Caracterización del perfil de expresión de canales iónicos en un modelo de diabetes

FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Química CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE EXPRESIÓN DE CANALES IÓNICOS EN UN MODELO DE DIABETES Autora: Lucía Benito Salamanca Tutoras: Pilar Cidad Velasco, Lucía Citores González Año 2023 Agradecimientos Quisiera agradecer a Teresa Pérez y José Ramón López la oportunidad de haber podido formar parte de su grupo de investigación “Canales iónicos y Fisiopatología vascular”. Por supuesto, dar las gracias a mi tutora Pilar Cidad, por su cercanía, su paciencia y por todo lo que me ha enseñado durante estos meses. Agradecer también a todo el Laboratorio C2 del IBGM: Esperanza Alonso, Sara Moreno, Jorge Rojo, Diego A. Peraza, Irina Rebollo y Nuria Daghbouche por su ayuda y por todo lo que he aprendido con ellos durante este tiempo. Me gustaría dar las gracias también a Lucía Citores, por acceder a ser mi tutora dentro de la Facultad de Ciencias y el trabajo y dedicación que esto conlleva. Por último, dar las gracias a mis padres y a mi hermana, por su apoyo incondicional, gracias al cual he llegado hasta aquí y soy quien soy; y a Luis, por estar siempre ahí. Índice Resumen ...................................................................................................................... 7 Abstract........................................................................................................................ 8 Abreviaturas ................................................................................................................. 9 Introducción ............................................................................................................... 13 1. Sistema cardiovascular ..................................................................................................... 13 1.1. Los vasos sanguíneos ................................................................................................. 13 1.2. Células de músculo liso vascular ............................................................................... 14 1.3. Modulación fenotípica de las células de músculo liso vascular ................................ 15 2. Diabetes ............................................................................................................................ 16 3. Aterosclerosis ................................................................................................................... 17 4. Macrófagos ....................................................................................................................... 19 5. Canales iónicos ................................................................................................................. 20 5.1. Canales Kv1.3 ............................................................................................................. 21 5.2. Otros canales ............................................................................................................. 23 5.2.1. Canales de potasio Kv1.5 .................................................................................... 23 5.2.2. Canales de potasio de rectificación interna, Kir2.1 ............................................. 23 5.2.3. Canales catiónicos inespecíficos activados por ATP, P2X ................................... 25 Objetivos .................................................................................................................... 27 Material y métodos .................................................................................................... 29 1. Modelos animales ............................................................................................................ 29 1.1. Modelo de ratón diabético ........................................................................................ 29 2. Obtención de muestras experimentales .......................................................................... 31 2.1. Tejidos ........................................................................................................................ 31 2.2. Macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) .................................................. 32 3. Tratamiento farmacológico .............................................................................................. 33 3.1. LPS .............................................................................................................................. 33 4. Cuantificación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa................................... 34 4.1. Extracción de RNA ..................................................................................................... 34 4.1.1. Preparación de las muestras .............................................................................. 34 4.1.2. Aislamiento de RNA ............................................................................................ 35 4.1.3. Lavado de RNA.................................................................................................... 35 4.2. Síntesis de cDNA ........................................................................................................ 36 4.3. PCR cuantitativa (qPCR) ............................................................................................. 37 4.3.1. qPCR con ensayo TaqMan .................................................................................. 38 4.3.2. qPCR con SYBR Green ......................................................................................... 40 5. Método de cuantificación relativo y análisis estadístico .................................................. 42 5.1. Análisis estadístico ..................................................................................................... 43 Resultados.................................................................................................................. 45 1. Obtención de un modelo de ratón con diabetes ............................................................. 45 2. La expresión de marcadores metabólicos en macrófagos ............................................... 47 3. La expresión de canales iónicos en macrófagos ............................................................... 50 3.1. Receptores purinérgicos, P2X .................................................................................... 50 3.2. Canales de potasio dependientes de voltaje ............................................................. 53 4. Expresión del Kv1.3 en diferentes tejidos de modelo de murino diabético .................... 55 4.1. Estudio de la expresión de Kv1.3 y Kv1.5 en aortas ................................................... 56 Discusión .................................................................................................................... 59 Conclusiones .............................................................................................................. 61 Bibliografía ................................................................................................................. 63 Anexo I ....................................................................................................................... 69 Resumen Las enfermedades cardiovasculares se encuentran entre las principales causas de mortalidad en el mundo, donde la diabetes tipo 2 (T2DM) se encuentra entre uno de los motivos de dicha tendencia al alza. Con el aumento de la prevalencia de la diabetes en todo el mundo, las complicaciones vasculares de la diabetes también van en aumento, dando como resultado un riesgo mayor de desarrollo de complicaciones macrovasculares, siendo la enfermedad cardiovascular aterosclerótica la principal causa de muerte en adultos con diabetes. La diabetes está relacionada con un ambiente que propicia la activación de los macrófagos hacia un fenotipo metabólico que puede formar parte de las complicaciones vasculares en diabetes. En este trabajo se pretende realizar un estudio de la expresión de RNA de diferentes canales iónicos y marcadores de fenotipo en macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) así como el estudio de la expresión de RNA del canal de potasio Kv1.3 en diferentes tejidos sensibles a insulina. Para ello, se utilizan técnicas moleculares como la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para estudiar los niveles de expresión en muestras de ratones macho y hembras alimentados con una dieta estándar (SD) y con una dieta alta en grasa (HFD) que simula el metabolismo de una persona diabética. A la luz de los resultados puede concluirse que no existen cambios reseñables en la expresión de RNA entre ratones SD y HFD pero sí entre machos y hembras, hecho destacado de cara al planteamiento de posibles tratamientos contra la T2DM en función del sexo del paciente. Palabras clave: Diabetes tipo 2, macrófagos, aorta, Kv1.3. Abstract Cardiovascular diseases are among the leading causes of mortality in the world, where type 2 diabetes (T2DM) is among one of the reasons for this upward trend. With the increasing prevalence of diabetes worldwide, vascular