Metodología para el análisis de contaminantes emergentes en aguas residuales urbanas y ganaderas

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Metodología para el análisis de contaminantes emergentes en aguas residuales urbanas y ganaderas Autor: Miguel Ángel de la Serna Calleja Tutor/es: Rebeca López Serna, Juan José Jiménez Sevilla 1 Tabla de contenido 1 RESUMEN .......................................................................................................................3 2 ABSTRACT .......................................................................................................................4 3 INTRODUCCIÓN ..............................................................................................................5 3.1 Problemática medioambiental: ...............................................................................5 3.1.1 Los purines ........................................................................................................5 3.1.2 Las aguas residuales ..........................................................................................8 3.2 Contaminantes emergentes:..................................................................................12 3.2.1 Fármacos y contaminantes emergentes ..........................................................12 3.2.2 Clasificación de los CECs considerados en este trabajo ....................................13 3.2.3 Incidencia de Contaminantes emergentes en aguas ........................................16 3.2.4 Eliminación de fármacos en aguas residuales con microalgas ..........................18 3.3 Métodos de análisis de fármacos en muestras líquidas.........................................20 3.3.1 Avance histórico del análisis de fármacos en matrices líquidas ........................20 3.3.2 Extracción en fase sólida (SPE).........................................................................22 3.3.3 Cromatografía de líquidos de alta y ultra-alta eficiencia (HPLC y UHPLC) .........22 3.3.4 Espectrómetro de masas .................................................................................23 3.4 Algunos estudios centrados en CECs en matrices acuosas: ....................................25 4 OBJETIVOS DEL TRABAJO ..............................................................................................30 5 PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................30 5.1 Material y reactivos ...............................................................................................30 5.2 Muestras analizadas ..............................................................................................31 5.2.1 Agua Milli-Q ....................................................................................................31 5.2.2 Agua residual urbana.......................................................................................31 5.2.3 Agua residual ganadera ...................................................................................32 5.3 Dopado de muestra ...............................................................................................32 2 5.4 Preparación de muestra.........................................................................................34 5.4.1 Pretratamiento ................................................................................................34 5.4.2 Preparación de disoluciones dopadas ..............................................................34 5.4.1 Extracción en fase sólida, SPE offline ...............................................................35 5.5 Determinación cromatográfica ..............................................................................37 6 RESULTADOS Y DISCURSIÓN .........................................................................................43 6.1 Selección del volumen de inyección ......................................................................43 6.1.1 Tratamiento de datos ......................................................................................43 6.1.2 Agua Milli-Q ....................................................................................................55 6.1.3 Agua residual urbana.......................................................................................58 6.1.4 Agua residual ganadera ...................................................................................62 6.2 Comparación con la SPE Off-line ............................................................................65 6.3 Influencia de factores. Análisis estadístico ............................................................64 6.3.1 Influencia del AEDT .........................................................................................64 6.3.2 Influencia del volumen de inyección ................................................................65 6.3.3 Análisis multifactorial ......................................................................................66 6.4 Validación de los métodos analíticos .....................................................................68 6.4.1 Efecto memoria ...............................................................................................68 6.4.2 Tasa de recuperación absoluta ........................................................................71 6.5 Incidencia de los compuestos en las muestras de agua residual ...........................75 7 CONCLUSIONES.............................................................................................................80 8 BIBLIOGRAFÍA ...............................................................................................................82 9 ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................86 10 ÍNDICE DE TABLAS .........................................................................................................87 3 1 RESUMEN La preparación de muestra para el análisis de microcontaminantes orgánicos en muestras de agua residual se lleva a cabo comúnmente mediante procedimientos de extracción en fase sólida que permiten la preparación conjunta de varias muestras, pero involucran diferentes operaciones de laboratorio; el tiempo de preparación de muestra requerido es del orden de varias horas además del posterior tiempo de análisis cromatográfico. En consecuencia, sería interesante disponer de métodos de análisis automatizados. En esta línea, este trabajo presenta los resultados de un estudio en el que se realiza una extracción en fase sólida acoplada on-line con un sistema de cromatografía UHPLC-MS/MS para la determinación multiresiduo de drogas de uso veterinario y farmacéutico en aguas residuales (influente y efluente de una depuradora). Como alternativa se ensaya también la inyección directa de grandes volúmenes de agua en el sistema cromatográfico y los resultados de ambos métodos automatizados se comparan con aquellos de una extracción rutinaria en fase sólida off-line. Los volúmenes de inyección adecuados se han seleccionado con la premisa de obtener bajos límites de cuantificación dado que se trata de un análisis de trazas. En las condiciones seleccionadas se han establecido parámetros analíticos básicos como el rango de linealidad, límites de detección y cuantificación y efecto memoria. Se ha trabajado con muestras reales determinando la concentración de las drogas presentes en ellas y su grado de eliminación en el proceso de depuración. 4 2 ABSTRACT Sample preparation for analysis of organic micro-pollutants in wastewater samples is commonly carried out by solid-phase extraction procedures that allow the co-preparation of several samples but involve different laboratory operations; the sample preparation time required is of the order of several hours in addition to the subsequent chromatographic analysis time. It would therefore be interesting to have automated methods of analysis. In this line, this paper presents the results of a study in which a solid phase extraction coupled online with a UHPLC-MS/MS chromatography system is performed for the multi-residue determination of veterinary and pharmaceutical drugs in wastewater (influent and effluent from a treatment plant). Alternatively, the direct injection of large volumes of water into the chromatographic system is tested and the results of both automated methods are compared with those of routine off-line solid phase extraction. Suitable injection volumes have been selected on the premise of low limits of quantification since this is a trace analysis. Under the selected conditions, basic analytical parameters such as linearity range, detection and quantification limits and memory effect have been established. Work has been carried out with real samples to determine the concentration of drugs present in them and their degree of elimination during the purification process. 5 3 INTRODUCCIÓN 3.1 Problemática medioambiental: 3.1.1 Los purines Son los residuos obtenidos de la mezcla de los excrementos sólidos y líquidos del ganado, las aguas residuales procedentes del lavado del propio ganado y la explotación ganadera, y los restos de alimentos del ganado. Generalmente son provenientes del ganado porcino y bovino en granjas de explotación (elevado número de ganado frente a poco espacio para el mismo). Centrándonos en valores del sector español, el sector porcino español ya es el segundo en cuanto a producción de ganado a nivel europeo tras Alemania (más de 25 millones de cabeza y 90000 explotaciones) y genera más del 20% de la producción europea de purines con un valor cercano a los 50 millones de toneladas anuales de dicho residuo. De toda esa cantidad de residuo, se desaprovechan valores cercanos al 30% porque se liberan al medio sin tratar, no hay zonas cercanas donde usarse como abono, la aportación es excesiva… [1] Si bien, los purines han sido residuos generados desde el comienzo de la ganadería porcina, antes estos residuos se utilizaban de abono sin apenas necesidad de tratamiento y eran incluso beneficiosos. Sin embargo, es en la actualidad debido a la aparición de grandes explotaciones intensivas cuando ese beneficio se ha convertido en una de las mayores preocupaciones medioambientales y sanitarias actuales. Esto es debido a la gran densidad de ganado (cabezas de ganado por hectárea) que hay en este tipo de explotaciones actuales. Estos residuos sobrantes que no son aprovechados como abono han de ser mandados a plantas de tratamiento porque si no se tratan o utilizan, generan grandes peligros como: − La emisión de gases de efecto invernadero (metano, amoniaco) debido a su descomposición. − Contaminación de aguas superficiales o incluso subterráneas (por filtración de dichos purines por el suelo) por parte de los nitratos que se encuentran en altas concentraciones. − Contaminación del suelo debido a la alta cantidad de nutrientes (nitrógeno, fósforo y potasio) y materia orgánica. 