Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto

! ! INSTITUTO UNIVERSITARIO DE OFTALMOBIOLOGÍA APLICADA TESIS DOCTORAL: CAMBIOS EN LA FISIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA CORNEAL INDUCIDOS POR EL PORTE DE LENTES DE CONTACTO PHYSIOLOGYCAL AND MORPHOLOGYCAL CHANGES IN THE CORNEA INDUCED BY CONTACT LENS WEAR Presentada por ANA MARÍA DEL RÍO SAN CRISTÓBAL para optar al grado de doctora por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Dr. Raúl Martín Herranz Dr. Miguel José Maldonado López Impreso 2T AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE TESIS (Art. 2.1. c de la Normativa para la presentación y defensa de la Tesis Doctoral en la UVa) D. RAÚL MARTÍN HERRANZ, con D.N.I. nº 50447910-D, investigador del Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada de la Universidad de Valladolid (IOBA) y profesor contratado doctor del Departamento de Física Teórica, Atómica y Óptica, y D. MIGUEL JOSÉ MALDONADO LÓPEZ, con D.N.I. no 25149971-T, investigador del Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada de la Universidad de Valladolid (IOBA) y profesor titular del Departamento de Cirugía, Oftalmología, Otorrinolaringología y Fisioterapia, como Directores de la Tesis Doctoral titulada ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’, presentada por Dña. Ana María del Río San Cristóbal, alumna del programa de Doctorado en Ciencias de la Visión impartido por el IOBA, Autorizan la presentación de la misma, considerando que es APTA para su defensa. Valladolid, 10 de junio de 2014 Los Directores de la Tesis, Fdo.: Dr. Raúl Martín Herranz Fdo.: Dr. Miguel José Maldonado López SR. PRESIDENTE DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO ! A mi familia. ‘‘Un viaje de mil leguas empieza con un sólo paso’’ Confucio! ‘‘Si tienes un problema que no tiene solución, ¿por qué te preocupas? Y si tiene solución, ¿por qué te preocupas?’’ Proverbio! ‘‘Pues aunque el resplandor que en otro tiempo fue tan brillante hoy esté por siempre oculto a mis miradas, aunque nada pueda hacer volver la hora del esplendor en la hierba, de la gloria en las flores, no debemos afligirnos, pues encontraremos fuerza en el recuerdo, en aquella primera simpatía que, habiendo sido una vez, habrá de ser por siempre….’’ William Wordsworth! ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! VI • Sven Jonuscheit; Michael Doughty; Raul Martin; Ana RioCristobal; Victoria Cruikshank; Sue Lang. Peripheral corneal thickness in prepresbyopic Caucasian subjects in relation to nasal-temporal asymmetry by Scheimpflug imaging. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 2014. En primera revisión. • Raul Martin; Ana Rio-Cristobal; Laura Mena; Sara Ortiz. Relationships between central and peripheral corneal thickness in different degrees of myopia. Journal of Optometry. 2014; 7-1, pp. 44 - 50. • Raul Martin; Sara Ortiz; Ana Rio-Cristobal. White-to-white corneal diameter differences in moderate and high myopic eyes: Partial coherence interferometry versus scanning-slit topography. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 2013; 39-4, pp. 585 - 589. • Sara Ortiz; Ana Rio-Cristobal; Raul Martin; Victoria de Juan; Guadalupe Rodriguez. Relación de los parámetros biométricos en el ojo miope. Gaceta de Optometría. 2012; 474, pp. 12 - 22. Además, se han presentado las siguientes comunicaciones en Congresos: • Ana Rio-Cristobal; Anton Guimera; Estefania Traver; Angela Morejon; Carmen Herrero; Carmen Lagunas; Rosa Villa; Miguel Jose Maldonado; Raul Martin. Evaluación de la seguridad clínica de la medida de la impedancia corneal. Aplicación en lentes de contacto. XXIII Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2014 . Comunicación oral. Abril de 2014. • Ana Rio-Cristobal; Maria Plata-Cordero; Anton Guimera; Estefania Traver; Carmen Herrero; Carmen Lagunas; Rosa Villa; ! Prefacio ! ! ! ! ! ! VII Miguel Jose Maldonado; Raul Martin. Respuesta del epitelio corneal a la hipoxia inducida por el porte de lentes de contacto en conejos. Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2014 . Comunicación en póster. Abril de 2014. • Sven Jonuscheit; Raul Martin; Ana Rio-Cristobal; Michael Doughty; Lisa Mackintosh; David MacTaggart; Michael Hiscock. Relación entre el espesor corneal periférico y el índice de masa corporal en adultos europeos jóvenes. Estudio piloto . Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2014 . Comunicación en póster. Abril de 2014. • Raul Martin; Sven Jonuscheit; Ana Rio-Cristobal; Michael Doughty; Lisa Mackintosh; David MacTaggart; Michael Hiscock. Repetibilidad de la paquimetría periférica (próxima al limbo) de la topografía corneal de Scheimpflug (Pentacam). Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2014 . Comunicación en póster. Abril de 2014. • Sven Jonuscheit; Raul Martin; Ana Rio-Cristobal; Michael Doughty; Lisa Mackintosh; David MacTaggart; Michael Hiscock. Body mass index, peripheral corneal thickness and anterior chamber depth in young European adults – A pilot study . Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting (ARVO). Comunicación en póster. Mayo de 2013. • Raul Martin; Sven Jonuscheit; Ana Rio-Cristobal; Michael Doughty; Lisa Mackintosh; David MacTaggart; Michael Hiscock. Repeatability of peripheral (near-limbal) corneal thickness measurements of Pentacam Scheimpflug corneal topography . Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting (ARVO). Comunicación en póster. Mayo de 2013. • Ana Rio-Cristobal; Maria Plata-Cordero; Anton Guimera; Estefania Traver; Raul Martin; Rosa Villa; Carmen Herrero; ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! VIII Carmen Lagunas; Miguel Jose Maldonado. A new non-invasive method to assess corneal integrity base don bioimpedance measurements. European Academy of Optometry and Optics . Comunicación en póster. Abril de 2013. • Victoria de Juan; Sara Ortiz; Laura Mena; Ana Rio-Cristobal; Raul Martin. Relación entre el espesor central y periférico de la córnea y el grado de miopía . 88 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología . Comunicación en póster. Septiembre de 2012. • Ana Rio-Cristobal; Angela Morejon; Raul Martin. Respuesta corneal inmediata al porte de lentes de contacto . XXII Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2012 . Comunicación en póster. Febrero de 2012. • Laura Mena; Sara Ortiz; Ana Rio-Cristobal; Raul Martin. Relación entre espesor corneal central y periférico y el grado de miopía . XXII Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica - OPTOM 2012 . Comunicación oral. Febrero de 2012. Repercusión en medios de comunicación (consultado el 3 de junio de 2014): • Radio Televisión Española (RTVE): http://www.rtve.es/noticias/20140319/crean-sensor-capazdiagnosticar-in-vivo-alteraciones-cornea/900280.shtml • Agencia Iberoamericana para la Difusión de la Ciencia y la Tecnología (DICYT): http://www.dicyt.com/noticias/investigancomo-afecta-a-la-cornea-el-uso-de-lentes-de-contacto ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 1 ÍNDICE PREFACIO Agradecimientos ............................................................................................................... I Financiación ................................................................................................................... III Divulgación Científica ..................................................................................................... V CAPÍTULO 0 Índice ............................................................................................................................... 1 Estructura de la Tesis Doctoral ....................................................................................... 9 Lista de tablas ............................................................................................................... 13 Lista de figuras .............................................................................................................. 17 Abreviaturas .................................................................................................................. 19 English Summary .......................................................................................................... 21 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Justificación ............................................................................................................ 75 1.2. Hipótesis ................................................................................................................. 79 1.3. Objetivos ................................................................................................................. 81 CAPÍTULO 2. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 2.1. Anatomía de la córnea. Estructura corneal ............................................................ 85 2.1.1. Epitelio ................................................................................................... 86 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 2 2.1.2. Lámina de Bowman ............................................................................... 87 2.1.3. Estroma ................................................................................................. 87 2.1.4. Membrana de Descemet ....................................................................... 88 2.1.5. Endotelio ................................................................................................ 88 2.2. Fisiología de la córnea. Función barrera de epitelio y endotelio ............................ 91 2.2.1. Tight junctions ....................................................................................... 92 2.2.2. Función barrera del epitelio ................................................................... 93 2.2.3. Función barrera del endotelio ................................................................ 94 2.3. Evaluación de la fisiología corneal. Técnicas indirectas ........................................ 97 2.3.1. Microscopía especular ........................................................................... 98 2.3.2. Paquimetría ultrasónica ......................................................................... 98 2.3.3. Microscopía confocal ............................................................................. 99 2.3.4. Tomografía de coherencia óptica .......................................................... 99 2.3.5. Topografía de elevación ...................................................................... 101 2.3.6. Topografía de Scheimpflug ................................................................. 102 2.3.7. Uso de la fluoresceína en la evaluación ocular ................................... 103 2.4. Evaluación de la fisiología corneal. Técnicas directas ......................................... 105 2.4.1. Fluorofotometría .................................................................................. 106 2.4.2. Resistencia eléctrica transepitelial ...................................................... 108 2.5. Córnea y lentes de contacto. Edema corneal con LC hidrofílicas ........................ 111 2.5.1. Propiedades de las LC ........................................................................ 112 2.5.2. Edema corneal inducido por el porte de LCH ...................................... 113 CAPÍTULO 3. BIOIMPEDANCIA CORNEAL 3.1. Introducción. Descripción de la técnica ................................................................ 117 3.1.1. Bases electrofisiológicas ..................................................................... 118 3.1.2. Equipo y proceso de medida ............................................................... 122 3.1.3. Validación de la técnica. Resultados previos en modelo animal ......... 124 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 3 3.2. Estudio I. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial en modelo animal ................................................................................................................ 125 3.2.1. Introducción ......................................................................................... 126 3.2.2. Hipótesis y objetivos ............................................................................ 126 3.2.2.1. Hipótesis ............................................................................. 126 3.2.2.2. Objetivos ............................................................................. 126 3.2.3. Material y métodos .............................................................................. 127 3.2.3.1. Animales ............................................................................. 127 3.2.3.2. Lentes de contacto ............................................................. 127 3.2.3.3. Instrumentación .................................................................. 128 3.2.3.4. Procedimiento ..................................................................... 128 3.2.3.5. Criterio de edema ............................................................... 131 3.2.3.6. Análisis histopatológico ...................................................... 132 3.2.3.7. Análisis estadístico ............................................................. 132 3.2.3.8. Instalaciones ....................................................................... 134 3.2.4. Resultados ........................................................................................... 134 3.2.4.1. Detección de diferencias en la paquimetría y en el edema inducido ............................................................................. 134 3.2.4.2. Detección de diferencias en la permeabilidad epitelial ....... 136 3.2.4.3. Tinción epitelial y evaluación histopatológica ..................... 138 3.2.5. Discusión ............................................................................................. 140 3.2.5.1. Cambios inducidos por el porte de LC ................................ 141 3.2.5.2. Puntos fuertes y limitaciones .............................................. 143 3.2.5.3. Conclusiones ...................................................................... 145 3.3. Estudio II. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial y endotelial. Prueba de concepto en humanos ................................................................... 147 3.3.1. Introducción ......................................................................................... 148 3.3.2. Hipótesis y objetivos ............................................................................ 149 3.3.2.1. Hipótesis ............................................................................. 149 3.3.2.2. Objetivos ............................................................................. 149 3.3.3. Material y métodos .............................................................................. 150 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 4 3.3.3.1. Sujetos ................................................................................ 150 3.3.3.2. Lentes de contacto ............................................................. 152 3.3.3.3. Instrumentación .................................................................. 152 3.3.3.4. Procedimiento ..................................................................... 153 3.3.3.5. Criterio de edema ............................................................... 157 3.3.3.6. Análisis estadístico ............................................................. 157 3.3.3.7. Instalaciones ....................................................................... 158 3.3.4. Resultados ........................................................................................... 159 3.3.4.1. Muestra ............................................................................... 159 3.3.4.2. Valoración de la seguridad del dispositivo .......................... 160 3.3.4.3. Detección de diferencias en la paquimetría corneal ........... 162 3.3.4.4. Detección de diferencias en la paquimetría epitelial .......... 164 3.3.4.5. Detección de diferencias en la permeabilidad epitelial ....... 166 3.3.4.6. Detección de diferencias en la permeabilidad endotelial .... 166 3.3.4.7. Correlaciones ...................................................................... 168 3.3.5. Discusión ............................................................................................. 171 3.3.5.1. Seguridad de la técnica de medida de bioimpedancia corneal ............................................................................... 173 3.3.5.2. Permeabilidad epitelial ........................................................ 174 3.3.5.3. Permeabilidad endotelial .................................................... 176 3.3.5.4. Puntos fuertes y limitaciones .............................................. 176 3.3.5.5. Conclusiones ...................................................................... 178 CAPÍTULO 4. ASIMETRÍA DEL ESPESOR CORNEAL 4.1. Introducción. Diferencias anatómicas. Centro Vs periferia ................................... 183 4.1.1. Definición de la zona central y periférica de la córnea ........................ 184 4.1.2. Diferencias en el espesor corneal ....................................................... 185 4.1.3. Relevancia clínica del espesor corneal periférico ............................... 185 4.1.4. Otras diferencias entre el centro y la periferia de la córnea ................ 186 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 5 4.1.5. Espesor corneal periférico y edema inducido por el uso de LC .......... 187 4.2. Estudio III. Asimetría del espesor corneal: porte de LC a corto plazo .......... 189 4.2.1. Introducción ......................................................................................... 190 4.2.2. Hipótesis y objetivos ............................................................................ 190 4.2.2.1. Hipótesis ............................................................................. 190 4.2.2.2. Objetivos ............................................................................. 191 4.2.3. Material y métodos .............................................................................. 191 4.2.3.1. Sujetos ................................................................................ 191 4.2.3.2. Lentes de contacto ............................................................. 192 4.2.3.3. Instrumentación .................................................................. 192 4.2.3.4. Procedimiento ..................................................................... 194 4.2.3.5. Criterios de edema y asimetría ........................................... 196 4.2.3.6. Análisis estadístico ............................................................. 198 4.2.3.7. Instalaciones ....................................................................... 199 4.2.4. Resultados ........................................................................................... 199 4.2.4.1. Muestra ............................................................................... 199 4.2.4.2. Medida basal del espesor corneal central y periférico y asimetrías corneales ........................................................................ 200 4.2.4.3. Diferencias en la paquimetría y edema del espesor corneal central y periférico ........................................................................... 202 4.2.4.4. Diferencias en la asimetría centro - periferia y en la asimetría nasal - temporal ............................................................... 204 4.2.5. Discusión ............................................................................................. 208 4.2.5.1. Puntos fuertes y limitaciones .............................................. 211 4.2.5.2. Conclusiones ...................................................................... 213 4.3. Estudio IV. Asimetría del espesor corneal: porte de LC a medio plazo ........ 215 4.3.1. Introducción ......................................................................................... 216 4.3.2. Hipótesis y objetivos ............................................................................ 217 4.3.2.1. Hipótesis ............................................................................. 217 4.3.2.2. Objetivos ............................................................................. 217 4.3.3. Material y métodos .............................................................................. 217 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 6 4.3.3.1. Sujetos ................................................................................ 218 4.3.3.2. Lentes de contacto ............................................................. 218 4.3.3.3. Instrumentación .................................................................. 