Producción de compuestos de interés nutricional a partir de bagazo de cerveza mediante tecnología microondas

UNIVERSIDAD DE VALLADOLID ESCUELA DE INGENIERIAS INDUSTRIALES Grado en Ingeniería Química PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS DE INTERÉS NUTRICIONAL A PARTIR DE BAGAZO DE CERVEZA MEDIANTE TECNOLOGÍA MICROONDAS Autor: Pérez de la Calle, Raquel Tutores: Lucas Yagüe, Susana López Linares, Juan Carlos Dpto. Ingeniería Química y TMA Valladolid, julio de 2019 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quiero agradecer a Susana Lucas Yagüe por haber querido ser mi tutora durante este trabajo, y por la paciencia que ha tenido conmigo. Muchas gracias por tu consideración y por el tiempo que has dedicado, me ha ayudado a mejorar mucho y aprender. Agradecer también a Juan Carlos su paciencia en el laboratorio al explicarme cada procedimiento de la mejor forma posible. Me he sentido muy cómoda y a gusto en estos meses, y la experiencia ha sido inolvidable, he aprendido mucho gracias a la atención que le has puesto a enseñarme. Gracias a mis ingenieras Estefanía, Chabe, Icíar e Iria, os habéis convertido en un apoyo enorme, me habéis dado el empujón cuando lo he necesitado y es que, hasta de los momentos de desesperación tengo un buen recuerdo, empezar riendo y acabar llorando. Hemos ido creciendo y superándonos juntas y no sabéis lo orgullosa que estoy de decir que tengo unas amigas como vosotras. Irene, mi ingeniera favorita, creo que sin ti no hubiera pasado ni de primero, gracias por ayudarme siempre amiga. Gracias a mis amigos de Íscar, por sacarme de casa y hacerme desconectar. Sara en especial a ti, por haber soportado vivir varios añitos conmigo, me has comprendido, me has visto en mis mejores y peores temporadas y me has apoyado incondicionalmente. Pero no hubiera llegado nunca hasta aquí si mi familia no me hubiera dado esta oportunidad que agradeceré toda mi vida. Muchas gracias por apoyarme hasta cuando ni yo siquiera sabía que iba a poder llegar hasta este punto, os quiero muchísimo. Raúl, vas a conseguir todos los objetivos que te propongas, solamente tienes que quererlo de verdad, y yo voy a estar ahí echándote una mano en todo lo que pueda. I ÍNDICE 1. RESUMEN/ABSTRACT........................................................................... 1 2. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 3 2.1 ARABINOXILANOS.............................................................................................. 3 2.1.1 COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA ................................................................. 4 2.1.2 PROPIEDADES ............................................................................................ 5 2.1.3 APLICACIONES............................................................................................ 8 2.2 BAGAZO DE CERVEZA ....................................................................................... 9 2.2.1 PROCESO DE PRODUCCIÓN .................................................................... 10 2.2.2 DATOS DE PRODUCCIÓN ......................................................................... 11 2.2.3 COMPOSICIÓN .......................................................................................... 11 2.2.4 APLICACIONES.......................................................................................... 12 2.3 OBTENCIÓN DE ARABINOXILANOS A PARTIR DEL BAGAZO DE CERVEZA ... 14 2.3.1 PRETRATAMIENTO .................................................................................... 15 2.3.2 EXTRACCIÓN ............................................................................................. 16 2.3.3 SEPARACIÓN/PURIFICACIÓN ................................................................... 20 2.4 PROCESOS ESTABLECIDOS PARA REALIZAR EL TRABAJO EXPERIMENTAL .... 20 3. OBJETIVOS ....................................................................................... 23 4. TRABAJO EXPERIMENTAL .................................................................... 25 4.1 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................... 25 4.1.1 MATERIA PRIMA Y REACTIVOS ................................................................ 25 4.1.2 ACONDICIONAMIENTO/PRETRATAMIENTO ............................................ 26 4.1.3 EXTRACCIÓN ALCALINA ASISTIDA CON TECNOLOGÍA MICROONDAS ... 27 4.1.4 EXPERIENCIAS PRELIMINARES............................................................... 30 4.1.5 DISEÑO EXPERIMENTAL.......................................................................... 31 4.1.6 PUNTO ÓPTIMO ........................................................................................ 32 4.1.7 SEPARACIÓN ............................................................................................ 32 4.1.8 MÉTODOS UTILIZADOS ............................................................................ 33 4.1.9 TRATAMIENTO DE DATOS........................................................................ 38 4.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 44 4.2.1 EXPERIENCIAS PRELIMINARES............................................................... 44 4.2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL.......................................................................... 46 4.2.3 OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN ASISTIDA CON MICROONDAS. ..... 53 5. EVALUACIÓN ECONÓMICA ................................................................... 57 5.1 COSTE TOTAL DE LA PLANTA .......................................................................... 58 II 5.2 VIABILIDAD ECONÓMICA Y ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD .............................. 60 6. CONCLUSIONES................................................................................. 65 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................... 66 8. ANEXO ............................................................................................. 69 III LISTA DE FIGURAS Figura 2.1-Estructura molecular del polímero de arabinoxilanos. (Holmsten, 2018) Figura 2.2Estructura química de una fracción de AX ferulado (Morales Otega et al., 2013). Figura 1.3Generación de BSG durante el proceso de elaboración industrial de la cerveza (Xiros & Christakopoulos, 2012). Figura 2.4 - Contenido medio de AX totales en granos enteros de distintos tipos de cereales (Bastos, Coelho, & Coimbra, 2018). Figura 2.5 - Diagrama de bloques de las principales etapas en la obtención de AX a partir de BSG. Figura 2.6 Diagrama de bloques del trabajo experimental realizado. Figura 4.1BSG seco sin moler. Figura 4.2BSG seco molido. Figura 4.3Medida de BSG sin moler. Figura 4.4Medida de BSG molido. Figura 4.5Diferencia de tamaño entre BSG antes y después de la molienda. Figura 4.6Tubo de presión de cerámica. Figura 4.7Rotor donde se colocan los tubos de presión. Figura 4.8Equipo de microondas apagado. Figura 4.9Equipo microondas con el rotor introducido en su interior. Figura 4.10Mezcla de BSG con NaOH antes de la extracción microondas. Figura 4.11Mezcla después de la extracción. Figura 4.12Sólido residual tras la centrifugación. Figura 4.13Extracto líquido rico en arabinoxilanos recuperado tras la centrifugación. Figura 4.14Fracción sólida centrifugada rica en AX. Figura 4.15Resuspensión de AX en etanol 95%. Figura 4.16Sólido seco con alto concentrado en AX. Figura 4.17Diagrama de los métodos de análisis usados para la fracción sólida tras la extracción alcalina asistida con microondas. IV Figura 4.18Diagrama de los métodos de análisis usados para la fracción líquida tras la extracción alcalina asistida con microondas. Figura 5.1Diagrama del proceso que tendría lugar en la planta piloto. V LISTA DE TABLAS Tabla 2.1Composición de BSG en distintos estudios (Ikram, Huang, Zhang, Wang, & Yin, 2017). Tabla 2.2Aplicaciones del BSG. Tabla 4.1Composición en porcentaje en peso por cada 100g de materia prima (BSG). Tabla 4.2Condiciones iniciales de las pruebas MAE de BSG con NaOH. Tabla 4.3Diseño experimental para la extracción de BSG alcalina asistida con tecnología microondas (2,5 min). Tabla 4.4Concentración (g/L) de azúcares del extracto líquido antes y después de HA, y concentración (g/L) de inhibidores en el extracto líquido antes de HA. Tabla 4.5pH del extracto líquido tras la MAE, recuperación total de sólidos (% RGT), concentración de oligómeros en el extracto líquido (g/L), pureza del extracto (%) y recuperación de azúcares del extracto líquido (%). Tabla 4.6Concentración (g/L) de glucosa, xilosa y arabinosa antes y después de someter el extracto líquido a HA, y concentración de inhibidores (g/L) del extracto líquido antes de HA para cada T y concentración de NaOH en cada experimento. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Tabla 4.7pH del extracto líquido tras la MAE, concentración (g/L) de oligómeros (xilosa y arabinosa) contenida en el extracto líquido tras la MAE y pureza de los AX (xilosa y arabinosa) contenidos en el extracto líquido tras MAE. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Tabla 4.8Recuperación total gravimétrica, (% RTG) de la fracción sólida, composición (%) de la fracción sólida tras la extracción MAE, grado de deslignificación de la fracción sólida tras la MAE. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante Tabla 4.9Recuperación de azúcares (recuperación de glucosa (%RG) y recuperación de azúcares hemicelulósicos (% RAH)) en el extracto líquido y en la fracción sólida. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Tabla 4.10-Concentración (g/L) de glucosa, xilosa y arabinosa antes y después de someter el extracto líquido a HA, y concentración de inhibidores (g/L) del extracto líquido antes de HA para cada T y concentración de NaOH en cada experimento. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Tabla 4.11pH del extracto líquido tras la MAE, concentración (g/L) de oligómeros (xilosa y arabinosa) contenida en el extracto líquido tras la MAE y pureza de los AX Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 6 Los AX solubles tienen muchas más propiedades funcionales en comparación con los insolubles, como aumentar el contenido el agua y disminuir los tiempos de digestión de los cerdos de forma que aumenta y regula su salud digestiva. También se ha demostrado que los AX aumentan la viscosidad de las disoluciones in vitro, de este modo esa viscosidad puede cambiar el metabolismo de lípidos y glucosa. (Chen et al., 2019) La viscosidad depende también del peso molecular, donde los AX solubles tienen una masa molecular de 10 a 10000 kDa mientras que los AX insolubles en agua exceden los 10000 kDa. (Rosicka-Kaczmarek et al., 2016) La viscosidad varía también dependiendo de la estructura. Así, los AX procedentes del salvado de trigo, en comparación con el pan de centeno, tienen muchas más ramificaciones, el cual le proporciona una mayor viscosidad, confirmando que el grado de ramificaciones en la cadena está directamente relacionado con la viscosidad. De forma similar, los AX con un alto peso molecular, tienen mayor viscosidad. Además, el contenido de ácido ferúlico contribuye a aumentar la viscosidad. Aparte de las propias características estructurales, una mayor concentración de AX también incrementa la viscosidad. (Chen et al., 2019) Propiedades funcionales de los arabinoxilanos. Existen varios estudios que confirman los efectos beneficiosos para los seres humanos de los AX derivados del trigo, aunque se necesita una mayor investigación in vivo para confirmar dichos efectos (Holmsten, 2018). o Interacción de los AX con la flora intestinal: efecto prebiótico. Un prebiótico es un alimento funcional, como la fibra dietética capaz de modificar la composición y actividad de la microbiota intestinal. (Holmsten, 2018). Existen numerosos estudios que indican el impacto de los AX en la salud humana. Los AX, que son los principales componentes de la fibra dietética insoluble, no se digieren en el tracto intestinal, sino que son fermentados por bacterias (Bifidobacterium) en el colon, dando lugar a cadenas cortas de ácidos grasos. (Rosicka-Kaczmarek et al., 2016). Los SCFA producen acetato, propionato y butarato, que inhiben el crecimiento de organismos patógenos y la formación de productos de ruptura que son tóxicos (Bhat & Rose, 2019). Dentro de los efectos positivos encontrados en los AX, se encuentran: mitigación del estreñimiento, reducción del nivel de colesterol LDL en sangre, disminución de nivel de glucosa en sangre, reducción de riesgo de desarrollar tumores, particularmente cáncer de colon, efecto antiinflamatorio e incrementa la absorción de minerales como calcio y magnesio. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 7 De modo que se ha confirmado que los AX y AXOS reducen la producción bacteriana de β-glucuronidasa y amonio en las heces, disminuyendo así los compuestos tóxicos en el colon. (Ciudad-Mulero, 2017) o Efecto de los arabinoxilanos en el metabolismo de lípidos. A pesar de que se han hecho algunos experimentos con animales demostrando que la suplementación con arabinoxilanos cambia la expresión genética en el hígado o el tejido adiposo reduciendo la cantidad de lípidos depositados en ellos, el mecanismo que lo realiza aún no queda esclarecido. Se necesitan más estudios para centrarse en la fracción bioactiva de arabinoxilanos que producen dicho cambio en la expresión genética y determinar si la flora intestinal está involucrada en dicho mecanismo. (Chen et al., 2019) o Efecto de los arabinoxilanos en el metabolismo de glúcidos. Se ha demostrado que los arabinoxilanos modifican la expresión genética del metabolismo en glúcidos, pero, como ocurre en el caso de los lípidos, el mecanismo no está claro. Es posible que las fracciones de arabinoxilanos bioactivas cambien la expresión genética o que los arabinoxilanos modifiquen la composición de la flora intestinal produciendo la modulación de la expresión genética. Además, los AX tienen la capacidad de los arabinoxilanos para reducir el nivel de glucosa en el plasma sanguíneo ayudando a controlar enfermedades como la diabetes. Este mecanismo descrito por Chen et al., 2019 puede ser uno de ellos para explicar el cambio en la expresión genética. o Efecto de los AX en el sistema inmunológico. El estudio de Mendis, Leclerc, & Simsek, 2016 indica que los AX tienen capacidad inmunomoduladora y además el sistema inmunológico reconoce los constituyentes de la fibra dietética. Varios estudios han determinado que la actividad antitumoral de los AX es principalmente debido a sus capacidades inmunoestimulatorias. Los AX incrementan la actividad de las células T y B e incrementa la respuesta inmunológica celular (M. Mendis & Simsek, 2014). o Capacidad antioxidante de los AX. La capacidad antioxidante de los AX está relacionada con el total de contenido ferúlico que contiene, ya que se encuentra unido de forma covalente al residuo de arabinosa. El ácido ferúlico de los AX implica capacidad antioxidante, de forma que el contenido de compuestos ferulados en los AX es el mayor factor para determinar su capacidad antioxidante (Chen et al., 2019). Son compuestos que evitan la oxidación de biomoléculas tales como lípidos, proteínas o ADN, y lesión de tejidos (Ciudad-Mulero, 2017). Entre los ácidos ferúlicos, se pueden encontrar también diy tri-, todos esterificados con Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 8 arabinosa, siendo el tri-ácido ferúlico el que tiene una mayor capacidad antioxidante por tener mayores unidades de ácido ferúlico en cada molécula, aumentando los hidrógenos donadores proporcionados por los grupos - OH.(Chen et al., 2019). 2.1.3 APLICACIONES El consumo de productos que contienen AX y AXOS tienen efectos beneficiosos en la salud humana. Estos efectos beneficiosos se adaptan muy bien a la actual tendencia en la dieta, es decir, un incremento del consumo y a su vez el desarrollo de tecnología para obtener alimentos con propiedades beneficiosas mejoradas para la salud. (Rosicka-Kaczmarek et al., 2016) La combinación de las propiedades prebióticas y antioxidantes hacen a los AXOS un interesante ingrediente en alimentos funcionales. Además, su estabilidad a bajo pH y altas temperaturas y solubilidad en agua contribuyen a aplicarlos como ingredientes en un gran rango de productos alimenticios (Snelders et al., 2014). Los AX tienen un efecto importante sobre las características resultantes de los productos obtenidos con esta materia prima. Debido a las propiedades fisicoquímicas, los AX se derivarán a un distinto uso. Estas propiedades dependen de las características de los AX antes descritas: la estructura molecular, el grado de sustitución y relación A/X. Estos polisacáridos adquieren mucha importancia en los procesos biotecnológicos que se encuentran relacionados con el procesamiento de cereales tales como horneado de pan, producción de cerveza, hidrolizado de glucosa y alimento para animales, y se debe tener en cuenta cómo interfieren los AX en la calidad de los productos. o Horneado de pan. En cuanto al sector panadero, los AX tienen un gran impacto en el proceso del horneado del pan. Añadir AX solubles en agua a la masa de trigo incrementa el volumen de la masa del pan al hornearse, también tienen un impacto positivo como conservante, manteniendo la humedad de la miga del pan y disminuyendo la descomposición del almidón por más tiempo durante su almacenamiento. Además de modificar las propiedades fisicoquímicas del pan y mejorar su calidad, añadir preparaciones específicas de AX ayuda a prevenir y tratar enfermedades relacionadas con la dieta mencionadas anteriormente, como reducir la glucosa en sangre, mejorando la salud en personas con diabetes de tipo II (Rosicka-Kaczmarek et al., 2016). o Elaboración de cerveza. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 9 La malta de cebada que se usa en la producción de cerveza suele contener entre 6 y 10% de AX. El contenido de AX en el grano de cebada depende de la variedad de grano y también de las condiciones ambientales y su forma de cultivo. Aunque la mayoría de los AX quedan en el BSG, hay una cantidad de AX que acaban en el producto final. Los AX aportan los beneficios antes descritos a la cerveza, pero también la gelifican y añaden turbidez (Rosicka-Kaczmarek et al., 2016). o Como ingrediente para alimentos funcionales. Hoy en día, el estilo de vida ajetreado afecta a la salud física y mental de las personas, aumentando el riesgo de todo tipo de enfermedades incluyendo gastrointestinales, de manera que la comida tiene un rol muy significativo en la salud del intestino llegando a aliviar y mitigar los síntomas del estrés. Los alimentos funcionales son aquellos que tienen propiedades que proveen y mejoran la salud, además de tener un valor nutricional. Se añaden a las comidas, de forma que quedan modificadas y enriquecidas para dar mayores beneficios en la salud que una dieta normal. Los alimentos funcionales están enriquecidos con probióticos, prebióticos y simbióticos así como de componentes de plantas o animales que tienen la capacidad de mejorar la salud y el bienestar (Bhat & Rose, 2019). Se han encontrado aplicaciones de los AX como sustituyente de sacarosa en la producción de galletas, añadiendo además propiedades beneficiosas para la salud humana incrementando el nivel de fibra de la galleta (Pareyt, Goovaerts, Broekaert, & Delcour, 2011). Actualmente los alimentos prebióticos también se venden en cápsulas y en polvo. 2.2 BAGAZO DE CERVEZA Los subproductos resultantes de la agricultura e industria, como el salvado de trigo o el bagazo de cerveza son ricos en polisacáridos celulósicos y no celulósico. En la actualidad, el interés por conseguir la total utilización de dichos subproductos está aumentando con el fin de garantizar la viabilidad económica y medioambiental de las empresas. Fraccionar dichos subproductos en sus componentes poliméricos y transformarlos en sus componentes monoméricos puede dar lugar a diversos caminos para explorar y la obtención de nuevos bioproductos. (Mandalari et al., 2005). El bagazo de cerveza es un residuo sólido insoluble obtenido del proceso de fabricación de la cerveza. Representa el 85% de los subproductos generados, siendo el mayor subproducto de la industria cervecera. A pesar de Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 10 ser un producto fácilmente aprovechable, el sector no le ha prestado atención de forma que se usa tradicionalmente de alimento para animales (Ikram et al., 2017). 