6 En 1998 se aprobó un Real Decreto en España que incentiva proyectos privados que se encarguen de transformar los purines en agua limpia y abono orgánico seco (utilizable en el sector agrícola), además de generar electricidad y aporte de calor (energía eléctrica y térmica). Aún con estas ayudas, en España hay alrededor de 30 plantas de tratamiento de este tipo impulsadas por la Asociación de Empresas para el Desimpacto Ambiental de los Purines (ADAP), mientras que en Alemania hay en torno a 9000. [1] Lo común con los purines sobrantes era almacenarlos en balsas que son una especie de fosas con material aislante (que evita que se filtre al suelo y pase al agua subterráneo) y al aire libre. Esto tiene múltiples inconvenientes ya que al paso del tiempo el purín va descomponiéndose y puede corroer el aislante y acabar filtrándose al subsuelo, además de que emite gases de efecto invernadero a la atmósfera. El gran problema de los purines es que, como todo problema emergente, no está correctamente regulado y las sanciones son muy bajas frente al daño que pueden causar. En la Tabla 1 se muestra la cantidad de residuo total ganadero frente los purines anualmente, en millones de toneladas generada por la ganadería extensiva: Tabla 1: Cantidad residuo ganadero en millones de toneladas frente al residuo de purines 7 Como se puede observar en la Tabla 1 el porcentaje de residuos que constituyen los purines varía mucho en los países de la Unión Europea. Se ve a España rondando el 25% de residuos referido a los purines. [2] Desde el punto de vista químico los purines son residuos muy complejos debido a su gran heterogeneidad ya que depende de la dilución en agua, el tipo de cría, alimentación, limpieza… Además, contienen mucha variedad de compuestos químicos como se muestra en la Tabla 2 a nivel nacional y europeo. De todos los compuestos que se muestran en la Tabla 2, cabe destacar que varios sirven para el uso como fertilizantes (K2O, P2O5 y los de nitrógeno) y otro parámetro de interés es la Demanda Biológica de Oxígeno (DBO) que como puede verse a nivel nacional es muy elevada y esto es uno de los motivos por los que se considera contaminante (alta DBO provoca dificultades a otros organismos que requieran oxígeno para desarrollarse). Tabla 2: Composición de purines sólidos y líquidos en la UE y España 14 Tabla 3: Clasificación de los fármacos según su aplicación Número asignado como analito Fármacos analizados Aplicación terapéutica 1 Penicillin G Antibióticos 2 Amoxicillin 3 Doxycycline 4 Tetracycline 5 Oxytetracycline 6 Danofloxacin 7 Enrofloxacin 8 Marbofloxacin 9 Ciprofloxacin 10 Ofloxacin 11 Levofloxacin 12 Norfloxacin 13 Nalidixic acid 14 Sulfadimidine 15 Sulfadiazine 16 Sulfamethoxazole 17 Sulfamethizole 18 Sulfathiazole 19 Sulfapyridine 20 Tylosin 21 Erythromycin 22 Clarithromycin 23 Apramycin 24 Tiamulin 25 Florfenicol 26 Trimethoprim 27 Metronidazole 28 Triclosan 15 29 Dexametasone Analgésicos/ Antiinflamatorio 30 Diclofenac 31 Naproxen 32 Ibuprofen 33 Salicylic acid 34 Acetaminophen 35 1,4-Benzoquinone 36 Acetylsalicylic Acid 37 Clofibric acid Reguladores de lípidos 38 Clofibrate 39 Atorvastatin 40 Gemfibrozil 41 Propranolol Fármacos cardiovasculares 42 Atenolol 43 Carbamazepine Fármacos psiquiátricos 44 Fenbendazole Antiparásitos 45 Progesterone Hormonas 46 17-α-Ethynylestradiol (EE2) 47 β-estradiol (E2) 48 Estrone (E1) 49 Iohexol Agentes contrastantes de rayos-X 50 DEET Insecticidas 51 Atrazine Pesticidas 52 Methylparaben Conservantes 53 Ethylparaben 54 Propylparaben 55 4-Hydroxybenzoic Acid 56 Octyphenol Surfactantes 57 4-nonylphenol 58 Caffeine Estimulantes 59 Crotamiton Anti-picores 16 3.2.3 Incidencia de Contaminantes emergentes en aguas En 2017 se realizó un estudio en Portugal que determinó la concentración de varios medicamentos en el agua del rio Tango y Mondego, las muestras se tomaron en varios puntos, en concreto 20 puntos distintos, a lo largo de ambos ríos para tener resultados representativos. [5] Este estudio surge en el contexto de que Portugal se clasificó como un área de agua de estrés moderado-alto sobre todo en el ámbito urbano. Se busca en este estudio 17 compuestos, 5 metabolitos y 1 producto de transformación, pertenecientes a diferentes grupos terapéuticos y han sido seleccionados los medicamentos más consumidos. Se determinó para cada uno de los analitos la frecuencia de detección (si se detectó o no en cada uno de los puntos de muestreo), el valor mínimo y máximo detectado, el valor medio de todas las medidas y la desviación de esas medidas. Esto se muestra en la Tabla 4. Figura 5: Zonas de muestreo de agua de rio Tabla 4: Determinación de CECs en agua de ríos de Portugal 17 Hay 23 analitos, los cuales se muestran a la derecha del nombre si son un compuesto farmacéutico (parent compound o PC), un metabolito (metabolite o M) o un producto de transformación (transformation producto o TP). Si no se detectó el analito es nd (non detected). Todas las medidas se han realizado usando como técnica analítica el HPLC-MS con una SPE previa usando ODS como adsorbente. [5] Estudiando los valores de la Tabla 4 extraemos mucha información: • Detección ➢ De los 23 analitos totales, pertenecientes todos a grupos terapéuticos distintos, se detectaron al menos una vez 11 de ellos. ➢ Los que más se detectaron fueron los antibióticos (casi en un 25% de las medidas), los SSRIs (más del 25% de las medidas), los antinflamatorios (casi en un 25% también) aunque solo se detectaron 2 de los 6 compuestos antinflamatorios estudiados. ➢ Los menos detectados son los reguladores de lípidos (menos del 10%), el antipiléptico estudiado (prácticamente el 1%) y las hormonas que no se detectaron. • Concentraciones medidas: ➢ Prácticamente todos los compuestos detectados (salvo los reguladores de lípidos) lo hicieron en concentraciones de entre 25-40 ng/L o ppb (partes por billón). ➢ Los valores máximos y mínimos rondan también valores de 15-60 ng/L. ➢ Se puede ver por tanto que las concentraciones de este tipo de contaminantes rondan las partes por billón (10-100 ppb) al menos en el caso aquí estudiado. • Conclusión extraída de la tabla: ➢ Aparecen varios compuestos farmacéuticos o derivados de ellos en aguas de rio (supuestamente ya depuradas), lo que quiere decir que, efectivamente estos contaminantes no pueden eliminarse en las actuales estaciones depuradoras. ➢ La concentración medida de este tipo de contaminantes es del orden de las partes por billón o nanogramos/litro. 18 3.2.4 Eliminación de fármacos en aguas residuales con microalgas En los últimos años debido al aumento de la preocupación por este tipo de contaminantes emergentes, se han desarrollado nuevos métodos de purificación de agua de estos contaminantes. Uno de los más efectivos se ha comprobado que es el uso de microalgas en fotobiorreactores, capaces de digerir estos compuestos farmacológicos a compuestos menos perjudiciales. [6] En este contexto, se estudiaron en este trabajo las concentraciones de varios medicamentos a lo largo del proceso de tratamiento con las microalgas. Como puede verse en la Figura 6 tenemos primero un rotor que decanta los residuos sólidos y los elimina, un tanque UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket o reactor anaerobio de flujo ascendente) que libera biogás, un reactor HRAP (high rate algae pond o tanque de algas de alto rendimiento) y un colector que separa el efluente de las algas. En este estudio lo importante es determinar la eliminación de fármacos en aguas urbanas mediante este método. Para ello se mide la concentración en el influente, salida del tanque UASB y salida del reactor HRAP de cada analito y se muestra todo ello en la Figura 7. Se puede observar la concentración de los diferentes analitos farmacológicos en ng/L en cada uno de los puntos de medida. Como conclusiones de la Figura 7 se puede deducir que, efectivamente, este método logra una eliminación (en realidad digestión) de estos contaminantes emergentes gracias a microalgas que, a su vez producen biogás y biomasa utilizables. Figura 6: Esquema de purificación con varios reactores de microalgas 19 Se puede ver, además, en la Figura 7 concretamente, los valores de eliminación de analito medios para cada grupo de fármaco en cada uno de los puntos de determinación comentados (cada bloque es una parte del esquema inicial en orden de izquierda a derecha). Los dos bloques de la derecha son otros lugares medidos que no nos interesan en nuestro trabajo. Figura 7: Gráfico de la concentración de los analitos en los distintos puntos del método Figura 8: Gráfico de recuperación de cada grupo farmacológico en cada parte del método 20 Como puede comprobarse en la Figura 8 los valores de concentración de los analitos disminuyen mucho al ir pasando por el proceso de purificación y con unos porcentajes finales muy elevados (salvo en los medicamentos psiquiátricos), por lo que se considera este método de utilizar fotobiorreactores como un método prometedor para eliminar este tipo de contaminantes emergentes. [6] 3.3 Métodos de análisis de fármacos en muestras líquidas 3.3.1 Avance histórico del análisis de fármacos en matrices líquidas El análisis de fármacos en muestras líquidas a los niveles de concentración que se está realizando no ha sido posible hasta hace apenas 20 años, esto es debido a que los métodos de análisis no eran capaces de detectar y, mucho menos, cuantificar ningún compuesto a nivel de trazas (microgramos o menos). Los métodos de análisis, así como la mayoría de los elementos relacionados con la química analítica, en los últimos años se han mejorado muchísimo debido a la gran importancia que está adquiriendo el control de calidad. Se han centrado muchos esfuerzos a mejorar los métodos gracias al aumento de los conocimientos sobre contaminantes y, también, a la preocupación con el medio ambiente y lo que se libera al mismo. Hoy en día, la clase más estudiada de contaminantes emergentes es la de los productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCPs) que contienen ~3000 sustancias diferentes (sustancias analgésicas, reguladores de lípidos, hormonas…) [7] y son consumidos por humanos y animales de granja para finalmente ser liberados mediante excreción a aguas residuales urbanas y ganaderas. Estas dos aguas residuales todavía tienen estos compuestos [8-12] incluso después de haber sido tratadas en depuradoras de agua, ya que las depuradoras actuales aun no cuentan con equipos ni procesos adecuados para eliminar la mayoría de estos contaminantes [13,14]. El principal problema de estos contaminantes (concretamente los PPCPs) es que permanecen en el agua ya tratada y vuelven a ser ingeridas por los humanos en concreto al volver a consumir estos productos y en el propio agua que toman (aunque sea en pequeñas cantidades) y el hecho de que ocurra agrava aun más algunos problemas medioambientales [15], aunque aún queda mucha investigación que realizar al respecto. 