con lo observado en el análisis sensorial para los descriptores ácido (fase gustativa) y tonalidad e intensidad de capa (fase visual), respectivamente. Finalmente, los catadores no encontraron diferencias estadísticamente significativas para el atributo acético (fase olfativa) ni en función del tiempo de inoculación ni del tipo de inóculo. Probablemente este resultado sea debido a que las diferencias observadas en la acidez volátil de los vinos fueron muy pequeñas. De este modo, estos resultados ponen de manifiesto que la aplicación de BAL inmovilizadas, con o sin lisozima, bien en régimen de coinoculación o inoculación secuencial, no modificó las características sensoriales de los vinos, a excepción del descriptor láctico.