2.2.1 PROCESO DE PRODUCCIÓN En las primeras etapas del proceso de producción de la cerveza, la cebada recogida de la cosecha se limpia y clasifica en tamaños. Se deja almacenada por 4-6 semanas y después se somete a un proceso de malteado, que es un proceso de germinación el cual sirve para aumentar el contenido enzimático del grano. En la fábrica de cerveza, la malta se muele y se mezcla con agua en un tonel macerador aumentando gradualmente su temperatura de 37 a 78ºC, de forma que así se promueve la hidrólisis enzimática de los constituyentes de la malta, mayoritariamente del almidón, pero también de otros componentes como las proteínas, β-glucanos y AX de forma que se solubilizan en el agua sus productos de ruptura. Durante el proceso de hidrólisis, el almidón se convierte en azúcares fermentables, (principalmente maltosa y maltotriosa) y azúcares no fermentables (dextrinas), y las proteínas son degradadas a polipéptidos y aminoácidos. Esta conversión enzimática llamada maceración produce un líquido de sabor dulce llamado mosto. La parte insoluble, formada por la malta, se asienta formando una cama en el macerador y se utiliza para filtrar el mosto. El mosto filtrado se usa como medio de fermentación para producir cerveza y a la fracción sólida residual resultante del grano de cebada malteado se le denomina bagazo de cerveza (Mussatto, Dragone, & Roberto, 2006). Figura 2.3 - Generación de BSG durante el proceso de elaboración industrial de la cerveza (Xiros & Christakopoulos, 2012). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 11 2.2.2 DATOS DE PRODUCCIÓN El bagazo de cerveza (BSG) es el mayor subproducto de la industria cervecera, abarcando el 85% de los subproductos generados. (Ikram et al., 2017) (Buffington, 2014). El BSG representa el 31% del peso de malta inicial y se obtienen 20 kg de BSG por cada 100 litros de cerveza producida. El BSG se encuentra en el mercado a precio muy bajo (Mussatto et al., 2006). En 2018, se produjeron 23.756.952 hL de cerveza, que equivalen a 475.179 toneladas de BSG. En el primer trimestre de 2019 se han consumido 755.1646 hL de cerveza, siendo el BSG producido de 151.932 toneladas (Las & Asociadas, 2019). En la Unión Europea se producen anualmente 3,4 millones de toneladas de bagazo de cerveza. A pesar de su gran volumen de producción, el sector no le ha prestado atención a este subproducto de forma que se ha usado tradicionalmente como alimento de animales. En los últimos años, el BSG ha ido ganando la atención para el consumo humano debido a sus componentes bioactivos y sus efectos beneficiosos para la salud. (Ikram et al., 2017). Uno de los problemas que tiene este residuo es su compleja composición, su gran contenido en humedad (aproximadamente el 75%), que provocan problemas en su almacenaje y transporte. Debido a esta humedad, se lo considera un material de desecho debido a que esta aumenta el riesgo de descomposición microbiológica. (Ikram et al., 2017). Para evitar estos problemas, se suele utilizar el secado (liofilización y secado en horno) como método de conservación del bagazo de cerveza (Cruz, 2018). 2.2.3 COMPOSICIÓN El bagazo de cerveza está compuesto mayoritariamente por la cáscara del grano, y pequeñas fracciones de pericarpio y del recubrimiento de la semilla (Bastos et al., 2018), compuesto por lignina, celulosa, hemicelulosa, lípidos y proteínas. El BSG es un material lignocelulósico ya que la celulosa (un homopolímero formado por unidades de glucosa), hemicelulosa y lignina (una macromolécula de polifenoles) forman casi el 50% en peso del BSG. En general, la composición del BSG depende del grano de cereal inicial. Como se indica en la Figura 2.4, se puede ver la media de AX que contienen distintos tipos de granos de cereal (en base seca). La cebada contiene un 5% de AX en el grano completo, un 18% en el salvado, un 15% en la paja, un 3% en la harina y un 20% en la cáscara (Bastos et al., 2018). También varía en función de la variedad de cebada, la temporada de cosecha, las condiciones de malteado y macerado, y la calidad y tipo de productos añadidos al proceso de fabricación de la cerveza (Mussatto et al., 2006). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 12 Figura 2.4 - Contenido medio de AX totales en granos enteros de distintos tipos de cereales (Bastos et al., 2018). El BSG está compuesto entre 15-26,2% de proteínas y 70% de fibras, las cuales se dividen en celulosa (entre 15,5 y 25% w/w), hemicelulosas (28 a 35% w/w) y lignina (aproximadamente 28% w/w), también puede contener lípidos y cenizas. (Ikram et al., 2017). Los principales componentes de los tejidos fibrosos son arabinoxilanos, lignina y celulosa. En concentraciones mucho menores, en el BSG también se encuentran minerales, vitaminas y aminoácidos (Mussatto et al., 2006). En la Tabla 2.1, se presentan los datos de composición del BSG obtenidos de diferentes estudios. Tabla 2.1 - Composición de BSG en distintos estudios (Ikram et al., 2017). Peso de los componentes en g/kg base seca Celulosa Hemicelulosa Proteínas Cenizas Lignina (glucosa) (xilosa) (Arabinosa) Estudio realizado por: 153 46 278 168 199 85 Mussato et al., 2006 240 24 118 254 ND ND Kanauchi et al., 2001 246 12 217 219 206 90 Carvalheiro et al., 2004 ND 46 169 253 ND ND Silva et al., 2004 247 42 194 217 136 56 Moreira et al., 2013 ND: No determinado en el estudio. 2.2.4 APLICACIONES Los subproductos lignocelulósicos (madera, paja, materiales agrícolas e industriales) son el material orgánico más abundante de la tierra, siendo aproximadamente el 50% de la biomasa con una producción mundial de 1x1010 Mt. (Buffington, 2014). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 13 Las grandes cantidades de grano usado y el incremento en la valoración de residuos orgánicos y bioeconomía circular, han impulsado el interés en desarrollar nuevos caminos de valorización como una alternativa al tradicional uso como alimentación animal. El grano usado BSG tiene un alto contenido en recursos nutritivos, por lo que puede ser usado como materia prima en distintos tipos de industria como alimento de ganado, químicos, industria farmacéutica y biofuel (Spjelkavik, Karlijn, Taylor, Bolwig, & Mark, 2019). En la tabla 2.2 quedan recogidas las principales aplicaciones del BSG: Tabla 2.2 - Aplicaciones del BSG. Producto Uso del BSG Estudio: Alimento para animales Es un ingrediente excelente para el alimento de animales como rumiantes, aves, cerdos y pescado debido a que proporciona proteínas, fibra y energía mediante su ingesta. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Nutrición humana El BSG es un ingrediente que, añadido en bajas concentraciones, mejora las propiedades sensoriales como el sabor y las nutricionales al tener alto contenido en proteínas y fibra, bajo contenido calórico, capacidad alta de absorción en agua, contiene minerales como Ca, P, Fe, Cu, Zn y Mg y fácil de mezclar. Debido a esto se ha añadido como ingrediente de: harina para hornear pan (5% a 10%), pasta, salchichas y snack de fritura. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Ikram et al., 2017 Producción de energía El BSG se usa para producir energía por combustión directa o se fermenta para producir biogas. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Producción de carbón Se hacen bloques de carbón secando el BSG con un poder calorífico de 27 MJ/kg. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Componente de bricks Al ser un material formado mayoritariamente por fibra y poco contenido de cenizas, el BSG se usa para fabricar bricks, pudiendo sustituir al serrín, aumenta su porosidad. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Fabricación de papel El BSG se utiliza para la producción de productos de papel como tarjetas, papel para secarse o posavasos. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Adsorbente Debido a su poder adsorbente, se utiliza para adsorber distintos tipos de componentes como compuestos orgánicos volátiles de gases residuales. También adsorbe cadmio y plomo de soluciones acuosas. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 14 Procesos biotecnológicos Se usa como sustrato para cultivo de microorganismos y sustrato para producción enzimas debido a su alto valor nutricional. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 Obtención de bioproductos Producción de AX, compuestos fenólicos, xilitol y arabitol. Mussato, Dragone, & Roberto, 2006 2.3 OBTENCIÓN DE ARABINOXILANOS A PARTIR DEL BAGAZO DE CERVEZA Como ha sido descrito anteriormente, el BSG contiene componentes de interés que deben extraerse para poder aprovechar sus distintas aplicaciones. Este trabajo centra su atención en la recuperación de los AX contenidos en el BSG para su uso como prebiótico en alimentos o suplementos alimentarios. Como se aprecia en la Figura 2.5, el proceso de obtención de AX se puede dividir en tres etapas, una de pretratamiento, otra de extracción de la materia prima (BSG), seguido de una etapa de separación y purificación del extracto para obtener el compuesto de interés (AX). Antes de la etapa de pretratamiento, se incluyen otras operaciones unitarias como son el secado y el lavado del BSG (acondicionamiento de BSG). Secado previo El bagazo, cuyo contenido en agua está entre 70-80%, se somete a un proceso de secado hasta lograr un contenido de humedad del 10-12% necesario para para evitar su deterioro. Este secado puede ser realizado mediante diferentes técnicas como secado con tambor rotatorio, secado mediante un flujo de vapor sobrecalentado, secado mediante separación con membranas con secado a vacío o secado en estufa (Skendi, Harasym, & Galanakis, 2018). Lavado previo Antes de realizar este secado, se puede realizar un lavado previo del BSG con agua destilada con el fin de eliminar los restos de glucosa procedentes del BSG PRODUCTO CON ALTO CONTENIDO EN AX PRETRATAMIENTO EXTRACCIÓN SEPARACIÓN/ PURIFICACIÓN Figura 2.5 - Diagrama de bloques de las principales etapas en la obtención de AX a partir de BSG. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 15 residuo de mosto, obtenido tras la etapa de maderación en el proceso de elaboración de cerveza. 