21 La contaminación de las aguas residuales urbanas y agrícolas es un hecho ya demostrado y comprobado por estudios de agua en todo el mundo. Estos estudios están más centrados en el agua residual urbana y, todos ellos coinciden en que estos contaminantes (mayormente los compuestos que provienen de los fármacos o sus metabolitos) se encuentran en concentraciones que rondan las decenas de ng/L [5,10,18]. También existen estudios más centrados en las aguas residuales ganaderas que se centran más en como eliminar o, al menos, reducir la concentración de estos contaminantes. Recientemente, varios estudios apuntan al uso de algas capaces de digerir algunos de estos compuestos de la forma farmacéutica o metabolito a otros compuestos menos peligrosos o nocivos [6]. Hay otros que comentan también otros métodos de eliminación de compuestos (aplicables a agua residual urbana también) como son la oxidación, la filtración con membrana o la adsorción sobre carbono activo [14]. Tradicionalmente el análisis de fármacos se ha centrado en analitos hidrófobos compuestos por aromáticos polinucleares o cadenas largas que correspondían generalmente a analgésicos (la familia de fármacos más estudiada), lo que provocaba un estancamiento del análisis de fármacos ya que se centraba solo en el estudio de fármacos apolares y no ampliaba su campo. Para el estudio de estos compuestos se utilizaba la cromatografía de gases acoplada al espectrómetro de masas (GC-MS) con una ionización electrónica (EI) [16]. Debido a la gran reproducibilidad de la cromatografía de gases, el paso a la cromatografía de líquidos ha sido un avance lento. En la actualidad, debido al aumento de interés en estudiar muchos más fármacos simultáneamente y a que muchos nuevos fármacos tienen más grupos polares, ha centrado el método hacia el estudio de compuestos polares mediante la cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) acoplada al espectrómetro de masas (MS) con ionización electroespray. Este avance en el método ha abierto mucho la lista de compuestos estudiables y por tanto ha aumentado la versatilidad mucho en el análisis de este tipo de contaminantes. El método utilizado en este estudio es: SPE-HPLC-MS. Que comienza con una extracción en fase sólida (SPE) con un cartucho, la separación de analitos se lleva a cabo con un cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia y la detección con un espectrómetro de masas (MS) 22 gracias a una ionización por electroespray que es uno de los métodos más usados y prometedores en este campo de estudio [17,19,20,21,22]. 3.3.2 Extracción en fase sólida (SPE) Es el procedimiento de preparación de muestra general y más utilizado actualmente para matrices líquidas y este tipo de analitos. Se basan en la afinidad de los analitos por un determinado adsorbente al que se adhieren mientras otros compuestos y la propia matriz pasan a través del adsorbente (idealmente sin adherirse ninguno). Se trata de una extracción cromatográfica en fase inversa (fase móvil polar y fase estacionaria apolar) ya que la fase móvil es acuosa. La fase estacionaria depende del cartucho que se utilice ya que varía con la marca y los analitos buscados. En nuestro caso el cartucho usado es un cartucho ``Oasis HLB Cartridge´´ perteneciente a la marca ``Waters´´ como el mostrado en la Figura 9 y que tiene un relleno de 60 mg y 3 cm3 compuesto de polipropileno capaz de lograr la extracción de compuestos ácidos, básicos y neutros. Es además una versión que está optimizada para que la sequedad del relleno no afecte a la extracción a diferencia de los rellenos convencionales. La recuperación de los analitos (desadsorción del relleno) se logra generalmente con una pequeña porción de un disolvente polar sobre el propio cartucho, en este caso con acetonitrilo se logran recuperar los analitos deseados. [23] 3.3.3 Cromatografía de líquidos de alta y ultra-alta eficiencia (HPLC y UHPLC) Es el aparato crítico a la hora de que el método sea adecuado para la separación de analitos a nivel de trazas y en el número y tipo de analitos que es capaz de separar. Figura 9: Cartucho OASIS HLB Cartridge 23 Tradicionalmente se ha utilizado la cromatografía de gases que ha sido históricamente mucho más reproducible, con mejores límites de detección y cuantificación y, utilizada en muchos más métodos oficiales de cuantificación que la cromatografía de líquidos. Sin embargo, la cromatografía de líquidos ha sido foco de mucha optimización y mejora tanto en la optimización de los parámetros usados (flujo, volumen de inyección) como en la composición de la propia columna (el relleno o fase estacionaria). Este tipo de cromatografía se ha ido optimizando y aumentando su rendimiento y capacidad para separar analitos. En 1906 se desarrolló la cromatografía líquida, 70 años después se mejoró y apareció a la HPLC y desde 1970 que se instauró la HPLC como método con potencial no ha dejado de mejorarse y ha aparecido la UHPLC. Es esta UHPLC la que vamos a utilizar en nuestro trabajo y tiene como diferencias que utiliza un tamaño de poro mucho menor dando lugar a mejor resolución (altura de plato teórico menor), permite aumentar el flujo sin perder resolución (disminuyendo el tiempo de análisis) y se logran picos más estrechos aumentando la sensibilidad del cromatograma. [24] 3.3.4 Espectrómetro de masas Es el aparato encargado de la separación final y detección de los analitos. Es muy importante la optimización de este ya que es el que junto con la cromatografía determinará cuales son los límites de detección, cuantificación y la sensibilidad del cromatograma final. Se dice por ello que está acoplado a la cromatografía previa (UHPLC-MS). El espectrómetro de masas se basa de forma genérica en cuatro procesos: - Ionización: Es el paso en el que se pasan a iones los compuestos que llegan. Puede ser una ionización química, electroespray (la que usaremos nosotros), por desorción laser, ionización por impacto electrónico… En nuestro caso usaremos la ionización por electroespray (ESI) en la que los analitos salen del capilar en el que llegan del cromatógrafo (se puede acoplar directamente) en forma de aerosol y se cargan con unos electrodos situados a la salida del aerosol. Es elegida por ser un tipo de ionización débil que evita la fragmentación de los iones. - Aceleración de los iones: Al estar ya los analitos ionizados (cargados) podemos acelerarlos gracias a la incidencia de un campo eléctrico de cuyo potencial y la propia masa de los iones dependerá la velocidad que alcancen. 30 4 OBJETIVOS DEL TRABAJO - Optimizar el volumen de inyección en los métodos de análisis basados en la inyección de grandes volúmenes y en la extracción en fase sólida online para el análisis de compuestos farmacéuticos en muestras acuosas. - Comparar tres métodos de análisis (inyección directa de grandes volúmenes, extracción en fase sólida online y extracción en fase sólida offline) para la determinación de los analitos de interés en aguas residuales urbanas. - Evaluar la incidencia de determinadas drogas en muestras de agua residual. 5 PARTE EXPERIMENTAL 5.1 Material y reactivos A lo largo de todo el proceso experimental se usaron varios aparatos, reactivos y material. • Aparatos: - Equipo de cromatografía Sciex Exion UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) con una columna de fase inversa Phenomenex con partículas de Kinetic EVO C18 de 1.7 µm de diámetro. Posee una bomba binaria, cuatro depósitos de disolventes, un sistema de eliminación de burbujas (desgasificador) y un sistema automatizado de inyección de muestra. - Equipo de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) Sciex 6500+ QqQ con ionización de electroespray con ambos modos de ionización, positiva y negativa, en el mismo ciclo de análisis. - Equipo de obtención de agua Milli-Q ultrapura: El agua ultrapura se obtiene con el sistema de purificación Milli-Q Advantage A10 de Merck Millipore de la marca Waters Chromatography. - Evaporador asistido por nitrógeno: El sistema utilizado para evaporar es el Organomation N-Evap 11250. - Centrífuga de frascos de 250 mL: El modelo de centrífuga utilizado es la Thermo Cientific Legent RT+. 31 • Instrumentación: - Instrumentación habitual de laboratorio (matraces, vasos de cromatografía, vasos precipitados, pipetas Pasteur…). - Capilares de vidrio Vitrex (20, 50, 100 y 200 µL). - Micropipeta y puntas de micropipeta. - Cartuchos extracción en fase solida OASIS HLB 3CC 60 mg fase estacionaria. - Jeringas de vidrio Hamilton. - Jeringas de plástico de 2 y 5 mL con sus puntas (microlances). - Filtro de jeringa de Nylon de 0.45 µm poro y de PTFE de 0.22 µm. - Filtros de fibra de vidrio de 0.7 µm, de celulosa de 0.45 µm y de PTFE de 0.22 µm. • Reactivos: - Nitrógeno seco 99.9% de pureza. - Metanol, acetonitrilo y ácido fórmico pureza LC/MS (>99%). - Ácido etilendiaminotetraacético (AEDT) con pureza mayor 99.9%. - Disolventes orgánicos para lavado del material (agua Milli-Q, etanol y acetona). - Patrones de los 60 analitos a analizar y patrones internos deuterados de 22 de ellos. 5.2 Muestras analizadas 5.2.1 Agua Milli-Q Es agua ultrapura que ha sido filtrada y desionizada de forma mucho más rigurosa que otras aguas destiladas o desionizadas, generalmente por osmosis inversa. Se obtiene gracias a un destilador especial en el propio laboratorio (Milli-Q Reference) capaz de purificarla hasta dicho punto a partir del agua de grifo de la misma zona de trabajo (Valladolid en nuestro caso). 