218 4.3.3.4. Procedimiento ..................................................................... 219 4.3.3.5. Criterios de edema y asimetría ........................................... 221 4.3.3.6. Análisis estadístico ............................................................. 221 4.3.3.7. Instalaciones ....................................................................... 222 4.3.4. Resultados ........................................................................................... 223 4.3.4.1. Muestra ............................................................................... 223 4.3.4.2. Medida basal del espesor corneal central y periférico y asimetrías corneales ........................................................................ 223 4.3.4.3. Diferencias en la paquimetría y edema del espesor corneal central y periférico ........................................................................... 225 4.3.4.4. Diferencias en la asimetría centro - periferia y en la asimetría nasal - temporal ............................................................... 227 4.3.4.5. Comparación Pentacam Vs Galilei ..................................... 230 4.3.5. Discusión ............................................................................................. 232 4.3.5.1. Comparación Pentacam Vs Galilei ..................................... 234 4.3.5.2. Puntos fuertes y limitaciones .............................................. 237 4.3.5.3. Conclusiones ...................................................................... 239 CAPÍTULO 5. SÍNTESIS FINAL 5.1. Resumen global .................................................................................................... 243 5.2. Relevancia clínica y perspectivas futuras ............................................................. 247 5.3. Conclusiones ........................................................................................................ 251 BIBLIOGRAFÍA Referencias ................................................................................................................ 253 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 7 ANEXOS Anexo I. Patente internacional número WO 2011/107645 PCT/ES2011/070131: ‘‘Sensor no invasivo para determinar características funcionales de la córnea, dispositivo que incluye dicho sensor y su uso’’ ........................................................... 265 Anexo II. Manual de usuario CORBI ........................................................................... 287 Anexo III. Inocuidad del sensor flexible R5868-O2 en experimentales realizados en conejos de experimentación ........................................................................................ 293 Anexo IV. Hoja de información para el sujeto para el estudio ‘‘Evaluación de la sensibilidad del dispositivo de medida de la bioimpedancia corneal (dispositivo CORBI)’’ ...................................................................................................................... 299 Anexo V. Consentimiento informado para el estudio ‘‘Evaluación de la sensibilidad del dispositivo de medida de la bioimpedancia corneal (dispositivo CORBI)’’ .................. 303 Anexo VI. Hoja de información para el sujeto para el estudio ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’ ............................................................. 307 Anexo VII. Consentimiento informado para el estudio ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’ ............................................................. 311 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 14 Tabla 3.16. Resumen de las medidas de bioimpedancia endotelial (media ± DS), obtenidas con el equipo de medida de bioimpedancia corneal CORBI, para las tres visitas del estudio ........................................................................................................ 167 Tabla 4.1. Grupos del ‘‘Estudio III. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a corto plazo’’ .......................................................................................................................... 195 Tabla 4.2. Fórmulas empleadas para calcular la diferencia absoluta y el índice relativo de progresión entre el centro y la periferia de la córnea ............................................. 196 Tabla 4.3. Fórmulas empleadas para calcular la diferencia absoluta y el índice relativo de progresión entre la periferia nasal y la periferia temporal de la córnea .................. 197 Tabla 4.4. Nomenclatura para la diferencia absoluta e índice relativo de progresión (IRP) en función de las localizaciones ......................................................................... 197 Tabla 4.5. Espesor corneal basal en las cinco localizaciones estudiadas .................. 200 Tabla 4.6. Diferencias absolutas (µm) e IRP (%) entre el espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) ............................... 201 Tabla 4.7. Espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) del grupo de ojos que no portó LC (grupo control) ....................... 202 Tabla 4.8. Espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) del grupo de ojos que portó LC de alto Dk ................................... 203 Tabla 4.9. Espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) del grupo de ojos que portó LC de bajo Dk .................................. 203 Tabla 4.10. Edema corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) de los tres grupos de ojos (grupo control, grupo alto-Dk y grupo bajo-Dk) después de 40 minutos de porte de las LC .................................................. 204 Tabla 4.11. IRP entre las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) del grupo de ojos que no portó LC (grupo control) ...................................................................... 205 Tabla 4.12. IRP entre las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) del grupo de ojos que portó LC de alto Dk (grupo alto-Dk) ......................................................... 205 Tabla 4.13. IRP entre las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) del grupo de ojos que portó LC de bajo Dk (grupo bajo-Dk) ....................................................... 206 Tabla 4.14. IRP de las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) de los tres grupos de ojos (control, alto-Dk y bajo-Dk) después de 40 minutos de porte ............. 207 Tabla 4.15. Grupos del ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’ ................................................................................................................ 220 Tabla 4.16. Espesor corneal basal en las cinco localizaciones estudiadas para la muestra total del estudio ............................................................................................. 224 Tabla 4.17. Diferencias absolutas (µm) e IRP (%) entre el espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) ............................... 225 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 15 Tabla 4.18. Espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) del grupo de ojos que portó LC de bajo Dk (grupo bajo-Dk) ........ 226 Tabla 4.19. Espesor corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) del grupo de ojos que portó LC de alto Dk (grupo alto-Dk) .......... 226 Tabla 4.20. Edema corneal central (CCT), periférico nasal (N4 y N5) y periférico temporal (T4 y T5) de los dos grupos de ojos (grupo alto-Dk y grupo bajo-Dk) después de 7 días de porte prolongado de las LC .................................................................... 227 Tabla 4.21. IRP entre las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) del grupo de ojos que portó LC de alto Dk (grupo alto-Dk) ......................................................... 228 Tabla 4.22. IRP entre las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) del grupo de ojos que portó LC de bajo Dk (grupo bajo-Dk). ...................................................... 228 Tabla 4.23. IRP de las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) de los dos grupos de ojos (grupo alto-Dk y grupo bajo-Dk) después de 7 días de porte prolongado de las LC ..................................................................................................................... 229 Tabla 4.24. Diferencias de las medidas basales obtenidas con el topógrafo Pentacam (Estudio III) y con el topógrafo Galilei (Estudio IV), en todas las localizaciones estudiadas (CCT, N5, N4, T5 y T4) ............................................................................. 230 Tabla 4.25. Diferencias de las medidas basales obtenidas con el topógrafo Pentacam (Estudio III) y con el topógrafo Galilei (Estudio IV), en todas las relaciones estudiadas entre el centro y la periferia (N5/CCT, N4/CCT, T5/CCT, T4/CCT) y la periferia nasal y temporal (N5/T5, N4/T4) .............................................................................................. 231 !! ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 16 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 17 LISTA DE FIGURAS ! Figura 1. Esquema de la organización de la memoria de tesis .................................... 11 Figura 2.1. Estructura de la córnea .............................................................................. 85 Figura 2.2. Imagen del epitelio corneal humano obtenida mediante microscopía óptica (40x). (Cortesía del laboratorio de Anatomía Patológica Ocular, IOBA) ....................... 86 Figura 2.3. Imagen del endotelio corneal humano obtenida mediante microscopía especular ....................................................................................................................... 89 Figura 2.4. Representación de la función barrera del epitelio corneal. Las tight junctions regulan el paso de moléculas a través de los espacios paracelulares .......... 93 Figura 2.5. Representación de la función barrera y bomba metabólica del endotelio corneal. Ambas funciones colaboran para mantener en equilibrio la relativa deshidratación de la córnea. ......................................................................................... 95 Figura 2.6. Representación de la regulación de la fisiología corneal en una córnea normal (izquierda) y en una córnea edematizada (derecha). Cuando la función barrera del endotelio corneal falla, permite una mayor filtración desde la cámara anterior hacia el estroma. La función de la bomba NA+-K+ no es capaz de contrarrestar esta alteración, y el equilibrio entre ambas funciones se pierde, lo que provoca edema corneal. (Srinivas, S. 2010) ........................................................................................... 96 Figura 2.7. Representación de la colocación de los electrodos necesarios para llevar a cabo la medida del TER en modelo animal in vivo. (Uematsu, M. 2007) .................... 109 Figura 3.1. Esquema del comportamiento de la corriente eléctrica a diferentes frecuencias al atravesar una capa celular. Línea discontinua: bajas frecuencias (<1 KHz), la corriente circula por el medio extracelular. Línea continua: altas frecuencias (>100 KHz), la corriente atraviesa la pared celular y el medio intracelular. Frec = frecuencia. (Adaptación de Ivorra, A. 2002) ................................................................ 119 Figura 3.2. Equipo de medida de la bioimpedancia corneal CORBI. Este dispositivo permite tomar y almacenar datos de forma automática, que posteriormente serán transferidos mediante conexión tipo bluetooth a un ordenador para su análisis. Su funcionamiento se detalla en el Manual de Usuario CORBI (ANEXO II) .................... 122 Figura 3.3.A. Imagen del sensor de medida de la bioimpedancia corneal listo para su aplicación sobre la córnea. Consta de un cabezal para su correcta manipulación y conexión al equipo de medida CORBI ........................................................................ 123 Figura 3.3.B. Esquema del apoyo del sensor flexible sobre la superficie corneal (Adaptación de Guimerà, A. 2013) .............................................................................. 123 Figura 3.4. Imagen de la medida de bioimpedancia epitelial. Se observa la aplicación del sensor sobre la superficie corneal del conejo.. ...................................................... 130 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 18 Figura 3.5. Representación de los valores de impedancia para los ojos control y los ojos que llevaron LC para las tres visitas del estudio: medida basal, medida después de un día con la LC, y medida después de 7 días con la LC. Los valores se representan como la media de cada grupo.. ............................................................... 138 Figura 3.6. Imágenes de la evaluación de la superficie corneal mediante tinción con fluoresceína en la observación con lámpara de hendidura y luz azul cobalto (A y C), e imágenes de microscopía óptica de la evaluación histopatológica (B y D). Imágenes A y B = ojo control. A nivel macroscópico (A) no se aprecia tinción por fluoresceína en la superficie ocular. A nivel histopatológico (B) no se observan alteraciones. Imágenes C y D = ojo tras 7 días de porte de LC. A nivel macroscópico (C) se aprecia un parche de tinción por fluoresceína (úlcera). A nivel histopatológico (D) se observa una bulla intraepitelial (separación de las células del epitelio) secundaria a edema. ................. 139 Figura 3.7. Imagen de la medida de la bioimpedancia corneal, donde se puede observar la aplicación del sensor de medida sobre la superficie corneal del sujeto. Arriba: imagen frontal. Abajo: imagen de perfil.. ......................................................... 155 Figura 3.8. Imágenes de la evaluación de la superficie corneal mediante tinción con fluoresceína y observación con lámpara de hendidura y luz azul cobalto del ojo que presentó queratopatía punteada superficial tras 3 días (B) y 7 días (C) de porte de una LC de bajo Dk (Etafilcon A) respecto del momento inical del estudio (A, imagen basal). Las imágenes fueron siempre tomadas inmediatamente después de realizar la medida de bioimpedancia ........................................................................................................ 161 Figura 3.9. Correlación entre permeabilidad epitelial y edema epitelial ..................... 169 Figura 3.10. Correlación entre permeabilidad epitelial y edema corneal total ............ 169 Figura 3.11. Correlación entre permeabilidad endotelial y edema corneal total ......... 170 Figura 3.12. Correlación entre edema epitelial y edema corneal total ....................... 170 Figura 4.1. Distribución de las tres zonas en que se divide la córnea ........................ 184 Figura 4.2. Representación de las cinco localizaciones donde se recogieron los valores de paquimetría corneal ................................................................................... 193 Figura 4.3. Representación esquemática de los momentos de medida del ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’. Las medidas se obtuvieron en dos momentos diferentes: antes de adaptar las LC (medida basal) y después de 7 días de porte prolongado de las LC (medida final), coincidiendo con las visitas 2 y 4 del ‘‘Estudio II. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial y endotelial en modelo humano’’ ...................................................................................................................... 220 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 19 ABREVIATURAS ANOVA BAC CCT CL CORBI D Dk Dk/t DS F FDA HEMA IC IRP KHz LoA LC LCH LCHC LCHSi LCPMMA LCRPG mm nm NA+ - K+ N4 N4 / CCT N4 / T4 N5 Análisis de la Varianza Cloruro de benzalconio Central corneal thickness / Espesor corneal central Contact lens Corneal - Bioimpedance (equipo de medida) Dioptría Permeabilidad al oxígeno Transmisibilidad al oxígeno Desviación estándar Faradio U.S. Food and drug administration Hidroxietil metacrilato Intervalo de confianza Índice relativo de progresión Kilohercio Límite de acuerdo Lente de contacto Lente de contacto hidrofílica Lente de contacto de hidrogel convencional (HEMA) Lente de contacto de hidrogel de silicona Lente de contacto de polimetil metacrilato Lente de contacto rígida permeable a los gases Milímetro Nanómetro Bomba metabólica sodio - potasio Periferia nasal, a 4 mm del centro de la córnea Ratio entre el centro y la periferia nasal a 4 mm del centro Ratio entre la periferia nasal y temporal a 4 mm del centro Periferia nasal, a 5 mm del centro de la córnea ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 20 N5 / CCT N5 / T5 OCT P PMMA SPSS TER TJ T4 T4 / CCT T5 T5 / CCT µm Ratio entre el centro y la periferia nasal a 5 mm del centro Ratio entre la periferia nasal y temporal a 5 mm del centro Tomografía de coherencia óptica (siglas en inglés) Pachymetry / Paquimetría Polimetil metacrilato Statistical Package for Social Science Translayer electrical resistance Tight Junctions o uniones estrechas Periferia temporal, a 4 mm del centro de la córnea Ratio entre centro y periferia temporal a 4 mm del centro Periferia temporal, a 5 mm del centro de la córnea Ratio entre centro y periferia temporal a 5 mm del centro Micrómetro ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 21 ENGLISH SUMMARY 1. MOTIVATION AND ORGANIZATION 1.1. MOTIVATION It is well known that corneal morphology and physiology are altered by the use of contact lenses (CL). The impact of CL wear on the ocular surface is a subject that has been studied intensively by clinicians and researchers. At a morphological level, one of the most studied changes induced by CL wear is the increase in the thickness of the cornea, known as corneal oedema. The degree of oedema is classically determined by calculating the percentage of change in corneal thickness after using CL, and is accepted as a parameter to assess its impact on the cornea and determine the safety of CL use. In the clinical practice, the measurement of the corneal oedema is usually obtained from the central location of the cornea, which means that the effect of the CL wear on the peripheral thickness is less understood. It has recently been postulated that any corneal oedema induced by hydrophilic CL (HCL) wear is evenly distributed between the centre and the periphery of the cornea.1 However, this is a controversial point since different studies have presented various hypotheses relating to the regional distribution of oedema (e.g. across different corneal regions), as will be described below. Furthermore, the progression of corneal thickening from the centre to the periphery and the pachymetric differences (asymmetry) between the nasal and the temporal periphery have rarely been taken into account in previous studies that aimed to evaluate the corneal oedema after CL use. One of the objectives of this thesis is to assess and quantify the impact of HCL wear on corneal thickness not only in terms of the percentage of change (oedema), but also by studying the behavior of the asymmetry at different points of the corneal ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 22 topography. This study would provide new knowledge that could help elucidate the mechanisms of corneal oedema induced by the use of CL. At a physiological level, it is accepted that the cornea swells when the mechanisms that maintains the level of corneal dehydration fails, resulting in an increase in corneal thickness and consequently loss of transparency.2 The responsibility for maintaining this level of dehydration falls on the corneal endothelium, which has an active (metabolic) as well as a passive (barrier) function. The primary aim of these functions is to maintain the balance between the fluids on both sides of the cornea – anterior chamber boundary. Disruptions of the endothelial function may lead to an imbalance in fluid exchange and a consequent thickening of the cornea occurs. There is only one technique currently available for the direct assessment of the barrier function of the corneal endothelium in humans in vivo, namely fluorophotometry. It basically consists on the instillation of fluorescein anteriorly and posterior measurement of the amount of fluorescein in cornea and anterior chamber by non-invasive optical methods. This technique has a number of disadvantages that will be detailed below, which make it an unreliable and not popular technique. Nevertheless, it remains being the only available tool to evaluate not only the barrier function of the corneal endothelium but also the barrier function of the corneal epithelium in humans in vivo. It seems reasonable to look for new technologies to quantitatively determine the status of the barrier function of the corneal endothelium and epithelium, which can be applied not only to the evaluation of CL users but also to study different endothelial abnormalities such as dystrophies, evaluate the suitability of donated corneas for transplantation or monitoring of patients undergoing any type of surgery likely to cause corneal oedema. A different approach for the quantification of the barrier function of these layers is by the study of the passive electrical properties of the cornea.4 Unfortunately, the investigations conducted to date in this area cannot be transferred to the clinical practice in humans due to the invasive nature of the method. However, a new technique, corneal bioimpedance, has recently been proposed. This method, which is based on the passive electrical properties of the cornea, can be used to determine the permeability of the corneal epithelium and endothelium non-invasively in vivo in animal models. One objective of this thesis was to evaluate the ability of this method to detect changes induced by the use of HCL in an animal model in vivo, and the safety and efficacy of the technique in a human model in vivo. The application of this new tool to the ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 23 study of the epithelial and endothelial barrier function in humans in vivo would enhance the understanding of the physiological mechanisms that produce corneal oedema as a response to hypoxia induced by the use of HCL. In summary, in this thesis HCL-induced corneal oedema will be studied using two different approaches: (1) the classic approach with a focus on morphological changes of the cornea (analyzing regional differences in corneal oedema, with the aim to clarify the controversy relating to the distribution of the oedema between centre and periphery); and (2) a novel and innovative approach with a focus on the physiology of the cornea (using the corneal bioimpedance technique to evaluate changes in corneal permeability after HCL wear and determining its safety in humans). 