2.3.1 PRETRATAMIENTO La etapa de pretratamiento tiene como objetivo modificar la estructura lignocelulósica favoreciendo el acceso del disolvente a los AX durante la posterior etapa de extracción. Puede ser realizada mediante tratamientos como molienda o la utilización de la tecnología de ultrasonidos (US). Se ha demostrado que el uso de cualquiera de estos tratamientos afecta a la solubilidad y estructura de los componentes del BSG. (Skendi et al., 2018) Molienda Mediante este proceso, la solubilidad de los WEAX mejora al reducir el tamaño de partícula del BSG, aumentando el área específica de contacto BSGdisolvente. Al disminuir el tamaño de partícula de BSG, se facilita de este modo que los polímeros más ramificados se puedan extraer. (Skendi et al., 2018). Un tamaño de la partícula menor permite incrementar el alcance de la hidrólisis. Las partículas de mayor tamaño se impregnan menos por lo que se tiene un menor rendimiento de extracción ya que en el interior de la partícula se ha producido una hidrólisis incompleta. (Bastos et al., 2018) Ultrasonidos La extracción con ultrasonidos (US) es un proceso que puede utilizarse tanto como pretratamiento antes de realizar la extracción, ya que se ha demostrado que aumenta su rendimiento, o directamente como método de extracción con el uso de un solvente adecuado. La tecnología de US provoca fluctuaciones de presión en el agua que se propagan a través del material. Las olas de presión y el fenómeno de cavitación producen unas burbujas que colapsan y producen un aumento de la temperatura en esa zona que rompe las paredes celulares. Además, promueve la ruptura de los enlaces de los AX con la lignina. Al romperse las paredes celulares se libera el contenido de la célula en el medio. El pretratamiento usando ultrasonidos y agua es una etapa de pretratamiento utilizada para la eliminación de almidón y proteínas de los subproductos de los cereales (mejora del rendimiento y de la pureza de los AX en la etapa de extracción). Se ha demostrado que usar este tratamiento reduce el tiempo de extracción, el solvente a utilizar y la temperatura de extracción, produciendo un rendimiento y una pureza de polisacáridos más altos, sin modificar su estructura ni sus propiedades funcionales (Bastos et al., 2018). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 23 3. OBJETIVOS El objetivo global de este proyecto es realizar un estudio experimental a escala laboratorio para la recuperación de arabinoxilanos (AX) mediante una extracción alcalina asistida con tecnología microondas a partir de bagazo de cerveza (BSG). Los objetivos parciales de este proyecto quedan enumerados a continuación: 1. Hacer una revisión bibliográfica con el fin de analizar que la propuesta del estudio experimental sobre las distintas etapas de obtención de AX a partir de BSG es más eficaz que otras alternativas y desempeñarla de la forma más eficiente. 2. Realizar un estudio experimental basado en la optimización de la etapa de extracción alcalina con NaOH asistida con tecnología microondas. 2.1. Llevar a cabo unas experiencias preliminares, las cuales van a ayudar a determinar los principales parámetros de operación del diseño experimental. 2.2. Proponer y realizar un diseño experimental para la etapa de extracción, utilizando el software Statgraphics Centurion XVIII. 2.3. Obtener las condiciones óptimas de extracción que permitan obtener la máxima recuperación de arabinoxilanos en el extracto líquido. 3. Comprobar la viabilidad económica que tendría una planta piloto de capacidad de tratamiento de 40kg/h BSG húmedo mediante un estudio de costes de la planta y un análisis de sensibilidad del proyecto. El presente Trabajo de Fin de Grado re ha realizado en el marco del proyecto “Transformación de las fracciones lignocelulósicas del bagazo de cerveza en productos con valor energético y alimentario” financiado por la Junta de Castilla y León (VA010P17) y concedido al Grupo de Investigación Reconocido de Tecnología de Procesos Químicos y Bioquímicos (GIR 30) de la Universidad de Valladolid, que pertenece al Instituto de Procesos Sostenibles de la misma universidad. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 25 4. TRABAJO EXPERIMENTAL 4.1 MATERIALES Y MÉTODOS 4.1.1 MATERIA PRIMA Y REACTIVOS Bagazo de cerveza: el BSG utilizado ha sido proporcionado por una cervecería local (Mahou SA, Burgos), y ha sido almacenado a -20ºC hasta su uso. Su composición queda recogida en la Tabla 4.1, en porcentaje en peso por cada 100g de materia prima de BSG. Su caracterización ha sido realizada en el estudio de López-linares et al., 2019: Tabla 4.1Composición en porcentaje en peso por cada 100g de materia prima (BSG). Componentes M. Prima Original (% w/w) Glucosa 19,68 ± 0,34 XGM 23,44 ± 0,46 Arabinosa 8,95 ± 0,43 Celulosa 17,89 ± 0,31 Hemicelulosa 28,67 ± 0,80 LAI 19,43 ± 1,21 LAS 6,35 ± 0,10 Lignina total 25,78 ± 1,21 CAI 1,04 ± 0,35 Cenizas totales 2,72 ± 0,13 grupos acetilos 1,04 ± 0,05 Extractos 2,33 ± 0,14 Glucosa en extractos 1,34 ± 0,10 Almidón 2,11 ± 0,02 Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 26 Reactivos utilizados en el trabajo experimental: - Hidróxido de sodio (NaOH) con pureza 98% de la casa comercial Panreac Applichem, usado para la realización de los experimentos con el microondas. - Ácido sulfúrico de pureza 72% (H2SO4), de la casa comercial Panreac Applichem, utilizado para realizar la hidrólisis ácida de los prehidrolizados y la caracterización de los sólidos pretratados. - Etanol de pureza 96% (EtOH) de la casa comercial Panreac Applichem, utilizado para la recuperación de los AX. - Agua destilada tipo II. 4.1.2 ACONDICIONAMIENTO/PRETRATAMIENTO Se procede a lavar el bagazo con agua destilada (tipo II) ya que es un residuo obtenido de un proceso industrial, de esta forma se elimina la glucosa desprendida en el proceso de maceración. Después, el bagazo ya lavado se seca en una estufa a temperatura de 50ºC. Una vez el bagazo esté seco, se almacena en bolsas de plástico. Como pretratamiento, se realiza una molienda utilizando un molinillo de café (Moulinex, A505, Francia), para reducir el tamaño de partícula del BSG y de forma que el tamaño de partícula sea como máximo de 2 milímetros. En la Figura 4.1 y Figura 4.2 se muestra la forma de almacenamiento del bagazo seco sin moler y tras el proceso de molienda. Figura 4.1BSG seco sin moler. Figura 4.2BSG seco molido. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 27 En la Figura 4.3 y Figura 4.4 se muestra el tamaño de partícula del BSG antes y después de la molienda, en la Figura 4.5 se comparan los tamaños antes y después de la molienda. Figura 4.3Medida de BSG sin moler. Figura 4.4Medida de BSG molido. Figura 4.5Diferencia de tamaño entre BSG antes y después de la molienda. 4.1.3 EXTRACCIÓN ALCALINA ASISTIDA CON TECNOLOGÍA MICROONDAS Los AX se van a extraer mediante una extracción alcalina utilizando tratamiento microondas con hidróxido de sodio (NaOH) como solvente. El equipo de microondas empleado en la etapa de extracción de AX es el modelo Multiwave PRO SOLV reactor 50 Hz con Rotor tipo 16HF100 de la casa comercial Antoon Paar GmbH (Austria, Europa). El microondas está compuesto por dos magnetrones de 1000W, siendo 1800W la máxima potencia del microondas. Se utilizan tubos de presión de PTFE-TFM (Figura 4.6), los cuales son introducidos dentro de tubos de Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 28 cerámica. Estos tubos tienen una de capacidad de 100mL y están provistos con imanes agitadores. El reactor puede ser usado con 16 tubos (Figura 4.7), uno de ellos llevando una sonda que mide la presión y temperatura dentro del tubo. Este sensor tiene como finalidad controlar en todo momento la energía que el microondas aplica al reactor. Además, incorpora un sensor IR para registrar la temperatura de todos los tubos constantemente. En las Figuras 4.8 y Figura 4.9 se visualiza el equipo microondas con el rotor en su correcta posición. Figura 4.6Tubo de presión de cerámica. Figura 4.7Rotor donde se colocan los tubos de presión. Figura 4.8Equipo de microondas apagado. Figura 4.9Equipo microondas con el rotor introducido en su interior. Inicialmente se mezcla el BSG con hidróxido de sodio con una relación sólido-líquido del 10% w/v (5 g BSG en peso seco y 50mL de NaOH) en cada tubo que se va a introducir al reactor microondas (Figura 4.10). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 29 Figura 4.10Mezcla de BSG con NaOH antes de la extracción microondas. Se fija la temperatura de trabajo del reactor y el tiempo de mantenimiento. Para cada uno de los experimentos, se emplean diferentes rampas de temperatura dependiendo de la temperatura de trabajo. El reactor se calienta hasta alcanzar la temperatura seleccionada. Al alcanzar esta temperatura, esta se mantiene el tiempo establecido. Una vez terminado el experimento, los tubos se enfrían hasta 50ºC. La mezcla se oscurece quedando de color marrón debido a que parte de la lignina del BSG se disuelve en la sosa (Figura 4.11). Figura 4.11Mezcla después de la extracción. Después del tratamiento por microondas, la fracción sólida se separa del extracto líquido mediante centrifugación (Figuras 4.12 y 4.13). La fracción sólida se lava con agua destilada y se lleva a secar a 50ºC en una estufa para determinar la recuperación de sólidos (g fracción sólida/100g BSG agotado) y para su posterior caracterización (determinación de su contenido en azúcares, lignina y cenizas) El extracto líquido, rico en AX, fue analizado para saber su composición de monosacáridos, productos de degradación (como ácido fórmico, ácido acético, HMF y furfural) y su contenido en carbono orgánico total. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 30 Figura 4.12Sólido residual tras la centrifugación. Figura 4.13Extracto líquido rico en arabinoxilanos recuperado tras la centrifugación. 4.1.4 EXPERIENCIAS PRELIMINARES Con la finalidad de establecer un intervalo razonable de temperatura y concentración de NaOH para la etapa de extracción de AX a partir de BAG se van a realizar unas experiencias previas al diseño experimental. Estas pruebas tienen por finalidad encontrar la zona de trabajo óptima para asegurar una mayor recuperación de AX. Las condiciones de trabajo de estas pruebas iniciales están en la Tabla 4.2. Se han realizado un total de 13 experimentos operando en un intervalo de trabajo de temperatura (120-180ºC), y un intervalo de concentraciones de Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 31 (0,05-0,2 M). El tiempo de mantenimiento ( 2,5 min) ha sido fijado en base a otras experiencias realizadas con BSG utilizando como disolvente agua (Lópezlinares et al., 2019). El experimento (P13) ha sido realizado con un tiempo de 5 min con el fin de justificar que los tiempos de mantenimiento superiores no mejoran los rendimientos de recuperación de AX. Tabla 4.2Condiciones iniciales de las pruebas MAE de BSG con NaOH. Exp Tª (ºC) Tiempo de mantenimiento de temperatura (min) Concentración de NaOH (M) P1 120 2,5 0,05 P2 0,1 P3 0,2 P4 150 2,5 0,05 P5 0,1 P6 0,2 P7 180 2,5 0,05 P8 0,1 P9 0,2 P10 0,3 P11 200 2,5 0,2 P12 0,3 P13 180 5 0,2 4.1.5 DISEÑO EXPERIMENTAL Con el fin de seleccionar las condiciones óptimas para la extracción alcalina asistida mediante tecnología microondas, se ha propuesto un diseño experimental con ayuda del software estadístico Statgraphics Centurion XVIII en base a los resultados de las experiencias preliminares realizadas. El diseño experimental seleccionado es el denominado Diseño Central Compuesto, el cual es un diseño de superficie de respuesta. Los factores establecidos han sido la temperatura de extracción (niveles entre 170ºC y 210ºC) y la concentración de NaOH (niveles entre 0,1 y 0,4 M). El diseño está formado por 13 puntos (experiencias), incluyendo un punto y cuatro réplicas en el centro del dominio seleccionado para cada factor estudiado (puntos centrales) y 4 puntos estrella, 2 por cada factor. Los factores y niveles quedan recogidos en la Tabla 4.3. El tiempo de mantenimiento de la temperatura ha sido fijado en 2,5 min. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 38 desecador durante 10 min para que alcancen la temperatura ambiente, Una vez alcancen la temperatura ambiente, los crisoles con las cenizas se pesan. Procedimiento: Determinar la tara del crisol, introduciendo el crisol vacío en la mufla a 550ºC hasta peso constante. Enfriar el crisol a temperatura ambiente en un desecador y pesar con precisión de 0,1 mg. Pesar 1,0 g de muestra y anotar el peso de muestra descontando la tara del crisol. Introducir el crisol en la mufla a 550ºC durante un mínimo de tres horas, o hasta que el carbono se haya eliminado. Calentar lentamente y evitar sobrepasar la temperatura. Si la muestra tiende a encenderse, cubrir parcialmente el crisol. Enfriar el crisol a temperatura ambiente en un desecador y pesar con precisión de 0,1 mg. Determinación de carbohidratos y compuestos inhibidores en el extracto líquido mediante HPLC. Para medir los carbohidratos y compuestos inhibidores en el extracto líquido, se introduce el extracto en botes de 2mL y se centrifugan (10 min, 13,4x1000 rpm) para eliminar todo tipo de finos, seguidamente se llenan viales con las muestras para llevar al HPLC. Procedimiento hidrólisis ácida realizada al extracto líquido. Se añaden 2mL de extracto líquido junto con 3mL de H2SO4 al 72% en una botella ISO 250mL, tapando con papel de alumino para evitar pérdidas. La mezcla se lleva a un agitador orbital durante 30 min, a 30ºC y 200 rpm. Se añaden 84mL de agua destilada a la mezcla (corresponde a una segunda hidrólisis con ácido diluido), y se lleva a autoclave pesándolo antes, ya que se van a tener en cuenta las pérdidas en el tratamiento de datos. Tras acabar el tiempo de autoclave (60 min a 120ºC), las muestras se enfrían introduciéndose en un baño con hielo. Cuando se enfrían, cada botella se pesa para determinar los gramos de pérdidas en el proceso de autoclavado. Seguidamente, las muestras se filtran en viales tal como se ha comentado anteriormente para su análisis mediante HPLC. 4.1.9 TRATAMIENTO DE DATOS Los datos obtenidos en este trabajo se dividen en: - Tratamiento de la fracción sólida. - Tratamiento del extracto líquido. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 39 TRATAMIENTO DE LA FRACCIÓN SÓLIDA Carbono Orgánico Total (TOC) De forma teórica, para la xilosa y arabinosa (5 carbonos en su estructura y peso molecular de 150,13 g/mol), se calcula su carbono orgánico total partiendo de su concentración (g/L) mediante la Ec1: 𝐂𝐎𝐓 (𝒈 𝑳 ⁄) = 𝑔 𝐿 ⁄·𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑡ó𝑚𝑖𝑐𝑜 𝐶 (60 𝑔/𝑚𝑜𝑙) 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐. 𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 (150,13 𝑔/𝑚𝑜𝑙) Ec (1) Cenizas insolubles en ácido (CAI) Su porcentaje se calcula mediante la Ec 2: %𝑪𝑨𝑰 = 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑓𝑙𝑎 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑔𝑜𝑡.𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 ·100 Ec (2) Lignina soluble en ácido (LAS) Se utiliza un coeficiente de extinción de 110 l/g-cm, para calcular la cantidad lignina ácido soluble en el hidrolizado. Los coeficientes a 205 nm para la mayoría de las maderas están entre 88 y 113 l/g-cm. El valor de 110 utilizado aquí está de acuerdo con el valor utilizado en el procedimiento TAPPI, y representa una medida de valores de diferentes maderas y pulpas. Para una muestra de biomasa sólida, el porcentaje de LAS en base al peso seco a 105ºC, o en base libre de extractivos se calcula de la siguiente manera El cálculo que determina la composición de la lignina ácido soluble es utilizando la Ec 3: %𝑳𝑨𝑺 = 𝐴 𝑏 ×𝑎 · 𝑑𝑖𝑙 40 ·87𝑚𝐿 ·𝐿 1000 𝑚𝐿 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑔𝑜𝑡𝑎𝑑𝑜 Ec (3) Donde: A = absorbancia a 205 nm df = factor de dilución b = longitud de paso de luz de la cubeta del espectrofotómetro, 1 cm a = coeficiente de extinción = 110 L/g-cm Cenizas de la fracción sólida tras la extracción Las cenizas del sólido tras la extracción asistida con microondas se calculan mediante la Ec 4: Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 40 %𝑪𝑬𝑵 = 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑓𝑙𝑎 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑔𝑜𝑡.𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 ·100 Ec (4) Cenizas insolubles en ácido Son las cenizas que se obtienen después de hacer pasar por la mufla el sólido insoluble filtrado de la HA de sólidos, calculando su porcentaje mediante la Ec 5: %𝑪𝑨𝑰 = 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑓𝑙𝑎 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑔𝑜𝑡.𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 ·100 Ec (5) Celulosa y hemicelulosa La celulosa (Ec 6) proviene de la glucosa y la hemicelulosa (Ec 7) está formada por el resto de azúcares: xilosa, arabinosa, galactosa y manosa, aunque de estas dos últimas no se obtienen cantidades para ser consideradas, se desprecian. % 𝑪𝒆𝒍𝒖𝒍𝒐𝒔𝒂 = 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 1,1 ·100 Ec (6) % 𝑯𝒆𝒎𝒊𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒐𝒔𝒂 = ( 𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎 1,13 + 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 + 𝑚𝑎𝑛𝑜𝑠𝑎 1,11 ) · 𝟏𝟎𝟎 Ec (7) Concentración inicial de la fracción sólida La concentración inicial de las muestras sólidas de BSG tras la extracción MAE y los patrones de glucosa, xilosa y arabinosa se calcula d la siguiente forma (Ec 8): 𝒈 𝑳 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 ⁄=𝑔 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒 (≈ 0,3𝑔) (3𝑚𝐿 𝐻2𝑆𝑂4+84𝑚𝐿 𝐻2𝑂) Ec (8) Degradación de patrones: glucosa, xilosa y arabinosa Con la concentración inicial y la medida obtenida de los patrones en HPLC tras la HA, se saca un factor de corrección mediante la Ec 9: 𝒇𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒄𝒄𝒊ó𝒏 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑔 𝐿 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 ⁄ 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑔 𝐿 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝐻𝑃𝐿𝐶 ⁄ Ec (9) Debido a que la xilosa es más lábil, se degrada más y se obtendrá un factor de corrección mayor. Humedad El porcentaje de humedad se calcula como (Ec 10): Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 41 % 𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅 = 100 − %𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 Ec (10) Donde el porcentaje de sólidos es (Ec 11): %𝒔ó𝒍𝒊𝒅𝒐𝒔 = 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑎 Ec (11) La recuperación total gravimétrica de los licores es la recuperación de los sólidos insolubles en NaOH tras la extracción MAE, se calcula a través de la Ec 12: % 𝑹𝑻𝑮 = 𝑔 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜/𝑡𝑢𝑏𝑜 5𝑔(𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑡𝑢𝑏𝑜 ) ·100 Ec (12) Donde los gramos totales de sólido tras MAE secos son calculados con la Ec 13: 𝒈 𝒔ó𝒍𝒊𝒅𝒐 𝒔𝒆𝒄𝒐 = 𝑔 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 5𝑔 𝑡𝑢𝑏𝑜 · (1 − ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑) Ec (13) Concentración corregida Se multiplica el dato obtenido de glucosa/xilosa/arabinosa medido en el HPLC por el factor de corrección obtenido por los patrones. Después, se calcula la concentración corregida en función de 100g de sólido agotado (Ec 14). % 𝒈 𝑮𝑳𝑼 𝟏𝟎𝟎 𝒈 ⁄𝒔ó𝒍𝒊𝒅𝒐 𝑴𝑨𝑬 = 𝑔 𝐿 ⁄ 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑜𝑠 · 0,087 𝐿 𝑔𝑟. 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 ·100 Ec (14) El porcentaje de g GLU/100g sólido MAE se va a poner en función del bagazo de cerveza inicial (g GLU/100g sólido BSG inicial) utilizando cambios de base. Recuperaciones de azúcares (de sólidos) La recuperación de azúcares va a ser analizada mediante dos cálculos: - RGs: es la recuperación de glucosa en la fracción sólida tras MAE (g glucosa en sólido pretratado/100g glucosa en la materia prima) (Ec 15): % 𝑹𝑮𝑺 = %𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑀𝐴𝐸 % 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑀𝐴𝐸 (𝑚𝑎𝑡 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑎) ·100 Ec (15) - RAHs: Es la recuperación de los azúcares hemicelulósicos (xilosa y arabinosa) en la fracción sólida tras la MAE (g azúcares Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 42 hemicelulósicos en sólido pretratado/100g azúcares hemicelulósicos en la materia prima) (Ec 16): %𝑹𝑨𝑯𝑺=%(𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎) 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑀𝐴𝐸 % (𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎)𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑀𝐴𝐸(𝑚𝑎𝑡 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑎) ·100 Ec (16) En la Ec 17 se refleja cómo se ha calculado el porcentaje de glucosa/xilosa/arabinosa después de la MAE: % 𝒅𝒆𝒔𝒑𝒖é𝒔 𝑴𝑨𝑬 = 𝑔𝑟. 𝐺𝐿𝑈 100 𝑔 ⁄𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 𝑀𝐴𝐸 · %𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑀𝐴𝐸 Ec (17) Grado deslignificación El grado de deslignificación (Ec 19) es la cantidad de lignina que se ha disuelto en la base tras la MAE, es la diferencia entre el porcentaje de lignina entre 100% de la materia prima y el porcentaje de lignina recuperado (Ec 18): % 𝒓𝒆𝒄𝒖𝒑. 