5.2.2 Agua residual urbana Se va a analizar agua residual urbana tanto en la entrada como en la salida de una depuradora por separado. La depuradora está una situada en Aldeamayor de San Martín, municipio situado en la provincia de Valladolid, España. Considerándose agua residual bruta la de la entrada y agua residual depurada la de salida. 32 5.2.3 Agua residual ganadera Se va a analizar purín tanto bruto como depurado al igual que con el agua residual. En este caso el purín bruto proviene de una granja de Cantalejo, municipio situado en la provincia de Segovia, España. El purín depurado es obtenido en el laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad de Valladolid a partir del purín bruto usando fotobiorreactores conteniendo microalgas. 5.3 Dopado de muestra En el procedimiento experimental se van a determinar concentraciones de drogas en disoluciones de muestras acuosas dopadas con disoluciones estándar que contengan todos los analitos a determinar. Este dopado de muestras va a realizarse añadiendo a las muestras acuosas a estudiar cierto volumen de disolución estándar ya preparada. Cada patrón preparado de esta manera tendrá por lo tanto una concentración y al medirse se obtendrá la recta de calibrado matriz-patrón (excepto en el análisis de agua Milli Q) a partir de la cual se determinará la concentración de la muestra sin dopar. Para preparar estos patrones se usan varias disoluciones patrón ya preparadas, con concentraciones distintas para facilitar la preparación de las disoluciones del calibrado patrón deseado. Dichas disoluciones y concentraciones son las siguientes: ➢ Standard Solution (SS): Disolución estándar de 20 mg/L. ➢ Standard Solution’ (SS’): Disolución estándar de 2 mg/L (1:10 de la SS). ➢ T: Disolución estándar de 0.5 mg/L (1:4 de la SS’). ➢ T’: Disolución estándar de 0.05 mg/L (1:10 de la T). ➢ T’’: Disolución estándar de 0.005 mg/L (1:10 de la T’). ➢ Tx’: Disolución estándar de 0.5/10*x mg/L (1:10 de la Tx-1’). 33 Además, hay ciertos analitos de los que se dispone de un patrón interno disponible, el mismo compuesto deuterado. Se utilizan estos patrones internos para preparar otras disoluciones estándar con ellos de igual manera que con los patrones de los propios analitos. Son las siguientes: ➢ Internal Standard Solution (iSS): Disolución de patrones internos estándar de 20 mg/L. ➢ Internal Standard Solution’ (iSS’): Disolución de patrones internos estándar de 2 mg/L. ➢ C: Disolución de patrones internos estándar de 0.5 mg/L. La disolución C contiene los siguientes patrones deuterados: - Sulfadiazine-d4 - Sulfadimidine-d4 - Ciprofloxacin-d8 - Sulfamethoxazole-d4 - Danofloxacin-d3 - Enrofloxacin-d5 - Salicylic acid-d4 - Bisphenol A-d8 - Methylparaben-d4 - Ethylparaben-d5 - Propylparaben-d7 - Clofibric acid-d4 - Naproxen-d3 - Diclofenac-d4 - Ibuprofen-d3 - Triclosan-d3 Todas ellas son preparadas en metanol y con las concentraciones mostradas en la Tabla 10: Tabla 10: Disoluciones estándar y sus concentraciones Stock Solution Concentration (mg/L) Concentration (µg/L) SS iSS 20 SS' iSS' 2 T C 0,5 500 T' 0,05 50 T'' 0,005 5 T''' 0,0005 0,5 TIV 0,00005 0,05 34 5.4 Preparación de muestra 5.4.1 Pretratamiento En el análisis de muestras de agua residual y purín se realiza un pretratamiento que consiste en una centrifugación inicial y, tras ello, una doble filtración de dicha fase acuosa evitando el sólido precipitado y una congelación final hasta que se vaya a usar para preparar la línea de calibrado. Este pretratamiento no es necesario para el agua Milli-Q ya que esta es ultrapura y no tiene partículas en suspensión. En el paso de centrifugación se usan frascos de 250 mL en la centrífuga (se pueden introducir hasta 6 frascos, que han de estar perfectamente equilibrados en el rotor). El programa usado para eliminar las partículas en suspensión fue de 10000 rpm durante 10 minutos. Al sacar los frascos se observan dos fases, la fase sólida de partículas en el fondo y la fase acuosa. En el paso de filtración se realiza primero con discos de fibra de vidrio de 0.7 µm echando la muestra acuosa directamente de los frascos de la centrífuga y evitando en lo posible que caiga el precipitado para no obturar el filtro. Tras ello se toma esa muestra y se vuelve a filtrar con un filtro de disco de celulosa de 0.45 µm. La primera filtración fue para minimizar las partículas de gran tamaño en el filtro de 0.45 µm y evitar asi su obturación. Terminado el pretratamiento tenemos la muestra acuosa filtrada por 0.45 µm y pasamos a introducirla en frascos de 500 mL de PET ámbar (es ámbar para que algunos de los analitos como las ciclinas que son fotosensibles no se degraden) y se congelan (para evitar que bacterias en la muestra degraden algunos analitos). 5.4.2 Preparación de disoluciones dopadas La noche antes del día de preparación se descongelan las muestras. Si se observan partículas en suspensión tras descongelar se vuelve a filtrar con un filtro de 0.45 µm. 35 Se pasa a preparar las disoluciones con que se realizarán las líneas de calibrado matrizpatrón. Dependiendo el punto de la recta de calibrado se añadirá a un matraz de 100 mL un volumen de una determinada disolución estándar y, cuando corresponda, se añadirán 100 µL de la disolución C (patrones internos de 0.5 mg/L) y se enrasará con la matriz (agua residual, agua Milli-Q o purín). 5.4.1 Extracción en fase sólida, SPE offline Como se va a comparar tres métodos analíticos: SPE-offline (realizada con cartuchos en el laboratorio), inyección directa y SPE-Online (realizada de forma automática por el propio aparato) se parten en todos los casos de una misma disolución preparada. Del volumen preparado, 100 ml, se retiran 1.5 mL para la inyección directa y 1.5 ml para la SPE-online, realizándose la extracción off-line de un volumen de 97 mL. Para la SPE-Offline se emplean de cartuchos OASIS HLB 3CC con 60 mg fase estacionaria en una cubeta que permite la extracción con hasta 20 cartuchos a la vez conectados a vacío. El proceso de extracción es el siguiente: 1. Activación del cartucho: Se rellenan los cartuchos con metanol (3 mL aproximadamente) y se deja que vaya cayendo por gravedad por los cartuchos activándolos. Se repite de nuevo de igual manera de forma que pasaron alrededor de 6 mL por cada cartucho por gravedad. 2. Acondicionamiento del cartucho: Se rellenan los cartuchos con agua Milli-Q (3 mL aproximadamente) dejándolo caer igual que antes por gravedad. Se repite de nuevo de forma que pasan también cerca de 10 mL de agua ultrapura. 3. Extracción de la muestra con el cartucho: Se conectan los cartuchos a los recipientes que contienen nuestras disoluciones preparadas y activando la bomba de vacío se va realizando la extracción de todas ellas simultáneamente. 4. Lavado del cartucho: Se rellena el cartucho con una disolución del 5% de metanol en agua y se deja caer por gravedad, ayudándose a veces con un pequeño encendido de la bomba de vacío para ayudar a pasar esta mezcla que pasa muy lentamente. 5. Secado del cartucho: Se enciende la bomba durante 20 minutos con el fin de secar totalmente los cartuchos. 36 6. Guardado de los cartuchos: Estos cartuchos pueden ya congelarse para evitar la degradación de nuestros analitos guardándolos todos en papel de aluminio hasta que vaya a realizarse la elución de estos. Tras la extracción hay que realizar el paso de elución, cuya finalidad es redisolver los compuestos que se han extraído en el cartucho. Ha de usarse un disolvente capaz de redisolver los compuestos (mucha solubilidad de los analitos en el disolvente y poca de posibles impurezas). La elución se lleva a cabo, primero atemperando los cartuchos que estaban congelados durante 10 minutos aproximadamente. Tras ello se colocan los cartuchos en la cubeta usada en la extracción colocando bajo el cartucho un tubo de ensayo para recoger dicho líquido. Finalmente se realiza la elución con 2x3 mL de acetonitrilo y dejando que caiga por gravedad. La evaporación del extracto se lleva a cabo a temperatura ambiente bajo una corriente de nitrógeno. Tras ello, los analitos se encontrarán en las paredes del tubo de ensayo, por ello se realiza una redisolución de estos con 1.5 mL de metanol (en 3 vertidas) sobre las paredes del tubo y se recoge el metanol con una pipeta Pasteur y se deja caer por las paredes varias veces. Todo esto para tratar de lograr que no quede apenas nada adherido en las paredes superiores. Se pasan esos 1.5 mL de metanol a un vial de inyección y se repite la evaporación bajo nitrógeno y cuando no queda líquido se congelan dichos viales ``vacíos´´ (en realidad los analitos estarán adheridos a las paredes) a -82ºC. En el momento de la inyección se saca esos viales y se vierte en ellos 1 mL de la fase móvil que se usará en la cromatografía (5% de metanol en agua con 0.1 % de ácido fórmico), se agita bien y se toma todo con una jeringa y usando un filtro de jeringa de PTFE de 0.22 µm se filtra sobre un vial de cromatografía ámbar que es finalmente inyectado. 37 5.5 Determinación cromatográfica • Separación cromatográfica Para determinar las características analíticas de todos los métodos utilizados (inyección directa, SPE-Offline y SPE-Online) y la concentración de los analitos a estudiar (60 analitos de interés farmacológico), la separación cromatográfica se realizó en una columna EVO-C18 (Phenomenex) de 5 cm de longitud, un diámetro interno de 2.1 mm y un tamaño de partícula de 1.7 µm. La fase móvil utilizada es una mezcla agua/metanol, de proporciones variables según un gradiente, con 0.1% de ácido fórmico. El gradiente de concentraciones comienza siendo metanol al 5% en agua durante 1 minuto, aumenta la concentración del metanol al 95% durante 2 minutos y se mantiene constante en ese valor durante 3 minutos, tras ello disminuye la concentración de metanol hasta el 5% durante 4 minutos y se mantiene en esa concentración otros 4 minutos (reequilibrio del sistema). El flujo de fase móvil se mantiene constante en 0.5 mL/min, la temperatura de operación también es fija en 40ºC. El volumen de inyección sin embargo es variable ya que se van a estudiar varios volúmenes en los métodos automatizados (inyección directa y SPEOnline) para encontrar el volumen óptimo. • Inyección de muestra Dependiendo el método de análisis utilizado hay diferencias en el proceso de separación en la extracción de los analitos, o bien en la inyección al sistema UHPLC. ➢ Inyección directa: Para la inyección directa se filtran los 1.5 mL, tomados previamente, con un filtro de jeringa de PTFE de 0.22 µm pasándolo a un vial cromatográfico de 2 mL. Todos estos viales se etiquetan como corresponden y se congelan a -82º para evitar la degradación de los analitos. En este tipo de método, como indica su nombre, se procede simplemente a la inyección de la matriz sin realizar ninguna extracción previa. Se optimizará el volumen de inyección en el proceso ya que una variable crítica. 