1.2. ORGANIZATION This Doctoral thesis applies for the International-awarded Doctorate Degree. It has been organized under the regulations of the International Doctorate Committee of the University of Valladolid, including a general summary in English and providing a certificate of stay of three months length at the Vision Sciences unit of the Department of Life Sciences at Glasgow Caledonian University in Glasgow, UK. This summary is structured as follows: • Chapter 1: Organization. The structure of the English summary is presented. • Chapter 2: Background. Overview of the relevant characteristics of the corneal morphology and physiology, corneal evaluation techniques and corneal oedema induced by CL wear. • Chapter 3: Corneal bioimpedance. Basic concepts to understand the workings of this technique, which is able to measure the permeability of the corneal layers in a non-invasive way and in vivo, are presented. Two different studies are summarized regarding the use of corneal bioimpedance (1) ‘‘Study of the corneal epithelial permeability in a contact lens animal model’’ and (2) ‘‘Study of the corneal epithelial and endothelial permeability in a contact lens human model’’. The main purpose ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 30 3.2. STUDY OF THE CORNEAL EPITHELIAL PERMEABILITY IN A CONTACT LENS ANIMAL MODEL The purpose of the present study was to present a proof of concept of the application of this novel technique based on the bioimpedance measurement for the non-invasive in vivo assessment and quantification of CLinduced changes in the rabbit corneal epithelium barrier function.!! 3.2.1. Methods 3.2.1.1. Animals A total of 20 New Zealand White rabbits were included in the experiment. All of the animals were treated according to the guidelines produced by the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) when using animals in Ophthalmic and Visual Research and under the supervision of the University of Valladolid Institutional Committee for Animal Care and Use. 3.2.1.2. Procedure A prospective study involving two study groups (n=10 each) was defined to analyse CL-induced changes in rabbit corneal epithelium permeability after one day (Group 1) and seven days (Group 2) of extended CL wear. In the baseline visit, all animals were anaesthetized with an intramuscular injection of 50 mg/kg of ketamine (Imalgene 1000®, Merial) and 7 mg/kg of Xylazine (Rompun®, Bayer), prior to any measurement or CL fit. Baseline measurements of the epithelial impedance were collected previous to any other procedure. To accomplish this, a prototype was used following the described procedure in previous works.109,110 Then, baseline measurements of the central corneal thickness were collected with an ultrasound pachymeter (Sonogage Corneo-Gage Plus, Cleveland, OH, USA). After baseline impedance and pachymetry measurements were collected, a single CL was randomly fitted in each animal (see below). At the end of the visit, ten rabbits were randomly assigned to Group 1 (one day of CL wear) and the other ten animals to Group 2 (seven days of CL wear). ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 31 After one day of CL wear (Group 1) and seven days of CL wear (Group 2) a second epithelial impedance and central corneal pachymetry readings were taken immediately after CL removal (and under the same intramuscular anaesthesia). The corneal epithelium was also examined with a slit-lamp biomicroscope under blue cobalt light after the instillation of topical fluorescein on both eyes in search for detectable corneal epithelial alterations. Animals were then euthanized by an intravenous injection of 200 mg/kg of pentobarbital (Dolethal Vetoquinol)® and their eyes were immediately enucleated and the corneas removed for histopathological analysis. 3.2.1.3. Lenses A low Dk CL (Vasurfilcon A, +10.00 D, Dk=38, Precision UV, Ciba Vision, Duluth, GA, USA) was randomly fitted to one eye of each animal and the fellow eye served as a control. Low Dk ensures corneal hypoxia and hence possible changes in the epithelium permeability. After CL fitting, a complete closure of the palpebral aperture by sutures (6-0, Mersilk®; Ethicon, France) was used to enhance the hypoxic effect and improve CL retention. 3.2.1.4. Histopathological analysis All corneas were examined histologically by conventional optical microscopy by a masked pathology specialist. Corneas were fixed in 10% neutral-buffered formalin (Panreac, Spain), routinely processed and then embedded in paraffin. Multiple serial sections (3 µm) were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and examined in an automated upright microscope (LEICA DM 4000 B, Leica, Germany). A normal distribution and composition of the epithelium was evaluated and compared with corneal staining results. 3.2.1.5. Data analysis Statistical analysis was performed using SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistical package for Windows. The Saphiro-Wilk test was used to assess the normality of the data distribution. Appropriate parametric tests were used to assess differences. Descriptive statistics were generated. A student paired t-test was used to detect differences between control eyes and CL-wearing eyes. Analyses of variance with post hoc comparisons (ANOVA with Bonferroni correction) were used to detect differences between the baseline visit, after one day of CL wear and after ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 32 seven days of CL wear for both the control eyes and the CL-wearing eyes in pachymetry and corneal epithelial permeability. A p value < 0.05 was considered statistically significant. 3.2.2. Results 3.2.2.1. Corneal swelling Corneal pachymetry is summarized in table II. No statistical significant differences were found between control eyes and CL-wearing eyes in baseline visit for pachymetry (p=0.208 Student paired t-test). However, after one day (Group 1) and seven days (Group 2) of CL wear, corneal pachymetry and corneal swelling significantly increased for the CL-wearing eyes (p<0.001 ANOVA with Bonferroni correction), showing also significant differences respect to the Control eyes in both groups (p<0.001 Student paired t-test). Baseline Group 1 (1 day of CL wear) Group 2 (7 days of CL wear) P† Control eyes Pachymetry (µm) % corneal swelling 375 ± 0.15 - 373 ± 0.14 -1.53±4.09% 375 ± 0.17 -0.71±4.47% 0.348 0.140 CL-wearing eyes Pachymetry (µm) % corneal swelling 374 ± 0.11 - 462 ± 0.30 26.58±9.56% 535 ± 1.36 42.46±36.96% <0.001 <0.001 P* Pachymetry (µm) % corneal swelling 0.208 - <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 Table II. Pachymetric results for the Control eyes and the CL-wearing eyes for the baseline visit and after one day (Group 1) and seven days (Group 2) of CL wear. P*: Student's paired t-test. P†: ANOVA with Bonferroni correction. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 33 3.2.2.2. Epithelial staining and histopathology evaluation ! Corneas of the control eyes showed no sign of corneal staining (figure IV.A), with little evidence of epithelial damage using optical microscopy in histopathological evaluation (figure IV.B). However, corneas of the CLwearing eyes showed clinical signs of epithelial staining (figure IV.C), with clear alteration of the epithelium layer using histopathological evaluation (figure IV.D). ! Figure IV. Images from the fluorescein staining test (figures A and C) and its correspondent optical microscopy from histopathological evaluation (figures B and D). A and B: images of a control eye; C and D: images of a CL-wearing eye after seven days of CL use. 3.2.2.3. Corneal epithelial permeability ! Epithelial impedance values are summarized in table III. Control eyes showed no statistically significant differences along the study (between baseline, Group 1 and Group 2) in epithelial permeability (p=0.884 ANOVA with Bonferroni correction). However, CL-wearing eyes showed a initial decrease in the epithelial permeability after one day of CL wear (Group 1), to steeply ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 34 increase after seven days of CL wear (Group 2) (p<0.001 ANOVA Bonferroni correction). Basal values of impedance measurements (epithelial permeability) showed no statistical significant differences between control eyes and CLwearing eyes (p=0.222 Student paired t-test). After one day (Group 1) and seven days (Group 2) of CL wear, statistical significant differences were found for the epithelial permeability between both the control eyes and the CL-wearing eyes (p<0.001 and p<0.05 respectively. Student paired t-test). !! Baseline Group 1 (1 day of CL wear) Group 2 (7 days of CL wear) P† Control eyes Impedance (Ω) -1451.99 ± 396.72 -1472.81 ± 405.60 -1464.29 ± 355.36 0.884 CL-wearing eyes Impedance (Ω) -1495.24 ± 377.20 -1833.77 ± 377.88 -1265.18 ± 929.33 <0.001 P* 0.222 <0.001 <0.05 Table III. Epithelial impedance results for the Control eyes and the CL-wearing eyes for the baseline visit and after one day (Group 1) and seven days (Group 2) of CL wear. P*: Student's paired t-test. P†: ANOVA with Bonferroni correction. 3.2.3. Discussion Corneal swelling after CL wear is widely reported in the literature.49,113 It has been also been shown that epithelial permeability increases when it is subjected to hypoxic conditions, both when examined by TER measurements in vitro114,115 or by fluorophotometric methods in vivo.77,116 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 35 The only method currently available to assess the human epithelial permeability in vivo is by measuring the penetration rate of fluorescein dye into the cornea. Duench77 has recently shown that daily wear of high-Dk CL (Betafilcon A) increases the epithelial permeability to fluorescein. An increase of the epithelial permeability represents a threat to the maintenance of the corneal health and homeostasis, as it is susceptible to microbial infections that could lead to a loss of corneal transparency and hence visual impairment. Accordingly, knowing the state of the epithelial barrier function is a major issue for the eye-care community. Unfortunately, there is a lack of techniques that are capable of detecting and quantifying changes in the physiology of the corneal epithelium in vivo as a result of CL wear. A new tool to evaluate corneal epithelial permeability changes after the application of different concentrations of benzalkonium chloride in vivo in a rabbit model has recently been validated.110 In the present study this novel tool has been used for the first time to detect and quantify the corneal epithelium permeability alterations secondary to HCL induced hypoxia. Control eyes The control eyes showed no statistically significant differences throughout the experiment with respect to any of the anatomical or physiological indicators measured. Therefore, it can be assumed that any differences observed in the CL-wearing eyes along the experiment time can be attributed to the effects of CL wear. Changes observed in CL-wearing eyes As expected, corneal thickness increased moderately after one day of CL and drastically after seven days of CL wear. Epithelial staining and histopathologic evaluation also showed the epithelium affected. However, an ongoing debate exists about what is actually stain by fluorescein, and therefore what corneal staining represents,102,118 raising concerns about the reliability of the technique in epithelial examination. Epithelial conductivity decreased after one day of CL wear, which means that the epithelial permeability decreases. As the permeability of the epithelial layer is directly related to extracellular space,119,120 the latter may decrease as a consequence of cell swelling, which has been described after ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 36 soft CL-induced hypoxia.121 There is some controversy in this respect, as some authors have reported corneal epithelial thinning after soft CL wear,121 corneal epithelial thickening,123 or even no changes at all in the epithelial thickness after soft CL wear.124 After seven days of CL wear epithelial conductivity showed an increase with respect to values after one day of CL wear, also exceeding the basal values. This increase in permeability of the epithelial layer suggests that the damage induced to the corneal epithelium due to CL wear over seven days is sufficient to break the tight junctions between the epithelial cells. This is indicated by the fact that the current can pass more easily through the extracellular gaps induced, and therefore induce corneal swelling. The latter may be explained by an additive effect of direct breakdown of the epithelial barrier and ensuing fluid penetration from the ocular surface to the early dysfunction of the corneal endothelium and consequent stromal hydration from the aqueous humour. This study has several strengths. It has shown for the first time that epithelial permeability can decrease in the early stages of the process that comprise the epithelial response to hypoxic conditions (when wearing CL). The study has also shown that at any subsequent time points (still to be determined) the epithelial tight junctions cannot longer resist and hence the epithelial permeability increases. Our results confirm previous findings77,114-116 by performing an in vivo evaluation of the corneal epithelium based on bioimpedance measurements. However, this new impedance technique also has limitations. Further studies and the confirmation of a robust correlation between the results of in vivo evaluation of the corneal epithelium based on impedance measurements and those based on other technologies would support the transfer of this technology into the clinical practice. Additionally, the absence of normative data limits the results of the current investigation to the finding of statistically significant differences between only the specific groups and times evaluated. Efforts should be directed toward elucidating the mechanical basis of the corneal response and alterations in epithelial barrier function secondary to CL wear, any corneal surgery or the effects of eye drops medications. In conclusion, our results suggest that in vivo evaluation of the corneal epithelium based on impedance measurements allows non-invasive and quantitative assessment of the epithelium barrier function. Data of healthy and oedematous corneas obtained with this method in the present study are in concordance with results obtained by pachymetry evaluation, fluorescein ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 37 staining and histopathology (optical microscopy). Further studies are needed to analyse the relationship between the epithelial permeability changes to the extracellular spaces in the tissue and to the tight junctions function. Developing new tools to help researchers and eye-care practitioners in acquiring quantitative information to have direct access to an in vivo study of the changes in corneal physiology would permit an innovation in the diagnosis and management of some corneal pathologies, improvement in early diagnosis, prevention of corneal disease, a change in the current method of corneal assessing and an opportunity for the eye-care community to obtain a deeper understanding of the physiology of the cornea. Future applications of this new technique in clinical practice include the assessment and follow up of the epithelial barrier function changes secondary to CL wear, postoperative assessments after ocular surgery; and the evaluation of the impact of CL care solutions including ophthalmic preservatives on the corneal surface. 3.3. STUDY OF THE CORNEAL EPITHELIAL AND ENDOTHELIAL PERMEABILITY IN A CONTACT LENS HUMAN MODEL In this work, the same novel non-invasive method based on the study of the passive electrical properties of the cornea (in terms of corneal bioimpedance) was used to measure quantitatively the state of the human corneal barrier function in vivo. The results of previous studies109,110 and those obtained in the study 3.2. of this thesis concluded that this method is able to detect minimal alterations in the permeability of the rabbit corneal barriers in a safe way. In the present study, the safety and efficacy of this bioimpedance prototype was assessed for the first time in human corneas under in vivo conditions. 3.3.1. Methods The safety and efficacy of the proposed sensor to assess the human corneal epithelium and endothelium permeability were evaluated in this work. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 38 Approval was granted by the Human Sciences Ethics Committee of the University of Valladolid and the Spanish Agency for Medicines and Medical Devices (AEMPS) of the Ministry of Health, Social Services and Equality of Spain. ! ! 3.3.1.1. Subjects Ten right eyes from ten volunteers were included in this pilot study. Healthy subjects with no history of anterior segment disease and with no history of ocular surgery were included. No CL use was allowed seven days before the beginning of the study. The full nature of the study was explained to participants and informed consent was obtained from each subject. All of the subjects were treated in accordance with the tenets of the Declaration of Helsinki. 3.3.1.2 Lenses A low-Dk CL (Etafilcon A, Dk= 28, Acuvue 2, Johnson & Johnson, Jacksonville, FL) or a high-Dk CL (Lotrafilcon B, Dk= 110, Air Optix Aqua, Ciba Vision, Duluth, GA) was randomly fitted in the right eye of each subject. The differences in the Dk of these CL ensure different levels of hypoxia to develop and thus different degrees of corneal swelling and permeability changes. 3.3.1.3. Instrumentation Evaluation of corneal health was carried out with the slit-lamp biomicroscope SL-8z (Topcon Medical Systems Inc., Paramus, NJ, USA) and fluorescein dye under blue cobalt light. Images were captured for each subject at every visit. Central corneal thickness (CCT) and epithelial corneal thickness (EPC) were monitored with the 3D OCT-2000 (Topcon Medical Systems Inc., Paramus, NJ, USA). Epithelial and endothelial bioimpedance measurements were monitored throughout the study: previous to CL wear and after three days and one week of extended (overnight) CL wear; with a prototype of the bioimpedance analysis system. The instrument consists on the placement of a sensor on the corneal surface to perform the measurements (figure V). One drop of double anaesthetic Colircusí® (tetracaíne 0.1% and oxybuprocaine ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 39 0.4%) was instilled in each eye before placing the sensor onto the ocular surface. The sensor electrodes have to be in contact with the corneal surface to perform the non-invasive bioimpedance measurements. It takes ten seconds approximately to perform every measurement. The same experimented operator (ADR) took all SL-8z images, the 3D OCT-2000 measurements and the bioimpedance measurements throughout the study. Figure V. Image captured during a measurement of corneal bioimpedance, where it can be seen the application of the sensor on the corneal surface of the subject. Above: front view. Bottom: side view. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 46 fluorophotometry is a concern. It has been reported to be a time-consuming,79 with a low repeatability,80 and in need of further refinement to make it a useful clinical tool.72,81 The inconsistencies between studies when using this method confirm these limitations. McNamara84 reported an average increase of 41% in the epithelial permeability after one hour of HCL use with the eyes closed, while Lin85 found no changes in the epithelial barrier function in their study in subjects that wore HCL for one hour with their eyes closed. Regarding the endothelium, Dutt86 reported a significant increase of the endothelial permeability in a group of CL wearers (with an average of four years of wear) versus a control group. However, Bourne87 found no changes on the endothelial barrier function in a group of CL wearers (with at least five years of wear) versus a control group. Finally, Chang78 showed a decrease of the endothelial permeability when comparing two groups of CL wearers (regarding the years of CL wear) versus a control group. From these findings it could be concluded that fluorophotometry, despite being the only tool available to assess the epithelial and endothelial barrier function in vivo, has a limited clinical value and hence the eye care community needs a more reliable technique capable to detect and monitor changes on the permeability of the corneal layers. This investigation was conceived in order to establish the safety and efficacy of a new method based on the study of the passive electrical properties of the cornea (corneal impedance) to measure in a quantitative way the state of the human corneal barriers function in vivo. 3.3.3.1. Safety The first concern of this study was to establish if the placement of the sensor on the corneal surface (to perform the impedance measurement) would impair the integrity of the corneal epithelium. Results showed no signs of corneal epithelial injury secondary to the placement of the sensor on the corneal surface after slit-lamp evaluation. Slight superficial punctuate keratopathy was found in some of the low-Dk CL eyes, attributable to the CL use. This confirms the safety of this tool to be used in the clinical practice as a non-invasive technique. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 47 3.3.3.2. Efficacy Epithelial permeability (as measured as the epithelial impedance) showed no statistically significant changes throughout the study for high-Dk or low-Dk CL. However, a modest decrease in epithelial permeability (which could be interpreted as an improvement on the epithelial barrier function) was noted for the eyes that wore a low-Dk CL. Accordingly, epithelial pachymetry showed no significant changes during the three visits of the study, although a trend toward the thinning of the epithelium was found for those low-Dk CL eyes. These findings are in accordance with the study of Lin85 who found the same trend towards the decrease of the epithelial permeability (no statistically significant) in eyes that wore a soft high-Dk CL during one hour. They could not explain at that moment the reason why the epithelial barrier function seemed to improve, giving some kind of protective effect to the fact of wearing high-Dk CL. In this thesis it has also been monitored the epithelial thickness, showing a thinning trend for the epithelium. These results suggests that the extracellular space in the epithelium decreases due to cell swelling and therefore does the permeability of the epithelial layer, as the current finds more trouble to pass across the tissue. Endothelial permeability showed no statistically significant differences between the baseline measurements and those obtained after three and seven days of CL use, independently of the CL used; neither between highDk or low-Dk CL. However, the correlation found between the increased endothelial permeability and the corneal oedema suggests that, although not significant for one week of CL wear, the use of CL affects the endothelial permeability deteriorating its function. This finding is explained by a loss of cohesion of the endothelial structure and a loss of tight junctions between the cells, induced by the hypoxia secondary to CL wear. These alterations directly affect the electrical properties of the corneal endothelium and increase its electrical conductivity, as the current can pass through the extracellular gaps that are induced. 3.3.3.3. Applicability Further investigation is needed to determine the state of the corneal epithelial and endothelial barrier function in long-term CL wearers, as well as to determine the range of values for healthy, non CL-wearing subjects. Future applications of this technique include the evaluation of the function of these layers when planning corneal surgery, assessing the suitability of a donor ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 48 cornea for transplantation, or monitoring endothelial dysfunction or corneal disease. The bioimpedance prototype has to be more robust for its clinical implementation. 3.3.3.4. Strengths and limitations This work has several strengths, including proof that it is possible to measure and quantify the corneal epithelial and endothelial permeability of the human cornea in vivo in a non-invasive way using impedance measurements. Two different types of CL were used to induce different permeability changes in the cornea. Other strengths are extended wear of the CL during one week, and the parallel assessment of the central corneal thickness and epithelial thickness. The study is limited by the small sample of subjects participating in it (as a pilot study) and the lack of previous work with this method in humans to compare results and evaluate accuracy. 3.3.3.5. Conclusion In summary, this study provides for the first time a quantitative assessment of the permeability of the epithelial and endothelial layers of the human cornea in vivo. A novel non-invasive method was successfully used to assess electrical corneal properties, making the measurement of the corneal impedance a potential diagnostic and monitoring tool in the future. The method has been shown to be safe and effective in detecting changes in the corneal permeability after CL wear. The results presented may be refined by improving the repeatability and reliability of the impedance system, and establishing the range for normal values. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 49 4. CORNEAL ASYMMETRY 4.1. ANATOMICAL DIFFERENCES BETWEEN CENTRAL AND PERIPHERAL CORNEA Although at a macroscopic level the corneal structure seems to be similar in dimensions and organization along its entire surface, there are considerable differences between the central and the peripheral regions of the tissue. In this chapter, the most relevant anatomical differences between the two areas will be described, with special attention to differences in corneal thickness between the central and peripheral cornea. 4.1.1. Definition of central and peripheral cornea There is no clear definition of the different regions of the corneal surface.8 A commonly used concept refers to the corneal geography as three distinct areas, using the corneal apex as the central reference point (figure VII). This thesis will be concentrated on just two of these areas: central and peripheral cornea. Figure VII. Distribution of the three corneal regions. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 50 4.1.2. Central and peripheral corneal thickness differences The first and most striking difference between both areas of the cornea is that its thickness progressively increases from the apex to the limbus. The cornea has an average thickness of 535 µm in the centre8 and 672 µm in the periphery8 (area outside the 4 central mm). However, this increase in thickness is not symmetrical from the centre towards the periphery, existing an asymmetric thickening where the superior zone is the thicker, followed by the nasal, inferior and temporal zones.140 If measured along the horizontal meridian, the nasal area at 4 mm from the apex is approximately 21% thicker than the central area, while the temporal area at the same distance from the apex is just 19% thicker than the centre.141 Despite this marked difference in the corneal thickness between central and peripheral cornea, only central corneal thickness (CCT) is routinely measured clinical practice. However, the measurement of the thickness at the periphery of the cornea could provide useful information when evaluating, monitoring, and treating corneal diseases such as keratoconus,142 systemic sclerosis (which results in thickening of the central area of the cornea without thickening at the periphery),143 herpex simplex infections (which produces a deeper and more painful damage on the corneal periphery),144 or measurement of intraocular pressure (which is influence by the mid-peripheral thickness).145 It is also important to assess the peripheral corneal thickness when preparing the evaluation of patients undergoing corneal surgery and subsequent postoperative monitoring, such as in intrastromal ring surgery,146 limbal relaxing incisions,146 refractive surgery,147 penetrating keratoplasty,147 or corneal crosslinking (which is less effective at the periphery than at the corneal centre).148 4.1.3. Other anatomical differences In addition to the thickness, there are other differences between the centre and the periphery of the cornea. This is the case for the anterior radii of curvature and refractive power,149 corneal innervation,150 nutrition and defence,151 and cell density in epithelium,152 stroma154 and endothelium.156 ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 51 4.1.4. Corneal peripheral thickness and oedema induced by CL wear Given the anatomical differences between the central and peripheral corneal regions it seems possible that the corneal response to CLinduced hypoxia also differs in magnitude between both areas or between different peripheral locations. Previous studies have provided contradictory conclusions: (1) the central cornea swells to a greater extent than the peripheral cornea,38,124,158-164 (2) the peripheral cornea swells more than the central cornea,164-166 and (3) the entire cornea swells equally.1,166-169 These results seem to be independent from the respective study design. Both short-term (between two and eight hours with CL)124,158,159,162164,166,169 and medium-long term studies (at least one week with CL)1,38,160,161,165,167,168 have shown different corneal responses. This makes it difficult to establish the possible relationship between the CL wearing time and the resultant corneal response to hypoxia (early response versus chronic response), in terms of topographic distribution of the oedema over the cornea. Previous studies of the IOBA Optometry Research Group (University of Valladolid) found a uniform distribution of the corneal oedema induced after one week with HCL, i.e. the same oedematous response was noted for the corneal centre and the corneal periphery.1 4.2. STUDY OF THE CORNEAL THICKNESS ASYMMETRY IN A SHORT-PERIOD OF TIME CONTACT LENS WEAR MODEL Due to the uncertainty with regard to the degree and location of CLassociated corneal oedema at central and peripheral regions it seems reasonable to propose new studies to help clarify this issue. One aim of these studies was to provide further information on the mechanisms underlying the corneal response to CL-induced hypoxia. No previous study has assessed how the oedema affects the asymmetry in the thickness between the nasal and temporal periphery, so deepen into this issue would lead to a better understanding of corneal structure and responses to adverse conditions such as hypoxia. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 52 4.2.1. Methods This work formed part of a multicentre research project between the Vision Sciences unit of the Department of Life Sciences at Glasgow Caledonian University and the IOBA – Eye Institute at University of Valladolid. The University of Valladolid financed the stay of an investigator (ADR) at Glasgow Caledonian University for three months with a grant under the ‘‘Support for short collaboration visits during the development of a doctoral thesis’’ scheme. The protocol was approved by the Ethics Committee for Clinical Research of the University of Valladolid. ! ! 4.2.1.1. Subjects Twenty volunteers were included in this study. Healthy subjects with no history of anterior segment disease and with no history of ocular surgery were included. No CL use was allowed seven days before the beginning of the study. The nature of the study was explained to participants and informed consent was obtained from each subject prior to participation. All of the subjects were treated in accordance with the tenets of the Declaration of Helsinki. 4.2.1.2 Lenses A low-Dk CL (Etafilcon A, Dk= 28, Acuvue 2, Johnson & Johnson, Jacksonville, FL) and a high-Dk CL (Lotrafilcon B, Dk= 110, Air Optix Aqua, Ciba Vision, Duluth, GA) were selected for use in the study. The differences in the Dk of these CL ensure different levels of hypoxia and thus different degrees of corneal swelling to develop. 4.2.1.3. Instrumentation Evaluation of the corneal pachymetry was carried out with the Pentacam Scheimpflug Topographer (Oculus Optikgeräte GmbH, Wetzlar, Germany). The high reliability of the central and peripheral corneal thickness measurements for this device has been reported in several previous studies.170172 For each corneal pachymetry measure, three consecutive reading were obtained and the average of the three measurements was used as the final value. The same experimented operator (ADR) took the measurements as ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 53 recommended by the manufacturer and collected the values for each corneal pachymetry measurement at five different corneal locations (figure VIII). Figure VIII. Representation of the five different locations where corneal pachymetry values where collected. CCT: central corneal thickness (geometrical centre of the cornea). N4, N5: nasal corneal thickness at 4 and 5 mm from the CCT. T4, T5: temporal corneal thickness at 4 and 5 mm from the CCT. To evaluate regional differences in corneal oedema between these five different locations the ratio between peripheral and central corneal thickness was calculated and the pachymetric data was considered in relative terms. The ratio was calculated by dividing the thicker (peripheral) by the thinner (central) location (N5/CCT, N4/CCT, T5/CCT, T4/CCT, N5/T5 and N4/T4). The index obtained is the rate of progression for the corneal pachymetry from the centre to the periphery of the cornea, or between the nasal and temporal periphery, and will subsequently be referred to as the relative peripheral index or IRP (Spanish acronym). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 54 4.2.1.4 Procedures This prospective, randomized, double-masked, clinical study was conducted within two study visits. In the first visit (visit 1), the full nature of the study was explained to participants and informed consent was obtained from each subject prior to any procedure. Then, evaluation of the corneal surface and basal measurements for corneal thickness were taken. A low-Dk or high-Dk CL was then randomly fitted in one eye of each subject. The contralateral eye served as a control. A correct CL fit was confirmed, and subjects were asked to attend the following visit (40 minutes after the visit 1). The second visit (visit 2) was scheduled after 40 minutes of CL wear. First, corneal health was assessed. Then the CL was removed and corneal thickness measurements obtained. Corneal health evaluation was established by searching for signs of damage or alteration attributable to the CL use. 4.2.1.5 Data analysis Statistical analysis was performed using the SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistical package for Windows. The Saphiro-Wilk test was used to test the normality of the data distribution. Appropriate parametric tests were used to assess differences. Descriptive statistics were generated. A student paired t-test was used to detect differences between the baseline visit and after 40 minutes of CL wear. Analyses of variance with post hoc comparisons (ANOVA with Bonferroni correction) were used to detect differences between control (non-CL-wearing contralateral eyes), high-Dk and low-Dk CL-wearing eyes (control group, highDk group and low-Dk group). A p value <0.05 was considered statistically significant. 4.2.2. Results Forty eyes from 20 volunteers were included in this study (14 women; six men). The mean age was 26.7 ± 4.4 years (range: 21 to 34 years). The mean spherical equivalent refraction was -1.33 ± 1.92 D (range: +0.50 to - 6.00 D). Seven participants were regular users of CL (six of them were using ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 55 HCL, the other one was using RGPCL). All of them discontinued CL use at least seven days before the beginning of the study. 4.2.2.1. Corneal health evaluation The slit-lamp examination of the corneal surface did not reveal any keratopathy or sign of damage attributable to the CL wear. 4.2.2.2. Central and peripheral corneal thickness Corneal thickness changes (CL-induced oedema) are summarized in table VI. Statistically significant differences (p<0.01 ANOVA with Bonferroni correction) were found for all the locations studied (CCT, N5, N4, T5 and T4) between the low-Dk CL group and the other two groups. Control group and high-Dk CL group showed no differences on corneal swelling. Oedema (%) ± SD Control group High-Dk CL group Low-Dk CL group P* N5 -0.82 ± 1.17 -0.50 ± 1.29 1.61 ± 1.33 <0.01 N4 -0.53 ± 1.11 -0.51 ± 0.88 1.62 ± 1.24 <0.01 CCT -0.45 ± 0.99 -0.66 ± 0.77 1.08 ± 1.60 <0.01 T4 -0.79 ± 1.31 -0.48 ± 1.38 1.20 ± 1.62 <0.01 T5 -1.12 ± 1.56 -0.30 ± 1.44 1.67 ± 1.95 <0.01 Table VI. Central and peripheral corneal oedema for the three groups: control (nonCL-wearing contralateral eyes), high-Dk and low-Dk; after 40 minutes of CL wear. SD = standard deviation. P*: ANOVA with Bonferroni correction. Statistically significant differences were found between the control and the low-Dk groups, and between the high-Dk and the low-Dk groups. No statistical significant differences (p>0.05 student’s paired t-test) were found between the basal IRP and after 40 minutes of CL wear IRP measurements for the control, high-Dk and low-Dk groups (table VII). No statistical significant differences (ANOVA with Bonferroni correction) were found between groups after 40 minutes of CL wear for the IRP between different corneal locations (table VIII). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 62 Three consecutive corneal pachymetry measurements were obtained, using the average of the three measurements for analysis. The same experimented operator (ADR) took the measurements as recommended by the manufacturer and collected the values for each corneal pachymetry measurement at the same five different corneal locations as described in the previous study 4.2. (figure VIII). The same criteria were used to evaluate differences in the corneal response to hypoxia at the five locations along the horizontal meridian (the pachymetric data was considered in relative terms by dividing the thicker location by the thinner location: N5/CCT, N4/CCT, T5/CCT, T4/CCT, N5/T5 and N4/T4, obtaining the IRP). 4.3.1.4 Procedures This prospective, randomized, double-masked, clinical study involved two study visits. The present study was carried out in parallel to the development of the study 3.2, by additionally obtaining the central and peripheral corneal pachymetry of the subjects included in the study with the Galilei topographer. The additional measurements were carried out at two different times of the study 3.2: (1) the baseline measure (visit 1) was performed before fitting CL and (2) the final assessment (visit 2) was performed after seven days of extended CL wear. For the analysis, eye were categorised and allocated to one of two groups based on the CL type used (high-Dk or low-Dk). 4.3.1.5. Data analysis Statistical analysis was performed using SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistical package for Windows. The Saphiro-Wilk test was used to test the normality of the data distribution. Appropriate parametric tests were used to assess differences. Descriptive statistics were generated. A student paired t-test was used to detect differences between the baseline visit and after seven days of CL wear. A student paired t-test were used to detect differences between high-Dk and lowDk CL-wearing eyes. A p value <0.05 was considered statistically significant. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 63 4.3.2. Results Twenty eyes from ten volunteers were included in this study (six women; four men). The mean age was 25 ± 2.7 years (range: 20 to 28 years). The mean spherical equivalent refraction was -2.40 ± 2.67 D (range: +0.50 to - 7.25 D). Four participants were regular users of CL (three of them were using HCL, the other one was using RGPCL). All of them discontinued CL use at least 7 days before the beginning of the study. 4.3.2.1. Corneal health evaluation The examination of the corneal surface revealed one case of superficial punctual keratopathy attributable to the wear of the low-Dk CL. 4.3.2.2. Central and peripheral corneal thickness Results for the oedema induced are summarized in table IX. Statistical significant differences (p>0.05 ANOVA with Bonferroni correction) were found for all the locations studied except for N5 between the high-Dk and low-Dk CL groups. Oedema (%) ± SD High-Dk CL group Low-Dk CL group P* N5 2.05 ± 2.99 2.84 ± 2.91 0.577 N4 0.47 ± 2.23 3.75 ± 2.48 <0.01 CCT -0.05 ± 2.77 3.75 ± 3.67 <0.01 T4 0.65 ± 2.12 2.74 ± 2.62 <0.01 T5 0.49 ± 3.19 1.47 ± 2.33 <0.01 Table IX.!Central and peripheral corneal oedema for both study groups (high-Dk and low-Dk) after seven days of CL wear. SD = standard deviation.! P*: Student's paired t-test. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 64 No statistical significant differences (p>0.05 student’s paired t-test) were found between the basal IRP and after seven days of CL wear IRP measurements for both high-Dk and low-Dk groups (table X). No statistical significant differences (p>0.05 student’s paired t-test) were found between groups after seven days of CL wear for the IRP between different corneal locations (table XI), except for the N5 location. IRP (%) ± SD Basal 7 days P* High-Dk CL group N5 / CCT 1.34 ± 0.03 1.36 ± 0.04 0.149 N4 / CCT 1.22 ± 0.02 1.23 ± 0.03 0.624 T5 / CCT 1.24 ± 0.03 1.24 ± 0.03 0.833 T4 / CCT 1.12 ± 0.02 1.13 ± 0.03 0.529 N5 / T5 1.09 ± 0.03 1.10 ± 0.03 0.235 N4 / T4 1.08 ± 0.02 1.08 ± 0.03 0.911 Low-Dk CL group N5 / CCT 1.32 ± 0.03 1.31 ± 0.05 0.334 N4 / CCT 1.21 ± 0.02 1.21 ± 0.03 0.962 T5 / CCT 1.24 ± 0.04 1.20 ± 0.04 0.085 T4 / CCT 1.13 ± 0.02 1.12 ± 0.03 0.412 N5 / T5 1.07 ± 0.04 1.08 ± 0.04 0.378 N4 / T4 1.08 ± 0.02 1.09 ± 0.02 0.380 Table X. Differences between the IRP (relative peripheral index) along the study time for all the studied locations (CCT, N5, N4, T5 and T4) in both groups (high-Dk and lowDk). SD = standard deviation. P*: Student's paired t-test. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 65 IRP (%) ± SD High-Dk CL group Low-Dk CL group P* N5 / CCT 1.36 ± 0.04 1.31 ± 0.05 0.041 N4 / CCT 1.23 ± 0.03 1.21 ± 0.03 0.402 T5 / CCT 1.24 ± 0.03 1.20 ± 0.04 0.170 T4 / CCT 1.13 ± 0.03 1.12 ± 0.03 0.251 N5 / T5 1.10 ± 0.03 1.08 ± 0.04 0.420 N4 / T4 1.08 ± 0.03 1.09 ± 0.02 0.770 Table XI. Differences in the IRP (relative peripheral index) after seven days of CL wear for all the studied locations (CCT, N5, N4, T5 and T4) for both groups (high-Dk and low-Dk). SD = standard deviation. P*: Student's paired t-test. 4.3.3. Discussion Differences between the central and peripheral (horizontal meridian) corneal oedema were assessed in the study described in chapter 4.2. after a short-period of time (40 minutes) of HCL wear. The results suggested a uniform corneal oedema distribution throughout the corneal topography of the tissue. However, a major limitation of the study was the short-term nature of the followup. While such assessments help to elucidate short-term structural changes and potentially biomechanical mechanisms of the corneal response to hypoxia during the early stages of oxygen deprivation, they do not represent standard conditions CL wearing conditions. Therefore, a similarly structured study with a longer follow-up and extended CL wearing pattern has been performed. In the present study (4.3), corneal oedema has been evaluated by assessing changes in IRP at different corneal locations after one week of extended HCL wear (without removing the lenses during sleep). The CL types used were the same as in study 4.2. The results of the present study showed that the IRPs remained stable after seven days of extended HCL wear (either high-Dk or low-Dk). These results essentially confirm the short-term findings of study 4.2. (40 minutes of wear), suggesting that hypoxia induced by a medium-term period ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 66 (one week) of CL wear affects the centre and the periphery (horizontal axis) of the cornea equally. Both types of CL (high-Dk and low-Dk) have shown the same trend to induce a uniform thickening at all corneal locations assessed, although it has been noted that the low-Dk CL led to a significantly higher oedema at all locations except for N5, where oedema was not statistically different between high-Dk and low-Dk lenses. These differences between both lens types are attributed to the different oxygen permeability of each material. These results agree with studies published by Sanders,168 who monitored corneal oedema during six weeks of conventional HCL wear, Lowther,169 who monitored oedema during six months of conventional HCL wear, and Martin,1 who evaluated oedema after one week of conventional and silicone HCL wear. These three studies have concluded that the oedema is equally distributed in the centre and in the periphery of the cornea. In contrast, Bonanno38,161 showed that corneal oedema was greater centrally than peripherally after two, four, six and 12 weeks of conventional HCL wear. As a possible explanation the author suggested that corneal peripheral areas receive oxygen from the limbal vessels, which leads to less hypoxia in the periphery and a greater degree of hypoxia and associated oedema centrally. Another possible cause given by the author is the anatomical differences in the transitional zone between the cornea and sclera. The higher endothelial cell density in the periphery than in the centre may contribute to the lower degree of peripheral oedema. The only reference found in the literature describing greater peripheral oedema is the work published by Kaluzny,165 who monitored corneal oedema caused by conventional HCL (etafilcon A) during two, four, and six weeks of wear. The author attributes this finding to the negative refractive power of the CL used in the study, providing a lower Dk/t in the peripheral than in the central zone, which results in less oxygen transmission to the most peripheral regions of the cornea. A limitation of the present study is the relatively small number of participants. Therefore the results should be evaluated cautiously, and any conclusions drawn should be carefully interpreted. ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 67 4.3.3.1. Pentacam Vs Galilei Comparison Two different topographers have been used to study differences between central and peripheral (horizontal meridian) corneal oedema after 40 minutes (Pentacam Scheimpflug topographer, in ‘‘Study of the corneal thickness asymmetry in a short-period of time contact lens wear model’’) and seven days (Galilei Dual Scheimpflug topographer, in ‘‘Study of the corneal thickness asymmetry in a medium-period of time contact lens wear model’’) of CL wear. Comparing baseline pachymetry values obtained from the different locations (CCT, N5, N4, T5 and T4), statistically significant differences (all peripheral locations) were noted for data obtained with the two types of corneal topographers (N5, N4, T5 and T4). This suggests that both systems may not be used interchangeably for assessments of peripheral corneal topography; further and more detailed analysis would be required to clarify it. These differences could explain the differences in N5/CCT, N4/CCT, T5/CCT, T4/CCT IRPs between both topographers. Measurements for the centre of the cornea (CCT) have yielded no statistically significant differences between both devices. Previous studies have found similar results, noting a good agreement on CCT measurements between different techniques and disagreement on peripheral pachymetry measurements.177-180 It seems that the range of differences between two different systems is not constant along the corneal topography, and is progressively larger moving from the centre to the periphery of the cornea.178,181-183 Additionally, lower repeatability is usually found in the corneal periphery measurements in comparison with those of the corneal centre.184,185 These findings suggest that the accuracy of the different devices to obtain measurements of peripheral corneal thickness is uncertain, which shows the unawareness of the true corneal thickness beyond the central area. Several options have been recently considered as possible reasons that could explain differences between the instruments: (1) in the case of Galilei Dual Scheimpflug topographer the superposition of images in the central cornea is greater than in the periphery due to the rotation of the camera around the optical axis. This leads to a considerable decrease of the measured data points from the central to the peripheral cornea.140 (2) The use of unstable reference points (e.g. the pupil centre rather than the corneal apex),186 and (3) scan of the vertical ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 68 meridian may due to artefacts such as partial lid coverage (upper and lower peripheral cornea).170,187 4.3.3.2. Strengths and limitations This study presents an important advancement over the previous work (central and peripheral corneal response to hypoxia induced after 40 minutes of HCL wear). This study has not been limited to the assessment of the immediate response of the cornea to hypoxia, but has extended the initial work by investigations involving measurements of corneal pachymetry after seven days of extended HCL wear, a situation that may resemble much more closely the actual pattern of CL user in patients. However, further studies are required in long-term CL users to assess the evolving response of the corneal topography after several years of CL adaptation and to evaluate if the corneal morphology retains its proportions, e.g. between the centre and the periphery of the cornea, and between the nasal and temporal periphery. As in the study described in section 4.2, this work has assessed the corneal response not only at the centre, but also at four locations of the corneal peripheral topography, (4 and 5 mm from the corneal apex to nasal and temporal periphery). However, the imaging instruments available today can provide information from almost any point of the corneal surface, so a more exhaustive study of the oedema could be performed not only at four points of the periphery of the horizontal meridian but including the entire map of the cornea. The methodology used to conduct this study, which differs from other works found in the literature, provides a new approach in the field. Instead of using absolute differences by comparing corneal thickness changes (percentages) at each location, the study determined the relative variation in the proportion between corneal thickness at different locations, by calculating an index that directly determines how substantial this variation is. An important limitation of this work is the relatively small size of the sample, limiting the statistical power of the study and therefore reducing the precision of the results. The reason for the limited number of subjects was that the study was designed as part of study 3.3. (which was a first proof of concept, and so a small sample was considered to perform it). ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 69 Finally, inclusion of the contralateral eye into the study (in which each subject wore CL in both eyes), may be controversial. ,Previous studies have described a possible sympathetic effect of an eye over the other in the corneal oedema induced.188,189 4.3.3.3. Conclusion In conclusion, corneal oedema induced after seven days of high-Dk (Lotrafilcon B - Dk=110) or low-Dk CL (Etafilcon A - Dk=28) wear is similarly evenly distributed between the corneal centre and the corneal periphery (horizontal meridian). The asymmetry between the central, nasal and temporal regions does not appear to undergo substantial variations in response to up seven days of extended CL wear. As expected, the data has shown that low-Dk lenses induce significantly more oedema than high-Dk lenses at all locations, except for N5. Despite the significant increase on corneal pachymetry of CCT, N5, N4 and T4 after seven days of extended low-Dk CL wear, the corneal proportions remained stable, suggesting a uniform distribution of the corneal oedema over its surface. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 70 5. SYNTHESIS Nowadays, corneal morphology can be evaluated by a wide variety of techniques that make the process of evaluation quick and easy. However, despite the huge advancement in imaging technology over the past decades, the need for new tools allowing the complete understanding of the corneal physiology is evident. Slit-lamp evaluation of the cornea has been practiced since 1911, when Gullstrand introduced its use in clinical practice (more than 100 years ago). The corneal anatomy can be assessed and pathological signs or corneal abnormalities identified. Since the introduction of slit-lamp biomicroscopy, corneal evaluation has evolved from an assessment of its general health to the acquisition of noninvasive and in vivo permeability measures of the corneal epithelium and endothelium; and it is likely that technology will continue to advance. New and better devices will facilitate even more detailed examination of the cornea, providing further insights into its structure and function.. The ultimate goal continues to be to provide the best care to patients in the clinical practice. This thesis aims to contribute to the study of corneal responses to CL wear. In order to achieve this aim, a series of projects that included the assessment of both the physiological response (epithelium and endothelium permeability) and the morphological response (change in thickness) of the cornea after HCL wear has been carried out. To evaluate the physiological response of the cornea to HCL wear, the effectiveness of the corneal bioimpedance technique in animal model (rabbits), after one and seven days of HCL use was assessed first. The results, although controversial, appear to be biologically plausible and, above all, show that the equipment for measuring corneal bioimpedance is sensitive and capable of detecting epithelial permeability changes induced by HCL. Secondly, the safety and effectiveness of this novel non-invasive tool was assessed in humans, using a strategy of three and seven days of CL wear and of two different types of CL with different Dk/t characteristics. The results showed no statistically significant changes in the permeability of either the epithelium or the endothelium, which is not surprising since both types of lenses were approved by the FDA (U.S. Food and Drug Administration) for extended ! Capítulo 0 ! ! ! ! ! 71 (etafilcon A, up to seven days) and continued wear (lotrafilcon B, up to 30 days). However, future studies are needed to determine the mechanisms related to the permeability of the corneal epithelium and its thinning when using HCL. To evaluate the morphological response, the distribution of the corneal thickness changes (oedema) was evaluated at five different locations of the corneal topography (CCT, N4, N5, T4 and T5), in order to help clarify whether corneal oedema induced by HCL wear is homogeneously distributed between the central and the peripheral cornea. For this, corneal response after 40 minutes (short-term response) and seven days (medium-term response) of two different Dk/t HCL wear was studied. In summary, the results showed a uniform distribution of corneal oedema, both short and medium-term response and for both high and low-Dk lenses. These results may help to elucidate the controversy surrounding this issue. In conclusion, further studies are needed to develop new technology to complement the existing methods to better define changes of the corneal physiology and biomechanics, in order to enhance patient care, facilitate clinical decision-making and to improve the methodology and knowledge about the interactions between cornea and CL. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 78 detectar cambios secundarios a la hipoxia inducida por el uso de LC en modelo animal y la seguridad de la técnica en humanos in vivo, valorando la posible transferencia de esta tecnología a la práctica clínica para analizar los cambios en la función barrera epitelial y endotelial que provoca el uso de LC. La aplicación de esta nueva herramienta al estudio de la función barrera del epitelio y endotelio corneal en humanos in vivo permitiría profundizar en el conocimiento de los mecanismos fisiológicos que producen edema corneal como respuesta a la hipoxia inducida por el uso de LC. En resumen, en este trabajo se estudia el edema corneal provocado por el porte de LC desde dos enfoques diferentes; uno más clásico, desde el punto de vista anatómico (analizando las diferencias en la respuesta corneal en distintas zonas de su topografía e intentando aclarar la controversia existente sobre la respuesta corneal central y periférica secundaria al porte de LC) y otro más innovador, intentando un abordaje desde el punto de vista funcional (aplicando una nueva tecnología para evaluar los cambios en la permeabilidad de las barreras corneales ocurridos por el uso de LC y determinando su seguridad en humanos). Los resultados de este trabajo aportan evidencia científica de primer nivel (evidencia tipo I-II),5 que podría utilizarse para incluir recomendaciones clínicas en protocolos, guías clínicas, y pautas de adaptación de LC entre otros; aumentando la seguridad de los usuarios de LC. ! Capítulo 1 ! ! Introducción ! ! ! 79 1.2. Hipótesis HIPÓTESIS Los cambios producidos en la fisiología corneal inducidos por el uso de lentes de contacto hidrofílicas de distinta permeabilidad pueden evaluarse in vivo de manera segura analizando los cambios en la función barrera epitelial y endotelial empleando la medida de la bioimpedancia. Así mismo, los cambios producidos en la morfología corneal secundarios al uso de lentes de contacto hidrofílicas de distinta permeabilidad no modifican la distribución paquimétrica de la córnea en el centro y la periferia, distribuyéndose el edema de manera homogénea por la topografía corneal. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 80 ! Capítulo 1 ! ! Introducción ! ! ! 81 1.3. Objetivos OBJETIVOS 1. Determinar la capacidad de la técnica de medida de la bioimpedancia corneal para detectar cambios en la permeabilidad epitelial en conejos inducidos por el porte de LCH. 2. Determinar la seguridad de la técnica de medida de la bioimpedancia corneal en humanos in vivo. 3. Determinar la capacidad de la técnica de medida de la bioimpedancia corneal para detectar cambios en la permeabilidad del epitelio y del endotelio corneal humano inducidos por el porte de LCH de diferente permeabilidad al oxígeno. 4. Evaluar la distribución topográfica del edema corneal inducido por el uso de LCH de diferente permeabilidad al oxígeno durante un corto plazo de porte, y establecer si el edema se reparte homogéneamente entre centro y periferia o se acentúa más dependiendo de la zona corneal. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 82 5. Evaluar la distribución topográfica del edema corneal inducido por el uso de LCH de diferente permeabilidad al oxígeno durante un medio plazo de porte, y establecer si el edema se reparte homogéneamente entre centro y periferia o se acentúa más dependiendo de la zona corneal. ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 83 2 ESTADO ACTUAL DEL TEMA ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 84 ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 85 2.1. Anatomía de la córnea ESTRUCTURA corneal La córnea es el elemento con mayor poder refractivo del ojo, contribuyendo aproximadamente con 43 de las 60 dioptrías (D) del sistema óptico ocular, por lo que aporta algo más del 70% de la refracción total.6 En un humano adulto mide aproximadamente 11 mm en el meridiano vertical y 12 mm en el meridiano horizontal,7 y su radio anterior de curvatura es de 7,8 mm de media.6 La córnea tiene un grosor aproximado de 535 µm8 y está conformada por 5 capas diferentes: el epitelio, la lámina de Bowman, el estroma, la membrana de Descemet y el endotelio (figura 2.1). En esta sección se describirán brevemente las principales características de su morfología. Figura 2.1. Estructura de la córnea. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 86 2.1.1. Epitelio El epitelio corneal (figura 2.2) es la capa que limita la córnea con el medio ambiente, por la tanto es la más externa de todas y la que está en contacto con la lágrima y la atmósfera. Cuenta con un grosor medio de entre 50 y 60 µm (aproximadamente el 10% del espesor total de la córnea).7 Está compuesta por 5-7 capas de células, principalmente de tres tipos diferentes: una única fila de células basales, 2 o 3 filas de células aladas y otras 2 o 3 filas de células superficiales.9 Las células basales del epitelio corneal poseen función mitótica, lo que supone una constante renovación de las mismas.10 Las células que proliferan se diferencian y migran hacia filas más superficiales para reemplazar a las dañadas o muertas. El ciclo de vida aproximado de una célula epitelial desde que nace, migra y muere es de entre 7 y 14 días,11 lo que supone una gran ventaja para mantener un epitelio sano rápida y constantemente. Figura 2.2. Imagen del epitelio corneal humano obtenida mediante microscopía óptica (40x). (Cortesía del laboratorio de Anatomía Patológica Ocular, IOBA) Esta capa tiene por un lado una función protectora para el ojo al impedir el paso de agentes patógenos para el medio ocular12 y por otro el de absorber oxígeno y otros nutrientes necesarios para llevar a cabo las funciones metabólicas que tienen lugar en el tejido corneal.13 También es importante que ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 87 mantenga una homogeneidad a lo largo de toda su superficie, contribuyendo a la estabilización de la película lagrimal, para evitar la degradación de la imagen óptica y consecuente pérdida de calidad visual.14 2.1.2. Lámina de Bowman Situada a continuación del epitelio se encuentra la lámina de Bowman, que tiene un grosor medio de entre 8 y 12 µm,7 y va adelgazando con la edad hasta perder un tercio de su grosor aproximadamente.15 Es una estructura acelular, compuesta por fibras de colágeno y matriz extracelular.16 Aunque su rol no está completamente dilucidado, se cree que esta capa se encarga de proteger la inervación subepitelial, acelerar la recuperación sensorial del epitelio o impedir la afectación estromal en patologías como la insuficiencia límbica, el pterigium o tumores epiteliales.17 De cualquier manera se cree que tiene una función superflua, ya que es una capa que carece de capacidad regenerativa y existen estudios que confirman la estabilidad del resto de tejido corneal a pesar de su ausencia (debido a traumatismos o cirugías).18 2.1.3. Estroma La siguiente capa corneal es el estroma, que comprende aproximadamente el 90% del total del grosor corneal19 (tomando como referencia un grosor corneal total de aproximadamente 535 µm,8 el espesor del estroma sería de unas 480 µm). Está compuesto por una matriz extracelular formada por queratocitos distribuidos entre las fibras de colágeno (principalmente de tipo I) regularmente ordenadas en láminas paralelas.7 Ésta regular estructura es la responsable de que la córnea produzca una mínima ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 94 Afortunadamente, las células epiteliales proliferan rápida y continuamente.10 Este proceso cíclico de renovación de epitelio corneal se traduce en un mantenimiento continuo de su función de barrera (apartado 2.1.1.). 2.2.3. Función barrera del endotelio El endotelio corneal es la capa que tapiza la córnea por su parte interna, separando el estroma de la cámara anterior. Su función consiste en mantener el estado normal de relativa deshidratación de la córnea y, consecuentemente, la transparencia de este tejido necesaria para que en su conjunto cumpla su función óptica.21 Para llevar a cabo su función, el endotelio corneal se comporta como una membrana parcialmente permeable al paso de diferentes moléculas en ambas direcciones: desde la cámara anterior hacia el estroma (función pasiva o barrera) y desde el estroma hacia la cámara anterior (función activa o bomba metabólica)35 (figura 2.5). Ambas funciones son complementarias y necesarias, conduciendo hacia un equilibrio entre la cantidad de agua que entra y sale del estroma y evitando por la tanto la edematización del tejido estromal. En el caso de la función pasiva o función barrera del endotelio, al igual que sucede con el epitelio, ésta se debe a las fuertes uniones intercelulares que se encuentran en la zona apical de las células endoteliales o TJ.28 Su función es la de presentar resistencia y por tanto regular el paso de solutos y agua hacia el estroma a través de la vía intercelular, sin embargo no se trata de una barrera completamente impermeable, pues el paso de ciertas ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 95 sustancias es necesario para la llegada de nutrientes al estroma desde la cámara anterior.36 Figura 2.5. Representación de la función barrera y bomba metabólica del endotelio corneal. Ambas funciones colaboran para mantener en equilibrio la relativa deshidratación de la córnea. En la dirección opuesta, desde el estroma hacia la cámara anterior, actúan las bombas metabólicas de las células endoteliales (conocidas como bombas NA+-K+) que se encargan de equilibrar el paso de fluidos hacia el estroma.35 Para el correcto funcionamiento de esta bomba endotelial es necesaria energía proveniente de la glucosa del humor acuoso y el oxígeno de la lágrima.35 Bajo condiciones fisiológicas normales, la función barrera del endotelio y la bomba metabólica trabajan conjuntamente para mantener la desturgescencia de la córnea.35 Sin embargo, la disfunción de las uniones TJ produce una disminución de la resistencia que ofrece el endotelio al paso de moléculas al estroma, lo que provoca un aumento de la permeabilidad del endotelio traducido en un mayor paso de fluidos desde el humor acuoso y en término final, aparición de edema corneal28 (figura 2.6). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 96 Figura 2.6. Representación de la regulación de la fisiología corneal en una córnea normal (izquierda) y en una córnea edematizada (derecha). Cuando la función barrera del endotelio corneal falla, permite una mayor filtración desde la cámara anterior hacia el estroma. La función de la bomba NA+-K+ no es capaz de contrarrestar esta alteración, y el equilibrio entre ambas funciones se pierde, lo que provoca edema corneal. (Adaptación de Srinivas, SP. 2010)28 ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 97 2.3. Evaluación de la fisiología corneal TÉCNICAS indirectas En 1880 Blix determinó por primera vez el espesor de la córnea humana in vivo.37 Desde entonces, los avances para obtener el valor de la paquimetría corneal de la manera más precisa posible han ido en constante crecimiento. El salto más grande se dio durante el siglo XX, con el desarrollo de nuevas tecnologías que resultaron en un amplio rango de herramientas disponibles para la medición de distintos parámetros de la córnea, evaluación de su salud y monitorización y manejo de sus afecciones. El propósito de esta sección es el de revisar brevemente las características más importantes de las diferentes tecnologías utilizadas actualmente en la práctica clínica para evaluar el espesor de la córnea. Estos dispositivos obtienen el valor de la paquimetría corneal de distinta manera. Para determinar el grado de edema corneal se calcula la diferencia en la paquimetría antes y después de una situación dada (porte de LC, cirugía corneal, disfunción endotelial, y otras). Clásicamente el edema se expresa como el porcentaje de cambio en el espesor corneal38 (tabla 2.1). % edema = [(PfinalPbasal)/ Pbasal] x 100 Tabla 2.1. Fórmula empleada para calcular el porcentaje de edema. Pfinal = paquimetría final. Pbasal = paquimetría basal. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 98 2.3.1. Microscopía especular En 1920, Vogt introdujo la biomicroscopía especular como una técnica para visualizar el endotelio corneal humano in vivo observando la luz reflejada desde esta capa.39 Sin embargo, no fue hasta finales de los años 60 cuando esta técnica comenzó su verdadera evolución gracias a Maurice,40 y tecnologías más sofisticadas fueron presentadas permitiendo una evaluación corneal más exhaustiva. Los actuales microscopios especulares son instrumentos ópticos de no contacto que utilizan tecnología de autofoco.41 Proporcionan medidas de la paquimetría corneal y la posibilidad de realizar un profundo análisis de las células del endotelio: densidad celular, polimegatismo, pleomorfismo, identificación de blebs, etc. 2.3.2. Paquimetría ultrasónica El uso de los ultrasonidos para la exploración ocular data de los años 50, con los trabajos de Mundt y Hughes42 y Baum y Greenwood.43 La paquimetría ultrasónica mide el espesor de la córnea emitiendo energía desde de la sonda que está en contacto con la córnea. Parte de esta energía vuelve reflejada en forma de eco. El tiempo que tarda en regresar a la sonda es la información utilizada para calcular el espesor corneal. Ésta técnica presenta una serie de ventajas como su fácil uso, ser un dispositivo portátil o un bajo coste en comparación con la mayoría de las tecnologías modernas que miden el espesor corneal. Se considera el Gold Standard para obtener la paquimetría corneal. Sin embargo, y aunque es una herramienta esencial en la práctica clínica, no está exenta de limitaciones: instilación obligada de anestesia tópica sobre la superficie corneal (debido al ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 99 contacto directo de la sonda con la córnea), incomodidad del paciente, o dificultad a la hora de colocar repetidas veces la sonda perpendicular a la córnea y siempre en el mismo punto.44,45 2.3.3. Microscopía confocal La córnea humana fue examinada mediante microscopía confocal por primera vez in vivo en 1990.46 Esta técnica se basa en el principio confocal: los caminos de iluminación y detección comparten el mismo plano focal (de aquí el término ‘‘confocal’’), solucionando el problema de la luz desenfocada de la microscopía convencional. Esta técnica proporciona paquimetría corneal total y epitelial, y es también capaz de evaluar la córnea a nivel celular47 por lo que cualquier cambio en la morfología celular o la presencia de estructuras anómalas pueden ser detectadas in vivo. También permite la evaluación no invasiva de los nervios corneales48 y la cuantificación de la densidad de queratocitos del estroma o la densidad celular del endotelio, entre otras capacidades.49-51 2.3.4. Tomografía de coherencia óptica La tomografía de coherencia óptica (OCT, siglas en inglés) apareció por primera vez en 1991 para la evaluación del segmento posterior del ojo.52 Tres años después, en 1994, aparecieron las primeras referencias de evaluación del segmento anterior mediante OCT.53 Desde entonces, el refinamiento de esta técnica ha ido progresando hacia el análisis del segmento anterior. La tecnología OCT se basa en interferometría de baja coherencia. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 100 Mide el retardo de la luz infrarroja (1310 nm) reflejada desde las diferentes estructuras del segmento anterior en comparación con una reflexión de referencia. En la actualidad existen dos tipos diferentes de OCT en el mercado: los OCT de dominio en el tiempo (TD - OCT, del anglosajón time-domain), en los cuales la variación de la posición del espejo de referencia produce las imágenes transversales; y los OCT de dominio espectral (SD - OCT, del anglosajón spectral-domain), en los que el espejo de referencia es fijo lo que permite una mayor velocidad de adquisición debido a la ausencia de elementos mecánicos.54 Además de una mayor velocidad de captura de la imagen, los SD - OCT poseen una mayor resolución, lo que permite la visualización de más detalles de la estructura del tejido examinado. Sin embargo, los TD - OCT son capaces de mostrar todas las estructuras del segmento anterior en una sola imagen, mientras que los SD - OCT procesan únicamente una pequeña parte.52 La técnica del OCT proporciona una amplia variedad de mapas paquimétricos de la córnea, incluyendo medidas del resto estromal y espesor del flap después de cirugía refractiva.52 Una de las mayores ventajas del sistema OCT es que permite medir el espesor corneal sin necesidad de retirar la LC en el caso de los usuarios de LC, lo que lo convierte en una excelente herramienta para monitorizar cambios en el espesor corneal secundarios al porte de LC.55 La técnica OCT es también capaz de evaluar diferentes estructuras del segmento anterior a parte de la córnea, incluyendo las dimensiones de la cámara anterior (profundidad de la cámara anterior, ángulo iridocorneal y distancia de ángulo a ángulo, entre otras), y analizar el cristalino (espesor y densidad).56 ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 101 También permite hacer una medida precisa de la localización de los anillos corneales intraestromales en los pacientes con queratocono52 o visualizar las lentes fáquicas intraoculares después de su implantación. 2.3.5. Topografía de elevación En 1995 apareció la topografía de elevación por escáner de hendidura, una combinación de una técnica de proyección (escáner de hendidura) y otra de reflexión (principio de los discos de Plácido). Su objetivo era el de proporcionar medidas de la curvatura anterior y posterior de la córnea y obtener mapas de su estructura.57 El Orbscan II (Bausch and Lomb Inc., Rochester, NY, USA) es el único dispositivo disponible en el mercado que emplea esta tecnología actualmente.58 Ofrece una amplia gama de variables y mapas, incluyendo mapas paquimétricos de la córnea, su poder óptico, profundidad de la cámara anterior, distancia blanco-blanco, y otros datos del segmento anterior del iris y critalino.59 El Orbscan II determina el espesor corneal como la diferencia entre la superficie anterior y posterior de la córnea. Esta información se muestra en forma de mapas que siguen un código de colores, donde el verde representa el rango esperado de paquimetría corneal, el púrpura y colores cálidos indican áreas más gruesas y el rojo indica áreas más delgadas. Estos mapas también incluyen valores numéricos para la paquimetría corneal. En comparación con el Gold Standard (la paquimetría ultrasónica) puede proporcionar valores de paquimetría significativamente diferentes, por lo que el fabricante sugirió introducir un factor acústico de 0,92 para transformar las medidas del Orbscan II en sus equivalentes de paquimetría ultrasónica.60 Sin embargo, el uso de cualquier factor acústico es controvertido, y diferentes autores recomiendan no utilizarlo cuando se requiere una evaluación prospectiva del paciente.61,62 ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 102 2.3.6. Topografía de Scheimpflug Theodor Scheimpflug fue un cartógrafo de la marina austríaca, y fue quien primero introdujo el principio de Scheimpflug en el campo de la fotografía a comienzos del siglo XX.63 El principio de Scheimpflug describe la condición óptica de las imágenes en las que el plano de un objeto no es paralelo a la película de la cámara. Se ha aplicado en el campo de la oftalmología desde finales de los años 50, cuando Drews propuso su uso para obtener imágenes del segmento anterior del ojo.64,65 Sin embargo, esta técnica no comenzó a emplearse en la práctica clínica hasta la aparición en 1995 de nuevos instrumentos, incluyendo el Pentacam (Oculus Optikgeräte GmbH, Wetzlar, Alemania) y el Galilei (Ziemer Group, Port, Suiza).66 Ambos dispositivos comparten muchas de sus características y miden básicamente los mismos parámetros corneales que el Orsbcan II, incluyendo elevación corneal, curvatura y espesor. Es más, el Pentacam representa sus mapas siguiendo el mismo código de colores que emplea el Orbscan II en sus mapas, donde el verde simboliza valores normales y los colores rojizos indican valores anormales. De manera similar a la topografía de elevación, la topografía de Scheimpflug describe un amplio rango de parámetros corneales, variables y mapas, incluyendo datos de la topografía anterior y posterior de la córnea, queratometría, radio de curvatura, poder corneal (con la cantidad y eje del astigmatismo), datos de la paquimetría (espesor corneal en el centro de la córnea, en el ápex, en el punto más delgado de la córnea, en localizaciones de la periferia corneal, etc.), excentricidad corneal, profundidad de la cámara anterior, diámetro pupilar, tamaño del ángulo iridocorneal, opacificación y espesor del cristalino, entre otros.67 ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 103 Al igual que la topografía de elevación, la principal ventaja de la técnica de Scheimpflug es que es un método de no contacto con rápidos tiempos de adquisición, además de permitir facilidad de uso sin pasar por un largo periodo de aprendizaje.56 2.3.7. Uso de la fluoresceína en la evaluación ocular La fluoresceína es una molécula que posee la propiedad de emitir luz verde fluorescente cuando recibe fotones de una longitud de onda de aproximadamente 490 nm (luz azul cobalto). Fue sintetizada por primera vez por Baeyer en 1871,68 aunque fue Pfluger quien propuso su aplicación para la evaluación de abrasiones corneales en 1882.69 Desde entonces, y en combinación con la lámpara de hendidura, su uso en el ejercicio clínico para la evaluación de la superficie corneal se ha extendido convirtiéndose en una práctica rutinaria en cualquier consulta de optometría u oftalmología. Algunos de los principales usos de la fluoresceína son detectar defectos, queratitis o erosiones en el epitelio corneal,70 así como para evaluar la superficie ocular en usuarios de LC71 u otras condiciones clínicas. La fluoresceína se instila de manera tópica sobre la superficie anterior del ojo y rápidamente se mezcla con la película lagrimal, dando un tinte amarillento a la superficie corneal (visto con luz blanca). Al observar con luz azul cobalto, las áreas dañadas serán identificadas por un color verde fluorescente. Así, se puede realizar de manera rápida y sencilla una evaluación macroscópica de los defectos de la superficie anterior del ojo, aunque la información obtenida no pueda relacionarse de manera objetiva con el estado de la función barrera o permeabilidad del epitelio o endotelio corneal, y se trate de una cuantificación subjetiva a la hora de gradar la severidad de los hallazgos. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 110 En resumen, a pesar de ser la única herramienta disponible para evaluar de manera directa la función barrera del epitelio y el endotelio corneal humano in vivo, la fluorofotometría tiene un valor limitado en la práctica clínica dadas sus desventajas. Por otro lado las medidas del TER para la valoración directa del estado de la función barrera del epitelio y el endotelio de la córnea no son aplicables a medidas en humanos in vivo por su naturaleza altamente invasiva. Parece por tanto que existe un vacío de herramientas capaces de valorar la permeabilidad de estas capas de manera no invasiva y eficaz. ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 111 2.5. Córnea y lentes de contacto EDEMA CORNEAL con LC hidrofílicas Las LC son dispositivos médicos que se colocan sobre la superficie corneal, normalmente para la corrección de las ametropías visuales. Otros usos de las LC incluyen razones cosméticas o terapéuticas.98 En 2005, se estimó que más de 140 millones de personas en el mundo utilizan LC.99 Es ampliamente conocido que el porte de LC altera algunas características de la morfología y fisiología de la superficie ocular.100 La magnitud de estos cambios está relacionada con el material y diseño de las LC (que condicionan el paso de oxígeno a la córnea), el patrón de porte (diario o continuado, entre otros), tiempo desde que comenzó el uso, hábitos del usuario, y otros. En esta sección será brevemente descrita la etiología y morfología de los cambios inducidos en el espesor corneal secundarios al porte de LC hidrofílicas. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 112 2.5.1. Propiedades de las LC Generalmente, las LC se clasifican dentro de dos tipos principales dependiendo del material del que estén hechas: lentes rígidas permeables a los gases (LCRPG) o lentes blandas o hidrofílicas (LCH).101 La interacción entre LC y córnea dependerá de las diferentes características de las LC, de su material y diseño. El objetivo final es el de mantener la salud y fisiología corneal normal. La habilidad de una LC para mantener la homeostasis de la córnea viene normalmente determinada por la cantidad de oxígeno que es capaz de transmitir desde la atmósfera a la córnea.102 Existen dos parámetros que permiten la cuantificar la cantidad de oxígeno que llega a la córnea:103 • Permeabilidad al oxígeno (Dk): la permeabilidad al oxígeno es una característica del material de las LC. Se refiere a cómo de permeable es ese material al paso del oxígeno y otros gases a su través.104 • Transmisibilidad al oxígeno (Dk/t): la transmisibilidad al oxígeno es una característica del diseño de las LC. No es apropiado decir que el parámetro Dk es representativo de todas la LC hechas de un material dado, pues la transmisión real de oxígeno a la córnea también depende del diseño, el poder refractivo y en resumen del espesor de cada LC.105 ! Capítulo 2 ! ! Estado actual del tema ! ! ! 