complications of diabetes are also increasing, resulting in an increased risk of developing macrovascular complications, with atherosclerotic cardiovascular disease being the leading cause of death in adults with diabetes. Diabetes is related to an environment that leads to the activation of macrophages towards a metabolic phenotype that can be part of the vascular complications in diabetes. This project aims to carry out a study of the RNA expression of different ion channels and proinflammatory phenotypic markers in bone marrow-derived macrophages (BMDM) as well as the study of the RNA expression of the potassium channel Kv1.3 in different insulin-sensitive tissues. For this purpose, molecular techniques such as qPCR are used to study the expression levels in samples of male and female mice fed with a standard diet (SD) and a high-fat diet (HFD) that simulates the metabolism of a diabetic person. In view of the results, it can be concluded that there are no notable changes in RNA expression between SD and HFD mice, but there are changes between males and females, a remarkable and very important fact for the development of possible treatments against T2DM based on the sex of the patient. Abreviaturas BMDM: Macrófagos derivados de médula ósea (Bone Marrow Derived Macrophages) BPH: Presión arterial elevada (Blood Pressure High) BPN: Presión arterial normal (Blood Pressure Normal) cDNA: DNA complementario Ct: Cycle Threshold DNA: Ácido desoxirribonucleico (DeoxyriboNucleic Acid) ECV: Enfermedad cardiovascular T2DM: Diabetes Mellitus Tipo 2 FBS: Suero Fetal Bovino (Fetal Bovine Serum) HFD: Dieta alta en grasa (High Fat Diet) ipGTT: Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal ipITT: Prueba de tolerancia a la insulina intraperitoneal Kir: Canal de potasio de rectificación interna (Inward Rectifier Potassium Channel) Kv: Canal de potasio dependiente de voltaje (Voltage Gated Potassium Channel) LDL: Lipoproteína de baja densidad (Low-Density Lipoprotein) LPS: Lipopolisacárido NOS2: Óxido nítrico sintasa 2 (Nitric Oxide Synthase 2) NTC: No Template control PA: Presión arterial PCR: Reacción en cadena de polimerasa PM: Modulación fenotípica (Phenotypic Modulation) qPCR: PCR cuantitativa o en tiempo real 16 2. Diabetes La diabetes mellitus se define como una enfermedad endocrino-metabólica caracterizada por hiperglucemia crónica y alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas. Puede deberse a una deficiencia en la secreción de insulina, resistencia a la acción de esta, o una combinación de ambas. En condiciones normales circula en la sangre cierta cantidad de glucosa. La insulina, hormona que produce el páncreas, controla la concentración de glucosa en la sangre al regular su producción y almacenamiento. [7] En la diabetes se elimina la capacidad del cuerpo para reaccionar a la insulina, o bien el páncreas deja de producirla. Esto conduce a hiperglucemia, que puede ocasionar complicaciones metabólicas graves. [7] Los dos tipos principales de diabetes son la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM), cuando el páncreas no es capaz de producir insulina debido a una reacción inmunológica; y la diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), cuando el paciente produce insulina de manera insuficiente o los mecanismos de respuesta están alterados. La insulina es una hormona secretada por las células del páncreas, cuya función se basa en el transporte de la glucosa que entra en el organismo a las células para poder ser convertida en energía a través del proceso de glucólisis. En personas que padecen diabetes, el organismo es capaz de descomponer los hidratos de carbono de los alimentos ingeridos y convertirlos en glucosa; sin embargo, cuando esta llega al torrente sanguíneo, no hay insulina o la cantidad es insuficiente para poder trasladar la glucosa a las células y convertirla en energía. Como consecuencia, la glucosa se acumula en la sangre. Cuando la secreción de insulina ya no puede compensar la resistencia a insulina, se produce la T2DM. [8] Los pacientes con resistencia a la insulina o T2DM muestran una mayor probabilidad de presentar hipertensión (presión sanguínea alta) o valores elevados en el perfil de lípidos (colesterol y triglicéridos). Dicha resistencia a insulina es el componente central del llamado síndrome metabólico. [9] El síndrome metabólico es un conjunto de alteraciones metabólicas consideradas como un factor de riesgo para desarrollar enfermedad cardiovascular y diabetes tipo 2. [10] Entre dichas alteraciones se incluyen el aumento de la presión arterial, niveles altos de azúcar en sangre, exceso de grasa corporal y niveles anormales de colesterol o triglicéridos. Con el aumento de la prevalencia de la diabetes en todo el mundo, las complicaciones vasculares de la diabetes también van en aumento. La diabetes da como resultado un mayor 17 riesgo de complicaciones macrovasculares, siendo la enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ECV) la principal causa de muerte en adultos con diabetes. [11] Los mecanismos exactos por los que la diabetes promueve el riesgo de ECV nos son claros, aunque hay evidencias del papel de las VSMCs, los macrófagos y otras células en dicho proceso. Además, la diabetes deja una huella, llamada memoria metabólica, en este tipo de células, lo que favorece esta mayor susceptibilidad a sufrir enfermedades cardiovasculares. 3. Aterosclerosis La aterosclerosis es una enfermedad vascular que se caracteriza por el engrosamiento de la capa íntima y media con pérdida de la elasticidad. Afecta a las arterias de mediano y gran calibre de diferentes lechos vasculares y su lesión básica es la placa de ateroma compuesta fundamentalmente de lípidos, tejido fibroso y células inflamatorias. Se produce un desequilibrio en el metabolismo lipídico y la inadecuada respuesta del sistema inmune a la acumulación de lipoproteínas en las arterias. [12] La aterosclerosis tiende a asentarse en las arterias que irrigan al corazón, el cerebro y las extremidades inferiores. [13] Sus principales factores de riesgo son la edad, la genética, la obesidad, la dieta poco saludable, la hiperlipidemia (exceso de grasa en sangre), la hipertensión y el consumo elevado de alcohol. La exposición a dichos factores de riesgo tiene un efecto acumulativo a lo largo de la vida. [14] En el proceso de aterosclerosis pueden diferenciarse tres etapas: inicio, progresión y rotura de la placa (Figura 3). Inicio Las células endoteliales (EC) de las áreas vasculares se encuentran expuestas a fuerzas de cizallamiento, sobre todo en zonas de flujo turbulento, los cuales promueven la lesión endotelial y desencadenan la formación de placas focales que modulan su estructura y función. Su disfunción se debe a la producción de radicales libres (ROS), capaces de activar las vías de inflamación en las ECs, aumentando su permeabilidad y conduciendo a su apoptosis.[15] El aumento de la permeabilidad endotelial facilita el paso de la lipoproteína de baja densidad (LDL) circulante al espacio subendotelial, produciendo LDL oxidasas (oxLDL) que dañan el 18 endotelio. En condiciones normales, los macrófagos regulan el metabolismo de las lipoproteínas controlando el contenido de LDL y colesterol. Sin embargo, esta regulación se altera en la aterosclerosis, ya que se permite la acumulación de colesterol y se reduce la expresión de los transportadores de colesterol fuera de la célula. [15] Por lo tanto, en esta etapa temprana de la aterosclerosis, la placa constará de varias placas de macrófagos cargados de lípidos. [16] Progresión Una vez establecidas, las placas ateroscleróticas progresan por la acumulación continua de lípidos y células llenas de lípidos. [14] Durante la evolución de la placa aterosclerótica, las células de músculo liso vascular (VSMCs) residentes y reclutadas producen moléculas de matriz extracelular (colágeno, elastina intersticial o proteoglucanos) que contribuyen al engrosamiento de la íntima, pero también atrapa a los macrófagos y a la oxLDL. Además, los macrófagos activados muestran una mayor producción de enzimas de la familia de las metaloproteínas de la matriz (MMP) que degradan el colágeno intersticial, además de inducir la proliferación y la migración de las células de músculo liso. [14], [16] Las VSMCs y los macrófagos en la lesión en evolución pueden dividirse, así como sufrir muerte celular. Los desechos de las células muertas se acumulan, formando el núcleo necrótico rico en lípidos del ateroma. La eferocitosis (eliminación de células muertas) por parte de los macrófagos, se vuelve defectuosa, contribuyendo a la inflamación. [14] Rotura de la placa La rotura de la placa se define como un área de ruptura de la cubierta fibrosa. La tapa propensa a la ruptura suele ser delgada, infiltrada por macrófagos y linfocitos y con un contenido limitado de VSMCs. La proporción en la que se encuentren los diferentes tipos celulares que conforman la placa de ateroma determinan su estabilidad. De modo que una placa que presenta abundancia en macrófagos y linfocitos será una placa vulnerable; mientras que una placa rica en VSMCs productoras de matriz extracelular será una placa estable. [16] Además, existen otros factores que cobran importancia en la ruptura de la placa de ateroma como puede ser el flujo turbulento, el aumento de la apoptosis o el crecimiento del núcleo necrótico. 