38 ➢ SPE-Offline: Para la SPE-offline se inyectan directamente al sistema cromatográfico, de igual forma que la inyección directa, ya que la extracción de los analitos ya se ha producido previamente como se ha explicado. ➢ SPE-Online: Para la SPE-Online se filtran los 1.5 mL, tomados previamente, con un filtro de jeringa de PTFE de 0.22 µm pasándolo a un vial cromatográfico de 2 mL. De igual forma que la inyección directa se etiquetan todos los viales y se congelan a -82º. En este caso, el propio sistema cromatográfico Sciex Exion UHPLC realiza de forma automatizada la extracción en fase sólida ya que el diagrama de flujo del sistema cromatográfico incluye un mini cartucho Strata X, de dimensiones 20 x 2 mm, que realiza la extracción y luego pasa a la columna cromatográfica. • Detección cromatográfica Para realizar la detección y determinación de los analitos estudiados se ha utilizado un sistema de espectrometría de masas acoplado al sistema cromatográfico UHPLC. Un sistema de espectrometría de masas está formado por varias partes: − Sistema de introducción de muestra: es un capilar de nebulización. − Fuente de ionización: por la cual se ionizan los analitos y compuestos coextraídos, nuestro aparato ha utilizado una ionización blanda de tipo electrospray en modo positivo y negativo con los siguientes parámetros: • Flujo de N2 (gas de nebulización): 45 unidades • Capilar de ionización o voltaje del electrodo: 4500 V • Gas cortina (N2): 35 unidades • Gas de secado: 45 unidades • Temperatura del gas de secado: 400ºC − Analizador de masas: es el encargado de separar los iones con diferente relación de masa/carga (m/z) aplicando un ultra alto vacío con el fin de evitar colisiones de los iones de analito con otras partículas gaseosas. En este caso se ha utilizado un triple cuadrupolo (QQQ) ya que se trata de un espectrómetro de masas en tándem. 39 En el primer cuadrupolo se selecciona el pseudoión molecular de cada droga que se fragmenta en el 2º cuadrupolo mediante una energía de colisión aplicada por el gas N2 en condiciones de alta energía. Esto permite monitorizar dos de las transiciones (ión padre-fragmento) que son característicos de cada compuesto, siendo normalmente la primera transición la más intensa y, por ello la utilizada para cuantificar. La segunda transición sirve para comprobar que se está integrando el pico correcto ya que debe aparecer al mismo tiempo de retención que la primera transición. − Detector: permite revelar el ión que nos interesa y proporcionar una señal eléctrica que es proporcional a la concentración del compuesto. Tabla 11: Tiempos de retención (RT), transiciones seguidas (m/z) y voltajes aplicados en el espectrómetro de masas para cada compuesto y transición. RT (min) Compuesto Q1 (m/z) Q3 (m/z) DP (V) CE (V) CXP (V) 0,64 Amoxicillin 1 365,9 348,9 26 13 28 Amoxicillin 2 114,2 26 29 12 0,80 Atenolol 1 267,1 145,1 11 33 24 Atenolol 2 190,3 11 29 4 0,91 Metronidazole 1 172,0 128,4 41 21 6 Metronidazole 2 82,1 41 35 14 1,13 Acetaminophen 1 151,9 110,0 61 23 16 Acetaminophen 2 108,9 61 55 14 1,15 Iohexol 1 821,8 804,1 126 33 26 Iohexol 2 602,8 126 43 46 1,50 Sulfadiazine 1 251,0 155,9 71 23 20 Sulfadiazine 2 108,2 71 31 12 1,84 Sulfathiazole 1 255,9 155,9 96 21 8 Sulfathiazole 2 108,1 96 33 12 1,93 Sulfapyridine 1 250,1 156,1 61 23 10 Sulfapyridine 2 108,1 61 35 12 2,18 Trimethoprim 1 291,0 230,1 51 33 18 Trimethoprim 2 261,1 51 35 16 2,77 Marbofloxacin 1 362,9 320,1 66 23 24 Marbofloxacin 2 326,7 66 25 24 3,30 Tetracycline 1 445,0 410,2 51 27 32 Tetracycline 2 427,1 51 19 32 46 Figura 14: Cromatogramas del Ciprofloxacin a 0,1 µg/L para los 4 volúmenes de inyección Figura 13: Cromatogramas del Ofloxacin a 0,1 µg/L para los 4 volúmenes de inyección 47 2. Recopilación de los datos en tablas y representación gráfica: Cuando se sabe ya que todos los picos están bien integrados, se recogen en tablas varios parámetros característicos: área de pico, área del pico del patrón interno (si hay), relación señal/ruido, anchura al 5% de altura y factor de asimetría (anchura lado derecho/anchura lado izquierdo). Con los valores de área y concentración se va a realizar la representación del área frente la concentración, con la pequeña diferencia que los compuestos que tienen un patrón interno asociado van a tener representación de la relación de areas (área compuesto dividido por el área patrón interno) frente a la concentración de analito. Se denomina a estos calibrados matriz-patrón ya que los patrones de calibración contienen la matriz de la muestra. Se muestran a continuación en las Tabla 12-19 los valores obtenidos en la integración de ambos compuestos para los 4 volúmenes analizados en la inyección directa del efluente. Tabla 12: Resultados de la integración para el Ofloxacin con 100 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 3,8*106 84,7 0,28 1,76 Blanco 2 4,0*106 89,4 0,29 2,26 0,0005 4,0*106 67,8 0,26 2,04 0,0010 4,1*106 83,2 0,24 1,59 0,0050 3,9*106 76,0 0,25 1,81 0,0100 4,7*106 108,4 0,24 1,15 0,0500 5,8*106 90,7 0,27 2,35 0,1000 8,7*106 136,6 0,25 2,44 0,5 1,5*107 194,2 0,25 1,84 1 2,5*107 290,2 0,24 1,92 4 1,0*108 1022,5 0,23 2,72 10 1,9*108 1326,0 0,24 2,82 20 3,2*108 2237,3 0,26 2,10 40 5,0*108 2436,4 0,26 1,84 60 6,2*108 2176,9 0,26 2,34 80 7,4*108 3080,7 0,29 1,96 100 8,6*108 1922,1 0,29 2,04 48 Tabla 13: Resultados de la integración para el Ciprofloxacin con 100 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área Área pI S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 3,4*106 5,0*107 104,7 0,15 2,36 Blanco 2 3,5*106 6,5*107 138,7 0,16 2,15 0,0005 2,6*106 6,0*107 91,1 0,15 2,65 0,0010 2,9*106 3,1*107 69,7 0,15 1,36 0,0050 2,6*106 6,0*107 133,5 0,12 2,62 0,0100 4,5*106 6,1*107 124,2 0,14 2,08 0,0500 4,0*106 4,9*107 115,1 0,15 2,20 0,1000 5,3*106 5,0*107 158,8 0,16 2,14 0,5 9,1*106 6,0*107 185,0 0,15 2,31 1 1,6*107 5,3*107 420,5 0,14 2,41 4 1,1*108 6,0*107 1254,9 0,14 1,68 10 1,4*108 6,1*107 1350,7 0,14 2,44 20 2,5*108 5,0*107 2338,4 0,15 1,99 40 4,3*108 5,5*107 2471,4 0,15 2,96 60 4,9*108 5,2*107 2054,6 0,15 1,75 80 5,7*108 5,0*107 2289,4 0,16 1,59 100 6,2*108 5,6*107 2253,9 0,17 2,06 Tabla 14: Resultados de la integración para el Ofloxacin con 200 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 5,4*106 125,8 0,19 1,44 Blanco 2 5,9*106 151,4 0,20 1,85 0,0005 5,4*106 167,1 0,19 1,82 0,0010 6,0*106 170,2 0,19 1,59 0,0050 5,6*106 129,5 0,18 1,58 0,0100 6,6*106 194,8 0,20 2,03 0,0500 8,2*106 222,5 0,20 1,57 0,1000 1,3*107 249,5 0,19 1,48 0,5 2,3*107 443,2 0,19 1,83 1 3,9*107 684,9 0,19 2,03 4 1,4*108 2583,4 0,19 1,44 10 2,6*108 2797,7 0,20 1,95 20 4,2*108 3382,5 0,21 1,95 40 7,0*108 3687,9 0,23 2,34 60 8,4*108 3126,7 0,23 1,86 80 9,4*108 3182,5 0,24 2,11 100 1,0*109 3207,3 0,25 1,86 49 Tabla 15: Resultados de la integración para el Ciprofloxacin con 200 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área Área pI S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 5,1*106 7,8*107 145.0 0,15 1,50 Blanco 2 4,3*106 8,4*107 131,2 0,13 1,34 0,0005 4,3*106 9,1*107 125,9 0,13 1,44 0,0010 4,1*106 9,2*107 155,3 0,15 1,43 0,0050 3,6*106 8,4*107 87,3 0,13 1,75 0,0100 5,7*106 8,1*107 118,4 0,14 1,86 0,0500 5,6*106 7,1*107 109,3 0,12 1,64 0,1000 7,8*106 7,5*107 160,5 0,14 1,80 0,5 1,5*107 7,9*107 382,6 0,14 1,83 1 2,6*107 7,8*107 609,7 0,13 1,61 4 1,6*108 8,0*107 2123,3 0,13 1,67 10 2,0*108 9,2*107 2122,4 0,14 1,50 20 3,3*108 7,4*107 2659,7 0,14 1,43 40 5,4*108 8,6*107 2615,2 0,16 1,58 60 6,4*108 7,1*107 2590,1 0,16 1,62 80 6,9*108 6,9*107 2740,3 0,15 1,77 100 7,6*108 8,2*107 2088,8 0,17 1,32 Tabla 16: Resultados de la integración para el Ofloxacin con 300 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 7,6*106 198,5 0,16 1,70 Blanco 2 7,6*106 232,9 0,16 1,55 0,0005 7,2*106 217,6 0,18 1,74 0,0010 7,5*106 190,8 0,16 1,35 0,0050 6,9*106 184,6 0,15 1,42 0,0100 8,3*106 224,7 0,18 1,83 0,0500 1,0*107 245,8 0,17 1,93 0,1000 1,6*107 373,3 0,17 2,23 0,5 2,8*107 2686,8 0,16 1,69 1 4,8*107 832,8 0,18 1,37 4 1,7*108 2124,0 0,17 1,55 10 3,1*108 3403,1 0,18 1,84 20 5,0*108 3674,6 0,18 1,38 40 7,4*108 4705,6 0,20 1,91 60 8,4*108 4520,4 0,22 2,78 80 9,4*108 4595,1 0,33 2,12 100 9,7*108 3121,3 0,34 4,34 50 Tabla 17: Resultados de la integración para el Ciprofloxacin con 300 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área Área pI S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 6,4*106 8,1*107 177,6 0,16 1,69 Blanco 2 6,0*106 1,0*108 141,2 0,16 2,08 0,0005 5,2*106 1,1*108 112,5 0,16 1,63 0,0010 5,1*106 1,1*108 149,1 0,15 1,59 0,0050 4,7*106 1,1*108 269,0 0,14 1,87 0,0100 7,4*106 1,0*108 181,8 0,15 1,56 0,0500 6,5*106 9,7*107 160,0 0,14 1,55 0,1000 8,6*106 8,6*107 178,2 0,15 2.00 0,5 1,8*107 1,0*108 374,5 0,13 1,66 1 2,9*107 9,5*107 1039,8 0,14 1,29 4 1,8*108 1,0*108 1801,0 0,14 1,75 10 2,3*108 1,1*108 1936,6 0,14 1,53 20 3,8*108 9,5*107 2240,8 0,15 1,43 40 6,1*108 7,7*107 2472,9 0,16 1,34 60 6,9*108 9,1*107 2930,3 0,17 1,74 80 7,8*108 9,3*107 4741,9 0,18 2,19 100 8,4*108 7,8*107 2638,1 0,18 1,12 Tabla 18: Resultados de la integración para el Ofloxacin con 400 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 8,9*106 208,1 0,15 1,48 Blanco 2 8,9*106 784,1 0,15 2,06 0,0005 7,8*106 205,0 0,14 1,47 0,0010 8,9*106 214,6 0,14 1,37 0,0050 7,8*106 184,6 0,14 1,29 0,0100 9,6*106 314,4 0,15 1,83 0,0500 1,2*107 347,8 0,15 1,48 0,1000 1,9*107 469,6 0,15 1,37 0,5 3,4*107 861,3 0,15 1,85 1 5,6*107 1072,0 0,15 1,95 4 1,9*108 2673,4 0,15 1,47 10 3,2*108 2610,8 0,16 1,93 20 5,3*108 3350,1 0,17 1,66 40 7,5*108 4005,5 0,20 2,58 60 8,4*108 4310,9 0,29 3,67 80 9,1*108 3306,8 0,29 5,34 100 9,5*108 1733,9 0,22 1,18 51 Tabla 19: Resultados de la integración para el Ciprofloxacin con 400 uL de volumen de inyección Concentración (µg/L) Área Área pI S/R Anchura 5% Factor asimetría Blanco 1 8,7*106 1,1*108 133 0,15 1,61 Blanco 2 7,5*106 1,2*108 146,4 0,13 1,51 0,0005 6,3*106 1,2*108 154,6 0,16 1,76 0,0010 6,3*106 1,2*108 116,4 0,15 1,61 0,0050 5,1*106 1,2*108 101,4 0,13 1,32 0,0100 8,4*106 1,2*108 168,2 0,15 1,42 0,0500 7,4*106 1,0*108 151,7 0,13 1,41 0,1000 1,0*107 9,5*107 192,7 0,14 1,41 0,5 1,9*107 1,2*108 324,1 0,14 1,54 1 3,3*107 1,1*108 452,6 0,14 1,71 4 2,1*108 1,2*108 1417,8 0,14 1,34 10 2,5*108 1,1*108 1871,8 0,15 1,61 20 4,2*108 1,0*108 3087,9 0,15 1,53 40 6,5*108 1,1*108 3634,3 0,17 1,31 60 7,8*108 9,8*107 3882,5 0,18 1,16 80 8,4*108 9,7*107 3214,3 0,19 1,13 100 9,0*108 1,1*108 2432,8 0,20 1,09 Con los valores de área frente a concentración se realiza la representación lineal con la que luego se puede determinar el rango lineal y la concentración de la muestra. Se muestra en la Figura 15 representación del Ofloxacin para los 4 volúmenes de inyección distintos en la inyección directa. 