113 2.5.2. Edema corneal inducido por el porte de LCH Cuando se coloca una LC sobre la córnea puede decirse que ésta actúa como una barrera entre el medio ambiente y la superficie corneal, disminuyendo la difusión de oxígeno al tejido corneal y por lo tanto induciendo hipoxia.106 Los mecanismos moleculares que subyacen el edema corneal secundario al uso de LC han sido extensamente revisados en la literatura existente.35 Brevemente explicado, como resultado de la falta de oxígeno las funciones de barrera y metabólica del endotelio se ven alteradas, lo que conduce a una mayor difusión de fluido desde la cámara anterior al estroma, el consiguiente aumento del contenido de agua estromal y, finalmente, edema corneal. Niveles de más de un 6% de edema causan cambios en la estructura corneal que suponen una amenaza para el mantenimiento de su transparencia, su función óptica y en última instancia su salud.107 Como se ha mencionado anteriormente (secciones 2.3 y 2.4), existen dos modos de evaluar el impacto que ejerce una LC sobre el espesor de la córnea: indirectamente (cambios morfológicos) y directamente (cambios fisiológicos). Los métodos indirectos se basan en cuantificar el espesor corneal antes y después del porte de LC, con el objetivo de calcular el porcentaje de edema inducido (tabla 2.1). Éstos métodos permiten conocer el incremento del espesor corneal, lo que es útil para poder comparar con ese valor de seguridad del 6%107 y tomar decisiones clínicas como cambiar las características o diseño de la LC utilizada, modificar el patrón de uso, o saber si es seguro o no para el ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 114 usuario continuar con el porte de LC, entre otras. Sin embargo, este método no permite conocer el estado real de la función barrera del endotelio corneal, la principal afectada por la hipoxia inducida por las LC. Para evaluarlo, el único método del que se dispone en la práctica clínica es la técnica basada en medidas fluorofotométricas, la cual no está exenta de limitaciones que impiden su popularización en la práctica clínica (como se ha explicado en el apartado 2.4.1). Además, aunque el fallo en la función barrera del epitelio no es responsable del edema corneal inducido por el porte de LC, sí que induce pérdida y rotura de las TJ del epitelio, lo que puede provocar una complicación clínica.77 Una de las complicaciones más graves tanto para la visión como para la salud ocular de las reportadas entre usuarios de LCH es la queratitis microbiana.108 Nuevamente, en la actualidad el único modo de evaluar el estado de las TJ del epitelio corneal en humanos in vivo es mediante medidas de la fluorofotometría (apartado 2.4.1). ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 115 3 BIOIMPEDANCIA CORNEAL APLICACIÓN NO INVASIVA IN VIVO ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 116 ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 117 3.1. Introducción DESCRIPCIÓN de la técnica El estudio de las propiedades eléctricas pasivas de la córnea se emplea habitualmente para evaluar la permeabilidad de epitelio y endotelio corneal en estudios in vitro, ex vivo o modelo animal in vivo (de manera invasiva), tal y como se ha descrito en el apartado 2.4.2. Recientemente, una técnica también basada en el estudio de las propiedades eléctricas pasivas de la córnea, ha sido validada para evaluar de forma no invasiva la permeabilidad de las distintas capas de la córnea en modelo animal (conejos) in vivo.109,110 En esta sección se describirán las bases electrofisiológicas de esta técnica, se explicarán las características del equipo de medida y se expondrán los resultados previos obtenidos en modelo animal hasta el momento (validación de la técnica). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 118 3.1.1. Bases electrofisiológicas La bioimpedancia eléctrica es un método sencillo, rápido y de bajo coste, basado en el estudio de las propiedades eléctricas pasivas de un tejido biológico. Ésta técnica observa cómo circula una corriente eléctrica a través del tejido, en concreto, estudia la resistencia que éste ofrece al paso de la corriente a su través. Así, cuanto mayor sea la resistencia ofrecida por el tejido menor será su permeabilidad y viceversa. Para saber cómo circula una corriente eléctrica a través de un tejido dado, es necesario primero aplicar esta corriente para después estudiar su comportamiento. A su vez, hay que tener en cuenta que la corriente no circulará de la misma manera dependiendo de su frecuencia, por lo que ésta ha de quedar determinada cada vez que se aplique la corriente en el tejido. En un medio celular, la corriente puede fluir alrededor de las células (medio extracelular) o atravesando las células. A bajas frecuencias (<1 KHz) la mayor parte de la corriente fluye por el medio extracelular, pues no es capaz de penetrar y atravesar las membranas celulares. A mayores frecuencias (>100 KHz) la membrana celular no puede presentar la resistencia suficiente para impedir el paso de la corriente a su través, por lo que ésta fluye de manera indiscriminada por el medio extra e intracelular (figura 3.1). ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 119 Figura 3.1. Esquema del comportamiento de la corriente eléctrica a diferentes frecuencias al atravesar una capa celular. Línea discontinua: bajas frecuencias (<1 KHz), la corriente circula por el medio extracelular. Línea continua: altas frecuencias (>100 KHz), la corriente atraviesa la pared celular y el medio intracelular. Frec = frecuencia. (Adaptación de Ivorra, A. 2002) Si se traslada este principio al tejido corneal, las medidas de bioimpedancia obtenidas al aplicar una corriente dada proporcionarán información de la permeabilidad de las distintas capas de la córnea, dependiendo siempre de la frecuencia de la corriente empleada. Una mayor facilidad de la corriente para atravesar una determinada capa corneal se asocia con mayor permeabilidad de esta capa, y viceversa. Así, en función de la capa que se quiera estudiar (epitelio, estroma o endotelio) se han diferenciado tres rangos de frecuencias para la corriente: ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 126 3.2.1. Introducción Una de las complicaciones más habituales secundarias al uso de LC son las queratitis infecciosas propiciadas entre otros factores por la rotura de las TJ del epitelio108 (apartado 2.5.2.). Actualmente sólo existe la posibilidad de evaluar en humanos in vivo de manera directa, objetiva y no invasiva el estado de las TJ del epitelio (y por consiguiente el estado de su función barrera) mediante técnicas fluorofotométricas77 (apartado 2.4.1). El principal propósito de este estudio fue la valoración de la capacidad del prototipo basado en medidas de la bioimpedancia corneal para evaluar los cambios secundarios al porte de LCH en la permeabilidad del epitelio corneal de conejo. 3.2.2. Hipótesis y objetivos 3.2.2.1. Hipótesis La medida de la bioimpedancia corneal permite detectar cambios en la función barrera del epitelio corneal en modelo animal (conejo) inducidos por el porte de lentes de contacto hidrofílicas. 3.2.2.2. Objetivos • Objetivo 1 de la tesis: Determinar la capacidad de la técnica de medida de la bioimpedancia corneal para detectar cambios en la permeabilidad epitelial en conejos inducidos por el porte de LCH. ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 127 3.2.3. Material y métodos 3.2.3.1. Animales Un total de 20 conejos de raza Blanco de Nueva Zelanda de entre 2,5 y 3 Kg fueron incluidos en el estudio. Todos los animales fueron tratados según las directrices para la experimentación animal en investigación visual de la Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO);111 y bajo la supervisión del Comité Ético para la Experimentación y Bienestar Animal (CEEBA) de la Universidad de Valladolid. 3.2.3.2. Lentes de contacto Las LC empleadas en el estudio fueron lentes de bajo Dk (vasurfilcon A, Dk = 38, Precision UV, Ciba Vision, Duluth, GA), que aseguraran una baja transmisión de oxígeno a la córnea con el objetivo de inducir cambios en la permeabilidad corneal secundarios a la hipoxia inducida. Las características de las LC se muestran en la tabla 3.1. Material Radio (mm) Diámetro (mm) Espesor* (mm) Hidratación Dk Potencia (D) Vasurfilcon A 8,40 14,40 0,14 74% 38 +10,00 Tabla 3.1. Parámetros de las LC utilizadas en el estudio ‘‘Estudio I. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial en modelo animal’’. *Espesor central para una LC de -3,00 D. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 128 3.2.3.3. Instrumentación Para la medición de la bioimpedancia del epitelio corneal se utilizó el equipo descrito en el apartado 3.1.2 (ANEXO I), siguiendo el procedimiento detallado en el Manual de Usuario CORBI (ANEXO II). Para facilitar la separación de los párpados durante las medidas se colocó un blefaróstato antes de comenzar con las mismas. La medida se realizó tres veces consecutivas en cada ojo, empleándose la media de las tres medidas como valor final. El mismo explorador realizó siempre las medidas de bioimpedancia a todos los conejos. También se monitorizaron los cambios en el espesor corneal central a lo largo del estudio, por ser un indicador de la integridad y salud corneal. Estas medidas se realizaron con el paquímetro ultrasónico Sonogage (Corneo-Gage Plus, Cleveland, OH, USA). Las bases de su funcionamiento se explican en el apartado 2.3.2. En cada ocasión la paquimetría corneal se midió tres veces consecutivas en cada ojo, utilizándose la media de las tres medidas como valor final. El mismo explorador realizó siempre las medidas de paquimetría corneal siguiendo las recomendaciones del fabricante. 3.2.3.4. Procedimiento El estudio fue prospectivo. Estuvo organizado en tres visitas (tabla 3.2) y dos grupos de estudio, dependiendo del tiempo de porte de las LC (tabla 3.3). ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 129 Visita 1: Común para los 20 conejos, donde se recogieron las medidas basales Visita 2: Visita final del grupo 1, donde se recogieron las medidas finales de 10 animales (después de 1 día con las LC). Visita 3: Visita final del grupo 2, donde se recogieron las medidas finales de 10 animales (después de 7 días con las LC). Tabla 3.2. Visitas del ‘‘Estudio I. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial en modelo animal’’. Grupo 1: 1 día (de manera prolongada) con la LC (n=10) Grupo 2: 7 días (de manera prolongada) con la LC (n=10) Tabla 3.3. Grupos del ‘‘Estudio I. Bioimpedancia corneal. Permeabilidad epitelial en modelo animal’’. Uso prolongado de LC = sin retirarlas durante el sueño En la primera visita y antes de realizar ningún procedimiento, los animales fueron anestesiados mediante una inyección intramuscular de 50 mg/kg de ketamina (Imalgene 1000®, Merial) y 7 mg/kg de Xylazina (Rompun®, Bayer). Una vez sedados, el primer paso fue llevar a cabo la medida basal de la bioimpedancia epitelial según se ha descrito en el apartado 3.2.3.3 (figura 3.4). A continuación se midió la paquimetría central corneal con el paquímetro ultrasónico Sonogage (apartado 3.2.3.3). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 130 Figura 3.4. Imagen de la medida de bioimpedancia epitelial. Se observa la aplicación del sensor sobre la superficie corneal del conejo. Una vez realizadas las medidas basales de bioimpedancia epitelial y paquimetría corneal, un ojo de cada animal fue aleatoriamente asignado como ojo control mientras que el contralateral portaría la LC (apartado 3.2.3.2). Para garantizar la retención de la LC sobre la córnea del conejo se procedió al cierre de la apertura palpebral del ojo portador de la lente con suturas 6-0 (Mersilk, Ethicon, Francia).112 Al final de esta primera visita, 10 de los conejos fueron asignados de manera aleatoria al grupo 1 (1 día con LC) y los otros 10 conejos fueron asignados al grupo 2 (7 días con LC). ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 131 En la segunda y tercera visita (después de uno o siete días con la LC, dependiendo del grupo de estudio) y antes de realizar ningún procedimiento, los animales fueron anestesiados de la misma manera que en la visita inicial. Una vez sedados, se procedió a retirar las suturas que cerraban la apertura palpebral del ojo portador de la lente y se retiró la LC. Inmediatamente después se realizó la medida de la bioimpedancia epitelial y de la paquimetría corneal (siguiendo el mismo procedimiento que durante la primera visita). A continuación, el estado de la superficie ocular fue evaluado con lámpara de hendidura portátil (KOWA SL15, Kowa; Düsseldorf, Alemania) después de la instilación de fluoresceína tópica en ambos ojos en busca de alteraciones epiteliales detectables macroscópicamente, que pudieran ser atribuidas o bien al uso de la LC o bien a la aplicación del sensor de medida de bioimpedancia. Al final de la visita los animales fueron eutanasiados mediante inyección intravenosa de 200 mg/kg de pentobarbital (Dolethal Vetoquinol) y se procedió a la enucleación de ambos ojos y extracción de córneas para su posterior análisis histopatológico. 3.2.3.5. Criterio de edema El criterio que se empleó para determinar el grado de edema corneal inducido entre la medida basal y la medida final (después de portar la LC) fue la variación que se produjo en el espesor corneal central expresado en porcentaje. La fórmula empleada para calcular este porcentaje se muestra en la tabla 3.4. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 132 % edema = [(PfinalPbasal)/ Pbasal] x 100 Tabla 3.4. Fórmula empleada para calcular el porcentaje de edema inducido. Pfinal = paquimetría después de utilizar la LC. Pbasal = paquimetría basal. 3.2.3.6. Análisis histopatológico Todas las córneas fueron examinadas histológicamente mediante microscopía óptica convencional por un patólogo enmascarado. Las córneas se fijaron en formol tamponado a pH neutro al 10% (Panreac, España) y conservadas de manera rutinaria hasta su inclusión en parafina. Los bloques de parafina fueron seccionados con microtomo a 3 µm y fueron teñidas con hematoxilina eosina. Se evaluó la distribución y composición del epitelio en busca de anormalidades con el microscopio automatizado LEICA DM4000B (Leica, Alemania). ! 3.2.3.7. Análisis estadístico Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS 19.0 (SPSS Inc; Chicago, IL, USA) para Windows. Se evaluó la normalidad de la distribución de los datos mediante el test de Saphiro-Wilk. Se emplearon los siguientes contrastes estadísticos (se tomó un valor de P<0,05 como diferencia significativa): • Las diferencias en el espesor corneal en el tiempo (entre visitas) se analizaron con un análisis de la varianza (ANOVA) con corrección de Bonferroni entre la medida basal (antes de ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 133 llevar la LC) y la medida final de los grupos 1 (1 día con LC) y 2 (7 días con LC). • Las diferencias en el espesor corneal entre el ojo control y el ojo portador de LC (entre grupos) se analizaron con la prueba t de Student para datos apareados para detectar si las diferencias eran atribuibles a la hipoxia provocada por el uso de LC. • Las diferencias en el grado de edema en el tiempo se analizaron con un análisis de la varianza (ANOVA) entre el edema después de 1 día y 7 días con la LC. • Las diferencias en el grado de edema entre el ojo control y el ojo portador de LC se analizaron con la prueba t de Student para datos apareados para detectar si las diferencias eran atribuibles a la hipoxia provocada por el uso de LC. • Las diferencias en la permeabilidad epitelial en el tiempo se analizaron con un análisis de la varianza (ANOVA) con corrección de Bonferroni entre la medida basal (antes de llevar la LC) y la medida final de los grupos 1 (1 día con LC) y 2 (7 días con LC). • Las diferencias en la permeabilidad epitelial entre el ojo control y el ojo portador de LC se analizaron con la prueba t de Student para datos apareados. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 134 3.2.3.8. Instalaciones Todas las medidas se realizaron en el quirófano de experimentación animal del Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA) de la Universidad de Valladolid. 3.2.4. Resultados 3.2.4.1. Detección de diferencias en la paquimetría y en el edema inducido Los datos de paquimetría y edema corneal siguieron una distribución normal según el test de Saphiro-Wilk. Los resultados de la paquimetría corneal se muestran en la Tabla 3.5. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la paquimetría entre los ojos control y los ojos de estudio en la visita basal (P=0,208 t Student para datos apareados). Sin embargo, después de 1 día y 7 días con la LC, la paquimetría corneal aumentó de manera estadísticamente significativa en el caso de los ojos portadores de LC (P<0,001 t Student para datos apareados). Además, los ojos control no mostraron diferencias estadísticamente significativas en su paquimetría en ninguna de las visitas del estudio (basal, 1 día y 7 días con LC) (P=0,348 ANOVA), mientras que los ojos portadores de LC mostraron un incremento estadísticamente significativo de su espesor corneal a lo largo del estudio (P<0,001 ANOVA). ! Capítulo 3 ! ! Bioimpedancia corneal: Aplicación no invasiva in vivo ! ! ! 135 Paquimetría corneal (µm) Visita 1: medida basal Visita 2: un día con LC (GRUPO 1) Visita 3: siete días con LC (GRUPO 2) P† Ojos control 375 ± 0,15 373 ± 0,14 375 ± 0,17 0,348 Ojos con LC 374 ± 0,11 462 ± 0,30 535 ± 1,36 <0,001 P* 0,208 <0,001 <0,001 Tabla 3.5. Resumen de las medidas del espesor corneal central (media ± DS), obtenidas con el paquímetro ultrasónico Sonogage para las tres visitas del estudio. *Test t Student para datos apareados. †Análisis de la varianza (ANOVA) con corrección de Bonferroni. Los resultados del edema corneal inducido se muestran en la Tabla 3.6. Después de 1 día y 7 días con la LC, el edema fue significativamente superior en el caso de los ojos portadores de LC (P<0,001 t Student para datos apareados). Por su parte, los ojos control no mostraron variaciones estadísticamente significativas en el edema corneal a lo largo del estudio (P=0,140 ANOVA), mientras que los ojos portadores de LC mostraron un incremento estadísticamente significativo del edema corneal entre las distintas visitas (P<0,001 ANOVA). ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 238 de la córnea, por lo que podría realizarse un estudio más exhaustivo del edema no sólo en 4 puntos de la periferia del meridiano horizontal sino incluyendo prácticamente el mapa completo de la córnea. Si bien la medida en el meridiano vertical presenta el inconveniente de verse afectada por los párpados, que pueden cubrir partes de la periferia corneal superior e inferior como se ha mencionado anteriormente. Además, la metodología empleada para llevar a cabo el presente estudio difiere del resto de trabajos encontrados en la literatura, lo que supone un nuevo enfoque. En la mayoría de los trabajos realizados previamente, para conocer si la respuesta es igual en el centro que en la periferia se calcula el porcentaje de variación en el espesor corneal antes y después del porte de las LC, y se compara por zonas para establecer posibles diferencias. Otra posible manera de determinar estas diferencias es la propuesta en el presente trabajo que además de establecer las diferencias según la comparación de los edemas en cada zona, se ha determinado la variación en la proporción entre los distintos puntos estudiados, obteniendo así de forma sencilla un índice que determina de manera directa cómo de grande es esa variación en el espesor corneal. Otra importante limitación de este trabajo es el pequeño tamaño de la muestra de estudio, que hace que el trabajo tenga una potencia estadística limitada y en consecuencia, las estimaciones sean menos generalizables. En el momento del diseño del estudio se contó con este limitado número de sujetos; al ser un trabajo enmarcado dentro del Estudio II, que fue una primera prueba de concepto donde se consideró un bajo número de sujetos para llevar a cabo el estudio de seguridad del dispositivo de medida de la bioimpedancia corneal, cumpliendo con los requisitos legales y recomendaciones del comité ético que aprobó el protocolo. ! Capítulo 4 ! ! Asimetría del espesor corneal ! ! ! 