19 4. Macrófagos Los macrófagos son células inmunitarias mieloides que se ubican estratégicamente en todos los tejidos del cuerpo, donde ingieren y degradan células muertas, desechos y materiales extraños y organizan procesos inflamatorios. Los macrófagos se clasificaron como parte del sistema fagocítico mononuclear (MPS) junto con monocitos y células dendríticas (DC). [17] En los mamíferos adultos se encuentran en todos los tejidos, donde presentan una gran diversidad anatómica y funcional. En los tejidos, están organizados en patrones definidos con cada célula ocupando su propio territorio. [18] Los macrófagos tienen muchas funciones en la configuración de la arquitectura de diversos tejidos. Después del desarrollo del organismo, los macrófagos modulan la homeostasis y la fisiología normal mediante la regulación de diversas actividades y la detección de daños. Sin embargo, estas funciones tróficas y reguladoras pueden verse alteradas y los macrófagos pueden contribuir a ciertas enfermedades. [18] Cuando los tejidos se dañan después de una infección o lesión, se reclutan monocitos inflamatorios de la circulación y se diferencian en macrófagos a medida que migran a los tejidos afectados. Estos macrófagos reclutados secretan una variedad de mediadores inflamatorios (TNF-α, NO…) que activan los mecanismos de defensa antimicrobianos que contribuyen a la muerte de los organismos invasores. [18] Aunque estos macrófagos inflamatorios son inicialmente beneficiosos porque facilitan la eliminación de los organismos invasores, también pueden desencadenar un daño tisular. De hecho, si la respuesta inflamatoria de los macrófagos no se controla rápidamente, puede volverse patógena y contribuir a la progresión de la enfermedad. Para contrarrestar el potencial de daño tisular de la respuesta inflamatoria, los macrófagos sufren apoptosis o Figura 3. Esquema resumen del proceso de aterosclerosis. 20 cambian a un fenotipo antiinflamatorio o supresor que amortigua la respuesta proinflamatoria al tiempo que facilita la cicatrización de las heridas. [18] Los macrófagos juegan un papel crucial en la respuesta inflamatoria, actuando como células presentadoras de antígenos. Los mecanismos de proliferación, activación y resolución de las células inmunes se deben, principalmente, a las respuestas de estas células a señales. Estas señales incluyen cambios en el flujo de iones a través de la membrana. Como cualquier tipo celular, los macrófagos expresan canales iónicos y transportadores que regulan el potencial de membrana (Vm). [19], [20] Los canales de potasio dependientes de voltaje son uno de los reguladores más importantes durante la maduración, activación y diferenciación de los macrófagos. Se han relacionado con la fagocitosis, migración, proliferación, apoptosis y la producción de citoquinas. [19] El equilibrio entre las corrientes determina el potencial de reposo de los macrófagos y tiene un papel importante en su activación y proliferación. [21] 5. Canales iónicos Los canales iónicos son proteínas integrales de membrana formadoras de poros que median la entrada/salida pasiva de iones de señalización esenciales hacia/desde la célula o los orgánulos intracelulares, controlando así la concentración de iones intra y extracelulares, el potencial de membrana y el volumen celular. Los canales iónicos contribuyen a prácticamente todos los procesos celulares básicos y están involucrados en procesos fisiológicos básicos del potencial de acción como la contracción muscular, la propagación y la secreción. [22] En términos básicos, los canales iónicos son una colección de dominios de proteínas que juntos crean un poro que permite el paso de iones a través de una membrana celular en respuesta a estímulos químicos, cambios de temperatura o fuerzas mecánicas (Figura 4). 21 Para cumplir la función de filtrar selectivamente los iones a través de la membrana biológica, la mayoría de los canales iónicos poseen una región de bucle denominada filtro de iones o de selectividad que se encarga de regular qué iones tienen permitido el paso a través del poro.[23] Existe una sorprendente variedad molecular de canales iónicos. Se clasifican por selectividad iónica (canales de sodio, canales de potasio, canales de cloruro, canales de calcio, canales de protones…), mecanismo de activación (activado por voltaje, activado por ligando, activado por luz…) o localización (membrana plasmática o intracelular). [22] En este trabajo nuestra atención se centrará en el estudio de los canales iónicos dependientes de voltaje debido a su importancia en muchos aspectos de la transducción de señales y la regulación celular; en concreto en el canal de potasio dependiente de voltaje Kv1.3 debido a la importancia que tiene su estudio en el grupo de investigación. Sin embargo, también estudiaremos el canal de potasio dependiente de voltaje Kv1.5, canales de potasio de rectificación interna como el Kir2.1, así como canales catiónicos inespecíficos activados por ATP. 5.1. Canales Kv1.3 El canal Kv1.3 es un canal de potasio dependiente de voltaje descrito en células del sistema nervioso, inmune y en VSMCs. Este tipo de canales son tetrámeros de subunidades formadoras de poro, cada uno con seis hélices transmembrana (S1-S6) conectadas a través de bucles intra y extracelulares. Los dominios NH2y -COOH terminales son regiones intracelulares de longitud variable que pueden unirse a otras proteínas y participar en cascadas de señalización. [24] Figura 4. Representación de los componentes estructurales básicos de un canal iónico. 22 Figura 5. Estructura de la subunidad Kv1.3 humana. La secuencia del segmento S4 con los residuos cargados en rojo, un sitio de N-glicosilación y la secuencia de la región del poro con el filtro de selectividad de K resaltado. [24] Las hélices transmembrana de cada subunidad Kv-α contienen dos dominios funcional y estructuralmente independientes: el poro selectivo, formado por las hélices S5 y S6 unidas por un dominio peptídico o lazo P, y el dominio del sensor de voltaje, formado por las hélices transmembrana S1-S4 (Figura 5). El poro tiene un dominio de cinco aminoácidos que forman la parte más estrecha del canal, denominada filtro de selectividad, que está muy conservada en los canales de potasio (TVGYG) y determina la selectividad al potasio del canal. La despolarización de la membrana induce un cambio conformacional en S4 provocando la apertura del poro. [24] Además, las subunidades α Kv1.3 son capaces de formar canales heterotetraméricos con las subunidades α de Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4 y Kv1.5, lo que permite formar un canal con diferentes propiedades cinéticas y funcionales. Las moléculas que inhiben el canal Kv1.3 se dividen en dos categorías estructurales: péptidos derivados del veneno de escorpiones u otros animales (margatoxina, kaliotoxina o caribdotoxina) y moléculas orgánicas pequeñas tales como 4-aminopiridina (4-AP), 5-(4fenoxibutoxi)-psoraleno (PAP-1) o tetraetilamonio (TEA). [24] Los canales de potasio están implicados en la proliferación de células puesto que contribuyen al potencial de membrana. Los primeros estudios relacionaron los canales de potasio con la proliferación celular de linfocitos T. En estas células existen canales Kv1.3 y canales de potasio activados por Ca2+ cuya activación conlleva la hiperpolarización de la membrana. También está descrito el papel del canal Kv1.3 en la proliferación de linfocitos B células natural killer (NK), oligodendrocitos, células de la microglía, macrófagos y VSMCs. [24] 23 Además, en las células de músculo liso vascular el canal Kv1.3 está implicado en la modulación fenotípica (PM), pasando de un estado contráctil o diferenciado a uno migratorio y proliferativo o desdiferenciado en respuesta a distintos factores. El canal Kv1.3 tiene la capacidad de responder a los cambios de voltaje de las membranas de las VSMCs, por lo que juega un papel importante en dicha PM. [24], [25] 5.2. Otros canales 5.2.1. Canales de potasio Kv1.5 El canal Kv1.5 se expresa fundamentalmente en la aurícula, así como en los vasos sanguíneos, músculo esquelético y células del sistema inmune. Participa en el mantenimiento del tono del músculo liso vascular, la liberación de insulina, la regulación del volumen celular y la proliferación. [26] Los canales Kv1.5 son sensibles al bloqueo por 4-AP, bloqueando el estado abierto del canal a través de la apertura interna del poro iónico. [27] Los macrófagos generan corrientes dependientes de voltaje que son corrientes iónicas de K+ generadas por heterotetrámeros Kv1.3/Kv1.5.