Caracterización y determinacion de polifenoles del vino

- 1 - AGRADECIMIENTOS En primer lugar quiero dar las gracias al Dr. Ramón Oliver y al Dr. Santiago Hernández por darme la oportunidad de participar en este proyecto realizado en el departamento de Quimiometría de la Universidad de Barcelona. En segundo lugar, dar las gracias a la dirección de la parte experimental de este proyecto, al Dr. Xavier Saurina, sus consejos han hecho posible el desarrollo de este. Muy especialmente, agradezco a Lidia Palau su dedicación y sus indicaciones que han servido para resolver muchas dudas surgidas. También agradecer a los compañeros del laboratorio de quimiometría, que se han portado muy bien conmigo durante estos 4 meses. A mi compañera le quiero agradecer todas las horas compartidas, ha sido un placer trabajar conjuntamente. - 3 - CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN Los polifenoles son un conjunto heterogéneo de moléculas que comparten la característica de poseer en su estructura anillos aromáticos sustituidos por funciones hidroxílicas [1]. Para clasificar los polifenoles se tiene en cuenta el número de átomos de carbono del esqueleto base. De esta manera podemos tener fenoles simples, ácidos fenólicos o compuestos más complejos como los flavonoides. La siguiente tabla muestra el tipo de polifenol según el número de átomos de carbono y ejemplos de esos polifenoles en el vino. Tabla 1.1. Clasificación Polifenoles Átomos de Carbono Esqueleto Tipo Ejemplos presentes en vino 6 C6 Fenoles Simples Benzoquinonas -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 7 C6 - C1 Ácidos Fenólicos Ácido Gálico -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 8 C6 - C2 Derivados de Tirosina Tirosol Ácidos Fenilacéticos -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 9 C6 - C3 Ácidos cinámicos Ácido Cafeico Fenilpropenos Cumarinas -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- Ramón Carlos Capdevila Grases - 4 - 10 C6-C4 Naftoquinones -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 13 C6 -C1-C6 Xantonas -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 14 C6C2-C6 Estilbenos Resveratrol Antraquinones -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 15 C6-C3-C6 Flavonoides Quercetina Isoflavonoides Cianidina Catequina Miricetina Malvidina -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 18 (C6-C3)2 Lignanos Neolignanos -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- 30 (C6-C3-C6)2 Bioflavonoides -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- n9 (C6-C3)n Ligninas -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- n6 (C6)n Melaninas Catecolicas -------------------------- --------------- ------------------------- ------------------------------- n15 (C6-C3-C6)n Taninos Condensados Procianidina La concentración de compuestos fenólicos en el vino varía entre 1,80 y 1,06 g/L, con un promedio de 2,57g para el vino tinto y entre 0,16 y 0,30g/L para el blanco. Los compuestos polifenólicos de la uva se encuentran en la piel, especialmente en las células epidérmicas, en las pepas y en la pulpa. La cantidad y calidad de polifenoles en la uva depende principalmente de la variedad de la vid, del clima, del terreno y de las prácticas de cultivo. Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 5 - Figura 1. Distribución esquemática de los polifenoles en un grano de uva tinta Vitis vinífera como Cabernet Sauvignon. Los polifenoles se distribuyen de la siguiente manera: 10% en el jugo, 30% en la piel, y 60% en las semillas [2]. Estos compuestos son en su mayoría potentes antioxidantes 1 necesarios para el funcionamiento de las células vegetales; que se encuentran en frutas y verduras, por ejemplo, manzanas y cebollas, y en bebidas como té y vino [3]. Existe una correlación entre el contenido total de polifenoles y la capacidad antioxidante de los alimentos, comparativamente un vaso de vino tino (150 mL) equivaldría en cuanto a capacidad antioxidante a 12 vasos de vino blanco, o a 2 tazas de té, 4 manzanas, 5 porciones de cebolla, 3 ½ vasos de cerveza, a 7 vasos de zumo de naranjas o 20 vasos de zumo de manzana [4]. En un estudio de un vino tinto Cabernet Sauvignon se hizo un fraccionamiento y análisis por cromatografía liquida de alta presión (HPLC) obteniéndose como resultado tres fracciones: • Polifenoles neutros (catequinas, epicatequinas, procianidinas y quercertina) • Polifenoles ácidos (ácido gálico, caseico y felúrico) • En la fracción acuosa residual las antocianinas [5]. 