0,00E+00 2,00E+08 4,00E+08 6,00E+08 8,00E+08 1,00E+09 1,20E+09 050 100 150 Área pico Concentración (µg/L) Ofloxacin 0-100 µg/L 100 200 300 400 0,00E+00 5,00E+07 1,00E+08 1,50E+08 2,00E+08 2,50E+08 0 1 2 3 4 5 Área pico Concentración (µg/L) Ofloxacin 0-10 µg/L 100 200 300 400 Figura 15: Representación del área de pico frente la concentración para los diferentes volúmenes estudiados en ID para el Ofloxacin 52 En la representación del Ofloxacin (Figura 15) se ve como el rango lineal no es de 0-100 µg/L ya que la recta se curva a partir de los 4 µg/L debido a la saturación del detector, es por esto por lo que se realiza otro grafico delimitando el rango a 4 µg/L. Se escoge el valor del rango lineal atendiendo a que el parámetro R2 del ajuste lineal sea mayor o igual a 0,99. Se ve, además, como ocurre en el resto de los casos que al aumentar el volumen de inyección aumenta la pendiente de la recta. Tras recopilar todos los datos se realiza una tabla resumen (Tabla 20) en la que se seleccionan los datos de anchura y factor de simetría de una concentración arbitraria (60 µg/L) para comparar esos parámetros entre los distintos volúmenes. Se añade también el límite de cuantificación y detección del método (MLQ y MLD respectivamente) que se calculan multiplicando por 10 y por 3 la división de concentración en µg/L entre señal/ruido respectivamente. El rango lineal exacto se expresa mediante la diferencia entre la concentración máxima de linealidad (a la cual deja de ser una recta la representación de intensidad frente concentración) y el valor del MLQ (concentración mínima cuantificable). En la Tabla 20 se muestra en unidades de ng/L para poder compararlo entre volúmenes y ver variación notable. Tabla 20: Resumen de parámetros analíticos para la inyección directa para Ofloxacin y Ciprofloxacin Analito Volumen (µL) Anchura 5% Factor simetría MLQ (ng/L) Rango lineal (ng/L) Ofloxacin 100 0,26 2,32 27 9972,4 Ofloxacin 200 0,23 2,61 8 3991,5 Ofloxacin 300 0,22 4,02 9 3991,1 Ofloxacin 400 0,29 3,93 7 3993,3 Ciprofloxacin 100 0,15 1,72 69 19931,5 Ciprofloxacin 200 0,16 2,11 25 19974,8 Ciprofloxacin 300 0,17 2,42 14 19986,4 Ciprofloxacin 400 0,18 1,14 18 19982,1 53 El cálculo de parámetros como el MLQ, el MLD, el rango lineal y la pendiente dependen de si hay señal en el blanco (si hay compuesto en la muestra sin dopar). Si no hay señal en el blanco, se calculan como se ha mostrado en este apartado, es decir, con la recta del calibrado matriz-patrón. En el caso de estos dos compuestos, hay señal y no valdrían dichos parámetros. Si hay señal en el blanco hay que calcular antes las concentraciones presentes para calcular después dichos parámetros. Las concentraciones en las muestras se determinan mediante un calibrado de adiciones patrón y posteriormente se realiza el calibrado matriz patrón en el que se representa el área frente la concentración total (suma de la concentración de la muestra y la concentración de dopado). Es de esta recta, con la concentración de la muestra calculada de la que se extraen dichos parámetros. 3. Cálculo de concentración: Se trabaja con muestras de agua real que pueden contener los compuestos que se estudian. Para poner a punto un método de análisis es necesario conocer cuáles están presentes y en qué concentración. El cálculo de concentración en la muestra estudiada (en este ejemplo el efluente de agua residual urbana) se realiza mediante una calibración de adiciones patrón que en este caso cuenta con 2 blancos y varias muestras con concentraciones ascendentes de analito. Al realizarse la representación mostrada en el anterior apartado con todas las muestras (incluidos los blancos), teniendo en cuenta las concentraciones añadidas se determina la concentración que había en los blancos mediante el cálculo de la intersección con el eje ``x´´, de la concentración, y cambiándole el signo (concentración equivalente). Teniendo ese valor correspondiente a la concentración del blanco se realiza una nueva representación denominada calibrado matriz-patrón en la que se representa el área frente la concentración real de las muestras (suma de la concentración calculada en la muestra más la concentración añadida al dopar con patrones). Con esta nueva representación obtenemos la pendiente que nos aporta el método para ese analito al tiempo que es posible calcular también el MLQ, el MLD y el rango lineal a partir de la concentración total presente cuando la presencia es positiva. 54 En la Tabla 21 se muestran los valores de concentración calculadas de ambos analitos en cada volumen para el efluente en la inyección directa. Tabla 21: Concentraciones calculadas en el efluente de la ID del Ofloxacin y Ciprofloxacin Analito Volumen (µL) Concentración calculada efluente (µg/L) Ofloxacin 100 0,29 Ofloxacin 200 0,15 Ofloxacin 300 0,19 Ofloxacin 400 0,20 Ciprofloxacin 100 0,91 Ciprofloxacin 200 0,39 Ciprofloxacin 300 0,36 Ciprofloxacin 400 0,28 55 6.1.2 Agua Milli-Q El estudio del volumen de inyección se comienza para el agua Milli-Q, en la que se asume un efecto matriz nulo, o casi nulo, se han estudiado 25, 50, 100, 200, 300 y 400 µL como volúmenes de inyección para ambos métodos automáticos. El estudio de los volúmenes en el agua Milli-Q va a servir para descartar algún volumen de inyección para las muestras de agua residual urbana y ganadera. Para poder seleccionar el volumen óptimo se van a estudiar tres factores principales: el límite de cuantificación del método (MLQ), el rango lineal y la anchura del pico al 5% de la altura del pico desde la línea de base. Para cada volumen se van a estimar varios parámetros estadísticos que nos den idea de los valores obtenidos de esos tres factores estudiados. Los parámetros estadísticos que nos dan mejor idea de ello son la mediana y los percentiles. La mediana (µ) indica cual es el valor central de una serie de datos y se observa en nuestro caso que es más adecuada que la media para dar idea de un valor orientativo de cada factor, ya que la última es más susceptible a variar mucho por valores extremos. Los percentiles nos dan los valores del factor por debajo de los cuales se encuentran un % determinado de compuestos. El percentil 90% nos da el valor del factor por debajo del cual se encuentran el 90% de los valores. Nos sirve para darnos una idea de cómo es la distribución de nuestros datos. Se muestra en la Tabla 22 os parámetros estadísticos comentados para los tres factores estudiados en cada método de análisis y volumen de inyección. 62 6.1.4 Agua residual ganadera Para esta matriz, asi como para la de agua residual urbana, se va a seleccionar solo un volumen como óptimo para realizar la posterior validación del método. Se van a estudiar 100, 200, 300 y 400 µL como volúmenes candidatos y se va a seleccionar el volumen que mejores resultados nos dé para cada corriente del biorreactor (influente y efluente) y para cada método automático. El volumen óptimo no tiene por qué ser el mismo en cada corriente, ni en cada método. Para seleccionar el volumen óptimo se va a realizar el estudio de la misma manera que con el agua residual urbana con una pequeña variación: el rango de concentraciones de las adiciones patrón comprende concentraciones desde 0.0005 hasta 40 µg/L. Se van a estudiar los mismos datos, con parámetros estadísticos como son la mediana y los percentiles, como en el caso del agua residual urbana. Tras ello se mostrará el porcentaje de compuestos para los que el método y volumen de inyección aporten un MLQ menor de 50 ng/L. Teniendo en cuenta ambos tipos de datos se determinará definitivamente cual es el volumen óptimo, únicamente para el método de análisis de inyección directa (ya que se vio en el agua residual urbana que era el método automático que mejores resultados aportaba) en ambas corrientes. Se muestran dichos valores en las Tabla 27-28. Tabla 27: Resumen de parámetros estadísticos para el agua residual ganadera con ID influente Influente Inyección directa MLQ (ng/L) Rango lineal (ng/L) Anchura 5% Vol iny (µL) µ P25% P75% µ P90% P95% µ P90% P95% 100 28 12 227 19997,0 39964,0 39970,9 0,13 0,37 0,50 200 22 7 259 19992,8 39980,7 39987,7 0,15 0,52 0,58 300 18 8 226 19992,4 39984,3 39990,5 0,16 0,47 0,64 400 20 6 190 19991,8 39984,7 39989,1 0,16 0,41 0,74 63 Tabla 28: Resumen de parámetros estadísticos para el agua residual ganadera con ID efluente En las Tabla 27-28 se obtienen como conclusiones: o Influente: Todos los volúmenes tienen valores de mediana del MLQ, rango lineal y anchura muy similares. Los mejores volúmenes de inyección según la mediana del MLQ son 300 y 400 µL. Según el rango lineal y la anchura el mejor volumen de inyección es 100 µL. o Efluente: Al igual que en la corriente de entrada todos los volúmenes tienen valores de mediana del MLQ, rango lineal y anchura muy similares. Los mejores volúmenes de inyección según la mediana del MLQ son 200, 300 y 400 µL. Según el percentil de 75% se puede ver que 400 µL es un volumen que da notablemente menor valor en este parámetro. Según el rango lineal el mejor sería 200 µL. En estas tablas no obtenemos resultados tan claros para seleccionar uno o dos volúmenes óptimos como obtuvimos en el estudio estadístico de la ID en el agua residual urbana. Según el parámetro observado el volumen óptimo varía. A continuación, se va a considerar el número de compuestos con MLQ inferior a 50 ng/L. Se muestra en la Tabla 29 los porcentajes de compuestos con MLQ inferior a 50 ng/L frente el total de compuestos que se detectaron a cada volumen de inyección con la ID para ambas