[24] La estequiometría de estos heterotetrámeros varía en función del estado de polarización de los macrófagos y, por tanto, sus propiedades biofísicas cambian. Los heterotetrámeros Kv1.3/Kv1.5 se localizan en lipid rafts o balsas lipídicas de la membrana plasmática y representan una diferente expresión en función de la composición de los heterotetrámeros y, fundamentalmente, debido al nivel de canales Kv1.5. [19], [20], [28] 5.2.2. Canales de potasio de rectificación interna, Kir2.1 La rectificación es un cambio en la conductancia iónica debido al voltaje. Los canales de potasio de rectificación interna, Kir, son una clase importante de canales de potasio que regulan la excitabilidad de la membrana, la frecuencia cardíaca, el tono vascular, la liberación de insulina y el flujo de sal a través del epitelio. Estos canales se expresan en diferentes tipos celulares del cerebro, el endotelio o en células de músculo liso. En general, en la mayoría de los tejidos contribuyen a mantener el potencial de membrana. [29]–[31] 24 Los canales Kir se agrupan dentro de siete familias denominadas Kir1-7, que permiten la salida de K+ y se pueden distinguir por su fuerza de rectificación y sus respuestas a señales celulares. La rectificación interna hace referencia a la capacidad del canal iónico para permitir una mayor entrada de iones que salida. En el caso de los canales Kir, la rectificación hacia el interior es causada por iones citoplasmáticos como poliaminas y Mg2+ que obstruyen la vía de conducción en la despolarización y, por lo tanto, impiden el flujo de K+ hacia el exterior. [31] Los canales Kir presentan un poro iónico más largo que los canales Kv y está compuesto por el dominio transmembrana y el dominio intracelular (Figura 6). [32] Figura 6. Dibujo esquemático de una subunidad del canal Kir. Cada subunidad comprende dos hélices transmembrana (M1 y M2), un bucle de poro (P) y un dominio citoplasmático formado por los extremos amino (N) y carboxilo (C). [31] El canal Kir2.1 genera una corriente de rectificación interna denominada IK1. Este canal forma homotetrámeros, pero, además, con los canales Kir2.2 y Kir2.3 puede formar heterotetrámeros con diferentes propiedades. [33] En VSMCs, los canales Kir clásicos pueden contribuir a la vasodilatación en respuesta a una alta concentración de potasio extracelular. Dicho aumento, despolariza las VSMCs y contrae los vasos sanguíneos. Sin embargo, un aumento leve en la concentración de K+ extracelular hiperpolariza la membrana y dilata arterias, como las arterias coronarias o cerebrales. Se ha visto que en VSMCs Kir2.1 es la subunidad principal encargada de formar las corrientes Kir clásicas.[34] En macrófagos, los canales Kir2.1 los son responsables de regular el potencial de membrana, junto con los heterotetrámeros Kv1.3/Kv1.5. Además, los estímulos que conducen a los macrófagos a su activación inflamatoria, como la presencia de lipopolisacárido (LPS) en el medio, reducen la corriente generada por los canales Kir2.1. [20], [30] 25 5.2.3. Canales catiónicos inespecíficos activados por ATP, P2X Los receptores purinérgicos, comúnmente conocidos como purinoceptores, son una familia de proteínas de membrana plasmática implicadas en diversas funciones celulares como la reactividad vascular, la apoptosis y la secreción de citoquinas. Estos receptores, según su mecanismo de activación, se clasifican en dos clases: P1 y P2. EL tipo de receptor P1 es activado por la molécula de adenosina (ADO), mientras que la clase de receptor P2 es activada por moléculas de adenosina difosfato (ADP) o adenosina trifosfato (ATP) y consta de dos familias, P2Y y P2X. [35] Los receptores P2X son canales catiónicos no selectivos controlados por ATP. Son una familia distinta de canales iónicos controlados por ligando activados por ATP extracelular. Se cree que son de naturaleza oligomérica y se expresan en muchas células excitables y no excitables, donde median una variedad de acciones fisiológicas, incluida la contractilidad de músculo liso o la modulación de la transmisión sináptica. [36] Hay siete subunidades P2X diferentes (P2X1P2X7), cada una de las cuales se ensambla como trímeros y tiene dos dominios transmembrana insertados en la membrana plasmática, de modo que tanto los extremos amino como carboxilo están ubicados intracelularmente (Figura 7). [37] El sitio de unión de ATP de los receptores P2X parece estar ubicado cerca de los dominios transmembrana. El segundo dominio transmembrana de las subunidades P2X forma el poro del canal, que es permeable a diferentes cationes. Todos los receptores P2X son canales selectivos a cationes con una permeabilidad casi igual a Na+ y K+, y una permeabilidad significativa a Ca2+. [37] Figura 7. Esquema de los receptores P2X. A) Representa una subunidad monomérica del receptor P2X en la membrana plasmática. B) Representación de un receptor trimérico funcional P2X. Hay tres sitios de unión de ATP ubicados en el dominio extracelular entre subunidades. [38] A B 32 Tabla 1. Composición (mM) de la disolución Tyrode 1X. 2.2. Macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) Para obtener los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM, Bone Marrow Derived Macrophages), se separaron el fémur y la tibia del animal sacrificado, y se extrajo la cabeza del hueso a la altura de la rodilla. Los huesos se introdujeron en tubos de 0.5 mL con un pequeño orificio en el fondo, los cuales contenían 100 μL de medio RPMI con 10% de FBS (Suero Fetal Bovino), con la parte cortada hacia abajo. Luego, se introdujeron los tubos de 0.5 mL en tubos de 1.5 mL para recolectar la médula ósea por medio de una centrifugación a 3000 g durante 3 minutos. Con dicha centrifugación, se formó un sedimento en el fondo del tubo de 1.5 mL correspondiente a los glóbulos rojos y los huesos se volvieron blancos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento de células obtenido se resuspendió y se sembró en placas de cultivo en medio RMPI con FBS al 10 % acondicionado con sobrenadante de la línea Figura 11. Esquema resumen de los tejidos extraídos del ratón sacrificado. COMPONENTE CONENTRACIÓN/mM NaCl 140 KCl 5 CaCl2·2H2O 2 MgCl2·6H2O 1.1 Glucosa 5 Hepes (C8H18N2O4S) 10 33 celular L-929 al 10%. La línea celular L-929 secreta el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que es capaz de inducir la diferenciación a macrófagos. Las células se mantuvieron a una temperatura de 37 C en una atmósfera de elevada humedad y con 5% de CO2. Después de cinco días, se observó como las células comenzaron a adherirse a la placa, indicando que los precursores de la médula ósea empezaron a diferenciarse en el linaje de macrófagos. El medio se cambió en los días 5 y 7. Además, el día 8 se reemplazó el medio de cultivo por uno sin sobrenadante L-929. El día 9, se aplicó a los ya diferenciados BMDM el tratamiento deseado, en este caso, LPS y se dejaron incubar. Al cabo de unos días, se recogió el sobrenadante y a las placas se les añadió 500 μL de TRIzol®. Ambas muestras se guardaron en un congelador a -20 C, en el caso de las que contenían TRIzol®, para su posterior extracción de RNA. La cronología del protocolo se detalla en la Figura 12. Figura 12. Esquema resumen de la obtención de BMDM. 3. Tratamiento farmacológico 3.1. LPS El lipopolisacárido (LPS) es un componente principal de la membrana externa de la mayoría de las bacterias Gram-negativas. Los LPS consisten en una porción de oligosacáridos o polisacáridos, el núcleo y el resto de antígeno O, anclados a la membrana externa de la bacteria por un resto hidrofóbico llamado lípido-A (Figura 13). [40] El lípido-A se conserva estructuralmente entre las diferentes clases de bacterias y está formada por dos unidades de 2-amino-2-desoxi-D-glucosa (GlcN) unidas por un enlace glucosídico β- (1→6) y fosforiladas en las posiciones 1 y 4’. El núcleo varía en la composición de 34 monosacáridos y, dentro de un género o familia, su estructura tiende a conservarse. La parte más externa del LPS, la cadena de polisacárido o antígeno O, se encuentra en la interfaz entre la bacteria y su entorno y es donde se encuentra la mayor heterogeneidad estructural. La enorme diversidad estructural de los antígenos O radica en la composición de los monosacáridos, la posición del enlace glucosídico, el tamaño de la unidad repetitiva y la longitud de la cadena. [40] Figura 13. Estructura general del lipopolisacárido (LPS). [40] 4. Cuantificación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa El estudio de la expresión génica del RNA se realizó a través de PCR cuantitativa (qPCR). El protocolo estaba formado por varios pasos consecutivos entre los que se incluían el aislamiento del RNA, la reacción de retrotranscripción o transcripción inversa para sintetizar el DNA complementario (cDNA) y la PCR cuantitativa para cuantificar la expresión. 4.1. Extracción de RNA Para la extracción de RNA se siguió, en todos los casos, el protocolo de extracción de RNA con el reactivo TRIzol®. Dicho protocolo se basa en el aislamiento del RNA mediante un proceso de separación/extracción líquido-líquido empleando fenol-cloroformo e isocianato de guanidina. 