𝒍𝒊𝒈𝒏𝒊𝒏𝒂 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = (%𝐿𝐴𝑆 · %𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝)+ (𝐿𝐴𝐼 · %𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝) %𝐿𝐴𝐼 𝑚𝑎𝑡 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑎 + %𝐿𝐴𝑆 𝑚𝑎𝑡 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑎 ·100 Ec (18) 𝑮𝒓𝒂𝒅𝒐 𝒅𝒆𝒔𝒍𝒊𝒈𝒏𝒊𝒇. = 𝟏 − %𝒓𝒆𝒄𝒖𝒑 𝒍𝒊𝒈𝒏𝒊𝒏𝒂 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 Ec (19) TRATAMIENTO DEL EXTRACTO LÍQUIDO Datos HPLC licores tras la extracción MAE (antes hidrólisis ácida) La masa de materia prima utilizada en cada tubo es de ≈5,13 g, ya que la masa tiene un porcentaje de humedad, de modo que, añadiendo esa cantidad, se están añadiendo 5g de BSG seco. Reajuste de datos HPLC licores post hidrólisis ácida. Tras la hidrólisis ácida hay una pérdida de peso que se va a tener en cuenta. Para calcular la concentración de oligómeros (xilosa +arabinosa) que se tiene después de la hidrólisis ácida se calcula (Ec 20): 𝒈 𝑳 ⁄𝒑𝒐𝒔𝒕 𝑯𝑨 𝒓𝒆𝒂𝒋𝒖𝒔𝒕𝒂𝒅𝒐 = 𝑔 𝐿 ⁄𝑝𝑜𝑠𝑡 𝐻𝐴 · (89𝑚𝐿 −𝑔𝑟 𝑝𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝑠) 2𝑚𝐿 Ec (20) Cálculo de la concentración de oligómeros. Se realiza el cálculo de los oligómeros utilizando la xilosa y arabinosa mediante la Ec 21: 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 (𝒈 𝑳 ⁄) 𝒐𝒍𝒊𝒈ó𝒎𝒆𝒓𝒐𝒔 = 𝑔 𝐿 ⁄ (𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 𝑦 𝑎𝑟𝑎𝑏)𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝐻𝐴 − 𝑔 𝐿 ⁄ (𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 𝑦 𝑎𝑟𝑎𝑏)𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝐻𝐴 Ec (21) Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 43 Donde los oligómeros son la resta de los azúcares antes y después de la HA. Recuperación de azúcares. Como se ha realizado anteriormente con el residuo sólido tras la MAE, se van a calcular la recuperación de azúcares: - RGL: es la recuperación de glucosa en la fracción líquida de la MAE (g glucosa en líquido tras MAE/100g glucosa en la materia prima) (Ec 22). % 𝑹𝑮𝑳= 𝑔 𝐿 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 · 50𝑚𝐿 · 10−3 ⁄ 5𝑔/𝑡𝑢𝑏𝑜 19,68𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 100 𝑔/𝑡𝑢𝑏𝑜 ·100 Ec (22) - RAHL: recuperación de azúcares hemicelulósicos (xilosa y arabinosa) en la fracción líquida (g azúcares hemicelulósicos en líquido tras MAE/ 100g glucosa en la materia prima) (Ec 23). % 𝑹𝑨𝑯𝑳= 𝑔 𝐿 (𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎) · 50𝑚𝐿 · 10−3 ⁄ 5𝑔/𝑡𝑢𝑏𝑜 (23,44 + 8,95)𝑔 (𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎) 100 𝑔/𝑡𝑢𝑏𝑜 ·100 Ec (23) Pureza del líquido extraído (xilosa y arabinosa). Donde el peso atómico del carbono es 12 g/mol multiplicado por los 5 carbonos contenidos en su estructura. La pureza de los AX extraídos se va a determinar mediante la Ec 24, basada en el contenido en carbono total de xilosa y arabinosa como azúcar monomérico y oligomérico (g, el medido tras la HA) dividido entre el COT del extracto líquido tras la MAE medido en el HPLC. % 𝑷𝒖𝒓𝒆𝒛𝒂 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒄𝒕𝒐 𝒍í𝒒𝒖𝒊𝒅𝒐 = 𝐶𝑂𝑇 𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 + 𝐶𝑂𝑇 𝑎𝑟𝑎𝑏𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎 𝐶𝑂𝑇 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑙í𝑞. 𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑀𝐴𝐸 ·100 Ec (24) Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 44 4.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN El objetivo de este trabajo es conseguir la máxima solubilización de azúcares hemicelulósicos tras la realización de una extracción alcalina asistida con tecnología microondas, utilizando como solvente NaOH. Esto es, maximizar la concentración de oligómeros (xilosa + arabinosa) (g/L), maximizar la recuperación de azúcares hemicelulósicos en la fracción líquida (RAHL) y maximizar la pureza de xilosa y arabinosa (AX). Los resultados obtenidos tras realizar los métodos de análisis descritos en el apartado 4.1 Materiales y métodos se exponen en los siguientes apartados. 4.2.1 EXPERIENCIAS PRELIMINARES En las Tabla 4.4 y Tabla 4.5 se muestran los resultados de azúcares antes de la HA, inhibidores, azúcares tras la HA, el pH, la concentración de AX (oligómeros: xilosa + arabinosa), pureza de AX, y recuperación de azúcares (glucosa y azúcares hemicelulósicos (xilosa+arabinosa) obtenidos en las experiencias preliminares. Dichas experiencias permitirán establecer el rango óptimo de temperatura (T) y tiempo de mantenimiento (t), que son los factores empleados. Posterior en el diseño experimental. Para ello se seleccionarán las condiciones de T y t que proporcionen valores máximos de concentración de oligómeros, máxima recuperación de azúcares en el extracto líquido y pureza de AX. Tabla 4.4Concentración (g/L) de azúcares del extracto líquido antes y después de HA, y concentración (g/L) de inhibidores en el extracto líquido antes de HA. Azúcares antes HA (g/L) Inhibidores (g/L) Azúcares después HA (g/L) Exp Tª (ºC) conc NaOH (M) t (min) Gluc Xilosa Arab Ácido Fórmico Ácido Acético HMF Furfural Gluc Xilos Arab P2 120 0,10 2,50 0,47 0,00 0,00 0,19 1,14 0,00 0,00 0,65 1,20 0,77 P3 120 0,20 2,50 0,62 0,00 0,00 0,31 1,02 0,00 0,00 1,48 4,40 2,48 P4 150 0,05 2,50 0,10 0,00 0,00 0,12 0,61 0,00 0,00 2,72 0,22 0,00 P5 150 0,10 2,50 0,08 0,00 0,00 0,31 1,06 0,00 0,00 0,94 2,92 1,80 P6 150 0,20 2,50 0,73 0,00 0,00 0,86 1,17 0,00 0,00 1,08 8,19 4,87 P7 180 0,05 2,50 0,13 0,00 0,00 0,17 0,76 0,00 0,00 4,36 1,25 0,56 P8 180 0,10 2,50 0,03 0,00 0,00 0,39 1,21 0,00 0,00 2,75 4,86 3,14 P9 180 0,20 2,50 0,24 0,00 0,00 0,99 1,32 0,00 0,00 1,64 9,21 5,45 P10 180 0,30 2,50 0,79 0,00 0,00 1,09 1,28 0,00 0,00 0,74 11,01 6,63 P11 200 0,20 2,50 0,17 0,00 0,00 1,14 1,34 0,00 0,00 1,00 12,41 7,07 P12 200 0,30 2,50 0,48 0,00 0,00 1,29 1,40 0,00 0,00 0,87 11,70 6,59 P13 180 0,20 5,00 0,26 0,00 0,00 1,02 1,29 0,00 0,00 0,65 10,61 6,35 Exp: experiencia. Gluc: glucosa. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 45 Arab: arabinosa. HMF: 5-Hidroximetilfurfural. Tabla 4.5pH del extracto líquido tras la MAE, recuperación total de sólidos (% RGT), concentración de oligómeros en el extracto líquido (g/L), pureza del extracto (%) y recuperación de azúcares del extracto líquido (%). Recuperación azúcares Exp Tª (ºC) Conc NaOH (M) t (min) pH RTG (%) Conc oligómeros (xilosa+arab) (g/L) Pureza (xilosa y arab) (%) RGL (%) RAHL (%) P1 120 0,05 2,50 8,43 76,20 0,00 0,00 4,79 0,00 P2 120 0,10 2,50 10,17 63,95 1,98 4,86 3,28 6,11 P3 120 0,20 2,50 12,62 64,75 6,88 10,81 7,52 21,23 P4 150 0,05 2,50 7,72 67,60 0,22 0,63 13,81 0,67 P5 150 0,10 2,50 9,52 52,30 4,72 9,19 4,80 14,57 P6 150 0,20 2,50 10,55 45,45 13,07 17,23 5,48 40,35 P7 180 0,05 2,50 6,55 64,43 1,81 4,06 22,13 5,59 P8 180 0,10 2,50 8,13 46,85 7,99 11,06 13,97 24,67 P9 180 0,20 2,50 10,20 45,90 14,66 19,13 8,35 45,27 P10 180 0,30 2,50 11,05 41,93 17,64 20,31 3,74 54,45 P11 200 0,20 2,50 9,79 26,05 19,48 23,87 5,07 60,15 P12 200 0,30 2,50 10,43 35,35 18,29 19,99 4,41 56,48 P13 180 0,20 5,00 10,15 40,65 16,96 20,16 3,31 52,37 Conc oligómeros (xilosa+arab) (g/L): concentración de oligómeros (xilosa y arabinosa) en el extracto líquido. RGL: recuperación de glucosa en la fracción líquida o prehidrolizado (g glucosa en extracto líquido/100 g glucosa en el BSG inicial (materia prima)). RAHL: recuperación de azúcares hemicelulósicos (xilosa y arabinosa) en la fracción líquida o prehidrolizado (g azúcares hemicelulósicos en extracto líquido/100 g azúcares hemicelulósicos en el BSG inicial (materia prima)). Para establecer el efecto de la temperatura, se analizan las pruebas con la misma concentración y distinta temperatura de operación. Fijando la concentración de NaOH, a medida que la temperatura aumenta (120ºC, 150ºC, 180ºC, 200ºC), se incrementa las concentraciones de oligómeros (AX) en el líquido, la %RAHL y la pureza. El parámetro determinante en este caso es la concentración de NaOH, ya que se experimentan grandes diferencias de resultados en función de las distintas concentraciones de NaOH utilizadas (0,05; 0,10; 0,20; 0,30 M NaOH). Los valores de concentración de oligómeros, RAHL y pureza aumentan con el aumento de concentración de NaOH hasta 0,20M NaOH, sin embargo, dichos valores no mejoran cuando la concentración aumenta a 0,30M NaOH. Así a la máxima T= 200ºC y concentración 0,2M NaOH, se obtienen los valores de concentración AX=18,29 g/L, %RAHL=56,48% y pureza 19,99%. El valor máximo de concentración de arabinoxilanos en el extracto líquido (Tabla 6), se encuentra en la prueba P11, con un valor de 19,48 g/L. La pureza Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 46 es de 23,87% y la recuperación de azúcares hemicelulósicos es de 60,15%. Estos valores corresponen a la máxima temperatura de trabajo utilizada (200ºC) y una concentración de 0,2M. 4.2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL Se van a presentar los resultados del diseño, basado en un Diseño Central Compuesto experimental basado en los valores de la concentración de oligómeros (g/L) obtenidos en las experiencias preliminares. Estos resultados han sido obtenidos tras realizar los métodos de análisis al extracto líquido y a la fracción sólida. Se han variado los rangos de los factores respecto a las experiencias preliminares. El factor temperatura (170-210ºC) (ligeramente superior a 200ºC), y el factor concentración de NaOH (0,1-0,4M), para comprobar que, si aumenta la concentración de NaOH o temperatura no mejora la recuperación de AX. EXTRACTO LÍQUIDO En este apartado se van a exponer los resultados correspondientes al extracto líquido (Tabla 4.6, Tabla 4.7). La variación de los factores (las condiciones durante la extracción asistida mediante tecnología microondas) producen distintos resultados en las variables respuesta. Tabla 4.6Concentración (g/L) de glucosa, xilosa y arabinosa antes y después de someter el extracto líquido a HA, y concentración de inhibidores (g/L) del extracto líquido antes de HA para cada T y concentración de NaOH en cada experimento. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Azúcares antes HA (g/L) Inhibidores (g/L) Azúcares después HA (g/L) Exp T (ºC) Conc NaOH (M) Gluc Xilosa Arab Fórmico Acético HMF Furfural Gluc Xilosa Arab 1 210,00 0,10 0,00 0,00 0,00 0,81 1,18 0,00 0,00 0,00 8,02 4,42 2 170,00 0,10 0,00 0,00 0,00 0,50 1,12 0,00 0,00 0,00 2,91 1,83 3 210,00 0,40 0,51 0,00 0,00 2,02 1,36 0,00 0,00 0,51 9,26 4,85 4 190,00 0,25 0,06 0,00 0,00 1,38 1,30 0,00 0,00 0,17 11,16 7,10 5 190,00 0,25 0,01 0,00 0,00 1,38 1,21 0,00 0,00 0,01 9,19 5,38 6 190,00 0,25 0,00 0,00 0,00 1,31 1,25 0,00 0,00 0,00 10,06 5,68 7 190,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,23 0,60 0,00 0,00 1,09 0,96 0,39 8 190,00 0,25 0,00 0,00 0,00 1,29 1,15 0,00 0,00 0,00 9,08 5,02 9 190,00 0,46 0,58 0,00 0,00 1,28 1,13 0,00 0,00 0,58 10,45 5,75 10 218,28 0,25 0,00 0,00 0,00 1,21 1,15 0,00 0,00 0,00 10,46 5,69 11 170,00 0,40 0,63 0,00 0,00 0,95 1,15 0,00 0,00 0,63 10,36 6,86 12 190,00 0,25 0,05 0,00 0,00 0,99 0,97 0,00 0,00 0,05 9,09 5,13 13 161,72 0,25 0,28 0,00 0,00 1,04 1,08 0,00 0,00 0,28 8,12 4,85 Antes de realizar la hidrólisis, la concentración de glucosa, xilosa y arabinosa medidas por HPLC en la fracción líquida tras la MAE es Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 47 prácticamente inexistente. Tras la hidrólisis, los valores de glucosa siguen siendo casi nulos mientras que los valores de concentración de xilosa y arabinosa han aumentado. Este aumento indica que tras la HA las cadenas de oligómeros se han roto, quedando sus monómeros libres (xilosa y arabinosa) y cuantificables mediante la técnica de HPLC. Como se ha descrito anteriormente, los factores (temperatura y concentración de NaOH) son determinantes en los resultados obtenidos (Tabla 4.6), de modo que, al aumentar la temperatura de extracción (161,72ºC a 218,28ºC), se obtiene una mayor concentración de azúcares medidos tras la hidrólisis. Esto ocurre hasta llegar a la temperatura de 190ºC (Exp 4; 0,25 M NaOH), donde se encuentra el valor máximo de concentración de xilosa y arabinosa (11,16 g/L xilosa; 7,10 g/L arabinosa). En la temperatura de 210ºC se obtiene una gran concentración de azúcares, pero es ligeramente inferior a la conseguida con 190ºC. El aumento de la concentración de NaOH (entre 0,04 M y 0,46 M NaOH), fijando una temperatura, produce un significativo aumento de la composición de azúcares tras la hidrólisis, esto indica que, tras la MAE, se ha conseguido extraer una mayor concentración de oligómeros (xilosa y arabinosa) y que la concentración de NaOH es el factor más influyente. Los resultados van aumentando hasta llegar a una concentración de NaOH de 0,25M NaOH. Este resultado es coherente con las experiencias preliminares donde una concetración de 0,3M hacía disminuir la concentración de azúcares libres. Las mayores concentraciones de azúcares (11,16 g/L xilosa y 7,10 g/L arabinosa) se encuentran en el experimento nº4 con los factores (190ºC, 0,25M NaOH). Los componentes inhibidores son generados como consecuencia de la extracción asistida por microondas. Estas concentraciones de inhibidores se han determinado para ver la posible influencia de los mismos en la transformación de esta corriente a butanol (vía fermentación) en caso de que se utilizase con ese fin. Como consecuencia, sus concentraciones varían dependiendo de la severidad de la etapa de extracción. Como se puede ver en la Tabla 4.6, los compuestos inhibidores tienen muy baja concentración en las extracciones con muy baja severidad, y sus concentraciones más altas son alcanzadas en las condiciones más severas de extracción. (ácido fórmico entre 0,23 y 2,02 g/L; ácido acético entre 0,60 y 1,36 g/L). Del ácido acético, se obtiene una concentración inferior a 1,36 g/L Exp 3 (210ºC, 0,40M NaOH). El factor de aumento de temperatura es solapado por la concentración de NaOH, ya que, disminuyendo el factor concentración, la concentración de inhibidores también disminuye hasta su mínima concentración, que es también la mínima concentración de NaOH (Exp 7; 190ºC, 0,04M NaOH). Aumentando la concentración de NaOH, aumenta concentración de inhibidores, siendo el Exp 3 (210ºC, 0,40M NaOH) el punto con mayor concentración, que también es el Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 54 lo consiguiente, se ha optimizado la extracción maximizando la concentración de oligómeros (g/L), que es la concentración de AX extraídos en la fracción líquida. Se ha optimizado la concentración de oligómeros (g/L) en la fracción líquida en función de los factores de temperatura de extracción y concentración del solvente (NaOH). A partir de los resultados experimentales, se ha llegado a la conclusión de que la interacción entre ambos factores tiene efecto positivo en la extracción de oligómeros, siendo la influencia de la concentración de NaOH el factor más influyente. Mediante el programa Statgraphics Centurion XVII, se ha obtenido una ecuación que muestra la influencia de cada factor (Ec 25) y que confirma la mayor contribución del factor concentración: 𝒄𝒐𝒏𝒄.𝒐𝒍𝒊𝒈ó𝒎𝒆𝒓𝒐𝒔 (𝒙𝒊𝒍𝒐𝒔𝒂 𝒚 𝒂𝒓𝒂𝒃𝒊𝒏𝒐𝒔𝒂) =14,71 + 1,13 · 𝐴 + 4,40 · 𝐵 − 2,70 · 𝐴 · 𝐵 − 2,84 · 𝐵2 Ec (25) A: Temperatura (ºC) B: Concentración de NaOH (M) El factor B aparece en tres términos de la ecuación, en uno de ellos sale elevado al cuadrado, mientras que el término A aparece en dos, donde en uno de ellos multiplicado por B. De forma que se puede asegurar que la concentración de oligómeros depende en más medida de la concentración de NaOH. A través del mismo programa, se ha obtenido el punto óptimo con mayor concentración de AX, las condiciones del punto óptimo son (172,38ºC, 0,38M NaOH), siendo la concentración de oligómeros (xilosa y arabinosa) de 17,51 g/L, recuperación de azúcares hemicelulósicos en la fracción líquida (RAHL) de 54,71% y una pureza del extracto líquido de 17,19%. Asimismo, se ha realizado un experimento confirmatorio del punto óptimo obtenido, mostrándose los resultados de concentración de glucosa, xilosa y arabinosa antes y después de someter el extracto líquido a HA, concentración de inhibidores del extracto líquido antes de HA, pH del extracto líquido, concentración de AX contenida en el extracto líquido, pureza de los AX contenidos en el extracto líquido tras MAE, recuperación de azúcares en el extracto líquido (recuperación de glucosa (%RGL) y recuperación de azúcares hemicelulósicos (% RAHL)), recuperación total gravimétrica de la fracción sólida (% RTG), composición (%) de la fracción sólida tras la extracción y grado de deslignificación de la fracción sólida, en las Tabla 4.10, Tabla 4.11 y Tabla 4.12. Tabla 4.10-Concentración (g/L) de glucosa, xilosa y arabinosa antes y después de someter el extracto líquido a HA, y concentración de inhibidores (g/L) del extracto líquido antes de HA para cada T y Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 55 concentración de NaOH en cada experimento. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Azúcares antes HA (g/L) Inhibidores (g/L) Azúcares después HA (g/L) Exp T (ºC) conc NaOH (M) Gluc Xilosa Arab Fórmico Acético HMF Furfural Gluc Xilos Arab ópt 172,38 0,38 0,30 0,00 0,00 1,21 1,17 0,00 0,00 0,34 10,22 6,81 Tabla 4.11pH del extracto líquido tras la MAE, concentración (g/L) de oligómeros (xilosa + arabinosa) contenida en el extracto líquido tras la MAE y pureza de los AX (xilosa + arabinosa) contenidos en el extracto líquido tras MAE y recuperación de azúcares (recuperación de glucosa (%RGL) y recuperación de azúcares hemicelulósicos (% RAHL)) en el extracto líquido Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Exp T (ºC) Conc NaOH (M) pH Conc oligómeros (xilosa+arab) (g/L) Pureza xilosa y arab (%) RGL (%) RAHL (%) ópt 172,38 0,38 12,38 17,03 17,05 1,73 52,59 Tabla 4.12-. Recuperación total gravimétrica, (% RTG) de la fracción sólida, composición (%) de la fracción sólida tras la extracción MAE, grado de deslignificación de la fracción sólida tras la MAE. Tiempo de mantenimiento de la temperatura (2,5 min) constante. Composición (%) Exp T (ºC) conc NaOH (M) RTG (%) Glucosa Xilosa Arab LAI LAS Grado deslignificación (%) ópt 172,38 0,38 24,02 54,50 27,91 4,73 12,53 0,82 87,56 Como se puede comprobar, los datos que han sido predichos de forma estadística se ajustan de forma aceptable a los datos obtenidos de forma experimental en el laboratorio, donde el proceso experimental óptimo se ha realizado con las condiciones (172ºC; 0,38 M NaOH; 2,5min). Siendo la recuperación de AX un poco más baja de la estimada (52,59%), pureza muy parecida (17,05%) y concentración de oligómeros 17,03 g/L, valores un porcentaje ligeramente inferiores a los determinados con el Modelo de Superficie, pero válidos asumiendo los posibles errores experimentales. En la Figura 4.19, sacada junto con el punto óptimo, representa un diagrama de superficie de respuesta sobre cómo varía la concentración de AX en función de los factores (temperatura y concentración NaOH). Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 56 Figura 4.19Gráfica de superficie que representa la variación de la concentración de oligómeros (xilosa + arabinosa) en función de la concentración de NaOH y de la temperatura de extracción. En el artículo de Rose & Inglett, 2010 se realiza una extracción acuosa de salvado de maíz mediante tecnología microondas en la que se consigue recuperar 25,8% del contenido inicial de AX, donde las condiciones iniciales del tratamiento para conseguir esa recuperación fueron 180ºC mantenidos durante 10 min o 200ºC durante 2 min. Este porcentaje de recuperación es muy pequeño comparado con el porcentaje máximo de recuperación de AX obtenido con el punto óptimo (52,59%). Punto óptimo (172,38ºC, 0,38 M NaOH; 54,71 g/L conc. AX Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 57 5. EVALUACIÓN ECONÓMICA En este apartado se realiza un estudio económico de una planta piloto en la que se realiza el mismo proceso de extracción y separación de arabinoxilanos que en el laboratorio. También se va a calcular el valor de venta del producto (AX) para que el proceso de producción sea rentable. El estudio incluye un análisis de sensibilidad de la inversión si variase del precio de venta del producto o el precio de compra de la materia prima. El proceso difiere del realizado en el laboratorio en que los equipos operan de forma continua, y el bagazo de cerveza (materia prima) se utiliza húmedo. Su diagrama de bloques está representado en la Figura 5.1: Se introduce la mezcla de BSG con NaOH acuoso al microondas, cuyo flujo másico es de: mmicroondas = 110 kg/h (40kg BSG húmedo + 70kg H2O) Este flujo ha sido calculando estableciendo la misma relación sólido-líquido 1:10 w/v que con la que se ha trabajado en el laboratorio, explicado en el ANEXO, tras el tiempo de residencia dentro del dispositivo (tr=2,5min), el flujo sale del microondas en la misma cantidad. 33 kg/h sólido húmedo MICROONDAS CENTRÍFUGA TANQUE DE PRECIPITADO CENTRÍFUGA 110 kg/h mezcla tras extracción 77 kg/h disolución líquida 7,2 kg/h AX húmedos 146,8 kg/h residuo líquido 154 kg/h disolución líquida con EtOH 77 kg/h EtOH 95% 110 kg/h (40kg/h BSG húmedo + 70kg/h NaOH acuoso Figura 5.1Diagrama del proceso que tendría lugar en la planta piloto. Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 58 Esta mezcla se introduce a la centrífuga 1 en flujo continuo. La centrífuga separa el sólido con un 70% de humedad, separándose 33kg/h de sólido húmedo de 77kg/h de extracto líquido. El extracto líquido pasa al tanque de precipitado. El tiempo de residencia en el tanque es tr = 15 min. Se añade la misma cantidad de etanol (77 L/h EtOH) que el flujo que proviene de la centrífuga 1 (77 L/h extracto líquido), y, tras el tiempo de residencia, la mezcla pasa a la centrífuga 2. Esta segunda centrífuga se encarga de separar los AX precipitados del residuo líquido restante. Se obtienen 7,2kg/h de AX húmedos y 146,8kg/h de residuo líquido (se realizan cambios de litros a kg considerando la densidad de la mezcla como la densidad del agua). Tomando como referencia los datos de precipitación de AX recogidos de las experiencias en el laboratorio, 3,2 kg/h corresponden a AX totalmente secos ya que los AX húmedos tienen una humedad del 45%. Para realizar la evaluación económica, se ha considerado como producto final la cantidad de arabinoxilanos secos obtenidos en un año: 3,2 𝑘𝑔 𝐴𝑋 𝑠𝑒𝑐𝑜 ℎ· 16ℎ 𝑑· 300 𝑑 𝑎ñ𝑜 =𝟏𝟓𝟑𝟔𝟎𝒌𝒈 𝑨𝑿 𝒔𝒆𝒄𝒐 𝒂ñ𝒐 5.1 COSTE TOTAL DE LA PLANTA El coste total de la planta se va a estimar mediante el método de Lang, es un método factorial el cual determina que el coste de la planta se puede expresar como un múltiplo del coste de todo el equipo base, este término de proporcionalidad es llamado factor de Lang. Para una planta mixta, que trabaja con sólidos y líquidos, el factor de Lang (fL) es 3,6. Mediante la tabla 6.2 del capítulo 6 del libro SINNOTT, 2014 se van a obtener los costes del tanque de precipitado. Los costes de ambas centrífugas y del microondas se obtienen mediante revisión bibliográfica. Se ha calculado el coste total de equipos (Ce), que es la suma de los precios de los equipos de la planta (Tabla 5.1): Tabla 5.1Precio de los equipos de la planta de extracción alcalina de arabinoxilanos asistida mediante tecnología microondas. Máquinas Precios (€) Microondas 120.000 Centrífuga GQ (F) L105 4.450 Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 59 Tanque de precipitado (vertical) 2.136 Centrífuga GQ (F) L45 4.272 Coste total de los equipos Ce 130.858 Mediante la ecuación de Lang Ec 5.1, se obtiene el valor de los costes fijos de la planta: 𝑪𝒇= 𝑓𝐿·𝐶𝑒 Ec (5.1) Ce: coste total de los equipos. Por lo que el capital fijo de la planta es Cf = 39257,4 €. Ahora se va a calcular el coste total de la inversión con la Ec 5.2: 𝑪𝒐𝒔𝒕𝒆 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒊𝒏𝒗𝒆𝒓𝒔𝒊ó𝒏 (𝑪𝑻𝑰) = 𝑐𝑎𝑝𝑖𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑖𝑗𝑜 (,𝐶𝑓) + 𝑐𝑜𝑠𝑡𝑒𝑠 𝑜𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑊𝐶,𝑤𝑜𝑟𝑘𝑖𝑛𝑔 𝑐𝑜𝑠𝑡) Ec (5.2) Los costes de operación equivalen al 5% del capital fijo Ec 5.3: 𝑾𝑪 = 0,05 ·𝐶𝑓 Ec (5.3) El coste de puesta en marcha es el 10% del coste fijo (Ec 5.4): 𝑪𝒐𝒔𝒕𝒆 𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒂 𝒆𝒏 𝒎𝒂𝒓𝒄𝒉𝒂 = 0,1 · 𝐶𝑓 Ec (5.4) En la Tabla 5.2 se presenta un resumen de los costes calculados mediante el método de Lang: Tabla 5.2Resumen de costes calculados mediante el método de Lang. Coste total de equipos (Ce) 130.858,00 € Coste fijo de la inversión (Cf) 471.088,88 € Coste de operación de la planta (WC) 23.554,44 € Coste de puesta en marcha 47.108,88 € Coste total de inversión 494.643,24 € Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 60 5.2 VIABILIDAD ECONÓMICA Y ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD VIABILIDAD ECONÓMICA El coste anual de las materias primas que se necesitan en la planta queda recogido en la Tabla 5.3: Tabla 5.3Datos de flujo (kg/año), precio (€), y coste de la materia prima por año (€/año) Materia prima Flujo (kg/año) Precio Coste (€/año) Bagazo de cerveza 384000,00 0,02 €/Kg húmedo 3.840,00 Hidróxido de sodio 98% 7257,60 12,40 €/Kg 89.994,24 Agua de proceso 84000,00 26,22 €/trimestre 243,40 Para determinar el estudio de la viabilidad económica, se va a realizar un análisis de costes simplificado partiendo de la Tabla 6.6 del capítulo 6 del libro SINNOTT, 2014 (Tabla 5.4). Se ha considerado que la planta va a operar 16h, en dos turnos, con un operario en cada turno (mañana y tarde), y los días trabajados van a ser 300 días/año. Tabla 5.4Costes fijos y variables de la planta piloto. Costes variables Materia prima 94.077,64 € Utilidades 2.355,44 € subtotal A 96.433,08 € Costes fijos Mantenimiento y labor de operación 23.554,44 € Costes de laboratorio 4.710,89 € Supervisión 4.710,89 € Gastos generales de la planta 11.777,22 € Cargos de capital 47.108,89 € Seguro 4.710,89 € Tasa local 9.421,78 € Derechos 4.710,89 € subtotal B 110.705,87 € Costes directos (A+B) 207.138,95 € Gastos de ventas y gastos generales 62.141,69 € subtotal C 62.141,69 € Coste anual de producción: A+B+C 269.280,64 € AX obtenidos en un día 3,22 kg/d AX en un año 15.456 kg/año Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 61 Coste de producción (€/kg) 17,42 €/kg AX A partir del coste anual de producción y de la cantidad de AX producida por año, se calcula el coste de producción de AX de la planta piloto(€/kg) (Ec 5.5): 𝑪𝒐𝒔𝒕𝒆 𝒑𝒓𝒐𝒅𝒖𝒄𝒄𝒊ó𝒏= 𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑢𝑎𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑐𝑖ó𝑛 € 𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (€ 𝑘𝑔 ⁄) Ec (5.5) La amortización de la planta junto con la de los equipos es de 10 años desde su inicio, cuyo impuesto es de 25%. El balance de costes e ingresos y flujos de caja tras el análisis a los cálculos de la planta piloto están recogidos en la Tabla 5.4. Este estudio se realiza para comprobar la viabilidad económica de la planta piloto y estimar el precio de venta del producto para su lanzamiento al mercado. En los tres primeros años se ha supuesto que se vende el 60%, 65% y 80% de producto respectivamente, y a partir del cuarto año las ventas son del 100%. Tabla 3Balance económico simplificado que incluye el balance de costes, ingresos y flujos de caja. BALANCE ECONÓMICO SIMPLIFICADO Año Descripción (€) 0 1 2 3 A1. Capital Inmovilizado -494643,24 A2. Capital circulante -24732,16 A3. Subvenciones A. FI - Fondos invertidos -494643,24 -24732,16 0,00 0,00 B1. Ingresos por ventas 322560,00 349440,00 430080,00 B2. Costes -207138,95 -207138,95 -207138,95 B. Margen Bruto 115421,05 142301,05 222941,05 C1. Amortización -49464,32 -49464,32 -49464,32 C. BAI - Beneficio antes de impuestos 65956,72 92836,72 173476,72 D1. Impuestos -16489,18 -23209,18 -43369,18 D.BDI - Beneficio después de impuestos 49467,54 69627,54 130107,54 E. FGO - Fondos Generados por las operaciones -494643,24 24735,38 69627,54 130107,54 F.FGO-RMovimiento de Fondos Flujo de Caja Acumulado -494643,24 -469907,86 -400280,32 -270172,77 Año 4 5 6 7 8 9 10 Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 537600,00 537600,00 537600,00 537600,00 537600,00 537600,00 537600,00 -207138,95 -207138,95 -207138,95 -207138,95 -207138,95 -207138,95 -207138,95 330461,05 330461,05 330461,05 330461,05 330461,05 330461,05 330461,05 -49464,32 -49464,32 -49464,32 -49464,32 -49464,32 -49464,32 -49464,32 280996,72 280996,72 280996,72 280996,72 280996,72 280996,72 280996,72 -70249,18 -70249,18 -70249,18 -70249,18 -70249,18 -70249,18 -70249,18 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 210747,54 -59425,23 151322,31 362069,86 572817,40 783564,94 994312,49 1205060,03 Tras realizar el cálculo de flujos de caja, se calculan los indicadores principales de la viabilidad del producto, estos son el Valor Actual Neto (VAN) y la Tasa Interna de Retorno (TIR). El VAN es un indicador el cual analiza los flujos de caja y la rentabilidad que da el proyecto, se mide en unidades de euros (€). El TIR es el porcentaje cuando el VAN se hace cero. Se ha escogido un precio de venta del producto en el que se obtengan unos valores de VAN y TIR que aseguren que la inversión sea rentable desde el punto de vista económico. Estos valores son: Precio del producto: 35€/kg VAN = 984.726,08 € TIR =23,86% Debido a que el VAN tiene un valor positivo y alto, realizar la planta piloto sería una buena inversión. Esto queda confirmado debido a que el TIR tiene un valor superior a la tasa mínima de rentabilidad que es exigida para invertir (5%), por lo que se puede asegurar que el proyecto es rentable. Se han representado los flujos de caja y los flujos de caja acumulados en la Figura 5.2: Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 63 Figura 5.2Flujos de caja y flujos de caja acumulados. Como se puede apreciar en la gráfica, la representación de los flujos de caja acumulados indica que la inversión inicial se recupera a partir del cuarto año en el que la planta está operando. Este dato se ha obtenido tras elegir el precio de venta del producto (AX). Desde un punto de vista económico, el proyecto es viable económicamente. La representación de los flujos de caja indica que, tras la inversión inicial en el año cero, a lo largo del primer año aún no se obtienen suficientes ventas como para que los beneficios de la planta sean positivos. ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD En la Figura 5.3 se muestra el análisis de sensibilidad realizado, el cual muestra cómo afectaría una variación del precio de venta de los arabinoxilanos y el precio de compra de la materia prima, BSG, ya que son la materia prima y el producto más importantes del proceso. La variación se va a estimar desde un 30% menos del precio actual hasta un 30% superior al precio actual. -600 -400 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Miles € Años Flujos de caja Flujos de caja acumulados Universidad de Valladolid Escuela de Ingenierías Industriales 70 𝑉𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑜𝑛𝑑𝑎𝑠 =110 𝐿 ℎ·2,5 𝑚𝑖𝑛 60 𝑚𝑖𝑛 = 4,58 𝐿 Siendo 2,5min el tiempo de residencia dentro del microondas. Mediante revisión bibliográfica se ha elegido un microondas con D=60mm y altura de 1,5m que suple las necesidades de la planta. Las centrífugas han sido elegidas a partir de los kg/h de sólido que separan, mediante revisión bibliográfica. Para escoger el tanque de precipitación, se ha estimado su volumen necesario y calculado su precio mediante la tabla 6.1 del capítulo 6 del libro SINNOTT, 2014: 𝑉𝑡𝑎𝑛𝑞𝑢𝑒 =154 𝐿 ℎ·15 𝑚𝑖𝑛 60 𝑚𝑖𝑛 =38,5 𝐿