corrientes de la depuradora. Efluente Inyección directa MLQ (ng/L) Rango lineal (ng/L) Anchura 5% Vol iny (µL) µ P25% P75% µ P90% P95% µ P90% P95% 100 23 8 319 19985,7 39697,7 39828,4 0,11 0,35 0,44 200 18 4 192 19996,9 39966,9 39974,7 0,12 0,38 0,50 300 18 5 131 19990,8 39959,0 39980,2 0,12 0,46 0,56 400 18 4 90 19991,8 39939,8 39978,4 0,13 0,45 0,74 64 Tabla 29: Conteo y porcentaje de analitos con MLQ<50 ng/L frente los detectados con la inyección directa en agua residual ganadera Con la Tabla 29 podemos deducir: Al obtenerse porcentajes tan parejos en ambas corrientes y casi todos los volúmenes, analizamos más el conteo de compuestos que el porcentaje en sí mismo. o Influente: Tanto 100 como 300 y 400 tienen el mismo número de analitos con MLQ<50 ng/L (25), por ello el volumen seleccionado será el que nos dé mayor número de analitos detectados. En esta corriente, inyectando 100 µL detectamos el mayor número de analitos teniendo el mismo número de ellos con MLQ inferior a 50 ng/L. El volumen óptimo en ID para el influente es por ello 100 µL, aunque el porcentaje estrictamente sea menor. o Efluente: Todos los volúmenes de inyección detectan el mismo número de analitos, por ello el volumen óptimo será aquel que nos aporte el mayor número de ellos con el MLQ inferior a 50 ng/L. En este caso, el volumen óptimo es 300 µL ya que da más compuestos con ese criterio y coincide, lógicamente, con el volumen con mayor porcentaje de estos. Como conclusión, los volúmenes óptimos seleccionados en la inyección directa para el agua residual ganadera son 100 µL para el influente y 300 µL para el efluente. Corriente agua residual ganadera Volumen inyección (µL) Nº Analitos con MLQ<50 ng/L Nº Analitos detectado % Analitos detectado y MLQ<50 ng/L Influente 100 25 41 61 200 24 39 62 300 25 39 64 400 25 38 66 Efluente 100 21 38 55 200 24 38 63 300 26 38 68 400 25 38 66 65 6.2 Comparación con la SPE Off-line En la extracción en fase sólida offline, es decir, la realizada en el laboratorio manualmente, no hay que elegir ningún volumen de inyección. En el método rutinario se inyecta un volumen de 10 µL después de concentrar los extractos. Se va a comprobar si los métodos automáticos son comparables, o al menos dan valores poco discordantes, y por tanto podrían sustituir al método manual y ganar así en repetibilidad, reproducibilidad y menor tiempo de tratamiento de muestra. La comprobación se realiza comparando los valores de los métodos automáticos recopilados en las tablas generadas en el apartado de selección de volumen frente los valores obtenidos en la extracción realizada manualmente. Se muestra en las Tabla 30-31 los parámetros estadísticos obtenidos con la SPE-Offline, para los 3 factores estudiados: MLQ, rango lineal y anchura de pico, y para los tipos de agua estudiados incluyendo la diferencia entre corriente en el agua residual. 66 Tabla 30: Resumen de parámetros estadísticos en los métodos automáticos para el agua Milli-Q con SPE-Offline Tabla 31: Resumen de parámetros estadísticos en los métodos automáticos para el agua residual urbana con SPE-Offline SPE Offline MLQ (ng/L) Rango lineal (ng/L) Anchura 5% µ P25% P75% µ P90% P95% µ P90% P95% Agua residual urbana influente 23 8 120 49936.6 99972.5 99992.8 0.13 0.38 0.39 Agua residual urbana efluente 13 4 41 39554.7 99024.4 99587.7 0.13 0.33 0.35 Agua Milli-Q SPE Offline MLQ (ng/L) Rango lineal Anchura 5% µ P25% P75% µ P90% P95% µ P90% P95% 0.7 0.03 5 59969.8 99998.2 99999.8 0.18 0.51 0.56 63 En las Tabla 30-31 se observa que los valores de MLQ son valores muy bajos y, menores que mediante los métodos automáticos, por tanto, valores bastante buenos. Se muestra a continuación la Tabla 32 con el conteo y porcentaje de analitos con MLQ inferior a 50 ng/L frente al total de los detectados en las tres matrices estudiadas en la SPE-Offline. Tabla 32: Conteo y porcentaje de analitos con MLQ<50 ng/L frente los detectados en las matrices acuosas estudiadas Nº Analitos con MLQ<50 ng/L Nº Analitos detectados % Analitos detectados y MLQ<50 ng/L Agua Milli-Q 35 39 90 Agua residual urbana influente 27 44 61 Agua residual urbana efluente 31 41 76 De igual manera que con los parámetros estadísticos, el conteo y los porcentajes son valores muy buenos para el análisis de analitos a nivel de trazas ya que en las tres matrices dan porcentajes de analitos con MLQ menor a 50 ng/L mayores al 50% siendo el número de analitos detectado muy alto también. Para poder comparar los métodos automáticos (inyección directa y SPE-Online) con el método manual (SPE-Offline) se muestra en la Tabla 33 la comparación del porcentaje de compuestos con MLQ inferior a 50 ng/L para el volumen óptimo en cada método automático con los valores obtenidos en el SPE-Offline en el agua residual urbana de entrada y salida. Tabla 33: Comparación de los porcentajes de analitos con MLQ<50 ng/L en el agua residual urbana entre los tres métodos de análisis Agua residual urbana influente Nº Analitos con MLQ<50 ng/L Nº Analitos detectados % Analitos detectados y MLQ<50 ng/L SPE-Offline 27 44 61 SPE-Online (300 µL) 16 41 39 Inyección directa (200 µL) 20 39 51 Agua residual urbana efluente Nº Analitos con MLQ<50 ng/L Nº Analitos detectados % Analitos detectados y MLQ<50 ng/L SPE-Offline 31 41 76 SPE-Online (300 µL) 12 39 30 Inyección directa (400 µL) 28 40 70 64 De la Tabla 33 se extrae como conclusión que el método de análisis manual es el que mejores porcentajes proporciona, al tiempo que da porcentajes más o menos similares a la inyección directa que, como método automático es mucho más rápido y los analitos detectados son prácticamente los mismos. Se puede observar también que los porcentajes de analitos con MLQ inferior a 50 ng/L son mayores en el efluente de depuradora que en el influente (salvo en la SPE-Online) debido a ser una matriz más limpia. 6.3 Influencia de factores. Análisis estadístico Además del volumen de inyección, se va a comprobar estadísticamente si hay otros factores que afecten determinantemente a los resultados del método aplicado a aguas residuales urbanas. Entre los factores a estudiar, destaca la influencia del AEDT (Ácido etilendiaminotetraacético). 6.3.1 Influencia del AEDT Para determinar la influencia del AEDT en el proceso analítico se ha realizado el análisis del agua residual urbana en ausencia y en presencia de AEDT (0.1%). Se comparan las respuestas obtenidas para estas tres concentraciones mediante un ANOVA que estudie dicho factor sobre el área de pico y la anchura. De esta forma podemos determinar mediante un ANOVA simple si el AEDT afecta significativamente al valor del área de pico y a la forma del pico (mediante la anchura de este). Dichos ANOVA simples estudiados para los tres métodos conjuntamente sobre ambas variables se muestran en las Tabla 34-35. Tabla 34: ANOVA simple sobre la influencia AEDT en el área de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 1,86*1015 1 1,86*1015 0,08 0,7745 Intra grupos 9,16*1019 4031 2,27*1016 Total 9,16*1019 4032 Tabla 35: ANOVA simple sobre la influencia AEDT en la anchura al 5% de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 0,45 1 0,45 6,75 0,0094 Intra grupos 270 4031 0,07 Total 270 4032 65 Las conclusiones que se extraen con estos gráficos ANOVA simples para el AEDT son: - La adición de AEDT no influye significativamente (α=0,05) al factor área de pico debido a que el valor de P es mayor que 0,05. - La adición de AEDT influye significativamente (α=0,05) al factor de anchura al 5% de pico ya que el valor de P es menor que 0,05. Como lo que nos interesa del método es el área de pico, y la anchura de pico no varía excesivamente a pesar la diferencia significativa observada se asume que la adición de AEDT no es crítica para el método. Por lo tanto, en las condiciones óptimas de los tres métodos de análisis para el agua residual urbana se omite la adición de AEDT. Similares conclusiones se obtienen cuando se consideran los métodos de análisis por separado. 6.3.2 Influencia del volumen de inyección El otro factor relevante para la optimización del método es el volumen de inyección, que ya ha sido seleccionado previamente. Ahora, se va a comprobar si el volumen de inyección es un factor influyente tanto en el área de pico como en la anchura al 5% del pico para los dos métodos automáticos (SPE-Online e inyección directa). Y, por tanto, poder confirmar que la selección del volumen de inyección óptimo era una operación crítica. Para estudiar su influencia se realiza un ANOVA simple para cada una de las variables a estudiar (área y anchura) considerando los diferentes volúmenes como factores controlados. Los resultados de estos ANOVA simples se muestran en las Tablas 36-37. Tabla 36: ANOVA simple sobre la influencia volumen inyección en el área de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 1,27*1018 4 3,17*1017 14,14 0,0001 Intra grupos 9,04*1019 4028 2,24*1016 Total 9,17*1019 4032 Tabla 37: ANOVA simple sobre la influencia volumen inyección en la anchura al 5% de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 12 4 3 49,69 0.0001 Intra grupos 257 4028 0,06 Total 270 4032 66 La conclusión que se extrae con estos gráficos ANOVA simples para el volumen es: - El volumen de inyección, como era de esperar, es un factor que influye significativamente (α=0,05) a las dos variables estudiadas (área de pico y anchura de este) ya que el valor de P es menor que 0,05. Es por esto por lo que se ha buscado cual es el volumen óptimo para cada método y corriente, debido a que el volumen si influye en estas variables y, por ello, en la cuantificación posterior. 