4.1.1. Preparación de las muestras Para las BMDM cultivadas, se retiró el medio y se añadieron 500 μL de TRIzol® a 4 C. En el caso de los tejidos se requiere de una homogenización física, la cual se lleva a cabo colocando las muestras en un tubo eppendorf, que contiene bolas de sílice, junto con 500 μL de TRIzol® utilizando un homogeneizador. En el caso de muestras con alto contenido en grasa, proteínas, polisacáridos o material extracelular, tras la homogenización física se requiere de 35 una centrifugación a 12000 x g durante 10 minutos a 4 C para que la muestra quede totalmente homogenizada. Fase de separación Las muestras homogeneizadas se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con el fin de conseguir la completa disociación de complejos nucleoproteícos. Posteriormente, se añadieron 0.2 mL de cloroformo por cada mililitro de TRIzol®. Se agitó vigorosamente con la mano durante 15 segundos aproximadamente, se incubó a temperatura ambiente durante 23 minutos y, por último se centrifugó durante 15 minutos a 12000 x g y a 4 C. La primera incubación de 5 minutos con TRIzol® permite que el isocianato de la solución fenolisocianato conserve la integridad del RNA a la vez que rompe las células y disuelve sus componentes. La posterior adición de cloroformo consigue separar la solución en fase orgánica y acuosa, donde la fase orgánica (inferior) contiene las proteínas y la acuosa (superior) el RNA deseado. Además, se forma fase intermedia donde se encuentra el DNA. Tras la centrifugación, la fase acuosa se pasó a un nuevo tubo y se procedió al aislamiento de RNA. 4.1.2. Aislamiento de RNA A la fase acuosa de cada muestra se le añadió 0.5 mL de isopropanol al 100% por cada mililitro de TRIzol® utilizado en la homogeneización. Se dejó incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, las muestras se centrifugaron a 12000 x g y 4 C durante 10 minutos. El RNA no es soluble en isopropanol por lo que, al añadirlo y centrifugar, el RNA se deposita en el fondo del eppendorf. Tras la centrifugación, cuando el contenido de RNA en la muestra es elevado, es visible un pequeño pellet en el fondo del tubo. 4.1.3. Lavado de RNA El sobrenadante que se formó tras la última centrifugación se retiró, con cuidado, por inversión y se añadió en torno a 1 mL de etanol al 75% por cada mililitro de TRIzol® utilizado. Se centrifuga durante 5 minutos a 7500 x g y 4 C. Tras ello, de nuevo se retiró el sobrenadante por inversión y se dejó secar el tubo durante 1-2 horas, hasta que todo el etanol se evaporase. Por último, una vez que el RNA estaba seco, se resuspendió en agua libre de RNAsas y se incubó durante 5 minutos a 60 C para medir su densidad óptica. 36 La cuantificación y verificación de la calidad del RNA se realizó mediante la medida de la densidad óptica a 260 y 280 nm con un espectrofotómetro (NanoDropTM 1000, Thermo Scientific). La concentración de RNA se calcula utilizando la ley de Lambert-Beer, la cual permite correlacionar la absorbancia con la concentración a través de la expresión: 𝐴 = 𝜀 · 𝑏 · 𝑐 donde 𝐴 es la medida de absorbancia, 𝜀 el coeficiente de absorción molar (en M-1 cm-1), 𝑏 el camino óptico (en cm) y 𝑐 la concentración de RNA, en este caso (en mol/L). Para conseguir medir la concentración de ácidos nucleicos, la ecuación de Lambert-Beer se reorganiza quedando: 𝑐 = 𝐴 · 𝜀𝑏 ⁄, donde 𝜀 tiene un valor de 40 ng/μL y 𝑏 = 1 𝑐𝑚. La calidad del RNA se determina a través de los ratios de absorbancias a A260/A230 y A260/A280, utilizando valores de absorbancia normalizada y corregida en línea de base a 230 nm y 280 nm. Los valores de absorbancia a 260 nm, 280 nm y 230 nm se utilizan para calcular los índices de pureza de los ácidos nucleicos medidos. Dichos índices de pureza son sensibles a la presencia de contaminantes en la muestra, como los disolventes y reactivos residuales que se utilizan en la purificación de la muestra; de forma que un valor próximo a 2.0 es considerado como RNA de alta pureza y valores por debajo de 2.0 indican contaminación por proteínas o compuestos fenólicos. 4.2. Síntesis de cDNA Antes de proceder con la síntesis del DNA complementario (cDNA) se realizó un tratamiento con la enzima DNAsa para eliminar los posibles restos contaminantes de DNA genómico presentes en las muestras. Para ello, las muestras de RNA se incubaron con la enzima DNAsa en el termociclador durante 30 minutos a 37 C. A continuación, la enzima se eliminó con DRR (DNAsa Removal Reagent) al 10% del volumen de reacción, un reactivo que se une a la DNAsa y permite eliminarla. Las muestras con el DRR se centrifugaron para que el DRR junto con la DNAsa precipitase y se recogió el sobrenadante que contiene el RNA libre de DNA y de DNAsa. El DNA complementario (cDNA) se sintetizó a partir de los sobrenadantes recogidos, utilizando un buffer 5X, dNTPs 10 mM, un inhibidor de RNAsa 20 U/μL, random hexámeros 50 μM y la enzima retrotranscriptasa M-MLV 200 U/μL. El cDNA producido con random hexámeros permite mantener la proporción de RNA presente en la reacción. El programa utilizado fue el que se muestra en el esquema de la Figura 14. 37 4.3. PCR cuantitativa (qPCR) Finalmente, el cDNA se utilizó como molde para la amplificación mediante qPCR para obtener los datos de expresión de RNA de los genes de interés. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, también llamada qPCR, permite determinar con precisión la concentración de los fragmentos moleculares objetivo. La amplificación del fragmento de DNA o RNA objetivo se detecta en tiempo real durante todo el proceso de PCR utilizando indicadores de fluorescencia.[41] Implica varias etapas, incluyendo la amplificación de la muestra, la detección de la fluorescencia y la cuantificación de la muestra. A diferencia de las PCR convencionales, la qPCR monitoriza la amplificación de la molécula de ADN problema durante cada ciclo de amplificación y no al final. Esto se consigue mediante reactivos fluorescente, llamados fluorocromos, y termocicladores, los cuales poseen un sensor para medir la fluorescencia durante unos breves segundos en un momento concreto de cada ciclo, permitiendo ver cómo avanza la reacción en cada ciclo. Por el contrario, la PCR convencional es una técnica de punto final, es decir, solo puede verse el resultado una vez haya terminado la reacción. Se aplican ciclos regulados de calentamiento y enfriamiento para permitir la amplificación de un fragmento de ácido nucleico, seguido de una detección cuantitativa de los productos mediante fluorescencia, para determinar la cantidad original de material genético en la muestra. La PCR se lleva a cabo con ayuda de cebadores complementarios o “primers”, secuencias de ácidos nucleicos específicas que se unen al material genético sin amplificar. Coinciden específicamente con el fragmento a amplificar y establecen la dirección de replicación. Se Figura 14. Programa seguido para llevar a cabo la reacción de retrotranscripción. 38 combinan con la enzima DNA polimerasa, permitiendo que la cadena de ácido nucleico aumente en forma de copias. Estas reacciones sucesivas se llevan a cabo en los denominados ciclos en los cuales, los productos de la PCR amplificados aumentan exponencialmente hasta alcanzar niveles significativos. Dependiendo de los fluorocromos utilizados, puede distinguirse entre dos tipos de qPCR: TaqMan y SYBR Green. 4.3.1. qPCR con ensayo TaqMan Los ensayos TaqMan utilizan un par de cebadores o primers y una sonda no extensible. La sonda es un oligonucleótido específico de secuencia corta, diseñada de manera que hibrida con una región específica de DNA que va a ser amplificada por un par de oligonucleótidos específicos denominados cebadores o primers. Un extremo de la sonda, normalmente en 5’, se marca con un fluoróforo o tinte fluorescente, mientras que el otro extremo, el 3’, se marca con un quencher o desactivador de fluorescencia. El fluoróforo y el quencher forman un par FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) donante-aceptor (Figura 15). [42] A media que avanza la amplificación, la sonda TaqMan se hibrida con la secuencia objetivo de uno de los primers, formando una unidad eficaz. [42] A media que la Taq polimerasa sintetiza la cadena en sentido 5’-3’, la actividad exonucleasa 5’-3’ de esta misma enzima degrada la sonda TaqMan ya hibridada al DNA. La degradación de la sonda separa el fluoróforo, rompiendo la unión de este con el quencher, permitiendo la emisión de fluorescencia. La señal de fluorescencia emitida será proporcional a la cantidad de producto qPCR acumulado. [42] Por tanto, un ensayo TaqMan se trata de un sistema de tres oligonucleótidos donde la sonda, como tercer oligonucleótido, introduce un nivel adicional de especificidad en el ensayo. [42] 39 Figura 15. Esquema resumen del proceso de actuación de ensayo TaqMan. Para llevar preparar la reacción de qPCR con ensayo TaqMan se mezclan la Master Mix (TaqManTM Fast Advance Master Mix; Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific), que contiene la polimerasa, los nucleótidos (dNTPS), el buffer y el MgCl2 necesario para la reacción, los cebadores o primers (Forward y Reverse), la sonda TaqMan, la muestra de cDNA y agua libre de nucleasas en los volúmenes indicados en la Tabla 2. En todos los experimentos se incluyó un control negativo llamado “No Template Control” (NTC), que contenía todos los reactivos excepto cDNA. Las reacciones qPCR con ensayo TaqMan siguieron un protocolo que consistía en 15 minutos a 95 C donde se producía la activación de la enzima polimerasa, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 C correspondientes con los pasos de desnaturalización del DNA y 60 segundos a 60 C de hibridación y elongación. Al final de cada ciclo se hace una lectura de la señal emitida por el fluoróforo (Figura 16). 