239 Por último, el diseño contralateral del estudio, en el que cada sujeto portó LC en ambos ojos, también es un aspecto controvertido, ya que se ha descrito un posible efecto simpático de un ojo sobre otro en el edema corneal inducido por el uso de LC. 188,189 4.3.5.3. Conclusiones En conclusión el edema corneal inducido por el uso de LC de alta (Lotrafilcon B – Dk = 110) y baja (Etafilcon A – Dk = 28) permeabilidad al oxígeno durante 7 días de porte prolongado presenta la misma tendencia a repartirse uniformemente entre el centro y el meridiano horizontal de la córnea, por lo que la asimetría entre las zonas nasal y temporal y éstas con el centro de la córnea no sufren variaciones significativas. Los datos han mostrado que después de 7 días de porte prolongado, las LC de bajo Dk inducen un edema significativamente mayor que las de alto Dk en todos los puntos estudiados excepto en N5. Esta diferencia puede ser analizada en futuros trabajos. A pesar de que el porte de las LC de bajo Dk indujo un aumento significativo del espesor corneal en CCT, N5, N4 y T4 después de 7 días de uso, las asimetrías estudiadas permanecen estables después del porte de las lentes, lo que sugiere un reparto uniforme del edema corneal. ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 240 ! Capítulo 5 ! ! Síntesis final ! ! ! 241 5 SÍNTESIS FINAL ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 242 ! Capítulo 5 ! ! Síntesis final ! ! ! 243 5.1. Síntesis final RESUMEN GLOBAL Las tecnologías disponibles para el estudio de la morfología de la córnea en la actualidad hacen que el proceso de evaluación corneal sea extremadamente completo además de rápido y sencillo. Sin embargo, a pesar de los importantes avances que se han producido en las últimas décadas, la carencia de herramientas para obtener una completa comprensión de la fisiología corneal es evidente. La evaluación de la córnea con lámpara de hendidura se practica desde que Gullstrand la presentara en 1911, hace más de 100 años. Con ella se puede explorar la anatomía corneal e identificar signos clínicos necesarios para el diagnóstico de patologías o alteraciones corneales, una vez éstas se producen en la morfología del tejido como consecuencia de diferentes procesos fisiopatológicos dependiendo del caso. En estos 100 años, se ha pasado de valorar el estado y salud general de la córnea a obtener medidas in vivo no invasivas de la permeabilidad del epitelio y del endotelio corneal, y es obvio que la tecnología continuará avanzando y desarrollando nuevos y mejores dispositivos que seguirán facilitando el examen de la córnea, proporcionando datos e ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 244 información que todavía hoy no es fácil imaginar. El final de la meta ha sido, es y será proporcionar la mejor atención a los pacientes en la práctica clínica. Esta tesis doctoral ha querido contribuir con los avances que se están produciendo en el campo de estudio de la respuesta corneal al porte de LC, planteando un proyecto que incluyera la evaluación tanto de la respuesta fisiológica (permeabilidad del epitelio y del endotelio) como de la respuesta mecánica (cambios en el espesor) de la córnea secundarios al porte de LCH. En el caso de la respuesta fisiológica, se evaluó en primer lugar la capacidad de la técnica de medida de la bioimpedancia corneal en un modelo animal de edema corneal inducido por el uso de LCH. Los resultados, aunque controvertidos, parecen ser biológicamente plausibles y, sobre todo, demuestran que el equipo de medida de la bioimpedancia corneal es sensible y capaz de detectar cambios inducidos por la hipoxia secundaria al uso de LCH, sin provocar lesiones ni efectos secundarios sobre el tejido corneal. En segundo lugar, se evaluó la seguridad y capacidad de esta herramienta para estudiar in vivo y de manera no invasiva la permeabilidad del epitelio y del endotelio corneal humanos. Para ello se diseñó un estudio en el que se monitorizó la medida de la bioimpedancia epitelial y endotelial en un grupo de voluntarios que portaron LCH de diferente Dk. En resumen, aunque los resultados obtenidos no muestran cambios estadísticamente significativos en la permeabilidad de ninguna de las dos capas corneales, [que puede explicarse ya que ambas LC están aprobadas por la FDA (U.S. Food and Drug Administration) para su uso prolongado (etafilcon A, hasta 7 días) y continuado (lotrafilcon B, hasta 30 días)]; los resultados pueden ayudar a identificar y explicar el adelgazamiento epitelial asociado al uso de LCH, que precisa ser aclarado con nuevas investigaciones. ! Capítulo 5 ! ! Síntesis final ! ! ! 245 El estudio de la respuesta mecánica de la córnea a la hipoxia inducida por el uso de LCH ha evaluado la distribución del edema corneal en cinco localizaciones de su topografía (CCT, N4, N5, T4 y T5), con el propósito de esclarecer si el edema secundario al porte de LCH se reparte homogéneamente entre centro y periferia corneal o por el contrario una de estas zonas presenta mayor edema. Para ello, se analizó la respuesta corneal después de 40 minutos (respuesta a corto plazo) y de 7 días (respuesta a medio plazo) de porte de las lentes. Los resultados muestran un reparto uniforme del edema, tanto a corto como a medio plazo de uso de LC. Estos resultados pueden ayudar a dilucidar la polémica en torno a esta cuestión, que parece no tener una teoría ampliamente aceptada, sino que se defienden varias hipótesis. En definitiva, esta tesis ha demostrado que es posible aplicar la medida de la bioimpedancia corneal para la evaluación del estado de la función barrera del epitelio y del endotelio corneal en humanos in vivo de manera segura y no invasiva y; además, que el edema inducido por el porte a corto y medio plazo de LCH se reparte uniformemente entre el centro y la periferia de la córnea a lo largo del meridiano horizontal. Sin embargo, son necesarios mayores esfuerzos para mejorar el prototipo de medida de la bioimpedancia corneal utilizado en esta tesis, de tal manera que se aumente su precisión, sensibilidad y eficacia, así como disminuyendo el tiempo de exploración y uso de anestésico tópico, con el fin de implementar su uso clínico y desarrollar nuevas tecnologías que mejoren la existente y ayuden a dilucidar los cambios en la fisiología y biomecánica corneal secundarios a la hipoxia inducida por el uso de LCH, lo que facilitará la ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 246 toma de decisiones clínicas y mejorará la metodología y los conocimientos sobre la interacción entre córnea y LC. ! Capítulo 5 ! ! Síntesis final ! ! ! 247 5.1. Síntesis final RELEVANCIA CLÍNICA y perspectivas de futuro Este trabajo ha continuado con una línea de investigación basada en avanzar en el conocimiento de la respuesta corneal al uso de LC, los mecanismos que provocan el edema corneal y la apreciación de los cambios no sólo en la morfología sino también en la fisiología de la córnea, contribuyendo al entendimiento de la interacción entre córnea y LC y a la definición de pautas y protocolos que permitan un uso más seguro de las mismas. Los resultados obtenidos han demostrado que es posible detectar y monitorizar de forma no invasiva los cambios secundarios al porte de LCH producidos en la permeabilidad del epitelio y del endotelio corneal en humanos in vivo aplicando nuevas herramientas de medida de la bioimpedancia corneal. La transferencia de esta técnica de medida a la práctica clínica supondría en primer lugar aportar un nuevo método de evaluación de la permeabilidad corneal en humanos in vivo. Actualmente, la única herramienta existente para la evaluación objetiva de este parámetro es la fluorofotometría, por lo que la implementación de la técnica de bioimpedancia no sólo aportaría un nuevo equipo de exploración de la córnea a la comunidad clínica y científica, ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 254 17. Lagali N, Germundsson J, Fagerholm P. 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Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 288 Manual de Usuario. Fecha de Edición: 1 Junio 2012. Versión 1. 1 CORBI Manual de Usuario ¿Que es CORBI? Es un equipo en fase de investigación y de ensayo clínico que aporta datos del grado de permeabilidad de la córnea basándose en un análisis de medidas de la impedancia mediante un microsensor colocado en la superficie corneal. Su principal ventaja frente a otros métodos es la rapidez de los resultados y no ser invasivo. Se aplica con la misma simplicidad que una tonometría. Ello permite que pueda llegar a generalizarse en visitas de oftalmología. El ensayo clínico pretende validar el método y dispositivo en pacientes y principalmente para su uso en el diagnostico y seguimiento de pacientes que son portadores de lentes de contacto o a los que se les va a realizar cirugía para corrección de cataratas. El ensayo está financiado por los laboratorios SALVAT SA. Descripción del equipo El equipo completo consta de tres elementos 1. Un Dispositivo electrónico 2. Un sensor corneal 3. Un PC opcional 1 El equipo electrónico consta de dos módulos unidos, A y B en la foto superior, que permiten tomar y almacenar datos de forma automática. Estos datos posteriormente serán enviados a un PC para su análisis posterior. Ambos están unidos por un cable, D en la foto superior. 2 El sensor corneal , C en la foto superior, esta realizado con tecnologías microelectrónicas. Consta de varios microelectrodos de oro distribuidos sobre una superficie polimérica flexible que permite su adaptacion perfecta a la curvatura corneal. Dicho sensor esta unido a un cabezal para su correcta manipulación y conexión al equipo electrónico. Dicho sensor y cabezal estará desinfectado y en bolsas precintadas y será de un solo uso. 3 Finalmente, un PC que contiene un programa específico que permite analizar los datos. Manual de Usuario. Fecha de Edición: 1 Junio 2012. Versión 1. 2 Modo de Funcionamiento Antes de utilizarlo comprobar que se tiene todos los elementos: Sensores esterilizados Dispositivo electrónico y hojas de protocolo. Los pasos de funcionamiento son: 1.- CONEXIÓN SENSOR. Sacar el sensor del blíster estéril. Unir el cabezal del sensor (1) al cable conector del dispositivo CORBI. Vigilar que coincidan los puntos rojos al mismo lado. Tener cuidado en no tocar partes estériles, es decir la zona flexible (2), que irán en contacto con el ojo. La parte sensora flexible ha sido previamente desinfectada y protegida en blíster especiales. El punto rojo del sensor (2) sirve además para colocar el lado correcto de la zona sensora en la superficie ocular. El oftalmólogo ha de visualizar siempre el punto rojo! 2.- ENCENDIDO. Encender ambos módulos electrónicos (B y A) apretando los botones de encendido respectivos. Se encenderá en el botón una luz verde en el módulo B y una roja en el A. 3.- TEST. Hacer una medida Test. Una vez puesto el sensor a utilizar en el extremo del cable colocarlo inmerso en un recipiente con suero fisiológico. Apretar el botón de test que es negro. Se encenderán las luces o LEDs de control ambas mientras se esta automáticamente realizando la medida de test. Si la medida es buena quedara solamente la luz verde. Si la medida no es correcta quedara encendida solamente la luz roja. En este caso repetir la medida y si repite el error proceder a cambiar el sensor y volver a hacer el test. 4.-MEDIDA. Colocar el sensor flexible en la supeficie corneal de forma centrada con el ojo abierto y viendo la marca roja por el examinador. Cuando toda la superficie del sensor contacta con la cornea iniciar la medida. Apretar el botón rojo de medida. Se volverán a encender las dos luces o LEDs, al acabar de medir permanecerá encendida solo una, verde si la medida es correcta y rojo en el caso de que haya un error en la medida. Comprobar que las luces de control tras la estabilización se queda el color verde. Sino repetir el proceso. Manual de Usuario. Fecha de Edición: 1 Junio 2012. Versión 1. 3 Los datos quedarán almacenados para un posterior análisis. Estos datos se almacenan de forma automática registrándose el día y la hora de realización. El dispositivo puede llegar a almacenar 2000 datos sin necesidad de volcarlos a un PC. 5.- PROTOCOLO. Completar la Hoja de Protocolo CORBI. Es fundamental anotar en las hojas la fecha, hora y numero de medidas totales. 6.- ANÁLISIS DE DATOS. Los datos se volcaran posteriormente a un PC que con el software CORBI permitirá analizar los resultados. En el módulo A parpadeara una luz verde que indica que hay conexión al PC. NO UTILIZAR ESTE EQUIPO EN CASO DE: • Infección, inflamación o enfermedad de la cámara anterior y la superficie anterior de ojo (conjuntiva, córnea y anejos oculares) tales como defectos epiteliales recurrentes, queratocono, conjuntivitis papilar gigante, blefaritis (activa de grado 2 o más) u ojo seco severo. • Sujetos que presenten cualquier tipo de complicación tras una cirugía Intraocular reciente. • Enfermedades sistémicas como diabetes, artritis e hiper o hipotiroidismo y síndromes de ojo seco. • Cualquier otra patología ocular o sistémica que contraindique el uso de lentes de contacto o la cirugía intraocular. • Embarazo. • Alergias oculares. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Instituto de Microelectrónica de Barcelona (IMB-CNM) Campus Universidad Autónoma de Barcelona 08193 Bellaterra Barcelona - España ! ! Anexos ! ! ! ! ! 293 Anexo III Inocuidad del sensor flexible R5868-O2 en experimentales realizados en conejos de experimentación ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 294 Inocuidad del sensor flexible R5868-O2 en experimentales realizados en conejos de experimentación Introducción Dentro del marco del proyecto “Desarrollo de un nuevo método de diagnóstico no invasivo de la córnea basado en medidas de bioimpedancia usando micro-nano tecnologías”, se han realizado números experimentos invivo para determinar y mejorar, en función de los resultados, las características del sensor flexible R5868-O2. Uno de los objetivos principales de estos trabajos ha sido, entre muchos otros, determinar la seguridad del mismo al realizar mediciones invivo en córnea de conejo. Cabe destacar que todos los procedimientos que implicasen el uso de animales de experimentación en este proyecto, han sido previamente evaluados y aprobados por el Comité Ético en Experimentación y Bienestar Animal (CEEBA) de la Universidad de Valladolid. Las imágenes que a continuación se muestran han sido recogidas como representación de un alto porcentaje de animales que recibieron solamente la instilación de suero salino fisiológico inocuo, seguido de la aplicación del sensor de impedancia. Por un lado, se muestran las imágenes tomadas durante las observaciones con lámpara de hendidura (Kowa SL-15®, Kowa; Düsseldorf, Alemania) bajo la iluminación azul cobalto, necesaria para evidenciar la tinción fluoresceínica en aquellos casos en los que el epitelio corneal se encontrase ausente. Por otro lado, se muestran las imágenes correspondientes a la córnea del mismo animal postmortem, procesadas para microscopía óptica o microscopía electrónica de barrido. En todas ellas, puede observarse la inocuidad del sensor en el momento de su aplicación, al no existir tinción fluoresceínica en ningún caso, ni lesión microscópica corneal representativa. ! ! Anexos ! ! ! ! ! 303 Anexo V Consentimiento informado para el estudio ‘‘Evaluación de la sensibilidad del dispositivo de medida de la bioimpedancia corneal (dispositivo CORBI)’’ ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 304 ! ! Consentimiento!informado!para!el!estudio!‘‘Evaluación!de!la!sensibilidad!del!dispositivo!de! medida!de!la!bioimpedancia!corneal’’.! ! D/Dña!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!con!DNI!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!edad!!!!!!!!!!!!!!!!!! años,!con!domicilio!en!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!provincia!de! manifiesto!que!he!sido!informado/a!por!!sobre!los!! siguientes!aspectos!en!cuanto!a!mi!participación!en!el!estudio!arriba!mencionado.! 1.!He!leído!la!hoja!de!información!que!se!me!ha!entregado.! 2.!Mi!participación!en!este!estudio!es!de!forma!voluntaria.! 3.!Acepto!que!se!me!realicen!las!exploraciones!oftalmológicas!y!optométricas! necesarias!para!el!desarrollo!del!estudio.! 4.!Conozco!y!asumo!los!efectos!secundarios!que!se!puedan!derivar!de!este!estudio! y!que!me!han!explicado!los!investigadores.! 5.!He!podido!hacer!preguntas!sobre!el!estudio!y!he!recibido!suficiente!información! sobre!el!estudio.! 6.!He!hablado!con!el!equipo!investigador!abajo!firmante.! Por!lo!que!declaro!que!todas!mis!dudas!y!preguntas!han!sido!aclaradas,!que!he!comprendido! que!mi!participación!es!voluntaria!y!que!comprendo!que!puedo!retirarme!del!estudio!cuando! quiera,!sin!tener!que!dar!explicaciones!y!sin!que!esto!repercuta!en!mis!cuidados!médicos.!Por! ello!doy!mi!consentimiento!para!participar!en!el!estudio.! ! En!Valladolid,!a………………de……………………………………….de!2011! ! Firma!del!paciente!Firma!del!Testigo!Firma!del!Investigador! Estoy! de! acuerdo! en! que! mis! datos! personales! relativos! a! este! trabajo!sean! almacenados,! procesados!electrónicamente!y!transmitidos,!con!propósitos!de!análisis!de!los!datos!derivados! de! este! estudio.! Doy! mi! consentimiento! para! que! el! personal! autorizado! del! IOBA! o! las! autoridades! sanitarias! revisen! que! el!estudio!se! está! llevando! a! cabo! de! manera! correcta! e! inspeccionen!mi!historial!referente!a!mi!colaboración!en!el!mismo.! Así! mismo! autorizo! a! mi! investigador! a! que! revele! la! información! necesaria! recogida! en! el! estudio!para!que!pueda!ser!procesada,!sin!que!se!revele!mi!identidad.! ! ! ! Fecha! ! ! Anexos ! ! ! ! ! 307 Anexo VI Hoja de información para el sujeto para el estudio ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’ ! Tesis Doctoral ! ! ‘‘Cambios en la fisiología y morfología corneal inducidos por el porte de lentes de contacto’’ ! ! ! 308 Hoja%de%información%para%el%sujeto% % !! ! ! El! uso! de! lentes! de! contacto! para! corregir! defectos! de! refracción! es! un! método! seguro,! cómodo!y!muy!extendido!en!todo!el!mundo,!calculándose!que!más!de!40!millones!de!personas! utilizan! lentes! de! contacto! todos! los! días.! Durante! el! año! 2010,! el! 91%! de! las! lentes! de! contacto! que! se! adaptaron! en! España! fueron! lentes! de! contacto! hidrofílicas! (también! conocidas! como! lentes! de! contacto! blandas).! Su! seguridad! ha! sido! probada! en! numerosos! estudios! que! las! coloca! a! la! cabeza! como! primera! elección! para! la! adaptación!de! lentes! de! contacto.!! Es!conocido!que!el!uso!de!lentes!de!contacto!afecta!de!diferente!manera!a!la!fisiología!de!la! córnea! dependiendo! de! cada! persona! y! del! tipo! de! lente! de! contacto.! Ese! efecto! se! puede! medir! con! diferentes! técnicas! que! son! utilizadas! en! las! consultas! de! Optometría! y! Oftalmología.!Sin!embargo,!se!han!propuesto!nuevos!equipos!útiles!para!la!medida!no!invasiva! de!diferentes!características!de!la!córnea!que!apenas!se!emplean!en!la!práctica!habitual.!Entre! estas! técnicas! destacan! nuevos! equipos! de! microscopía! especular! que! permiten! captar! una! fotografía! del! endotelio! (capa! de! células! de! la! córnea! más! interna),! la! tomografía! de! coherencia!óptica!(OCT)!que!permite!una!visualización!transversal!de!la!córnea!y!la!topografía! de! elevación! (Orbscan)! ! y! Scheimpflug! (Pentacam)! que! permiten! estudiar! los! cambios! en! la! topografía!de!las!caras!anterior!y!posterior!de!la!córnea.!Todas!son!técnicas!no!invasivas,!sin! efectos!secundarios!y!seguras!para!la!exploración!ocular.! El! propósito! de! este! estudio! es! el!de! valorar! el! uso! de! las! técnicas! no! invasivas! de! imagen! anteriormente! mencionadas! para! medir! las! variaciones! que! provocan! el! uso! de! lentes! de! contacto!sobre!las!diferentes!capas!de!la!córnea!y!con!ello!mejorar!las!técnicas!de!adaptación! de!lentes!de!contacto.! Las!lentes!de!contacto!se!utilizarán!durante!un!breve!periodo!de!tiempo!(40!minutos),!tras!el! cual!serán!retiradas.!La!superficie!ocular!y!la!córnea!serán!evaluadas!mediante!SPR3000p,!3DR OCT,! Orbscan! II! y! Pentacam! ! para! valorar! la! capacidad! de! estos! aparatos! de! detectar! los! cambios!tempranos!provocados!por!el!uso!de!lentes!de!contacto.!También!se!emplearán!las! pruebas! habituales! para! la! exploración! y! adaptación! de! lentes! de! contacto,! garantizando! la! seguridad!de!sus!ojos.! Las!posibles!complicaciones!de!este!estudio!pueden!ser!las!mismas!que!se!derivan!del!uso!de! lentes!de!contacto!como!queratitis,!conjuntivitis,!úlceras!y!más!grave!y!excepcionalmente!el! caso! de! infección! corneal,! si! bien! es! muy! improbable! que! estas! puedan! aparecer! en! grado! significativo.!Pero,!en!el!caso!hipotético!de!que!Ud.!presentara!alguna!complicación!ésta!será! tratada!en!el!IOBA!según!los!protocolos!clínicos!adecuados.! Si!quiere!consultarnos!alguna!duda!o!pregunta!no!dude!en!consultar!con!cualquier!miembro! del!equipo.Muchas!gracias!por!su!colaboración.!! Raúl!Martín!Herranz! ! ! ! Anexos ! ! ! ! ! 311 Anexo VII Consentimiento informado para el estudio ‘‘Estudio IV. Asimetría del espesor corneal. Porte de LC a medio plazo’’