1 Se define como agente antioxidante a cualquier sustancia que, cuando está presente a dosis bajas en comparación con el sustrato oxidable, retrasa o previene significativamente la oxidación de dicho sustrato, incluyéndose en éste a todas las moléculas orgánicas e inorgánicas que se encuentran en las células vivas, como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y ADN . Ramón Carlos Capdevila Grases - 6 - La fracción de polifenoles hidrosolubles represento el 71% de sus componentes fenólicos por lo tanto la más importante en cuanto a capacidad antioxidante. A pesar de esto la fracción de polifenoles neutros es la que tuvo mayor actividad antioxidante por unidad de concentración de polifenoles [6]. 1.1. Flavonoides Se piensa que la única propiedad cardioprotectora del vino tinto esta en la acción de sus flavonoides. Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales que protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la polución ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos, etc. El organismo humano no es capaz de producir estas sustancias así que deben obtenerse a través de la alimentación o en forma de suplementos. Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6). El esqueleto se compone de dos anillos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano. [7] La actividad antioxidante de los flavonoides depende de las propiedades redox de sus grupos hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura química [8]. Tres características estructurales son importantes para su función: a) Presencia de grupos hidroxilo en el anillo B b) Presencia de doble enlace en la posición 2,3 c) Presencia de grupos hidroxilo en posición 3 y 5 [9]. Figura 2. Estructura flavonoide. Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 7 - Un numero creciente de sustancias naturales se han identificado como moduladoras del proceso de carcinogénesis; entre ellas se encuentran los flavonoides que han demostrado poseer efectos antimutagénicos y anticarcinogénicos [10-11]. Se ha encontrado una relacion en forma de “U” entre el consumo de alcohol y la cardiopatia isquémica. Mientras el equivalente a dos vasos al dia de vino se asocia con la disminución de su incidencia, mas de 2 vasos incrementa el riesgo [12]. 1.2. Polifenoles Utilizados A continuación se muestra una lista con la clasificacion y la estructura de cada uno de los polifenoles estudiados en este proyecto: 1. Ácidos Fenólicos • Ácido Siríngico • Ácido Gálico Ramón Carlos Capdevila Grases - 8 - • Ácido Vanílico • 3,4-dihidroxibenzoico • 4-hidroxibenzoico Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 9 - 2. - Ácidos Cinámicos • Ácido Cafeico • Ácido Cumárico • Ácido Felúrico Ramón Carlos Capdevila Grases - 16 - Espectrofotometría de resonancia magnética nuclear (RMN) Espectrofotometría de Spin electrónico (EPR) Espectrofotometría de Raman • No espectroscópicos No miden espectros ni están relacionados con transiciones de energía. Se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia y en el cambio que se produce debido a esta interacción. Métodos no espectroscópicos: Refractometría Difracción de los rayos X Polarimetría 3.1.2. Espectrofotometría UV-visible Fue una de las primeras técnicas que se aplico para el análisis cuantitativo así como para el análisis de estructuras. Hoy solo tiene interés cuantitativo ya que para conocer la estructura molecular se tiene técnicas más resolutivas. Las regiones del espectro electromagnético que corresponden al visible-UVA son: 170-250nm = UV lejano 250-350nm = UV próximo 350-1000nm = visible El espectrofotómetro consta de tres partes: • Fuente de energía Se denomina lámpara. Para la luz visible se usan lámparas halógenas de tungsteno y para UV se usan lámparas de Deuterio. En algunos casos también se usan lámparas de Xenón o de mercurio (cuando se requiere mucha luz). • Filtro o monocromador Se necesita un filtro porque la lámpara no emite luz monocromática, emite un amplio espectro de longitudes. El monocromador, que suele ser un prisma, descompone