40 Figura 16. Esquema del protocolo qPCR con ensayo TaqMan. 4.3.2. qPCR con SYBR Green Mientras que en los ensayos TaqMan la emisión de una señal fluorescente se produce únicamente cuando la sonda interactúa con la secuencia de nucleótidos específica, como ya se ha explicado en el apartado anterior, el ensayo SYBR Green emite una señal fluorescente cuando el fluoróforo, que en este caso no está unido a ninguna sonda, entra en contacto con cualquier secuencia de nucleótidos de doble cadena. Dado que el fluoróforo se intercala con cualquier secuencia de nucleótidos de doble cadena, pueden detectarse falsas señales que se producen por la presencia de dímeros de primers, bucles en la horquilla o por la amplificación de productos no específicos, disminuyendo la especificidad. Sin embargo, se ha demostrado que cuando se sigue el protocolo de qPCR adecuado y los primers se diseñan cuidadosamente, los ensayos de detección basados en SYBR Green logran resultados con un rendimiento muy similar a los obtenidos con los ensayos TaqMan.[43] Figura 17. Esquema resumen del proceso de actuación de ensayo SYBR Green Para realizar la qPCR con SybrGreen se utilizó la MasterMix (PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix; Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific) que contiene la enzima DNA polimerasa, los nucleótidos, el buffer de trabajo y el colorante SybrGReen; cada uno de los primers de cada gen a amplificar, la muestra de cDNA y agua libre de nucleasas en los volúmenes indicados en la Tabla 2. De nuevo, en este tipo de ensayos se utilizó un “No Template Control” (NTC), para 41 comprobar la no existencia de contaminantes durante la reacción. En la Figura 18 que se muestra a continuación, se detalla el protocolo seguido para una qPCR con SybrGreen. Figura 18. Esquema del protocolo qPCR con ensayo SybrGreen. Tabla 2. Tabla resumen de los volúmenes necesarios para llevar a cabo una qPCR con cada uno de los ensayos. El colorante SybrGreen es capaz de unirse a cualquier DNA de doble cadena, por tanto, al final de los ciclos de PCR se realizó una curva de Melting, como se muestra en la Figura 18, verificando así la especificidad de la reacción y descartar la amplificación de fragmentos no deseados. VOLÚMENES PARA LA PREPARACIÓN DE UNA qPCR COMPONENTES ENSAYO TaqMan ENSAYO SYBR Green MasterMix 10X 10 μL 10 μL Primer Forward (10 μM) 1 μL 1 μL Primer Reverse (10 μM) 1 μL 1 μL Sonda TaqMan (4 μM) 1 μL - cDNA 1 μL 1 μL Agua 6 μL 7 μL Volumen total 20 μL 20 μL 48 M2 Arg1 (arginasa-1) o Irf4 (factor regulador de interferón 4). [46] En este contexto, estímulos proinflamatorios como el LPS promueven la polarización M1, mientras que estímulos como la interleucina-4 (IL-4) promueven la polarización antiinflamatoria M2. Los mecanismos que subyacen a la transición entre un fenotipo y otro y la firma correspondiente de los marcadores de superficie celular no son muy conocidos. Además, varios estudios describen un fenotipo M1/M2 “mixto” para ratones obesos, lo que sugiere que los macrófagos adoptan estados más complejos in vivo. [45] Estudios han demostrado que los macrófagos con dicho fenotipo mixto no son capaces de expresar los marcadores típicos de los macrófagos activados clásicamente. Sin embargo, ciertas proteínas de la superficie celular, incluyendo CD36, ABCA1, PLIN2, fueron sobreexpresadas por estos macrófagos con fenotipo mixto. [45] De acuerdo con toda esta evidencia, se lleva a cabo el estudio de la expresión de los marcadores de fenotipo M1 típicos, TNF-α y NOS2. Además, se propone a la proteína CD36, un transportador de ácidos grasos de macrófagos, como posible marcador metabólico del fenotipo mixto anteriormente mencionado. Para ello, se han realizado una serie de qPCR con muestras de macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) provenientes de ratones y ratonas SD y HFD. Para cada muestra, se han estudiado dos condiciones: una condición control donde los BMDM no han sido estimulados (M0) y una segunda condición donde los BMDM han sido tratados y activados con LPS (M1). Los resultados obtenidos se muestran a continuación. 49 Figura 24. Abundancia relativa de los marcadores de fenotipo metabólico. (A) Expresión de los marcadores en ratones y ratonas BPH/SD y BPH/HFD en condición control y con LPS. Los datos son la media ± ESM. (B) Expresión de los marcadores en ratones y ratonas BPH/SD y BPH/HFD en condición control. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 HFD con respecto a la dieta SD. # 𝑝 < 0.05,## 𝑝 < 0.01 o ### 𝑝 < 0.001 hembras con respecto a machos. En la Figura 24.A se observa que, de acuerdo con lo descrito en la literatura [45] la estimulación de los macrófagos con LPS aumenta significativamente la expresión de la citoquina (proinflamatoria) TNF-α y de la enzima NOS2. Esto sucede tanto en SD como en HFD y no hay diferencias entre dietas en este cambio. Esto apoya el empleo de estos genes como marcadores de M1. Sin embargo, con la expresión de CD36 ocurre lo contrario; la activación A B 50 con LPS conlleva una disminución significativa de su expresión [47] y en este cambio no hay diferente entre dietas. En la Figura 23.B están representados solo los datos de macrófagos sin estimular de machos y hembras con las distintas dietas y de, esta forma, se evidencia que no se observan diferencias significativas entre dietas, pero sí una expresión significativamente mayor en hembras con respecto a machos, tanto en SD como en HFD. Esto nos lleva a comparar las diferencias en la expresión relativa entre machos y hembras, que se muestra a continuación. Figura 25. Diferencias en la expresión relativa en hembras con respecto a machos en macrófagos M0. Los datos son la media ± ESM. Las barras hacia la derecha indican un aumento (hacia la izquierda indicarían disminución) en la expresión de los marcadores en hembras con respecto a machos tanto en dieta SD como HFD. Un valor de 1.0 indica un aumento de 10 veces la expresión de mRNA en hembras con respecto a machos, y un valor de 0.5 un aumento de 3.2 veces. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 cambio en la expresión en hembras con respecto a machos. En la Figura 25 puede apreciarse un aumento significativo en la expresión de TNF-α y CD36 en hembras con respecto a machos. Además, se observa una tendencia mayor en HFD que en SD. Por el contrario, en NOS2 los cambios no son significativos, además de observar que la expresión en HFD disminuye (en torno a 0.2) con respecto a los machos, algo contradictorio en comparación con los datos que se muestran en las Figuras 22.A y 22.B. Esta contradicción puede deberse al gran error que acarrean estos datos debido a la enorme variabilidad en los resultados obtenidos entre muestras. 3. La expresión de canales iónicos en macrófagos 3.1. Receptores purinérgicos, P2X Diferentes estímulos dentro de la matriz extracelular promueven a los macrófagos hacia un fenotipo proinflamatorio o antiinflamatorio. Los nucleótidos extracelulares, como el ATP, actúan como señales de daño, organizando una respuesta inflamatoria a través de los receptores purinérgicos. El perfil de expresión de estos receptores en macrófagos define de forma única su respuesta frente a los nucleótidos del entorno celular. [46] 51 Varios estudios demuestran que los BMDM expresan un repertorio único de receptores purinérgicos, el cual es muy flexible y se adapta rápidamente a la diferenciación de macrófagos pro y antiinflamatorios. Además, se destaca el potencial del receptor purinérgico P2X7 como posible nuevo marcador de polarización de macrófagos. [46] Conociendo estos datos, se propone el estudio de la expresión de mRNA de ciertos receptores purinérgicos (P2X4, P2X7 y P2X1) en BMDM de ratones macho y hembras SD y HFD a través de la técnica molecular qPCR. De nuevo, para cada muestra, se han estudiado la condición control donde los BMDM no han sido estimulados y la condición donde los BMDM han sido tratados y activados con LPS. A B 52 Figura 26. Abundancia relativa de los receptores purinérgicos. (A) Expresión de los receptores purinérgicos en ratones y ratonas BPH/SD y BPH/HFD en condición control y con LPS. (B) Expresión de los receptores purinérgicos en ratones y ratonas BPH/SD y BPH/HFD en condición control. Los datos son la media ± ESM. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 HFD con respecto a la dieta SD. # 𝑝 < 0.05,## 𝑝 < 0.01 hembras con respecto a machos. Observando la Figura 26.A se aprecia que la estimulación con LPS no provoca ningún efecto significativo a excepción del P2X1, donde el aumento de su expresión en hembras es grande y significativo. En el caso de la Figura 26.B, de nuevo no se aprecia ningún cambio significativo entre dietas. De nuevo, al igual que sucedía en el caso de los marcadores, las únicas diferencias a remarcar son las que existen en la expresión de los receptores entre machos y hembras, por lo que se estudian, a continuación, las diferencias en la expresión relativa entre machos y hembras. Con relación a la Figura 27, se observa que la expresión de los receptores P2X1 y P2X4 tiende a disminuir en hembras con respecto a los machos, siendo la disminución mayor en ratonas SD que HFD, aunque el cambio solo es significativo en el caso de P2X4 con dieta SD. En cambio, en Figura 27. Diferencias en la expresión relativa de receptores purinérgicos en hembras con respecto a machos en macrófagos M0. Los datos son la media ± ESM. Las barras hacia la derecha indican un aumento (hacia la izquierda indicarían disminución) en la expresión de los marcadores en hembras con respecto a machos tanto en dieta SD como HFD. Un valor de 1.0 indica un aumento de 10 veces la expresión de mRNA en hembras con respecto a machos, y un valor de 0.5 un aumento de 3.2 veces. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 cambio en la expresión en hembras con respecto a machos. 53 el caso del receptor P2X7, la expresión en hembras aumenta de forma significativa con ambas dietas. 3.2. Canales de potasio dependientes de voltaje Los canales de potasio dependientes de voltaje están asociados con funciones de macrófagos tales como la migración, proliferación, activación y producción de citoquinas. Estudios anteriores evidencian que los BMDM expresan, entre otros, los canales Kv1.3, Kir2.1 e IK1 [19], [48] que han sido relevantes en la función de este tipo de células, por lo que en este trabajo se estudia cuál es su expresión en el modelo de ratón diabético obtenido. Al igual que en los apartados anteriores, se lleva a cabo el estudio de la expresión de mRNA de los canales iónicos dependientes de voltaje Kv1.3, Kir2.1 e IK1 en BMDM de ratones macho y hembras SD y HFD mediante qPCR. En cada muestra se han estudiado la condición control (M0) donde los BMDM no han sido estimulados y la condición M1, donde los BMDM han sido tratados y activados con LPS. A B 54 Figura 28. Abundancia relativa de los canales iónicos dependientes de voltaje. (A) Expresión de los canales iónicos en ratones y ratonas BPH/SD y BPH/HFD en condición control y con (B) Expresión de los canales iónicos en ratones y ratonas SD y HFD en condición control. Los datos son la media ± ESM. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 HFD con respecto a la dieta SD. # 𝑝 < 0.05 hembras con respecto a machos. En la Figura 28.A se muestra que la estimulación de los BMDM con LPS aumenta la expresión del canal Kv1.3 de manera significativa tanto en machos como en hembras, mientras que disminuye significativamente la expresión de Kir2.1 e IK1, tanto en machos como en hembras respectivamente. Atendiendo a la Figura 28.B, donde se encuentran representadas las expresiones de los canales en las situaciones control, se percibe que el único cambio destacable es el que se produce en la expresión del Kir2.1, donde se observa una diferencia significativa entre dietas. La expresión de dicho canal es significativamente mayor en ratones y ratonas HFD que en ratones y ratonas SD. Mientras tanto, la expresión de los canales Kv1.3 e IK1 parece tender a la baja en ratones HFD, pero no son diferencias significativas. En cuanto a la diferencia entre sexos, no parece existir una expresión diferente de los canales entre machos y hembras. Aun así, se representan las diferencias en la expresión relativa entre ellos, siguiendo el esquema de apartados anteriores. 55 Figura 29. Diferencias en la expresión relativa de canales iónicos en hembras con respecto a machos en macrófagos M0. Los datos son la media ± ESM. Las barras hacia la derecha indican un aumento (hacia la izquierda indicarían disminución) en la expresión de los marcadores en hembras con respecto a machos tanto en dieta SD como HFD. Un valor de 1.0 indica un aumento de 10 veces la expresión de mRNA en hembras con respecto a machos, y un valor de 0.5 un aumento de 3.2 veces. ∗ 𝑝 < 0.05, ∗∗ 𝑝 < 0.01 o ∗∗∗ 𝑝 < 0.001 cambio en la expresión en hembras con respecto a machos. Como ya se podía observar en la Figura 28.B, la Figura 29 muestra que no existen diferencias significativas en la expresión de los canales iónicos estudiados entre machos y hembras. Es decir, Kv1.3, Kir2.1 e IK1 se expresan de igual manera en machos que en hembras, con ambas dietas. 4. Expresión del Kv1.3 en diferentes tejidos de modelo de murino diabético En los últimos años, el conocimiento sobre la cascada de señalización de insulina ha crecido rápidamente. Estudios previos en roedores indican que el canal de potasio Kv1.3, se expresa en tejidos sensibles a insulina, como son el tejido adiposo, el hígado, el músculo esquelético y el bulbo olfatorio. Además, el bloqueo farmacológico del canal en tejidos sensibles a insulina aumenta la captación de glucosa, aumentando la sensibilidad a insulina, y el ratón Knock-out (ratón modificado genéticamente para que uno o varios genes estén inactivado) para este canal tiene un peso corporal más bajo, una mayor sensibilidad a insulina y niveles más bajos de glucosa en plasma. [49], [50] Estas evidencias sugieren que el canal Kv1.3 tiene un papel importante tanto en los vasos, como en tejidos relevantes en el estado metabólico a nivel sistémico, por lo que resulta especialmente interesante en un modelo de animal diabético como el empleado en este trabajo... Por tanto, se estudia la expresión del canal Kv1.3 en diferentes tejidos (aorta, bulbo olfatorio, músculo, hígado y grasa) en el modelo murino con diabetes y otros factores de riesgo vascular. 56 Figura 30. Abundancia relativa del canal Kv1.3 en diferentes tejidos. Expresión del canal iónico en diferentes tejidos extraídos de ratonas BPH/SD y BPH/HFD. Los datos son la media ± ESM. ∗ 𝑝 < 0.05 HFD con respecto a la dieta SD. En la Figura 30 puede observarse que la expresión es especialmente alta en bulbo olfatorio y que en la mayoría de los tejidos no existe ninguna diferencia significativa entre ratonas SD y HFD. Por otro lado, se observa que, mientras que en el hígado y el músculo la abundancia relativa del Kv1.3 no es muy alta, dicha abundancia aumenta enormemente en el caso del bulbo olfatorio. La única diferencia significativa se observa en aorta, donde la abundancia relativa del canal Kv1.3 disminuye de manera significativa en ratonas HFD. Puesto que es el único tejido en el que se perciben dichas diferencias, suscita mayor interés, por lo que se procede a un estudio más completo en las arterias aortas. 4.1. Estudio de la expresión de Kv1.3 y Kv1.5 en aortas En la mayoría de los sistemas, las células expresan varios canales de la familia Kv1, cuya expresión también se remodela tras la activación y/o cambio fenotípico. En particular, en las VSMCs, está descrito que los canales Kv1.5 disminuyen su expresión con el cambio fenotípico dejando al canal Kv1.3 como en canal predominante las VSMCs de los vasos y permitiendo que lleve a cabo sus funciones de proliferación y migración. [24] En preparaciones de VSMCs de estudios anteriores, la modulación fenotípica no cambia la expresión de mRNA de Kv1.3. Sin embargo, todos los demás mRNA de Kv1.x disminuyeron, en particular se produce una drástica disminución para Kv1.5. Como ya se ha comentado anteriormente, las subunidades α de Kv1.3 y Kv1.5 pueden ensamblarse formando complejos 57 heterotetraméricos. En estos casos, la proporción relativa de ambos canales controla la tasa de proliferación puesto que los canales tienen un papel proliferativo y antiproliferativo, respectivamente. Las subunidades Kv1.5 tendrán un efecto negativo que dominará sobre la proliferación inducida por Kv1.3. [24] Debido a las evidencias anteriores en la relación entre Kv1.3 y Kv1.5 en VSMCs, se procede al estudio y comparación de la expresión de ambos canales en las aortas de machos y hembras SD y HFD. Figura 31. Abundancia relativa de los canales Kv1.3 y Kv1.5 en aorta. A) Expresión del canal iónico Kv1.3 en aorta extraída de ratonas SD y HFD. B) Expresión del canal iónico Kv1.5 en aorta extraída de ratonas SD y HFD. Los datos son la media ± ESM. ∗∗ 𝑝 < 0.01 HFD con respecto a la dieta SD. # 𝑝 < 0.05,## 𝑝 < 0.01 o ### 𝑝 < 0.001 hembras con respecto a machos. La Figura 31.A revela una mayor expresión del canal Kv1.3 en hembras que en machos además de ser mayor en el caso de ratones SD. En cuanto a la dieta, se observa que la expresión del canal disminuye significativamente en hembras. En la Figura 31.B se observa que el canal Kv1.5 se expresa significativamente menos en hembras que en machos, tanto en SD como en HFD. Además, la dieta hace que la expresión disminuya significativamente en HFD, tanto en hembras como en machos. Estudiada la expresión de ambos canales en aorta, se estudia el ratio Kv1.3/Kv1.5 para conocer el fenotipo de las VSMCs en las muestras de aorta; de manera que un mayor ratio Kv1.3/Kv1.5 sugiere un fenotipo más desdiferenciado y, un menor ratio Kv1.3/Kv1.5, sugiere un fenotipo más diferenciado (más células contráctiles). A B 64 [11] J. E. Kanter, C. C. Hsu, and K. E. Bornfeldt, “Monocytes and Macrophages as Protagonists in Vascular Complications of Diabetes,” Frontiers in Cardiovascular Medicine, vol. 7, 2020. doi: 10.3389/fcvm.2020.00010. [12] K. J. Moore, F. J. Sheedy, and E. A. Fisher, “Macrophages in atherosclerosis: A dynamic balance,” Nature Reviews Immunology, vol. 