6.3.3 Análisis multifactorial Aparte de estudiar solo la influencia de un único factor se ha estudiado la influencia conjunta de varios factores mediante un ANOVA multifactorial en el que se estudia la influencia del método de análisis, la corriente del agua y de nuevo la concentración del AEDT añadida. Se muestran en las Tablas 38-39 los ANOVA multifactoriales en el que el factor A es la corriente de agua (influente a la depuradora de agua o efluente de esta), el factor B es el método de análisis usado (inyección directa, SPE-offline, SPE-Online) y el factor C es la presencia o no del AEDT en la muestra. Tabla 38: ANOVA multifactorial de tres factores sobre la influencia en el área de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P A:Corriente agua dep 1,31*1015 1 1,31*1015 0,06 0,8098 B:Método análisis 2,84*1017 2 1,42*1017 6,27 0,0019 C:Concentración AEDT 1,66*1015 1 1,66*1015 0,07 0,7866 RESIDUOS 9,14*1019 4028 2,27*1016 TOTAL 9,17*1019 4032 Tabla 39: ANOVA multifactorial de tres factores sobre la influencia en la anchura al 5% de pico Fuente Suma Cuadrados Grados libertad Cuadrado Medio Razón-F Valor-P A:Corriente agua dep 0,45 1 0,45 11,94 0,0005 B:Método análisis 117 2 58 1565,76 0,0000 C:Concentración AEDT 0,49 1 0,49 12,90 0,0003 RESIDUOS 151 4028 0,038 TOTAL 270 4032 67 Las conclusiones que se extraen con estos gráficos ANOVA multifactoriales son: - El factor A (corriente de agua en la depuradora) no afecta significativamente (α=0,05) al área de pico, pero si afecta significativamente (α=0,05) a la anchura del pico al 5%; debido a que el valor de P es mayor que α y menor que α respectivamente. Se deduce que la matriz afecta a la forma del pico debido a que el efluente es una matriz más limpia que el influente a la depuradora. - El factor B (método de análisis utilizado) afecta significativamente (α=0,05) a ambas variables ya que el valor de P es menor que 0,05. Esto era esperable ya que el método de análisis y sobre todo el diferente volumen de inyección tiene que influir claramente sobre las dos variables estudiadas. - El factor C (concentración de AEDT) ya se había comentado con el ANOVA simple. 74 Tabla 43: Recuperación absoluta y desviación estándar de las mismas en agua residual urbana con SPE-Online Efluente Influente Analito Recuperación (%) Desviación (RSD%) Recuperación (%) Desviación (RSD%) PenicillinG 43 4 22 19 Doxycycline 118 11 134 2 Marboflaxin 37 16 42 31 Erofloxacin 31 27 39 16 Danofloxacin 33 24 35 32 Sulfathiazole 25 12 25 21 Sulfamethizole 20 9 18 51 Sulfadimidine 18 20 22 54 Sulfamethoxazole 16 15 19 3 Tylosin 64 15 71 9 Tiamulin 97 9 74 10 Apramycin 65 24 55 13 Trimethoprim 28 25 33 33 Florfenicol 59 17 25 14 Fenbendazol 10 9 13 36 Dexamethasone 48 12 43 33 Progesterone 19 16 14 46 Methylparaben 56 9 48 9 Carbamazepine 64 13 62 24 Propanolol 27 12 26 14 Metronidazole 42 5 40 14 Ofloxacin 51 21 59 30 Naproxen 23 28 36 53 Clarithromicyn 66 15 77 11 Erythromicyn 27 47 24 9 Levofloxacin 49 23 47 21 Norfloxacin 63 34 74 11 Atorvastatin 48 66 91 23 Atenolol 40 35 23 58 Atrazine 53 1 49 4 DEET 90 45 95 12 Ciprofloxacin 38 59 36 15 Crotamiton 45 10 38 11 Ethylparaben 33 4 28 14 Propylparaben 28 9 23 33 Diclofenac 39 2 21 21 Ibuprofen 32 15 45 2 Clofibric acid 41 32 37 11 Gemfibrocil 24 4 13 29 75 Hay analitos en los que se obtiene una única recuperación dentro del rango lineal del calibrado y por ello solo habiendo un valor no puede calcularse la desviación estándar y en la tabla se muestra con un guion (-). Podemos observar que los resultados obtenidos son valores muy variables entre analitos, esto es común ya que en la recuperación absoluta se tiene en cuenta todo el proceso desde la preparación hasta la detección de muestra y, cada analito tiene un comportamiento y da lugar a valores muy variables entre ellos. Los resultados de recuperación absoluta se pueden comparar si es sobre el mismo analito y método de análisis, donde si se ven en general valores mucho más similares y comparables. 6.5 Incidencia de los compuestos en las muestras de agua residual Una vez se han calculado las concentraciones de los analitos en las muestras de agua residual urbana, tanto de entrada como de salida a la depuradora, se comparan entre sí las concentraciones de cada analito en ambas corrientes para poder determinar cuál ha sido el porcentaje de eliminación de dicho analito en el proceso de depuración. Se muestra en la Tabla 44 las concentraciones de cada analito y el porcentaje de eliminación conseguido en el proceso de depuración en ambas corrientes de agua residual urbana en la depuradora y para cada método de análisis estudiado. Todos los valores mostrados en la Tabla 44 corresponden a los valores obtenidos con los métodos optimizados (volumen de inyección óptimo). Hay algún método en que se no detecta un analito que si ha detectado mediante otro método como se muestra en la tabla (n.d. siendo los no detectados). Esto es debido principalmente a las diferencias de sensibilidad (MLQs) entre los diferentes métodos. 77 Tabla 44: Concentraciones de agua residual urbana y porcentaje de eliminación con los tres métodos de análisis ID SPE-Online SPE-Offline Analito Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Doxycycline 970 231 76 n.d. n.d. - n.d. n.d. - Erofloxacin n.d. 258 <0 n.d. n.d. - n.d. n.d. - Danofloxacin 325 68 79 612 331 46 n.d. n.d. - Sulfathiazole n.d. n.d. - n.d. n.d. - n.d. 218 <0 Sulfadimidine n.d. n.d. - n.d. n.d. - n.d. 74 <0 Sulfamethoxazole 454 n.d. 100 n.d. n.d. - 321 227 29 Tylosin n.d. 63 <0 n.d. n.d. - n.d. n.d. - Tiamulin 869 184 79 751 123 84 60 52 14 Trimethoprim n.d. 41 <0 n.d. 109 <0 91 17 81 Fenbendazol 197 183 7 170 138 18 17 3 81 Progesterone 556 n.d. 100 232 173 25 248 n.d. 100 Methylparaben 2420 475 80 2651 352 87 2322 306 87 Carbamazepine 85 24 72 118 56 52 28 10 65 Propanolol 946 172 82 n.d. n.d. - 217 78 64 Metronidazole n.d. n.d. - n.d. n.d. - 91 84 7 Ofloxacin 714 198 72 571 474 17 119 72 40 Naproxen 3802 3260 14 4565 3169 31 3860 2769 28 Clarithromicyn 87 44 49 203 84 59 168 64 62 Erythromicyn 1219 790 35 n.d. n.d. - n.d. 502 <0 Levofloxacin 798 224 72 602 380 37 192 103 46 Norfloxacin n.d. 702 <0 n.d. n.d. - n.d. n.d. - Atorvastatin 174 138 21 233 233 0 483 28 94 Atenolol 395 331 16 95 279 <0 232 222 5 78 Analito ID SPE-Online SPE-Offline Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Conc influente (ng/L) Conc efluente (ng/L) % eliminado Atrazine 68 28 59 n.d. 53 <0 12 7 38 DEET 326 129 60 411 326 21 221 190 14 Ciprofloxacin 530 279 47 1455 1210 17 891 603 32 Crotamiton 178 119 33 n.d. 113 <0 175 56 68 Ethylparaben 1030 n.d. 100 n.d. n.d. - 776 79 90 Propylparaben 1723 835 52 1515 292 81 1573 441 72 Diclofenac 1232 553 55 920 515 44 n.d. n.d. - Ibuprofen 21820 12453 43 20015 11202 44 15741 7063 55 Clofibric acid 1351 826 39 n.d. n.d. - 362 229 37 Gemfibrocil 1566 1375 12 907 727 20 233 174 25 79 Las concentraciones calculadas en la inyección directa y la SPE-offline son valores comparables y cercanos, sobre todo las concentraciones en el influente. Los de la SPE-Online son valores no tan similares. Los porcentajes de eliminación obtenidos no son comparables prácticamente entre métodos. Se ve además algún porcentaje negativo, que supone una concentración de analito mayor en la corriente de salida de la depuradora que en la entrada de esta. El aumento en la señal detectada (y por ello en la concentración) en la corriente de salida frente la de entrada a la depuradora, a priori, es un resultado inesperado. Sin embargo, hay algunas posibles explicaciones a que el porcentaje de eliminación de un analito sea negativo: - Que las muestras no hayan sido cogidas teniendo en cuenta el tiempo hidráulico de residencia de la depuradora y, por lo tanto, no sean exactamente comparables. Al tomarse sin tenerse en cuenta el punto hidráulico, el caudal es diferente y por ello se asume una dilución diferente entre ellas. - Que en la entrada el analito estuviese unido a un compuesto biológico (derivatizado), generalmente ácido glucurónico (glucuronizado), y se hidrolice durante el tratamiento de la depuradora. Esto provocaría que en la entrada el analito no sea detectado por nuestro método, por estar derivatizado y no en la forma en la que se detecta óptimamente en nuestro método, y en la salida de la depuradora si se detecte debido a que se haya hidrolizado y se encuentre libre el propio analito y por ello se detecte íntegramente. - Que dentro del proceso de depuración el agua residual cruce algún paso en el que el tratamiento de limpieza utilizado, generalmente los lodos utilizados, se encuentre saturado de ese compuesto determinado. 80 7 CONCLUSIONES • En los ensayos con agua ultrapura Milli-Q el aumento del volumen de inyección incrementa el número de analitos cuyo MQL es inferior 50 ng/L, siendo recomendable en líneas generales la inyección de 100-400 µL. • En los ensayos con agua residual urbana el volumen de inyección seleccionado para la extracción en fase sólida Online es 300 µL, para la inyección directa el volumen de inyección recomendado es diferente según se trate del influente, 200 µL, o del efluente, 400 µL, de la depuradora. • La selección del volumen óptimo en función del porcentaje de compuestos para los que se obtiene un MQL inferior a 50 ng/L es coherente generalmente con el valor de la mediana de los MQL para los diferentes volúmenes de inyección. • Mediante la SPE-Offline se obtienen mejores MQL para un mayor porcentaje de compuestos, si bien la inyección directa de volúmenes elevados podría ser una alternativa adecuada dada la rapidez y menor laboriosidad de este último método. • La anchura de pico es mayor en los métodos automatizados que emplean volúmenes de inyección elevados frente a la inyección de 10 µL habitual en los métodos Offline. La anchura de pico es claramente superior en la SPE Online. • El uso de AEDT para complejar determinados cationes presentes en las aguas urbanas no es necesario para incrementar las áreas de pico de los analitos. Se ha observado que la adición de AEDT disminuye significativamente la anchura de los picos cromatográficos si bien en pequeña cuantía. • El efecto memoria en la inyección directa es inferior al 1% salvo para el danofloxacin, doxycycline y fenbedazol. En la SPE-Online el efecto memoria es superior de forma global y por analito. • Las tasas de recuperación absolutas obtenidas mediante los métodos automatizados, que tienen en cuenta la influencia de la matriz en la preparación de muestra y en la ionización electrospray, son inferiores al 100% en el análisis de aguas urbanas como era esperable salvo para la tylosin y la doxycycline. • Se ha detectado una treintena de drogas en el agua residual urbana calculándose los porcentajes de eliminación durante el proceso de depuración, aunque en algún caso los resultados difieren según el método de análisis. 81 • Para el agua residual ganadera, en función del número de compuestos cuyo MQL es inferior a 50 ng/L, el volumen de inyección recomendado para el análisis mediante inyección directa de influentes es 100 µL, y 300 µL en el caso de efluentes. 82 8 BIBLIOGRAFÍA [1] uned, V. M. R.-R. 100cias@, época, N., & 2017, undefined. (n.d.). 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