la luz en diversas longitudes de onda, existen de dos tipos: Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 17 - - Prismas de refracción o de cuarzo - Redes de difracción • Detector Puede ser: células fotovoltaicas, fototubos y tubos fotomultiplicadores. Detecta la intensidad que les llega y la transforman en absorbancia. De este modo detectan como ha variado la intensidad. • La cubeta es el dispositivo para poner la muestra: Para medir en el visible se usa de vidrio o plástico para medir en el UV se usa de cuarzo ya que el vidrio y el plástico absorben en esa zona. Fuente Monocromador Detector Cubeta - 19 - CAPÍTULO 4: MÉTODO EXPERIMENTAL 4.1. Reactivos • Ácidos y bases • Polifenoles • Disoluciones madre de los polifenoles • Disolución tampón ácida Se preparan 1000ml de disolución tampón ácida. Es una solución tampón de ácido clorhídrico, acetato de sodio, ácido bórico y hidrogenofosfato de potasio, para obtener una concentración de 0,02M. Nos permite regular el pH durante las valoraciones espectrofotométricas en un amplio intervalo. • Disolución neutralizadora Para neutralizar progresivamente las diferentes sustancias presentes en la disolución se utiliza una solución básica 2M y otra 1M de NaOH. 4.2. Instrumentación • Espectrofotómetro PERKIN-ELMER λ-19, controlado por ordenador • Cubeta HELLMA QS de cuarzo adaptada para flujo continuo con un volumen interno de 18 µl, camino óptico de 1cm i caras esmeriladas. • pH-metro EUTECH Instruments Cyberscan 2500, con un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Ramón Carlos Capdevila Grases - 20 - • Agitador magnético SBS A-163 y núcleo magnético de agitación. • Pipetas automáticas de volumen variable NICHIRYO de volúmenes 0,5-10, 10-100, 100-1000µl. • Bomba peristáltica WATSON-MARLOW 505 DU. • Tubos de bombeo de Tygon estándar. Figura4.1. Esquema del montaje utilizado en las valoraciones espectrofotométricas en continuo. Seguidamente se puede ver una fotografía (figura 4.2.) del montaje real que se llevo a cabo para poder realizar estas valoraciones espectrofotométricas en continuo. Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 21 - Figura 4.2. Fotografía del montaje utilizado en las valoraciones espectrofotométricas en continuo. 4.3. Procedimiento experimental La caracterización de los polifenoles estudiados se realiza mediante valoraciones ácido-base en proceso continuo, registrando las medidas espectrofotométricas con el objetivo de poder calcular finalmente los valores de pKa de las sustancias analizadas. Se han estudiado, por separado, cada uno de los polifenoles dentro de un amplio intervalo de pH que va de 2 a 12 aproximadamente; y en un intervalo de longitudes de onda comprendido entre 200nm a 500nm. El objetivo principal es determinar sus pKa de manera individual. Se trabaja con disoluciones de cada analito de concentración 10 -4 M permitiendo, de este modo, que la absorción a las longitudes de onda de trabajo sea moderada. Procedimiento − En primer lugar hay que encender el espectrofotómetro para estabilizar las lámparas, aproximadamente unos 10 20 minutos antes. − Durante este rato de estabilización se calibrara el pH-metro utilizando dos soluciones tampón de pH=4 y pH=7. − Se realiza el blanco del tampón ácido(20mL), registrando su espectro a través del sistema continuo. Ramón Carlos Capdevila Grases - 22 - − Se introduce en un recipiente de vidrio, de volumen pequeño, la muestra a valorar y se hace recircular continuamente mediante la bomba peristáltica. − En el recipiente se incluye también un núcleo magnético para agitar de manera continua la disolución a valorar. Se deja circular unos 10 minutos hasta que se estabiliza el pH. − Se registra el espectro de la solución de la muestra en medio ácido. − A continuación se añade una cantidad de la solución básica de NaOH para aumentar pH, y registrar el espectro una vez estabilizado el pH. Se tiene que intentar que el aumento sea progresivo para, de este modo, obtener el mayor número de espectros registrados próximos al punto de equivalencia. Es decir, a cada pH obtenido, tras añadir una cantidad determinada de NaOH, se tiene que registrar el espectro de la disolución. − Una vez el pH supere el valor de 12 se detiene el procedimiento. − Cada polifenol se valora por triplicado. − Una vez se tienen todos los espectros registrados se transforman, copian a una hoja de cálculo y posteriormente se utilizaran en programas de tratamiento numérico (MATLAB). − Para poder limpiar la cubeta del espectrofotómetro es necesario hacer circular Agua Milli-Q una vez finalizadas las valoraciones. Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 23 - CAPÍTULO 5: RESULTADOS EXPERIMENTALES 5.1. Valoraciones espectrofotométricas y cálculo de pKa Para la caracterización de los analitos se ha utilizado el método en continuo explicado anteriormente (parte experimental). Se parte de una solución tampón que contiene el polifenol a estudiar y se le añaden poco a poco un valorante (NaOH 1M/2M), se registran los espectros para cada medida de pH obtenida. Este procedimiento se repite al menos tres veces por cada polifenol. Una vez se han registrado los espectros, se tratan con el programa informático “Matlab” para obtener una estimación de los valores de pKa para cada uno de los polifenoles, así como una representación tridimensional de la absorbancia respecto a la longitud de onda y el pH. Se ha dividido el estudio de los polifenoles en tres partes según el número de pKa’s dependiendo si tienen 2,3 o 4. Ramón Carlos Capdevila Grases - 24 - 5.1.1. Siríngico (grupo con 2 pKa’s) Todos los polifenoles que entran en este grupo son ácidos fenólicos o ácidos cinámicos. La característica que tienen en común es que todos ellos cuentan con un grupo hidroxilo y un grupo carboxilo. Esto les lleva a tener dos pKa. A continuación, se muestra un ejemplo de los resultados que se obtuvieron en estas valoraciones del polifenol Siríngico de concentración 10 -4 M. Figura 5.1. Valoración espectrofotométrica en continuo del Siríngico Al representar gráficamente la absorbancia respecto al pH se puede obtener una estimación visual de los pKa que puede tener el polifenol. En las zonas en las que las líneas mantienen una tendencia horizontal no existen cambios, al acercarse a la zona del pKa, las líneas empiezan a cambiar de pendiente. En este caso, se puede observar unos cambios en los espectros entre los pH 3 y 5 y entre los pH 8 y 10 tal i como se muestra en la figura 5.2 Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 25 - Figura 5.2. Siríngico. Variación de la absorbancia en función del pH Una vez registrados los espectros ácido-base a cada pH, se convierten mediante el programa informático “Matlab” en representaciones tridimensionales de la absorbancia respecto a la longitud de onda y al pH. En la figura 5.3. Se muestra un ejemplo de este tipo de representaciones, que dan también una estimación de cuales serán los valores de pK del polifenol. Figura 5.3. Siríngico. Absorbancia (nm) respecto al pH i a la longitud de onda (U.A.) Ramón Carlos Capdevila Grases - 32 - Con los datos obtenidos en las valoraciones espectrofotométricas en continuo se pueden obtener los perfiles de concentración de las especies ácidas y básicas para cada valor de pH. La utilización de la función “alshmsm” del algoritmo ALS junto con los datos obtenidos de las valoraciones, nos permite obtener los espectros optimizados y las concentraciones de sus especies para cada pH. A continuación, con estos resultados se muestra un ejemplo de los espectros optimizados i los diagramas de distribución de perfiles de concentración de las especies para una de las valoraciones realizadas, así como los pKa’s correspondientes. Figura 5.12. Diagrama de perfiles de concentración de las especies i espectros optimizados, para una de las valoraciones de la Quercetina. Tabla 5.3 pKa obtenidos en las cuatro valoraciones Quer1 Quer2 Quer3 Quer4 Media Desviación estándar pka1 5,9648 6,3424 6,2735 6,4817 6,3659 0,1061 pka2 7,6682 7,9697 7,7377 8,1051 7,9375 0,1858 pka3 9,9066 10,2427 10,1787 10,2999 10,2404 0,0606 pka4 11,4146 11,4814 11,5635 11,4985 11,5145 0,0433 Caracterización y determinación de polifenoles del vino - 33 - Se realizaron 4 valoraciones ya que la primera se observó una desviación de los valores de pKa respecto a las dos siguientes. La media y la desviación estándar no contemplan los valores de Quer1. Tal y como se ve en este estudio los valores de pKa estimado de la Quercetina es de 6,36 02,0 ± , 7,93 02,0 ± , 10,24 02,0 ± y 11,51 02,0 ± . - 35 -