13, no. 10. pp. 709–721, 2013. doi: 10.1038/nri3520. [13] C. Lahoz, J. M. Mostaza, and C. Lahoz, “La aterosclerosis como enfermedad sistémica,” Revista Española de Cardiología, vol. 60, no. 2, pp. 184-195, 2007, doi: https://doi.org/10.1157/13099465 [14] P. Libby et al., “Atherosclerosis,” Natural Reviews Disease Primers, vol. 5, no. 1, 2019, doi: 10.1038/s41572-019-0106-z. [15] P. Marchio, S. Guerra-Ojeda, J. M. Vila, M. Aldasoro, V. M. Victor, and M. D. Mauricio, “Targeting early atherosclerosis: A focus on oxidative stress and inflammation,” Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2019, 2019. doi: 10.1155/2019/8563845. [16] H. Goikuria, K. Vandenbroeck, and I. Alloza, “Inflammation in human carotid atheroma plaques,” Cytokine Growth Factor Reviews, vol. 39, pp. 62–70, 2018, doi: 10.1016/j.cytogfr.2018.01.006. [17] C. Varol, A. Mildner, and S. Jung, “Macrophages: Development and tissue specialization,” Annual Review of Immunology, vol. 33., pp. 643–675, 2015. doi: 10.1146/annurev-immunol-032414-112220. [18] T. A. Wynn, A. Chawla, and J. W. Pollard, “Macrophage biology in development, homeostasis and disease,” Nature, vol. 496, no. 7446. pp. 445–455, 2013. doi: 10.1038/nature12034. [19] R. Vicente et al., “Differential Voltage-dependent K+ Channel Responses during Proliferation and Activation in Macrophages,” Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 47, pp. 46307–46320, 2003, doi: 10.1074/jbc.M304388200. 65 [20] R. Vicente et al., “Association of Kv1.5 and Kv1.3 contributes to the major voltagedependent K+ channel in macrophages,” Journal of Biological Chemistry, vol. 281, no. 49, pp. 37675–37685, 2006, doi: 10.1074/jbc.M605617200. [21] W. Zhang, X. J. Lei, Y. F. Wang, D. Q. Wang, and Z. Y. Yuan, “Role of Kir2.1 in human monocyte-derived foam cell maturation,” Journal of Cellular and Molecular Medicine, vol. 20, no. 3, pp. 403–412, 2016, doi: 10.1111/jcmm.12705. [22] A. Kondratskyi, K. Kondratska, R. Skryma, D. J. Klionsky, and N. Prevarskaya, “Ion channels in the regulation of autophagy,” Autophagy, vol. 14, no. 1., pp. 3–21, 2018, doi: 10.1080/15548627.2017.1384887. [23] S. K. Bagal et al., “Ion channels as therapeutic targets: A drug discovery perspective,” Journal of Medicinal Chemistry, vol. 56, no. 3, pp. 593–624, 2013. doi: 10.1021/jm3011433. [24] M. Teresa Pérez-García, P. Cidad, and J. R. López-López, “The secret life of ion channels: Kv1.3 potassium channels and proliferation,” American Journal of Physiology. Cell Physiology, vol. 314, pp. 27–42, 2018, doi: 10.1152/ajpcell.00136.2017.-Kv1.3. [25] P. Cidad et al., “Characterization of ion channels involved in the proliferative response of femoral artery smooth muscle cells,” Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, vol. 30, no. 6, pp. 1203–1211, 2010, doi: 10.1161/ATVBAHA.110.205187. [26] B. Hille, “Potassium channels and chloride channels. In Ionic Channels of Excitable Membrane,” Edited by Hill B, pp. 130–133, 1992. [27] D. J. Snyders, M. M. Tamkun, and P. B. Bennett, “A Rapidly Activating and Slowly Inactivating Potassium Channel Cloned from Human Heart Functional Analysis after Stable Mammalian Cell Culture Expression,” Journal of General Physiology, vol. 101, pp. 513-543, 1993, doi: 10.1085/jgp.101.4.513 [28] R. Vicente et al., “Kv1.5 association modifies Kv1.3 traffic and membrane localization,” Journal of Biological Chemistry, vol. 283, no. 13, pp. 8756–8764, 2008, doi: 10.1074/jbc.M708223200. 66 [29] Y. Fang et al., “Functional expression of Kir2.x in human aortic endothelial cells: the dominant role of Kir2.2,” American Journal of Physiology. Cell Physiology, vol. 289, no. 5, pp. 1134–1144, 2005, doi: 10.1152/ajpcell.00077.2005.-Inward. [30] Y. Kubo, T. J. Baldwin, Y. Nung Jan, and L. Y. Jan, “Primary structure and functional expression of a mouse inward rectifier potassium channel,” Nature, vol. 362, pp. 127-133, 1993, doi: https://doi.org/10.1038/362127a0 [31] D. Bichet, F. A. Haass, and L. Y. Jan, “Merging functional studies with structures of inward-rectifier K + channels,” Nature Reviews Neuroscience, vol. 4, no. 12, pp. 957–967, 2003. doi: 10.1038/nrn1244. [32] X. Tao, J. L. Avalos, J. Chen, and R. MacKinnon, “Crystal Structure of the Eukaryotic Strong Inward-Rectifier K+ Channel Kir2.2 at 3.1 Å Resolution,” Science (1979), vol. 326, no. 5960, pp. 1668–1674, 2009, doi: 10.1126/science.1180310. [33] C. Moreno et al., “Modulation of Voltage-Dependent and Inward Rectifier Potassium Channels by 15-Epi-Lipoxin-A4 in Activated Murine Macrophages: Implications in Innate Immunity,” The Journal of Immunology, vol. 191, no. 12, pp. 6136–6146, 2013, doi: 10.4049/jimmunol.1300235. [34] H. Hibino, A. Inanobe, K. Furutani, S. Murakami, I. Findlay, and Y. Kurachi, “Inwardly Rectifying Potassium Channels: Their Structure, Function, and Physiological Roles,” Physiological Reviews, vol. 90, no. 1, pp. 291-366, 2010, doi: 10.1152/physrev.00021.2009.- Inwardly. [35] N. Mehta et al., “Purinergic receptor P2X7: A novel target for anti-inflammatory therapy,” Bioorganic and Medicinal Chemistry, vol. 22, no. 1, pp. 54–88, 2014, doi: 10.1016/j.bmc.2013.10.054. [36] G. E. Torres, T. M. Egan, and M. M. Voigt, “Hetero-oligomeric Assembly of P2X Receptor Subunits,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 274, no. 10, pp. 6653-6659, 1999, doi: https://doi.org/10.1074/jbc.274.10.6653 [37] B. S. Khakh, “Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses,” Nature Reviews Neuroscience, vol. 2, pp. 165-174, 2001, doi: https://doi.org/10.1038/35058521 67 [38] F. M. Bennetts, J. I. Mobbs, S. Ventura, and D. M. Thal, “The P2X1 receptor as a therapeutic target,” Purinergic Signalling, vol. 18, no. 4, pp. 421–433, 2022. doi: 10.1007/s11302-022-09880-4. [39] B. S. Khakh and R. Alan North, “P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease,” Nature, vol. 442, no. 7102, pp. 527–532, 2006. doi: 10.1038/nature04886. [40] R. V Serrato, “Lipopolysaccharides in diazotrophic bacteria,” Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, vol. 4, 2014, doi: 10.3389/fcimb.2014.00119. [41] Y. Cao, M. Yu, G. Dong, B. Chen, and B. Zhang, “Digital PCR as an emerging tool for monitoring of microbial biodegradation,” Molecules, vol. 25, no. 3, 2020. doi: 10.3390/molecules25030706. [42] A. Nagy et al., “Evaluation of TaqMan qPCR system integrating two identically labelled hydrolysis probes in single assay,” Scientific Reports, vol. 7, 2017, doi: 10.1038/srep41392. [43] B. Thornton and C. Basu, “Rapid and Simple Method of qPCR Primer Design,” PCR Primer Design, C. Basu, Ed., New York, pp. 173–179,2015, doi: 10.1007/978-1-4939-23656_13. [44] K. J. Livak and T. D. Schmittgen, “Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method,” Methods, vol. 25, no. 4, pp. 402–408, 2001, doi: 10.1006/meth.2001.1262. [45] M. Kratz et al., “Metabolic dysfunction drives a mechanistically distinct proinflammatory phenotype in adipose tissue macrophages,” Cell Metabolism, vol. 20, no. 4, pp. 614–625, 2014, doi: 10.1016/j.cmet.2014.08.010. [46] J. Merz et al., “Proand anti-inflammatory macrophages express a sub-type specific purinergic receptor profile,” Purinergic Signal, vol. 17, pp. 481-492, doi: 10.1007/s11302-02109798-3/Published. [47] S. Pennathur et al., “The Macrophage Phagocytic Receptor CD36 Promotes Fibrogenic Pathways on Removal of Apoptotic Cells during Chronic Kidney Injury,” American Journal of Pathology, vol. 185, no. 8, pp. 2232–2245, 2015, doi: 10.1016/j.ajpath.2015.04.016. 68 [48] E.-P. Reich et al., “Blocking ion channel KCNN4 alleviates the symptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice,” European Journal of Immunology, vol. 35, no. 4, pp. 1027–1036, 2005, doi: https://doi.org/10.1002/eji.200425954. [49] S. V Straub et al., “Pharmacological inhibition of Kv1.3 fails to modulate insulin sensitivity in diabetic mice or human insulin-sensitive tissues,” American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism, vol. 301, pp. 380–390, 2011, doi: 10.1152/ajpendo.00076.2011.-Genetic. [50] O. Tschritter et al., “A New Variant in the Human Kv1.3 Gene Is Associated with Low Insulin Sensitivity and Impaired Glucose Tolerance,” The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 91, no. 2, pp. 654–658, 2006, doi: 10.1210/jc.2005-0725. 69 Anexo I ENSAYOS TaqMan Tabla.A.I. Ensayos TaqMan comerciales y personalizados usados. NOMBRE DEL GEN PROTEÍNA ENSAYO (Applied Biosystem) CD36 CD36 mCD36_F: 5'- ATGGGCTGTGATCGGAACTG-3' mCD36_R: 5'-GTCTTCTCAATAAGCATGTCTCC-3' KCNA3 Kv1.3 mK3_3utr_F: 5'-CCACGAACAATAACCCCAAC-3' mK3_3utr_R: 5'-AGGGCATACACAGACCAAGG-3' mK3_3utr_Sonda: 5'-TGTCTAATATATGATACGGTTGCCA-3' KCNA5 Kv1.5 mK5_F2174: 5'-GGACACTAGCCGGGAAACAG-3' mK5_R2318: 5'-TCCGGACTTTGATGGGTGAC-3' mK5_Sonda: 5'-ACCGGTTCCTCTTGAGCTTGCT-3' KCNJ2 Kir2.1 Mm00434616_m1 KCNN4 IK1 Mm00464586_m1 NOS2 NOS2 mNOSi_F: 5'-CCAAGCCCTCACCTACTTCC-3' mNOSi_R: 5'-CTCTGAGGGCTGACACAAGG-3' P2RX1 P2X1 Mm00435460_m1 P2RX4 P2X4 Mm00501787_m1 P2RX7 P2X7 Mm01199500_m1 RPL18 RPL18 F: 5'-AAGACTGCCGTGGTTGTGG-3' R: 5'-AGCCTTGAGGATGCGACTC-3' Sonda: 5'-FAM-TTCCCAAGCTGAAGGTGTGTGCA-BHQ1-3' TNF-α TNF-α F: 5'-AGCCGATGGGTTGTACCTTGTCTA-3' R: 5'-TGAGATAGCAAATCGGCTGACGGT-3'